WO2012083832A1 - 富集原核生物mrna的方法及其用途 - Google Patents

富集原核生物mrna的方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2012083832A1
WO2012083832A1 PCT/CN2011/084237 CN2011084237W WO2012083832A1 WO 2012083832 A1 WO2012083832 A1 WO 2012083832A1 CN 2011084237 W CN2011084237 W CN 2011084237W WO 2012083832 A1 WO2012083832 A1 WO 2012083832A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
probe
mrna
rrna
sequencing
sequencing library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/CN2011/084237
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
万成
刘晓
陈利
刘雪莉
王俊
汪建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Publication of WO2012083832A1 publication Critical patent/WO2012083832A1/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention relates to the field of genome sequencing, in particular to the field of transcriptome sequencing.
  • the invention relates to methods of enriching prokaryotic mRNA and uses thereof. More specifically, the present invention provides a method for enriching prokaryotic mRNA, a method for constructing a transcriptome sequencing library, a transcriptome sequencing library, a method for determining prokaryotic mRNA sequence information, and a probe And its use in enriching mRNA and a kit and its use in constructing a transcriptome sequencing library. Background technique
  • Prokaryotes are an important part of biological systems, including bacteria, cyanobacteria, rickettsia and chlamydia. Obtaining mRNA information from prokaryotes and even transcriptome studies on prokaryotes are important in many fields such as medicine, food, environment and disease. However, in prokaryotes, mRNA (messert RNA, messenger RNA) is extremely low, accounting for only 2% to 5% of total RNA, and most prokaryotic mRNAs do not have 3' ends. The poly(A) structure makes the isolation of mRNA more difficult.
  • the present invention aims to solve at least one of the technical problems existing in the prior art. To this end, the present invention provides a method of enriching prokaryotic mRNA and uses thereof.
  • the invention provides a method of enriching prokaryotic mRNA.
  • the method comprises the steps of: hybridizing a nucleic acid sample to a probe, the nucleic acid sample containing 16s of prokaryotes rRNA, 23 s rRNA and mRNA, the probe carries a label, and the probe is capable of specifically binding to 16s rRNA and 23 s rRNA to form a probe-rRNA complex; and molecular entity removal using a specific binding label Probe-rRNA complex to enrich prokaryotic mR A.
  • the inventors have surprisingly found that the method for enriching prokaryotic mRNA according to an embodiment of the present invention can efficiently enrich mRNA of prokaryote, and is convenient, rapid, and reproducible, and has high efficiency and good effect for removing rRNA. Compared with the prior art, the purity and ratio of prokaryotic mRNA obtained by this method are significantly improved.
  • the invention provides a method of constructing a transcriptome sequencing library.
  • the method comprises the steps of: enriching mRNA according to a method for enriching prokaryotic mRNA according to an embodiment of the present invention; and constructing a sequencing library for the obtained mRNA to obtain a transcriptome sequencing library .
  • the inventors have surprisingly found that a method for constructing a transcriptome sequencing library according to an embodiment of the present invention can conveniently and efficiently construct a transcriptome sequencing library of prokaryote, which is reproducible, low in cost, less time-consuming, and highly efficient.
  • the library obtained was of good quality.
  • the invention provides a transcriptome sequencing library.
  • the library is constructed by the method of constructing a transcriptome sequencing library of the invention.
  • the inventors have surprisingly found that a transcriptome sequencing library according to an embodiment of the present invention can be effectively applied to a high-throughput sequencing platform such as an Illumina Solexa sequencing platform, thereby enabling accurate and efficient obtaining of prokaryotic mRNA sequence information based on sequencing results.
  • the present invention provides a method of determining prokaryotic mRNA sequence information.
  • the method comprises the steps of: constructing a transcriptome sequencing library according to a method of constructing a transcriptome sequencing library according to an embodiment of the present invention; and sequencing the transcriptome sequencing sequencing library to obtain prokaryotic mRNA sequence information.
  • the inventors have surprisingly found that the method for determining prokaryotic mRNA sequence information according to an embodiment of the present invention enables accurate and efficient determination of prokaryotic mRNA sequence information with low cost, low time, high efficiency, and good repeatability.
  • the present invention provides a probe.
  • the probe carries a label and is capable of specifically binding to a conserved region of the 16s and 23s rRNA of the prokaryote.
  • the probe of the present invention can be used for enriching prokaryotic mRNA, whereby the probe of the present invention can be effectively applied to the method for enriching prokaryotic mRNA of the present invention, and constructing a transcriptome sequencing library
  • the method and the method for determining prokaryotic mRNA sequence information enable the mRNA sequence information of the prokaryote to be accurately and efficiently determined.
  • the present invention provides a kit.
  • the kit comprises: a probe according to an embodiment of the invention; and a molecular entity that specifically binds to the label of the probe.
  • the inventors have found that the prokaryotic transcriptome can be conveniently and rapidly constructed using the kit according to an embodiment of the present invention.
  • the library was sequenced and the library quality was very good.
  • the invention provides the use of a kit according to an embodiment of the invention for constructing a transcriptome sequencing library.
  • Figure 1 shows the principle of using hybridization probes and removing prokaryotic rRNA
  • Figure 2 shows the results of detection of mR A enriched in a total RN A sample and a method for enriching prokaryotic mR A according to an embodiment of the present invention using an Agilent Bioanalyzer 2100d;
  • Figure 3 shows the results of E. coli transcriptome Solexa sequencing according to one embodiment of the present invention
  • Figure 4 shows the sequencing results of the E. coli 1 transcriptome sequencing library of one embodiment of the present invention before and after DSN enzyme treatment .
  • the invention provides a method of enriching prokaryotic mRNA.
  • the method may comprise the steps of: hybridizing a nucleic acid sample to a probe, the nucleic acid sample containing 16s rR A, 23 s rRNA and mRNA of a prokaryote, the probe carrying a label, and the probe Capable of specifically binding to 16s rRNA and 23 s rRNA to form a probe-rRNA complex; and removing the probe-rRNA complex using a molecular entity that specifically binds the label to enrich for prokaryotic mR A.
  • the marker is polyA and the molecular entity is oligomeric dT.
  • the molecular entity is formed on the magnetic beads.
  • the probe comprises the oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 1-10.
  • Hybridization can be carried out at 70-74 ° C for 25-35 minutes according to an embodiment of the invention.
  • the hybridization is carried out at 72 °C.
  • hybridization was carried out for 30 minutes.
  • hybridization means that two single-stranded nucleic acid molecules having complementary sequences to each other are annealed to form a double-stranded nucleic acid under certain conditions (suitable temperature, ionic strength, etc.) according to the principle of complementary pairing of bases. process.
  • Nucleic acid hybridization can be carried out between DNA-DNA or between DNA-RNA or RNA-RNA, and base pairing can be performed as long as there is a complementary sequence between them.
  • the two sides of the hybrid can be the nucleic acid molecule to be tested and the known nucleic acid molecule, respectively.
  • a nucleic acid molecule of known sequence in a hybrid system is referred to as a probe.
  • the nucleic acid hybridization may include solid-liquid phase hybridization and liquid phase hybridization, wherein the liquid phase hybridization is a hybridization reaction carried out in a solution, which means that the nucleic acid molecule to be tested is annealed with a known nucleic acid molecule (probe) in a solution to form a hybrid composite. Things.
  • the hybridized duplex can be isolated and detected using the label on the probe, wherein the label is known in the art and can include However, it is not limited to radioisotopes or nuclide, biotin, acridinium ester or polyA.
  • the hybridization products can be isolated and detected using corresponding nucleic acid isolation and detection methods known in the art including, but not limited to, hydroxyapatite (HAP) or affinity adsorption. .
  • the method for enriching prokaryotic mRNA according to an embodiment of the present invention can enrich the mRNA of prokaryotes conveniently, rapidly and efficiently, and has good reproducibility, and has high efficiency and good effect for removing rR A. Compared with the prior art, the purity and ratio of the prokaryotic mRNA obtained by the method are significantly improved.
  • the prokaryotic mRNA enriched by the method for enriching prokaryotic mRNA of the present invention can be effectively applied to the construction of a transcriptome sequencing library of prokaryote, and the reproducibility is good, and the obtained library quality is obtained.
  • the obtained library is further subjected to high-throughput sequencing, thereby enabling accurate and efficient obtaining of prokaryotic mRNA sequence information.
  • the invention provides a method of constructing a transcriptome sequencing library.
  • the method may comprise the steps of: enriching mRNA according to a method for enriching prokaryotic mRNA according to an embodiment of the present invention; and constructing a sequencing library for the obtained mRNA to obtain transcriptome sequencing library.
  • the transcriptome sequencing library is adapted to be sequenced using at least one selected from the group consisting of Illumina Solexa, ABI SOLiD and Roche 454 sequencing platforms.
  • the method of constructing a transcriptome sequencing library of the present invention may further comprise: processing the transcriptome sequencing library with a double-strand specific nuclease.
  • a method for constructing a transcriptome sequencing library according to an embodiment of the present invention can conveniently and efficiently construct a transcriptome sequencing library of prokaryote, which is reproducible, low in cost, less time-consuming, and highly efficient.
  • the library obtained was of good quality.
  • a transcriptome sequencing library of a prokaryotic organism constructed by the method for constructing a transcriptome sequencing library of the present invention can be effectively applied to a high-throughput sequencing platform such as an Illumina Solexa sequencing platform, and the sequencing cost is low and the time is low. Less, high efficiency, good repeatability, and accurate sequencing results, based on the sequencing results, can accurately and efficiently obtain prokaryotic mRNA sequence information.
  • the method of constructing a transcriptome sequencing library of the present invention may comprise the steps of: providing a label-carrying probe that hybridizes to a conserved region of a 16s and 23s rRNA of a prokaryote; using the probe to bind rRNA in a nucleic acid sample to form a probe-rRNA complex; binding to the probe-rRNA complex using a molecular entity that specifically binds to the label, thereby removing the rRNA-probe complex and enriching mR A, thereafter The enriched mRNA was used to construct a library.
  • the probe is a probe designed for the 16s R A and 23s R A conserved regions.
  • the method of designing the probe is not particularly limited.
  • the marker is polyA and the molecular entity is oligomeric dT ( Oligo (dT)).
  • the oligomeric dT may be formed on the magnetic beads.
  • the length of the marker polyA is not particularly limited and can be determined by those skilled in the art according to the prior art.
  • polyA may be 5 - 30 bases A, preferably 10 - 20 bases A, and may be, for example, 15, 16, 17, 18 or 19 bases A.
  • the probe comprises the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1-10.
  • the temperature at which the probe hybridizes to rRNA is 70-74 ° C, preferably 72 ° C; the hybridization time is 25-35 min, preferably 30 min.
  • the method for constructing a library may be a database construction method based on an Illumina solexa, ABI SOLiD or Roche 454 sequencing platform, preferably based on an illumina solexa sequencing platform.
  • the above three sequencing platforms are all commercialized sequencing platforms, and the RNA-related database construction process is provided in the specification, and the specific reference can be made to the merchant's website.
  • the method may further comprise the step of processing the constructed library using DSN enzyme.
  • the invention provides a transcriptome sequencing library.
  • the library is constructed by the method of constructing a transcriptome sequencing library of the invention.
  • the inventors have surprisingly found that transcriptome sequencing libraries according to embodiments of the present invention can be effectively applied to high-throughput sequencing platforms such as the Illumina Solexa sequencing platform, thereby enabling accurate acquisition of prokaryotic mRNA sequence information based on sequencing results.
  • the present invention provides a method of determining prokaryotic mRNA sequence information.
  • the method comprises the steps of: constructing a transcriptome sequencing library according to a method of constructing a transcriptome sequencing library according to an embodiment of the present invention; and sequencing the transcriptome sequencing sequencing library to obtain prokaryotic mRNA sequence information.
  • the method of sequencing is not particularly limited, and sequencing can be performed using at least one selected from the group consisting of Illumina Solexa, ABI SOLiD and Roche 454 sequencing platforms. According to a specific example of the invention, sequencing can be performed using the Illumina Solexa sequencing platform.
  • the method for determining prokaryotic mRNA sequence information can effectively determine the mRNA sequence information of a prokaryote, and has low cost, low time, high efficiency, accurate result, and good repeatability. .
  • the present invention provides a probe.
  • the probe carries The marker, and is capable of specifically binding to the conserved regions of the 16s and 23s rR A of prokaryotes.
  • the probe consists of the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 1-10.
  • a probe according to an embodiment of the present invention can be used for enriching prokaryotic mRNA, whereby the probe of the present invention can be effectively applied to the method for enriching prokaryotic mRNA of the present invention, and constructing a transcriptome sequencing library
  • the method and the method for determining prokaryotic mRNA sequence information enable the prokaryotic mRNA sequence information to be efficiently determined, and the information is accurate and reproducible.
  • the use of the probe in enriching mRNA is mainly manifested as:
  • the probe carrying the probe of the present invention can be used with 16s in prokaryotes
  • the rRNA and 23 s rRNA specifically bind to form a probe-rRNA complex, and the molecular entity that specifically binds the label can further remove the probe-rRNA complex, thereby enabling successful enrichment of prokaryotic mRNA.
  • the present invention provides a kit.
  • the kit comprises: a probe according to an embodiment of the invention; and a molecular entity that specifically binds to the label of the probe.
  • the label of the probe is polyA and the molecular entity is oligomeric dT.
  • the molecular entity is formed on the magnetic beads.
  • kit may further comprise other conventional components for constructing a transcriptome sequencing library of prokaryotes.
  • the kit of the present invention may further comprise a pronucleus suitable for constructing the pronuclear.
  • Other reagents for biological transcriptome sequencing libraries may be used.
  • the kit of the present invention may comprise: a labeled probe that hybridizes to a conserved region of 16s and 23s rRNA of a prokaryote, and a molecular entity capable of specifically binding to the probe.
  • the marker for labeling in the kit is polyA and the molecular entity is oligomeric dT ( Oligo (dT)).
  • the oligomeric dT is formed on the magnetic beads.
  • the probe in the kit comprises the oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 1-10.
  • the invention provides the use of a kit according to an embodiment of the invention for constructing a transcriptome sequencing library.
  • Example 1 E. coli transcriptome solexa sequencing
  • the probe herein consists of an oligonucleotide as shown in SEQ ID NO: 1-10.
  • the R A precipitate was dissolved, whereby a sample (i.e., enriched mRNA) of the E. colO total RNA sample treated by the method of the present invention was obtained and stored at -80 ° C until use.
  • FIG. 2 shows the results of detection of mRNA enriched with a total RNA sample by the Agilent Bioanalyzer 2100 and a method for enriching prokaryotic mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • a is the detection result of the total RNA sample
  • b is the detection result of the R A sample enriched with mRNA by the method of enriching prokaryotic mRNA according to an embodiment of the present invention. It can be seen from Fig.
  • the samples which have been tested by the above method, the gelatinized samples and the total RNA samples are respectively constructed according to the illumina solexa platform transcriptome sequencing method (refer to, for example, the illumina mR A-Seq Sample Preparation Guide).
  • the transcriptome was sequenced, and the resulting three libraries were separately sequenced on an illumina HiSeq2000 sequencer.
  • FIG. Figure 3 shows the results of Solexa sequencing of E. coli (E. co/) transcriptome according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 wherein "E.coli 1-3" is respectively three transcriptomes constructed by using the samples E.coli 1, E.coli2 and E.coli3 treated by the method of the present invention, according to the present invention.
  • the sequencing results obtained by the method of the example "cutting group” is the sequencing result of the transcriptome sequencing library constructed by using the gelatinized sample
  • the "control group” is a transcriptome sequencing library directly constructed using the total RNA sample. Sequencing results.
  • the proportion of mRNA in the sequencing results of the transcriptome sequencing library constructed by using the three samples treated by the method of the present invention was 27.3%, 35.5%, and 48.3%, respectively, and the average value was 37.0%
  • the mRNA ratio was increased by about 3 times compared with the sequencing result of the transcriptome sequencing library constructed by the gelatinized sample, compared with the sequencing result of the sequencing of the transcriptome sequencing library directly constructed using the total RNA sample. Increase by about 30 times.
  • Fig. 2 and Fig. 3 show that the method for enriching prokaryotic mRNA of the present invention can effectively reduce the rR A content in the total RNA of prokaryotic organisms and increase the proportion of mRNA in the sequencing data.
  • the experimental data showed that the proportion of mRNA in the treated samples was increased by more than 20 times compared with the untreated control group, and the mRNA ratio was also increased by more than 2 times compared with the agarose gel electrophoresis recovery method.
  • a transcriptome sequencing library (also referred to herein as E. coli 1 library or E. coli 1 transcriptome sequencing library) constructed using the sample E. coli 1 treated by the method of the present invention, takes an equal amount of two One of them was treated without DSN enzyme, and the E. coli 1 library was used as a control, and the other was treated with DSN enzyme (double-strand specific nuclease, Evrogen, Russia) to obtain DSN enzyme treatment. The E. coli 1 library was then sequenced on an Illumina HiSeq 2000 sequencer.
  • the 20 ⁇ DSN-treated cDNA was used as a template for PCR amplification (using Solexa sequencing primers) to obtain an amplification product, that is, a DSN-treated E. coli 1 library was obtained.
  • FIG 4 shows the sequencing results of the E. coli 1 transcriptome sequencing library before and after DSN enzyme treatment according to one embodiment of the present invention.
  • the ratio of mRNA in the E.coli 1 library before treatment was 27.3%.
  • the proportion of mRNA in the E.coli 1 library increased to 61.33%, which was increased by 2.25 times, indicating that DSN enzyme treatment
  • the construction of a bacterial transcriptome sequencing library has a significant impact on the proportion of mRNA in the library, thereby reducing the cost of sequencing.
  • Method for enriching prokaryotic mR A of the present invention method for constructing transcriptome sequencing library, transcriptome sequencing library, method for determining prokaryotic mR A sequence information, probe and use thereof in enriched mRNA, and kit and Its use in the construction of transcriptome sequencing libraries can be effectively applied to the construction and sequencing of transcriptome sequencing libraries of prokaryotes, and the obtained libraries are of good quality and accurate sequencing results.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

富集原核生物 mRNA的方法及其用途 优先权信息
本申请请求 2010 年 12 月 22 日向中国国家知识产权局提交的、 专利申请号为 20101060021 1.0的专利申请的优先权和权益， 并且通过参照将其全文并入此处。 技术领域
本发明涉及基因组测序领域， 特别是转录组测序领域。 具体地， 本发明涉及富集原 核生物 mRNA的方法及其用途。 更具体地， 本发明提供了一种富集原核生物 mRNA的方 法、 一种构建转录组测序文库的方法、 一种转录组测序文库、 一种确定原核生物 mRNA序 列信息的方法、 一种探针及其在富集 mRNA中的用途以及一种试剂盒及其在构建转录组 测序文库中的用途。 背景技术
原核生物是生物系统中的重要组成部分， 包括细菌、 蓝藻、 立克次氏体和衣原体等 多个门类。 获得原核生物的 mRNA信息， 乃至对原核生物进行转录组研究， 都对医药、 食品、 环境和疾病等许多领域具有重要意义。 但是， 在原核生物中， mRNA ( messnger RNA , 信使 RNA ) 的含量极低， 仅占其总 RNA ( total RNA ) 的 2%-5%左右， 且绝大 多数原核生物 mRNA都不具有 3 '端的 poly(A)结构， 使得 mRNA的分离有较大困难。 因此， 按照以真核生物 mRNA特点而建立的转录组文库构建方法进行原核生物转录组 Solexa 高通量测序， 难以获得理想的结果 （例如参见 Amoud H.M. van Vliet. Next generation sequencing of microbial transcriptom.es: challenges and opportunities. Federation of European Microbiological Societies, Microbiol Lett 302 (2010) 1-7 , 通过参 照将其全文并入本文） 。
因此， 确定原核生物 mRNA序列信息的方法仍有待改进。 发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提供了富集原 核生物 mRNA的方法及其用途。
根据本发明的一个方面， 本发明提供了一种富集原核生物 mRNA的方法。 根据本发明 的实施例， 该方法包括以下步骤： 将核酸样品与探针杂交， 该核酸样品含有原核生物的 16s rRNA、 23 s rRNA和 mRNA,该探针携带标记物，并且该探针能够与 16s rRNA和 23 s rRNA 特异性结合以便形成探针 -rRNA 复合物； 以及利用特异性结合标记物的分子实体去除探针 -rRNA复合物， 以便富集原核生物 mR A。 发明人惊奇地发现， 利用根据本发明实施例的 富集原核生物 mRNA的方法， 能够有效地富集原核生物的 mRNA, 且方便、 快速、 可重复 性好，去除 rRNA的效率高、效果好，相比现有技术，利用该方法富集得到的原核生物 mRNA 的纯度和比例显著提高。
根据本发明的又一方面， 本发明提供了一种构建转录组测序文库的方法。 根据本发明 的实施例， 该方法包括以下步骤： 才艮据本发明实施例的富集原核生物 mRNA的方法， 富集 mRNA; 以及针对所得到的 mRNA, 构建测序文库， 以便获得转录组测序文库。 发明人惊 奇地发现， 利用根据本发明实施例的构建转录组测序文库的方法， 能够方便有效地构建原 核生物的转录组测序文库， 且可重复性好、 成本低、 需时少、 效率高， 获得的文库质量好。
根据本发明的另一方面， 本发明提供了一种转录组测序文库。 根据本发明的实施例， 该文库是由本发明的构建转录组测序文库的方法构建的。 发明人惊奇地发现， 根据本发明 实施例的转录组测序文库， 能够有效地应用于高通量测序平台例如 Illumina Solexa测序平 台， 从而基于测序结果， 能够准确有效地获得原核生物 mRNA序列信息。
根据本发明的再一方面， 本发明提供了一种确定原核生物 mRNA序列信息的方法。 根 据本发明的实施例， 该方法包括以下步骤： 根据本发明实施例的构建转录组测序文库的方 法构建转录组测序文库； 以及对转录组测序测序文库进行测序， 以便获得原核生物 mRNA 序列信息。 发明人惊奇地发现， 利用根据本发明实施例的确定原核生物 mRNA序列信息的 方法， 能够准确有效地确定原核生物的 mRNA序列信息， 且成本低、 用时少、 效率高、 可 重复性好。
根据本发明的又一方面， 本发明提供了一种探针。 根据本发明的实施例， 该探针携带 标记物， 并且能够与原核生物的 16s和 23s rRNA的保守区域特异性结合。 根据本发明的实 施例， 本发明的探针能够用于富集原核生物 mRNA, 由此， 本发明的探针能够有效地应用 于本发明的富集原核生物 mRNA 的方法、 构建转录组测序文库的方法以及确定原核生物 mRNA序列信息的方法中， 从而能够使得原核生物的 mRNA序列信息被准确有效地确定。
根据本发明的另一方面， 本发明提供了根据本发明实施例的探针在富集 mRNA中的 用途。
根据本发明的再一方面， 本发明提供了一种试剂盒。 根据本发明的实施例， 该试剂盒 包括：根据本发明实施例的探针； 以及分子实体，该分子实体特异性结合探针的标记物。 发明人发现， 利用根据本发明实施例的试剂盒， 能够方便、 快速地构建原核生物的转录组 测序文库， 且文库质量非常好。
根据本发明的又一方面， 本发明提供了根据本发明实施例的试剂盒在构建转录组测序 文库中的用途。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得 明显， 或通过本发明的实践了解到。 附图说明
本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明 显和容易理解， 其中：
图 1 : 显示了利用杂交探针与去除原核生物 rRNA的原理；
图 2： 显示了利用 Agilent Bioanalyzer 2100d对总 RN A样品与根据本发明实施例的 富集原核生物 mR A的方法富集的 mR A进行检测的结果；
图 3 : 显示了根据本发明一个实施例的大肠杆菌转录组 Solexa测序结果； 以及 图 4:显示了 #居本发明一个实施例的 E.coli 1转录组测序文库经 DSN酶处理前后 的测序结果。 发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例， 所述实施例的示例在附图中示出， 其中自始至终相 图描述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是， 在本发明的描述中， 除非另有说明， "多个" 的含义是两个或两个 以上。
富集原核生物 mRNA的方法
根据本发明的一个方面， 本发明提供了一种富集原核生物 mRNA的方法。 根据本发明 的实施例， 该方法可以包括以下步骤： 将核酸样品与探针杂交， 该核酸样品含有原核生物 的 16s rR A、 23 s rRNA和 mRNA, 该探针携带标记物， 并且该探针能够与 16s rRNA和 23 s rRNA特异性结合以便形成探针 -rRNA复合物； 以及利用特异性结合标记物的分子实体去 除探针 -rRNA 复合物， 以便富集原核生物 mR A。 根据本发明的一个实施例， 标记物为 polyA, 分子实体为寡聚 dT。 根据本发明的具体示例， 该分子实体形成于磁珠上。 根据本发 明的实施例， 探针包括 SEQ ID NO: 1-10所示的寡核苷酸。 根据本发明的实施例， 可以在 70-74 °C下进行杂交 25-35分钟。 根据本发明的一个实施例， 杂交是在 72 °C下进行的。 根据 本发明的具体示例， 进行杂交 30分钟。
在本文中所使用的术语 "杂交"是指， 相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在 一定条件下（适宜的温度及离子强度等）按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。 核酸杂交可以在 DNA-DNA之间进行， 也可以在 DNA-RNA或 RNA-RNA之间进行， 只要它们之间存在互补序列， 可以进行碱基配对。 通常， 杂交的双方可以分别是待测核 酸分子和已知核酸分子。 在杂交体系中已知序列的核酸分子称作探针（ probe )。 核酸杂 交可以包括固-液相杂交和液相杂交， 其中液相杂交是在溶液中进行的杂交反应， 其是 指待测核酸分子与已知核酸分子（探针）在溶液中退火形成杂交复合物。 当利用携带标 记物的探针进行杂交时，在杂交反应结束后， 能够利用探针上的标记物分离和检测杂交 后的双链，其中，标记物是本领域内是已知的，可以包括但不限于放射性同位素或核素、 生物素、 吖啶翁酯 （ acridinium ester ) 或 polyA等。 根据所使用的标记物的类型， 可以 利用本领域内已知的相应的核酸分离和检测方法， 包括但不限于羟基磷灰石 （HAP )法 或亲和吸附法， 将杂交产物进行分离和检测。
发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的富集原核生物 mRNA的方法， 能够方便、 快速、 有效地富集原核生物的 mRNA, 且可重复性好， 去除 rR A的效率高、 效果好， 相 比现有技术， 利用该方法富集得到的原核生物 mRNA的纯度和比例显著提高。 根据本发明 的实施例， 利用本发明的富集原核生物 mRNA的方法富集的原核生物 mRNA, 能够有效地 应用于原核生物的转录组测序文库的构建， 且可重复性好， 获得的文库质量好， 进一步将 所得的文库进行高通量测序， 从而能够准确有效地获得原核生物 mRNA序列信息。
根据本发明的又一方面， 本发明提供了一种构建转录组测序文库的方法。 根据本发明 的实施例， 该方法可以包括以下步骤： 才艮据本发明实施例的富集原核生物 mRNA的方法， 富集 mRNA; 以及针对所得到的 mRNA, 构建测序文库， 以便获得转录组测序文库。 根据 本发明的实施例， 转录组测序文库适于利用选自 Illumina Solexa、 ABI SOLiD及 Roche 454 测序平台的至少一种进行测序。 根据本发明的实施例， 本发明的构建转录组测序文库的方 法可以进一步包括： 利用双链特异性核酸酶对所述转录组测序文库进行处理。
发明人惊奇地发现， 利用根据本发明实施例的构建转录组测序文库的方法， 能够方便 有效地构建原核生物的转录组测序文库， 且可重复性好、 成本低、 需时少、 效率高， 获得 的文库质量好。 根据本发明的实施例， 利用本发明的构建转录组测序文库的方法构建的原 核生物的转录组测序文库， 能够有效地应用于高通量测序平台例如 Illumina Solexa测序平 台， 且测序成本低、 用时少、 效率高、 可重复性好、 测序结果准确， 从而基于测序结果， 能够准确有效地获得原核生物 mRNA序列信息。 进一步， 根据本发明的实施例， 本发明的构建转录组测序文库的方法可以包括以下步 骤： 提供与原核生物的 16s和 23s rRNA的保守区域杂交的携带标记物的探针； 使用该探针 结合核酸样品中的 rRNA, 以便形成探针 -rRNA复合物； 利用与标记物特异性结合的分子实 体结合探针 -rRNA复合物， 从而去除 rRNA-探针复合物而富集 mR A, 其后将富集得到的 mRNA用于构建文库。
其中， 根据本发明的实施例， 探针是针对 16s R A和 23s R A保守区设计的探针。 根 据本发明的实施例， 设计探针的方法不受特别限制。 根据本发明的一个实施例， 标记物是 polyA, 并且分子实体为寡聚 dT ( Oligo ( dT ) )。 根据本发明的具体示例， 寡聚 dT可以形成 于磁珠上。 根据本发明的实施例， 标记物 polyA 的长度不受特别限制， 可以由本领域技术 人员根据现有技术来确定。 根据本发明的具体示例， polyA可以是 5 - 30个碱基 A, 优选 10 - 20个碱基 A, 例如可以为 15、 16、 17、 18或 19个碱基 A。 具体地， 根据本发明的实 施例， 探针包括 SEQ ID NO: 1-10所示的寡核苷酸。 根据本发明的实施例， 探针与 rRNA 杂交的温度是 70-74 °C , 优选 72°C ; 杂交时间是 25-35min, 优选 30min。 根据本发明的实施 例，用于构建文库的方法可以为基于 Illumina solexa, ABI SOLiD或 Roche 454测序平台的建 库方法， 优选基于 illumina solexa测序平台的建库方法。 其中， 上述三种测序平台均为已经 商业化的测序平台， 其说明书中都提供有 RNA相关的建库流程， 具体可参考商家的网站。 根据本发明的实施例， 该方法还可以进一步包括使用 DSN酶处理构建完成的文库的步骤。
根据本发明的另一方面， 本发明提供了一种转录组测序文库。 根据本发明的实施例， 该文库是由本发明的构建转录组测序文库的方法构建的。 发明人惊奇地发现， 根据本发明 实施例的转录组测序文库， 能够有效地应用于高通量测序平台例如 Illumina Solexa测序平 台， 从而基于测序结果， 能够准确地获得原核生物 mRNA序列信息。
根据本发明的再一方面， 本发明提供了一种确定原核生物 mRNA序列信息的方法。 根 据本发明的实施例， 该方法包括以下步骤： 根据本发明实施例的构建转录组测序文库的方 法构建转录组测序文库； 以及对转录组测序测序文库进行测序， 以便获得原核生物 mRNA 序列信息。才艮据本发明的实施例，测序的方法不受特别限制， 可以利用选自 Illumina Solexa, ABI SOLiD及 Roche 454测序平台的至少一种进行测序。根据本发明的具体示例，可以利用 Illumina Solexa测序平台进行测序。
发明人惊奇地发现， 利用根据本发明实施例的确定原核生物 mRNA序列信息的方法， 能够有效地确定原核生物的 mRNA序列信息， 且成本低、 用时少、 效率高、 结果准确、 可 重复性好。
根据本发明的又一方面， 本发明提供了一种探针。 根据本发明的实施例， 该探针携带 标记物， 并且能够与原核生物的 16s和 23s rR A的保守区域特异性结合。 根据本发明的实 施例， 该探针由 SEQ ID NO: 1-10所示的寡核苷酸构成。
发明人发现， 根据本发明实施例的探针能够用于富集原核生物 mRNA, 由此， 本发明 的探针能够有效地应用于本发明的富集原核生物 mRNA的方法、 构建转录组测序文库的方 法以及确定原核生物 mRNA序列信息的方法中，从而能够使得原核生物的 mRNA序列信息 被有效地确定， 且信息准确， 可重复性好。
根据本发明的另一方面， 本发明提供了根据本发明实施例的探针在富集 mRNA中的 用途。 根据本发明的实施例， 探针在富集 mRNA中的用途主要表现为： 在本发明的富 集原核生物 mRNA的方法中， 利用本发明的携带标记物的探针能够与原核生物中的 16s rRNA和 23 s rRNA特异性结合以便形成探针 -rRNA复合物， 进一步利用特异性结合标记物 的分子实体能够去除探针 -rRNA复合物， 从而能够成功富集原核生物 mRNA。
根据本发明的再一方面， 本发明提供了一种试剂盒。 根据本发明的实施例， 该试剂盒 包括： 根据本发明实施例的探针； 以及分子实体， 其特异性结合该探针的标记物。其中， 关于根据本发明实施例的探针的特征、优点及用途，前面已经详细描述，在此不再赘述。 根据本发明的一个实施例， 探针的标记物为 polyA, 且分子实体为寡聚 dT。根据本发明的 一个具体事例， 分子实体形成于磁珠上。 由此， 利用才艮据本发明实施例的试剂盒， 能够方 便有效地构建原核生物的转录组测序文库， 且文库质量非常好。 当然， 本领域技术人员能 够理解， 试剂盒中还可以包含其他用于构建原核生物的转录组测序文库的常规组件，根据 本发明的实施例，本发明的试剂盒中还可以包括适于构建原核生物的转录组测序文库的 其他试剂。
具体地， 根据本发明的实施例， 本发明的试剂盒可以包括： 与原核生物的 16s 和 23s rRNA的保守区域杂交的经标记的探针， 以及能与探针特异性结合的分子实体。 根 据本发明的一个实施例， 该试剂盒中用于标记的标记物是 polyA, 分子实体为寡聚 dT ( Oligo ( dT ) )。 根据本发明的具体示例， 该寡聚 dT形成于磁珠上。 根据本发明的一些 实施例， 该试剂盒中的探针包括 SEQ ID NO: 1-10所示的寡核苷酸。
根据本发明的又一方面， 本发明提供了根据本发明实施例的试剂盒在构建转录组测序 文库中的用途。
需要说明的是， 根据本发明实施例的确定原核生物 mRNA序列信息的方法是本申请的 发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。 本领域技术人员将会理解， 下面的实施 例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分 子克隆实验指南》， 第三版， 科学出版社）或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注 明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品， 例如可以釆购自 Illumina公司。
实施例 1: 大肠杆菌转录组 solexa测序
一、样品处理
1. 利用本发明的方法处理样品
利用本发明的富集原核生物 mR A 的方法， 按照下列步骤， 分别将三份大肠杆菌 ( E. coli ) 总 R A样品进行处理：
1.1 DNA酶消化：
1 )取 l(^g总 RNA样品 （利用 TRIzol ( invitrogen, 美国）， 按照生产商说明书中的步 骤， 从大肠杆菌 ( E. coli 中提取）至一个无 R A酶的 1.5mL离心管（Axygen, 美国）中， 然后添加 Ι μΙ DNA酶（invitrogen, 美国）， 混匀后依次于 37 °C下进行反应 lOmin, 80 °C下 加热 5min , 然后终止反应；
2 )向上述离心管中添加 3倍体积的无水乙醇（sigma, 美国）， 混匀， 然后于 -80 °C下静 置 30min, 接着于 4 °C下进行高速离心 20min, 吸去上清获得沉淀， 然后添加 lmL用 DEPC 水（Ambion,美国）配成的 75%乙醇将沉淀进行洗涤一次，然后于 4 °C下进行高速离心 5min, 弃上清并在空气中干燥去除残留的乙醇， 以便获得干燥的沉淀；
3 )利用 lO LDEPC水将得到的干燥的沉淀进行溶解， 获得 DNA酶消化过的总 R A, 然后于 -80 °C下进行保存， 备用。
1.2 将探针与 rRNA杂交：
其中， 这里的探针由如 SEQ ID NO: 1-10所示的寡核苷酸构成。
1 )取 200μ 杂交緩冲液至无 RNA酶的 1.5mL EP管 ( Axygen, 美国） 中；
2 ) 向 EP管中添加 15μΙ^ DNA酶消化过的总 R A (不超过 l(^g ), 混匀；
3 ) 向 EP管中添加 4 L探针， 混匀， 然后将其进行短暂离心使混合液位于管底；
4 )将 EP管置于 72 °C下进行变性 5min;
5 )将 EP管置于 37 °C下进行结合 30min以便形成探针 -rRNA复合物， 备用。
1.3 含寡聚 dT的磁珠结合探针 -rRNA复合物：
1 )将洗脱液置于 37 °C下进行温育 lOmin, 备用；
2 )向上述含有探针 -rRNA复合物的 EP管中添加 50μ 结合有寡聚 dT的磁珠（ Dynabeads
01igo(dT)25, invitrogen, 61005 ), 混匀， 然后进行短暂离心， 并于 37 °C下进行温育 30 min; 3 )将上述 EP管置于磁力架（invitrogen, 美国）上， 静置 2〜3min, 然后取上清液至收 集管 （Collection Tube , Axygen, 美国） 中， 于水上静置；
4 )利用预热的洗脱液对 EP管中的磁珠进行洗涤： 向 EP管中添加 100μL·预热的洗脱 液， 混匀后于磁力架上静置 2〜3min, 然后取上清液， 并将其与收集管中的溶液合并；
5 )向收集管中添加三倍体积的无水乙醇沉淀 R A, 然后用适量 RNase-free水将得到的
R A沉淀溶解， 由此， 获得大肠杆菌 ( E. colO 总 RNA样品的经过本发明的方法处理的 样品 （即富集的 mRNA ) 。 并于 -80 °C下保存， 备用。
2. 平行地，釆用切胶法（例如参见 Ken C. McGrath, Skye R. Thomas-Hall, et al. Isolation and analysis of mRNA from environmental microbial communities, Journal of Microbiological Methods. 75 (2008), 172-176 , 通过参照将其全文并入本文）去除总 RNA样品中的 rR A, 以便获得经过切胶处理的样品， 备用。
3. 平行地， 直接将总 R A样品保存， 作为对照组， 备用。
利用 Agilent Bioanalyzer 2100 ( Agilent, 美国）分别将上述经过本发明的方法处理的 样品和总 R A样品进行检测， 结果见图 2。 图 2显示了利用 Agilent Bioanalyzer 2100将 总 RNA样品与根据本发明实施例的富集原核生物 mRNA的方法富集的 mRNA进行检测 的结果。 如图 2所示， 其中， a为总 RNA样品的检测结果， b为根据本发明实施例的 富集原核生物 mRNA的方法富集 mRNA后的 R A样品的检测结果。 由图 2可知， 将总 RNA样品通过本根据本发明实施例的富集原核生物 mRNA的方法处理后， 2100检测峰 图上原有的 16s、 23s rRNA峰消失了， 结果表明该方法有效去除了总 RNA样品中的大 部分 rRNA。
二、 建库并测序
将上述检测合格的经过本发明的方法处理的样品、 经过切胶处理的样品以及总 RNA 样品分别按照 illumina solexa 平台转录组测序建库方法 （参考例如 illumina mR A-Seq Sample Preparation Guide )构建样品的转录组测序文库， 然后将所得的三个文库分别于 illumina HiSeq2000测序仪上进行测序，结果见图 3。 图 3显示了根据本发明一个实施例的 大肠杆菌 （E. co/ ) 转录组 Solexa测序结果。 如图 3所示， 其中， "E.coli 1 -3 " 分别为 利用经过本发明的方法处理的样品 E.coli 1、 E.coli2和 E.coli3所构建的 3个转录组测序 根据本发明实施例的方法所得到的测序结果， "切胶组" 为利用经过切胶处理的样品所 构建的转录组测序文库的测序结果， "对照组" 为利用总 RNA样品直接构建的转录组 测序文库的测序结果。 由图 3可知， 利用三个经过本发明的方法处理的样品所构建的转 录组测序文库的测序结果中的 mRNA 比例分别为 27.3%、 35.5%、 48.3% , 平均值为 37.0% , 与利用经过切胶处理的样品所构建的转录组测序文库的测序结果相比 mRNA比 例提高了 3 倍左右， 与利用总 RNA 样品直接构建的转录组测序文库的测序结果相比 mRNA比例提高 30倍左右。
图 2和图 3的结果表明，本发明的富集原核生物 mRNA的方法， 能够有效减少原核生 物的总 RNA中 rR A的含量， 提高测序数据中的 mRNA的比例。 其中， 实验数据表明， 处理后的样品中 mRNA比例相对未经处理的对照组提高 20倍以上，与琼脂糖凝胶电泳回收 法相比， mRNA比例也提高了 2倍以上。
三、 DSN酶处理文库
将上述利用经过本发明的方法处理的样品 E.coli 1所构建的转录组测序文库（在本 文中也称为 E.coli 1文库或 E.coli 1转录组测序文库） ， 取等量的两份， 将其中一份不经 DSN酶处理， 以其即 E.coli 1文库作为对照， 将另一份进行 DSN酶（双链特异性核酸酶， Evrogen, 俄罗斯）处理， 以便获得经 DSN酶处理的 E.coli 1文库， 然后将两个文库分别将 于 Illumina HiSeq2000测序仪上进行测序。
其中， 将其中一份 E.coli 1文库进行 DSN酶处理是按照下列步骤进行的：
1 )取 4 L上述 E.coli 1文库 （ cDNA )至 1.5mL离心管中， 然后添加 ΑμΙ,杂交緩冲 液和 8 L超纯水， 混匀后将其进行短暂离心使溶液位于管底；
2 )将上述离心管于 98 °C下进行加热 2min, 然后于 68 °C下进行孵育 4〜7小时； 注意： 以下的第 3、 4步的加液与混匀操作均需在恒温（68 °C ) 下进行， 不能将离心 管拿出加热仪（ ABI 9700型 PCR仪， Applied Biosystems, 美国）。
3 ) 向上述离心管中添加 20μ 预热至 68 °C的 DSN酶反应緩冲液， 充分混匀后于 68
°C下进行孵育 lOmin;
4 ) 向上述离心管中添加 ΑμΙ, DSN酶溶液， 充分混匀后于 68 °C下进行孵育 25min; 5 )向上述离心管中添加 40μ 终止緩冲液， 充分混匀后于 68 °C下进行孵育 5min, 然 后将离心管于水上静置 5min, 并添加 20μ 超纯水， 混匀后于 -20 °C下进行保存；
6 )取 20μ DSN处理后的 cDNA作为模板，进行 PCR扩增（釆用 Solexa测序引物）， 以便获得扩增产物， 即获得经 DSN酶处理的 E.coli 1文库。
两个文库的测序结果见图 4。 图 4显示了根据本发明一个实施例的 E.coli 1转录组测 序文库经 DSN酶处理前后的测序结果。 如图 4所示， 处理前的 E.coli 1文库中 mRNA 比例为 27.3% , 经过 DSN酶处理后 E.coli 1文库中 mRNA比例提高至 61.33% , 约提高 了 2.25倍， 表明 DSN酶处理对细菌转录组测序文库的构建具有显著影响， 可提高文库 中 mRNA的比例， 从而能够降低测序成本。 工业实用性
本发明的富集原核生物 mR A的方法、构建转录组测序文库的方法、转录组测序文库、 确定原核生物 mR A序列信息的方法、 探针及其在富集 mRNA中的用途以及试剂盒及其 在构建转录组测序文库中的用途， 能够有效地应用于原核生物的转录组测序文库的构建以 及测序， 并且获得的文库质量好， 测序结果准确。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。 根据已 经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范 围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中， 参考术语 "一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示 例"、 "具体示例"、 或 "一些示例" 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结 构、 材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语 的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或 者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书
1、 一种富集原核生物 mRNA的方法， 其特征在于， 包括以下步骤：
将核酸样品与探针杂交， 所述核酸样品含有原核生物的 16s rRNA, 23s rRNA和所述 mRNA, 所述探针携带标记物， 并且所述探针能够与所述 16s rRNA和 23s rRNA特异性结 合以便形成探针 -rRNA复合物； 以及
利用特异性结合所述标记物的分子实体去除所述探针 -rRNA 复合物， 以便富集所述原 核生物 m NA。
2、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述标记物为 polyA, 所述分子实体为 寡聚 dT。
3、 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述分子实体形成于磁珠上。
4、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述探针包括 SEQ ID NO: 1-10所示的 寡核苷酸。
5、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 在 70-74 °C下进行所述杂交 25-35分钟。
6、 根据权利要求 5所述的方法， 其特征在于， 在 72°C下进行所述杂交。
7、 根据权利要求 5所述的方法， 其特征在于， 进行所述杂交 30分钟。
8、 一种构建转录组测序文库的方法， 其特征在于， 包括以下步骤：
根据权利要求 1 -7任一项所述的方法， 富集 mRNA; 以及
针对所得到的 mRNA, 构建测序文库， 以便获得转录组测序文库。
9、 根据权利要求 8所述的方法， 所述转录组测序文库适于利用选自 Illumina Solexa、 ABI SOLiD及 Roche 454测序平台的至少一种进行测序。
10、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于， 进一步包括：
利用双链特异性核酸酶对所述转录组测序文库进行处理。
11、 一种转录组测序文库， 其是由根据权利要求 8-10任一项所述的方法构建的。
12、 一种确定原核生物 mRNA序列信息的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 根据权利要求 8- 10任一项所述的方法构建转录组测序文库； 以及
对所述转录组测序测序文库进行测序， 以便获得所述原核生物 mRNA序列信息。
13、根据权利要求 12所述的方法， 其特征在于， 利用选自 Illumina Solexa、 ABI SOLiD 及 Roche 454测序平台的至少一种进行测序。
14、 根据权利要求 13所述的方法， 其特征在于， 利用 Illumina Solexa测序平台进行测 序。
15、 一种探针， 其特征在于， 所述探针携带标记物， 并且能够与原核生物的 16s和 23s rRNA的保守区域特异性结合。
16、 根据权利要求 15所述的探针， 其特征在于， 由 SEQ ID NO: 1-10所示的寡核苷酸 构成。
17、 权利要求 15或 16所述的探针在富集 mRNA中的用途。
18、 一种试剂盒， 其特征在于， 包括：
权利要求 15或 16所述的探针； 以及
分子实体， 所述分子实体特异性结合所述探针的标记物。
19、 根据权利要求 18所述的试剂盒， 其特征在于， 所述标记物为 polyA, 所述分子实 体为寡聚 dT。
20、 根据权利要求 19所述的试剂盒， 其特征在于， 所述分子实体形成于磁珠上。
21、 权利要求 18-20任一项所述的试剂盒在构建转录组测序文库中的用途。
PCT/CN2011/084237 2010-12-22 2011-12-19 富集原核生物mrna的方法及其用途 Ceased WO2012083832A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010600211.0A CN102533956B (zh) 2010-12-22 2010-12-22 一种提高原核生物转录组高通量测序效率的方法
CN201010600211.0 2010-12-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012083832A1 true WO2012083832A1 (zh) 2012-06-28

Family

ID=46313161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2011/084237 Ceased WO2012083832A1 (zh) 2010-12-22 2011-12-19 富集原核生物mrna的方法及其用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN102533956B (zh)
WO (1) WO2012083832A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3052644B1 (en) * 2013-10-01 2019-07-10 Texcell Detection of rare microbiological nucleic acids
CN105297144A (zh) * 2015-10-27 2016-02-03 北京百迈客生物科技有限公司 一种原核生物小rna的高通量文库构建方法
CN105200531A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 北京百迈客生物科技有限公司 一种针对特定大小rna片段的高通量测序文库构建方法
CN105631246B (zh) * 2016-01-27 2018-07-06 广东省微生物研究所 一种分析微生物群落结构所需测序量的预测方法
CN106801050B (zh) * 2017-02-20 2020-01-14 广州永诺生物科技有限公司 一种环状rna高通量测序文库的构建方法及其试剂盒
CN107119043B (zh) * 2017-04-28 2020-04-10 北京全式金生物技术有限公司 一种去除rna样本中非目标rna的方法
CN108193283A (zh) * 2017-12-21 2018-06-22 上海美吉生物医药科技有限公司 一种单细胞转录组文库建立方法及其应用
CN110878298B (zh) * 2019-11-22 2023-09-15 深圳市易基因科技有限公司 rRNA捕获探针及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1491955A (zh) * 2002-10-25 2004-04-28 中国人民解放军军事医学科学院微生物 一种提取细菌mRNA的方法
CN1882839A (zh) * 2003-09-24 2006-12-20 原子能委员会 溶于复杂混合物中的不同分子靶的分离和/或分析设备
CN101640085A (zh) * 2009-07-03 2010-02-03 南开大学 一种分离mRNA的纤维素磁性微米材料的制备及应用
CN101851786A (zh) * 2009-12-11 2010-10-06 香港城市大学深圳研究院 一种海洋青鳉鱼特异性组织的均一化cDNA文库及制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020072061A1 (en) * 1999-07-30 2002-06-13 Alex Chenchik Methods and compositions for use in synthesizing nucleic acids
CN1683565A (zh) * 2005-03-15 2005-10-19 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途
CN101397586B (zh) * 2008-10-10 2011-02-02 广东省疾病预防控制中心 食源性致病菌检测的复合型基因芯片

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1491955A (zh) * 2002-10-25 2004-04-28 中国人民解放军军事医学科学院微生物 一种提取细菌mRNA的方法
CN1882839A (zh) * 2003-09-24 2006-12-20 原子能委员会 溶于复杂混合物中的不同分子靶的分离和/或分析设备
CN101640085A (zh) * 2009-07-03 2010-02-03 南开大学 一种分离mRNA的纤维素磁性微米材料的制备及应用
CN101851786A (zh) * 2009-12-11 2010-10-06 香港城市大学深圳研究院 一种海洋青鳉鱼特异性组织的均一化cDNA文库及制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIAN, ZHEXIAN ET AL.: "Transcriptome analysis of Sinorhizobium meliloti nodule bacteria in nifA mutant background.", CHINESE SCIENCE BULLETIN, vol. 51, no. 17, 15 September 2006 (2006-09-15), pages 2079 - 2086, XP019411910, DOI: doi:10.1007/s11434-006-2092-2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102533956B (zh) 2014-05-14
CN102533956A (zh) 2012-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2012083832A1 (zh) 富集原核生物mrna的方法及其用途
JP2024149636A (ja) ヌクレアーゼを利用したｒｎａ枯渇
JP6324962B2 (ja) 標的ｒｎａ枯渇化組成物を調製するための方法およびキット
WO2016037537A1 (en) Method for constructing a sequencing library based on a single-stranded dna molecule and application thereof
JP7733642B2 (ja) シーケンシングのためのｒｎａ試料を調製する方法およびそのキット
CN113061648A (zh) 一种采用Tn5转座酶辅助构建微量样品m6A修饰检测文库的方法及其应用
CN103571822B (zh) 一种用于新一代测序分析的多重目的dna片段富集方法
CN115747208A (zh) 一种dna/rna混合物的处理方法
Hoch et al. Bacillus subtilis 6S-2 RNA serves as a template for short transcripts in vivo
CN104818331B (zh) 雷蒙德氏棉功能着丝粒序列及其分子标记
CN114364813B (zh) 多重等温扩增核酸序列的方法
CN102465178B (zh) 一种cot-1DNA、其制备方法及用途
US20220380839A1 (en) Methods and kits for depleting undesired nucleic acids
CN106754891A (zh) 一种rna反义纯化方法
WO2012083845A1 (zh) 用于除去测序文库中载体片段的方法及其用途
Matteau et al. Precise identification of genome-wide transcription start sites in bacteria by 5′-rapid amplification of cDNA ends (5′-RACE)
CN113039283B (zh) 分离和/或富集宿主源核酸和病原核酸的方法和试剂及其制备方法
CN112080555A (zh) Dna甲基化检测试剂盒及检测方法
RU2746100C1 (ru) Способ мультиплексного выявления генов токсинов
JP2023548857A (ja) ヘアピンオリゴヌクレオチド及びその使用
CN115279918A (zh) 用于测序的新型核酸模板结构
CN120060439B (zh) 一种基于封闭引物去人源核酸的测序文库构建方法及应用
CN118957022B (zh) 一种接头组合物和小rna文库及其构建方法
CN120536554A (zh) 用于和细菌核糖体rna杂交的dna探针及其制备方法和应用
US10626444B2 (en) Methods of assaying nucleic acids of low quantities using a buffer nucleic acid

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11852020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11852020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1