WO2012100384A1 - 人源化抗egfr抗体l4-h3及其编码基因 - Google Patents

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heavy chain
cell
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靳彦文
威孚⋅戴维
瑞奇韦兹⋅米歇尔
曹诚
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中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-EGFR humanized antibody L4-H3 and its encoding gene and application. Background technique
  • the epidemic growth factor receptor is a member of the epidermal growth factor gene (erbB) family and is overexpressed in approximately 30% of human tumors, especially non-small cell lung cancer, head and neck squamous cells. Cancer and colorectal cancer, etc. Many studies at home and abroad have shown that antibodies against EGFR can effectively inhibit the EGFR signal transduction pathway by blocking the binding of ligands in vitro, and various human tumors caused by EGFR overexpression or/and mutation. Especially, head and neck squamous cell carcinoma (80% ⁇ 100%), colorectal cancer (25% ⁇ 77%), non-small cell lung cancer (40% ⁇ 80%) have good curative effect. Epidermal growth factor receptor has become one of the most intensive and well-received cancer therapeutic targets. The use of genetic engineering to develop anti-EGFR monoclonal antibodies has become one of the research hotspots of tumor immunotherapy.
  • the humanized antibody against nibuzumab (nimotuzumab) has obtained a new class of drug certificate approved by the State Food and Drug Administration (SFDA) and is currently undergoing clinical trials in ⁇ / ⁇ .
  • SFDA State Food and Drug Administration
  • the murine monoclonal antibody can produce a human anti-mouse antibody response in human application, thereby affecting its function.
  • the mouse-human chimeric antibody engineered by genetic engineering technology can greatly attenuate the immunogenicity of murine monoclonal antibody, prolong the half-life of the antibody in vivo and mediate immunomodulation and ADCC effect by human immunoglobulin Fc segment, thereby enhancing the antibody.
  • 7% ⁇ The ability of the chimeric antibody to bind to the antigen is 98.7% lower than the murine antibody.
  • panitumumab is a transgenic mouse technology
  • the prepared human antibody has a human sequence close to 100% compared with the chimeric antibody and the humanized antibody, and greatly enhances the antibody target affinity, but the antibody has a mouse glycosylation pattern, a short half-life and a hypersensitivity reaction.
  • Nimuzumab is a humanized antibody obtained by humanization of anti-EGFR mouse monoclonal antibody, and the light and heavy chain genes of the antibody are ligated to different expression vectors for expression, due to the expression of light and heavy chains. Large differences often result in extremely low levels of expression of intact antibody molecules. Summary of the invention
  • the antibody provided by the present invention comprises a light chain and a heavy chain, wherein the heavy chain is linked by a heavy chain variable region and a heavy chain constant region; the amino acid sequence of the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 3
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of the human antibody IgG1; the amino acid sequence of the light chain is shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence of the heavy chain of the above antibody can be specifically as shown in SEQ ID NO: 3.
  • the coding gene of the light chain of the above antibody is as follows: I), ⁇ ) or III):
  • the gene encoding the heavy chain of the above antibody is as follows 1), 2) or 3):
  • a recombinant vector, recombinant plasmid, recombinant cell or expression cassette containing the above-described coding gene is also within the scope of the present invention.
  • the above recombinant vector may specifically be a recombinant expression vector prepared according to the method comprising the steps of: inserting the coding gene of the light chain into the vector pIRES along the direction from the Nhe I cleavage site to the EcoR ⁇ restriction site Between the A3 ⁇ 4el and ⁇ 7?1 cleavage sites, a recombinant vector was obtained, which was recorded as an intermediate recombinant vector; the gene encoding the heavy chain was inserted in the direction from the cleavage site to the Not I cleavage site.
  • the recombinant vector obtained between the Not I restriction sites of the intermediate recombinant vector is the recombinant expression vector of interest.
  • the recombinant cell may specifically be a recombinant cell obtained by introducing the above recombinant expression vector into a starting cell; Wherein, the starting cell is 293T cells.
  • the method for producing any of the antibodies described above may comprise the steps of: culturing the above recombinant cells, collecting the supernatant, to obtain the antibody.
  • the light chain of the antibody and the heavy chain of the antibody are separately expressed, and the light chain of the antibody and the heavy chain of the antibody self-assemble into the antibody.
  • Another object of the present invention is to provide an inhibitor which inhibits the epidermal growth factor receptor signal transduction pathway.
  • the inhibitor of the epidermal growth factor receptor signal transduction pathway provided by the present invention, wherein the active component is the above antibody, the above-mentioned coding gene, the above recombinant vector, the above recombinant plasmid, the above recombinant cell, and/or the above expression cassette.
  • Another object of the present invention is to provide an inhibitor which inhibits invasion of tumor cells.
  • the inhibitory agent for inhibiting invasion of tumor cells comprises the above antibody, the above-mentioned coding gene, the above recombinant vector, the above recombinant plasmid, the above recombinant cell and/or the above expression cassette.
  • Another object of the present invention is to provide a product for preventing and/or treating a tumor.
  • the product for preventing and/or treating tumors comprises the above antibody, the above-mentioned coding gene, the above recombinant vector, the above recombinant bacteria, the above recombinant cells and/or the above expression cassette.
  • the tumor is colon cancer; and the tumor cell is SW480 cell.
  • the use of the above antibody, the above-described coding gene, the above recombinant vector, the above recombinant plasmid, the above recombinant cell and/or the above expression cassette for the preparation of a preventive and/or therapeutic tumor product is also within the scope of the present invention.
  • the tumor is colon cancer; and the tumor cell is SW480 cell.
  • a final object of the invention is to provide a protein fragment and its encoding gene.
  • amino acid sequence of the protein fragment provided by the present invention is shown as the 1-145th position in SEQ ID NO: 3;
  • the coding gene of the protein fragment provided by the present invention is as follows: a), b) or c): a) its nucleotide sequence is shown as position 1-435 of SEQ ID NO: 4;
  • FIG. 1 Agarose electrophoresis pattern of PCR product of light chain gene and heavy chain variable region gene.
  • Figure 2 is a schematic view showing the structure of an expression vector containing the antibody of the present invention.
  • the pIRES double expression vector was purchased from Clontech, Inc., catalog number 631605; the pMD18-T expression vector was purchased from Takara Bio Company, catalog number: D504 CA.
  • the vector pIRES-Anti-CD20 was published in the literature "Detection of Anti-CD20 Chimeric Antibody Expression and Activity", China Biotechnology, 2005, 25 (7): 34-39. Obtained by the Institute of Biotechnology of the Chinese Academy of Military Medical Sciences.
  • the murine-human chimeric antibody cetuximab amino acid sequence was used as a template to humanize the FR surface gene of human murine and design the synthetic light chain amino acid sequence and heavy chain "variable region + heavy chain”.
  • Amino acid sequence of constant region 1 The antibody of the present invention consists of a light chain L4 and a heavy chain H3; the heavy chain H3 is composed of a heavy chain variable region (VH), a heavy chain constant region 1 (CH1), a hinge region, a heavy chain constant region 2 (CH2), and a heavy chain.
  • the antibody of the present invention is referred to as L4-H3.
  • Light chain L4 the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 1; the coding gene sequence is shown in positions 85-726 of SEQ ID NO: 2;
  • Heavy chain H3 the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3; the coding gene sequence is shown in SEQ ID NO: 4;
  • amino acids 1-145 are heavy chain variable regions (VH), amino acids 146-243 are heavy chain constant region 1 (CH1), and amino acids 244-258 are hinge regions (hinge)
  • the amino acids at positions 259-369 are heavy chain constant region 2 (CH2), and the amino acids at positions 370-475 are heavy chain constant region 3 (CH3).
  • nucleotides 1-435 are heavy chain variable regions (VH), nucleotides 436-729 are heavy chain constant region 1 (CH1), nucleosides 730-739
  • the acid is a splicing donor, the nucleotides 740-1117 are intron 1, the nucleotides 1118-1162 are hinges, and the nucleotides 1163-1280 are introns 2,
  • the nucleotides of 1281-1613 are heavy chain constant region 2 (CH2), the nucleotides of 1614-1410 are intron 3, and the nucleotides of 1711-2031 are heavy chain constant region 3 (CH3),
  • the nucleotides at positions 2032-2230 are intron 4.
  • variable region + constant region 1 of the heavy chain HI:
  • the coding gene sequence is shown as SEQ ID NO: 5.
  • the coding gene for the light chain L4 is artificially synthesized (i.e., artificially synthesized at nucleotides 9-729 of SEQ ID NO: 2).
  • the coding gene for the "constant region 2+ constant region 3" of the heavy chain H3 i.e., nucleotides 730-2230 in SEQ ID NO: 4) can be artificially synthesized, or can be obtained by digesting the vector pIRES-Anti-CD20.
  • the coding gene for "variable region + constant region 1" of heavy chain H3 can be obtained by artificial synthesis or can be obtained as follows: Synthetic SEQ ID NO: 5 The coding gene shown. Using the artificially encoded gene shown in SEQ ID NO: 5 as a template, the overlapping PCR method was used to amplify the primers 1, 2, 3, 4, 5, and 6 to obtain the variable region + constant region 1 of the heavy chain H3.
  • the coding gene 1 and 3 are a pair of primers, 4 and 5 are a pair of primers, 6 and 2 are a pair of primers, each of which amplifies a fragment (named A, B, C) and then amplifies The A, B, and C were mixed into a template, and the target heavy chain H3 "variable region + constant region 1" encoding gene was amplified with the 1 and 2 primers.
  • the obtained genes were detected by gel electrophoresis, and the results were consistent with the expected size.
  • the fragment size of the light chain L4 was about 720 bp, and the size of the variable region + constant region 1 of the heavy chain H3 was about 729 bp (Fig. 1). ).
  • the obtained light chain coding gene and the "variable region + constant region 1" coding gene of heavy chain H3 were cloned into PMD18-T vector, transformed into Escherichia coli DH5a, single cloned, plasmid extracted and sequenced.
  • the DNA represented by nucleotides 9 to 729 (i.e., light chain coding gene) in SEQ ID NO: 2 was inserted into the PMD18-T vector, and the recombinant vector was designated as pMD18-T/L4.
  • the recombinant vector PMD18-T/L4 and pIRES double expression vectors were digested with the corresponding restriction enzymes (A3 ⁇ 4e1 and I) respectively, and the purified target fragment was recovered by agarose gel electrophoresis; the light chain gene fragment L4 was The vector fragment was mixed and reacted at 16 ° C for 12 h under the action of a linking reagent. Escherichia coli DH5a was transformed, single cloned, plasmid extracted and sequenced.
  • fragment 2 A fragment of about 729 bp (ie, a "variable region + constant region 1" fragment of heavy chain H3) was designated as fragment 2; and pIRES-Anti-CD20 was used as a template, and BMI and Not I were digested to recover a fragment of about 1502 bp ( That is, the fragment containing the "heavy chain constant region 2+ constant region 3" was recorded as fragment 3; the fragments 1, 2 and fragment 3 were ligated to obtain a recombinant vector, which was transformed into Escherichia coli DH5a, picked up, extracted, and sequenced.
  • the light chain coding gene indicated by nucleotides 9-729 in SEQ ID NO: 2 was inserted between the Nhe I restriction sites (in the direction from Nhe I to EcoRY), encoding the light chain encoding gene and heavy chain Between the genes is the IRES (Internal ribosome entry site, the internal ribosome entry site sequence, IRES can independently recruit ribosomes to translate the heavy chain mRNA).
  • the positive recombinant expression vector was recorded as pIRES/L4/H3 (Fig. 2). Second, vector transformation and antibody expression
  • 293T cells (293T human embryonic kidney T cells) were purchased from the American Type Culture Collection (also known as the American Model Collection Center, ATCC), catalog number CRL-11268; Lipof ectamine 2000 was purchased from Invitrogen, catalog number is 12566014; HyQSFM4CH0 medium was purchased from HyClone, catalog number SH30518, 02; rProtein A column was purchased from GE Company, catalog number 17-5079-01.
  • 293T cells were inoculated into a 10 cm diameter culture dish at a dose of 1 ⁇ 10 6 /ml, and the culture dish was filled with DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
  • the plasmid pIRES/L4/H3 obtained in step 1 was transfected into 293T cells, and the specific procedure was described with reference to the reagent of Lipofectamine 2000. Recombinant cells 293T- pIRES/L4/H3 were obtained.
  • the recombinant cell 293T- pIRES/L4/H3 was cultured in serum-free DMEM medium, and after 6 to 8 hours of culture, the serum-free medium was aspirated and replaced with HyQSFM4CH0 medium. Continue under the same conditions After cultured for 84 hours, the cell supernatant was collected once every 12 hours, and the expression of the antibody was initially detected by ELISA. To increase the transfection system, collect the cell culture supernatant 4 ⁇ 5L, adjust the pH to 6. 0 ⁇ 7. 0, filter with 0. 45 ⁇ m filter, and then purify the antibody with rProte in A column. Instructions.
  • ELISA Double antibody sandwich method for detecting unknown antigens:
  • the antibody primary antibody goat anti-human IgG was diluted to a protein content of l ⁇ 10 w g / ml with 0. 05M PH9. 0 carbonate coating buffer. 0.1 ml was added to the reaction well of each polystyrene plate at 4 ° C overnight. The next day, the solution in the well was discarded and washed 3 times with washing buffer for 3 minutes each time. (referred to as washing, the same below).
  • results can be observed directly with the naked eye on a white background: The darker the color in the reaction well, the stronger the positive degree, and the negative reaction is colorless or very light, depending on the depth of the color, with "+", The "-" sign indicates.
  • the 0D value can also be measured: on the ELISA detector, at 450 nm (if the color is developed by ABTS, 410 nm), the 0D value of each well is measured after zero adjustment of the blank control well, if it is greater than the 0D value of the specified negative control. 1 time, that is, positive.
  • Coating buffer (PH9. 06. 05M carbonate buffer): N3 ⁇ 4C0 3 1. 59 g,
  • BSA Bovine serum albumin 0. 1 gram plus wash buffer to 100ml or The serum of sheep serum, rabbit serum and the like are mixed with the washing liquid to be used in 5 to 10%.
  • Sodium Phosphate Buffer Used as a binding buffer for ProteinA purification.
  • the preparation method is as follows: Take 1M Na 2 HP0 4 57.7 ml and 1M NaH 2 P0 4 42.3 ml, and mix well, which is 0.1 ml of sodium phosphate buffer solution of pH 7.0, and dilute to 20 mM with distilled water for use.
  • Citric Acid-Sodium Citrate Buffer Used as an elution buffer for ProteinA purification.
  • the preparation method is as follows: Take 0.1M citric acid 186ml and 0.1M sodium citrate 14ml, which is 0.1ml, pH 3.0 citrate buffer 200ml.
  • Purify the antibody with rProtein A column Purification medium: HiTrap rProtein A FF,
  • the prepared cell supernatant was loaded at a flow rate of 1 to 2 ml/min; the cell supernatant was prepared by centrifugation at 12000 g for 15 minutes, and the supernatant was taken out and filtered through a 0.22 um nitrocellulose filter.
  • the target protein is eluted with 1M elution buffer (pH 3.0);
  • Goat anti-human IgG-HRP antibody was purchased from Sigma, catalog number (046K4801); goat anti-mouse IgGl was purchased from SBA (Southern Biotechnology Associates, Inc.), catalog number (1010-05);
  • Immunoblot (12%) analysis showed that the antibody specifically binds to goat anti-human IgG.
  • some non-specific hybridization bands including commercial cetuximab
  • anti-human IgG secondary antibodies have also emerged, which may be due to the mixing of some non-full length heavy chain fragments in the purification.
  • the above results did not affect the evaluation of antibody affinity. None of the above antibodies reacted with goat anti-mouse IgGl.
  • the cell culture supernatant of the antibody L4-H3 was obtained in accordance with the method of the steps 1 and 2, and the antibody was purified by the rProte in A column, and the expression of the antibody in the 293T cells was detected. The result was 0.6 g/ml. Eluent.
  • Biacore detects the binding ability of antibodies to antigens
  • Sensor Chip CM5 was purchased from BD, catalog number Br-1000-14; BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber was purchased from BD, catalog number 354480.
  • EGFR protein was purchased from Sigma, catalog number E2645-500UN.
  • the affinity of the antibody to EGFR was determined using a Biacore 3000 device.
  • the EGFR protein was diluted with 10 mmol/L NaAc at different pH values (4.0, 4. 5, 5. 0 and 7.5), preconcentrated on a CM5 chip, and the NaAc diluted protein at the optimum pH was selected.
  • the purified antibody i.e., the eluate obtained in the second step of Example 2 was covalently coupled to a CM5 sensor chip, and the mobile phase was HBS-EP (pH 7.4) at a flow rate of 20 ⁇ l/min.
  • Concentration of antibodies (0, 10. 55, 21. U 42. 2 and 84.4 nmol/L) Detection of binding affinity to EGFR protein. Affinity is calculated using the software included with Bi aCOTe 3000. At the same time, cetuximab was used as a control.
  • the experiment was set up with 3 repetitions and the results were averaged.
  • SW480 cells were purchased from the American Type Culture Collection (also known as the American Model Collection Center).
  • ATCC ATCC S Number : CCL-228TM
  • cetuximab antibody was purchased from Merkelion Pharmaceuticals, Germany (original English trade name: ERBITUX; country of origin English drug name: Cetuximab; Chinese Reference product translation: Erbitux; molecular structure name: cetuximab; country of origin: Germany; manufacturer: Merkelion Pharmaceutical Company, Germany).
  • SW480 cells were cultured with RPMI 1640 medium (purchased from Invitrogen, catalog number 31800-022).
  • the invasion chamber was hydrated with serum-free RPMI 1640 medium and incubated for 2 h (37 ° C, 5% C0 2 ).
  • Discard serum-free RPMI 1640 add 750 ⁇ l RPMI 1640 (containing 10% serum) to the chamber of the invasion chamber (BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber, catalogue 354480); in the insert chamber Add 475 ⁇ l of RPMI 1640 (containing 1% serum), then add 25 ⁇ l of digested SW480 cells (cell number > 10 5 /500 ⁇ 1 ), and finally add negative control PBS to the insertion chamber and the present invention.
  • each sample has two replicate wells with a final antibody concentration of 100 ng/ml.
  • the cells that failed to penetrate the basement membrane of the invasion cassette were wiped off with a sterile cotton swab; the cells that penetrated the basement membrane were fixed, stained, and air-dried at room temperature, and counted by light microscopy.
  • the humanized antibody of the present invention can better bind to EGFR, thereby ensuring its antitumor effect.
  • the method of the present invention for producing an antibody is capable of simultaneously expressing a light chain and a heavy chain such that the expression ratio of the light chain and the heavy chain is closer to 1:1, resulting in a higher ratio of mutually matched diabody.
  • the antibodies of the present invention and methods for their preparation will have broad application prospects in the field of prevention and/or treatment of tumors.

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Description

人源化抗 EGFR抗体 L4-H3及其编码基因 技术领域
本发明涉及一种抗 EGFR人源化抗体 L4-H3及其编码基因与应用。 背景技术
表皮生长因子受体 ( epidemic growth factor receptor , EGFR ) 是 表皮生长因子基因 （erbB ) 家族的一员， 在约 30%的人体肿瘤中过度表达， 尤其是非小细胞型肺癌、 头颈部鳞状细胞癌和结直肠癌等。 国内外许多研 究表明， 针对 EGFR 的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对 EGFR信号转导途径的抑制，对多种由 EGFR过度表达或 /和突变所引起的人 体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌（80 %〜100%)，结直肠癌（25 %〜77%)， 非小细胞型肺癌（40 %〜80%)等有较好的疗效。 表皮生长因子受体成为目 前研究较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程研制抗 EGFR 的单克隆抗体， 成为肿瘤免疫治疗的研究热点之一。
2004、 2006年， 美国 FDA先后批准了针对 EGFR的鼠-人嵌合抗体西妥 昔单抗 （cetuximab ) 和全人抗体帕尼单抗 （pani tumumab ) ， 用于结直肠 癌治疗； 2005年， 抗 EGFR的人源化抗体尼莫珠单抗 （nimotuzumab ) 获得 了我国药监局 （SFDA) 批准的一类新药证书， 目前正在进行 Π /ΙΠ期临床 试验。 鼠源单抗在人体应用中可产生人抗鼠抗体反应， 从而影响其功能的 发挥。 采用基因工程技术改造的鼠-人嵌合抗体可大幅度减弱鼠单抗的免 疫原性、 延长抗体在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白 Fc 段介导免疫 调理及 ADCC 效应， 进而增强抗体的生物学效应， 但该嵌合抗体结合抗原 的能力低于鼠源抗体 98. 7%。 大量临床前及临床试验均已证实西妥昔单抗 单药及联合化疗 /放疗具有较好的疗效， 但简单 CDR 移植往往会引起抗原 抗体亲和力的下降； 帕尼单抗是采用转基因小鼠技术制备的全人抗体， 与 嵌合抗体和人源化抗体相比， 人源序列接近 100%， 大大增强了抗体靶亲和 力， 但该抗体具有鼠糖基化模式、 半衰期短和超敏反应更多等缺点。 尼莫 珠单抗则通过对抗 EGFR 鼠源单抗进行人源化改造获得了人源化抗体， 并 把抗体的轻、 重链基因分别连接至不同的表达载体进行表达， 由于轻重链 表达存在较大差异， 往往导致完整抗体分子表达水平极低。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗体及其编码基因。
本发明所提供的抗体， 由轻链和重链构成， 所述重链由重链可变区和 重链恒定区连接而成； 所述重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3 中 第 1-145位所示； 所述重链恒定区为人源抗体 IgGl 的重链恒定区； 所述 轻链的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。
上述抗体的重链的氨基酸序列具体可如 SEQ ID NO: 3所示。
上述抗体的轻链的编码基因为如下 I ) 、 Π) 或 III) 所示：
I ) 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2中第 85- 726位所示或 SEQ ID NO: 2中第 9-729位所示；
II ) 在严格条件下与 I ) 限定的匪序列杂交且编码所述轻链的匪 分子；
III)与 I )限定的 DNA序列具有 70%以上的同源性且编码所述轻链的 DNA分子；
上述抗体的重链的编码基因为如下 1) 、 2) 或 3) 所示：
1) 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 4所示；
2)在严格条件下与 1)限定的 DNA序列杂交且编码所述重链的 DNA分 子；
3) 与 1) 限定的 DNA序列具有 70%以上的同源性且编码所述重链的 DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、 重组菌、 重组细胞或表达盒 也属于本发明的保护范围。
上述重组载体具体可为按照包括如下步骤的方法制备得到的重组表 达载体： 将所述轻链的编码基因沿着从 Nhe I酶切位点至 EcoR\酶切位点 的方向插在载体 pIRES的 A¾el和 ^^ 7?1酶切位点间， 得到重组载体， 记 作中间重组载体； 将所述重链的编码基因沿着从 酶切位点至 Not I 酶切位点的方向插在所述中间重组载体的 禾卩 Not I酶切位点间， 得 到的重组载体即为目的重组表达载体。
上述重组细胞具体可为将上述重组表达载体导入出发细胞得到的重 组细胞； 其中， 所述出发细胞为 293T细胞。
制备上述任一所述抗体的方法也属于本发明的保护范围。
制备上述任一所述抗体的方法可包括如下步骤： 培养上述重组细胞， 收集上清液， 即得到所述抗体。
在培养重组细胞的过程中， 所述抗体的轻链和抗体的重链分别表达， 抗体的轻链和抗体的重链自组装成为所述抗体。
本发明的另一个目的是提供一种抑制表皮生长因子受体信号转导途 径的抑制剂。
本发明所提供的抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂， 其活 性成分为上述抗体、 上述编码基因、 上述重组载体、 上述重组菌、 上述重 组细胞和 /或上述表达盒。
本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂。
本发明所提供的抑抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂， 其活性成分为上述抗 体、 上述编码基因、 上述重组载体、 上述重组菌、 上述重组细胞和 /或上 述表达盒。
本发明的另一个目的是提供一种预防和 /或治疗肿瘤的产品。
本发明所提供的预防和 /或治疗肿瘤的产品， 其活性成分为上述抗体、 上述编码基因、 上述重组载体、 上述重组菌、 上述重组细胞和 /或上述表 达盒。
上述抑制剂或产品中， 所述肿瘤为结肠癌； 所述肿瘤细胞为 SW480细 胞。
上述抗体、 上述编码基因、 上述重组载体、 上述重组菌、 上述重组细 胞和 /或上述表达盒在制备抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂 中的应用也属于本发明的保护范围。
上述抗体、 上述编码基因、 上述重组载体、 上述重组菌、 上述重组细 胞和 /或上述表达盒在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用也属于本 发明的保护范围。
上述抗体、 上述编码基因、 上述重组载体、 上述重组菌、 上述重组细 胞和 /或上述表达盒在制备预防和 /或治疗肿瘤产品中的应用也属于本发 明的保护范围。 上述应用中， 所述肿瘤为结肠癌； 所述肿瘤细胞为 SW480细胞。
本发明的最后一个目的是提供一种蛋白质片段及其编码基因。
本发明所提供的蛋白质片段的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3中第 1-145 位所示；
本发明所提供的蛋白质片段的编码基因为如下 a) 、 b ) 或 c ) 所示： a) 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 4中第 1-435位所示；
b )在严格条件下与 a)限定的 DNA序列杂交且编码所述蛋白质片段的 DNA分子；
c ) 与 a) 限定的 DNA序列具有 70%以上的同源性且编码所述蛋白质 片段的 DNA分子。 附图说明
图 1 轻链基因、 重链可变区基因 PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。 图 2含有本发明抗体的表达载体的结构示意图。
图 3本发明抗体的还原型 SDS-PAGE检测。
图 4本发明抗体的免疫印记分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径 得到。
pIRES双表达载体购自 Clontech 公司，产品目录号为 631605； pMD18-T 表达载体购自 Takara Bio Company, 产品目录号为： D504 CA.
载体 pIRES-Anti-CD20在文献 " 《抗 CD20嵌合抗体的表达和活性检 测》 ， 中国生物工程杂志 ( china biotechnology) , 2005, 25 (7) : 34-39. " 中公开过， 公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获 得。
实施例 1、 抗体的轻链和重链可变区编码基因的获得
根据计算机模拟， 以鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗氨基酸序列为模板， 对其鼠源 FR表面基因进行人源化改造而设计合成轻链氨基酸序列和重链 "可变区 +重链恒定区 1 " 的氨基酸序列。 本发明抗体由轻链 L4和重链 H3构成； 重链 H3由重链可变区 （VH) 、 重链恒定区 1 (CH1)、 铰链区、 重链恒定区 2(CH2)和重链恒定区 3(CH3)组 成 (H3=VH+CHl+hinge+CH2+CH3) 。 将本发明抗体记作 L4-H3。
轻链 L4: 氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示； 编码基因序列如 SEQ ID NO: 2中第 85-726位所示；
重链 H3: 氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3所示； 编码基因序列如 SEQ ID NO: 4所示；
SEQ ID NO: 3中： 第 1-145位氨基酸为重链可变区 （VH) ， 第 146-243 位氨基酸为重链恒定区 1 (CH1)， 第 244-258位氨基酸为铰链区（hinge)， 第 259-369位氨基酸为重链恒定区 2 (CH2)，第 370-475位氨基酸为重链恒 定区 3 (CH3)。
SEQ ID N0: 4中： 第 1-435位核苷酸为重链可变区 （VH) ， 第 436-729 位核苷酸为重链恒定区 1 (CH1)， 第 730-739 位核苷酸为剪接供体， 第 740-1117位核苷酸为内含子 1， 第 1118-1162位核苷酸为铰链区（hinge) , 第 1163-1280位核苷酸为内含子 2， 第 1281-1613位核苷酸为重链恒定区 2 (CH2) , 第 1614-1710位核苷酸为内含子 3， 第 1711-2031位核苷酸为重 链恒定区 3 (CH3)， 第 2032-2230位核苷酸为内含子 4。
重链 HI的 "可变区 +恒定区 1" ： 编码基因序列如 SEQ ID N0: 5所示。 轻链 L4的编码基因由人工合成得到 （即人工合成 SEQ ID NO: 2中第 9-729位核苷酸） 。 重链 H3的 "恒定区 2+恒定区 3" 的编码基因 （即 SEQ ID NO: 4 中第 730-2230 位核苷酸） 可人工合成得到， 也可酶切载体 pIRES-Anti-CD20得到。
重链 H3的 "可变区 +恒定区 1" 的编码基因可由人工合成得到， 也可 按照如下方法得到： 人工合成 SEQ ID NO: 5 所示编码基因。 以人工合成 的 SEQ ID N0: 5所示编码基因为模板， 采用重叠 PCR方法， 由引物 1、 2、 3、 4、 5、 6扩增， 得到重链 H3的 "可变区 +恒定区 1" 的编码基因； 1和 3是一对引物， 4和 5是一对引物， 6和 2是一对引物， 各扩增出一个片段 (命名为 A、 B、 C) ， 然后， 将扩增出的 A、 B、 C混合为模板， 以 1和 2 引物扩增出目的重链 H3 "可变区 +恒定区 1" 编码基因。
1： 5， -gtgtctagagccgccaccatggactgga-3 ' (Xba I )； ( SEQ ID NO: 6) 2： 5， -gggatccacttacctgttgctttct-3' (BaiM I )； (SEQ ID NO: 7) 3：
5， - atccactcaagtctttgtccaggggcctgtcgcacccagtggacgccgtagttagt caggctgaatccag -3' ； ( SEQ ID NO: 8)
4：
5， -gagtggatgggagtgatctggagtggtggtaacactgactacaacacccccttc actagcagagt cacc -3' 。 (SEQ ID NO: 9)
5：
5 ' -gaccagggttccctggccccagtaggcgaactcgtagtcgtaataagtcagggct ctcgcacag -3， (SEQ ID NO: 10)
6：
5， -cctactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggccc atcg -3， (SEQ ID NO: 11) .
将得到的各基因进行凝胶电泳检测， 结果与预期大小一致， 轻链 L4 的片段大小约为 720bp， 重链 H3 的 "可变区 +恒定区 1" 的编码基因大小 约为 729bp (图 1) 。 M. 相对分子质量标准； A: 泳道 1为轻链 L4的编 码基因； B: 泳道 1为重链 HI的 "可变区 +恒定区 1"基因、 泳道 3为重链 H3的 "可变区 +恒定区 1"基因。
将获得的轻链编码基因和重链 H3的 "可变区 +恒定区 1" 编码基因分 别克隆入 PMD18-T载体， 转化大肠杆菌 DH5a， 挑取单克隆、 提取质粒并测 序鉴定。结果表明， PMD18-T载体中插入了 SEQ ID N0: 2中第 9-729位（即 轻链编码基因）核苷酸所示 DNA，将该重组载体记作 pMD18-T/ L4。 pMD18-T 载体中插入了 SEQ ID NO: 4中第 1-729位 （即重链 H3 的 "可变区 +恒定 区 1" 编码基因） 核苷酸所示 DNA， 将该重组载体记作 pMD18-T/ VH+CH1。 实施例 2、 抗体的表达与纯化
一、 重组表达载体的构建：
将重组载体 PMD18-T/ L4和 pIRES双表达载体分别用相应的限制性内 切酶 （A¾e l和 I ) 酶切， 琼脂糖凝胶电泳后， 回收纯化目的片段； 将轻链基因片段 L4与载体片段混匀，在连接试剂的作用下， 16°C反应 12h。 转化大肠杆菌 DH5a，挑单克隆、提取质粒并测序鉴定，结果：在载体 pIRES 的 Nhe I和 EcoR\酶切位点间 （沿着从 Nhe I酶切位点至 EcoR\酶切位点 的方向） 插入了 SEQ ID NO: 2 中第 9-729位核苷酸所示轻链编码基因， 表明构建的重组载体正确， 记作重组表达载体 pIRES/ L4。
以 pIRES/ L4为模板， 用 Xba I和 Not I酶切， 回收质粒大片段， 记 作片段 1;以 PMD18-T/ VH+CH1为模板，用 Xba I禾卩 BaiM I酶切，回收 729bp 左右的片段 （即重链 H3 的 "可变区 +恒定区 1" 片段） ， 记作片段 2; 以 pIRES-Anti-CD20为模板， 用 B M I禾卩 Not I酶切， 回收 1502bp左右片 段 （即含有 "重链恒定区 2+恒定区 3" 片段） ， 记作片段 3; 将片段 1、 2 和片段 3连接， 得到重组载体， 转化大肠杆菌 DH5a， 挑单克隆、 提取质粒 并测序鉴定。 结果表明， 在载体 pIRES的 Xba I和 Not I酶切位点间 （沿 着从 I至 /b I的方向） 插入了 SEQ ID NO: 4所示重链编码基因， 在 载体 pIRES的 EcoR\和 Nhe I酶切位点间（沿着从 Nhe I至 EcoRY的方向） 插入了 SEQ ID NO: 2 中第 9-729位核苷酸所示轻链编码基因， 在轻链编 码基因和重链编码基因之间为 IRES (Internal ribosome entry site, 内部 核糖体进入位点序列， IRES能独立地招募核糖体对重链 mRNA进行翻译） 。 将 阳性重组表达载体记作 pIRES/ L4/ H3 (图 2) 。 二、 载体转化及抗体的表达
293T细胞 （293T 人胚肾 T细胞） 购自美国菌种保藏中心 （又称美国 模式菌种收集中心， ATCC)，产品目录号为 CRL-11268； Lipof ectamine 2000 购自 Invitrogen公司， 产品目录号为 12566014; HyQSFM4CH0培养基购 自 HyClone公司， 产品目录号为 SH30518, 02 ； rProtein A层析柱购自 GE 公司， 产品目录号为 17-5079-01。
将 293T细胞按 lX106/ml分别接种于直径为 10cm的培养皿中， 培养 皿中装有含 10%胎牛血清的 DMEM培养基， 37°C、 5%C02孵箱，培养。取 5w g 步骤一中得到的质粒 pIRES/ L4/ H3 转染 293T 细胞， 具体操作参照 Lipofectamine 2000的试剂说明。 得到重组细胞 293T- pIRES/ L4/ H3。
将重组细胞 293T- pIRES/ L4/ H3用无血清 DMEM培养基培养，培养 6〜 8h后吸出无血清培养基， 代之以 HyQSFM4CH0培养基。 相同条件下继续共 培养 84h， 间隔 12h收取一次细胞上清， 用 ELISA法初步检测抗体的表达。 扩大转染体系， 收集细胞培养上清 4〜5L， 调 pH至 6. 0〜7. 0， 用 0. 45 μ m 滤膜过滤， 再用 rProte in A层析柱纯化抗体， 具体操作参见产品说明书。
ELISA法： 用于检测未知抗原的双抗体夹心法：
1. 包被： 用 0. 05M PH9. 0碳酸盐包被缓冲液将抗体 （一抗为山羊抗 人 IgG) 稀释至蛋白质含量为 l〜10 w g / ml。 在每个聚苯乙烯板的反应孔 中加 0. lml， 4°C过夜。 次日， 弃去孔内溶液， 用洗涤缓冲液洗 3次， 每次 3分钟。 （简称洗涤， 下同）。
2. 加样： 加一定稀释的待检样品 0. lml于上述已包被之反应孔中， 置 37°C孵育 1小时。 然后洗涤。 （同时做空白孔， 阴性对照孔 （未转染质 粒的 293T 细胞上清） 及阳性对照孔 （西妥昔单抗注射液 （Erbi tux) ，进 口药品注册证号： S20050095。 德国默克公司， 产品批号： 7667201。 ）。
3. 加酶标抗体 （二抗为山羊抗人 IgG-HRP (山羊抗人 IgG-辣根过氧 化物酶） ） ： 于各反应孔中， 加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释 度） 0. lml。 37 °C孵育 0. 5〜1小时， 洗涤。
4. 加底物液显色： 于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0. lml , 37°C 10〜30分钟。
5. 终止反应： 于各反应孔中加入 2M硫酸 0. 05ml。
6. 结果判定： 可于白色背景上， 直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜 色越深， 阳性程度越强， 阴性反应为无色或极浅， 依据所呈颜色的深浅， 以 " + " 、 " - " 号表示。 也可测 0D值： 在 ELISA检测仪上， 于 450nm (若 以 ABTS显色， 则 410nm)处， 以空白对照孔调零后测各孔 0D值， 若大于规 定的阴性对照 0D值的 2. 1倍， 即为阳性。
试剂
(1) 包被缓冲液（PH9. 6 0. 05M碳酸盐缓冲液）： N¾C03 1. 59克 ，
NaHC03 2. 93克 ， 加蒸馏水至 1000ml 。
(2) 洗涤缓冲液（ΡΗ7· 4 PBS)： 0. 15M ： KH2P04 0. 2 克 ， Na2HP0 · 12H20 2. 9克 ， NaCl 8· 0克 ， KC1 0· 2克 ， Tween- 20 0. 05 %
0. 5ml ， 加蒸馏水至 1000ml 。
(3) 稀释液： 牛血清白蛋白（BSA) 0. 1克加洗涤缓冲液至 100ml 或 以羊血清、 兔血清等血清与洗涤液配成 5〜10%使用。
(4) 终止液（2M H2S04 ) ： 蒸馏水 178.3ml， 逐滴加入浓硫酸 (98%)21· 7ml。
磷酸钠盐缓冲液 （结合缓冲液） ： 用作 ProteinA纯化的结合缓冲液。 配制方法为： 取 1M Na2HP04 57.7 ml 禾卩 1M NaH2P04 42.3ml 混匀， 即为 0.1M pH7.0的磷酸钠盐缓冲液 100 ml， 再用蒸馏水稀释至 20mM备用。
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 （洗脱缓冲液） ： 用作 ProteinA纯化的洗脱 缓冲液。 配制方法为： 取 0.1M 柠檬酸 186ml 和 0.1M 柠檬酸钠 14 ml混 匀， 即为 0.1M、 pH3.0的柠檬酸盐缓冲液 200 ml。
用 rProtein A层析柱纯化抗体： 纯化介质： HiTrap rProtein A FF，
5 ml, 购自 GE公司， 目录号 17-5079-01， 详细使用说明书请参阅其公司 提供的说明书。
操作：
1)清洗， 用 1M NaOH和 dd 0先后清洗管道， 将小滤器用 0.1M NaOH 煮沸 lOmin后再用 dd 0浸泡 l〜2min;
2)设定程序， 连接 rProtein A亲和层析柱；
3)用 20mM结合缓冲液 （pH7.0) 平衡层析柱；
4)将已制备好的细胞上清以 1〜2 ml/min的流速上样；细胞上清制备： 以 12000g离心 15分钟， 取出上清， 经过 0.22um硝酸纤维素滤膜过滤除 菌。
5)上样将要结束时用 1M洗脱缓冲液 （pH3.0) 洗脱目的蛋白；
6)收集洗脱液（即目的蛋白），用 Trise碱（pH9.0)将其 pH调至 7.0， 电泳检测；
7)按步骤 1)清洗管道和小滤器。 三、 蛋白检测
山羊抗人 IgG-HRP抗体购自 Sigma公司， 产品目录号为（046K4801)； 山羊抗鼠 IgGl购自 SBA (Southern Biotechnology Associates, Inc.), 产品目录号为（1010-05);
SDS-PAGE: 取 15μ 1 洗脱液（即抗体溶液）在 12%凝胶上进行还原 SDS-PAGE电泳， 用考马斯亮兰 R-250染色。
结果显示， 纯化所得抗体的重链与轻链的相对分子质量分别为 25 X 103、 50 X 103 (图 3 ) ， 与预期结果一致。 图 3中， 泳道 1-4表示本发 明抗体 L4-H3 , 泳道 5表示阳性对照 西妥昔单抗。
免疫印迹分析：另取洗脱液在 12%凝胶上进行非还原 SDS-PAGE电泳后， 转移至硝酸纤维素膜上， 取出膜用封闭液 （含有 5%脱脂奶粉的 1 X PBST ) 在室温封闭 2h，用 1 : 5000稀释的羊抗人 IgG-HRP抗体与之孵育 2h (室温）， 再用 1 X PBST洗膜 3次。 最后用 ECL显色， 用 X线片进行曝光。 图 4中， 泳道 1表示阳性对照 西妥昔单抗； 泳道 2-5表示本发明抗体 L4-H3。
免疫印记 （12%) 分析表明， 该抗体可与山羊抗人 IgG特异性结合。 但是也出现了部分与抗人 IgG 二抗反应的一些非特异杂交带（包括商品化 的西妥昔单抗）， 这可能是纯化中有部分非全长的重链片段混合所至。 但 是上述结果不影响抗体亲和力的评价。 上述抗体均不与山羊抗鼠 IgGl 反 应。
由于本抗体的轻链和重链在一个表达载体上， 成比例表达， 自动组成 含两条轻链和重链的完整抗体。
四、 蛋白表达量
按照步骤一和二中方法获得表达抗体 L4-H3的细胞培养上清 4〜5L， 用 rProte in A层析柱纯化抗体， 检测抗体在 293T细胞中的表达量， 结果 为 0. 6 g/ml洗脱液。
实施例 3、 抗体的功能
一、 Biacore检测抗体与抗原的结合能力
Sensor Chip CM5购自 BD公司，产品目录号为 Br- 1000- 14； BD BioCoat™ Matrigel™ Invas ion Chamber购自 BD公司， 产品目录号为 354480.
EGFR蛋白购自 Sigma公司， 产品目录号 E2645-500UN。
用 Biacore3000设备测定抗体与 EGFR的亲和力。配制不同 pH值（4. 0， 4. 5， 5. 0和 5. 5)的 lOmmol/ L NaAc稀释 EGFR蛋白， 在 CM5芯片上做预 浓缩， 选择最适 pH值的 NaAc稀释蛋白。 将纯化的抗体 （即实施例 2中步 骤二得到的洗脱液）共价偶联于 CM5传感芯片上，流动相为 HBS-EP (pH7. 4)， 流速 20 μ l/min，取五种浓度的抗体（0， 10. 55， 21. U 42. 2和 84. 4nmol/L ) 与 EGFR蛋白结合亲和力的检测。 亲和力用 BiaCOTe3000附带软件计算。 同时以西妥昔单抗为对照。
实验设 3次重复， 结果取平均数。
结果显示抗体对抗原 EGFR具有良好的结合活性，亲和力为 2. 75 X 10— 9 M。 西妥昔单抗的亲和力为 1. 1 X 10 M。 结果表明本发明人源化抗体保持 了亲本良好的结合活性， 克服了鼠源抗体的不良反应， 具有很好的临床应 用价值。 二、 肿瘤细胞侵袭实验
SW480 细胞购自美国菌种保藏中心 （又称美国模式菌种收集中心，
ATCC ) ， 产品目录号为（ATCCS Number : CCL-228™)； 西妥昔单抗抗体购自 德国默克里昂制药公司 （原产地英文商品名： ERBITUX; 原产地英文药品 名： Cetuximab; 中文参考商品译名： 爱必妥； 分子结构名： 西妥昔单抗； 产地国家： 德国； 生产厂家： 德国默克里昂制药公司） 。
用 RPMI 1640培养基（购自 Invitrogen公司， 目录号为 31800-022)培 养 SW480细胞。用无血清 RPMI 1640培养基水化侵袭室（invasion chamber) , 孵育 2h ( 37°C， 5% C02 ) 。 弃无血清 RPMI 1640, 在侵袭室 （BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Chamber购自 BD公司， 产品目录号为 354480) 的孔 室加入 750 μ 1 RPMI 1640 (含 10%血清）； 在插入（insert )室中加入 475 μ 1 RPMI 1640 (含 1%血清）， 然后向其中加入 25 μ 1 消化的 SW480细胞 （细胞 数〉 105/500 μ 1 ) ， 最后分别向插入室中加入阴性对照 PBS和本发明抗体， 每个样品均有两个复孔， 抗体终浓度均为 100ng/ml。 孵育 24h后， 将未能 穿透侵袭盒基底膜的细胞用无菌棉签擦去； 穿透基底膜的细胞固定、染色、 室温晾干后， 光镜计数。
统计学处理： 在 100倍显微镜下计算每个插入室中样品的相应 3组细 胞数。 运用 SPSS12. 0统计软件对细胞侵袭实验数据进行 t检验， 将本发 明抗体与人 IgG组比较。 若结果为 P〈0. 05,两种处理效果差异有统计学意 义。
实验设 3次重复， 结果取平均数。 t检验分析结果显示（表 1 ) ：人 IgG 组与本发明抗体组的 P值小于 0. 01，抗 EGFR抗体与对照组人 IgG组相比， 差异显著， 对 SW480肿瘤细胞的侵袭具有显著的抑制作用
表 1、 细胞侵袭实验的 ί检测结果
组别 n 细胞平均数
(个）
人 IgG组 8 146±16.531 本发明抗体组 8 67±15.334*
注： 与人 IgG组对比， *ρ<ο. 01
工业应用
实验结果证实， 本发明抗体具有良好的抗原结合活性和抑制肿瘤细胞 生长迁移侵袭能力； 而国外市场上常见抗 EGFR 人一鼠嵌合抗体西妥昔单 抗的亲和力 1. 1 X 10 Μ。 本发明的人源化抗体能更好与 EGFR结合， 从而 保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链， 使轻链和重链的表达比例更接近 1 : 1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。 综上所述， 本发明抗体及其制备方法在预防和 /或治疗肿瘤的领域将有广 阔的应用前景。

Claims

权利要求
1、 一种抗体， 由轻链和重链构成， 所述重链由重链可变区和重链恒 定区连接而成； 所述重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3中第 1-145 位所示； 所述重链恒定区为人源抗体 IgGl 的重链恒定区； 所述轻链的氨 基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。
2、 根据权利要求 1 所述的抗体， 其特征在于： 所述抗体的重链的氨 基酸序列如 SEQ ID NO: 3所示。
3、 权利要求 1或 2所述抗体的编码基因；
或， 所述轻链的编码基因为如下 I ) 、 II ) 或 III) 所示：
I ) 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2中第 85- 726位所示或 SEQ ID NO:
2中第 9-729位所示；
II ) 在严格条件下与 I ) 限定的匪序列杂交且编码所述轻链的匪 分子；
III)与 I )限定的 DNA序列具有 70%以上的同源性且编码所述轻链的 DNA分子；
或， 所述重链的编码基因为如下 1) 、 2) 或 3) 所示：
1) 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 4所示；
2)在严格条件下与 1)限定的 DNA序列杂交且编码所述重链的 DNA分 子；
3) 与 1) 限定的匪序列具有 70%以上的同源性且编码所述重链的
DNA分子。
4、 含有权利要求 3 所述编码基因的重组载体、 重组菌、 重组细胞或 表达盒。
5、 根据权利要求 4所述的重组载体， 其特征在于： 所述重组载体为 按照包括如下步骤的方法制备得到的重组表达载体： 将所述轻链的编码基 因沿着从 A¾e l酶切位点至 酶切位点的方向插在载体 pIRES 的 A¾el和 ^^ 7?1酶切位点间， 得到重组载体， 记作中间重组载体； 将所述 重链的编码基因沿着从 ¾a l酶切位点至 Not I酶切位点的方向插在所述 中间重组载体的 禾卩 Not I酶切位点间， 得到的重组载体即为目的重 组表达载体。
6、 根据权利要求 4所述的重组细胞， 其特征在于： 所述重组细胞是 将权利要求 5所述重组表达载体导入出发细胞得到的重组细胞；
和 /或， 所述出发细胞为 293T细胞。
7、 制备权利要求 1或 2所述抗体的方法， 包括如下步骤： 培养权利 要求 6所述重组细胞， 收集上清液， 即得到权利要求 1或 2所述抗体。
8、 一种抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂、 一种抑制肿 瘤细胞侵袭的抑制剂或一种预防和 /或治疗肿瘤的产品， 其活性成分为权 利要求 1或 2中所述抗体、 权利要求 3所述编码基因、 权利要求 4或 5中 所述重组载体、 权利要求 4所述重组菌、 权利要求 4或 6中所述重组细胞 和 /或权利要求 4中所述表达盒；
和 /或， 所述肿瘤为结肠癌； 所述肿瘤细胞为 SW480细胞。
9、 权利要求 1或 2中所述抗体、 权利要求 3所述编码基因、 权利要 求 4或 5中所述重组载体、 权利要求 4所述重组菌、 权利要求 4或 6中所 述重组细胞和 /或权利要求 4 中所述表达盒在制备抑制表皮生长因子受体 信号转导途径的抑制剂中的应用； 权利要求 1或 2中所述抗体、 权利要求 3所述编码基因、 权利要求 4或 5中所述重组载体、 权利要求 4所述重组 菌、 权利要求 4或 6中所述重组细胞和 /或权利要求 4中所述表达盒在制 备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用； 权利要求 1或 2中所述抗体、 权 利要求 3所述编码基因、 权利要求 4或 5中所述重组载体、 权利要求 4所 述重组菌、 权利要求 4或 6中所述重组细胞和 /或权利要求 4中所述表达 盒在制备预防和 /或治疗肿瘤产品中的应用；
和 /或， 所述肿瘤为结肠癌； 所述肿瘤细胞为 SW480细胞。
10、 一种蛋白质片段及其编码基因；
所述蛋白质片段的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3中第 1-145位所示； 所述蛋白质片段的编码基因为如下 a ) 、 b ) 或 c ) 所示：
a ) 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 4中第 1-435位所示；
b )在严格条件下与 a )限定的 DNA序列杂交且编码所述蛋白质片段的 DNA分子；
c ) 与 a ) 限定的 DNA序列具有 70 %以上的同源性且编码所述蛋白质 片段的 DNA分子。
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