KR20140043052A - L-dna를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특히 안티센스 반응에서 L-RNA에 결합할 수 있고 상기 L-RNA의 표적 서열의 영역에서는 L-RNA를 선택적으로 절단할 수 있는 L-DNA로서, 상기 L-RNA를 함유하는 치료 분자의 투여에 의해 야기되는 원치 않는 생리학적 부반응을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도에 관한 것이다. 상기 L-DNA에 의해 내인성 표적 RNA 또는 DNA를 선택적으로 절단할 수 있다.
Description
본 발명은 L-DNA를 함유하는 약제학적 조성물, 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도 및 이러한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
압타머(Aptamer)는 대부분 항체/항원-반응과 유사하게 임의의 표적 분자에 대해 특이적으로 결합하는 2중 가닥의 D-핵산이다(Ellington, A.D. et al., Nature 346:818-822 (1990)). 소정의 표적 분자에 특이적인 압타머는 예를 들면 SELEX-법에 의해 핵산 라이브러리로부터 단리된다(Tuerk, C. et al., Science 249:505-510 (1990)).
압타머는 치료 분야에서 특히 원치 않는 대사산물에 결합하여 억제하는 목적을 갖고 있다. 이에 대한 예로는 발암성 유전자 산물이 알려져 있을 뿐이다. 압타머를 치료용으로 사용시 예를 들면 내인성 뉴클레아제에 의한 바람직하지 않은 약동학, 즉 매우 빠르게 분해되는 약동학을 갖는다는 단점이 있다. 이와 관계없이 상대적으로 작은 분자인 압타머는 신장을 통해 빠르게 배출된다.
스피겔머(spiegelmer)는 기본적으로 압타머이지만, L-뉴클레오티드로부터 형성된다는 점에서 구별된다. 스피겔머는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. L-뉴클레오티드를 사용함으로써 내인성 뉴클레아제에 의한 분해가 방지되고 이에 따라 약동학은 현저하게 개선, 즉 혈청 내 체류 시간이 길어진다. 이와 같이 비-기능성 스피겔머가 2시간에 걸쳐 대사적으로 완전히 안정하다는 것이 문헌 Boisgard, R et al., Eur Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32:470-477 (2005)에 기재되어 있다. 또한 이 문헌에는 예를 들면 방사성 리포터 물질과 결합된 스피겔머의 진단 용도가 기재되어 있다.
예를 들면 문헌 Klussmann, S. et al., Nat Biotechnol 14:1112-1115 (1996)에 기재된 바에 따라 소정의 표적 분자에 대해 특이적인 스피겔머를 동정할 수 있다. 스피겔머와 그의 치료 가능성에 대해서는 문헌 Vater, A. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 6:253-261 (2003)을 참조할 수 있다.
스피겔머의 치료 용도에 있어서 지금까지는 스피겔머가 면역원이 아니라는 점으로부터 출발하였다(Wlotzka et al., Proc Natl Acad Sei USA 99:8898-8902 (2002)). 실제로 본 발명의 기재내용에서 제시하고 있는 시험을 통해 유기체에 있는 L-핵산은 부작용이 완전히 없지 않다는 것을 알 수 있다. 이로부터, 스피겔머 사용시 원치 않는 생리학적 부반응, 예를 들면 내인성 RNA(조절 RNA 포함)에 의한 면역반응 및/또는 원치 않는 효소 반응, 또는 환자에게 투여시 내인성 핵산의 안티센스 억제반응(왓슨-크릭-반응)의 간과할 수 없는 위험이 있다. 특히 임상 1기에서는 단클론성 항체 TGN1412에 의해 음성인 점을 감안하고 위에서 언급한 관계에서 스피겔머의 체류 시간이 기대한대로 비교적 매우 높다는 배경기술로부터 스피겔머의 투여시 사용할 스피겔머에 대한 해독제를 미리 준비하고 원치 않는 생리학적 부반응이 일어날때 신속하게 해독제를 투여하여 혈청 내 (생물학적으로 활성인) 스피겔머의 농도를 즉시 낮추는 것이 바람직하다.
또 다른 관계, 즉 리보자임-촉매 입체 선택적인 딜스-알더 반응으로부터 L-리보자임이 알려져 있는데, 이에 대해서는 문헌 Seelig, B. et al., Angew.Chem. Int., 39:4576-4579(2000)과 Seelig, B. et al., Angew. Chem. 112:4764-4768(2000)을 참조한다.
나아가, 내인성 핵산의 억제를 위한 다양한 산물, 예를 들면 mRNA 또는 다른 비-코딩 핵산이 알려져 있다. 이들의 예에는 안티센스 핵산, siRNA, miRNA, piRNA, 압타머 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 내인성 핵산의 억제에 의해 대사과정이 제어, 억제 또는 전환될 수 있는데, 이는 예를 들면 종양-관련 RNA 분자와도 관련이 있지만 다른 의약 분야에서도 관련성이 있다. 종양-관련 유전자의 예로는 H19 유전자가 알려져 있다. 비-종양 관련 유전자의 예로서, 심부전과 관련하여 중요한 역할을 하는 포스포람반(Phospholamban) 코딩 유전자가 공지되어 있다.
문헌 WO 2010/088899 A2에는 스피겔자임 및/또는 내인성 RNA 분자를 절단하기 위해 L-리보자임을 사용하는 것이 알려져 있다.
L-DNA 자체는 문헌 G. Hayashi et al., Nucleic Acid Symp Ser 49 (1); 261-262 (2005)에 공지되어 있는데, 상기 문헌에는 분자 표지와 같은 핵산이 기재되어 있다.
본 발명의 기술적 과제는 스피겔머와 내인성 핵산을 절단하기 위한 개선된 수단을 제공하는데 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해서 본 발명은 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도로서, 상기 L-DNA는 특히 안티센스-반응(억제성 왓슨-크릭-반응)에서 L-RNA에 결합할 수 있고 L-RNA의 표적 서열의 영역에서는 L-RNA를 선택적으로 절단할 수 있으며 구체적으로 특히 상기 L-RNA를 함유하는 치료 분자의 투여에 의해 야기되는 원치 않는 생리학적 부반응, 특히 내인성 RNA(조절 RNA 포함)와 상기 L-RNA의 면역반응 및/또는 원치 않는 효소 또는 안티센스 반응을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도를 개시한다. 또한 적어도 하나의 내인성 유전자의 과발현을 수반하는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도로서, 상기 L-DNA는 예를 들면 안티센스 반응에서 상기 유전자를 코딩하는 내인성 표적-D-DNA 또는 표적-D-RNA의 표적 서열에 결합할 수 있고 상기 표적 서열을 선택적으로 절단할 수 있는 L-DNA의 용도를 개시한다.
먼저 본 발명은 지금까지의 가설과는 달리 부반응이 전혀 없는 것이 아니라 유기체 내 천연 핵산을 절단하고 그 결과 예측할 수 없는 부작용이 일어날 수 있다는 인식을 바탕으로 한다. 또한 원치 않는 안티센스 반응, 즉 스피겔머와 내인성 핵산 사이의 왓슨-크릭 염기 결합에 의한 내인성 핵산의 억제가 결합된 스피겔머의 효소반응과는 관계없이 가능하다.
본 발명은 놀랍게도 L-DNA가 내인성 D-핵산, DNA와 같이 RNA을 절단하거나 여기에 결합한다는 또 다른 인식을 바탕으로 한다. 이는 당연히 기대되는 것은 아니다. 또한 L-DNA는 특히 효소 분해로부터 안정하여 작은(대개는 부피가 큼) 보호기가 분자에 부착됨으로써 한편으로는 유리한 약동학적 특성을 얻고 다른 한편으로는 세포 내 흡수에 유리하게 된다.
L-RNA에 비해 L-DNA의 놀라운 장점은 세포 내에서 L-RNA에 비해 L-DNA의 활성이 더 높다는 데 있으며, 이에 대해서는 실시예를 참조하기로 한다.
본 발명은 투여된 스피겔머를 특이적으로 절단하거나 여기에 억제적으로 결합하여 특히 원치 않는 부반응과 관련한 생리학적 활성을 방해하는 L-DNA, 즉 L-DNA 기반효소를 이용할 수 있다는 기술적 개시내용을 토대로 하는 인식을 바탕으로 한다. 스피겔머에 대한 예로는: Spiegelmer, NOXC89, NOXA42, NOXA50, NOXB11, NOXA12, NOXE36, NOXF37(모두 NOXXON AG제), Eli Lilly & Co.제의 스피겔머, Firma ARCA biopharm Inc.제의 NU172, ARCHEMIX, ARC1905, ARC1779, ARC183, ARC184, E10030, NU172, REG2, REG1(모두 Archemix Corp.제), AS1411, AS1405(모두 Antisoma Research Ltd.제), Dicerna Pharmaceuticals Inc.제의 DsiRNA, BexCore Inc.제의 RNA Aptamer BEXCORE, Firma Elan Corp Plc.,제의 ELAN 또는 Macugen가 있다. 스피겔머 투여시 원치 않는 부반응을 관찰한 결과, 이러한 L-DNA의 투여 결과 대사로부터 원치 않는 부반응의 원인을 빠르면서 효과적이고 높은 선택성으로 제거할 수 있고 더 정확하게는 L-DNA 투여의 부작용 위험이 극히 낮아진다. 마지막으로 본 발명은 L-데옥시리보뉴클레오티드의 L-DNA의 구성 뿐 아니라 L-DNA, 즉 스피겔머의 표적 서열에 대한 높은 선택성을 바탕으로 한다. 결과적으로, 치료용으로 사용되고 있는 스피겔머에 대해 높은 효율과 선택성이 있는 해독제를 얻고 스피겔머의 원치 않는 부반응을 효과적이면서 빠르게 부작용 없이 억제할 수 있다.
기본적으로 압타머를 포함하는 모든 RNA 분자에 대해 D- 또는 L-뉴클레오티드로부터 구성될 수 있고 RNA 분자의 표적 서열을 절단하여 분리하거나(리보자임으로서 효과) 여기에 억제적으로 결합하는(안티센스 반응) 특이적 L-DNA가 구성될 수 있다. 이러한 L-DNA의 실질적인 특성은 또한 표적 서열에 대한 서열 특이적 결합이다. 이는 임의의 표적 서열에 대한 L-DNA의 부분 서열을 제공할 수 있고 예를 들면 절단 부위를 포함하는 L-DNA의 부분 서열을 표적 서열과 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 범위에서 소정의 표적 서열에 대한 소정의 L-DNA-부분 서열만을 구조적으로 제공하는 것은 적절하지 않다. 따라서 예를 들어 설명한 표적 서열과 L-DNA-부분 서열은 예시적인 것일 뿐, 당업자라면 스피겔머의 소정의 표적 서열에 대해 적절히 구성된, 즉 혼성화하는 L-DNA-부분 서열을 결정하고 L-DNA-부분 서열에 대한 정보를 토대로 L-DNA를 통상적인 수단으로 용이하게 합성할 수 있다.
기본적으로 상기 치료 분자는 스피겔머일 수 있거나 상기 L-RNA는 압타머와 공유 결합될 수 있다. 또한 상기 치료 분자는 L-DNA를 함유할 수 있거나(예를 들면 압타머 제외) L-DNA로 구성될 수 있다. 예를 들면 뉴클레아제로부터 안정화된 압타머의 경우에는 스피겔머/압타머 조합이 존재할 수 있다. 이 경우에 본 발명의 치료 용도는 L-RNA 또는 L-DNA의 절단에 의해 압타머를 뉴클레아제에 접근할 수 있도록 함으로써 결국에는 경우에 따라 부작용을 야기하는 압타머를 혈청으로부터 비교적 빠르게 제거할 수 있다는 데 있다.
또한 L-DNA는 압타머, 항체 또는 펩티드 또는 단백질과 공유 결합할 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들면 압타머 또는 항체와 세포 표면과의 상호작용으로 인해 L-DNA와 압타머 또는 항체의 전체 구조가 세포에 삽입되도록 압타머 또는 항체를 선택할 수 있다.
도 1, 특히 도 1a에 명백히 나타낸 바와 같이 적절한 L-DNA는 기질 서열에 보존된 절단 부위에 작용할 수 있고 자체에 보존된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이에 대한 구체적인 실시예를 도 1c에 나타내었다.
상기 약제학적 조성물은 먼저 L-RNA의 투여량에 상응하는 양의 L-DNA를 함유하고, 바람직하게는 L-RNA의 투여량의 분자수 또는 몰수 기준으로 2 내지 10배에 해당하는 양을 함유한다. 제거할 모든 L-RNA를 확실하게 소산되도록 L-RNA의 양에 비해 과다하게 투여하는 것이 권장된다. 따라서 본 발명에 따른 소정의 절대량은 L-RNA의 소정량에 대한 소정의 상대적 비율을 정밀하게 조절함으로써 L-RNA에 대한 소정량에 관한 지식을 가진 당업자는 용이하게 결정 및 조정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 표적 서열의 영역에서 이중 가닥의 L-RNA에 융합할 수 있는 핵산, 특히 5- 내지 100-mer, 바람직하게는 5- 내지 25-mer의 핵산을 더 함유한다. 이와 관련하여, 표적 서열에 인접한 부분 서열과 혼성화하는 서열이 제공된다. 그 결과, 통상적으로 입체적인 이유로 접근할 수 없는 L-RNA의 절단할 영역에 L-RNA의 3차 구조로 인해 L-DNA가 접근 가능하게 된다. 또한 원하는 절단 부위가 매우 특이적으로 절단되지만 다른 인접 서열과의 해당 이중쌍 또는 삼중쌍은 절단되지 않는다.
본 발명은 또한 L-RNA를 함유하는 치료 분자의 투여로 인해 야기되는 원치 않는 생리학적 부반응, 특히 면역반응을 치료하기 위한 L-DNA를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 본 발명에 따른 L-DNA는 (감염 진행 중에 예를 들면 바이러스 또는 박테리아 소스의 내인성 또는 외인성) 핵산, 실질적으로 RNA 절단 뿐 아니라 DNA를 절단하거나 내인성 핵산에 대한 안티센스 반응에 의해 이들을 억제하기 위해 사용될 수 있다. DNA의 절단에 대해서는 문헌 Lu, Y., et al., Current Opinions in Biotechnology 17:580-588 (2006) 또는 Jiang, D., et al., FEBS 277 (11) :2543-2549 (2010)을 참조하기로 한다. 특히 소정의 RNA 또는 DNA 또는 그 결과 코딩되는 발현 산물의 과발현을 수반하는 질환을 치료할 수 있다. 그 결과, 상기 L-DNA는 이들 발현 산물에 대한 저해제로서 작용하는바, 즉 이를 코딩하는 RNA 또는 DNA의 분해 또는 여기에 안티센스 결합에 의해 발현을 방해하거나 감소시키기 때문이다. 이때, 상기 특이적 표적 서열(즉, 절단하거나 결합할 RNA 또는 DNA의 특이적 표적 서열)은 본 발명의 범위에서 어느 정도 관련이 없는바, 이에 따라 임의의 표적이 억제될 수 있다. 상기 L-DNA 또는 그의 서열은 선택된 절단 부위의 영역에 있는 표적 서열의 서열에 맞게 상술한 방법으로 구성할 필요가 있다. 따라서 치료할 질환이 원인적으로 관련 표적 서열과 연관이 있는 한 기본적인 암시로 이해될 수 있다. 이하의 내용은 단지 예로서 언급될 뿐 이와 관련하여 본 발명의 이용 가능성은 결코 한정되지 않는다.
상기 약제학적 조성물과 관련하여 상술한 실시예와 후술하는 실시예 모두가 유사하게 적용된다.
마지막으로 본 발명은 이러한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 특히 안티센스 반응을 위해 L-리보뉴클레오티드의 소정의 서열 또는 D-리보뉴클레오티드 또는 D-데옥시리보뉴클레오티드의 소정의 서열에 결합할 수 있고 상기 서열을 선택적으로 절단할 수 있는 L-데옥시리보뉴클레오티드의 서열을 제공 및 합성하고, 이렇게 얻어진 L-DNA를 약리학적으로 유효한 투여량으로 제제화하는 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여 상기 L-DNA를 전형적으로 생약적 보조제 및/또는 부형제와 혼합한다. 제제화 범위에서 (L-DNA의) 엔도시토시스를 필요로 하는 종래의 물질들은 L-DNA에 공유 결합시키거나 조성물을 별도로 혼합할 수 있다.
기본적으로 하나 이상의 생리학적으로 친화성이 있는 보조제 및/또는 부형제를 L-DNA와 혼합할 수 있고 상기 혼합물을 국소 또는 전신 투여, 특히 경구, 비경구용, 목표로 하는 기관에 주입용, 주사용(예를 들면 정맥내, 근육내, 관절내 또는 요추내), 치은구(치근과 잇몸 사이 공간)에 대한 도포용 및/또는 흡입용으로 생약적으로 제제화할 수 있다. 첨가제 및/또는 보조제의 선택은 투여형태의 선택에 따라 다르다. 이와 관련하여 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 생약적 제제화는 종래의 방법에 따라 수행할 수 있다. 이온성 화합물에 대한 대이온으로서 Mg++, Pb++, Mn++, Ca++, CaCl+, Na+, Li+ 또는 시클로헥실암모늄 또는 Cl-, Br-, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 락테이트, 옥살레이트, 말로네이트, 말레에네이트, 시트레이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 푸트레신, 카다베린, 스페르미딘, 스페르민 등을 예로 들 수 있다. 적합한 고상 또는 액상의 약제학적 제형의 예로서 과립제, 미분제, 당의정, 정제, (미소)캡슐제, 좌제, 시럽제, 주스제, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사액제(정맥내, 복강내, 근육내, 피하 주사) 또는 분무제(에어로졸), 건조 분말 흡입용 제형, 경피계 및 유효성분의 서방형 제제를 들 수 있고, 이들을 제조할 때 부형제, 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽윤제, 활택제 또는 윤활제, 향미제, 감미제, 용해제와 같은 통상적인 보조제를 사용할 수 있다. 또한 예를 들면 흡입제형을 제조하기 위해 바람직한 생물학적 분해성 나노캡슐 내에 유효성분을 캡슐화하거나 다공성 나노입자의 기공 내에 캡슐화하여 생물학적으로 분해하거나 안정화할 수도 있다. 또한 예를 들면 스피겔자임(spiegelzyme)과 스피겔머 또는 압타머의 세포 표적화를 위해 D- 및 L-핵산의 나노입자를 사용할 수도 있다(N.C., Nano Lett. 10(6): 1971-1978 (2010); Sigh, W., Nature 478(7368): 225-228 (2011); Sigh, W. Synapse 65(12): 1289-97 (2011) Zhao, W. et al, Nanotechnology 22(49): 490201 (2011); Hilt, J.Z., Adv Drug Deliv. Rev. 56(11): 1533-1536 (2004); Lin, C, et al., Biochemistry 48(8): 1663-1674 (2007) 참조). 보조제로서 예를 들면 탄산나트륨, 탄산마그네슘, 중탄산마그네슘, 이산화티탄, 락토오스, 만니톨과 기타 당류 또는 시클로덱스트린, 활석, 유단백질, 젤라틴, 전분, 셀룰로오스와 이들의 유도체, 간유, 해바라기유, 땅콩유 또는 참기름과 같은 동물성 및 식물성 오일, 폴리에틸렌글리콜, 멸균수와 같은 용매 및 예를 들면 글리세린과 같은 1가 이상의 다가 알코올이 알려져 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제조할 수 있고, 본 발명에 따라 사용되는 적어도 하나의 물질 조합의 소정량을 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 기재와 경우에 따라 소정량의 적절한 다른 유효성분, 첨가제 또는 보조제와 혼합하고 원하는 투여형태로 제제화한다. 희석제로서 폴리글리콜, 물, 디메틸설폭사이드(예를 들면 피부질환 또는 류마티스 치료를 위한 제제의 경우)와 완충액을 예로 들 수 있다. 적합한 완충제로서 예를 들면 N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, N-벤질펜에틸아민, 디에틸아민, 포스페이트, 중탄산나트륨 또는 탄산나트륨을 들 수 있다. 희석제 없이도 가공할 수 있음은 물론이다. 생리학적으로 허용되는 염은 예를 들면 젖산, 염산, 황산, 아세트산, 시트르산, p-톨루엔설폰산과 같은 무기 또는 유기산과의 염, 또는 예를 들면 NaOH, KOH, Mg(OH)2, 디에탄올아민, 에틸렌디아민과 같은 무기 또는 유기 염기과의 염, 또는 예를 들면 아르기닌, 라이신, 글루타민산 등과 같은 아미노산과의 염, 또는 예를 들면 CaCl2, NaCl과 같은 무기염 또는 이의 유리 이온, 예를 들면 Ca++, Na+, Pb++, Cl-, S04 2- 또는 이에 상응하는 염과 Mg++ 또는 Mn++의 유리 이온과의 염, 또는 이들의 조합이 있다. 이들은 표준 방법에 따라 제조된다. pH-값은 5 내지 9, 특히 6 내지 8의 범위로 조절하는 것이 바람직하다.
위에서 이미 설명한 본 발명의 변형예는 적어도 하나의 내인성 유전자의 과발현을 수반하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 L-DNA의 용도에 관한 것으로, 상기 L-DNA는 특히 안티센스 반응을 위해 유전자를 코딩하는 표적-D-RNA 또는 표적-D-DNA의 표적 서열에 결합할 수 있고 상기 표적 서열을 선택적으로 절단할 수 있다는 점에서 독립적인 의미를 갖는다. 상기 L-DNA를 관련 바이러스 또는 박테리아의 표적 서열에 결합시키기 위해 제공할 때 바이러스 또는 박테리아의 감염을 치료 또는 예방할 수 있다. 그 외에는 상술한 바와 유사하게 적용한다. 이와 관련하여 중요한 것은 본 발명의 상기 요지의 또 다른 변형예는 미생물에 의한 포유류의 감염을 수반하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 L-DNA의 용도에 관한 것으로, 상기 L-DNA는 미생물의 유전자를 코딩하는 표적-D-RNA 또는 표적-D-DNA의 표적 서열을 절단(또는 특히 안티센스 반응을 위해 상기 표적 서열에 결합)할 수 있다는 점에서 의미가 있다. 미생물의 예로서 특히 바이러스, 박테리아와 진균을 언급할 수 있다. 기본적으로 상기 L-DNA를 적어도 부분적으로 알려져 있는 유전자 서열을 가진 임의의 미생물의 핵산에 결합하거나 상기 핵산을 절단하기 위해 사용할 수 있고, 절단할 유전자 서열의 영역은 예를 들면 미생물의 활성 및/또는 그의 복제 가능성이 약화 또는 억제되고/또는 세포 표면에 대한 결합이 약화 또는 억제되도록 선택한다.
본 변형예에서는 상기 L-DNA를 안티센스 반응을 통한 억제 또는 특히 mRNA 또는 조절 RNA, 예를 들면 siRNA, microRNA, shRNA, ncRNA, tRNA, rRNA 등을 포함하는 D-RNA의 절단을 위해 사용할 수 있고 D-DNA의 절단 또는 D-DNA에 결합하기 위해 사용할 수도 있다. 그 결과, 유전자 또는 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 코딩 또는 비코딩 RNA가 억제될 수 있다. 이는 질환이 없는 유기체의 발현에 비해 소정의 유전자의 과발현을 수반하는 모든 질환의 치료용도에 적용된다.
본 변형예는 한편으로는 표적 서열의 절단 또는 표적 서열에 대한 결합이 매우 높은 특이성으로 수행되고 따라서 조절계와 여타의 간섭없이 수행되는 장점이 있다. 또한 예를 들면 siRNA와 같은 억제성 D-핵산의 사용을 수반하는 부작용이 확실하게 방지될 수 있다. L-RNA 리보자임과 L-DNA 기반효소는 siRNA(Risc 인자 등) 외에는 보조 분자를 필요로 하지 않음으로써 원치 않는 부반응을 크게 감소시킬 수 있다.
최종적으로 2개의 L-DNA 또는 L-DNA 기반효소를 조합하여 사용할 수 있되, 상기 서열은 2중 가닥의 DNA 또는 RNA가 절단될 수 있도록 선택된다.
약제학적 조성물 제조를 위한 본 발명에 따른 L-DNA의 용도의 범위에서 다른 변형예도 가능하다.
먼저, L-DNA는 또 다른 핵산에 결합하기 위해 사용할 수 있을 뿐 아니라 기본적으로 D-핵산의 압타머의 공지된 용도와 유사할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 L-DNA에 의해 원칙적으로는 유기체에 있는 모든 표적 분자를 결합하여 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 당업자에게 알려져 있는 압타머의 모든 기술은 L-DNA 압타머에 대해서 적용될 수 있다.
소정의 표적에 결합하는 L-DNA는 하기 방법으로 얻을 수 있다. 선택된 표적 분자를 스크리닝 분석의 고정상(또는 고상, 예를 들면 자기 비드)에 결합한다. 상기 스크리닝 분석은 고정상 외에 고정상과 접촉 상태에 있거나 고정상에 접촉하게 되는 이동상(대부분의 경우에 핵산과 표적 분자가 안정화되고 결합될 수 있는 수용액임)을 포함한다. 상기 이동상은 L-DNA 라이브러리, 즉 폴리뉴클레오티드, 전형적으로 10 내지 500개의 뉴클레오티드의 길이를 갖고 서열은 가변적이며 일반적으로 무작위적인 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 이러한 L-DNA 라이브러리는 D-DNA 라이브러리의 발생으로부터 알려진 통상적인 합성 방법으로 제조할 수 있다. 상기 접촉에 의해 이러한 L-DNA 분자는 표적 분자에 결합할 수 있는데, L-DNA 분자의 서열에 의해 표적 분자에 대해 안정한 반데르발스 결합이 가능한다. 이와 관련하여 결합 강도는 전형적으로 해리 상수가 100 nmol 미만, 바람직하게는 100 pmol 미만, 더욱 바람직하게는 1 pmol 미만의 값에 해당하는 상태에 있을 수 있다. 이어서, 상기 이동상(결합되지 않거나 약하게 결합되어 있는 핵산을 가진)을 예를 들면 하나 이상의 세척 공정단계에 의해 고정상으로부터 분리한다. 그후, 상기 고정상을 D-DNA 라이브러리를 구비한 표적 분자와 결합된 L-DNA 분자와 접촉시킨다. 상기 표적 분자에 결합된 L-DNA와 혼성화된 D-DNA를 L-DNA에 결합함으로써 표적 분자/L-DNA/D-DNA의 복합체를 생성한다. 결합되지 않은 D-DNA는 이동상과 함께 재차 제거한다. 다음, 이렇게 얻어진 복합체로부터 D-DNA를 종래의 방법으로 용출, 즉 이동상으로 이동시킨다. 이렇게 얻어진 D-DNA 분자를 경우에 따라서 증폭시키고(예를 들면 PCR에 의해) 적어도 서열을 결정할 수 있다. 이렇게 얻어진 D-DNA의 서열로부터 상보적인 L-DNA를 결정 및 합성할 수 있다. 이와 다르게, 상기 L-DNA를 표적 분자로부터 용출할 수 있고 본 명세서의 다른 단락에 기재되어 있는 서열 결정 방법에 의해 서열을 결정할 수 있다. 기본적으로 본 단락에 기재되어 있는 공정으로 고정상 없이도 실시할 수 있고, 그 대신에 상기 표적 분자를 고정상에 결합하고 표지 분자에 결합할 수 있다. 다음, 상기 복합체 표적/결합된 L-DNA로부터 결합되지 않은 L-DNA를 통상적인 방법으로 표지 분자의 결합과 표지 분자를 동반하지 않는 분자의 분리에 의해 실시할 수 있다. 이 외에는 본 실시예에서는 상술한 바와 매우 유사하게 실시한다.
결과적으로 상기 표적 분자에 대해 높은 친화성으로 결합하는 L-DNA 분자종 또는 이러한 분자종의 혼합물을 얻을 수 있다. 다음, 상기 분자종 또는 그의 혼합물은 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 범위에서 임의의 의미로 사용할 수 있다. 다음, 상기 의미는 표적 분자가 통상적으로 질환과 관련하여 인과관계로서 알 수 있고 상기 질환의 치료 또는 예방을 위해 억제되는 바에 따라 다르다.
표적에 결합한 L-RNA는 적절한 방법으로 단리 또는 결정할 수 있다. 이와 관련하여, L-DNA 라이브러리 대신에 L-RNA 라이브러리를 사용할 수 있다.
또 다른 방법으로, (임의의) 표적, 예를 들면 표적 분자에 바이러스, 박테리아, 진균 또는 그 밖의 세포(또는 이들의 단편)에 결합하는 L-DNA 또는 L-RNA을 단리 또는 결정 및 제조할 수 있다. 이를 위해, L-핵산 라이브러리를 제공할 수 있고, 핵산에 선택적으로 연결 분자 또는 표지 분자를 결합하고, 예를 들면 비오틴을 5'-말단에 결합한다. 상기 표적 분자를 고상, 예를 들면 자기 비드에 결합한다. 다음, 상기 고상을 핵산 라이브러리와 접촉시킨다. 이때, 이들 L-핵산을 높은 결합 친화도를 가진 표적 분자에 결합시킨다. 상기 고상은 하나 이상의 세척 공정 단계로 처리하여 결합되지 않은 L-핵산을 제거한다. 다음, 상기 L-핵산을 재차 용출하여 종래의 방법으로 표적 분자로부터 분리한다. 다음, 마지막으로 이렇게 얻어진 L-핵산의 서열 결정은 본 명세서의 다른 단락에 기재되어 있는 바대로 실시한다.
본 발명에 따른 용도의 범위에서 L-DNA의 잠재적 부작용에 대해 시험하기 위해 L-DNA를 사용할 수 있다. 이러한 시험 방법의 범위에서는 유망한 유효성분으로서 선택된 상기 L-DNA(또는 더 많은 수의 동일한 L-DNA 분자들)를 세포 추출물, 예를 들면 치료할 유기체의 세포 추출물과 접촉시키고 통상적인 수단으로 상기 세포 추출물 내에서 표적 분자가 L-DNA에 결합하는지 또는 다른 분자도 결합하는지를 측정한다. 첫 번째 경우에, 유망한 유효성분이 가장 발생 확률이 높은 부작용이 없다는 것은 다른 세포 구성성분이 표적 분자로서 결합되거나 억제되지 않았다는 것을 의미한다. 후자의 경우에는 부작용이 예상될 수 있다.
L-핵산의 서열 결정은 본 발명의 다른 요지와는 독립적인 것으로 다양한 방법으로 실시할 수 있다. L-RNA 또는 L-DNA의 서열 결정을 위한 첫 번째 방법에서는 상기 L-핵산을 고상에 결합시킨다. 이는 예를 들면 상기 핵산이 연결 분자 또는 비오틴과 같은 표지 분자를 함유할 수 있도록 (상술한 바와 같이) 실시할 수 있다. 다음, 상기 고상은 연결 분자에 상보적이면서 연결 분자에 결합한 분자, 예를 들면 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 동반할 수 있다. 다음, 상기 고상에 결합된 L-핵산을 D-DNA 라이브러리와 접촉시킨다. 이와 관련하여, 상기 라이브러리의 이러한 D-DNA 분자를 상보 서열을 함유하거나 상보 서열로 이루어진 L-핵산과 혼성화한다. 다음, 상기 고상을 하나 이상의 세척 공정단계로 세척하여 결합되지 않은 D-DNA를 제거한다. 이후, 결합된 D-DNA를 L-핵산으로부터 분리한다. 이어서, PCR에 의한 증폭을 실시한다. 이후, D-DNA의 서열을 결정한다. 다음, 이렇게 얻어진 D-DNA 서열로부터 L-핵산의 상보 서열을 결정한다.
이와 달리, L-핵산, 특히 L-RNA의 서열을 후술하는 바와 같이 서열 결정 방법으로 결정할 수 있다. 이와 관련하여 상기 핵산은 말단, 예를 들면 5'-말단에 연결 분자 또는 표지 분자, 예를 들면 비오틴을 동반한다(상술한 바와 같이). 다음, 상기 핵산을 "조절자"로 분해, 즉 가수분해 방법으로 다양한 길이의 핵산 단편을 얻는데, 이상적인 경우에는 1 염기 내지 전체 핵산의 염기 수에 이르는 핵산 단편이 얻어진다. 상기 분해는 L-RNA의 경우에 전형적으로 pH가 >8이고, 대개 8.5-10인 알칼리에서 실시할 수 있다. 이를 위해 KOH 또는 탄산수소나트륨을 포함하는 시판 중의 가수분해 완충액을 이용할 수 있다. 다음, 여전히 연결 분자를 동반하는 이렇게 얻어진 단편을 고상에 결합시킨다. 이때, 상기 고상은 연결 분자에 상보적이고 상기 연결 분자에 결합하는 분자, 예를 들면 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 동반한다. 다음, 상기 고상은 하나 이상의 세척 공정단계에 의해 처리하여 연결 분자를 동반하지 않은 핵산 단편을 제거한다. 결국, 표지된 핵산 단편의 조절자가 남게 된다. 다음, 상기 조절자를 고상으로부터 용출하고 질량분광법으로 검사한 다음, 측정한 질량과 그의 분포를 참조하여 N-핵산의 고유한 서열을 결정할 수 있다. L-DNA의 경우에 적절한 방법, 이 경우에는 pH < 6, 바람직하게는 < 5의 산에서 가수분해에 의해 "조절자"를 얻는다.
적용할 수 있는 mRNA 서열을 결정하기 위해 L-DNA 또는 스피겔자임을 사용할 수도 있다. 이 경우, siRNA, microRNA와 스피겔자임에 대해 적용 가능한 이러한 mRNA 서열을 결정하는 것은 컴퓨터 기술에 의한 2차 구조 예측이 매우 불확실하기 때문에 매우 어렵다. RNA 분자의 3차원 접힘 배치에 대해 너무 적은 것이 알려져 있어 컴퓨터 프로그램은 충분하지 않기 때문이다. 다른 한편으로, 세포 내에서 mRNA는 용액 중에 유리 상태로 접힘되어 있다는 것을 예상할 수 있다. 이 때문에 siRNA, microRNA와 스피겔자임의 사용을 최적화할 필요성이 매우 크다. 이는 예를 들면 진핵 또는 원핵세포의 생체외 계(예를 들면 독일 RiNA GmbH에서 구입 가능)에서 결정된 (소정의) mRNA를 번역하고 다양한 스피겔자임(유망한 유효성분)에 따라 단백질의 수율을 시험하는 생체외 단백질 생합성에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면 L-리보자임, siRNA 등과 같은 종래기술의 분자 가위(scissor)는 보조 분자를 필요로 하기 때문에 안정성과 환경적인 면에서 적합하지 않다.
본 명세서에 기재되어 있는 관련성과 무관하게 또한 별도의 독립적인 발명에 따르면, L-DNA는 비-약제학적인 목적을 위해 사용할 수도 있다. 하나의 사용 분야는 보안 및/또는 인증용으로 물품 또는 사람을 L-DNA로 표지화 및/또는 사람의 신분을 확인하는 것이다. 이와 관련하여, 상기 L-DNA는 물품 또는 사람에 적용하고 이들의 존재 및/또는 이들의 서열을 적절한 방법으로 검사한다.
물품으로서는 원칙적으로 모든 물품을 예로 들 수 있고, 도난 방지를 위해 표지화되어 있는 진본을 검사하거나 소유자에게 귀속시킬 수 있어 바람직하다. 제1군에는 소위 보안 및/또는 증명서류, 예를 들면, 여권, 신분증, 운전면허증, 자동차 증명서, 비자 등의 증명서류 및/또는 예를 들면 출입카드, 회원카드, 은행권, 티켓, 세관직인, 우체국직인, 신용카드 또는 접착 라벨(예를 들면 제품 보안)과 같은 신분확인서류 등이 포함된다. 물건의 가치를 나타내고 도난 방지를 위한 제2군에 속하는 물품으로는 예를 들면 보석, 시계, 기타 귀중품, 기술장비, 자동차 등이 있다. L-DNA를 사용하여 물품을 개별화할 수 있는데, 즉 물품을 그 물품에 대해 특징적인 서열과 그 물품에 대해서만 특징적인 서열을 포함하는 L-DNA로 표지할 수 있다. 이러한 서열이 사람 또는 소유자에게 귀속되면, 물품에 적용된 L-DNA의 서열을 결정함으로써 그 사람 또는 소유자에 물품을 귀속시킬 수 있다. 바람직한 사용 분야로는 약제학적 제품 또는 그의 포장 또는 박물관 전시물 등이 있다.
사람에 대한 표지는 예를 들면 침해의 경우에 바람직할 수 있다. 다음, 피해자는 가해자에 대해 예를 들면 L-DNA를 함유하는 스프레이를 뿌림으로써 가해자 본인 또는 가해자의 옷에 있는 L-DNA를 검출함으로써 가해자를 식별할 수 있다. 또한 예를 들면 무자격 구내 출입자를 표지하기 위한 자동 분무 장치를 제공할 수도 있다. 이와 관련하여, 경보 장치와 연결되어 있는 분무 장치를 작동시키면 경보 장치의 센서는 경보 장치의 경보 상태에서 분무 장치의 작동범위 내에 사람이 있다는 것을 검출하게 된다. 다음, 분무 장치에 포함되어 L-DNA를 함유하는 용액을 그 사람에게 분무한 후, 상술한 바와 같이 신분을 확인할 수 있다.
이러한 목적을 위한 D-핵산의 사용은 실제로 알려져 있지만, 예를 들면 뉴클레아제에 의해 승인되지 않은 사람으로부터 D-핵산이 분해될 수 있다는 단점이 있다. 이는 특히 도난으로부터 물품을 보호하는 경우나 사람을 표지하는 경우에 방해되는데 이는 뉴클레아제의 사용에 의해 표지가 분해되어 제거되기 때문이다. 이 밖에도 N-핵산의 사용은 (D-핵산과는 달리) 사람의 게놈에 삽입되지 않아 질환, 특히 종양 진행을 유도할 위험성이 없다는 장점이 있다.
이와 관련하여, 본 명세서에 기재되어 있는 발명은 물품 또는 사람을 표지화하기 위한 방법으로서, 상기 물품 또는 사람 또는 그의 옷에 L-DNA를 제공하고 상기 L-DNA를 물품, 사람 또는 그의 옷에 고정시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 외부 또는 내부에 고정된 L-DNA를 포함하는 물품에 관한 것이다. 본 발명은 또한 물품 또는 사람을 식별하기 위한 방법으로서, 상기 물품 또는 사람 또는 그의 옷에 L-DNA의 존재 여부에 대한 분석, 경우에 따라 추가로 서열 분석 처리하는 방법에 관한 것이다.
여기서, 상기 용어 표지화는 물품 또는 사람의 외부 또는 내부에 없었던 특징을 물품 또는 사람에 부착함으로써 상기 물품 또는 사람을 식별하는 것을 의미한다. 모든 경우에, 특징이라 함은 소정의 구조를 갖고 (의도한) 표지화 이외에는 다른 상황에 의해서 물품 또는 사람에 미치지 않는 것을 의미한다.
상기 고정화는 D-핵산에 의한 표지화와 관련하여 알려진 모든 기술에 의해 실시할 수 있다. 가장 단순한 경우는 상기 L-DNA를 함유하는 용액, 특히 수용액을 물품 또는 사람 또는 그의 옷에 도포하고 건조하는 것이다. 그러나 용해 또는 분산된 결합제를 추가로 함유하는 제형에 상기 L-DNA를 포함시키는 것이 바람직하다. 기본 제형으로는 pH가 9 미만, 바람직하게는 8 미만인 한 기본적으로 경화되지 않은 모든 액체 또는 페이스트 형태의 래커 결합제 제형, 접착제 제형 등이 적합하다. 용매로서 물 이외에 래커 기술분야 또는 접착제 기술분야에서 통상적인 모든 용매를 예로 들 수 있다. 이는 사용 가능한 결합제와 종래기술의 첨가제에 대해서도 동일하다. 표지할 물품 또는 표지할 사람에 상기 제형을 도포한다. 도포할 용액 또는 제형은 ml 당 바람직하게는 1 또는 10^1 내지 10^16, 바람직하게는 10^3 내지 10^12, 특히 10^3 내지 10^9개의 L-DNA 분자를 함유한다. 상기 L-DNA 분자의 적어도 10%, 바람직하게는 50%는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일 변형예에서, 상기 L-DNA는 5'- 또는 3'-말단에서 공유 결합된 광발광 리포터 분자기를 동반하되, 상기 분자기는 또한 UV 조사에 의해 여기시 발광, 특히 형광을 수행하도록 선택된다. 리포터 분자기로서 생화학 분야에서 종래의 모든 발광 분자기가 사용 가능하다. 본 발명에 따라 표지된 물품 또는 표지된 사람을 UV 광으로 조사하면 그 결과 여기된 발광을 참조하여 표지화 여부를 육안으로 식별하거나 장치를 이용하여 검출할 수 있다. 상기 L-DNA는 대향 말단에 표지자 기, 예를 들면 비오틴이 공유 결합하여 동반될 수 있다. 다음, L-DNA에 의한 표지화가 양성으로 검출될 때까지 절단과 서열 결정을 상술한 방법 중 하나에 따라 실시할 수 있다. 다음, 상기 서열과 함께 경우에 따라 결정된 서열 중 하나에 등록된 사람 또는 회사에 대한 할당을 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 L-DNA는 먼저 불변 서열 블록 및/또는 가변 서열 블록을 함유할 수 있다. 상기 불변 서열 블록은 L-DNA에 의한 모든 또는 적어도 일군의 표지화에 대해 동일한 것으로, 즉 모든 표지화는 상기 서열 블록의 서열을 가진 부분 서열을 함유한다. 다음, 상기 가변 서열 블록은 개별화될 수 있다. 개별화는 예를 들면 UV에 의한 조사에 의한 검출이 상기 서열 블록을 가진 L-DNA의 존재에 추가로 의존할 때 유리하다. 그 결과, 본 발명에 따른 L-DNA의 존재와는 관계없이 임의의 발광 재료로부터 나타날 수 있는 광효과에 대해 서로 차이가 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 따라 사용한 L-DNA가 분자 비콘의 구조를 가질 때 더 유리하다. 이와 관련하여 헤어핀 또는 스템-루프 구조를 가진 단일 가닥의 핵산이 제공될 수 있는데, 상기 스템을 형성하는 말단은 한편으로는 발광 분자를 동반하고 대향 위치에서는 소광제, 예를 들면 Dabcyl을 동반한다. 상기 말단 중 적어도 하나는 (전형적으로 5 내지 20개의 염기쌍 길이의) 불변 서열(서열 블록)이다. 상기 L-DNA의 비-혼성화된 상태에서는 형광이 소광제에 대한 Forster-공명 에너지 전이에 의해 억제되고 UV 조사시 광효과가 전혀 나타나지 않는다. 그 결과, 상기 L-RNA의 검출은 먼저 표지된 영역에 상기 L-DNA에 상보적인 핵산, 특히 L-DNA의 불변 서열 블록의 용액을 분무하여 실시한다. 상기 L-DNA는 불변 서열과 혼성화함으로써 발광 분자와 소광제는 서로 분리된다. 이에 따라 상기 표지를 UV광으로 조사하면 형광을 관찰하거나 장치를 이용하여 검출할 수 있다. 다음, 경우에 따라 가변 서열 블록의 용출과 서열 결정을 상술한 바와 같이 실시한다.
상술한 바람직한 실시형태의 일 변형예에 있어서, 상기 표지의 L-DNA는 단일 가닥으로서 존재할 뿐 아니라 (더 긴) 단일 가닥의 하나의 말단(항상 3' 또는 5' 중 어느 하나의 말단을 의미함)은 발광 분자를 동반한다. 상기 말단은 소정 개수의 염기의 불변 서열 블록을 형성한다. 여기에 하나의 말단에서 소광제를 동반하는 상보적인 L-DNA가 혼성화하되, 실제로 상기 소광제는 발광 분자에 충분히 가까이 배치되어 발광을 억제한다. 상기 상보적인 L-DNA의 길이는 불변 서열 블록의 길이에 비해 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 5개의 염기만큼 짧다. 불변 서열 블록에 상보적이고 그 길이가 각각의 L-DNA 보다 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 5개의 염기만큼 길며 소광제를 동반하는 L-DNA를 가진 용액인 경우에, 소광제에 의해 치환되고 불변 서열 블록과 혼성화한다. UV 조사를 실시하면 발광 분자와 표지자를 쉽게 관찰할 수 있고 기계를 이용하여 검출할 수 있다. 이어서, 상술한 바와 같이 용출 및 서열 결정하여 경우에 따라 가변 서열을 결정할 수 있다.
따라서 본 발명은 목록 시스템을 포함하는 데이터 뱅크를 포함하고, 가변 서열 블록의 데이터 뱅크에서 다양한 L-DNA 표지자를 검출하고 사람, 회사 또는 기관에 할당한다. 목록 시스템에 의해 표지자로부터 결정되는 가변 서열 블록은 할당하고자 하는 기관, 박물관, 회사 또는 개인에 쉽게 할당될 수 있다.
기본적으로 상술한 L-DNA의 용도는 L-RNA와 유사하게 용이하게 실시할 수 있음에 주목해야 한다.
이하, 도면과 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 도면에서:
도 1은 각각 나열된 표적 서열 특이성과 보존된 구조 요소를 가진 본 발명에 따른 L-DNA(a)와 해머헤드 리보자임(b)의 일반적인 구조, 및 녹색 형광 단백질 GFP(b)의 동일한 표적 서열에 대한 결합 후 구체적인 L-DNA의 결합(c) 및 구체적인 해머헤드 리보자임의 결합(d)을 비교한 2차 구조를 나타내는 도면이고(Zaborowska, Z., et al., The Journal of Biological Chemistry 277 (43): 40617-40622 (2002), Kim, K., et al., Bull. Korean Chem. Sco. 27(5: 657ff (2006), und Hertel, K.J., et al., Nucleic Acids Research 20 (12): 3252ff (1992) 참조),
도 2: L- 및 D-DNA 기반효소와 해머헤드에 리보자임에 의한 L- 및 D-GFP 표적 서열의 절단에 대한 분석을 보여주는 도면이고,
도 3: L-DNA 기반효소(L-Dz)에 의한 D-GFP 표적 서열과 D-DNA 기반효소에 의한 L-GFP 표적 서열의 절단의 MgCl2-농도 의존성을 비교하고 있는 도면이고,
도 4: 절단 부위의 결정과 함께 L-DNA 기반효소(L-Dz)에 의한 D-GFP 표적 서열의 절단의 MgCl2-농도 의존성을 비교하고 있는 도면이고,
도 5: 다양한 효소 농도와 24시간 배양시 GFP-감염된 세포에서 다양한 DNA 기반효소와 RNA 기반효소의 활성을 비교하고 있는 도면이고,
도 6: 도 5의 결과를 형광 세기의 표시에 따라 정량화한 도면이고,
도 7: 다양한 효소 농도와 24시간 배양시 L-DNA 기반효소와 L-리보자임의 활성을 직접 비교하고 있는 도면이고,
도 8: 도 7의 결과를 형광 세기의 표시에 따라 정량화한 도면이고,
도 9: 48시간 배양 후 도 5의 물품을 보여주고 있는 도면이고,
도 10: 도 9의 결과를 형광 세기의 표시에 따라 정량화한 도면이다.
도 1은 각각 나열된 표적 서열 특이성과 보존된 구조 요소를 가진 본 발명에 따른 L-DNA(a)와 해머헤드 리보자임(b)의 일반적인 구조, 및 녹색 형광 단백질 GFP(b)의 동일한 표적 서열에 대한 결합 후 구체적인 L-DNA의 결합(c) 및 구체적인 해머헤드 리보자임의 결합(d)을 비교한 2차 구조를 나타내는 도면이고(Zaborowska, Z., et al., The Journal of Biological Chemistry 277 (43): 40617-40622 (2002), Kim, K., et al., Bull. Korean Chem. Sco. 27(5: 657ff (2006), und Hertel, K.J., et al., Nucleic Acids Research 20 (12): 3252ff (1992) 참조),
도 2: L- 및 D-DNA 기반효소와 해머헤드에 리보자임에 의한 L- 및 D-GFP 표적 서열의 절단에 대한 분석을 보여주는 도면이고,
도 3: L-DNA 기반효소(L-Dz)에 의한 D-GFP 표적 서열과 D-DNA 기반효소에 의한 L-GFP 표적 서열의 절단의 MgCl2-농도 의존성을 비교하고 있는 도면이고,
도 4: 절단 부위의 결정과 함께 L-DNA 기반효소(L-Dz)에 의한 D-GFP 표적 서열의 절단의 MgCl2-농도 의존성을 비교하고 있는 도면이고,
도 5: 다양한 효소 농도와 24시간 배양시 GFP-감염된 세포에서 다양한 DNA 기반효소와 RNA 기반효소의 활성을 비교하고 있는 도면이고,
도 6: 도 5의 결과를 형광 세기의 표시에 따라 정량화한 도면이고,
도 7: 다양한 효소 농도와 24시간 배양시 L-DNA 기반효소와 L-리보자임의 활성을 직접 비교하고 있는 도면이고,
도 8: 도 7의 결과를 형광 세기의 표시에 따라 정량화한 도면이고,
도 9: 48시간 배양 후 도 5의 물품을 보여주고 있는 도면이고,
도 10: 도 9의 결과를 형광 세기의 표시에 따라 정량화한 도면이다.
실시예 1: 절단 분석
L-리보자임과 D-리보자임의 활성을 다양한 조건에서 측정하였다. 기본 조건은 다음과 같았다. 0.2 μM 표적 RNA 또는 DNA를 10 ㎕ 반응 혼합물과 함께 pH 7.5의 50 mM 트리스-HCl 완충액 중 2 μM DNA 기반효소 또는 RNA 기반효소가 존재하는 상태에서 20℃에서 2시간 동안 배양하였다(그 결과 DNA 기반효소 또는 RNA 기반효소/표적 비율은 10:1이었다). 반응 전에 표적 RNA 또는 DNA와 DNA 기반효소 또는 RNA 기반효소를 2분간 72℃에서 변성시키고 가열 블록에서 25℃까지 서서히(1℃/분) 냉각하였다. Mg2+-이온의 영향을 0.1 내지 10 mM의 농도에서 시험하였다. 절단 산물을 pH 8.3의 0.09 M 트리스-붕산염 완충액 중 7 M 요소가 존재하는 상태에서 20% 폴리아크릴아미드 전기영동법으로 분리하였다. 형광 분석은 인 영상장치인 Fuji Film FLA 5100 상에서 실시하였다. 프로그램 Fuji 분석 프로그램으로 데이터를 얻었다. 그래프는 엑셀로 제공하였다.
실시예 2: 표적 서열과 L-리보자임의 제조
모든 표적 서열은 화학적 합성법으로 제조하였다. 합성 산물의 순도는 90%가 넘었다.
A1 DNA 기반효소- 또는 RNA 기반효소-서열은 표적 서열에 따라 가변 영역 절단 부위 3중쌍 주위에서 DNA 기반효소 또는 RNA 기반효소를 선택하였고 RNA 기반효소- 또는 DNA 기반효소-서열은 합성하여 제조하였다. 합성 산물의 순도는 85%가 넘었다.
모든 합성 산물은 5--말단에서 형광색소로 표지하였다.
실시예 3: 세포 내 활성 측정
HeLa 세포를 방법 후 1 ㎍ EGFP 플라스미드로 감염시켰다. 이후, 사용할 DNA 기반효소 또는 RNA 기반효소의 25, 50 또는 100 nM 용액으로 배양하였다. 24시간 또는 48시간 후에 상기 세포를 Leica 현미경으로 분석하거나 형광 세기(RFU)를 지침에 따라 Multi-Mode Microplate Reader Synergy-2에 의해 측정하였다.
실시예 4: DNA 기반효소의 대사작용과 표적 서열의 비교
도 2에서(10 mM MgCl2), L-DNA 기반효소가 L-표적 서열과 D-표적 서열을 모두 절단하는 것을 관찰할 수 있다. 이와 관련하여 도 3은 MgCl2 농도 의존성을 보여주고 있다. 상기 도면으로부터 L-DNA 기반효소는 D-표적을 절단하지만 D-DNA 기반효소는 L-표적을 절단하지 않는 것을 알 수 있다. 도 4는 도 3에 따른 측정을 다시 보여주는 것으로, 도 1a에 따른 표적에 절단 부위를 추가로 볼 수 있다.
실시예 5: 세포 내 다양한 DNA 기반효소와 RNA 기반효소의 활성
도 5에서는 D-표적을 함유하는 EGFP 플라스미드로 HeLa 세포를 감염시켰다. 특히 L-DNA 기반효소는 L-RNA 기반효소 또는 D-RNA 기반 효소 또는 D-DNA 기반효소보다 형광색소를 강하게 억제한다는 것을 알 수 있다. 이러한 발견은 도 6에서 현저하게 확인된다. 그 결과, 특히 세포 내에서 L-RNA 기반효소에 비해 L-DNA 기반효소의 우수한 효과가 확인된다. 도 7과 8에서는 24시간 배양에 대한 결과가 더욱 확인한다. 마지막으로, 도 9와 10으로부터는 다른 효소에 비해 48시간 배양시 L-DNA 기반효소가 상당히 개선된 억제를 보인다는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 가능성 있는 약제학적 용도
해독제로서의 용도 외에, 스피겔머에 의한 치료시 다른 일반적인 것과 관련하여 본 발명을 이용할 수 있다. 여기에는 기본적으로 유전자 산물의 원치 않는 발현을 가진 질환이 상관하는 모든 징후가 포함된다.
예로서 심부전 또는 비대증이 있다. 이에 대해 포스포람반을 억제하는 치료법이 적합하다는 것은 문헌 L. Suckau et al., Circulation 119: 1241-1252 (2009)에 알려져 있다. 이와 관련하여, 상기 문헌에서는 RNAi를 사용하고 있다. 유사한 L-DNA 기반효소는 인간 포스포람반에 대해 공지된 서열 정보를 참고하여 쉽게 제작할 수 있고 이와 관련하여 공지된 치료법에 비해 효소 분해로부터 L-DNA 기반효소 유효성분의 개선된 안정성과 포스포람반을 코딩하는 표적 RNA의 억제에 관련한 양호한 활성이 장점으로 제공된다.
인체 내 또 다른 표적은 예를 들면 비코딩 H19 RNA이다. 상기 유전자는 예를 들면 암 세포에서 차별적으로 발현한다. 특히, 문헌 US 2010/0086526 A에는 H19 RNA가 siRNA에 의해 억제되는 것이 알려져 있다. 유사한 방법으로, 본 발명에 따른 L-DNA 기반효소 분자는 H19 핵산으로부터 공지된 적절한 부위를 절단하여 상기 핵산의 전사를 감소 또는 억제하도록 선택될 수 있다. 이는 이미 위에서 설명한 바와 같은 장점을 제공한다.
Claims (13)
- 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 L-DNA가 특히 안티센스 반응에서 L-RNA 또는 D-RNA에 결합할 수 있고 L-RNA 또는 D-RNA의 표적 서열의 영역에서는 L-RNA 또는 D-RNA를 선택적으로 절단할 수 있는 용도.
- 특히 안티센스 반응에서 L-RNA 또는 D-RNA에 결합할 수 있고 L-RNA 또는 D-RNA의 표적 서열의 영역에서는 L-RNA 또는 D-RNA를 선택적으로 절단할 수 있는 L-DNA로서, L-RNA 또는 D-RNA를 함유하는 치료 분자의 투여에 의해 야기되는 원치 않는 생리학적 부반응을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도.
- 적어도 하나의 내인성 유전자의 과발현을 수반하는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 L-DNA의 용도로서, 상기 L-DNA가 특히 안티센스 반응에서 상기 유전자를 코딩하는 내인성 표적-D-DNA 또는 표적-D-RNA에 결합할 수 있고 상기 유전자를 코딩하는 내인성 표적-D-DNA 또는 표적-D-RNA의 표적 서열을 선택적으로 절단할 수 있는 L-DNA의 용도.
- 제3항에 있어서, 상기 치료 분자가 L-RNA, 특히 이중 가닥의 L-RNA, 예를 들면 스피겔머로 구성되는 용도.
- 제3항에 있어서, 상기 치료 분자가 L-RNA와 공유 결합하는 압타머 또는 L-RNA와 공유 결합하는 항체를 함유하는 용도.
- 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 적어도 L-RNA의 투여량에 상응하는 양의 L-DNA를 함유하고 L-RNA의 투여량의 2 내지 100배, 바람직하게는 2 내지 20배에 해당하는 양을 함유하는 용도.
- 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 표적 서열의 영역에서 이중 가닥의 D-RNA 또는 L-RNA의 융합할 수 있는 핵산, 특히 5- 내지 100-mer의 핵산을 더 함유하는 용도.
- .
- L-DNA를 함유하는 약제학적 조성물로서, L-RNA 또는 D-RNA를 함유하는 치료 분자의 투여에 의해 야기되는 원치 않는 생리학적 부반응을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 적어도 하나의 내인성 유전자의 과발현을 수반하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 L-DNA를 함유하는 약제학적 조성물로서, 상기 L-DNA가 특히 안티센스 반응을 위해 상기 유전자를 코딩하는 내인성 표적-D-DNA 또는 표적-D-RNA에 결합할 수 있고 상기 유전자를 코딩하는 내인성 표적-D-DNA 또는 표적-D-RNA의 표적 서열을 선택적으로 절단할 수 있는 약제학적 조성물.
- 제10항 또는 제11항에 따른 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, L-리보뉴클레오티드의 소정의 서열 또는 D-리보뉴클레오티드 또는 D-데옥시리보뉴클레오티드의 소정의 서열에 결합할 수 있고 상기 소정의 서열을 선택적으로 분해할 수 있는 L-데옥시리보뉴클레오티드의 서열을 제공 및 합성하고, 이렇게 얻어진 L-DNA를 약리학적으로 유효한 투여량으로 제제화하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 L-DNA를 생약적 보조제 및/또는 부형제와 혼합하는 방법.
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