WO2012089207A2 - Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend l-dna - Google Patents

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WO2012089207A2
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical
  • a composition containing an L-DNA the use of an L-DNA for the preparation of a pharmaceutical composition, and a process for producing such a pharmaceutical composition.
  • aptamers are isolated from nucleic acid libraries by the SELEX method
  • Aptamers have the purpose in the therapeutic field, i.a. to bind and thereby inhibit unwanted metabolites. Only for example, oncogenic gene products are mentioned for this purpose. In the
  • aptamers have unfavorable pharmacokinetics, i.e. be broken down very quickly
  • aptamers are relatively small molecules anyway, which are therefore excreted relatively quickly on the kidney.
  • Spiegelmers are aptamers in the core, but differ in that they are formed from L-nucleotides. Spiegelmers can be single or double-stranded.
  • the use of the L-nucleotides prevents degradation by endogenous nucleases and thus greatly improves the pharmacokinetics, i.e. the residence time in the serum is prolonged.
  • Boisgard, R et al. Eur Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32: 470-477 (2005) that non-functional aptmers are metabolically completely stable even over a period of 2 hours.
  • the diagnostic use of Spiegelmeren is described, wherein the Spiegelmer with a
  • radioactive reporter substance is coupled.
  • Target molecule specific Spiegelmeren can
  • physiological side reaction for example an immune reaction and / or an undesired one
  • mRNA or other non-coding nucleic acids known. These include, but are not limited to, antisense nucleic acids, siRNA, miR A, piRNA, aptamers, etc.
  • Inhibition of such endogenous nucleic acids can be controlled, inhibited or redirected metabolic processes, which is relevant for example in connection with tumor-associated RNA molecules, but also in other medical fields.
  • a tumor-associated gene for example, the H19 gene may be mentioned.
  • An example of a non-tumor-associated gene is the gene coding for phospholamban, which plays an important role in connection with heart failure.
  • L-DNA is known per se, for example from the
  • Nucleic acids are described as molecular tags.
  • the invention is based on the technical problem to provide improved means for cutting Spiegelmeren and endogenous nucleic acids.
  • the invention teaches the use of an L-DNA for the preparation of a pharmaceutical composition, wherein the ILDNA is preferably for binding to an L-RNA,
  • an antisense reaction Watson-Crick inhibitory reaction
  • optionally capable of cleaving the L-RNA in the region of a target sequence of L-RNA in particular for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of undesired physiological side reactions, in particular immune reactions and / or undesired enzymatic or antisense reactions of L-RNA with endogenous RNA (including a regulatory RNA) due to the administration of a therapeutic molecule containing the L-RNA.
  • endogenous RNA including a regulatory RNA
  • Target D-RNA for example in an antisense
  • Target sequence is capable.
  • the invention is based initially on the recognition that Contrary to previous assumptions, aptmers are not necessarily free from side reactions, but rather may be able to
  • the invention is based on the further finding that L-DNA is surprisingly able to cut or bind to endogenous D-nucleic acids, RNA, such as DNA. This is not to be expected automatically.
  • L-DNAs are particularly stable against
  • a surprising advantage of L-DNA over L-RNA is that the activity of L-DNA against L-RNA is higher in cells, including the
  • L-DNA ie L-DNzyme, which specifically cut an administered Spiegelmer or thereto bind inhibiting and so their physiological
  • Spiegelmers are: Spiegelmer, NOXC89, NOXA42, NOXA50, NOXB11, NOXA12, NOXE36, NOXF37 (all NOXXON AG),
  • L-DNA unwanted side reaction from the metabolism can be quickly, effectively and highly selectively removed, again with extremely low risk of side effects of the administration of L-DNA.
  • the latter is not only based on the construction of L-DNA from L-DNA.
  • a specific L-DNA be constructed, which cuts a target sequence of the RNA molecule and this cleaves (action as a ribozyme), or binds thereto inhibiting (antisense reaction).
  • An essential feature of such an L-DNA is thus the sequence-specific binding to the target sequence.
  • a partial sequence of an L-DNA can be created by hybridizing the partial sequence of the L-DNA containing, for example, a cleavage site, with the target sequence. Therefore, in the context of the invention, it is not appropriate to use only certain L-DNA partial sequences with respect to certain
  • target sequences and L-DNA partial sequences given in the examples are therefore only examples and those skilled in the art can easily determine the appropriate, namely hybridizing L-DNA partial sequence for each given target sequence of a spiegelmer and the L-DNA on the basis of information for Synthesize L-DNA partial sequence by conventional means.
  • the therapeutic molecule may be a spiegelmer, or the L-RNA may be covalently bound to an aptamer.
  • the therapeutic molecule may also contain an L-DNA (in addition to a
  • Aptamer for example or consist thereof.
  • a combination aptamer / aptamer can be present, for example, in the case of a nuclease-stabilized aptamer. Then the therapeutic benefit of the invention is that by cutting the L-RNA or L-DNA, the aptamer is made available for nucleases, which then ultimately a possibly causing side effects aptamer from the serum can be eliminated comparatively short term.
  • the L-DNA is covalently bound to an aptamer, an antibody or a peptide or protein.
  • the aptamer or the antibody may for example be selected so that due to the interactions of the aptamer or the antibody with cell surfaces, the entire construct of L-DNA and aptamer or antibody is introduced into the cell.
  • a suitable L-DNA may be directed against a conserved cleavage site in the substrate sequence and may itself contain conserved nucleotides, as shown in Figure 1, in particular Fig. 1a.
  • the pharmaceutical composition contains the L-DNA in at least the dose corresponding to the dose of the administration of the L-RNA, preferably at a dose of 2 to 10 times the number of moles of the dose of the dose corresponds to the L-RNA.
  • An overdose, compared to the dose of L-RNA, will be recommended to ensure that all L-RNA to be eliminated is abreacted.
  • the pharmaceutical composition additionally contains a nucleic acid, in particular a 5- to 100-mer, preferably a 5- to 25-mer, which belongs to the
  • the invention relates to a
  • L-DNA according to the invention can also be used for the cleavage of (endogenous or else exogenous, for example from viral or bacterial sources in the course of an infection) nucleic acids, essentially RNA, but also DNA, are used, or to inhibit the same by antisense
  • RNA or DNA can be used to treat diseases associated with a particular RNA or DNA, or the overexpression of a coded thereby
  • the L-DNA is thus used as an inhibitor with regard to this
  • binding RNA or DNA within the scope of the invention insofar irrelevant as to allow arbitrary targets to be inhibited. It is only necessary, the L-DNA or its sequence of the sequence of
  • any indications can be detected, provided that the disease to be treated causes the relevant target sequence
  • the invention relates to a method for
  • composition wherein a sequence of L-
  • Deoxyribonucleotides are generated and synthesized, which bind to a given sequence of L-ribonucleotides or a predetermined sequence of D-ribonucleotides or D-deoxyribonucleotides,
  • the L-DNA is typically with galenic auxiliary and / or
  • L-DNA which promote endocytosis
  • one or more physiologically acceptable auxiliaries and / or excipients can be mixed with the L-DNA and the mixture galenically for local or systemic administration, in particular orally, parenterally, for infusion or infusion into a target organ, for injection (zBiV, im, intracapsular or intralumbar), for application in tooth pockets (space between tooth root and gums) and / or prepared for inhalation.
  • zBiV im, intracapsular or intralumbar
  • the choice of additives and / or adjuvants will depend on the chosen dosage form.
  • Composition can be carried out in the usual way. Come as counterions for ionic compounds
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (icro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or solutions for injection (iv, ip, im, sc) or nebulization (aerosols ), Formulations for dry powder inhalation, transdermal systems, and
  • nanoparticles of D and L nucleic acids for example for the cell targeting of Spiegelzymes and Spiegelmers or aptamers (Seeman, NC, Nano Lett. 10 (6): 1971-1978 (2010); , Nature 478 (7368): 225-228 (2011); Sigh, W. Synapse 65 (12): 1289-97 (2011) Zhao, W. et al., Nanotechnology 22 (49): 490201 (2011); JZ, Adv Drug Deliv. Rev. 56 (11): 1533-1536 (2004); Lin, C, et al., Biochemistry 48 (8): 1663-1674 (2007))
  • excipients for example, sodium carbonates
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be prepared by at least one substance combination used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiological
  • the diluents are polyglycols, water,
  • Dimethyl sulfoxide (for example for preparations for the treatment of skin diseases or rheumatism) and
  • Buffer solutions in question are, for example, N, N'-dibenzylethylenediamine, diethanolamine, ethylenediamine, N-methylglucamine, N-benzylphenethylamine, diethylamine, phosphate, sodium bicarbonate, or
  • Physiologically acceptable salts are salts with inorganic or organic acids, e.g. Lactic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid,
  • Citric acid Citric acid, p-toluenesulfonic acid, or with inorganic or organic bases, such as NaOH, KOH, Mg (OH) 2 ,
  • Diethanolamine, ethylenediamine, or with amino acids such as arginine, lysine, glutamic acid, etc. or with inorganic salts such as CaCl 2 , NaCl or their free ions, such as Ca 2+ , Na + , Pb ++ , Cl " , S0 4 2 ⁇ or corresponding salts and free ions of the Mg ++ or Mn ++ , or combinations thereof, are prepared by standard methods, preferably a pH in the range between 5 and 9, in particular between 6 and 8, set.
  • Target sequence of a gene encoding endogenous target D-RNA or target D-DNA, in particular for antisense reaction, and optionally capable of cleaving said target sequence comprises.
  • the L-DNA is capable of cleaving a (or for binding, in particular antisense reaction, to a) target sequence of a coding for a gene of the microorganism target D-RNA or target D-DNA.
  • Suitable microorganisms include viruses, bacteria and fungi.
  • the L-DNA can bind to or cleave nucleic acids of any microorganism at least partially known gene sequences are used, wherein areas of the gene sequences for the purpose
  • Cleavage can be selected which, for example, the activity of the microorganism and / or its
  • the L-DNA also for inhibition by antisense reaction with or cleavage of D-RNA, in particular mRNA or
  • Regulatory RNA for example, but not exclusively siRNA, microRNA, shRNA, ncRNA, tRNA, rRNA, etc., can be used, but also for the cleavage of D-DNA or binding thereto. As a result, genes or proteins encoded thereby or coding or noncoding RNAs can be inhibited. This is from
  • this variant has the advantage that the cleavage of the target sequence or the binding thereto takes place with very high specificity and thus also no other interference with the regulatory system takes place.
  • side effects like them
  • inhibitory D-nucleic acids such as siRNA
  • L-RNA ribozymes and L-DNAzymes do not require helper molecules, unlike the siRNAs (Risc factors, etc.), which causes unwanted Side reactions are drastically reduced.
  • an L-DNA can be used not only for binding to another nucleic acid, but in principle analogous to the known fields of application of aptamers from D-nucleic acids. This means that in principle any target molecule can be bound in an organism and thus inhibited by means of an L-DNA according to the invention.
  • a target binding L-DNA is available in a following procedure.
  • a selected target molecule is attached to an immobile (resp.
  • Solid phase for example, also magnetic beads
  • the screening assay comprises in addition to the immobile phase a mobile phase (usually an aqueous solution in which
  • Nucleic acids and the target molecule are stable and can bind), which with the immobile phase in
  • the mobile phase contains an L-DNA library, ie Polynucleotides, typically 10 to 500 nucleotides in length, whose sequences vary, are usually randomized.
  • L-DNA libraries can be prepared by conventional and from the generation of D-DNA libraries known synthesis method. With the contacting, such L-DNA molecules bind to the target molecule, which by their sequence are capable of stable Van der Waals
  • Bindings to the target molecule to enter The
  • Bond strengths are typically included
  • Dissociation constants with values below 100 nmol, better below 100 pmol, often even below 1 pmol.
  • the mobile phase (with the non-binding or only weakly binding nucleic acids) is separated from the immobile phase, for example by means of one or more washing process stages. This is followed by immobile phase with target molecules
  • D-DNA molecules contacted with a D-DNA library D-DNA hybridizing to the L-DNA bound to the target molecule binds to the L-DNA, resulting in a complex of target molecule / L-DNA / D-DNA. Unbound D-DNA is removed again with the mobile phase. From the complex thus obtained, the D-DNA is then eluted again in the usual manner, i. transferred to a mobile phase.
  • the D-DNA molecules thus obtained can now optionally
  • amplified for example by PCR
  • the complementary L-DNA can then be determined and synthesized.
  • the L-DNA can be eluted from the target molecule and labeled with a elsewhere in this description Sequencing methods are sequenced. The procedure described in this section can
  • the target molecule instead of being bound to the immobile phase, bound to a marker molecule.
  • the separation of unbound L-DNA from the complex target / bound L-DNA is then carried out by conventional methods by binding of the marker molecule and separation of molecules which this
  • Bind affinity to the target molecule can then be used in the context of an inventive
  • Indications are used. The indication will then depend on which target molecule has been causally recognized as causally related to a disease and is to be inhibited for the treatment or prophylaxis thereof.
  • an L-RNA binding to a target can also be isolated or determined.
  • an L-RNA library is used instead of an L-DNA library.
  • a target molecule for example a target molecule, a virus, a bacterium, a fungus or a other cell (or fragments thereof) binding L-DNA or L-RNA isolated or determined and produced.
  • the L-nucleic acid library for example a target molecule, a virus, a bacterium, a fungus or a other cell (or fragments thereof) binding L-DNA or L-RNA isolated or determined and produced.
  • the L-nucleic acid library for example a target molecule, a virus, a bacterium, a fungus or a other cell (or fragments thereof) binding L-DNA or L-RNA isolated or determined and produced
  • nucleic acids optionally a coupling molecule or marker molecule is bound, for example, biotin to the 5 'end.
  • Target molecule is attached to a solid phase
  • Nucleic acid library contacted. In the process, those nucleic acids which bind to the target molecule and have a high binding affinity thereto.
  • the solid phase becomes one or more washing steps
  • L-DNAs can also be used for testing for potential side effects of L-DNA.
  • L-DNAs can also be used for testing for potential side effects of L-DNA.
  • Test procedure is the L-DNA (or a larger
  • the L-nucleic acid is bound to a solid phase. This can be done, for example, in that the nucleic acid is a coupling or
  • the solid phase carries a molecule complementary to the coupling molecule and this binding molecule, such as avidin or streptavidin.
  • This binding molecule such as avidin or streptavidin.
  • the solid phase is washed in one or more washing steps, removing the unbound D-DNA. Then the bound D-DNA is released from the L-nucleic acid.
  • the complementary sequence of the L-nucleic acid can then be determined from the D-DNA sequence thus obtained.
  • an L-nucleic acid in particular L-nucleic acid RNA
  • the nucleic acid carries at one end, for example at the 5 "end, a coupling or marker molecule (as described above), for example biotin
  • the nucleic acid is then broken down into a" ladder ", ie by hydrolysis different fragments of the nucleic acid are obtained ideally, from 1 base to the base number of the complete nucleic acid.
  • L-RNA this can be done in the alkaline, pH typically> 8, usually 8.5-10.
  • a commercially available hydrolysis buffer with KOH or sodium bicarbonate can be used.
  • the fragments thus obtained, which still carry the coupling molecule are then bound to a solid phase.
  • the solid phase contributes to the coupling molecule complementary and this binding molecule, such as avidin or streptavidin.
  • the solid phase then becomes one or more
  • nucleic acid fragments are removed, which do not carry the coupling molecule. The result is the "ladder" of labeled nucleic acid fragments, which are then eluted from the solid phase and
  • L-DNA or Spiegelzyme can also be used to determine accessible mRNA sequences. Because the Determination of such mRNA sequences that are accessible to siRNAs, miroRNAs and also Spiegelzymen very difficult, since a secondary structure prediction using computer technology is very uncertain. This is due to the fact that too little is known about the rules of three-dimensional folding of RNA molecules, so that the
  • Scissors of the prior art such as Ribozymes, siRNAs, etc., are for stability reasons or due to the fact that these scissors helper molecules
  • L-DNA can also be used for non-pharmaceutical purposes.
  • One application is the marking of
  • the L-DNA is applied to the subject or person and to her
  • the first group includes the so-called
  • Security and / or valuable documents such as passports, identity cards, driver's licenses,
  • the second group includes items which represent a material value and are to be secured against theft, such as jewelry, watches, miscellaneous
  • the marking of persons can, for example be desirable in case of attack.
  • Spraying devices for example, be provided for marking unauthorized premises entering or leaving the premises. This is a spray device, which with an alarm system
  • Alarm system in an alarm state of the alarm system the presence of a person within reach of the
  • Spray device detected. Then the person is sprayed with the solution contained in the spraying device, which in turn contains the L-DNA, and the
  • D-nucleic acids for such purposes is known, however, they have the disadvantage that they can be degraded by an unauthorized person, for example by means of nuclease. This disturbs in particular in such cases, where an object against theft is to be secured, or where a person has been marked, as by the employment of a
  • L-nucleic acids destroys the mark and so removed.
  • the use of L-nucleic acids also has the great advantage that they can not (as opposed to D-nucleic acids), be incorporated into the human genome, so the risk of a possible induction of a disease, in particular
  • the invention described herein in this respect, relates to a method for marking an object or a person, wherein the object or the person or their clothing is provided with an L-DNA and wherein the L-DNA is fixed on or in this object, the person or their clothing becomes. she
  • Article or a person wherein the article or the person or their clothing is subjected to an analysis for the presence of an L-DNA, optionally in addition to its sequencing.
  • marking here means one
  • Marking an object or person by attaching a feature on or to that object or person who was not previously on or on the object or person.
  • the feature is one of a given structure and which can not be affected by circumstances other than (intentional) marking on the subject or person.
  • a solution in particular aqueous solution, containing the L-DNA on the object or the person or their
  • the L-DNA in a preparation which additionally contains a dissolved or dispersed binder.
  • Base preparations are basically all not yet cured liquid or pasty paint binder preparations, adhesive preparations or the like, provided that their pH is less than 9, better less than 8.
  • All solvents in paint technology or as solvents also come as solvents
  • Adhesive technology usual solvents in question. This also applies to the usable binders and customary additives.
  • This preparation is applied to the object to be marked or to the person to be marked.
  • the solution or preparation to be administered per ml preferably contains between 1 or 10 A 1 and 10 A 16, for example between 10 A 3 and 10 A 12, in particular between 10 A 3 and 10 A 9 molecules of L-DNA.
  • the L-DNA carries at the 5 ' or at the 3 ' end a covalently bonded photoluminescent reporter molecule group, which is further preferably selected with the proviso that the luminescence, in particular fluorescence, upon excitation with UV radiation he follows.
  • Reporter molecule groups which can be employed are all photoluminescent molecular groups customary in biochemistry. Is a marked according to the invention
  • the L-DNA can be on
  • the L-DNA may contain in development of this invention at least one invariant sequence block and / or a variable sequence block.
  • the invariant sequence block is then the same for all or at least one set of labels with the L-DNA, i. all labels contain a partial sequence with the sequence of this sequence block.
  • Sequence block can then be individualizing. This is useful if the detection by illumination, for example, with UV should also be dependent on the presence of an L-DNA with said sequence block. This distinguishes you from one
  • Luminescent regardless of the presence of an L-DNA according to the invention, can occur.
  • Structure of a molecular beacon has. This is a single-stranded nucleic acid with hairpin structure or stem-loop structure, wherein the ends forming the stem on the one hand Luminescent molecule and, opposite one
  • Quencher such as dabcyl wear. At least one of the ends is an invariant sequence (sequence block) (typically 5 to 20 base pairs long). In the non-hybridized state of L-DNA is the
  • the L-DNA of the label is not present as a single strand, but an end (the reference to an end always means either 3 or 5 ') of one
  • Luminescent molecule is arranged to the luminescence to suppress.
  • the length of this complementary L-DNA is at least 2, more preferably at least 5 bases shorter than the length of the invariant sequence block.
  • the luminescent molecule lights up and the marking is visible or detectable by apparatus. Thereafter, as above eluted and sequenced again, to determine a possible variable sequence.
  • the invention thus also comprises a register system comprising a database, wherein in the database variable sequence blocks of different L-DNA
  • Marks are recorded and assigned to a person, company or authority.
  • Register system can be one of a marker
  • FIG. 3 Comparison of MgCl 2 -
  • FIG. 6 Quantification of the results from FIG.
  • Figure 7 direct comparison of the activities of L-DNAzyme and L-ribozyme at different
  • FIG. 8 Quantification of the results from FIG.
  • Figure 9 subject of Figure 5, but after 48h
  • RNA or DNA were incubated with 10 ⁇ reaction mixture in the presence of 2 ⁇ DNAzym or RNAzym in 50 mM Tris. HCL buffer, pH 7.5, incubated at 20 ° C. for 2 hours ⁇ ratio of DNAzyme or RNAzyme / target consequently 10: 1).
  • target RNA or DNA and DNAzyme or RNAzyme were denatured for 2 minutes at 72 ° C and slowly (1 ° C / min) in the heating block to 25 ° C
  • the synthesis products had a purity of more than 90%.
  • AI DNAzym- or RNAzym sequences were selected in accordance with the target sequences, the variable regions of the DNAzyme or RNAzyme to the interface triplet and synthesized the RNAzyme or DNAzyme sequences.
  • the synthesis products had a purity of over 85%.
  • L-DNAzyme is able to cut both the L-target sequence and the D-target sequence.
  • Target intersects, but not D-DNAzyme, the L-target.
  • FIG. 4 once again shows measurements corresponding to FIG. 3, wherein additionally the interface at
  • RNAzymes in cells In FIG. 5, HeLa cells were transfected with EGFP plasmid, thus containing a D target. In particular, it can be seen that L-DNAzyme inhibits flourescence more strongly than L-RNAzyme, or else as DR-SFAzyme or D-DNAzyme. This finding is shown in FIG. 6
  • FIGS. 7 and 8 show that L-DNAzyme is also active at 48 h
  • RNAi RNAi is used.
  • Corresponding L-DNAzymes can be easily constructed on the basis of the known sequence information on human phospholamban and it follows compared to the known therapy methods, the advantages of better stability of the L-DNAzyme
  • Another target in the human organism is, for example, the noncoding H19 RNA.
  • This gene becomes differential, for example in cancer cells
  • L-DNAzyme molecule can be selected, which known and suitable sites of H19

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer L-DNA, welche zur Bindung an eine L-RNA befähigt ist, insbesondere in einer antisense Reaktion, und optional zur Spaltung der L-RNA im Bereich einer Targetsequenz der L-RNA befähigt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von unerwünschten physiologischen Nebenreaktionen aufgrund der Gabe eines therapeutischen Moleküls enthaltend die L-RNA. Mit der L-DNA kann aber auch alternativ eine endogene Target RNA oder DNA gespalten werden.

Description

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend L-DNA
Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische
Zusammensetzung enthaltend eine L-DNA, die Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik Aptamere sind meist doppelsträngige D-Nukleinsäuren, welche spezifisch an ein beliebiges Targetmolekül binden, analog einer Antikörper/Antigen-Reaktion
(Ellington, A.D. et al . , Nature 346:818-822 (1990)) . Für ein vorgegebenes Targetmolekül spezifische
Aptamere werden beispielsweise durch das SELEX- Verfahren aus Nukleinsäurebibliotheken isoliert
{Tuerk, C. et al., Science 249:505-510 (1990)).
Aptamere haben im therapeutischen Bereich den Zweck, u.a. unerwünschte StoffWechselprodukte zu binden und dadurch zu inhibieren. Lediglich beispielsweise seien hierfür onkogene Genprodukte genannt. Bei der
therapeutischen Anwendung von Aptameren nachteilig ist, dass diese eine unvorteilhafte Pharmakokinetik aufweisen, i.e. sehr schnell abgebaut werden,
beispielsweise durch endogene Nukleasen. Unabhängig hiervon sind Aptamere ohnehin relativ kleine Moleküle, welche daher vergleichsweise schnell über die Niere ausgeschieden werden.
Spiegelmere sind im Kern Aptamere, unterscheiden sich davon jedoch dadurch, dass sie aus L-Nukleotiden gebildet werden. Spiegelmere können einzel- oder doppelstängig sein. Durch den Einsatz der L- Nukleotiden wird ein Abbau durch endogene Nukleasen verhindert und so die Pharmakokinetik erheblich verbessert, i.e. die Verweilzeit im Serum verlängert. So ist in der Literaturstelle Boisgard, R et al . , Eur Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32:470-477 (2005) beschrieben, dass nicht -funktioneile Spiegelmere metabolisch auch über einen Zeitraum von 2 Stunden völlig stabil sind. In dieser Literaturstelle ist auch der diagnostische Einsatz von Spiegelmeren beschrieben, wobei das Spiegelmer mit einer
beispielsweise radioaktiven Reportersubstanz gekoppelt ist .
Die Identifizierung von für ein vorgegebenes
Targetmolekül spezifischen Spiegelmeren kann
beispielsweise wie in der Literaturstelle Klussmann, S. et al., Nat Biotechnol 14:1112-1115 (1996)
beschrieben erfolgen. Zu den Spiegelmeren und deren therapeutische Anwendungsmöglichkeiten wird auch auf die Literaturstelle Vater, A. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 6:253-261 (2003) verwiesen. In der therapeutischen Anwendung von Spiegelmeren ist bislang davon ausgegangen worden, dass Spiegelmere nicht immunogen sind (Wlotzka et al . , Proc Natl Acad Sei USA 99:8898-8902 (2002)). Allerdings zeigen
Untersuchungen, die in der vorliegenden Beschreibung präsentiert werden, dass L-Nukleinsäuren in einem Organismus durchaus nicht notwendigerweise
nebenwirkungsfrei sind. Hieraus folgt, dass bei dem Einsatz von Spiegelmeren durchaus ein nicht
vernachlässigbares Risiko einer unerwünschten
physiologischen Nebenreaktion, beispielsweise einer Immunreaktion und/oder einer unerwünschten
enzymatisehen Reaktion mit endogener RNA
{einschließlich einer regulatorischen RNA) , oder auch einer antisense- Inhibierung (Watson-Crick-Reaktion) einer endogenen Nukleinsäure, bei Verabreichung an einen Patienten besteht. Insbesondere im Lichte der in der klinischen Phase 1 gemachten negativen Erfahrungen mit dem monoklonalen Antikörper TGN1412 und vor dem Hintergrund, dass die Verweilzeit von Spiegelmeren aufgrund der vorstehend genannten Zusammenhänge vergleichsweise sehr hoch ist, wäre es wünschenswert, ein Antidot für ein einzusetzendes Spiegelmer bei der Gabe des Spiegelmers bereit zu halten, damit bei Auftreten einer unerwünschten physiologischen
Nebenreaktion unverzüglich das Antidot verabreicht und so der (biologisch aktive) Spiegelmer- Pegel im Serum kurzfristig gesenkt werden kann.
Aus anderen Zusammenhängen, nämlich der Ribozym- katalysierten stereoselektiven Diels-Alder Reaktion sind L-Ribozyme bekannt, wozu auf die Literaturstellen Seelig, B. et al . , Angew.Chem. Int., 39:4576-4579
(2000) und Seelig, B. et al . , Angew. Chem. 112:4764- 4768 (2000) verwiesen wird. Es sind des Weiteren die verschiedensten Ansätze zur Inhibierung von endogenen Nukleinsäuren,
beispielsweise mRNA oder anderen nicht codierenden Nukleinsäuren bekannt. Diese umfassen beispielsweise, aber nicht abschließend antisense Nukleinsäuren, siRNA, miR A, piRNA, Aptamere usw. Durch die
Inhibierung solcher endogenen Nukleinsäuren können Stoffwechselprozesse gesteuert, gehemmt bzw. umgelenkt werden, was beispielsweise im Zusammenhang mit Tumorassoziierten RNA Molekülen, aber auch in anderen medizinischen Bereichen relevant ist. Als Beispiel eines Tumor-assoziierten Gens sei beispielsweise das H19 Gen genannt. Als Beispiel eines nicht-Tumor- assoziierten Gens sei das für Phospholamban codierende Gen genannt, welches im Zusammenhang mit Herzversagen eine wichtige Rolle spielt.
Aus der Literaturstelle WO 2010/088899 A2 ist es bekannt, L-Ribozyme zur Spaltung von Spiegelzymen (als Antidot) und/oder von endogenen RNA Molekülen
einzusetzen.
L-DNA ist per se bekannt beispielsweise aus der
Literaturstelle G. Hayashi et al . , Nucleic Acid Symp Ser 49 (1) ; 261-262 (2005), in welcher solche
Nukleinsäuren als molekulare Tags beschrieben werden.
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, verbesserte Mittel zum Schneiden von Spiegelmeren und endogenen Nukleinsäuren anzugeben.
Grundzüge der Erfindung
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung die Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei die ILDNA vorzugsweise zur Bindung an eine L-RNA,
insbesondere eine antisense-Reaktion (inhibierende Watson-Crick-Reaktion) , und optional zur Spaltung der L-RNA im Bereich einer Targetsequenz der L-RNA befähigt ist, und zwar insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von unerwünschten physiologischen Nebenreaktionen, insbesondere Immunreaktionen und/oder unerwünschten enzymatischen oder antisense Reaktionen der L-RNA mit endogener RNA (einschließlich einer regulatorischen RNA) , aufgrund der Gabe eines therapeutischen Moleküls enthaltend die L-RNA. Weiterhin wird die Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer pharmazeu ischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, welche mit einer Überexpression
zumindest eines endogenen Genes einhergehen, wobei die L-DNA zur Bindung an eine eine Targetsequenz einer für das Gen codierenden endogenen Target-D-DNA oder
Target-D-RNA, beispielsweise in einer antisense
Reaktion, und optional zur Spaltung besagter
Targetsequenz befähigt ist.
Die Erfindung beruht zunächst auf der Erkenntnis, dass Spiegelmere entgegen bisheriger Vermutungen nicht notwendigerweise frei von Nebenreaktionen sind, sondern vielmehr in der Lage sein können,
natürlicherweise in einem Organismus vorkommende
Nukleinsäuren zu schneiden und so unvorhersehbare Nebenwirkungen zu erzeugen. Ebenso sind unerwünschte antisense Reaktionen, i.e. Inhibierung einer endogenen Nukleinsäure durch Watson-Crick Basenbindungen
zwischen dem Spiegelmere und der endogenen
Nukleinsäure, möglich, unabhängig von enzymatischen Reaktionen des gebundenen Spiegelmers .
Die Erfindung beruht auf der weiteren Erkenntnis, dass L-DNA überraschenderweise in der Lage ist endogene D- Nukleinsäuren, RNA wie DNA, zu schneiden bzw. hieran zu binden. Dies ist nicht automatisch zu erwarten. Zudem sind L-DNAs besonders stabil gegen
enzymatischen Abbau, so dass keine (meist voluminöse) Schu zgruppen an den Molekülen angebracht werden müssen, wodurch einerseits vorteilhafte
pharmakokinetische Eigenschaften erhalten werden und andererseits die Aufnahme in Zellen begünstigt wird.
Ein überraschender Vorteil von L-DNA gegenüber L-RNA besteht darin, dass die Aktivität von L-DNA gegenüber L-RNA in Zellen höher ist, wozu auf die
Ausführungsbeispiele verwiesen wird.
Die Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen
aufbauend auf der technischen Lehre, L-DNA, also L- DNzyme, zur Verfügung zu stellen, welche spezifisch ein verabreichtes Spiegelmer schneiden bzw. hieran inhibierend binden und so deren physiologische
Wirksamkeit, insbesondere in Hinblick auf unerwünschte Nebenreaktionen, zu zerstören. Beispiele für
Spiegelmere sind: Spiegelmer, NOXC89, NOXA42, NOXA50, NOXB11, NOXA12, NOXE36, NOXF37 (alle NOXXON AG) ,
Spiegelmere der Firma Eli Lilly & Co., NU172 de Firma ARCA biopharm Inc., ARCHEMIX, ARC1905, ARC1779,
ARC183, ARC184, E10030, NU172, REG2 , REG1 (alle
Archemix Corp.), AS1411, AS1405 (beide Antisoma
Research Ltd.), DsiRNA von Dicerna Pharmaceuticals Inc . , RNA Aptamer BEXCORE der BexCore Inc . , ELAN der Firma Elan Corp Plc . , oder Macugen, Durch die Gabe einer solchen L-DNA in Verfolg der Beobachtung einer unerwünschten Nebenreaktion bei Gabe eines
Spiegelmeres kann folglich die Ursache der
unerwünschten Nebenreaktion aus dem Stoffwechsel schnell, effektiv und hochselektiv entfernt werden, und zwar bei wiederum extrem niedrigen Risiko von Nebenwirkungen der Gabe der L-DNA. Letzteres beruht nicht nur auf dem Aufbau der L-DNA aus L-
Desoxyribonukleotiden, sondern zusätzlich auf der hohen Selektivität der L-DNA, nämlich gerichtet auf die Targetsequenz des Spiegelmeres . Im Ergebnis wird ein hochwirksames und hochselektives Antidot gegen ein therapeutisch eingesetztes Spiegelmer erhalten und unerwünschten Nebenreaktionen des Spiegelmeres kann effektiv, schnell und nebenwirkungsfrei begegnet werden. Grundsätzlich kann gegen jedes RNA Molekül,
einschließlich Aptamere, sei es aus D- oder L- Nukleotiden aufgebaut, eine spezifische L-DNA konstruiert werden, welche eine Targetsequenz des RNA Moleküls schneidet und diese so spaltet (Wirkung als Ribozym) , oder hieran inhibierend bindet (antisense Reaktion) . Eine wesentliche Eigenschaft einer solchen L-DNA ist also die sequenzspezifische Bindung an die Targetsequenz. Dies bedeutet aber auch, dass für jede beliebige Targetsequenz eine Teilsequenz einer L-DNA dadurch erstellt werden kann, dass die Teilsequenz der L-DNA, enthaltend beispielsweise eine Spaltungsstelle, mit der Targetsequenz hybridisiert. Daher ist es im Rahmen der Erfindung nicht zweckmäßig, nur bestimmte L-DNA-Teilsequenzen in Bezug auf bestimmte
Targetsequenzen strukturell anzugeben. Die in den Beispielen angegebenen Targetsequenzen und L-DNA- Teilsequenzen sind daher lediglich beispielhaft und der Fachmann kann ohne weiteres für jede vorgegeben Targetsequenz eines Spiegelmeres die passende, nämlich hybridisierende L-DNA-Teilsequenz bestimmen und die L- DNA auf der Basis der Informationen zur L-DNA- Teilsequenz mit fachüblichen Mitteln synthetisieren.
Grundsätzlich kann das therapeutische Molekül ein Spiegelmer sein, oder die L-RNA kann mit einem Aptamer covalent gebunden sein. Das therapeutische Molekül kann aber auch eine L-DNA enthalten (neben einem
Aptamer, beispielsweise) oder hieraus bestehen. Eine Kombination Spiegelmer/Aptamer kann beispielsweise im Falle eines gegen Nukleasen stabilisierten Aptamers vorliegen. Dann liegt der therapeutische Nutzen der Erfindung darin, dass durch das Schneiden der L-RNA bzw. L-DNA das Aptamer für Nukleasen zugänglich gemacht wird, wodurch dann letztendlich auch ein eventuell Nebenwirkungen verursachendes Aptamer aus dem Serum vergleichsweise kurzfristig eliminiert werden kann. Es ist aber auch möglich, dass die L-DNA covalent mit einem Aptamer, einem Antikörper oder einem Peptid oder Protein gebunden ist. Dabei kann das Aptamer oder der Antikörper beispielsweise so ausgewählt sein, dass auf Grund der Wechselwirkungen des Aptamers bzw. des Antikörpers mit Zelloberflächen das Gesamtkonstrukt aus L-DNA und Aptamer bzw. Antikörper in die Zelle eingeführt wird.
Eine geeignete L-DNA kann gegen eine konservierte Spaltstelle in der Substratsequenz gerichtet sein und selbst konservierte Nukleotide aufweisen, wie in der Figur 1, insbesondere Fig la, ersichtlich. Ein
konkretes Beispiel hieraus ist in der Figur lc
ebenfalls dargestellt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält die L-DNA in zumindest der Dosis, welche der Dosis der Gabe der L-RNA entspricht, vorzugsweise in einer Dosis, welche dem 2- bis 10-fachen, bezogen auf die Molekülanzahl bzw. Mole, der Dosis der Gabe der L-RNA entspricht. Eine Überdosierung, im Vergleich zur Dosis der L-RNA, wird sich empfehlen, um sicher zu gehen, dass alle zu eliminierende L-RNA abreagiert wird. Die
erfindungsgemäß vorgesehenen absoluten Dosen werden sich dabei streng in den angegebenen relativen
Mengenverhältnissen an den vorgegebenen Dosen der L- RNA richten und können daher vom Fachmann in Kenntnis der vorgegebenen Dosen für die L-RNA leicht bestimmt und eingerichtet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich eine Nukleinsäure, insbesondere ein 5- bis 100-mer, vorzugsweise ein 5- bis 25-mer, welches zur
AufSchmelzung einer doppelstrangigen L-RNA im Bereich derer Targetsequenz befähigt ist. Hierbei handelt es sich um Sequenzen, welche mit Teilsequenzen die der Targetsequenz benachbart sind, hybridisieren. Dadurch wird erreicht, dass zu spaltende Regionen der L-RNA, die normalerweise aus sterischen Gründen nicht
zugänglich sind aufgrund der Tertiärstruktur der L- RNA, für die L-DNA zugänglich gemacht werden. Zudem wird weiterhin erreicht, dass sehr spezifisch die gewünschten Schnittstellen gespalten werden, und nicht entsprechende Dupletts bzw, Tripletts mit anderen benachbarten Sequenzen.
Des Weiteren betrifft die Erfindung eine
pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein L-DNA zur Behandlung von unerwünschten physiologischen
Nebenreaktionen, insbesondere Immunreaktionen, aufgrund der Gabe eines therapeutischen Moleküls enthaltend die L-RNA.
Erfindungsgemäße L-DNA kann erfindungsgemäß aber auch zur Spaltung von (endogenen oder auch exogenen, beispielsweise aus viralen oder bakteriellen Quellen in Verfolg einer Infektion stammenden) Nukleinsäuren, im wesentlichen RNA, aber auch DNA, eingesetzt werden, oder zur Inhibierung derselben durch antisense
Reaktion an den endogenen Nukleinsäuren. In Bezug auf das Schneiden von DNA ist ergänzend auf die
Literaturstellen Lu, Y. , et al . , Current Opinions in Biotechnology 17:580-588 (2006), oder Jiang, D. , et al., FEBS 277 (11) :2543-2549 (2010) zu verweisen.
Insbesondere können damit Krankheiten therapiert werden, welche mit einer bestimmten RNA bzw. DNA, oder der Überexpression eines dadurch codierten
Expressionsproduktes einhergehen. Die L-DNA wird folglich als Inhibitor in Hinblick auf dieses
Expressionsproduktes funktionieren, nämlich indem die Expression unterbunden oder reduziert wird durch
Spaltung der dafür codierenden RNA bzw. DNA bzw durch antisense Bindung hieran. Dabei ist die spezifische Targetsequenz {also der zu spaltenden bzw. zu
bindenden RNA bzw. DNA) im Rahmen der Erfindung insoweit irrelevant, als dass damit beliebige Targets inhibiert werden können. Es ist lediglich notwendig, die L-DNA bzw. deren Sequenz der Sequenz der
Targetsequenz im Bereich der ausgewählten Spaltstelle in der vorstehend beschriebenen Weise anzupassen.
Damit lassen sich grundsätzlich beliebige Indikationen erfassen, sofern die zu therapierende Erkrankung ursächlich mit der betreffenden Targetsequenz
zusammenhängt. Im Folgenden werden lediglich Beispiele genannt, die jedoch die Anwendbarkeit der Erfindung insofern keinesfalls limitieren.
Bezüglich der pharmazeutischen Zusammensetzung gelten alle vorstehenden und nachfolgenden Ausführungen analog .
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung einer solchen pharmazeutischen
Zusammensetzung, wobei eine Sequenz aus L-
Desoxyriboukleotiden erstellt und synthetisiert wird, welche zur Bindung an eine vorgegebenen Sequenz aus L- Ribonukleotiden oder einer vorgegebenen Sequenz aus D- Ribonukleotiden oder D-Desoxyribonukleotiden,
insbesondere zur antisense Reaktion, und optional zur Spaltung besagter Sequenz befähigt ist, wobei die so erhaltene L-DNA in pharmakologisch wirksamer Dosis zur Darreichung hergerichtet wird. Dabei wird die L-DNA typischerweise mit galenischen Hilfs- und/oder
Trägerstoffen gemischt. Es ist im Rahmen der
Herrichtung auch möglich, fachübliche Substanzen,
welche die Endozytose (der L-DNA) fördern, entweder kovalent an die L-DNA zu koppeln, oder der
Zusammensetzung separat beizumengen.
Grundsätzlich können ein oder mehrere physiologisch verträgliche HilfStoffe und/oder Trägerstoffe mit der L- DNA gemischt und die Mischung galenisch zur lokalen oder systemischen Gabe, insbesondere oral, parenteral, zur Infusion bzw. Infundierung in ein Zielorgan, zur Injektion (z.B. i.V. , i.m., intrakapsulär oder intralumbal), zur Applikation in Zahntaschen (Raum zwischen Zahnwurzel und Zahnfleisch) und/oder zur Inhalation hergerichtet ist. Die Auswahl der Zusatz- und/oder Hilfsstoffe wird von der gewählten Darreichungsform abhängen. Die galenische
Herrichtung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung kann dabei in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen
beispielsweise Mg++, Pb++, Mn++, Ca++, CaCl+, Na+, +, Li+ oder Cyclohexylammonium, bzw. Cl", Br", Acetat,
Trifluoracetat , Propionat, Laktat, Oxalat, Malonat,
Maleinat, Citrat, Benzoat, Salicylat, Putrecin, Cadaverin, Spermidin, Spermin, usw. in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, ( ikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), Zubereitungsformen zur Trockenpulverinhalation, transdermale Systeme, sowie
Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Auch ist es möglich, den Wirkstoff in vorzugsweise biologisch abbaubaren Kanokapseln zu
verkapseln oder in Poren poröser Nanopartikel, biologisch abbaubar oder stabil, einzubringen, beispielsweise zur Herstellung einer Zubereitung zur Inhalation. Aber auch der Einsatz von Nanopartikeln aus D- und L-Nukleinsäuren ist möglich, beispielsweise für das Zelltargeting von Spiegelzymen und Spiegelmeren oder Aptameren (Seeman, N.C., Nano Lett. 10 ( 6 ): 1971- 1978 (2010); Sign, W. , Nature 478 (7368) :225-228 (2011); Sigh, W. Synapse 65 (12) : 1289-97 (2011) Zhao, W. et al, Nanotechnology 22 (49) :490201 (2011); Hilt, J.Z., Adv Drug Deliv. Rev. 56 ( 11) : 1533 - 1536 (2004); Lin, C, et al., Biochemistry 48 (8) : 1663-1674 (2007)) Als Hilfsstoffe seien beispielsweise Natriumcarbonate ,
Magnesiumcarbonat , Magnesiumbicarbonat , Titandioxid,
Laktose, Mannit und andere Zucker oder Cyklodextrine, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendete Substanzkombination in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch
verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Als Verdünnungsmittel kommen Polyglykole, Wasser,
Dimethylsulfoxid (beispielsweise für Präparationen zur Behandlung von Hauterkrankungen oder Rheuma) und
Pufferlösungen in Frage. Geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise N, N'-Dibenzylethylendiamin, Diethanolamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, N-Benzylphenethylamin, Diethylamin, Phosphat, Natriumbicarbonat , oder
Natriumcarbonat . Es kann aber auch ohne Verdünnungsmi tel gearbeitet werden. Physiologisch verträgliche Salze sind Salze mit anorganischen oder organischen Säuren, wie z.B. Milchsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure,
Citronensäure, p-Toluolsulfonsäure , oder mit anorganischen oder organischen Basen, wie z.B. NaOH, KOH, Mg(OH)2,
Diethanolamin, Ethylendiamin, oder mit Aminosäuren, wie Arginin, Lysin, Glutaminsäure usw. oder mit anorganischen Salzen, wie CaCl2, NaCl oder deren freie Ionen, wie Ca2+, Na+, Pb++, Cl", S04 2~ bzw. entsprechende Salze und freien Ionen des Mg++ oder Mn++, oder Kombinationen hieraus. Sie werden nach Standardmethoden hergestellt. Vorzugsweise wird ein pH-Wert im Bereich zwischen 5 und 9, insbesondere zwischen 6 und 8, eingestellt.
Von selbstständiger Bedeutung ist die bereits
vorstehend angesproche Variante der Erfindung, welche die Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, welche mit einer
Überexpression zumindest eines endogenen Genes
einhergehen, wobei die L-DNA zur Bindung an eine
Targetsequenz einer für das Gen codierenden endogenen Target-D-RNA oder Target-D-DNA, insbesondere zur antisense Reaktion, und optional zur Spaltung besagter Targetsequenz befähigt ist, umfasst. Eine Behandlung oder Prophylaxe von viralen oder bakteriellen
Infektionen ist möglich, wenn die L-DNA zur Bindung an eine Targetsequenz des betreffenden Virus oder
Bakteriums eingerichtet ist. Ansonsten gelten die vorstehenden Ausführungen analog. In diesem
Zusammenhang von Bedeutung ist eine weitere Variante des vorstehenden Aspekts der Erfindung mit der
Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, welche mit einer
Infektion eines Säugetiers mit einem Mikroorganismus einhergehen, wobei die L-DNA zur Spaltung einer (oder zur Bindung, insbesondere antisense Reaktion, an eine) Targetsequenz einer für ein Gen des Mikroorganismus codierenden Target-D-RNA oder Target-D-DNA befähigt ist. Als in Frage kommende Mikroorganismen sind u.a. Viren, Bakterien und Pilze zu nennen. Grundsätzlich kann die L-DNA zur Bindung an oder zur Spaltung von Nukleinsäuren eines beliebigen Mikroorganismus mit zumindest teilweise bekannten Gensequenzen eingesetzt werden, wobei Bereiche der Gensequenzen zwecks
Spaltung ausgewählt werden, welche beispielsweise die Aktivität des Mikroorganismus und/oder seine
Replikatinsf higkeit attenuieren oder inhibieren und/oder die Bindung an Zelloberflächen attenuieren oder inhibieren.
In dieser Variante wird genutzt, dass die L-DNA auch zur Inhibierung durch antisense Reaktion mit oder Spaltung von D-RNA, insbesondere mRNA oder
regulatorischer RNA, beispielsweise, aber nicht ausschließlich siRNA, microRNA, shRNA, ncRNA, tRNA, rRNA, etc., eingesetzt werden können, aber auch zur Spaltung von D-DNA bzw. Bindung hieran. Dadurch können Gene bzw. hierdurch codierte Proteine oder coding oder noncoding RNAs inhibiert werden. Dies ist von
therapeutischem Nutzen für alle Erkrankungen, die mit der Überexpression bestimmter Gene, verglichen mit der Expression des nicht erkrankten Organismus,
einhergehen.
Diese Variante hat zum einen den Vorteil, dass die Spaltung der Targetsequenz bzw. die Bindung hieran mit sehr hoher Spezifität erfolgt und somit auch keine sonstige Interferenz mit dem regulatorischen System erfolgt. Zudem werden Nebenwirkungen, wie sie
beispielsweise mit dem Einsatz inhibitorischer D- Nukleinsäuren, wie siRNA, einhergehen, sicher
vermieden werden. L-RNA Ribozyme und L-DNAzyme benötigen keine Helfermoleküle, anders als die siRNAs (Risc Faktoren usw.), wodurch unerwünschte Nebenreaktionen drastisch reduziert werden.
Schließlich ist es möglich, zwei L-DNA bzw. L-DNAzyme kombiniert einzusetzen, wobei die Sequenzen mit der Maßgabe ausgewählt sind, dass auch doppelsträngige DMA bzw. RNA geschnitten werden kann.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung sind weitere Varianten möglich.
Zunächst kann eine L-DNA nicht nur zur Bindung an einer anderen Nukleinsäure eingesetzt werden , sondern grundsätzlich analog der bekannten Einsatzgebiete von Aptameren aus D-Nukleinsäuren. Dies bedeutet, dass mittels einer erfindungsgemäßen L-DNA im Prinzip jegliches Targetmolekül in einem Organismus gebunden und somit inhibiert werden kann. Die gesamte dem
Fachmann bekannte Technologie der Aptamere ist entsprechend auf L-DNA Aptamere übertragbar.
Eine ein vorgegebenes Target bindende L-DNA ist in einem folgenden Verfahren erhältlich. Ein ausgewähltes Targetmolekül wird an einer immobilen (bzw.
Festkörperphase, beispielsweise auch magnetic beads) Phase eines Screening Assays gebunden. Das Screening Assay umfasst neben der immobilen Phase eine mobile Phase (meist eine wäßrige Lösung, in welcher
Nukleinsäuren sowie das Targetmolekül stabil sind und binden können) , welche mit der immobilen Phase in
Kontakt steht bzw. hiermit in Kontakt gebracht wird. Die mobile Phase enthält eine L-DNA Bibliothek, also Polynukleotide, typischerweise eine Länge von 10 bis 500 Nukleotiden, deren Sequenzen variieren, in der Regel randomisiert sind. Solche L-DNA Bibliotheken lassen sich mittels üblicher und aus der Generierung von D-DNA Bibliotheken bekannter Syntheseverfahren herstellen. Mit der Kontaktierung binden solche L-DNA Moleküle an das Targetmolekül, welche aufgrund ihrer Sequenz in der Lage sind, stabile Van der Waals
Bindungen an das Targetmolekül einzugehen. Die
Bindungsstärken liegen dabei typischerweise bei
Dissoziationskonstanten mit Werten unterhalb 100 nmol, besser unterhalb 100 pmol, oft sogar unterhalb 1 pmol . Hieran anschließend wird die mobile Phase (mit den nicht oder nur schwach bindenden Nukleinsäuren) von der immobilen Phase getrennt, beispielsweise mittels einer oder mehrerer Waschverfahrenstufen. Hierauf wird die immobile Phase mit den an Targetmolekülen
gebundenen L-DNA Molekülen mit einer D-DNA Bibliothek kontaktiert. Mit der an das Targetmolekül gebundenen L-DNA hybridisierende D-DNA bindet an die L-DNA, wodurch ein Komplex aus Targetmolekül/L-DNA/D-DNA entsteht. Nicht gebundene D-DNA wird mit der mobilen Phase wieder entfernt. Von dem so erhaltenen Komplex wird dann die D-DNA wieder in fachüblicher Weise eluiert, i.e. in eine mobile Phase überführt. Die so erhaltenen D-DNA Moleküle können nunmehr ggf.
amplifiziert (beispielsweise mittels PCR) und
jedenfalls sequenziert werden. Aus der so erhaltenen Sequenz der D-DNA kann dann die komplementäre L-DNA ermittelt und synthetisiert werden. Alternativ kann die L-DNA von dem Targetmolekül eluiert und mit einem an anderer Stelle dieser Beschreibung angegebenem Sequenzierungsverfahren sequenziert werden. Das in diesem Abschnitt beschriebene Verfahren kann
grundsätzlich auch ohne immobile Phase ausgeführt werden, dann ist das Targetmolekül anstatt an die immobile Phase gebunden zu sein, an ein Markermolekül gebunden. Die Abtrennung von ungebundener L-DNA von dem Komplex Target/gebundener L-DNA erfolgt dann mit üblichen Verfahren durch Bindung des Markermoleküls und Abtrennung von Molekülen, welche dieses
Markermolekül nicht tragen. Ansonsten funktioniert diese Alternative ganz analog der vorstehenden
Beschreibung .
Im Ergebnis erhält man eine L-DNA Molekülspezies bzw. eine Mischung solcher Spezies, welche mit hoher
Affinität an das Targetmolekül binden. Diese können dann im Rahmen einer erfindungsgemäßen
pharmazeutischen Zusammensetzung mit beliebigen
Indikationen eingesetzt werden. Die Indikation wird dann davon abhängen, welches Targetmolekül als kausal mit einer Erkrankung zusammenhängend erkannt worden ist und zur Behandlung oder Prophylaxe derselben inhibiert werden soll. In entsprechender Weise kann auch eine an ein Target bindende L-RNA isoliert bzw. bestimmt werden. Dabei wird dann an Stelle einer L-DNA Bibliothek eine L-RNA Bibliothek eingesetzt. In einem weiteren alternativen Verfahren können an ein (beliebiges) Target, beispielsweise ein Targetmolekül, einen Virus, eine Bakterie, einen Pilz oder eine sonstige Zelle {oder Fragmente hiervon) bindende L-DNA oder L-RNA isoliert bzw. bestimmt und hergestellt werden. Dazu wird die L-Nukleinsäurebibliothek
bereitgestellt, wobei an die Nukleinsäuren optional ein Kopplungsmolekül bzw. Markermolekül gebunden ist, beispielsweise Biotin an das 5 '-Ende. Das
Targetmolekül wird an eine Festkörperphase,
beispielsweise magnetic beads, gebunden. Die
Festkörperphase wird dann mit der
Nukleinsäurebibliothek kontaktiert. Dabei binden jene L- ukleinsäuren an das Targetmolekül, welche eine hohe Bindungsaffinität dazu aufweisen. Die Festkörperphase wird einer oder mehrerer Waschverfahrensstufen
unterworfen, wobei die nicht bindenden L-Nukleinsäuren entfernt werden. Dann werden die L-Nukleinsäuren wiederum eluiert und so von den Targetmolekülen in fachüblicher Weise abgetrennt. Schließlich erfolgt dann eine Sequenzierung der so erhaltenen L- Nukleinsäuren, wie an anderem Ort dieser Beschreibung beschrieben.
Im Rahmen erfindungsgemäßer Verwendungen können L-DNAs auch zur Testung auf potentielle Nebenwirkungen der L- DNA eingesetzt werden. Im Rahmen eines solchen
Testverf hrens wird die L-DNA (bzw. eine größere
Anzahl von identischen L-DNA Molekülen) , welche als prospektiver Wirkstoff ausgewählt ist, in Kontakt mit einem Zellextrakt, beispielsweise eines zu
therapierenden Organismus, gebracht und es wird mit üblichen Mitteln gemessen, ob nur das Targetmolekül in dem Zellextrakt an die L-DNA bindet, oder auch noch andere Moleküle. In ersterem Fall wäre der prospektive Wirkstoff höchstwahrscheinlich Nebenwirkungsfrei in dem Sinne, dass keine anderen Zellbestandteile, als das Targetmolekül gebunden bzw. inhibiert werden. In letzterem Fall wäre mit Nebenwirkungen zu rechnen.
Die Sequenzierung von L-Nukleinsäuren kann, unabhängig von den anderen Aspekten der Erfindung, auf
verschiedene Weisen erfolgen. In einem ersten
Verfahren zur Sequenzierung einer L-RNA oder L-DNA wird die L-Nukleinsäure an eine Festkörperphase gebunden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Nukleinsäure ein Kopplungs- bzw.
Markermolekül, wie Biotin, enthält (wie vorstehend beschrieben) . Dann trägt die Festkörperphase ein zum Kopplungsmolekül komplementäres und dieses bindende Molekül, beispielsweise Avidin oder Streptavidin. Die so an die Festkörperphase gebundene L-Nukleinsäure wird dann mit einer D-DNA Bibliothek kontaktiert.
Dabei hybridisieren solche D-DNA Moleküle aus der Bibliothek mit der L-Nukleinsäure, welche
komplementäre Sequenzen enthalten oder hieraus bestehen. Dann wird die Festkörperphase in einer oder mehreren Waschverfahrensstufen gewaschen, wobei die nicht gebundene D-DNA entfernt wird. Sodann wird die gebundene D-DNA von der L-Nukleinsäure gelöst.
Anschließend kann eine Amplifikation, beispielsweise mittels PCR, erfolgen. Sodann wird die D-DNA
sequenziert. Aus der so erhaltenen D-DNA Sequenz kann dann die komplementäre Sequenz der L-Nukleinsäure bestimmt werden.
Alternativ kann eine L-Nukleinsäure, insbesondere L- RNA, in einem Sequenzierungsverfahren, wie folgt, sequenziert werden. Hierbei trägt die Nukleinsäure an einem Ende, beispielsweise am 5 "-Ende, ein Kopplungsbzw. Markermolekül (wie vorstehend beschrieben) , beispielsweise Biotin. Die Nukleinsäure wird dann in eine „Leiter" zerlegt, i.e. im Wege der Hydrolyse werden verschieden lange Fragmente der Nukleinsäure erhalten, im Idealfall von 1 Base bis zur Basenzahl der vollständigen Nukleinsäure. Im Fall einer L-RNA kann dies im Alkalischen erfolgen, pH typischerweise >8, meist 8,5-10. Hierzu kann ein handelsüblicher Hydrolysepuffer mit KOH oder Natriumhydrogencarbonat eingesetzt werden. Die so erhaltenen Fragmente, welche noch das Kopplungsmolekül tragen, werden dann an eine Festphase gebunden. Die Festphase trägt dazu ein zum Kopplungsmolekül komplementäres und dieses bindende Molekül, beispielsweise Avidin oder Streptavidin. Die Festphase wird dann einer oder mehreren
Waschverf hrensstufen unterworfen, wobei
Nukleinsäurefragmente entfernt werden, welche nicht das Kopplungsmolekül tragen. Im Ergebnis verbleibt die „Leiter" von markierten Nukleinsäurefragmenten . Diese werden dann von der festphase eluiert und
massenspektrometrisch untersucht, wobei dann anhand der gefundenen Massen und deren Verteilung die
ursprüngliche Sequenz der L-Nukleinsäure ermittelt werden kann. Im Falle der L-DNA wird entsprechend verfahren, nur wird dabei die „Leiter" durch Hydrolyse im Sauren, pH <6, besser <5, erzeugt.
L-DNA bzw. Spiegelzyme können auch zur Bestimmung von zugänglichen mRNA Sequenzen eingesetzt werden. Denn die Bestimmung von solchen mRNA Sequenzen, die für siRNAs, miroRNAs und auch Spiegelzymen zugänglich sind sehr schwierig, da eine Sekundärstrukturvorhersage mittels Computertechnologien sehr unsicher ist. Das liegt einmal daran, dass zu wenig über die Regeln der dreidimensionalen Faltung von RNA Molekülen bekannt ist, so dass die
Computerprogramme unzureichend sind. Zum Anderen kann man davon ausgehen, dass eine mRNA in der Zelle anders
gefaltet ist als frei in Lösung. Deswegen besteht ein sehr großer Bedarf, den Einsatz von siRNAs , microRNAs und
Spiegelzyme zu optimieren. Dies könnte man z.B. mit einer in vitro Proteinbiosynthese ermitteln, in welcher in pro- oder eukaryontischen in vitro Systemen (z.B. erhältlich von der RiNA GmbH, Deutschland) eine bestimmte
(vorgegebene) mRNA translatiert wird und die Ausbeute des Proteins in Abhängigkeit der verschiedenen Spiegelzyme (prospektiver Wirkstoffe) getested wird. Molekulare
Scheren des Standes der technik, wie z.B. Ribozyme, siRNAs usw. , sind hierfür aus Stabilitätsgründen oder auf Grund des Umstandes, dass diese Scheren Helfermoleküle
benötigen, nicht geeignet.
Unabhängig von den hier beschriebenen Zusammenhängen und eine eigenständige Erfindung darstellend, kann L- DNA auch für nicht-pharmazeutische Zwecke verwendet werden. Ein Anwendungsbereich ist die Markierung von
Gegenständen oder Personen mit L-DNA zu Sicherheitsund/oder Authentizierungszwecken und/oder zur
Identifizierung einer Person. Dabei wird die L-DNA auf den Gegenstand oder die Person aufgebracht und ihr
Vorhandensein und/oder ihre Sequenz mittels geeigneter Methoden geprüft . Als Gegenstände können im Prinzip alle Gegenstande in Frage, deren Echtheit zu überprüfen ist, welche zu Diebstahlschutzzwecken zu markieren sind, oder bei welchen eine Zuordnung zu einem Besitzer wünschenswert ist. Zu erster Gruppe gehören die sogenannten
Sicherheits- und/oder Wertdokument , wie beispielsweise Pässe, Personalausweise, Führerscheine,
Kraftfahrzeugpapiere, Visa, sonstige Identitäts- und/oder Zugangsdokumente, wie Zugangskarten,
Mitgliedsausweise, Banknoten, Tickets, Steuerzeichen, Postwertzeichen, Kreditkarten, oder Haftetiketten (beispielsweise zur ProduktSicherung) . Zur zweiten Gruppe gehören Gegenstände, welchen einen materiellen Wert darstellen und gegen Diebstahl zu sichern sind, wie beispielsweise Schmuck, Uhren, sonstige
Wertgegenstände, technische Geräte, Fahrzeuge, usw. Mit dem Einsatz einer L-DNA lassen sich Gegenstände auch individualisieren, nämlich indem ein Gegenstand mit einer L-DNA markiert wird, welche eine für den Gegenstand und nur für diesen Gegenstand
charakteristische Sequenz aufweist. Ist eine solche Sequenz einer Person bzw. einem Eigentümer zugeordnet, so läßt sich durch Bestimmung der Sequenz der auf dem Gegenstand angebrachten L-DNA auch eine Zuordnung des Gegenstandes zu der Person bzw. dem Eigentümer
durchführen. Bevorzugte Einsatzgebiet sind auch die Markierung von pharmazeutischen Produkten bzw. deren Verpackungen oder Exponate in einem Museum oder dergleichen.
Die Markierung von Personen kann beispielsweise wünschenswert sein im Falle eines Angriffs. Die
Angegriffene Person kann dann den Angreifer
beispielsweise mittels eines eine L-DNA enthaltenden Sprays besprühen, wodurch die Person durch Nachweis der L-DNA auf ihr bzw. ihrer Bekleidung
identifizierbar ist. Auch können automatische
Sprühvorrichtungen beispielsweise zur Markierung von unbefugt Räumlichkeiten betretende oder hieraus austretenden Personen vorgesehen sein. Dabei wird eine Sprühvorrichtung, welche mit einer Alarmanlage
gekoppelt ist, betätigt, sobald ein Sensor der
Alarmanlage in einem Alarmzustand der Alarmanlage die Anwesenheit einer Person in der Reichweite der
Sprühvorrichtung detektiert. Dann wird die Person mit der in der Sprühvorrichtung enthaltenen Lösung, welche wiederum die L-DNA enthält, besprüht und die
Identifizierung kann dann, wie vorstehend, erfolgen.
Zwar ist der Einsatz von D-Nukleinsäuren für solche Zwecke bekannt, diese haben jedoch den Nachteil, dass sie von einer unberechtigten Person beispielsweise mittels Nuklease abgebaut werden können. Dies stört insbesondere in solchen Fällen, wo ein Gegenstand gegen Diebstahl zu sichern ist, oder wo eine Person markiert worden ist, da durch den Einsatz einer
Nuklease die Markierung zerstört und so entfernt wird. Der Einsatz von L-Nukleinsäuren birgt außerdem den großen Vorteil, dass diese nicht (im Gegensatz zu D- Nukleinsäuren) , in das Genom des Menschen eingebaut werden können, so dass die Gefahr einer möglichen Induktion einer Erkrankung, insbesondere
Tumorentwicklung, nicht gegeben ist. Die hier beschriebene Erfindung betrifft insofern ein Verfahren zur Markierung eines Gegenstandes oder einer Person, wobei der Gegenstand oder die Person oder deren Bekleidung mit einer L-DNA versehen wird und wobei die L-DNA auf oder in diesem Gegenstand, der Person oder deren Bekleidung fixiert wird. Sie
betrifft weiterhin einen Gegenstand, welcher eine daran oder darin fixierte L-DNA aufweist. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung eines
Gegenstandes oder einer Person, wobei der Gegenstand oder die Person oder deren Bekleidung einer Analyse auf Vorhandensein einer L-DNA, optional zusätzlich deren Sequenzierung, unterworfen wird.
Der Begriff des Markierens bezeichnet dabei eine
Kennzeichnung eines Gegenstandes oder einer Person durch Anbringen eines Merkmals auf oder an diesem Gegenstand oder dieser Person, welches zuvor nicht auf oder an dem Gegenstand oder der Person war. In jedem Fall handelt es sich bei dem Merkmal um ein solches mit vorgegebener Struktur und welches nicht durch andere Umstände, als (absichtsvolles) Markieren auf den gegenständ oder die Person gelangen kann.
Die Fixierung kann mit allen im Zusammenhang mit der Markierung mittels D-Nukleinsäuren bekannten
Technologien erfolgen. Im einfachsten Falle wird eine Lösung, insbesondere wäßrige Lösung, enthaltend die L- DNA auf den Gegenstand oder die Person oder deren
Kleidung appliziert und getrocknet. Bevorzugt wird es jedoch sein, wenn die L-DNA in einer Zubereitung enthalten ist, welche zusätzlich ein gelöstes oder dispergiertes Bindemittel enthält. Als
Basiszubereitungen eigenen sich grundsätzlich alle noch nicht ausgehärteten flüssigen oder pastösen Lackebindemittelzubereitungen, Adhäsivzubereitungen oder dergleichen, sofern deren pH kleiner als 9, besser kleiner als 8 ist. Als Lösemittel kommen neben Wasser auch alle in der Lacktechnologie oder
Adhäsivtechnologie üblichen Lösemittel in Frage. Die gilt auch für die einsetzbaren Bindemittel und fachüblichen Zusatzstoffe. Diese Zubereitung wird auf den zu markierenden Gegenstand oder auf die zu markierende Person appliziert. Die zu applizierende Lösung bzw. Zubereitung enthält pro ml vorzugsweise zwischen 1 oder 10A1 und 10A16, beispielsweise zwischen 10 A3 und 10A12, insbesonderen zwischen 10A3 und 10 A 9 Moleküle der L-DNA. Vorzugsweise haben zumindest 10%, vorzugsweise zumindest 50%, der L-DNA Moleküle eine identische Nukleotidsequenz .
In einer bevorzugten Variante dieser Erfindung trägt die L-DNA am 5 ' - oder am 3 '-Ende eine covalent gebundene photolumineszierende Reportermolekülgruppe, wobei diese weiterhin vorzugsweise mit der Maßgabe ausgewählt ist, dass die Lumineszenz, insbesondere Fluoreszenz, auf Anregung mit UV-Strahlung erfolgt. Als Reportermolekülgruppen sind alle in der Biochemie fachüblichen photolumineszierenden Molekülgruppen einsetzbar. Wird ein erfindungsgemäß markierter
Gegenstand oder eine markierte Person mit UV-Licht beleuchtet, so ist die Markierung anhand der dadurch angeregten Lumineszenz mit dem Auge ersichtlich oder apparativ erfassbar. Die L-DNA kann am
entgegengesetzten Ende eine Markergruppe ,
beispielsweise Biotin, covalent gebunden tragen. Dann kann auf positive Detektion einer Markierung mit L-DNA eine Ablösung derselben und Sequenzierung nach einem der oben beschriebenen Verfahren erfolgen. Mit der Sequenz kann dann ggf. eine Zuordnung zu einer unter der gemessenen Sequenz registrierten Person oder Geschäftseinheit erfolgen.
Die L-DNA kann in Weiterbildung dieser Erfindung zumindest einen invarianten Sequenzblock und/oder einen variablen Sequenzblock enthalten. Der invariante Sequenzblock ist dann für alle oder für zumindest eine Gruppe von Markierungen mit der L-DNA gleich, i.e. alle Markierung enthalten eine Teilsequenz mit der Sequenz dieses Sequenzblocks . Der variable
Sequenzblock kann dann individualisiernd sein. Dies ist zweckmäßig, wenn der Nachweis durch Beleuchtung beispielsweise mit UV zusätzlich von dem Vorliegen einer L-DNA mit besagtem Sequenzblock abhängig sein soll. Dadurch wird unterschieden gegenüber einem
Leuchteffekt, welcher von beliebigen
Lumineszenzstoffen, unabhängig vom Vorhandensein einer erfindungsgemäßen L-DNA, auftreten kann.
In dieser Weiterbildung ist es weiterhin vorteilhaft, wenn die erfindungsgemäß eingesetzte L-DNA die
Struktur eines molecular beacon aufweist. Hierbei handelt es sich um eine einzelsträngige Nukleinsäure mit Haarnadelstruktur oder Stamm-Schleifen- Struktur, wobei die den Stamm bildenden Enden zum einen ein Lumineszenzmolekül und, gegenüberliegend, einen
Quencher, beispielsweise Dabcyl, tragen. Zumindest eines der Enden ist eine (typischerweise 5 bis 20 Basenpaare lange) invariante Sequenz (Sequenzblock) . Im nicht-hybridisierten Zustand der L-DNA ist die
Floureszenz durch Förster-Resonanzenergietransfer auf den Quentcher unterdrückt, bei Bestrahlung mit UV ist kein Leuchteffekt zu sehen. Ein Nachweis der L-RNA erfolgt dann dadurch, dass der markierte Bereich zunächst mit einer Lösung einer zum invarianten
Sequenzblock dieser L-DNA komplementären Nukleinsäure, insbesondere L-DNA, besprüht. Diese hydbridisiert mit dem invarianten Sequenzblock und dadurch werden das Lumineszenzmolekül und der Quentcher voneinander entfernt. Wird nunmehr die Markierung mit UV Licht bestrahlt, so ist Floureszenz nunmehr zu beobachten oder apparativ zu erfassen. Eine Eluierung und
Sequenzierung eines eventuellen variablen
Sequenzblocks erfolgt dann, wie vorstehend
beschrieben.
In einer Variante der vorstehenden bevorzugten
Ausführungsform liegt die L-DNA der Markierung nicht als Einzelstrang vor, sondern ein Ende (der Bezug auf ein Ende meint stets entweder 3 Oder 5') eines
(längeren) Einzelstrangs trägt ein Lumineszenzmolekül. Dieses Ende bildet einen invarianten Sequenzblock einer vorgegebenen Anzahl Basen. Hieran hybridisiert ist eine komplementäre L-DNA, welche an einem Ende einen Quentcher trägt, und zwar mit der Maßgabe, dass der Quentcher hinreichend nahe an dem
Lumineszenzmolekül angeordnet ist, um die Lumineszenz zu unterdrücken. Die Länge dieser komplementären L-DNA ist zumindest 2, besser zumindest 5 Basen kürzer, als die Länge des invarianten Sequenzblocks. Wird nun eine Lösung mit einer L-DNA, welche komplementär zum invarianten Sequenzblock ist und deren Länge zumindest 2, besser zumindest 5, Basen länger als jener L-DNA, die den Quentcher trägt, ist, so wird diese die L-DNA mit dem Quentcher verdrängen und mit dem invarianten Sequenzblock hybridisieren. Erfolgt nunmehr eine
Bestrahlung mit UV, so leuchtet das Lumineszenzmolekül und die Markierung wird sichtbar bzw. apparativ erfassbar. Anschließend kann wieder, wie oben eluiert und sequenziert werden, um eine eventuelle variable Sequenz festzustellen.
Die Erfindung umfasst somit auch ein Registersystem umfassend eine Datenbank, wobei in der Datenbank variable Sequenzblocks verschiedener L-DNA
Markierungen erfasst und einer Person, Firma oder Behörde zugeordnet sind. Mittels dieses
Registersystems kann ein aus einer Markierung
ermittelter variabler Sequenzblock unschwer der zugeordneten Behörde, Museum, Firma oder Person zugeordnet werden.
Grundsätzlich ist anzumerken, dass die vorstehend beschriebenen Verwendungen von L-DNA auch ohne
Weiteres analog mit L-KNA durchgeführt werden können.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren und Beispielen näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 : Allgemeine Strukturen von erfindungsgemäßer
L-DNA (a) und Hammerhead Ribozym (b) , jeweils mit aufgeführten
Targetsequenzspezifitäten und konservierten Strukturelementen sowie Vergleich der
Bindung einer konkreten L-DNA (c) und eines konkreten Hammerhead Ribozyms (d) nach Bindung an die gleiche Targetsequenz des Green Fluorescent Proteins GFP (b) , Darstellung der Sekundärstrukturen, (siehe auch Zaborowska, Z., et al . , The Journal of Biological Chemistry 277 (43) :40617-40622 (2002), Kim, K. , et al . , Bull. Korean Chem. Sco. 27(5}:657ff (2006), und Hertel, K.J., et al., Nucleic Acids Research 20 (12) : 3252ff (1992) ) ,
Figur 2 : Analyse der Spaltung einer L- und D-GFP
Targetsequenz durch L- und D-DNAzym und Hammerhead Ribozym Figur 3 : Vergleich der MgCl2-
Konzentrationsabhängigkeit der Spaltung der D-GFP Targetsequenz durch L-DNAzym (L-Dz) und der L-GFP Targetsequenz durch D-DNAzym (D-Dz) ,
Figur 4 : MgCl2-Konzentrationsabhängigkeit der
Spaltung der D-GFP Targetsequenz durch L- DNAzym (L-Dz) mit Bestimmungs der
Spaltungsstelle ,
Figur 5: Vergleich der Aktivitäten verschiedener
DNAzyme und RNAzyme in GFP-transfizierten
Zellen bei verschiedenen Enzym- Konzentrationen und 24h Inkubation,
Figur 6: Quantifizierung der Ergebnisse aus der Figur
5 durch Angabe der Fluoreszenzintensitäten,
Figur 7: direkter Vergleich der Aktivitäten von L- DNAzym und L-Ribozym bei verschiedenen
Enzyme-Konzentrationen und 24h Inkubation,
Figur 8: Quantifizierung der Ergebnisse aus der Figur
7 durch Angabe der Fluoreszenzintensitäten,
Figur 9: Gegenstand der Figur 5, jedoch nach 48h
Inkubation, und
Quantifizierung der Ergebnisse aus der Figur durch Angabe der Fluoreszenzintensitäten
Beispiel 1: Cleavage assay
Die Aktivitäten von L-Ribozymen und D-Ribozymen wurden unter verschiedenen Bedingungen gemessen. Die
Basisbedingungen waren wie folgt. 0,2 μΜ Target RNA oder DNA wurden mit 10 μΐ Reaktionsmischung in der Gegenwart von 2 μΜ DNAzym bzw. RNAzym in 50 mM Tris- HCL Puffer, pH 7,5, bei 20°C für 2 Stunden inkubiert {Verhältnis DNAzyme bzw. RNAzym/Target folglich 10:1). Vor der Reaktion wurden Target RNA oder DNA und DNAzytn bzw. RNAzym für 2 Minuten bei 72 °C denaturiert und langsam (l°C/min.) in dem Heizblock auf 25°C
abgekühlt. Es wurde der Einfluss der Mg2+- Ionen in Konzentration von 0,1 bis 10 tnM untersucht.
Spaltprodukte wurden auf 20% Polyacrylamid
Gelelektrophorese in der Gegenwart von 7 Harnstoff in 0,09 M Tris-Borat Puffer, pH 8,3, getrennt. Die Analyse der Fluoreszenz erfolgte auf Phosphoimager Fuji Film FLA 5100. Die Daten wurden mit dem Programm Fuji Analysis Program erhalten. Diagramme wurden mit Excel erstellt.
Beispiel 2: Herstellung der TargetSequenzen und der
Ribozyme Alle Targetsequenzen wurden im Wege der chemischen
Synthese hergestellt. Die Syntheseprodukte hatten eine Reinheit von mehr als 90%.
AI DNAzym- bzw. RNAzym-Sequenzen wurden nach Maßgabe der Targetsequenzen die variablen Bereiche des DNAzyms bzw. RNAzyms um das Schnittstellentriplett ausgewählt und die RNAzyme- bzw. DNAzymsequenzen synthetisch hergestellt. Die Syntheseprodukte hatten eine Reinheit von über 85%.
Alle Syntheseprodukte waren am 5' -Ende mit Fluoreszein markiert . Beispiel 3: Messung von Aktivitäten in Zellen HeLa Zellen wurden mit 1 g EGFP Plasmid nach
Vorschrift transfiziert . Es folgte eine Inkubation mit 25, 50 oder 100 nM Lösung des einzusetzenden DNAzyms bzw. RNAzyms . Die Zellen wurden nach 24h oder 48h mit einem Leica Mikroskop analysiert, oder es wurde die Fluoreszenzintensität (RFU) mittels Multi-Mode
Microplate Reader Synergy-2 nach Vorschrift gemessen.
Vergleich der Wechselwirkung
verschiedener DNAzyme mit
Targetsequenzen
In der Figur 2 {10 mM MgCl2) ist ersichtlich, dass ein
L-DNAzym sowohl die L-TargetSequenz als auch die D- Targetsequenz zu schneiden in der Lage ist. Die Figur
3 zeigt hierzu die MgCl2 Konzentrationsabhängigkeiten.
Dieser Figur entnimmt man auch, dass L-DNAzym das D-
Target schneidet, nicht jedoch D-DNAzym das L-Target.
Die Figur 4 zeigt nochmals Messungen entsprechend der Figur 3, wobei zusätzlich die Schnittstelle beim
Target gemäß der Figur la ersichtlich ist.
Beispiel 5: Aktivitäten verschiedener DNAzyme und
RNAzyme in Zellen In der Figur 5 wurden HeLa Zellen mit EGFP Plasmid transfiziert , enthalten also ein D-Target. Man erkennt insbesondere, dass L-DNAzym die Floureszenz stärker inhibiert, als L-RNAzym, oder auch als D-R-SFAzym oder D-DNAzym. Dieser Befund wird in der Figur 6
signifikant bestätigt. Dadurch ist insbesondere die überlegene Wirkung von L-DNAzym gegenüber L-RNAzym in der Zelle belegt. In den Figuren 7 und 8 werden diese Ergebnisse auch für 24 Stunden Inkubationszeiten weiter bestätigt. Den Figuren 9 und 10 ist schließlich zu entnehmen, dass L-DNAzyme auch bei 48h
Inkubationszeiten gegenüber den anderen Enzymen eine signifikant bessere Inhibierung zeigt.
Beispiel 6: Mögliche pharmazeutische Anwendungen
Neben der Anwendung als Antidot bei der Therapie mit Spiegelmeren ist die Erfindung auch in anderen
allgemeinen Zusammenhängen einsetzbar. Hierzu zählen grundsätzlich alle Indikationen, bei welchen eine Erkrankung mit der unerwünschten Expression eines Genproduktes korreliert ist. Ein Beispiel ist Herzversagen bzw. Hypertrophie. Aus der Literaturstelle L. S ckau et al . , Circulation 119:1241-1252 (2009) ist es bekannt, dass hiergegen eine Therapie geeignet ist, welche Phospholamban inhibiert. In dieser Literaturstelle wird dazu RNAi eingesetzt. Entsprechende L-DNAzyme kann anhand der bekannten SequenzInformation zu humanem Phospholamban unschwer konstruiert werden und es ergeben sich gegenüber den insofern bekannten Therapiemethoden die Vorteile der besseren Stabilität des L-DNAzym
Wirkstoffes gegen enzymatischen Abbau bei gleichzeitig guter Aktivität in Hinblick auf Inhibierung der Target RNA, codierend für Phos holamban .
Ein anderes Target im menschlichen Organismus ist beispielsweise die noncoding H19 RNA. Dieses Gen wird differenziell , beispielsweise in Krebszellen
exprimiert . Unter Anderem aus der Literaturstelle US 2010/0086526 A ist es bekannt, H19 RNA mittels siRNA zu inhibieren. In analoger Weise kann ein
erfindungsgemäßes L-DNAzym Molekül ausgewählt werden, welches bekannte und geeignete Stellen von H19
Nukleinsäuren schneidet, so dass dessen Transskription reduziert oder inhibiert wird. Es ergeben sich
Vorteile, wie bereits vorstehend erläutert.

Claims

Patentansprüche ;
Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die L-DNA zur Bindung an eine L-RNA oder D-RNA, insbesondere in einer antisense Reaktion, und optional zur
Spaltung der L-RNA bzw. D-RNA im Bereich einer Targetsequenz der L-RNA bzw. D-RNA befähigt ist.
Verwendung einer L-DNA, welch zur Bindung an eine L-RNA oder D-RNA, insbesondere in einer antisense Reaktion, und optional zur Spaltung der L-RNA bzw. D-RNA im Bereich einer Targetsequenz der L- RNA bzw. D-RNA befähigt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur
Behandlung von unerwünschten physiologischen Nebenreaktionen, aufgrund der Gabe eines
therapeutischen Moleküls enthaltend die L-RNA bzw. D-RNA.
Verwendung einer L-DNA zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, welche mit einer Überexpression zumindest eines endogenen Genes einhergehen, wobei die L-DNA zur Bindung an eine für das Gen codierende endogene Target-D-DNA oder Target -D-RNA , insbesondere in einer
antisense Reaktion, und optional zur Spaltung einer Targetsequenz der für das Gen codierenden endogenen Target-D-DNA oder Target-D-RNA befähigt ist .
Verwendung nach Anspruch 3 , wobei das
therapeutische Molekül aus der L-RNA besteht, insbesondere eine doppelsträngige L-RNA,
beispielsweise ein Spiegelmer, ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das
therapeutische Molekül ein mit der L-RNA covalent gebundenes Aptamer oder mit der L-RNA covalent gebundenen Antikörper enthält .
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 und 5 bis 6, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung die L-DNA in zumindest der Dosis enthält, welche der Dosis der Gabe der L-RNA entspricht, vorzugsweise in einer Dosis enthält, welche dem 2- bis 100- fachen, vorzugsweise dem 2- bis 20 -fachen, der Dosis der Gabe der L-RNA entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich eine Nukleinsäure enthält,
insbesondere ein 5- bis 100-mer, welches zur AufSchmelzung einer doppelstrangigen D-RNA oder L-RNA im Bereich der Targetsequenz befähigt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine L-DNA zur Behandlung von unerwünschten
physiologischen Nebenreaktionen, aufgrund der Gabe eines therapeutischen Moleküls enthaltend eine L-RNA oder eine D-RNA.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine L-DNA zur Behandlung oder Prophylaxe von
Erkrankungen, welche mit einer Überexpression zumindest eines endogenen Genes einhergehen, wobei die L-DNA zur Bindung an eine für das Gen codierende endogene Target-D-RNA oder Target-D- DNA befähigt ist, insbesondere zu einer antisense Reaktion, und optional zur Spaltung einer
Targetsequenz der für das Gen codierenden endogenen Target-D-RNA oder Target-D-DNA befähigt ist .
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, wobei eine Sequenz aus L-Desoxyribonukleotiden erstellt und synthetisiert wird, welche zur Bindung an eine vorgegebenen Sequenz aus L-Ribonukleotiden oder einer vorgegebenen Sequenz aus D- Ribonukleotiden oder D-Desoxyribonukleotiden befähigt ist und optional zur Spaltung besagter vorgegebener Sequenz befähigt ist, und wobei die so erhaltene L-DNA in pharmakologisch wirksamer Dosis zur Darreichung hergerichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die L-DNA mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen
gemischt wird.
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