WO2012100600A1 - 过氧化物还原酶iv特异性抗体在制备早期类风湿关节炎体外诊断试剂中的应用 - Google Patents

过氧化物还原酶iv特异性抗体在制备早期类风湿关节炎体外诊断试剂中的应用 Download PDF

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WO2012100600A1
WO2012100600A1 PCT/CN2011/083644 CN2011083644W WO2012100600A1 WO 2012100600 A1 WO2012100600 A1 WO 2012100600A1 CN 2011083644 W CN2011083644 W CN 2011083644W WO 2012100600 A1 WO2012100600 A1 WO 2012100600A1
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peroxide reductase
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吴乔
吴玉章
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中国人民解放军第三军医大学
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    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the invention relates to the field of medical examination, in particular to a double-anti-sandwich ELISA kit for detecting peroxide reductase IV in biological specimens, and a method and application thereof.
  • Rheumatoid arthritis is a systemic autoimmune disease characterized by synovitis as a basic pathological change characterized by chronic destructive joint disease. Most of the conditions are progressive, eventually leading to joint fibrosis or bony rigidity. Severe disability, seriously affecting the quality of life of patients. Rheumatoid arthritis without proper treatment can be delayed and even cause joint deformities. As a self-immune disease, pathogenic antigen-driven autoreactive CD4+ T cell activation is a central pathway in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
  • RA pathological changes of RA gradually progress from cartilage tissue to cartilage to bone. If the RA is not effectively treated in the early stage, it will cause joint dysfunction and even labor loss, and cause multiple organs in the body to be involved and endangered. If you can diagnose the condition of RA as soon as possible and treat it early to prevent or delay its development, it will effectively improve the treatment effect of RA and reduce its complications.
  • the detection of high sensitivity and specificity in the early stage of RA is a prerequisite for the early diagnosis and treatment of RA.
  • Rheumatoid factor has the disadvantage of low sensitivity; 53.3% of patients with early RF-negative rheumatoid arthritis are positive for anti-peripheral factor (APF), but APF antigen
  • APF antigen
  • the storage time of the tablets is short (only 1 ⁇ 2 weeks), and the detection stability is low; the positive rate of Sa antibody in rheumatoid arthritis is 40%, the specificity is 98.9%, but the early stage of rheumatoid arthritis is only about 23%. Correlation studies between peroxide reductase IV and rheumatoid arthritis have not been reported.
  • One of the objects of the present invention is to provide a kit which can rapidly detect the content of peroxide reductase IV, which is simple in operation and low in cost.
  • a double-antibody sandwich ELISA kit for detecting peroxide reductase IV in a biological specimen comprising a capture agent consisting of a specific monoclonal antibody and/or a polyclonal antibody against a peroxide reductase IV, and a second enzyme Resistance, sample diluent and substrate.
  • the capture agent is mouse anti-peroxide reductase IV antibody IgG.
  • mouse anti-peroxide reductase IV antibody IgG is diluted by no more than 640 volumes, and the dilution is a capture agent.
  • the double-antibody sandwich ELISA kit for detecting peroxide reductase IV in a biological specimen according to 8 the HRP-labeled rat anti-human peroxidase IV antibody IgG is not more than 10,000 Double volume dilution, the dilution is the enzyme-labeled secondary antibody.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the above kit, which can make up for the technical blank in the field of peroxide reductase IV detection, and provides a diagnostic idea for rheumatoid arthritis and other immune diseases, and is particularly suitable for biological use. Specimen detection.
  • the reductase IV concentration is greater than 0.1011 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 is positive for peroxide reductase IV, less than or equal to 0.1011 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 is negative for peroxide reductase IV.
  • a third object of the present invention is to provide a method for the content of a peroxide reductase IV which is highly sensitive and simple to operate.
  • step a the capture agent is coated with an enzyme label
  • the biological specimen to be tested is contacted with the capture agent, insulated and blocked with a blocking solution; the biological specimen is not more than 200 times the volume dilution.
  • a serum dilution the capture agent is a mouse anti-peroxide reductase IV antibody IgG as a dilution of no more than 640 volume dilutions.
  • step c the antigen-antibody complex obtained in step b is added to a double-antibody sandwich ELISA kit.
  • the enzyme-labeled secondary antibody is subjected to an incubation reaction to obtain a double-antibody sandwich complex; the enzyme-labeled secondary antibody is a HRP-labeled rat anti-human peroxidase reductase IV antibody IgG as a dilution of not more than 10,000 volume dilutions.
  • step d adding the chromogen substrate to the double-antibody sandwich composite obtained in step c After coloring, the reaction solution was terminated by adding a stop solution, and the content of the peroxide reductase IV bound to the capture agent was measured by measuring the OD 45Qnm value of the color developing sample liquid.
  • the invention has the beneficial effects that: the kit can specifically detect the content of the peroxide reductase IV, and the cost thereof is low and the sensitivity is good; the kit is used to detect the content of the peroxide reductase IV, and the normal person The level of peroxide reductase IV is compared to specifically diagnose rheumatoid arthritis, so the kit can be prepared as a diagnostic kit for rheumatoid arthritis, especially for early diagnosis.
  • Figure 1 is a graph showing the results of ELISA test of peroxidase reductase IV double antibody sandwich in serum of early and late rheumatoid arthritis and other different disease groups.
  • Figure 3 is a graph showing the working curve of a double-anti-sandwich ELISA kit in the detection of early rheumatoid arthritis, in which the abscissa is sensitivity and the ordinate is (100-specific).
  • the human peroxidase reductase IV is obtained by constructing a prokaryotic expression plasmid, transforming the expression bacteria, and fermenting the culture, collecting a large amount of the bacterial body precipitate containing the peroxide reductase IV, and then breaking by ultrasonication.
  • a Freund's incomplete adjuvant 3 parts of liquid paraffin oil, 1 part of lanolin, evenly mixed, 115 ° C, 15 min autoclaved to obtain Freund's incomplete adjuvant. Heat and melt before use, cool to about 50 °C, add antigen to emulsification;
  • Freund's complete adjuvant Add BCG to the final concentration of Img/mL on the above basis, and mix the antigen solution with the same amount when using Fully emulsified.
  • Preparation of a immunogen The purified peroxide reductase IV is expressed, and the first exemption is mixed with an equal amount of complete Freund's adjuvant and fully emulsified, and the second and third excipients are mixed with incomplete Freund's adjuvant and fully emulsified. The fourth is free of adjuvant.
  • Dialysis equilibrium was carried out in buffer A (pH 8.0, 20 mmol/L Tris-HCl buffer) at 4 ° C overnight; (2) Pretreatment of the column: After 0.5 mol/L NaOH, water washing, 1.0 mol/ Pretreatment with L NaCl, water washing, etc., and equilibrate HighQ column with buffer A; (3) Load: Take 5 mL of crude IgG sample; (4) Wash: equilibrate with 50 mL of buffer A and wash unbound Proteins and impurities; (5) Elution: Linear gradient ionic strength elution with buffer B (1.0 mol/L NaCl), flow rate 0.5 mL/min, elution time 200 min, fractional collection of eluted fractions.
  • buffer A pH 8.0, 20 mmol/L Tris-HCl buffer
  • Pretreatment of the column After 0.5 mol/L NaOH, water washing, 1.0 mol/ Pretreatment with L NaCl, water washing, etc., and equilib
  • the enzyme solution after b reaction was passed through a Sephadex G-25 column and eluted with physiological saline. The flow rate was controlled at 1 ml / 1 minute and the brown effluent was collected. If the volume is greater than 5 ml, concentrate to 5 ml with PEG. Place in a small 25ml beaker and mix slowly.
  • c 12.5 mg of the antibody to be labeled was diluted to 5 ml with physiological saline, and added dropwise to the enzyme solution with stirring.
  • RA rheumatoid arthritis
  • OA osteoarthritis
  • the collected procoagulant serum samples were centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes at room temperature overnight, and the supernatant was taken, lOOul was dispensed, -70
  • the square matrix titration method is as follows: (1) The mouse anti-peroxide reductase IV antibody IgG is diluted with the coating solution (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1). :1600, 1 :3200), coated with enzyme plate, lOOul/well, incubate at 4°C wet box overnight, wash machine 3 times, 5min/time, pat dry; (2) add 100 ⁇ /well Blocking solution, 37°C wet box closed for lh, washing machine for 3 times, 5min/time, patted dry; (3) Add serum sample to be tested, 100 ⁇ /well, 37°C wet box for lh, wash plate Machine washing 3 times, 5 min / time, patted dry; (4) Dilute HRP-labeled rat anti-human peroxide reductase IV antibody IgG (1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000) , 1 : 16000 , 1 : 32000 ) , added to the microplate ,
  • mice anti-peroxide reductase IV antibody IgG and rat anti-peroxide reductase IV antibody IgG with the highest P/N value was the best. concentration.
  • mice anti-human peroxidase reductase IV monoclonal antibody IgG and the rat anti-human peroxidase reductase IV polyclonal antibody IgG were serially diluted and subjected to a square matrix test. The results are shown in Table 2. The results of the square array titration showed that when the mouse anti-human peroxide reductase IV antibody IgGl was diluted 200-fold, the rat anti-human peroxidase IV antibody IgG was diluted 1:4000. When the OD 45Qnm value is greater than 1.0, the yt positive serum OD 45Qnm ratio (P / N) is the largest. Therefore, the optimal coating concentration of mouse anti-human peroxidase IV antibody IgG was 1:200, ie 5 mg/ml; rat anti-human peroxide reductase IV antibody
  • the optimal dilution factor for IgG is 1:4000.
  • the above-mentioned optimal coating concentration is the threshold concentration. When the threshold concentration is greater than the threshold concentration, the same effect can be achieved, but the economic cost increases.
  • the concentration of the mouse anti-human peroxidase IV antibody concentration of 5 mg / ml was coated with the enzyme standard plate, and the serum to be tested was added at 1:20, 1:50, 1:100, 1:200 dilution, and then the concentration was added.
  • the test serum was diluted in different multiples, and double antibody sandwich ELISA was performed. The dilution is repeated 3 times, and the average P value and N value of the sample are determined to determine the optimal working concentration of the serum to be tested.
  • the results are shown in Table 3, when the serum to be tested At a dilution of 1:50, the P/N value is at most 7.030, so the optimal serum dilution factor is determined to be 1:50. Where 1:50 is the dilution factor threshold, and when the dilution factor is less than 1:50, the same effect can be achieved.
  • lOl lyg / ml is a positive value of the negative, the value of the peroxide reductase IV of the sample to be tested is greater than 0. 101 lyg / ml for peroxide reduction Enzyme IV is positive, less than or equal to negative.
  • OA Osteoarthritis
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • AD autoimmune diseases
  • RA rheumatoid arthritis
  • NC normal people
  • the control (NC) serum was tested according to the method in the present example, and the results were observed.
  • the average value of the OD 45Qmn value was 0.2162 0.3151 0.2906 0.7878 0.1367
  • the human peroxidase reductase IV containing 2 ug/ml of recombinant expression was diluted according to the following concentration gradient (2000 ng/ml lOOOOg/mU 500 ng/ml 250 ng/ml 125 ng/mU).
  • the coefficient of variation (CV) of the OD 45Qnm value in the intra-assay repeated test between the rheumatoid arthritis serum collected at different times was 2.44% ⁇ 2.96%, less than 5%; 3 collected at different times
  • the CV of the OD 45Qnm value of the rheumatoid arthritis serum 3 batches was 2.34% ⁇ 3.01%, less than 5% (Table 10).
  • the established peroxide reductase IV double antibody sandwich ELISA method has good intra- and inter-assay repeatability.
  • the content of peroxide reductase IV is detected by using serum as a biological specimen as an example, and the content of peroxide reductase IV can also be detected by using other biological samples such as plasma, urine, synovial tissue and the like.
  • the serum of patients with early rheumatoid arthritis was detected by the above method.

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Description

过氧化物还原酶 I V特异性抗体在制备早期类风湿关节炎体外 诊断试剂中的应用 技术领域
本发明涉及医学检验领域， 特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹 心 ELISA试剂盒及其方法与运用。
背景技术
类风湿关节炎 (RA) 是一种以滑膜炎为基本病理改变， 以慢性破坏性关节病变为特征的 全身性自身免疫病， 大多病情呈进行性， 最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残， 严重 影响患者生活质量。 未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈， 甚至导致关节畸形。 作为自 身免疫性疾病， 致病抗原驱动的自身反应性 CD4+T 细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途 径。
对于类风湿关节炎的诊断， 现在主流仍然沿用 1987 年美国风湿病学学会 RA的分类标 准， 其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对 RA进行判断。 另外， X线改变和类风湿因 子也是判断 RA的常用标准。 但上述方法操作繁琐且特异性不高， 且不适用于早期诊断。
众所周知， RA 的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。 RA在早期若未得到 有效治疗， 将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失， 并导致全身多脏器受累进而危及生命。 如果能尽早对 RA病情做出诊断， 及早治疗， 从而阻止或延缓其发展， 将能有效的提高 RA 的治疗效果并减少其并发症的发生。 而针对 RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实 现 RA早期诊断和治疗的前提。
早期诊断指标中， IL-8、 IL-6水平在巨细胞病毒 DNA 阳性的类风湿关节炎患者中升高 和 CMV基因组出现之间存在联系， 但特异性和敏感性低。 在 RA 自身抗体作为检测指标方 面： 类风湿因子 （RF ) 存在灵敏度低的缺点； 在早期 RF 阴性的类风湿关节炎病人中可 53.3% 的病人抗核周因子 （APF ) 呈阳性， 但 APF 抗原片的保存时间较短 （仅为 1〜2 周）， 检测稳定性低； Sa抗体在类风湿关节炎中阳性率为 40%， 特异性为 98.9%， 但类风湿 关节炎早期仅约 23%; 过氧化物还原酶 IV和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种试剂盒， 该试剂盒能快速检测过氧化物还原酶 IV的含 量， 操作简单， 成本低廉。
为实现上述目的， 本发明的技术方案为： 1、 用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 包括以抗过氧 化物还原酶 IV的特异性单抗和 /或多抗组成的捕获剂、 酶标二抗、 样品稀释液和底物。
2、 进一步， 所述捕获剂为小鼠抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG。
3、 进一步， 小鼠抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 640倍体积稀释， 其稀释液为 捕获剂。
4、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 所述捕获剂附于固相支持物上。
5、 根据 4所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
6、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 所述生物标本为血清、 尿液、 细胞组织物或血浆。
7、 根据 6所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 所述生物标本为血清。
8、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 所述酶标二抗为 HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG。
9、 根据 8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 将所述 HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 10000倍体积稀释液， 其 稀释液为酶标二抗。
10、 根据 1 所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 所述捕获剂与酶标二抗的用量比为 1 :1。
本发明的目的之二在于提供上述试剂盒的用途， 该用途能弥补过氧化物还原酶 IV检测领 域的技术空白， 并为类风湿关节炎及其它免疫性疾病提供了诊断思路， 特别适用于生物标本 的检测。
为实现上述目的， 本发明的技术方案为：
11、 1-10任一项所述双抗夹心 ELISA试剂盒在检测过氧化物还原酶 IV含量的应用。
12、 根据 11所述的双抗夹心 ELISA试剂盒应用， 所述试剂盒在检测类风湿关节炎中的 应用。
13、 根据 11所述的双抗夹心 ELISA试剂盒应用， 所述试剂盒在检测早期类风湿关节炎 试剂盒中的应用。
14、 根据 11所述的双抗夹心 ELISA试剂盒应用， 其特征在于： 明确当待测血清的过氧 化物还原酶 IV浓度大于 0.1011μ§/ηι1为过氧化物还原酶 IV阳性， 小于或等于 0.1011μ§/ηι1为 过氧化物还原酶 IV阴性。
本发明的目的之三在于提供过氧化物还原酶 IV含量的方法， 该方法敏感性高， 操作简 单。
为实现上述目的， 本发明的技术方案为：
15、 运用 1-10任一项所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方法， a、 将生物标本与双抗夹心 ELISA试剂盒中的捕获剂接触并保温； b、 将未结合的生物标本 分离， 得抗原-抗体复合物； c、 在步骤 b所得的抗原 -抗体复合物加入双抗夹心 ELISA试剂 盒中的酶标二抗， 得双抗夹心复合物； d、 检测结合于捕获剂的过氧化物还原酶 IV的含量。
16、 根据 15 所述的运用所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 还包括将步骤 d所得的过氧化物还原酶 IV的含量与正常人进行比较判断。
17、 根据 15所述的方法， 步骤 a中， 将捕获剂包被酶标板， 将待测生物标本与捕获剂 接触， 保温并用封闭液封闭； 所述生物标本为不大于 200倍体积稀释的血清稀释液， 所述捕 获剂为小鼠抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 640倍体积稀释的稀释液。
18、 根据 15 所述的运用所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 步骤 b中， 将步骤 a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离， 得 抗原-抗体复合物。
19、 根据 15 所述的运用所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 步骤 c中， 在步骤 b所得的抗原 -抗体复合物加入双抗夹心 ELISA试剂盒中的酶标二抗 进行保温反应， 得双抗夹心复合物； 所述酶标二抗为 HRP 标记的大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 10000倍体积稀释液的稀释液。
20、 根据 15 所述的运用所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 步骤 d中， 在步骤 c所得的双抗夹心复合物中加入色原底物避光显色后， 加入终止液终 止反应得显色样品液，通过测显色样品液的 OD45Qnm值检测结合于捕获剂的过氧化物还原酶 IV 的含量。
21、 根据 15 所述的运用所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 所述方法还包括阴性对照组和空白对照组， 所述阴性对照组为源自于正常人的生物标 本。
22、 根据 21 所述的运用所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 明确当待测血清的过氧化物还原酶 IV浓度大于 0.1011μ§/ηι1 为过氧化物还原酶 IV阳性， 小于或等于 0.1011μ§/ηι1为过氧化物还原酶 IV阴性。
本发明的有益效果在于： 本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶 IV的含量， 其成本 低， 敏感性佳； 运用本试剂盒检测过氧化物还原酶 IV的含量， 并与正常人的过氧化物还原酶 IV的水平进行比较， 可特异性高的诊断类风湿关节炎， 所以该试剂盒可以制备成类风湿关节 炎诊断试剂盒， 尤其适用于早期诊断。
附图说明
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进一步的 详细描述， 其中：
图 1为早晚期类风湿关节炎及其他不同疾病组血清当中过氧化物还原酶 IV双抗体夹心法 ELISA检测结果图。
图 2为过氧化物还原酶 IV双抗体夹心法 ELISA标准曲线，横坐标为过氧化物酶 IV标准品 的稀释浓度， 纵坐标为各稀释浓度标准品对应的 OD45Q值。
图 3 为双抗夹心 ELISA试剂盒在检测早期类风湿关节炎中的受试者工作曲线分析图， 其中横坐标为敏感性， 纵坐标为 （100-特异性）。
具体实施方式
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面结合附图对本发明的优选实施例 进行详细的描述。 本实施例中将所述人过氧化物还原酶 IV的获得是通过构建原核表达质粒、 转化表达菌并发酵培养， 收集到大量的含有过氧化物还原酶 IV的菌体沉淀， 再通过超声波破 碎菌体、 过氧化物还原酶 IV包涵体冼涤、 纯化及梯度透析而获得的； 用所述人过氧化物还原 酶 IV对大鼠进行常规免疫程序和纯化， 获得大鼠抗人过氧化物还原酶 IV多克隆抗体 IgG， 在 此抗体上标记辣根过氧化物酶 (HRP), 作为双抗体夹心法 ELISA的二抗； 进一步确定了小鼠 抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG和大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG的最佳浓度范围及阴 阳性临界值的确定， 制定了一种特异性和敏感性高的类风湿关节炎抗原过氧化物还原酶 IV检 测方法， 其能捕获 7.8ng/mL过氧化物还原酶 IV抗原。
实施例
一抗体 IgG的制备
1构建人过氧化物还原酶 IV表达质粒，用 pET原核表达系统制备重组抗原 TRX-过氧化物 还原酶 IV融合蛋白。
1.1根据 GenBank中检索到的人过氧化物还原酶 IV成熟蛋白序列编码，设计合成编码过氧 化物还原酶 IV蛋白的 DNA; 1.2分别在 DNA5 ' 端和 3 ' 端设计 EcoR I和 Hindlll酶切位点，经聚合酶链反应 (PCR)、 构建重组质粒 pET过氧化物还原酶 IV；
1.3在 BL21(DE3)经 IPTG诱导表达；
1.4 Ni-NTA亲和层析制备 TRX-过氧化物还原酶 IV；
1.5通过 DNA测序、 融合蛋白的相对分子质量分析及 Western印迹来鉴定 TRX-过氧化 物还原酶 IV质粒及表达的过氧化物还原酶 IV抗原的正确性。
2大鼠抗人过氧化物还原酶 IV多克隆抗体的制备和纯化
2.1弗氏佐剂
a弗氏不完全佐剂： 液体石蜡油 3份， 羊毛脂 1份， 混合均匀， 115°C， 15min高压灭菌 后得弗氏不完全佐剂。 使用前加热融化， 冷却至 50°C左右， 加抗原进行乳化处理； b弗氏完 全佐剂： 在上述基础上添加卡介苗至终浓度 Img/mL 即可， 使用时将抗原溶液与其等量混 合， 充分乳化。
2.2大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG的制备和纯化
2.2.1 大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体的制备 （重复进行三次此试验， 每次间隔 1 周， 以制备三个不同批次的抗体）
a免疫原的制备： 将表达纯化后的过氧化物还原酶 IV， 首免与等量完全弗氏佐剂混合并 充分乳化， 第二、 三免与不完全弗氏佐剂混合并充分乳化， 第四免不加佐剂。
b免疫程序： 选择健康雄性 Wistar大鼠 4只， 首免前一天分别采血， 分离血清作为阴性 对照。 制备大鼠抗人过氧化物还原酶 IV高免血清免疫程序如下表：
表 1 制备大鼠抗人过氧化物还原酶 IV高免血清免疫程序
免疫接种时间 抗原及佐剂 抗原注射剂量 注射部位
~一免 (第 Id) 过氧化物还原酶 IV+弗氏完全佐 50(^g/mLZkg 双后足掌、 腋下
剂
二免 (第 14d) 过氧化物还原酶 IV+弗氏不 30(^g/mL/kg 腋下、 脊背皮下
完全佐剂
三免 (第 21d) 过氧化物还原酶 IV+弗氏不 30(^g/mLZkg 双后足掌、 脊背皮下 完全佐剂
四免 (第 28d) 纯化的过氧化物还原酶 IV 0.6mL只 耳缘静脉 四免后 14d颈动脉放血， 收集血液。 37°C放置 lh， 4°C冰箱过夜。 第二天析出血清， 血凝块 以 4000r/min离心 15min再次收集血清， -20°C保存备用。 2.2.2大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG的纯化
除使用大鼠外， 也可以采用其它动物制备抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG。
a正辛酸 -硫酸铵法粗提大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG: 粗提大鼠抗人过氧化物还 原酶 IV抗体 IgG， 步骤如下： （1 ) 取分离的 10mL血清加入等量的 0.06mol/L pH4.8醋酸盐缓 冲液， 混匀； （2) 室温搅拌下逐滴加入正辛酸 75 w g/mL 血清， 室温搅拌 30min， 4°C静置 >3h, 使其充分沉淀后， 13，000r/min 离心 30min; ( 3 ) 取上清用滤纸过滤， 向滤液中加入 1/10体积的 10mmol/L pH7.4的 PBS， 用 2 mol/L NaOH调节 pH=7.4; (4) 冰浴下向液体中 缓缓加入饱和硫酸铵 0.277g/mL使其终浓度达到 45%，搅拌 30min， 置 4°C静置 >3h或过夜， 13,000r/min离心 30min弃上清液； （4) 按 1 : 4的比例向沉淀中加入 PBS, 充分吹打使其充 分溶解； （5 ) 将溶解液装入透析袋中， 在 4°C下用 10mmol/L pH7.4 PBS透析， 每 6h换液一 次，直至奈氏试剂检测透析液中无沉淀产生为止。
b High Q 柱阴离子交换色谱法纯化大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG: 纯化抗体 IgG， 步骤如下： （1 ) 样品前处理： 将粗提 IgG用 0.45 μ ηι滤膜过滤去除杂质， 以缓冲液 A (pH8.0, 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液） 在 4°C条件下进行透析平衡过夜； （2) 色谱柱前处 理： 经过 0.5mol/L NaOH、 水洗、 1.0mol/L NaCl、 水洗等前处理， 且以缓冲液 A平衡 HighQ 色谱柱； （3 ) 上样： 取 5mL的粗提 IgG样品； （4) 清洗： 用 50 mL缓冲液 A平衡并洗下未 结合的蛋白质和杂质； （5)洗脱： 以缓冲液 B ( 1.0 mol/L NaCl) 进行线性梯度离子强度洗 脱， 流速 0.5 mL/min， 洗脱时间为 200min， 分部收集洗脱组分。
c抗体 IgG纯度和浓度测定： 将收集到的洗脱峰样品处理后， 进行 SDS-PAGE电泳 （图 3-B和图 5 )， 测定抗体 IgG的纯度， 并用 Bradford法测定抗体 IgG的最终浓度， 并将其稀 释为 2mg/mL， 分装后于 -20°C保存备用。
3戊二醛二步法 HRP标记大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG
a称取 HRP25mg溶于 1.25 %戊二醛溶液中， 于室温静置过夜。
b反应后的酶溶液经 Sephadex G-25层析柱， 用生理盐水洗脱。 流速控制在 1ml / 1 分 钟， 收集棕色流出液。 如体积大于 5ml， 则以 PEG浓缩至 5ml。 放置 25ml小烧杯中， 缓慢 搅拌。
c将待标记的抗体 12.5mg用生理盐水稀释至 5ml， 搅拌下逐滴加入酶溶液中。
d用 1M PH9.5碳酸缓冲液 0.25ml， 继续搅拌 3小时。
e加 0.2M赖氨酸 0.25ml， 混匀后， 置室温 2小时。
f 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵， 置 4°C 1小时。 g 3000rpm离心半小时， 弃上清。 沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次， 最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4的 PBS中。
h将上述溶液装入透析袋中， 对 0.15M PH7.4的 PB缓冲盐水透析， 去除铵离子后 (用萘 氏试剂检测)， 10,000rpm离心 30 分钟去除沉淀， 上清液即为酶结合物， 分装后， 冰冻保 存。
4包被抗体
由 Abeam公司提供 （效价 1 :12800)。
5实验方法
5.1待测血清样品的获得
所有待测类风湿关节炎 (RA)、 骨关节炎 (OA)血清由第三军医大学附属西南医院中医科 提供； 系统性红斑狼疮 （SLE) 血清由第三军医大学附属西南医院皮肤科提供； 正常人血清 由第三军医大学附属西南医院健康查体中心提供。
5.2待测血清样品的处理和保存
将收集的促凝血清样品 4°C过夜后经 3，000rpm离心 30分钟， 取上清， lOOul分装， -70
°C保存。
5.3最佳小鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG包被浓度和大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗 体 IgG最佳浓度的确定
采用方阵滴定法， 具体步骤如下： （1 ) 将小鼠抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG 用包被液 倍比稀释 ( 1 :100、 1 :200、 1 :400、 1 :800、 1 :1600、 1 :3200), 包被酶标板， lOOul/孔， 置 4°C 湿盒孵育过夜， 洗板机洗涤 3次， 5min/次， 拍干； （2) 加入 100 μ ΐ/孔封闭液， 37°C湿盒封 闭 lh， 洗板机洗涤 3次， 5min/次， 拍干； （3 ) 加入待测血清样品， 100 μ ΐ/孔， 37°C湿盒作 用 lh， 洗板机洗涤 3次， 5min/次， 拍干； （4) 将 HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗 体 IgG 倍比稀释 （1:1000、 1 :2000、 1:4000、 1 :8000、 1 :16000、 1 :32000), 加入酶标板中， ΙΟΟ μ Ι/L, 37°C湿盒孵育 30分钟， 洗板机洗涤 3次， 5min/次， 拍干； （5 ) 加入 TMB底物 ΙΟΟ μ Ι/孔， 37°C避光显色 15min后， 加入 100 μ 1/孔 2mol/L硫酸终止反应； （6) 检测： 用酶 标仪测 OD45Qnm值。 同时以 1%的 BSA/PBS溶液作空白对照， 以 P/N值最大的小鼠抗过氧化 物还原酶 IV抗体 IgG和大鼠抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG的稀释度为最佳工作浓度。
分别将小鼠抗人过氧化物还原酶 IV单克隆抗体 IgG和大鼠抗人过氧化物还原酶 IV多克隆 抗体 IgG作系列稀释， 进行方阵试验， 结果见表 2。 方阵滴定结果显示， 当小鼠抗人过氧化 物还原酶 IV抗体 IgGl :200倍稀释， 大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG以 1 : 4000倍稀释 时， OD45Qnm值大于 1.0， 阴阳性血清 OD45Qnm比值 (P / N)最大。 因此选择小鼠抗人过氧化物 还原酶 IV抗体 IgG 的最佳包被浓度为 1 :200， 即 5mg/ml; 大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体
IgG 的最佳稀释倍数为 1:4000， 上述最佳包被浓度均为阈浓度， 在大于阈浓度时， 同样可以 实现相同的作用， 但经济成本增加。
表 2 鼠抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG和兔抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG最佳工作浓度的确定 大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 小鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体的稀释倍数 的稀释倍数 100 200 400 800 1600 3200 类风湿关节炎患者血清 OD450m 1000 1.923 1.826 1.654 1.481 1.239 0.879
( P值） 2000 1.733 1.620 1.364 1.296 1.155 0.732
4000 1.526 1.421 1.277 1.165 1.078 0.518
8000 1.209 1.031 1.108 0.936 0.901 0.366
16000 0.964 0.812 0.674 0.518 0.439 0.309
32000 0.722 0.672 0.414 0.362 0.285 0.243 正常人血清 OD450m 1000 0.169 0.152 0.143 0.138 0.113 0.095
( N值） 2000 0.132 0.129 0.118 0.103 0.098 0.087
4000 0.123 0.113 0.101 0.093 0.088 0.075
8000 0.112 0.102 0.096 0.083 0.072 0.051
16000 0.094 0.089 0.081 0.072 0.064 0.039
32000 0.083 0.072 0.066 0.057 0.045 0.025
P/N值 1000 11.38 12.01 11.57 10.73 10.96 10.10
2000 13.13 12.56 13.50 12.58 11.79 8.41
4000 12.41 12.58 12.64 12.53 12.25 6.91
8000 10.79 7.96 11.54 11.28 12.51 7.18
16000 10.26 9.12 8.32 7.19 6.86 7.92
32000 8.70 9.33 6.27 6.35 6.33 9.72
5.4待测血清最适稀释倍数的确定
以浓度为 5mg/ml 小鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体浓度包被酶标板， 加入 1 :20、 1 :50、 1 :100、 1 :200稀释倍数待测血清， 再加入浓度为 1 :4000大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体， 选 择 P/N值最大时的血清稀释浓度作为最佳工作浓度。
根据确定的小鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG和大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG 最佳工作浓度， 将待测血清作不同倍数的稀释， 进行双抗体夹心 ELISA每个稀释度重复 3 次， 求出样品的平均 P值和 N值， 确定待测血清的最佳工作浓度。 结果见表 3， 当待测血清 作 1 :50稀释时， P/N值最大为 7.030， 因此确定最佳血清稀释倍数为 1 :50。 其中 1 :50为稀释 倍数阈值， 当稀释倍数小于 1 :50时， 同样可以实现相同的作用。
表 3待测血清最佳稀释工作浓度
样 品 待测血清稀释倍数
1 :20 1 :50 1 : 100 1 :200
类风湿关节炎 OD450nm值的平均值（P ) 1.832 1.631 1.125 0.752 正常人 00450靈值平均值（N ) 0.437 0.232 0.193 0.151
P/N 4.192 7.030 5.829 4.980
5.5阴阳性临界值的确定
表 4 100份正常人血清过氧化物还原酶 IV双抗体夹心 ELISA检测结果
Ϊ 2 3 4 5 6 7 8 过氧化物还原酶 IV 0.05957 0.07300 0.07300 0.11711 0.05574 0.06788 0.05830 0.06852 ( ug/ml)
9 Ϊ0 Π Ϊ2 Ϊ3 Ϊ4 Ϊ5 Ϊ6 过氧化物还原酶 IV 0.07939 0.09473 0.09857 0.06277 0.05318 0.06725 0.05830 0.05957 ( ug/ml)
Ϊ7 18 Ϊ9 20 21 22 23 24 过氧化物还原酶 IV 0.03784 0.05126 0.04551 0.05062 0.04423 0.06980 0.06661 0.05254 ( ug/ml)
25 26 27 28 29 30 31 32 过氧化物还原酶 IV 0.07939 0.05574 0.04040 0.03336 0.03528 0.03784 0.03081 0.02953 ( ug/ml)
33 34 35 36 37 38 39 40 过氧化物还原酶 IV 0.18167 0.04231 0.04679 0.09921 0.07236 0.04231 0.06852 0.04423 ( ug/ml)
ϋ 41 42 43 44 45 46 47 48 过氧化物还原酶 IV 0.03976 0.03528 0.04615 0.02761 0.03528 0.09857 0.04679 0.05254 ( ug/ml)
49 50 51 52 53 54 55 56 过氧化物还原酶 IV 0.04871 0.04679 0.04167 0.04104 0.15994 0.03656 0.07875 0.03464 ( ug/ml)
57 58 59 60 61 62 63 64 过氧化物还原酶 IV 0.04359 0.04295 0.03081 0.07364 0.06533 0.09409 0.14715 0.03081 ( ug/ml) 编号 65 66 67 68 69 70 71 72 过氧化物还原酶 IV 0.05062 0.07236 0.02441 0.04551 0.07683 0.08451 0.07428 0.05190 ( ug/ml)
73 74 75 76 77 78 79 80 过氧化物还原酶 IV 0.06788 0.06469 0.08514 0.03848 0.04040 0.03400 0.05830 0.04423 ( ug/ml)
81 82 83 84 85 86 87 88 过氧化物还原酶 IV 0.09346 0.05702 0.05702 0.07683 0.08323 0.09729 0.07683 0.05382 ( ug/ml)
89 90 91 92 93 94 95 96 过氧化物还原酶 IV 0.04615 0.11903 0.06725 0.05126 0.05702 0.08642 0.07620 0.06469 ( ug/ml)
97 98 99 Ϊ00
过氧化物还原酶 IV 0.04693 0.05732 0.08422 0.09177
( ug/ml) 表 5 50份早期 RA血清过氧化物还原酶 IV双抗体夹心 ELISA检测结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 过氧化物还原酶 IV 1.82714 0.20724 0.48724 0.20341 0.71610 0.25327 1.83353 0.22131 ( ug/ml)
9 Ϊ0 Π Ϊ2 Ϊ3 Ϊ4 Ϊ5 Ϊ6 过氧化物还原酶 IV 0.17592 0.21811 0.10368 0.24432 1.11436 1.05683 0.23224 0.17208 ( ug/ml)
Ϊ7 18 Ϊ9 20 21 22 23 24 过氧化物还原酶 IV 1.86230 0.75893 0.47254 0.15099 0.25839 0.12798 1.81371 1.86230 ( ug/ml)
25 26 27 28 29 30 31 32 过氧化物还原酶 IV 1.14760 0.00012 0.84587 0.14843 0.22131 0.31356 0.21246 0.24990 ( ug/ml)
33 34 35 36 37 38 39 40 过氧化物还原酶 IV 0.81167 0.40231 0.46709 0.99121 0.72436 0.42315 0.68522 0.44523 ( ug/ml)
ϋ 41 42 43 44 45 46 47 48 过氧化物还原酶 IV 0.39762 0.35289 0.46155 0.27618 0.35289 0.09857 0.45679 0.52254 ( ug/ml)
编号 49 50 过氧化物还原酶 IV 0.04198 0.49679
( ug/ml)
表 6 200份晚期 RA血清过氧化物还原酶 IV双抗体夹心 ELISA检测结果 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 过氧化物还原酶 IV 0.11135 0.14140 0.12414 0.91683 0.11519 1.83992 0.11263 0.50322 ( ug/ml)
编号 9 10 11 12 13 14 15 16 过氧化物还原酶 IV 0.16123 0.04935 1.85527 0.08451 0.13501 0.08131 0.10432 0.06021 ( ug/ml)
编号 17 18 19 20 21 22 23 24 过氧化物还原酶 IV 0.06021 0.05254 0.08578 0.07875 0.14524 0.10816 0.21811 0.06725 ( ug/ml)
编号 25 26 27 28 29 30 31 32 过氧化物还原酶 IV 0.04487 0.11903 1.68267 0.04167 1.68778 0.08259 0.09218 0.06725 ( ug/ml)
编号 33 34 35 36 37 38 39 40 过氧化物还原酶 IV 0.15099 0.67263 0.12798 0.07364 0.07811 0.05318 0.06533 0.34469 ( ug/ml)
编号 41 42 43 44 45 46 47 48 过氧化物还原酶 IV 1.82330 0.10304 0.30953 0.12478 0.07811 0.32615 0.18934 1.05171 ( ug/ml)
编号 49 50 51 52 53 54 55 56 过氧化物还原酶 IV 0.15291 0.06469 0.15930 0.07044 0.12670 0.14140 0.12542 0.07683 ( ug/ml)
编号 57 58 59 60 61 62 63 64 过氧化物还原酶 IV 0.07300 0.15802 0.06533 0.14779 0.05126 0.12030 0.17912 0.11391
( ug/ml)
编号 65 66 67 68 69 70 71 72 过氧化物还原酶 IV 0.04679 0.07939 0.06021 0.07875 0.09026 0.34724 0.41373 0.12670
( ug/ml)
编号 73 74 75 76 77 78 79 80 过氧化物还原酶 IV 0.74870 0.16569
( ug/ml)
编号 81 82 83 84 85 86 87 "88 过氧化物还原酶 IV 0.36770 0.36469
( ug/ml) 编号 89 90 91 92 93 94 95 96 过氧化物还原酶 IV 0.46192 0. 73352 0. 41822 0.39173 0.38990 0.07863 0.31002 0.38964 ( ug/ml)
编号 97 98 99 100 101 102 103 104 过氧化物还原酶 IV 0.67260 0.56174 0.37642 0.33382 0.04329 0.03375 0.08933 0.06902 ( ug/ml)
编号 105 106 107 108 109 110 111 112 过氧化物还原酶 IV 0.72260 0.15674 0.27332 0.082382 0. 90243 1.07375 0.89520 0. 69012 ( ug/ml)
编号 113 114 115 116 117 118 119 120 过氧化物还原酶 IV 1.04498 0.53790 1.68267 0.64133 1.68778 0.38259 1.09218 1.06725 ( ug/ml)
编号 121 122 123 124 125 126 127 128 过氧化物还原酶 IV 1.04099 0.78429 1.12798 1.07364 1.01178 1.08105 1.03365 0.34469 ( ug/ml)
编号 129 130 131 132 133 134 135 136 过氧化物还原酶 IV 1.18167 1.21031 0.98045 0.77123 0.72436 0.42315 0.68522 1.34235 ( ug/ml)
编号 137 138 139 140 141 142 143 144 过氧化物还原酶 IV 1.07728 1.10208 1.13368 1.94211 1.15631 0.12030 0.17922 0.69241 ( ug/ml)
编号 145 146 147 148 149 150 151 152 过氧化物还原酶 IV 1.12389 1.04359 1.27527 1.41578 0.33501 0.78289 1.10458 0.46033 ( ug/ml)
编号 153 154 155 156 157 158 159 160 过氧化物还原酶 IV 1.2700 1.18025 1.56422 1.77892 1.02590 1.45098 0.37314 0.55361 ( ug/ml)
编号 161 162 163 164 165 166 167 168 过氧化物还原酶 IV 0.12223 1.04522 0.85517 0.78411 1.13051 1.08243 0.35743 1.04562 ( ug/ml)
编号 169 170 171 172 173 174 175 176 过氧化物还原酶 IV 1.26192 0.07335 1. 41824 0.941228 0.68271 0.09886 1.32807 0.39814 ( ug/ml)
编号 177 178 179 180 181 182 183 184 过氧化物还原酶 IV 1.04960 1.09033 1.03422 1.07857 0.09033 0.24438 0.03398 0.32067 ( ug/ml)
编号 186 187 188 189 190 191 192 /3/:/ O9sol£nosi 00900ϊίϊ0ίAV
Figure imgf000015_0001
> 0.07396 78.82 68.61 % to 86.94% 75.00 65.12% to 83.28% 3.15
> 0.07524 78.82 68.61 % to 86.94% 76.04 66.25% to 84.17% 3.29
> 0.07652 78.82 68.61 % to 86.94% 77.08 67.39% to 85.05% 3.44
> 0.07748 77.65 67.31 % to 85.97% 80.21 70.83% to 87.64% 3.92
> 0.07844 75.29 64.75% to 84.01 % 80.21 70.83% to 87.64% 3.80
> 0.07908 72.94 62.21 % to 82.01 % 81.25 72.00% to 88.49% 3.89
> 0.08036 71.76 60.96% to 81.00% 83.33 74.35% to 90.16% 4.31
> 0.08195 70.59 59.71 % to 79.98% 83.33 74.35% to 90.16% 4.24
> 0.08291 69.41 58.47% to 78.95% 83.33 74.35% to 90.16% 4.16
> 0.08387 69.41 58.47% to 78.95% 84.38 75.54% to 90.98% 4.44
> 0.08483 68.24 57.24% to 77.92% 85.42 76.74% to 91.79% 4.68
> 0.08547 68.24 57.24% to 77.92% 86.46 77.96% to 92.59% 5.04
> 0.0861 1 67.06 56.02% to 76.87% 86.46 77.96% to 92.59% 4.95
> 0.08835 67.06 56.02% to 76.87% 87.50 79.18% to 93.37% 5.36
> 0.09122 65.88 54.80% to 75.82% 87.50 79.18% to 93.37% 5.27
> 0.09282 64.71 53.59% to 74.77% 87.50 79.18% to 93.37% 5.18
> 0.09378 64.71 53.59% to 74.77% 88.54 80.42% to 94.14% 5.65
> 0.09442 64.71 53.59% to 74.77% 89.58 81.68% to 94.89% 6.21
> 0.09602 64.71 53.59% to 74.77% 90.63 82.95% to 95.62% 6.90
> 0.09794 64.71 53.59% to 74.77% 91.67 84.24% to 96.33% 7.76
> 0.09889 63.53 52.38% to 73.71 % 93.75 86.89% to 97.67% 10.16
> 0.101 1 63.53 52.38% to 73.71 % 94.79 88.26% to 98.29% 12.20
> 0.1037 62.35 51.18% to 72.64% 94.79 88.26% to 98.29% 1 1.97
> 0.1053 61.18 49.99% to 71.56% 94.79 88.26% to 98.29% 1 1.75
> 0.1072 60.00 48.80% to 70.48% 94.79 88.26% to 98.29% 1 1.52
> 0.1098 58.82 47.62% to 69.39% 94.79 88.26% to 98.29% 1 1.29
> 0.1 120 57.65 46.45% to 68.30% 94.79 88.26% to 98.29% 1 1.07
> 0.1 133 56.47 45.28% to 67.20% 94.79 88.26% to 98.29% 10.84
> 0.1 146 55.29 44.1 1 % to 66.09% 94.79 88.26% to 98.29% 10.62
> 0.1 162 54.12 42.96% to 64.98% 94.79 88.26% to 98.29% 10.39
> 0.1 178 54.12 42.96% to 64.98% 95.83 89.67% to 98.85% 12.99
> 0.1 187 52.94 41.81 % to 63.87% 95.83 89.67% to 98.85% 12.71
> 0.1 197 51.76 40.66% to 62.74% 96.88 91.14% to 99.35% 16.56
> 0.1222 50.59 39.52% to 61.61 % 96.88 91.14% to 99.35% 16.19
> 0.1245 49.41 38.39% to 60.48% 96.88 91.14% to 99.35% 15.81
> 0.1251 48.24 37.26% to 59.34% 96.88 91.14% to 99.35% 15.44
> 0.1261 47.06 36.13% to 58.19% 96.88 91.14% to 99.35% 15.06
> 0.1273 44.71 33.91 % to 55.89% 96.88 91.14% to 99.35% 14.31
> 0.1315 43.53 32.80% to 54.72% 96.88 91.14% to 99.35% 13.93
> 0.1360 42.35 31.70% to 53.55% 96.88 91.14% to 99.35% 13.55
> 0.1372 41.18 30.61 % to 52.38% 96.88 91.14% to 99.35% 13.18
> 0.1395 40.00 29.52% to 51.20% 96.88 91.14% to 99.35% 12.80
> 0.1433 37.65 27.36% to 48.82% 96.88 91.14% to 99.35% 12.05
> 0.1462 36.47 26.29% to 47.62% 96.88 91.14% to 99.35% 1 1.67
> 0.1475 36.47 26.29% to 47.62% 97.92 92.68% to 99.75% 17.51
> 0.1494 35.29 25.23% to 46.41 % 97.92 92.68% to 99.75% 16.94
> 0.1520 34.12 24.18% to 45.20% 97.92 92.68% to 99.75% 16.38
> 0.1548 32.94 23.13% to 43.98% 97.92 92.68% to 99.75% 15.81
> 0.1574 31.76 22.08% to 42.76% 97.92 92.68% to 99.75% 15.25
> 0.1587 30.59 21.05% to 41.53% 97.92 92.68% to 99.75% 14.68
> 0.1596 29.41 20.02% to 40.29% 97.92 92.68% to 99.75% 14.12
> 0.1606 29.41 20.02% to 40.29% 98.96 94.33% to 99.97% 28.24
> 0.1635 28.24 19.00% to 39.04% 98.96 94.33% to 99.97% 27.1 1
> 0.1724 27.06 17.99% to 37.79% 98.96 94.33% to 99.97% 25.98
> 0.1804 25.88 16.99% to 36.52% 98.96 94.33% to 99.97% 24.85 取 100份正常人血清， 50份早期 RA、 200份晚期 RA患者血清， 用上述建立的过氧化 物还原酶 IV双夹心 ELISA 的方法检测。 将各样品所得过氧化物还原酶 IV浓度值分组带入 GraphPad Prism软件进行受试者工作曲线 （R0C) 分析， 选择 （特异性％+敏感性％) _1 为最 大值所对应的过氧化物还原酶 IV浓度值为临界值， 如表 7所示， 0. lOl lyg/ml为阴阳性临界 值， 待测样品的过氧化物还原酶 IV浓度值大于 0. 101 lyg/ml为过氧化物还原酶 IV阳性， 小于 或等于则为阴性。
5.6特异性试验
取骨性关节炎 （OA)、 系统性红斑狼疮 （SLE )、 其他自身免疫性疾病 （AD)， 包括多 形性硬化、 硬皮病、 皮肌炎、 类风湿关节炎 （RA) 和正常人对照 （NC) 血清， 按照本实施 例中的方法进行检测， 观察结果。
过氧化物还原酶 IV双抗体夹心法 ELISA特异性试验结果
疾病或正常人血清 OA AD SLE RA NC
OD45Qmn值的平均值 0.2162 0.3151 0.2906 0.7878 0.1367 将含 2ug/ml重组表达的人过氧化物还原酶 IV按照如下浓度梯度倍比稀释 （2000ng/ml lOOOng/mU 500ng/ml 250ng/ml 125 ng/mU 62.5ng/ml 31.25 ng/mU 15.625 ng/mU 7.8125 ng/ml), 100 μ Ι7孔加于酶标板中， 每个稀释度重复 3 次， 按建立的过氧化物还原酶 IV双抗 体夹心 ELISA方法检测， 同时设定空白 （PBS) 对照。
按照建立的过氧化物还原酶 IV双抗体夹心法 ELISA方法， 将含重组表达的人过氧化物 还原酶 IV作一系列倍比稀释， 结果见表 9和图 2。 将人过氧化物还原酶 IV稀释至 7.8125ng/ml 时， OD45Qnm值为 0.078， 稍大于空白对照值 0.069， 由于在每一酶标孔中加 100 μ L， 因此， 血清中检测含过氧化物还原酶 IV蛋白最低含量为 0.78ng
表 9过氧化物还原酶 IV双抗体夹心法 ELISA敏感性试验结果
过氧化物还原酶 IV倍比稀释浓度（ng/ml )
2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 7.8125 0
OD450 平均值 1.812 0.919 0.491 0.273 0.165 0.125 0.092 0.084 0.078 0.069 线性回归公式： Y=0.009X+0.063
5.8重复性试验结果
( 1 ) 批内重复性测定试验： 取 3 份不同时间收集到的类风湿关节炎血清， 按最佳稀释 度稀释， 加到抗原包被孔中， 每份样品做 3次重复 ELISA测定。 由每份样品的 OD45Qnm值计 算出平均 OD45()nn (X) 与标准方差 （SD)， 进而计算出每份样品批内变异系数 [CV=(SD/X) X 100%]; (2) 批间重复性测定试验： 在其它条件相同的情况下， 用 3 份不同批次制备的纯 化的小鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体包被酶标板， 对 3份不同时间收集到的类风湿关节炎血 清进行检测。 由每份样品的 OD45Qnm值计算出平均 OD45Qnm值 （X) 与 SD， 进而计算出每份 样品的批间变异系数。
经统计学分析， 3 份不同时间收集到的类风湿关节炎血清之间批内重复试验 OD45Qnm值 的变异系数 （CV) 为 2.44%〜2.96%， 小于 5%; 3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清 3 次批间重复试验 OD45Qnm值的 CV为 2.34%〜3.01%， 小于 5% (表 10)。 表明建立的过氧化物 还原酶 IV双抗体夹心法 ELISA方法具有很好的批内及批间重复性。
表 10 重复性试验结果
项目 血清 测定次数 Times of test 平均值 标准差 变异系数
Item Sera 1st 2nd 3rd X SD /% CV 板内 1 1.245 1.320 1.278 1.281 0.038 2.96%
Within 2 1.476 1.520 1.550 1.515 0.037 2.44% plate 3 0.943 1.010 0.965 0.973 0.034 3.49% 项目 血清 测定 4比次 Times of test 平均值 标准差 变异系数
Item Sera 1st 2nd 3rd X SD /% CV 板间 1 1.832 1.790 1.875 1.832 0.043 2.34%
Among 2 0.732 0.754 0.710 0.732 0.022 3.01% plates 3 1.523 1.558 1.480 1.520 0.039 2.57%
5.9过氧化物还原酶 IV与 RF和 CCP区分度分析
过氧化物还原酶 IV阳性判断值分别同类风湿因子 （RF) 和抗环瓜氨酸肽 （CCP) 通过四 格表卡方检验， 过氧化物还原酶 IV与 RF 比较， 卡方 =5.6 (校正）， P<0.05; 过氧化物还原 酶 IV与 CCP 比较， 卡方 =27.22， P<0.01， 说明过氧化物还原酶 IV作为类风湿关节炎诊断检 测指标， 其区分度高于 RF和 CCP。
表 11 过氧化物还原酶 IV和 RF四格表卡方检验
Figure imgf000018_0001
卡方 =5.6 (校正）， P < 0.05
表 12 过氧化物还原酶 IV和 CCP四格表卡方检验
过氧化物还原酶 IV 合计 阳 性 阴 性
CCP 阳 性 85 5 90
阴 性 40 0 40 合计 125 5 130
卡方 =27.22, P < 0.01
本实施例以血清作为生物标本为例对过氧化物还原酶 IV的含量进行检测， 也可以采用如 血浆、 尿液、 滑膜组织等其他生物标本对过氧化物还原酶 IV的含量进行检测。
5.10 早期诊断
运用上述方法对早期内风湿关节炎患者血清进行检测。
1 ) 本申请中所述早期类风湿关节炎定义为发现临床症状时间 2 个月以内的患者。 如图 1 所示， 早期类风湿关节炎血清中过氧化物还原酶 IV 含量检测。 通过本试剂盒双抗夹心 ELSIA方法检测早期类风湿关节炎 （RA) ( 50例） 血清中过氧化物还原酶 IV， 其浓度值均值 0. 646 ±0. 612。 和实施例 5. 5中正常人血清及晚期 RA血清中过氧化物还原酶 IV浓度值比较 P<0. 0001。
2) 本试剂及体外试剂盒的特异性及敏感性检测
将上述结果通过 GraphPad Prism 软件进行受试者工作曲线 （R0C ) 分析， 如图 3 所 示， 其特异性敏感性分别为 89. 66%、 96. 88%。
最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参照本发 明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可以在形式 上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范 围。

Claims

权利要求书
1. 用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于包括以 抗过氧化物还原酶 IV的特异性单抗和 /或多抗组成的捕获剂、 酶标二抗、 样品稀释液和底 物。
2. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 所述捕获剂为小鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG。
3. 根据权利要求 2所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 小鼠抗过氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 640倍体积稀释， 其稀释液为 捕获剂。
4. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 所述捕获剂附于固相支持物上。
5. 根据权利要求 4所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
6. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 所述生物标本为血液标本、 体液标本以及细胞组织物。
7. 根据权利要求 6所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 所述血液标本为血清。
8. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 所述酶标二抗为 HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG。
9. 根据权利要求 8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 将所述 HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 10000 倍体积稀释液， 其稀释液为酶标二抗。
10. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV的双抗夹心 ELISA试剂 盒， 其特征在于： 所述捕获剂与酶标二抗的用量比为 1:1。
11. 权利要求 1-10 任一项所述双抗夹心 ELISA 试剂盒在检测过氧化物还原酶 IV含量的应 用。
12. 根据权利要求 11所述的双抗夹心 ELISA试剂盒应用， 其特征在于： 所述试剂盒在类风 湿关节炎诊断试剂盒中的应用。
13. 根据权利要求 11所述的双抗夹心 ELISA试剂盒应用， 其特征在于： 所述试剂盒在早期 类风湿关节炎诊断试剂盒中的应用。
14. 根据权利要求 11所述的双抗夹心 ELISA试剂盒应用， 其特征在于： 所述试剂盒检测待 测血清与正常人血清的过氧化物还原酶 IV的含量， 明确当待测血清的过氧化物还原酶 IV浓度 大于 0.1011 yg/ml 为过氧化物还原酶 IV阳性， 小于或等于 0.1011 yg/ml 为过氧化物还原酶 IV 阴性。
15. 运用权利要求 1-10任一项所述双抗夹心 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， a、 将生物标本与双抗夹心 ELISA 试剂盒中的捕获剂接触并保温； b、 将未结合的生物 标本分离， 得抗原-抗体复合物； c、 在步骤 b 所得的抗原 -抗体复合物加入双抗夹心 ELISA 试剂盒中的酶标二抗， 得双抗夹心复合物； d、 检测结合于捕获剂的过氧化物还原酶 IV的含
16. 根据权利要求 15 所述的运用双抗夹心 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV浓度的方 法， 其特征在于： 所述方法还包括将步骤 d所得的过氧化物还原酶 IV的含量与正常人进行比 较判断。
17. 根据权利要求 15 所述的运用双抗夹心 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV浓度的方 法， 其特征在于： 步骤 a中， 将捕获剂包被酶标板， 将待测生物标本与捕获剂接触， 保温并 用封闭液封闭； 所述生物标本为不大于 200倍体积稀释的血清稀释液， 所述捕获剂为小鼠抗 过氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 640倍体积稀释的稀释液。
18. 根据权利要求 15 所述的运用双抗夹心 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 其特征在于： 步骤 b中， 将步骤 a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物 标本分离， 得抗原-抗体复合物。
19. 根据权利要求 15 所述的运用双抗夹心 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 其特征在于： 步骤 c中， 在步骤 b所得的抗原 -抗体复合物加入双抗夹心 ELISA试剂盒 中的酶标二抗进行保温反应， 得双抗夹心复合物； 所述酶标二抗为 HRP 标记的大鼠抗人过 氧化物还原酶 IV抗体 IgG作不大于 10000倍体积稀释液的稀释液。
20. 根据权利要求 15 所述的运用双抗夹心 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 其特征在于： 步骤 d中， 在步骤 c所得的双抗夹心复合物中加入色原底物避光显色后， 加入终止液终止反应得显色样品液,通过测显色样品液的 OD45Qnm值检测结合于捕获剂的过氧 化物还原酶 IV的含量。
21. 根据权利要求 15 所述的运用双抗夹心 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 其特征在于： 所述方法还包括阴性对照组和空白对照组， 所述阴性对照组为源自于正常 人的生物标本。
22. 根据权利要求 21 所述的运用双抗夹心 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV含量的方 法， 其特征在于： 所述待测生物标本的浓度值对应的 (敏感性 +特异性）一 1为最大值时， 设置 为临界值， 标本浓度值大于临界值时， 判定为过氧化物还原酶 IV阳性， 标本浓度值小于或等 于临界值时为阴性。
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