WO2012077828A1

WO2012077828A1 - 炎症性サイトカインの機能を抑制する炎症性疾患治療剤

Info

Publication number: WO2012077828A1
Application number: PCT/JP2011/078982
Authority: WO
Inventors: 郁野上原; 田中　信之; 篤子谷村; 善哉内藤; 佳代小暮
Original assignee: 学校法人日本医科大学
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2012-06-14
Also published as: JP6043997B2; JPWO2012077828A1

Abstract

　本発明は、炎症性サイトカインの機能を抑制することにより抗炎症効果を示す炎症性疾患の予防又は治療剤の提供を目的とし、本発明は2-デオキシ-D-グルコース又はその誘導体を有効成分として含む、炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤である。

Description

炎症性サイトカインの機能を抑制する炎症性疾患治療剤

　本発明は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース等のマンノース代謝に関与する化合物を有効成分として含む炎症性疾患の予防又は治療剤に関する。

　炎症は、外因あるいは内因性の有害な刺激に応答してそれを除去する反応であるが、過度の反応は生体にとって害を及ぼし、様々な疾患の原因となっている。これらの病態は、炎症部位に集積するマクロファージなどの炎症細胞とこれらの細胞から産生される炎症性サイトカインやケミカルメディエーターによって引き起こされる。これまでに多くの炎症の治療法が開発されているが、その効果は限定的であり、副作用も多い。また、直接炎症性サイトカインの効果を抑制する治療法も開発されている。炎症の治療には免疫抑制作用をもつステロイド系抗炎症薬や主にシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２）の活性を抑制してケミカルメディエーターの産生を抑えることで働く非ステロイド系抗炎症薬があるが、副作用も多く効果も限定的である。直接炎症性サイトカインに働いてその効果を抑制する治療法としては、抗体を用いた抗ＩＬ−６、抗ＴＮＦ−α療法やＩＬ−１受容体アンタゴニストなどのタンパクを用いた治療があり、リウマチ性関節炎の治療などに用いられているが、高価であり単一のサイトカインを抑制するために、効果は限定的である。
　これまで、アミノ糖の１種であるグルコサミンによる抗炎症効果について報告されている（特許文献１~４等を参照）。グルコサミンの抗炎症作用についてプロスタグランジン合成経路の抑制等の現象が観察されているが、その分子機構は明らかではない（非特許文献１を参照）。また、グルコサミンの研究の過程で、構造的に類似している２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）と比較した報告もあるが（非特許文献２~３を参照）、これらは２−デオキシ−Ｄ−グルコースの抗腫瘍効果について報告しており、また、抗腫瘍効果はグルコサミンよりも効果が劣っているとも報告されていた（非特許文献２を参照）。さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコースが肥満予防や肥満改善に効果があるという報告もあった（特許文献５を参照）。なお、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを抗炎症性物質としている報告もあるが（特許文献３）、実証データは示されておらず、単にグルコサミンとの構造的類似性から種々の化合物の１つと記載しているに過ぎない。実際、グルコースの誘導体は基本骨格は類似しているが、構造が類似していたとしても置換基が異なれば、その作用が異なることは周知の事実であり、単に構造が類似しているからといって、同様の作用効果を奏するとは言えない。
　上記のように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの抗炎症効果については研究がされていなかった。
特表２０１０−５０６９０８号公報特公平６−７８２３５号公報特公平６−５１６２６号公報特開２００７−２９１０１１号公報特開２００９−２０９１４１号公報Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２０１０，１８；５−１１Ｂｅｋｅｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，１９６９，２９；３５３−３５９Ｌａｓｚｌｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　ｌｎｓｔ．，１９６０，２４；２６７−２８１Ｂｅｋｅｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ．，１９６９，２１１；３７６６−３７７２

　本発明は、炎症性サイトカインの機能を抑制することにより抗炎症効果を示す炎症性疾患の予防又は治療剤の提供を目的とする。
　上記のように、これまで２−デオキシ−Ｄ−グルコースと構造が類似しているグルコサミンによる抗炎症効果について報告されていた。しかしながら、構造が類似しているからといって、置換基の異なる２−デオキシ−Ｄ−グルコースがグルコサミンと同様の作用効果を奏するとは予測できなかった。本発明者らは、これまで研究されていなかった、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの抗炎症作用について検討を行った。その結果、２−デオキシ−Ｄ−グルコースがＩＬ−６やＩＦＮ−γ受容体分子の糖鎖修飾の抑制やそのシグナルの抑制効果を有することを見出し、さらにそれにより炎症性サイトカインの機能を抑制し、炎症反応を抑えることができることを見出した。すなわち、２−デオキシ−Ｄ−グルコースはＩＬ−６やＩＦＮ−γ等の種々の炎症性サイトカインの作用を抑制し、その作用は２−デオキシ−Ｄ−グルコースが糖代謝経路のうち、マンノース代謝からタンパクの糖鎖修飾（Ｎ−結合型糖鎖）を抑制することを介することにより発揮されていた。この作用により、特に受容体タンパク質の半減期の短いＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α受容体分子の糖鎖修飾が抑制された。本発明者等は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの作用を比較し、グルコサミンには２−デオキシ−Ｄ−グルコースで観察されたＩＬ−６受容体の糖鎖修飾の抑制やそのシグナルの抑制効果が認められないことを確認した。このことは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの作用効果が、従来から知られていたグルコサミンの抗炎症効果とは全く機序が異なることを示している。本発明者等はこの新たな知見を基に、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの種々の炎症性サイトカインに対する効果を調べ、２−デオキシ−Ｄ−グルコースが多種類の炎症性サイトカインの効果を同時に抑制して炎症反応を抑える新しい予防又は治療法に用い得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、既に癌の治療やてんかんの治療を目的とした研究が行われており、それらの結果から副作用が非常に少ない安全な医薬として利用し得ることは知られていた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体を有効成分として含む、炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［２］　２−デオキシ−Ｄ−グルコースの誘導体が、ＧＤＰ−２−デオキシマンノース、２−デオキシマンノース−１−リン酸及び２−デオキシマンノース−６−リン酸からなる群から選択される化合物である、［１］の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［３］　２−デオキシ−Ｄ−グルコースの誘導体が、２−フルオロ−２−デオキシグルコース、２−フルオロデオキシグルコース、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース、ＧＤＰ−２−フルオロデオキシマンノース、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸及び２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸からなる群から選択される化合物である、［１］の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［４］　炎症性疾患が炎症性サイトカインにより引き起こされるものである、［１］~［３］のいずれかの炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［５］　炎症性サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γからなる群から選択される、［１］~［４］のいずれかの炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［６］　炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、関節炎、敗血症及び炎症性腸疾患からなる群から選択される、［１］~［５］のいずれかの炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−２７３７０４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

　図１Ａは、培養細胞における２−デオキシ−Ｄ−グルコースによるＩＬ−６受容体であるｇｐ１３０のＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を示す図である。
　図１Ｂは、培養細胞における２−デオキシ−Ｄ−グルコースによるＩＦＮ−γ受容体の発現への影響を示す図である。
　図１Ｃは、培養細胞における２−デオキシ−Ｄ−グルコースによるＴＮＦ−α受容体の発現への影響を示す図である。
　図２は、サイトカイン刺激による転写活性化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図である。図２ＡはＩＬ−６刺激によるＳｔａｔ３の転写への効果を示し、図２ＢはＴＮＦ−α刺激によるＮＦ−κＢの転写への効果を示し、図２ＣはＩＬ−１刺激によるＮＦ−κＢの転写への効果を示し、図２ＤはＬＰＳ刺激によるＩＦＮ−βの転写への効果を示す。
　図３Ａは、炎症性腸疾患モデルマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを摂取させた場合の効果を示す図である。
　図３Ｂは、炎症性腸疾患モデルマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを摂取させた場合の大腸組織におけるＩＬ−６（図３Ｂ（ａ））、ＩＬ−１（図３Ｂ（ｂ））及びＨＰ（図３Ｂ（ｃ））の発現量を示す図である。
　図４は、炎症性腸疾患モデルマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを摂取させた場合の組織病理学的解析の結果を示す写真である。図４Ａはコントロールマウス、図４Ｂはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）飲水マウス、図４ＣはＤＳＳ飲水マウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与したマウスの結果を示す。
　図５は、ＳＫＧマウスによる関節リウマチ発現に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す写真である。図５Ａは水を飲水したコントロールマウスの結果、図５Ｂは２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を飲水したマウスの結果を示す。
　図６Ａは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における関節炎スコアに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図である。
　図６Ｂは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における体重変化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図である。
　図７は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース及びグルコサミンの構造を示す図である。
　図８は、ＩＬ−６標的遺伝子群へのシグナル伝達経路を示す図である。
　図９は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの糖鎖修飾及び炎症性シグナル伝達に対する効果の違いを示す図である。
　図１０は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの腸炎に対する効果の違いを示す図である。
　図１１は、ＳＫＧマウスによる関節リウマチ発現に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す写真である。図１１ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｃが無処置のＳＫＧマウスの肢の状態を示す。
　図１２は、ＳＫＧマウスによる関節リウマチ発現に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示すＨｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色法で組織染色した結果を示す写真である。図１２ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの結果であり、図１２ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの結果である。
　図１３Ａは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における関節炎スコアに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図であり、ラミナリン投与後の関節スコアを示す図である。
　図１３Ｂは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における関節炎スコアに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図であり、ラミナリン投与後の体重変化を示す図である。
　図１４は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースをマウスに経口投与した場合の、マウス腹腔滲出マクロファージ（チオグリコレート誘導）のＩＬ−６受容体であるｇｐ１３０のＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を示す図である。
　図１５は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの副作用低減効果を示す図である。図１５Ａは、マウス腹腔滲出マクロファージ（チオグリコレート誘導）を用いた結果を示し、図１５Ｂはマウス腹腔常在性マクロファージを用いた結果を示す。
　図１６は、２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＦＤＧ）によるＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害の検討の結果を示す図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の有効成分は、マンノース代謝に関与し、マンノシルトランスフェラーゼによる、Ｎ結合型糖鎖合成前駆体であるドリコール脂質への糖鎖（マンノース）付加反応を抑制し得る化合物である。このマンノース付加は、マンノース代謝産物であるＧＤＰ−マンノースを基質としたマンノシルトランスフェラーゼによる反応である。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の有効成分は、上記反応を阻害し、代謝半減期の早いサイトカインレセプターの新規合成時の糖鎖修飾を阻害し、これにより炎症性サイトカインのシグナル伝達を阻害することにより抗炎症効果を発揮する。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の有効成分の存在下で、培養細胞を培養した場合、培養細胞中のＧＤＰ−マンノースが蓄積する。
　上記の作用を奏する本発明の炎症性疾患の有効成分として用い得る化合物として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＧＤ））、２−デオキシ−Ｄ−グルコースがマンノース代謝された際の生成物である２−デオキシマンノース−６−リン酸（２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（＝２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））、２−デオキシマンノース−１−リン酸（２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（＝２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））及びＧＤＰ−２−デオキシマンノース（ＧＤＰ−２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ（＝ＧＤＰ−２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ））等が挙げられる。さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコースと同様の作用を持つことが知られている（Ｍｅｔｉｎ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ　Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ　２００７；６（１１）：３０２９−５８）２−フルオロ−２−デオキシグルコース及び２−フルオロ−２−デオキシグルコースがマンノース代謝された際の生成物である２−フルオロデオキシグルコース（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２−フルオロ−デオキシマンノース（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ）、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等が挙げられる。上記化合物は、フリー体であってもよく、その生理学的に許容される塩又は溶媒和物であってもよい。さらに、水和物であっても非水和物であってもよい。塩は限定されないが、塩酸塩等の無機塩や酢酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩等の有機酸塩を含む。本発明においては、上記化合物を２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体という。
　本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の対象となる炎症性疾患は、炎症性サイトカインにより引き起こされる炎症性疾患である。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、炎症性サイトカインの産生を抑制し、あるいは炎症性サイトカインの機能を抑制し、炎症症状を抑えることができる。本発明において炎症性サイトカインの機能を抑制するとは、炎症性サイトカインの産生の抑制も炎症性サイトカインの作用の抑制も含む。炎症性サイトカインとしては、ＩＬ（インターロイキン）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ（インターフェロン）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等が挙げられる。この中でも、本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤により、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの機能を好適に抑えることができる。
　炎症性サイトカインにより引き起こされる炎症性疾患は、炎症を伴う状態又は疾患をいい、上記のサイトカインの産生が亢進している状態又は疾患をいい、全身性の炎症性疾患も局所性の炎症性疾患も含まれる。このような炎症性疾患として、クローン病、潰瘍性腸疾患等の炎症性腸疾患；慢性関節リウマチ、骨関節炎、変形性関節炎、脊椎炎等の関節炎；慢性気管支炎；アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等のアレルギー性の炎症性疾患；動脈硬化等のメタボリックシンドローム；自己免疫疾患；ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）；敗血症；皮膚炎；外傷、熱傷、術後等の全身性炎症；糸球体腎炎、腎炎等の腎臓の炎症性疾患等が含まれる。この中でも慢性関節リウマチ、関節炎、敗血症及び炎症性腸疾患の予防又は治療に好適に用いることができる。
　ヒトの炎症性疾患だけでなく、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、フェレット、ニワトリ等の非ヒト脊椎動物の炎症性疾患も対象となる。
　また、２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は正常細胞よりも炎症細胞で強く作用する。従って、２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体を有効成分として含む本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤を用いる場合には、正常細胞への作用が抑えられその結果、正常細胞が受ける小胞体ストレスに起因する副作用は軽減することができる。すなわち、本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、正常細胞に作用しにくい、副作用の少ない予防又は治療剤である。
　本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、製薬上許容される担体や希釈剤等を含んでいてもよい。担体としては、限定されないが生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グルコース液、緩衝生理食塩水等を挙げることができる。
　投与経路は限定されないが、経口投与、あるいは皮下、筋肉内及び静脈内、直腸内等のなどの非経口投与により投与することができる。投与形態としては、種々の形態で投与することができ、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、噴霧剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤；デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを含んでいてもよい。また、乳剤、シロップ剤等の液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；オリーブ油、ごま油、大豆油等の油脂類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを含んでいてもよい。さらに、注射剤は、水；ショ糖、ソルビトール、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを含んでいてもよい。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、さらにｐＨ調整剤、抗酸化剤、安定化剤、保存剤、増粘剤、キレート化剤、保湿剤、着色剤、等張剤等を含んでいてもよい。
　投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができるが、１回投与当たり、フリー体換算で０．００５~１０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、１０~５００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、１００~４００ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましく、２００~３５０ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましく、２５０~３００ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。投与方法は限定されないが、静注する場合、１回投与当たり上記の量を生理食塩水等に溶解して投与することができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

　Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾及びサイトカイン刺激による転写活性化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
　２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）によるＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を検討した。培養細胞として、マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた。２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地の組成は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に２−デオキシ−Ｄ−グルコースを終濃度で２５ｍＭ添加したものであった。
　培養細胞を２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地処理及び無グルコース培地で処理し、一定時間ごとに培養細胞（ＭＥＦ）を採取し、ＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾のコントロールとして、培養細胞をＧｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＦ（ＧＰ−Ｆ）で処理したものを用いた。ＧＰ−ＦはＮ−グリコシド糖鎖とタンパク質の結合部位を特異的に切断する酵素である。図１Ａに示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理した受容体タンパク質がＧＰ−Ｆで処理したサンプルと同じ分子量を示している。このことから、Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾が外れていることがわかる。
　同様に培養細胞を２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地で処理し、一定時間ごとに培養細胞（ＭＥＦ）を採取し、ＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮＧＲα）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾のコントロールとして、培養細胞をＧＰ−Ｆで処理したものと、Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾阻害剤であるＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ（ＴＭ）で処理したものを用いた。図１Ｂに結果を示す。図１Ｂに示すように、ＩＬ−６受容体同様、ＩＦＮ−γ受容体でもＮ−グリコシド型糖鎖修飾が外れていることがわかる。
　同様に培養細胞を２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地で処理し、一定時間ごとに培地を採取し、ＴＮＦ−α受容体（ＴＮＦＲ１）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾のコントロールとして、培養細胞をＧＰ−Ｆで処理したものを用いた。図１Ｃに結果を示す。図１Ｃに示すように、ＩＬ−６受容体同様、ＴＮＦ−α受容体でもＮ−グリコシド型糖鎖修飾が外れていることがわかる。
　さらに、サイトカイン刺激による転写活性化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を検討した。培養細胞に２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理を行った後、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＴＮＦα、（Ｃ）ＩＬ−１、（Ｄ）ＬＰＳで刺激し、ルシフェラーゼアッセイにより、各刺激に対する転写活性化能が２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理により変化するかを調べた。結果を図２に示す。図２に示すように、各サイトカイン刺激による下流遺伝子の転写活性が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理によって全て抑制されていることがわかる。
　２−デオキシ−Ｄ−グルコースは解糖系を阻害することが知られているが、無グルコース培地で解析してもＩＬ−６、ＩＦＮ−γ受容体分子の糖鎖修飾の抑制やこれらのサイトカインのシグナルの抑制が見られないことから、この現象は２−デオキシ−Ｄ−グルコースの解糖系の阻害効果によるものではないことも明らかになった（図１）。
　上記の炎症性サイトカイン受容体は細胞膜表面への移動やそのリガンドとの結合に糖鎖修飾が必須であり、本実施例により、２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理によってこれらのサイトカインシグナルが顕著に抑制されること、ＩＬ−１作用やＴＮＦ−α、ＴＬＲ４の作用も抑制されることを、培養細胞を用いた実験で示された。

　炎症性腸疾患に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
　マウスを用いて潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患のモデルであるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性腸炎に対する効果を調べた。ＤＳＳ腸炎発症にＩＬ−６やＩＦＮ−γが部分的に関与することは、それぞれの遺伝子欠損マウスの解析から知られていた（Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１９３，ｐｐ．４７１−４７８，２００１）。
　マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）を用い、ＩＬ−６欠損マウスは、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉ１６＜ｔｍ１Ｋｏｐｆ＞／Ｊ（Ｔｈｅ　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ．日本チャールズ・リバー）、ＩＦＮ−γ受容体欠損マウスは、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｉｆｎｇｒ１＜ｔｍ１Ａｇｔ＞／Ｊ（Ｔｈｅ　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ．日本チャールズ・リバー）を用いた。ＤＳＳ飲水によるマウスの体重変化及び大腸組織におけるＩＬ−６の発現量を調べた。
　マウスに２％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを飲み水として自由に摂取させ、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを１日１回　腹腔内投与して、体重変化を観察した。実験終了時にマウスの大腸組織を摘出し、その大腸からＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法によりｍＲＮＡレベルでのＩＬ−６の発現量を調べた。Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌとしてβ−Ａｃｔｉｎの発現量を使用した。図３Ａ及び図３Ｂに結果を示す。図３Ａはマウスの体重変化を示し、図３ＢはＩＬ−６（図３Ｂ（ａ））、ＩＬ−１（図３Ｂ（ｂ））及びハプトグロビン（ＨＰ）（図３Ｂ（ｃ））のｍＲＮＡ発現量（ｆｏｌｄ）を示す。
　２％ＤＳＳを飲み水としてマウスに自由摂取させると、激しい下痢と血便がみられるようになり、７~１０日程で死亡した。一方、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを２００ｍｇ／ｋｇ（報告では、ラットでのＬＤ５０は２０００ｍｇ／ｋｇ）腹腔内に１日１回連日投与したところ、ほとんど下痢、血便の症状を示さず、体重減少（ＤＳＳのみを投与した場合、一週間で体重は約３／４に減少する）もほとんど見られなかった（図３Ａ）。さらに、この大腸組織でのＩＬ−６のｍＲＮＡレベルでの発現を見たところ、ＤＳＳのみを投与した時に発現誘導されるＩＬ−６が２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与時は顕著に発現が抑制されていた（図３Ｂ）。
　また、ＩＬ−６欠損マウス及びＩＦＮ−γ受容体欠損マウスを用いて解析しても、これらのマウスで限定的にみられていた腸炎症状が２−デオキシ−Ｄ−グルコースで抑制された。このことは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースが単独の抗サイトカイン療法よりも効果が高いことを示している。
　さらに、本実施例の検討に供したマウスの大腸組織を摘出し、Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色法で組織染色した。結果を図４に示す。図４に示すように、この大腸組織の組織病理学的解析でも、２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与群では、大腸粘膜の破壊はほとんど観察されず、非常に有効性の高い治療法であること考えられた。

　慢性関節リウマチモデルマウスに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
　慢性関節リウマチを発症するモデルマウスであるＳＫＧマウス（ＩＬ−６が発症に関与することがＩＬ−６欠損マウスとの掛け合わせによって証明されている：Ｈａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．１１４，ｐｐ．５８２−５８８，２００４、日本クレアより入手、６週齢）に１週間、水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）又は０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を自由摂取で与えた後、誘発性関節炎を発症させるためにβグルカンとしてラミナリン３０ｍｇ／匹を腹腔内投与し、その後も水又は０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を自由摂取で与え続け、８週後、関節炎の程度を観察した。
　図５に結果を示す。図５Ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図５Ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの肢の状態を示す。図５に示すように、ＳＫＧマウスでのコラーゲン誘発性関節炎発症に対して、飲み水に０．５％（ｗ／ｖ）の２−デオキシ−Ｄ−グルコースを加えておくと、発症が顕著に抑えられた。
　さらに、関節リウマチモデルマウスであるＳＫＧマウスを用いて、上記と同様の実験を行い、発現した関節炎のスコア及び体重の変化を１週ごとに観察した。なお、餌は全ての期間において自由摂取させた。結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。図６Ａはラミナリン投与後の関節スコアを示し、図６Ｂはラミナリン投与後の体重変化を示す。図に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与したマウスでは、関節スコアが低く関節炎の発症が抑制され、体重増加も良好であった。
　さらに、敗血症のモデルであるｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）腹腔内投与においても２−デオキシ−Ｄ−グルコース腹腔内投与により症状の緩和が観察された。

　慢性関節リウマチモデルマウスに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果（その２）
　実施例３の実験の再現性を確認した。結果を図１１及び図１２並びに図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。
　図１１ａがラミナリンを投与し水を与えたコントロールＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｂがラミナリンを投与し０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｃがラミナリン無処置のＳＫＧマウスの肢の状態を示す。図１１ａ~図１１ｃに示すように、ＳＫＧマウスでのコラーゲン誘発性関節炎発症に対して、飲み水に０．５％（ｗ／ｖ）の２−デオキシ−Ｄ−グルコースを加えておくと、発症が顕著に抑えられた。また、図１２に左後肢関節部をＨｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色法で組織染色した結果を示す。図１２ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの結果であり、図１２ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの結果である。２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与群では、好中球やリンパ球の浸潤に伴う滑膜の破壊及び炎症性肉芽反応はほとんど観察されず、非常に有効性の高い治療法であることがわかった。
　図１３Ａはラミナリン投与後の関節スコアを示し、図１３Ｂはラミナリン投与後の体重変化を示す。図に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与したマウスでは、投与１１週後においても関節スコアが低く関節炎の発症が抑制され、体重増加も良好であった。

　２−デオキシ−Ｄ−グルコースの経口投与による効果
　マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）の腹腔滲出性マクロファージを、３％チオグリコレート培地２ｍｌづつ腹腔内投与して無菌性炎症を引き起こす事により誘導した後、ゾンデを用いて２−デオキシ−Ｄ−グルコースを１０ｍｇづつ経口投与した。その後一定時間ごとに、マウスから腹腔滲出性マクロファージの調製を行い、得られたマクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害を調べた。
　すなわち、マクロファージ上のＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
　結果を図１４に示す。図１４に示すように２−デオキシ−Ｄ−グルコースを経口投与したマウスにおいては、マクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害が確認された。

　２−デオキシ−Ｄ−グルコースの副作用低減効果
　実施例５と同様に、マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）の腹腔滲出性マクロファージをチオグリコレート培地で誘導した後、２−デオキシ−Ｄ−グルコース１０ｍｇずつを腹腔内注射により投与した。その後、一定時間ごとに滲出性マクロファージの調製を行い、得られたマクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
　また、前処理なしのマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）に２−デオキシ−Ｄ−グルコース１０ｍｇずつを腹腔内注射により投与した。その後、滲出性マクロファージの調製時と同様の時間に、腹腔常在性マクロファージの調製を行い、得られたマクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
　結果を図１５Ａに示す。図１５Ａに示すようにチオグリコレートによる炎症で誘導された滲出性マクロファージは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの腹腔内投与により、マクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害が確認された。
　一方、チオグリコレートで誘導しない常在性マクロファージでは、同様に２−デオキシ−Ｄ−グルコースで処理しても、ｇｐ１３０の糖鎖修飾阻害は起こらなかった（図１５Ｂ）。このことから、２−デオキシグルコースの作用は、正常細胞よりも炎症細胞で強く作用する事が示唆され、治療薬として正常細胞に小胞体ストレスダメージを与える事が少ないので、副作用の軽減が期待できる。

　Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾に対する２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
　２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＦＤＧ）によるＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を検討した。培養細胞として、マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた。２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地の組成は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースを終濃度で２５ｍＭ添加したものであった。
　培養細胞を２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地処理及びコントロールとして２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）培地で処理し、一定時間ごとに培養細胞（ＭＥＦ）を採取し、ＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
　結果を図１６に示す。２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いた場合も、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いた場合と同様の糖鎖修飾阻害活性が認められた。
比較例１　２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの糖鎖修飾及び炎症性シグナル伝達に対する効果
　２−デオキシ−Ｄ−グルコースと類似した構造（図７）を有するグルコサミンの糖鎖修飾及び炎症性シグナル伝達への効果を調べた。
　培養細胞にＩＬ−６及び可溶性レセプターであるｓＩＬ−６Ｒを作用させると、細胞膜レセプターであるｇｐ１３０に作用し、その下流に存在するＪＡＫｋｉｎａｓｅ（ＪＡＫ１，ＪＡＫ２，Ｔｙｋ２）がリン酸化されて活性化型となり、Ｓｔａｔ３をリン酸化する。リン酸化されて活性化型となったＳｔａｔ３は２量体となり、ＩＬ−６標的遺伝子群の転写誘導を行う（図８）。本比較例においては、２−デオキシ−Ｄ−グルコース及びグルコサミンであらかじめ処理した培養細胞をＩＬ−６で刺激した際に、これら下流のシグナル伝達が生じているのかを確認した。
　培養細胞を、通常の培地（ＤＭＥＭ）、２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地、無グルコース培地及びグルコサミン含有培地で４時間処理し、その後ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を培地中に添加して刺激し、一定時間ごとにＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾やＩＬ−６による下流のシグナル伝達の有無をＩｍｕｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
　結果を図９に示す。図９に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースで処理した細胞に見られるｇｐ１３０の糖鎖修飾欠損がグルコサミン処理では確認できず、さらに下流のＪＡＫ　ｋｉｎａｓｅ群のリン酸化が２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理では減弱しているのに対し、グルコサミン処理群ではコントロール群と同様のＪＡＫ　ｋｉｎａｓｅ群及びＳｔａｔ３の活性化が確認できた。この結果は、グルコサミンには２−デオキシ−Ｄ−グルコースと同様の効果はないことを示す。なおｇｐ１３０の研究において、ｇｐ１３０のＮ結合型糖鎖が付かない変異を入れた変異体では、細胞膜での安定性が悪くなり、下流へのシグナルが減弱されることが既にわかっており（Ｇｅｏｒｇ　Ｈ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，１７８１−１７８９）、本比較例の２−デオキシ−Ｄ−グルコースによる処理でＮ結合型糖鎖修飾がなくなったことにより、変異体と同様の効果が起きているのではないかと推察される。
比較例２　２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの腸炎に対する効果
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週令）に２％（Ｗ／Ｖ）ＤＳＳを飲み水として自由摂取させ、ＤＳＳ誘導性腸炎を発症させた。このマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はグルコサミン（ＧＳ）を１０ｍｇ／日で腹腔内投与し、体重変化を確認した。結果を図１０に示す。図１０に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与群はＤＳＳ単独投与群よりも体重減少が抑えられたが、グルコサミン投与群には全く抑制効果は見られず、むしろＤＳＳ単独投与群よりも体重減少が確認された。
　これまでに、炎症性サイトカインを抑制することで様々な疾患モデルの病態が緩和されることがこれらのサイトカイン遺伝子欠損マウスの解析から明らかとなっており、抗炎症性サイトカイン治療も開発されていた。しかし、これらの抗炎症性サイトカイン治療法は単独のサイトカインを標的としたものである。上記実施例は２−デオキシ−Ｄ−グルコースにより多種類の炎症性サイトカインを同時に抑制することができることを示し、さらにこの方法が従来の単独のサイトカインを標的とした場合よりも治療効果に優れていることを示している。また、従来の抗炎症性サイトカイン治療法はタンパク質を用いた治療法であり、その効果の持続性にも限界があった。また、抗炎症性サイトカインは非常に高価なものであり、治療コストも大きかった。これに比べると、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは安価であり、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いた治療はコストが小さく、さらに２−デオキシ−Ｄ−グルコースは副作用が少なく長期投与にも適した方法である。また、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは経口投与でも効果がみられており、患者にとっても負担が少ない。

　２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、炎症性サイトカインの機能を抑制することにより炎症反応を抑えるので、炎症性疾患の予防及び治療に用いることができる。２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、多種類の炎症性サイトカインの機能を抑制するので、強い抗炎症効果を発揮し得る。このような強い効果は構造が類似しているグルコサミンの作用からは予測し得なかったことである。さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、低コストで大量に製造することができるので、治療コストも下げることができ、さらに動物への安全性も確認されているので、安全な予防又は治療薬として用いることができる。
　２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、効果的で、さらに安全かつ安価な抗炎症剤として用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

　２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体を有効成分として含む、炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
　２−デオキシ−Ｄ−グルコースの誘導体が、ＧＤＰ−２−デオキシマンノース、２−デオキシマンノース−１−リン酸及び２−デオキシマンノース−６−リン酸からなる群から選択される化合物である、請求項１記載の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
　２−デオキシ−Ｄ−グルコースの誘導体が、２−フルオロ−２−デオキシグルコース、２−フルオロデオキシグルコース、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース、ＧＤＰ−２−フルオロ−デオキシマンノース、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸及び２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸からなる群から選択される化合物である、請求項１記載の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
　炎症性疾患が炎症性サイトカインにより引き起こされるものである、請求項１~３のいずれか１項に記載の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
　炎症性サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γからなる群から選択される、請求項１~４のいずれか１項に記載の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
　炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、関節炎、敗血症及び炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項１~５のいずれか１項に記載の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。