WO2012074117A1 - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents

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和利 高橋
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Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the establishment efficiency of artificial pluripotent stem (hereinafter also referred to as iPS) cells and a drug therefor. More specifically, the present invention relates to a method for improving iPS cell establishment efficiency using a Ras family member, and an iPS cell establishment efficiency improving agent comprising a Ras family member as an active ingredient.
  • iPS artificial pluripotent stem
  • Non-Patent Document 1 introduced the Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc genes into a fibroblast derived from a reporter mouse knocked in with a neomycin resistance gene at the Fbx15 locus and forced expression. IPS cells were induced.
  • Non-Patent Document 2 created a transgenic mouse in which a green fluorescent protein (GFP) and a puromycin resistance gene were incorporated into the locus of Nanog whose expression was more restricted to pluripotent cells than Fbx15.
  • GFP green fluorescent protein
  • IPS cells whose gene expression and epigenetic modification are almost the same as those of embryonic stem (ES) cells by forcibly expressing the above 4 genes in fibroblasts derived from the mice and selecting puromycin-resistant and GFP-positive cells (Nanog iPS cells) was successfully established. Thereafter, it was revealed that iPS cells can also be produced by three factors excluding the c-Myc gene (Non-patent Document 3). Furthermore, Takahashi et al. (Non-Patent Document 4) succeeded in establishing iPS cells by introducing the same 4 genes as in mice into human skin-derived fibroblasts. On the other hand, Yu et al.
  • Non-Patent Document 5 produced human iPS cells using Nanog and Lin28 instead of Klf4 and c-Myc. Thus, it was shown that by introducing a specific factor into a somatic cell, an iPS cell that is inferior to an ES cell in differentiation pluripotency can be produced in humans and mice.
  • iPS cell establishment efficiency is still low.
  • three factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf4) are introduced into somatic cells except for c-Myc, which is suspected to be tumorigenic in tissues and individuals differentiated from iPS cells.
  • c-Myc which is suspected to be tumorigenic in tissues and individuals differentiated from iPS cells.
  • Ras which is a low molecular weight GTPase, controls proliferation and differentiation in many cells. Ras usually exists as an inactivated form bound to GDP, but dissociates GDP by stimulating growth factors, etc., binds to GTP, changes to an activated form, and transmits a signal downstream through the target factor .
  • Ras target factors Raf, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3 kinase), Ral Guanine nucleotide ExchangingalFactor (RalGEF) and the like are known. Ras constitutively activated point mutations have been reported in various human cancer cells, and the failure of Ras protein function due to abnormal downstream signals of these target factors is one of the important steps in cell canceration. Has been speculated.
  • Non-Patent Document 6 identified a gene homologous to other Ras genes that is specifically expressed in embryonic stem cells (ES cells) and named it ERas. ERas has only about 40% homology with other Ras as a whole, but the five guanine nucleotide-binding domains (G1-G5) essential for Ras function are highly conserved and required for membrane localization. And Cax motif (C: cysteine, a: aliphatic amino acid, x: any amino acid).
  • An object of the present invention is to provide a means for improving the establishment efficiency of iPS cells, and to provide an efficient method of producing iPS cells using the same.
  • the present inventors have found that in the nuclear reprogramming process of somatic cells, an activated Ras family member, its target factor or its related factor, PI3 kinase, RalGEF, It was clarified that the establishment efficiency of iPS cells can be remarkably increased by increasing the level of Raf, AKT family member, Rheb, TCL1 or S6K activated molecule.
  • the present invention is as follows.
  • a method for improving the establishment efficiency of induced pluripotent stem cells comprising the group consisting of Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member, Rheb, TCL1 and S6K in the nuclear reprogramming process of somatic cells Increasing the level of an activated form of one or more proteins selected from.
  • [2] comprising contacting a somatic cell with one or more factors selected from the group consisting of a Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member, Rheb, TCL1 and S6K, and nucleic acids encoding them The method described in [1] above.
  • [3] The method described in [2] above, wherein the Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member and S6K are constitutively activated.
  • the Ras family member is selected from the group consisting of ERas, HRas, NRas and KRas.
  • the Ras family member constitutively activates one or more signaling pathways selected from the PI3 kinase pathway, Ral pathway and MAP kinase pathway.
  • An induced pluripotent stem cell comprising a factor selected from the group consisting of a Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member, Rheb, TCL1 and S6K, and nucleic acids encoding them. Establishment efficiency improver.
  • Ras family member is selected from the group consisting of ERas, HRas, NRas and KRas.
  • the Ras family member constitutively activates one or more signal transduction pathways selected from the PI3 kinase pathway, Ral pathway and MAP kinase pathway.
  • the Ras family member constitutively activates the PI3 kinase pathway and / or the Ral pathway.
  • [20] One or more factors selected from the group consisting of a nuclear reprogramming substance and a Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member, Rheb, TCL1 and S6K, and nucleic acids encoding them in a somatic cell
  • a method for producing induced pluripotent stem cells comprising contacting [21] The method described in [20] above, wherein the Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member and S6K are constitutively activated.
  • Ras family member is selected from the group consisting of ERas, HRas, NRas, and KRas.
  • the Ras family member constitutively activates one or more signaling pathways selected from the PI3 kinase pathway, the Ral pathway, and the MAP kinase pathway.
  • the Ras family member constitutively activates the PI3 kinase pathway and / or the Ral pathway.
  • the nuclear reprogramming substance is selected from the group consisting of Oct family members, Sox family members, Klf4 family members, Myc family members, Lin family members and Nanog, and nucleic acids encoding them.
  • the nuclear reprogramming substance is Oct3 / 4, Klf4, Sox2, and c-Myc or L-Myc and / or Nanog and / or Lin28 or Lin28B, or a nucleic acid encoding them.
  • [32] comprising a factor selected from the group consisting of Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member, Rheb, TCL1 and S6K, and nucleic acids encoding them, and a nuclear reprogramming substance An inducer of induced pluripotent stem cells.
  • Ras family member, PI3 kinase, RalGEF, Raf, AKT family member and S6K are constitutively activated.
  • the agent described in [32] or [33] above, wherein the Ras family member is selected from the group consisting of ERas, HRas, NRas and KRas.
  • the nuclear reprogramming substance is selected from the group consisting of an Oct family member, a Sox family member, a Klf4 family member, a Myc family member, a Lin family member and Nanog, and nucleic acids encoding them.
  • induced pluripotent stem cells Use of the method according to claim 1, wherein the factor is brought into contact with a somatic cell together with a nuclear reprogramming substance.
  • iPS cells Can be remarkably improved, and is particularly useful for iPS cell induction by three factors other than c-Myc, which has conventionally had a low establishment efficiency.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Example 1.
  • the vertical axis shows the fold change (Fold change) of the number of iPS colonies when the number of colonies obtained by introducing 4 genes of Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc is 1 (Red in the figure) .
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Example 2.
  • the vertical axis shows the fold change (Fold change) of the number of iPS colonies when the number of colonies obtained by introducing 4 genes of Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc is 1 (Red in the figure) .
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Example 3. The left figure shows the results using Tig-120 cells, and the right figure shows the results using 1616 cells. In the figure, the vertical axis represents the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Example 4.
  • the vertical axis shows the fold change (Fold change) of the number of iPS colonies when the number of colonies obtained by introducing 4 genes of Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc is 1 (Red in the figure) .
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Example 5. In the figure, the vertical axis represents the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Example 6.
  • the vertical axis represents the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 7 is an alkaline phosphatase-stained image of an iPS cell colony showing the results of Example 7. Each number represents the number of iPS cell colonies.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of Example 8. In FIG. 8A, the vertical axis represents the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis shows the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes and twice the amount of Mock, Mock and Myr-AKT1, Mock and c-MYC shRNA, Myr-AKT1 and c-MYC shRNA, or Myr-AKT1 and GSK3 ⁇ S9A. Indicates a combination.
  • the vertical axis represents the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of Example 9. In the figure, the vertical axis represents the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of Example 10.
  • the vertical axis represents the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes with each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 11 is a graph and a photograph showing the results of Example 11.
  • the vertical axis represents the number of iPS cell colonies
  • the horizontal axis represents the combination of the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes in the presence or absence of c-Myc shRNA and the respective genes shown on the horizontal axis.
  • FIG. 11B shows intracellular c-Myc, p-AKT (phosphorylated AKT), AKT when Mock, Myr-AKT1, Rheb, S6K1 T389E or p53 shRNA was introduced into human-derived skin fibroblasts, respectively.
  • the results of measuring the expression of p-S6K1 (phosphorylated S6K1), S6K1, p-TSC2 (phosphorylated TSC2) and TSC2 by the Western blot method are shown.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of Example 12.
  • FIG. 12A shows the result of introduction into human-derived skin fibroblasts, where the vertical axis indicates the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis shows the combination of the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes in the presence or absence of p53 shRNA and the genes shown on the horizontal axis.
  • FIG. 12B shows the result of introduction into human-derived skin fibroblasts, where the vertical axis indicates the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis shows the combination of the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes in the presence or absence of GLIS1 and each gene shown on the horizontal axis.
  • FIG. 12C shows the result of introduction into human-derived dental pulp cells, where the vertical axis indicates the number of iPS cell colonies.
  • the horizontal axis shows the combination of the Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes in the presence or absence of p53 shRNA and the genes shown on the horizontal axis, and Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 in the presence or absence of GLIS1.
  • a combination of a gene and each gene shown on the horizontal axis is shown.
  • the present invention relates to an activated Ras protein, an activated target factor thereof, a downstream signal factor of the activated Ras target factor, or an intracellular activator of the signal.
  • a method for improving iPS cell establishment efficiency by increasing the level Means for increasing the intracellular level of the activated Ras protein, the activated target factor thereof, the downstream signal factor of the activated Ras target factor or the activator of the signal are not particularly limited.
  • a protein that is a member of Ras family, PI3 kinase, RalGEF or Raf that is a target factor thereof, a downstream signal factor of a target factor of Ras or an AKT family member that is an activator of the signal, Rheb, TCL1 or S6K, or Examples include a method of contacting a somatic cell with an encoding nucleic acid, a substance that promotes a reaction that converts Ras protein into an activated form, or a substance that inhibits a reaction that converts Ras protein into an inactivated form.
  • the present invention also provides iPS cells by bringing the substance and the nuclear reprogramming substance into contact with the somatic cells.
  • a manufacturing method is provided.
  • iPS cells cannot be established only with a nuclear reprogramming substance, and iPS cells are also established by increasing the level of activated Ras protein, etc. Treat as what you want.
  • Somatic cell source Somatic cells that can be used as a starting material for producing iPS cells in the present invention are germ cells derived from mammals (eg, humans, mice, monkeys, cows, pigs, rats, dogs, etc.). May be any cell other than, for example, keratinized epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells of the tongue surface layer), exocrine glandular epithelial cells (eg, mammary cells), Hormone-secreting cells (eg, adrenal medullary cells), cells for metabolism and storage (eg, hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (eg, type I alveolar cells), luminal epithelium of inner chain vessels Cells (eg, vascular endothelial cells), ciliated cells with transport ability (eg, airway epithelial cells), cells for extracellular matrix secretion (eg, fibroblasts,
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • final differentiated mature cells It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the mammalian individual from which somatic cells are collected there are no particular restrictions on the mammalian individual from which somatic cells are collected.
  • the patient or the HLA gene is used from the viewpoint that no rejection occurs. It is particularly preferred to collect somatic cells from another person of the same or substantially the same type.
  • the HLA genotype is “substantially identical” means that cells obtained by inducing differentiation from iPS cells derived from the somatic cells by using immunosuppressive agents are transplanted into patients. Means that the HLA genotype matches to the extent that can be engrafted.
  • genotypes of the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci plus HLA-C
  • the genotypes of the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci plus HLA-C
  • the genotypes of the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci plus HLA-C
  • iPS cells are used as a source of screening cells for evaluating the patient's drug sensitivity and the presence or absence of side effects. It is desirable to collect somatic cells from others who have the same genetic polymorphism that correlates with side effects.
  • Somatic cells isolated from mammals can be pre-cultured in a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • Examples of such a medium include a minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, and F12 medium containing about 5 to 20% fetal calf serum. It is not limited to.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 RPMI1640 medium
  • 199 medium 199 medium
  • F12 medium containing about 5 to 20% fetal calf serum.
  • an introduction reagent such as a cationic liposome is used.
  • Ras protein an activated molecule of the target factor, a substance that increases the level of the downstream signal factor of the Ras target factor or the activator of the signal
  • “increases the level of the activated Ras protein” The “substance” may be any substance as long as it can increase the level of protein existing as an activated form (GTP-binding form) in one or more proteins belonging to the Ras family.
  • the “substance that increases the level of an activated Ras protein target factor” means one or more factors of the three Ras protein target factors of PI3 kinase, RalGEF and Raf, preferably one or two factors Any substance can be used as long as it can increase the intracellular level of the activated form of PI3 kinase and / or RalGEF. That is, PI3 kinase, RalGEF or Raf or a nucleic acid encoding the same, or a localization factor that recruits these intracellular target factors to the cell membrane, for example, an activated Ras protein, is also referred to as “activated form” in the present specification. Substances that increase the level of Ras protein target factor.
  • the “substance that increases the level of a downstream signal factor of Ras target factor or an activator of the signal” refers to a factor of further downstream signal of Ras protein target factor or an AKT family that is an activator of this signal
  • the Ras protein its target factor or an activation type molecule of a downstream signal factor of the Ras target factor, and substances that increase the level of the signal activator, and are referred to as “the establishment efficiency improvement factor of the present invention” There is.
  • Ras family member refers to Ras subfamily proteins identified among the Ras subfamily proteins identified by primary structural homology with HRas, KRas, and NRas identified as proto-oncogenes.
  • preferred Ras family members include, but are not limited to, HRas, KRas, NRas, ERas and the like.
  • NRas protein examples include mouse NRas (RefSeqNRAccession No. NP_035067) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, human NRas (RefSeq Accession No consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12).
  • NP_002515 or orthologs thereof in other mammals, as well as their natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants, natural and artificial activated variants, and the like.
  • heterologous NRas can also be used.
  • ERas protein examples include mouse ERas (RefSeqERAccession No. NP_853526) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and human ERas (RefSeq Accession No consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16).
  • NP_853510 mouse ERas (RefSeqERAccession No. NP_853526) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and human ERas (RefSeq Accession No consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16).
  • NP_853510 mouse ERas
  • human ERas RefSeq Accession No consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16
  • NP_853510 or its orthologs in other mammals, as well as their natural allelic variants, polymorphic variants, and splicing variants.
  • heterologous ERas can also be used.
  • the amino acid identity between human HRas and human KRas in this region is about 95%, and the amino acid identity between human HRas and human NRas is about 92%.
  • five domains (G1 to G5) involved in binding to guanine nucleotides and effector domains involved in binding to target factors are particularly well conserved.
  • the 4 amino acid residues at the C-terminal are called Caax motif (C: cysteine, a: aliphatic amino acid, x: any amino acid; SEQ ID NO: 17) It undergoes post-translational modification and a farnesyl group is added to the cysteine residue, followed by cleavage of the terminal 3 amino acids and methyl esterification of the newly exposed C-terminal cysteine. Ras protein binds strongly to the inner surface of the cell membrane by such lipid modification.
  • Caax motif C: cysteine, a: aliphatic amino acid, x: any amino acid; SEQ ID NO: 17
  • Ras proteins such as HRas, KRas, and NRas
  • Ras proteins usually exist as inactivated forms bound to GDP, and are converted to activated forms bound to GTP when receiving signals from upstream, but various cancers
  • Constantly activated Ras mutants have been isolated from cells, and numerous amino acid substitutions contributing to constitutive activation have been reported.
  • the level of activated Ras protein can be increased efficiently.
  • a mutant in which the 12th glycine of H-, K-, and N-Ras is replaced with valine is able to pass all three signaling pathways downstream of Ras (PI3 kinase pathway, Ral pathway, and MAP kinase pathway).
  • Human and mouse ERas share about 40% homology with HRas as a whole, but G1 to G5 essential for Ras function, effector domain, and Caax motif necessary for membrane localization are conserved.
  • G1 to G5 essential for Ras function, effector domain, and Caax motif necessary for membrane localization are conserved.
  • 59th alanine, and 63rd glutamic acid of H-, K-, and N-Ras if any one of them is substituted with another amino acid, it becomes a constitutively activated form.
  • three amino acids are different from other Ras, and it is known to constitutively activate the PI3 kinase pathway among the three signal transduction pathways downstream of Ras.
  • the constitutively activated Ras protein used in the present invention is capable of constitutively activating at least one of the three signal transduction pathways downstream of Ras (PI3 kinase pathway, Ral pathway, and MAP kinase pathway).
  • PI3 kinase pathway PI3 kinase pathway
  • Ral pathway PI3 kinase pathway
  • MAP kinase pathway PI3 kinase pathway
  • Ras proteins that constitutively activate the PI3 kinase pathway and / or Ral pathway include ERas, H-, K- or N-Ras 12th glycine substituted with valine, and 37th glutamic acid Is a mutated glycine, or a double mutant in which the 40th tyrosine is replaced with a cysteine, but is not limited thereto.
  • the Ras protein used in the present invention is preferably constitutively inactive in both the PI3 kinase pathway and the Ral pathway unless any of the three signal transduction pathways downstream of Ras is constitutively inactivated.
  • 1 to 2 or more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to a number (5, 4, 3, 2) in the amino acid sequence of any of the above Ras proteins, It may be a protein comprising an amino acid sequence in which a single amino acid is substituted, deleted, inserted or added.
  • Ras target factor (effector) examples include PI3 kinase, RalGEF and Raf.
  • the PI3 kinase in the present invention is a class IA PI3 kinase that is a target factor of Ras, and includes a p110 catalytic subunit (having three isoforms of ⁇ , ⁇ , and ⁇ ) and a regulatory subunit (p85 ⁇ , p85 ⁇ , p55 ⁇ , and the like) There are splicing variants).
  • Preferred examples of the p110 protein include, for example, mouse p110 ⁇ (RefSeq Accession No. NP_032865) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, human p110 ⁇ (RefSeq Accession No consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21) NP_006209), mouse p110 ⁇ (RefSeq Accession No. NP_083370), human p110 ⁇ (RefSeq Accession No. NP_006210), mouse p110 ⁇ (RefSeq Accession No. NP_0010250058), human p110 ⁇ (RefSeq Accession No.
  • NP_005017 NP_005017
  • NP_005017 NP_005017
  • p110 p110
  • a heterologous p110 can also be used.
  • RalGEF protein examples include mouse RalGDS (RefSeqGAccessionRefNo. NP_033084) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and human RalGDS (RefSeq Accession No consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25).
  • NP_006266 mouse Rgl (RefSeq Accession No. NP_058542), human Rgl (RefSeq Accession No. NP_055964), mouse Rlf / Rgl2 (RefSeq Accession No. NP_033085), human Rlf / Rgl2 (RefSeq Accession No. NP_033085), human Rlf / Rgl2 (RefSeq Accession No.
  • NP_0047 Orthologs thereof in mammals, natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants, natural and artificial activated variants, and the like. Depending on the animal species of the somatic cell to be introduced, it is desirable to use the same type of RalGEF, but it is also possible to use a heterologous RalGEF.
  • Raf protein examples include, for example, mouse c-Raf consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (RefSeq Accession No. ⁇ NP_084056), human c-Raf consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 (RefSeq Accession No. NP_002871), mouse A-Raf (RefSeq Accession No. NP_033833), human A-Raf (RefSeq Accession No. NP_001645), mouse B-Raf (RefSeq Accession No. NP_647455), human B-Raf (RefSeq Accession No.
  • NP — 004324 or orthologs thereof in other mammals, as well as their natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants, natural and artificial activated variants, and the like.
  • heterologous Raf can also be used.
  • Ras target factors such as PI3 kinase, RalGEF, and Raf are activated by localizing on the inner surface of the cell membrane through binding to activated Ras, and activate downstream signal transduction pathways. Therefore, by introducing a constitutively activated mutant of these target factors into somatic cells, the level of the activated Ras target factor can be increased efficiently.
  • Ras target factor is activated by localizing to the membrane, so that by adding a membrane localization signal sequence to the N-terminus or C-terminus of the target factor, constitutive activation of the target factor Type mutants can be made.
  • a myristoylated signal sequence for example, myristoylated signal sequence ⁇ (MGSSKSKPKDPSQRRRRIRT; SEQ ID NO: 30) derived from c-Src
  • MGSSKSKPKDPSQRRRRIRT SEQ ID NO: 30
  • a Caax motif to the C-terminus (eg, PI3K-CaaX of Example 3, RalGDS-Caax, Raf-CaaX, etc. of Example 4) can do.
  • constitutively activated mutants include, for example, a PI3 kinase mutant in which the histidine at position 1047 of p110 ⁇ is replaced with arginine, a mutant PI3 kinase in which the 545th glutamic acid of p110 ⁇ is replaced with lysine, and 227 of p110 ⁇ .
  • PI3 kinase mutant in which the second lysine was replaced with glutamic acid
  • PI3 kinase mutant lacking 108 amino acids (regulatory subunit binding domain) on the N-terminal side of p110, 305 amino acids on the N-terminal side of c-Raf (Ras Raf mutant lacking (including binding domain)
  • Raf mutant with B-Raf 600th valine substituted with glutamic acid Raf mutant with c-Raf 340th tyrosine substituted with aspartic acid, etc.
  • it is not limited to these.
  • the constitutively activated Ras target factor used in the present invention is preferably a constitutively activated mutant of PI3 kinase (p110) or RalGEF, specifically, Myr-PI3K used in Examples described later, PI3K-CaaX, RalGDS-CaaX, etc. are mentioned.
  • the constitutively activated PI3 kinase used in the present invention constitutively activates the signal transduction pathway of the AKT pathway.
  • the Ras target factor used in the present invention is preferably one or two or more in the amino acid sequence of any of the above Ras target factors, unless the signal transduction pathway downstream of the target factor is constitutively inactivated.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to several (5, 4, 3, 2) amino acids are substituted, deleted, inserted or added. May be.
  • an amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more identity with the amino acid sequence of any of the above Ras proteins It may be a protein containing
  • Ras target factor (effector) downstream signal factor used in the present invention includes AKT family members Rheb and S6K.
  • Examples of the “activator of downstream signal of Ras target factor (effector)” include TCL1.
  • the “AKT family member” is a protein identified as a homologous gene of v-Akt, which is a viral oncogene, and capable of transmitting a signal to activation of mTOR downstream thereof.
  • AKT family members include, but are not limited to, AKT1, AKT2, AKT3, and the like.
  • Preferred examples of the AKT protein include mouse Akt1 (RefSeq Accession No. NP_001159366) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35, human AKT1 (RefSeq Accession No. NP_001014432) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, for example.
  • Rheb protein examples include mouse Rheb (RefSeqSAccession No. NP_444305) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, human RHEB consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 (RefSeq Accession No. NP_005605) Or their orthologs in other mammals, their natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants, natural and artificial activated variants, and the like. Depending on the animal species of the somatic cell to be introduced, it is desirable to use the same type of Rheb, but it is also possible to use a heterologous Rheb.
  • TCL1 protein examples include mouse Tcl1 (RefSeq Accession No. NP_033363) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, human TCL1A consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 (RefSeq Accession No. NP_001092195) Or their orthologs in other mammals, as well as their natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants (eg, RefSeq Accession No. NP_068801), natural and artificial activated variants, etc. It is done. Although it is desirable to use the same kind of TCL1 depending on the animal species of the somatic cell to be introduced, heterologous TCL1 can also be used.
  • S6K protein examples include, for example, S6K (RefSeq Accession No. NP_001107806) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, human S6K1 (RefSeq Accession No. NP_003152) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49, Or their orthologs in other mammals, their natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants (eg RefSeq Accession No. NP_082535), natural and artificial activated mutants, etc. .
  • S6K RefSeq Accession No. NP_001107806
  • human S6K1 RefSeq Accession No. NP_003152
  • SEQ ID NO: 49 Or their orthologs in other mammals, their natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants (eg RefSeq Accession No. NP_082535), natural and artificial activated mutants, etc.
  • AKT family members are activated by localizing on the inner surface of the cell membrane through binding to activated Ras, PI3 kinase, etc., and activate downstream signal transduction pathways. Therefore, if a constitutively activated mutant of an AKT family member is introduced into a somatic cell, the level of a downstream signal factor can be efficiently increased. For example, since AKT family members are activated by localizing to the membrane, constitutive activation of the target factor can be achieved by adding a membrane localization signal sequence to the N-terminus or C-terminus of the target factor. Type mutants can be made.
  • myristoylated signal sequence for example, myristoylated signal sequence ⁇ (MGSSKSKPKDPSQRRRRIRT; SEQ ID NO: 30) derived from c-Src
  • myristoylated signal sequence ⁇ MMSSKSKPKDPSQRRRRIRT; SEQ ID NO: 30
  • Myr-AKT1 Myr-AKT1 in Example 8
  • Other constitutively activated mutants include, for example, the PI3 kinase mutant in which the 40th glutamic acid of AKT1 is replaced with lysine (E40K-AKT1), and the PI3 kinase mutant in which the 17th glutamic acid of AKT1 is replaced with lysine Body (E17K-AKT1) and the like, but is not limited thereto.
  • S6K protein is usually converted into an activated form by phosphorylation of 389th threonine, but it is reported that 389th is converted to glutamic acid and is constantly activated. . If such a constitutively activated mutant of S6K protein is introduced into a somatic cell, the activated S6K protein level can be efficiently increased.
  • downstream signal factor of Ras target factor (effector) used in the present invention and the activator of this signal may be any one of the above Ras unless the downstream signal transduction pathway is constitutively inactivated.
  • amino acid sequences of the downstream signal factor of the target factor (effector) and the activator of this signal one or more, preferably 1-20, more preferably 1-10, and even more preferably 1-number (5, It may be a protein comprising an amino acid sequence in which 4, 3, 2) amino acids are substituted, deleted, inserted or added.
  • the downstream signal factor of the constitutively activated Ras target factor (effector) used in the present invention and the activator of this signal are preferably AKT family members or constitutively activated variants of S6K, Examples include Myr-AKT1, Myr-AKT2, Myr-AKT3, S6K1 T389E and the like used in Examples described later.
  • Ras activator When receptor tyrosine kinase is activated by stimulation of extracellular signals such as growth factors, it undergoes autophosphorylation and recognizes this via adapter proteins such as Grb2 and Shc. Sos, RasGRF, RasGRF2, RasGRP, SmgGDS, Vav, C3G and the like are recruited to the cell membrane, thereby activating Ras protein localized in the cell membrane. Therefore, introduction of RasGEF or adapter protein into somatic cells can also improve iPS cell establishment efficiency through activation of Ras protein.
  • Sos protein examples include mouse Sos1 (RefSeq Accession No. NP_033257), human Sos1 (RefSeq Accession No. NP_005624), mouse Sos2 (RefSeq Accession No. XP_127051), human Sos2 (RefSeq Accession No. NP_008870), or others. Orthologs thereof in mammals, natural allelic variants, polymorphic variants, splicing variants, natural and artificial activated variants, and the like. Although it is desirable to use the same type of Sos depending on the animal species of the somatic cell to be introduced, heterogeneous Sos can also be used. Examples of artificial activated mutants include membrane-localized mutants in which a Caax motif is added to the C-terminus or a myristoylation signal is added to the N-terminus.
  • RasGEF proteins such as RasGRF, RasGRF2, RasGRP, SmgGDS, Vav and C3G are known, and their polymorphic variants and splicing variants are also known.
  • activated mutants of these proteins include membrane-localized mutants in which a Caax motif is added to the C-terminus or a myristoylation signal is added to the N-terminus.
  • Grb2 protein examples include mouse Grb2 (RefSeq Accession No. NP_032189), human Grb2 (RefSeq Accession No. NP_002077), their orthologs in other mammals, and their natural allelic variants and polymorphisms. Variants, splicing variants, natural and artificial activated mutants, and the like. Although it is desirable to use the same kind of Grb2 depending on the animal species of the somatic cell to be introduced, heterologous Grb2 can also be used. Examples of artificial activated mutants include membrane-localized mutants in which a Caax motif is added to the C-terminus or a myristoylation signal is added to the N-terminus.
  • the protein of (b1) to (b4) (sometimes referred to as “the proteinaceous establishment efficiency improving factor of the present invention”) is, for example, a human or other mammalian rabbit (eg, mouse, rat, monkey, pig, dog, etc.) Cells / tissues [eg, thymus, bone marrow, spleen, brain, spinal cord, heart, skeletal muscle, kidney, lung, liver, pancreas or prostate cells / tissue, precursor cells of these cells, stem cells or cancer cells, etc.] Although it can be isolated using a known protein separation and purification technique, preferably, cDNA is cloned from the cells / tissues according to a conventional method and expressed in an appropriate host cell to prepare a recombinant protein.
  • the above-mentioned various activated mutants can be prepared by introducing a point mutation or adding a membrane localization signal sequence to the terminal by a gene recombination technique known per se.
  • Introduction of the proteinaceous establishment efficiency improving factor of the present invention into a somatic cell can be carried out using a method for introducing protein into a cell known per se.
  • a method for introducing protein into a cell known per se examples include a method using a protein introduction reagent, a method using a protein introduction domain (PTD) or a cell-penetrating peptide (CPP) fusion protein, and a microinjection method.
  • a method using a protein introduction reagent a method using a protein introduction domain (PTD) or a cell-penetrating peptide (CPP) fusion protein, and a microinjection method.
  • PTD protein introduction domain
  • CPP cell-penetrating peptide
  • Protein introduction reagents include cationic lipid-based BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systmes), Pro-Ject TM Protein Transfection Reagent (PIERCE) and ProVectin (IMGENEX), and lipid-based Profect-1 (Targeting Systems) ), Penetrain Peptide (Q biogene) and Chariot Kit (Active Motif) based on membrane-permeable peptides, GenomONE (Ishihara Sangyo) using HVJ envelope (inactivated Sendai virus), and the like are commercially available.
  • the introduction can be carried out according to the protocol attached to these reagents, but the general procedure is as follows.
  • the proteinaceous establishment efficiency improving factor of the present invention is diluted in an appropriate solvent (for example, a buffer solution such as PBS or HEPES), added with an introduction reagent, and incubated at room temperature for about 5 to 15 minutes to form a complex. Is added to cells exchanged in serum-free medium and incubated at 37 ° C. for 1 to several hours. Thereafter, the medium is removed and replaced with a serum-containing medium.
  • an appropriate solvent for example, a buffer solution such as PBS or HEPES
  • CPP derived from PTD include polyarginine such as 11R (Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)) and 9R (Cell Stem Cell, 4: 472-476 (2009)).
  • the fusion protein expression vector incorporating the cDNA encoding the proteinaceous establishment efficiency improving factor of the present invention and the PTD sequence or CPP sequence is prepared and recombinantly expressed, and the fusion protein is recovered and used for introduction. Introduction can be performed in the same manner as described above except that no protein introduction reagent is added.
  • Microinjection is a method in which a protein solution is put into a glass needle having a tip diameter of about 1 ⁇ m and puncture is introduced into a cell, and the protein can be reliably introduced into the cell.
  • electroporation method in addition, electroporation method, semi-intact cell method (Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365 (2006)), introduction method using Wr-t peptide (Kondo, E. et al. Protein introduction methods such as Mol. Cancer Ther. 3 (12), 1623-1630 (2004)) can also be used.
  • the protein introduction operation can be performed any number of one or more times (for example, 1 to 10 times or 1 to 5 times), and preferably the introduction operation is performed 2 or more times (for example, 3 or 4 times). ) Can be done repeatedly. Examples of the interval when the introduction operation is repeated include 6 to 48 hours, preferably 12 to 24 hours.
  • Proteinaceous establishment efficiency improving factor of the present invention (Ras family member, Ras target factor (effector), downstream signal factor of Ras target factor (effector)),
  • the nucleic acid encoding the signal activator and Ras activator) (also referred to as “the nucleic acid establishment efficiency improving factor of the present invention”) is a Ras family member (eg, HRas, KRas, NRas, ERas, etc.), Ras target factors (effectors) (eg, PI3 kinase, RalGEF, Raf, etc.), Ras target factors (effectors) downstream signaling factors (eg, AKT1, AKT2, AKT3, Rheb, S6K, etc.) Encodes an activator of Ras target factor (effector) downstream signal (eg, TCL1) or Ras activator (eg, RasGEF, receptor tyrosine kinase adapter protein, etc.) Not particularly limited as long as
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera. Preferably, DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a DNA: RNA hybrid.
  • the nucleic acid establishment efficiency improving factor of the present invention is, for example, a human or other mammalian sputum (eg, mouse, rat, monkey, pig, dog, etc.) sputum cell / tissue [eg, thymus, bone marrow, spleen, brain, spinal cord, It can be cloned from cDNA derived from heart, skeletal muscle, kidney, lung, liver, pancreas or prostate cells / tissue, precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.] according to a conventional method.
  • mammalian sputum eg, mouse, rat, monkey, pig, dog, etc.
  • sputum cell / tissue eg, thymus, bone marrow, spleen, brain, spinal cord, It can be cloned from cDNA derived from heart, skeletal muscle, kidney, lung, liver, pancreas or prostate cells / tissue, precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells,
  • the nucleic acid encoding HRas includes, for example, a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, or a stringent condition with a complementary strand sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3. And a nucleic acid encoding a protein that can activate at least one of the three signal transduction pathways downstream of Ras, preferably the PI3 kinase pathway and / or the Ral pathway.
  • the nucleic acid encoding KRas includes, for example, a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7, or a stringent condition with a complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7 And a nucleic acid encoding a protein that can activate at least one of the three signal transduction pathways downstream of Ras, preferably the PI3 kinase pathway and / or the Ral pathway.
  • the nucleic acid encoding NRas includes, for example, a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 11, or a stringent condition with a complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 11. And a nucleic acid encoding a protein that can activate at least one of the three signal transduction pathways downstream of Ras, preferably the PI3 kinase pathway and / or the Ral pathway.
  • the nucleic acid encoding ERas includes, for example, a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15, or a stringent condition with a complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 And a nucleic acid encoding a protein that can activate at least one of the three signal transduction pathways downstream of Ras, preferably the PI3 kinase pathway and / or the Ral pathway.
  • nucleic acid encoding the catalytic subunit (p110) of PI3 kinase for example, a nucleic acid encoding p110 ⁇ containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or 20, or represented by SEQ ID NO: 18 or 20 Examples thereof include a nucleic acid that encodes a protein that contains a base sequence that can hybridize with a complementary strand sequence of the base sequence under stringent conditions and that can activate the PI3 kinase pathway.
  • a nucleic acid containing a cDNA sequence of mouse p110 ⁇ (RefSeq Accession No. NM_029094), human p110 ⁇ (RefSeq Accession No.
  • NM_006219 mouse p110 ⁇ (RefSeq Accession No. NM_001029837), human p110 ⁇ (RefSeq Accession No. NM_005026), or Examples thereof include a nucleic acid that contains a base sequence that can hybridize under stringent conditions with a complementary strand sequence of the cDNA sequence and encodes a protein that can activate the PI3 kinase pathway.
  • nucleic acid encoding RalGEF examples include a nucleic acid encoding RalGDS containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 or 24, or a complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 or 24 and a string.
  • examples include a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can hybridize under a gentle condition and that can activate the Ral pathway.
  • cDNA sequences of mouse Rgl RefSeqSAccession No. NM_016846
  • human Rgl RefSeq Accession No. NM_015149
  • mouse Rlf / Rgl2 RefSeq Accession No.
  • NM_009059 human Rlf / Rgl2 (RefSeq Accession No. NM_004761)
  • a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can hybridize under stringent conditions with a complementary strand sequence of the cDNA sequence and that can activate the Ral pathway.
  • nucleic acid encoding Raf examples include a nucleic acid encoding c-Raf containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 or 28, or a complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 or 28 And a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can hybridize under stringent conditions and can activate the MAP kinase pathway.
  • mouse A-Raf (RefSeq Accession No. NM_009703), human A-Raf (RefSeq Accession No. NM_001654), mouse B-Raf (RefSeq Accession No.
  • NM_139294 human B-Raf (RefSeq Accession No. NM_004333) Examples include a nucleic acid containing a cDNA sequence, or a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can hybridize with a complementary strand sequence of the cDNA sequence under stringent conditions and can activate the MAP kinase pathway.
  • nucleic acids encoding Sos include mouse Sos1 (RefSeq Accession No. NM_009231), human Sos1 (RefSeq Accession No. NM_005633), mouse Sos2 (RefSeq Accession No. XM_127051), human Sos2 (RefSeq Accession No. NM_006939)
  • Examples thereof include a nucleic acid containing a cDNA sequence, or a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can hybridize with a complementary strand sequence of the cDNA sequence under stringent conditions and can activate a Ras protein.
  • RasGEF cDNA sequences such as RasGRF, RasGRF2, RasGRP, SmgGDS, Vav, C3G are known, and their polymorphic variants and splicing variants are also known.
  • nucleic acid encoding Grb2 examples include a nucleic acid containing the cDNA sequence of mouse Grb2 (RefSeq Accession No. NM_008163), human Grb2 (RefSeq Accession No. ⁇ NM_002086), or a stringent condition with a complementary strand sequence of the cDNA sequence.
  • examples thereof include a nucleic acid that contains a base sequence that can hybridize underneath, encodes a protein that recognizes and binds to a receptor tyrosine kinase, and that can recruit RasGEF to the cell membrane to activate the Ras protein.
  • nucleic acid encoding AKT1 as an example of the AKT family member include a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 or 36, or a complementary strand sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 or 36 And a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can hybridize under stringent conditions and that can activate the AKT pathway.
  • the nucleic acid encoding Rheb is, for example, a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 40, or a stringent condition with a complementary strand sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 40 And a nucleic acid that encodes a protein that contains a base sequence that can be hybridized with and that can activate a downstream mTOR pathway.
  • the nucleic acid encoding TCL1 includes, for example, a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 42 or 44, or a stringent condition with a complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 42 or 44 And a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can be hybridized with AKT1 and that can activate the AKT1 protein.
  • the nucleic acid encoding S6K includes, for example, a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 or 48, or a stringent condition with a complementary strand sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 or 48 And a nucleic acid encoding a protein that contains a base sequence that can be hybridized with and that can activate the S6K protein.
  • nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions with a complementary strand sequence of the base sequence represented by each SEQ ID NO: about 80% or more, preferably about 90% or more, with the base sequence represented by each SEQ ID NO: More preferably, a nucleic acid containing a base sequence having about 95% or more identity is used.
  • stringent conditions include, for example, the conditions described in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999, for example, 6 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate) / 45 ° C. Hybridization, followed by one or more washes at 0.2 ⁇ SSC / 0.1% SDS / 50 to 65 ° C., those skilled in the art will know the conditions for hybridization that will give the same stringency. It can be selected appropriately.
  • the protein establishment efficiency improving factor of the present invention is preferably a constant activation molecule of Ras protein, a constant activation molecule of Ras target factor (effector), or a constant signal factor downstream of Ras target factor An activated molecule, an activation molecule of downstream signal of Ras target factor, and a constant activation molecule of Ras activator. Therefore, the nucleic acid establishment efficiency improving factor of the present invention is preferably a nucleic acid encoding the above-mentioned constitutively activated molecule.
  • the nucleic acid can be obtained by introducing a desired amino acid substitution into the nucleic acid encoding the wild-type molecule obtained as described above by site-directed mutagenesis, or an oligonucleotide encoding a membrane localization signal sequence. It can be prepared by adding to the end using ligase or PCR.
  • the introduction of the nucleic acid establishment efficiency improving factor of the present invention into a somatic cell can be carried out by using a gene transfer method into a cell known per se.
  • Ras protein, Ras target factor, downstream signal factor of Ras target factor, activator of the signal or nucleic acid encoding Ras activator should be put into an appropriate expression vector containing a promoter that can function in the host somatic cell Inserted.
  • expression vectors include retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai virus and other viral vectors, animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV). , PcDNAI / Neo) or the like.
  • the type of vector to be used can be appropriately selected according to the intended use of the iPS cells obtained.
  • adenovirus vectors plasmid vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors and the like can be used.
  • Examples of the promoter used in the expression vector include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Molone murine leukemia virus) LTR. HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used. Of these, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, an SV40 replication origin, and the like as desired.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, and the like.
  • Ras protein, Ras target factor, downstream signal factor of Ras target factor, activator of the signal or nucleic acid encoding Ras activator may be incorporated into the expression vector alone or one or more reprogramming genes And may be incorporated into one expression vector. In some cases, it is preferable to select the former when using a retrovirus or lentiviral vector with high gene transfer efficiency, and when using a plasmid, adenovirus, episomal vector, or the like, but there is no particular limitation.
  • Ras protein, Ras target factor, downstream signal factor of Ras target factor, nucleic acid encoding the signal activator or Ras activator and one or more reprogramming genes in one expression vector When incorporated, these multiple genes can be incorporated into the expression vector, preferably via sequences that allow polycistronic expression.
  • sequences enabling polycistronic expression include 2A sequences of foot-and-mouth disease virus (PLoS ONE3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES sequences (US Patent No. 4,937,190), preferably 2A An array can be used.
  • An expression vector containing a Ras protein, a Ras target factor, a downstream signal factor of the Ras target factor, an activator of the signal or a nucleic acid encoding the Ras activator can be obtained by a method known per se depending on the type of the vector. Can be introduced.
  • a virus produced in the culture supernatant by introducing a plasmid containing the nucleic acid into an appropriate packaging cell (eg, Plat-E cell) or a complementary cell line (eg, 293 cell) The vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • WO2007 / 69666 Cell, 126, 663-676 (2006) and Cell, 131, 861-872 (2007).
  • the case of use is disclosed in Science, 318, 1917-1920 (2007) 2007.
  • Ras protein, Ras target factor, downstream signal factor of Ras target factor, expression of the signal activator or Ras activator (reactivation) or Activation of endogenous genes present in the vicinity where these exogenous nucleic acids are incorporated may increase the risk of carcinogenesis in tissues regenerated from differentiated cells derived from iPS cells, so Ras protein, Ras target factor or The nucleic acid encoding the Ras activator is preferably not transiently expressed in the cell chromosome. From this point of view, it is preferable to use an adenovirus vector that rarely integrates into the chromosome. Specific means using an adenoviral vector is described in Science, 322, 945-949 (2008).
  • adeno-associated virus also has a low frequency of integration into chromosomes, and has lower cytotoxicity and inflammation-inducing action than adenovirus vectors, and thus can be mentioned as another preferred vector.
  • the Sendai virus vector can exist stably outside the chromosome, and can be preferably used in the same manner because it can be decomposed and removed by siRNA as necessary.
  • the Sendai virus vector those described in J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) and Japanese Patent No. 3602058 can be used.
  • a method of excising nucleic acid encoding Ras protein, Ras target factor or Ras activator at the time point can be preferably used. That is, loxP sequences are arranged at both ends of the nucleic acid, and after iPS cells are induced, Cre recombinase is allowed to act on the cells using a plasmid vector or an adenovirus vector to cut out the region sandwiched between the loxP sequences. be able to.
  • the enhancer-promoter sequence in the LTR ⁇ U3 region may up-regulate nearby host genes by insertion mutation, so the 3′-self is deleted or replaced with a polyadenylation sequence such as SV40.
  • an inactivated (SIN) LTR is used to avoid expression control of the endogenous gene by an LTR outside the loxP sequence that is not excised and remains in the genome. Specific means using Cre-loxP system and SIN LTR are disclosed in Soldner et al., Cell, 136: 964-977 (2009), Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009), etc. ing.
  • plasmid vector which is a non-viral vector
  • the vector is transferred to cells using lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method, etc.
  • lipofection method liposome method
  • electroporation method calcium phosphate coprecipitation method
  • DEAE dextran method microinjection method
  • gene gun method etc.
  • Specific means using a plasmid as a vector are described in, for example, Science, 322, 949-953 (2008).
  • gene introduction can be carried out any number of one or more times (for example, 1 to 10 times or 1 to 5 times).
  • time for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times, etc.
  • the number of times can be performed, and preferably the introduction operation can be repeated 2 times or more (for example, 3 times or 4 times).
  • Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from a lepidopteran insect. Specific means using the piggyBac transposon are disclosed in Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009), Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009).
  • Another preferred non-integrated vector is an episomal vector capable of autonomous replication outside the chromosome. Specific means using an episomal vector is disclosed in Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009). If necessary, encode Ras protein, Ras target factor or Ras activator on episomal vector with loxP sequences placed in the same direction on the 5 'and 3' sides of vector elements necessary for episomal vector replication An expression vector into which the nucleic acid to be inserted is inserted can be constructed and introduced into somatic cells.
  • the episomal vector examples include a vector containing a sequence necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40 or the like as a vector element.
  • vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication.
  • EBV the replication origin oriP And EBNA-1 gene
  • SV40 includes the origin of replication ori and SV40 large T antigen gene.
  • the episomal expression vector also includes a Ras protein, a Ras target factor, a downstream signal factor of the Ras target factor, a promoter that controls the transcription of a nucleic acid encoding the signal or a Ras activator.
  • a promoter the same promoter as described above can be used.
  • the episomal expression vector may further contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, and the like as desired, as described above. Examples of the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene and a neomycin resistance gene.
  • the loxP sequence used in the present invention includes a wild-type loxP sequence derived from bacteriophage P1 (SEQ ID NO: 31), and when placed in the same direction at a position sandwiching a vector element required for transgene replication. Any mutated loxP sequence that can undergo recombination to delete sequences between loxP sequences. Examples of mutant loxP sequences include lox71 (SEQ ID NO: 32) having a mutation in the 5 ′ repeat sequence, lox66 (SEQ ID NO: 33) having a mutation in the 3 ′ repeat sequence, lox2272 having a mutation in the spacer portion, and the like. For example, lox511.
  • the two loxP sequences arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element may be the same or different, but in the case of a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer portion (for example, , Lox2272 and lox511) are used.
  • a mutant loxP sequence eg, lox71
  • a mutant loxP sequence eg, lox66
  • the loxP sequence remaining on the chromosome as a result of recombination has double mutations in the 5 'and 3' repeats, making it difficult to recognize by Cre recombinase, and chromosomal deletion mutations due to unnecessary recombination. The risk of causing this is reduced.
  • any of the mutant loxP sequences may be arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element, but the mutation site is mutated so that the mutation site is located at the outer end of the loxP sequence. It is necessary to insert the loxP sequence.
  • the two loxP sequences are located 5 'and 3' to the vector element required for transgene replication (ie, the origin of replication or a gene sequence that binds to the origin of replication and encodes a protein that controls replication). Arranged in the same direction.
  • the vector element sandwiched by the loxP sequence may be either one of the replication origin, the gene sequence encoding the protein that binds to the replication origin and controls replication, or both.
  • Episomal vectors can be introduced into cells using, for example, lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method and the like. Specifically, for example, the method described in Science, 324: 797-801 (2009) can be used.
  • nuclear reprogramming substance refers to an iPS cell derived from a somatic cell by introducing it into a somatic cell or by bringing it into contact with a somatic cell together with the establishment efficiency improving factor of the present invention.
  • a substance (group) capable of inducing the protein it may be composed of any substance such as a protein factor or a nucleic acid encoding the same (including a form incorporated in a vector) or a low molecular weight compound.
  • the nuclear reprogramming substance is a protein factor or a nucleic acid encoding the same
  • the following combinations are preferably exemplified (in the following, only the name of the protein factor is described).
  • (1) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc (2) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2 (where Sox2 can be replaced with Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 or Sox18.
  • Klf4 can be replaced with Klf1, Klf2 or Klf5.
  • c-Myc can be replaced with T58A (active mutant) or L-Myc.) (3) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, ERas, TclI (4) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen (SV40LT) (5) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6 (6) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7 (7) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7 (8) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil (See WO 2007/069666 for the above (however, in the combination of (2) above, for the substitution of Sox2 to Sox18 and the substitution of Klf4 to K
  • Oct family members such as Oct1A and Oct6 can be used instead of Oct3 / 4.
  • Sox family members such as Sox7 can be used instead of Sox2 (or Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18).
  • L-Myc or Lin28B can be used instead of c-Myc or Lin28, respectively.
  • combinations not including the above (1) to (24) but including all of the constituent elements in any of them and further including any other substances are also included in the category of “nuclear reprogramming substances” in the present invention.
  • somatic cells subject to nuclear reprogramming are partially expressing the components in any of the above (1)-(24) under conditions that are endogenously expressed at a sufficient level for nuclear reprogramming.
  • a combination of only the remaining components excluding the component can also be included in the category of “nuclear reprogramming substance” in the present invention.
  • At least one selected from Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc or L-Myc, Nanog, Lin28 or Lin28B and SV40LT, preferably two or more, more preferably three or more are examples of preferred nuclear reprogramming materials.
  • a combination of reprogramming factors that do not use c-Myc is preferable when the obtained iPS cells are used for therapeutic purposes.
  • a combination including a combination and not including c-Myc can be exemplified.
  • Mouse and human cDNA sequence information for each of the protein factors described above can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO62007 / 069666 (Nanog is described as “ECAT4” in the publication)
  • mouse and human cDNA sequence information of Lin28, Lin28B, Esrrb, Esrrg, and L-Myc can be obtained by referring to the following NCBI accession numbers, respectively, and those skilled in the art can easily obtain these cDNAs. It can be isolated.
  • the obtained cDNA is inserted into an appropriate expression vector, introduced into a host cell, and cultured from the resulting culture. Can be prepared by recovering.
  • a nucleic acid encoding a protein factor is used as a nuclear reprogramming substance
  • the obtained cDNA is treated with a virus vector, episomal vector or plasmid in the same manner as the nucleic acid establishment efficiency improving factor of the present invention.
  • An expression vector is constructed by inserting it into a vector, and is subjected to a nuclear reprogramming step. If necessary, the above Cre-loxP system or piggyBac transposon system can also be used.
  • each nucleic acid may be carried on a separate vector, or a plurality of nucleic acids connected in tandem to a polycistronic vector It can also be. In the latter case, in order to enable efficient polycistronic expression, it is desirable to link the 2A self-cleaving peptide of foot-and-mouth disease virus between each nucleic acid (see Science, 322, 949-953, 2008, etc.) .
  • the nuclear reprogramming substance When the nuclear reprogramming substance is contacted with a somatic cell, (a) when the substance is a proteinous factor, (b) the substance is (a) in the same manner as the protein establishment efficiency improving factor of the present invention.
  • the substance In the case of a nucleic acid encoding a protein factor, it can be carried out in the same manner as the nucleic acid establishment efficiency improving factor of the present invention.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • TSA trichostatin A
  • SSA sodium butyrate
  • MC 1293, M344 nucleic acids
  • siRNA and shRNA against HDAC eg, HDAC1 siRNA Smartpool® (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)) Sexual expression inhibitors, etc.
  • DNA methyltransferase inhibitors for example, 5'-azacytidine5 (5'azaC)
  • G9a histone methyltransferase inhibitors For example, small molecule inhibitors such as BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), nucleic acids such as siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology), etc.) Expression inhibitors, etc.], L-channel calcium agonist (eg Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), p53 inhibitors (eg, siRNA against p53, shRNA, dominant negative, etc.
  • small molecule inhibitors such as BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)
  • nucleic acids such as siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology), etc.) Expression inhibitors, etc.
  • L-channel calcium agonist eg Bayk8644
  • p53 inhibitors eg, siRNA against p53, shRNA, dominant
  • the nucleic acid expression inhibitor may be in the form of an expression vector containing DNA encoding siRNA or shRNA.
  • SV40 large T is not an essential factor for somatic cell nuclear reprogramming, but is an auxiliary factor. It can also be included in a category.
  • auxiliary factors other than those essential for nuclear reprogramming are positioned as nuclear reprogramming substances or substances that improve the establishment efficiency of iPS cells. It may be convenient.
  • the nuclear reprogramming process of somatic cells is regarded as an overall event caused by the contact of somatic cells with the nuclear reprogramming substance and the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells. There will be no gender.
  • the contact of the substance that improves the efficiency of establishment of iPS cells with the somatic cell is determined depending on whether the substance is (a) a proteinaceous factor or (b) a nucleic acid encoding the proteinous factor.
  • Each efficiency improvement factor can be implemented by the same method as described above.
  • contact of the substance with somatic cells can be achieved by dissolving the factor in an aqueous or non-aqueous solvent at an appropriate concentration and isolating it from a human or other mammal.
  • Medium suitable for culturing cultured somatic cells eg, minimal essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium (about 5 to 20 if KSR is not used as an improvement factor) Etc.
  • MEM minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium 199 medium
  • F12 medium about 5 to 20 if KSR is not used as an improvement factor
  • Etc. eg, minimal essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium (about 5 to 20 if KSR is not used as an improvement factor) Etc.
  • the contact period is not particularly limited as long as it is sufficient to achieve somatic cell nuclear reprogramming.
  • the contact period can be allowed to coexist in the medium until a positive colony appears.
  • An iPS cell establishment efficiency improving substance containing the establishment efficiency improving factor of the present invention is a nuclear reprogramming substance as long as iPS cell establishment efficiency from somatic cells is significantly improved as compared to the absence of the substance. You may make it contact with a somatic cell simultaneously, and you may make either contact first.
  • the nuclear reprogramming substance is a nucleic acid encoding a proteinous factor
  • the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is a chemical inhibitor
  • the former removes the proteinous factor from the gene transfer treatment.
  • a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is added to the medium can do.
  • both a nuclear reprogramming substance and an iPS cell establishment efficiency improving substance are used in the form of a viral vector or a plasmid vector, both may be introduced into a cell simultaneously.
  • the “hypoxic condition” means that the oxygen concentration in the atmosphere when cells are cultured is significantly lower than that in the air. Specifically, the oxygen concentration condition is lower than the oxygen concentration in the atmosphere of 5-10% CO 2 / 95-90% air generally used in normal cell culture. For example, oxygen in the atmosphere Conditions with a concentration of 18% or less apply.
  • the oxygen concentration in the atmosphere is 15% or less (eg, 14% or less, 13% or less, 12% or less, 11% or less, etc.), 10% or less (eg, 9% or less, 8% or less, 7% or less) 6% or less), or 5% or less (eg, 4% or less, 3% or less, 2% or less, etc.).
  • the oxygen concentration in the atmosphere is preferably 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0.4% or more), 0.5% or more (eg, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.95 Or 1% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, etc.).
  • a method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing the cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is the easiest and is a preferable example.
  • CO 2 incubators with adjustable oxygen concentration are sold by various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture by manufacturers such as Thermo scientific, Ikemoto Rika Kogyo, Toji Field, and Waken Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 incubators can be used).
  • the time when cell culture is started under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the iPS cell establishment efficiency from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). Although it may be before contact with the establishment efficiency improving factor of the invention and the nuclear reprogramming substance, simultaneously with the contact, or after the contact, Low immediately after contact with remedial factor and nuclear reprogramming substance or after a period of time (eg 1 to 10 (eg 2,3,4,5,6,7,8 or 9) days) after contact It is preferable to culture under oxygen conditions.
  • the period for culturing cells under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). Examples include, but are not limited to, a period of 7 days or more, 10 days or more, 50 days or less, 40 days or less, 35 days or less, or 30 days or less.
  • a preferable culture period under low oxygen conditions varies depending on the oxygen concentration in the atmosphere, and those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the oxygen concentration used. In one embodiment, when selection of iPS cell candidate colonies is performed using drug resistance as an index, it is preferable to return from a low oxygen condition to a normal oxygen concentration before drug selection is started.
  • the preferred time and preferred culture period for starting cell culture under hypoxic conditions vary depending on the type of nuclear reprogramming substance used, iPS cell establishment efficiency under normoxic conditions, and the like.
  • the cells are suitable for culturing ES cells, for example. Can be cultured under different conditions. In the case of mouse cells, Leukemia Inhibitory Factor (LIF) is added to a normal medium as a differentiation inhibitory factor and cultured. On the other hand, in the case of human cells, it is usually desirable to add basic fibroblast growth factor (bFGF) and / or stem cell factor (SCF) instead of LIF.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • the cells are cultured as feeder cells in the presence of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) that have been treated with radiation or antibiotics to stop cell division.
  • MEFs mouse embryonic fibroblasts
  • STO cells are usually used as MEFs, but SNL cells (McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) are often used to induce iPS cells.
  • Co-culture with feeder cells may be started before the contact with the establishment efficiency improving factor of the present invention and the nuclear reprogramming substance, at the time of the contact, or after the contact (for example, after 1-10 days). You may start.
  • the selection of iPS cell candidate colonies includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method using visual morphological observation.
  • Examples of the former include a drug resistance gene and / or a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (for example, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • a recombinant cell targeted with a reporter gene is used to select colonies positive for drug resistance and / or reporter activity.
  • Such recombinant cells include, for example, mice (Takahashi & Yamanaka, Cell, 126,-663-676) in which the ⁇ geo (encoding a fusion protein of ⁇ -galactosidase and neomycin phosphotransferase) gene is knocked in at the Fbx15 locus. 2006)) derived from transgenic mice (Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) in which a green fluorescent protein (GFP) gene and a puromycin resistance gene are incorporated into the Nanog locus Such as MEF and TTF.
  • GFP green fluorescent protein
  • examples of a method for selecting candidate colonies by visual morphological observation include the methods described in Takahashi et al., Cell, 131, 861-872-8 (2007).
  • a method using a reporter cell is simple and efficient, when iPS cells are produced for the purpose of human therapeutic use, visual colony selection is desirable from the viewpoint of safety.
  • the resulting iPS cell is a new cell different from the conventionally known iPS cell in that it contains the exogenous nucleic acid.
  • the exogenous nucleic acid is introduced into a somatic cell using a retrovirus, a lentivirus or the like, the exogenous nucleic acid is usually incorporated into the genome of the resulting iPS cell, and therefore contains the exogenous nucleic acid. This trait is stably maintained.
  • iPS cells are induced using somatic cells collected from the patient or another person who has the same or substantially the same type of HLA
  • the desired cells ie, the organ in which the patient is affected
  • Stem cell therapy by autotransplantation is possible, in which cells and cells that exhibit therapeutic effects on diseases are differentiated and transplanted into the patient.
  • functional cells differentiated from iPS cells eg, hepatocytes
  • drug candidates It can also be suitably used for in vitro screening of the efficacy and toxicity of compounds.
  • Example 1 Examination of the effect of Ras family on human iPS cell establishment It was examined whether the Ras family (Nras, Hras, Kras and Eras) had an effect on the establishment of iPS cells.
  • lentivirus The mouse ecotropic virus receptor Slc7a1 gene was expressed using pLenti6 / UbC-Slc7a1.
  • the following genes were introduced into the cells (1 ⁇ 10 5 cells / well, 6 well plate) by retrovirus. The number of iPS cell colonies generated was compared with the case of introducing 4 genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc).
  • V12 refers to a constant active mutant of HRas in which the 12th glycine of HRas is replaced with valine. V12 is known to activate any of the three signal transduction pathways of Ras, the MAP kinase pathway, the PI3 kinase pathway, and the Ral pathway (RalGEF pathway).
  • SVLS is an inactive mutant that is unable to localize to the cell membrane by substituting SVLS for the C-terminal 4 amino acids CVLS of H-Ras
  • SSVA is the C of E-Ras. It is an inactive mutant whose localization to the cell membrane is disabled by replacing the terminal 4 amino acids CSVA with SSVA.
  • the cells were collected and re-sown onto feeder cells (2.5 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish).
  • SNL cells McMahon, AP & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)
  • the cells were cultured in a medium obtained by adding 4 ng / ml recombinant human bFGF (WAKO) to a primate ES cell culture medium (ReproCELL).
  • WAKO 4 ng / ml recombinant human bFGF
  • ReproCELL primate ES cell culture medium
  • V12E37G is a mutant in which the Ral pathway is selectively and permanently activated by substituting the 12th glycine of HRas with valine and the 37th glutamic acid with glycine.
  • the cells were collected and re-sown onto feeder cells (2.5 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish).
  • the cells were cultured in a medium obtained by adding 4 ng / ml recombinant human bFGF (WAKO) to a primate ES cell culture medium (ReproCELL).
  • WAKO recombinant human bFGF
  • ReproCELL primate ES cell culture medium
  • Example 3 Examination of effects on different cells Using skin-derived fibroblasts (cell name: TIG120) of a 6-year-old Japanese woman and skin-derived fibroblasts (cell name: 1616) of a 68-year-old Japanese woman The same experiment as in the above example was performed in the following combinations.
  • Myr-PI3K (M-PI3K) is a constitutively active PI3 kinase localized in the membrane by adding a myristoylated signal sequence to the N-terminus.
  • PI3K-CaaX (C-PI3K) is a constitutively active PI3 kinase catalytic subunit that is localized in the membrane by adding a Caax motif sequence to the C-terminus.
  • the cells were collected and re-wound onto feeder cells (0.5 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish).
  • the cells were cultured in a medium obtained by adding 4 ng / ml recombinant human bFGF (WAKO) to a primate ES cell culture medium (ReproCELL).
  • WAKO human bFGF
  • ReproCELL primate ES cell culture medium
  • the number of iPS cell colonies on day 24 after infection is shown in FIG. Figure 3 is the average of three experiments.
  • an increase in the number of human iPS cell colonies was observed by adding Eras, V12Y40C (Y40C) or V12E37G (E37G) to the 4 genes.
  • Example 4 Examination of the effect of Ras signaling pathway on human iPS cell establishment (2) With respect to the effect of activation of each signal transduction pathway of Ras on the establishment of iPS cells, the same experiment as in the above Example was examined in the following combinations.
  • Ras-CaaX is a constitutively activated form that has become membrane localized by adding a Caax motif sequence to the C-terminus of MAP kinase kinase kinase (MAPKKK) present in the MAP kinase pathway.
  • MAPKKK MAP kinase kinase kinase
  • RasGDS-Caax activates Ral, a G protein belonging to the Ras subfamily, and is permanently activated by adding a Caax motif sequence to the C-terminus of Ras target protein. Is the body.
  • the cells were collected and re-sown onto feeder cells (2.5 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish).
  • the cells were cultured in a medium obtained by adding 4 ng / ml recombinant human bFGF (WAKO) to a primate ES cell culture medium (ReproCELL).
  • WAKO human bFGF
  • ReproCELL primate ES cell culture medium
  • Example 5 Examination of the effect of Ras signaling pathway on human iPS cell establishment (3) With respect to the effect of activation of each signal transduction pathway of Ras on the establishment of iPS cells, the same experiment as in the above Example was examined in the following combinations.
  • FIG. Figure 5 shows the average of three experiments.
  • V12E37G, V12Y40C, RalGDS-CaaX or PI3K-CaaX was added to the 4 genes, a marked increase in the number of human iPS cell colonies was observed.
  • Example 7 Examination of effects in the absence of bFGF The effects of Raf-CaaX, RalGDS-CaaX and PI3K-CaaX in the absence of bFGF were examined. The experiment was performed in the same manner as in Examples 5 and 6. The results are shown in FIG. When RalGDS-CaaX was added to the 4 genes, the same number of colonies was observed even in the absence of bFGF as in the presence of bFGF.
  • Example 8 Examination of the effect of AKT on the establishment of human iPS cells Whether cKT as a downstream signal of PI3K has an effect on the establishment of iPS cells, and c-MYC or GSK3 ⁇ influences the establishment of iPS cells by AKT Whether or not to affect.
  • Myr-AKT1 is a constitutively active AKT1 localized in the membrane by adding a myristoylated signal sequence to the N-terminus.
  • c-MYC shRNA is a shRNA targeting c-MYC.
  • pRetrosuper Myc shRNA (Plasmid 15662) purchased from Addgene was used.
  • GSK3 ⁇ S9A is a constitutively active mutant that is not degraded by protease by substituting the 9th serine of GSK3 ⁇ with alanine.
  • FIG. 8A shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the 32nd day after infection.
  • the number of human iPS cell colonies was significantly increased by adding Myr-AKT1.
  • c-MYC shRNA since this effect was not obtained by adding c-MYC shRNA, it was shown that c-MYC is essential for the promotion of iPS cell establishment by activation of AKT1.
  • GSK3 ⁇ S9A was not affected, it was shown that phosphorylation of GSK3 ⁇ was not involved as a downstream signal of AKT1.
  • HDF human skin cell-derived fibroblasts
  • P110-KD is an inactivated PI3K that is a mutant lacking the kinase domain.
  • AKT1-KD is an inactivated AKT1 that is a mutant lacking the kinase domain.
  • PTEN ⁇ shRNA is shRNA against PTEN (phosphatase and tensin homolog) that suppresses the PI3K pathway
  • pMKO.1 puro PTEN shRNA (Plasmid 10669) purchased from Addgene was used.
  • FIG. 8B shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the seventh day after infection.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the following genes were introduced into skin cell-derived fibroblasts (HDF: cell name 1616) in the presence of each low molecular weight compound.
  • HDF skin cell-derived fibroblasts
  • PS48 is a drug that selectively binds to the PIF binding pocket site of PDK1 and activates PDK1.
  • 10 ⁇ M was added to the medium. Used from Sigma.
  • CHIR99021 is an inhibitor showing a high selectivity for GSK3 ⁇ .
  • 1 ⁇ M was purchased from Stemgent and added to the medium.
  • Wnt3a was purchased from R & D Systems, and 10 ng / ml was added to the medium.
  • FIG. 9 shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the 32nd day after infection.
  • the number of human iPS cell colonies was significantly increased by adding PS48 and Wnt3a. On the other hand, when CHIR99021 was added, the number of iPS cell colonies tended to decrease. From the above, it was shown that the PDK1 and Wnt signals downstream of the PI3K signal are involved in promoting the establishment of iPS cells, but the inhibition of GSK3 ⁇ phosphorylation is not involved in the establishment of iPS cells.
  • Example 10 Examination of effects of AKT family and mTOR signal on human iPS cell establishment The same genes as described above in Example 1 were introduced into skin cell-derived fibroblasts (HDF: cell name 1616).
  • PTEN ⁇ shRNA is shRNA against PTEN (phosphatase and tensin homolog) that suppresses the PI3K pathway
  • pMKO.1 puro PTEN shRNA (Plasmid 10669) purchased from Addgene was used.
  • Myr-AKT1 # 2 is a constitutively activated AKT1 with a different basic skeleton plasmid from Myr-AKT1.
  • AKT1 K179M is an inactive dominant negative AKT1 in which the kinase region is mutated.
  • Myr-AKT2 is a constitutively active AKT2 that is localized in the membrane by adding a myristoylated signal sequence to the N-terminus.
  • Myr-AKT3 is a constitutively active AKT3 that is localized in the membrane by adding a myristoylated signal sequence to the N-terminus.
  • Myr-SGK1 is an important regulatory factor in the mTORC2 / SGK1 pathway and the addition of a myristoylated signal sequence to the N-terminus of SGK1 (Serum / glucocorticoid regulated kinase), a protein kinase in the insulin signal transduction system. It is a constitutively active SGK1 localized in the membrane.
  • SGK1 K127M is a dominant negative type SGK1 in which the kinase region is mutated by replacing the 127th lysine of SGK1 with methionine.
  • Myr-ILK is a localization of the membrane by adding a myristoylated signal sequence to the N-terminus of ILK (Integrin Linked Kinase), a serine / threonine kinase located upstream of AKT in the PI3K signal. It is a constitutively active ILK. ILK inhibits the PI3K / AKT pathway by binding to PDK upstream of AKT.
  • ILK Integrin Linked Kinase
  • ILKILE359K is a dominant negative ILK in which the kinase region is mutated by substituting the 359th glutamic acid of ILK with lysine.
  • Myr-PDK1 is a constitutively active PDK1 localized in the membrane by adding a myristoylated signal sequence to the N-terminus of PDK1 contained in the PDK subfamily.
  • S6K1389T389E is a constitutively active S6K1 mutant by replacing the 389th threonine of S6K1 with glutamic acid.
  • FIG. 10 shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the 32nd day after infection.
  • Example 3 an increase in the number of iPS cell colonies was observed by adding p110-Caax. Similarly, an increase in the number of iPS cell colonies was also observed in PTEN shRNA, indicating that PI3K is important for promoting the establishment of iPS cells. As in Example 8, an increase in the number of iPS cell colonies was observed with Myr-AKT1, and similar results were obtained with AKT family members AKT2 and AKT3.
  • Rheb is a factor that activates mTOR
  • S6K1 is a downstream factor of mTOR, suggesting that activation of the mTOR signaling pathway contributes to the establishment of iPS cells.
  • Example 11 Examination of c-MYC of mTOR signal-related gene on human iPS cell establishment The same gene as described above in Example 1 was introduced into skin cell-derived fibroblasts (HDF: cell name 1616).
  • FIG. 11A shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the 32nd day after infection.
  • the effect of promoting the establishment of iPS cells was lost by adding c-MYC shRNA, indicating that c-MYC is essential for the promotion of iPS cell establishment by these genes.
  • Mock, Myr-AKT1, Rheb, S6K1 T389E and p53 shRNA were introduced into skin cell-derived fibroblasts (HDF: cell name 1616), and the intracellular protein 7 days later was collected by a conventional method, and c-MYC was obtained by Western blot.
  • P-AKT, AKT, p-S6K1, S6K1, p-TSC2 and TSC2 expression levels were confirmed.
  • p53 shRNA is an shRNA against p53, and the sequence described in Hong H, et al., Nature. 460: 1132-1135 (2009) was used.
  • phosphorylated AKT is increased by the introduction of p53 shRNA.
  • Hong H et al. Showed that inhibition of p53 promotes the establishment of iPS cells, suggesting that inhibition of p53 promotes the establishment of iPS cells through phosphorylation of AKT.
  • Example 12 Examination of the effect of AKT1 on the promotion of human iPS cell establishment by the inhibition of p53 and the introduction of GLIS1
  • human skin cell-derived fibroblasts HDF: cell name 1616
  • HDF cell name 1616
  • FIG. 12A shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the 32nd day after infection.
  • the number of iPS cell colonies was increased by adding Myr-AKT1 and p53 ⁇ ⁇ ⁇ shRNA simultaneously. Therefore, it was shown that introduction of p53shRNA and AKT1 has a synergistic effect of promoting the establishment of iPS cells. Moreover, since the number of iPS cell colonies decreased in any case by c-MYC shRNA, it was suggested that these effects are actions mediated by c-MYC.
  • HDF human skin cell-derived fibroblasts
  • FIG. 12B shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the 32nd day after infection.
  • FIG. 12C shows the result of measuring the number of iPS cell colonies on the 32nd day after infection.

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Abstract

　本発明は、体細胞の核初期化工程においてRasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6Kからなる群より選択される1以上のタンパク質の活性化型のレベルを増大させることを含む、人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法を提供する。本発明はまた、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤を提供する。さらに、本発明は、体細胞に核初期化物質と、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子とを接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法を提供する。

Description

効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
　本発明は、人工多能性幹（以下、iPSともいう）細胞の樹立効率の改善方法及びそのための薬剤に関する。より詳細には、本発明は、Rasファミリーのメンバーを用いたiPS細胞の樹立効率の改善方法、並びにRasファミリーのメンバーを有効成分とするiPS細胞の樹立効率改善剤に関する。
　近年、マウス及びヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Takahashi及びYamanaka（非特許文献1）は、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した。Okitaら（非特許文献2）は、Fbx15よりも多能性細胞に発現が限局しているNanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾が胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog iPS細胞）を樹立することに成功した。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることが明らかとなった（非特許文献3）。
　さらに、Takahashiら（非特許文献4）は、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した。一方、Yuら（非特許文献5）は、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した。このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。
　しかし、iPS細胞の樹立効率は依然として低く、特に、iPS細胞から分化した組織や個体において腫瘍化が懸念されるc-Mycを除く3因子（Oct3/4, Sox2, Klf4）を体細胞に導入してヒトiPS細胞を作製する場合、その樹立効率が極めて低いという問題点がある。
　ところで、低分子量GTPaseであるRasは多くの細胞において増殖と分化を制御している。Rasは通常GDPに結合した不活性化型として存在するが、増殖因子などの刺激によりGDPを解離し、GTPと結合して活性化型に変化し、標的因子を介して下流にシグナルを伝達する。Rasの標的因子として、Raf、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3キナーゼ)、Ral Guanine nucleotide Exchanging Factor（RalGEF）等が知られている。様々なヒトがん細胞においてRasの恒常的活性化型点変異が報告されており、これらの標的因子の下流シグナルの異常によるRasタンパク質の機能破綻が、細胞がん化の重要なステップの１つと推測されている。
　Takahashiら（非特許文献6）は、胚性幹細胞（ES細胞）で特異的に発現する、他のRas遺伝子と相同性を有する遺伝子を同定し、ERasと命名した。ERasは他のRasと全体では約40%程度の相同性しかないが、Rasの機能に必須の5つのグアニンヌクレオチド結合ドメイン（G1-G5）は高度に保存され、膜局在に必要なC末端のCaaxモチーフ（C: システイン、a: 脂肪族アミノ酸、x: 任意のアミノ酸）も有している。
　しかしながら、Rasファミリーと体細胞の初期化との関連については、未だ十分に解明されていない。
Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006) Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007) Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007) Takahashi, K. et al., Nature, 423: 541-545 (2003)
　本発明の目的は、iPS細胞の樹立効率を改善する手段を提供することであり、それを用いた効率的なiPS細胞の製造方法を提供することである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体細胞の核初期化工程において、活性化型のRasファミリーメンバー、その標的因子又はその関連因子であるPI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1若しくはS6Kの活性化型分子のレベルを増大させることにより、iPS細胞の樹立効率を顕著に増大させ得ることを明らかにした。また、種々の活性化型変異体を用いた実験から、Rasタンパク質による、PI3キナーゼを介するシグナル伝達経路（PI3キナーゼ経路）、RalGEFを介するシグナル伝達経路（Ral経路）及びAKT経路の活性化が、iPS樹立効率の改善に大きく寄与していることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
[1] 人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6Kからなる群より選択される1以上のタンパク質の活性化型のレベルを増大させることを含む、方法。
[2] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1およびS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを含む、上記[1]記載の方法。
[3] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[2]記載の方法。
[4] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[2]又は[3]記載の方法。
[5] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[3]又は[4]記載の方法。
[6] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[3]又は[4]記載の方法。
[7] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[3]記載の方法。
[8] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[2]又は[3]記載の方法。
[9] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[3]又は[8]記載の方法。
[10] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、上記[2]記載の方法。
[11] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤。
[12] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[11]記載の剤。
[13] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[11]又は[12]記載の剤。
[14] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[12]又は[13]記載の剤。
[15] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[12]又は[13]記載の剤。
[16] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[12]記載の剤。
[17] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[11]又は[12]記載の剤。
[18] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[12]又は[17]記載の剤。
[19] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、上記[11]記載の剤。
[20] 体細胞に核初期化物質と、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子とを接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法。
[21] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[20]記載の方法。
[22] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[20]又は[21]記載の方法。
[23] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[21]又は[22]記載の方法。
[24] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[21]又は[22]記載の方法。
[25] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[21]記載の方法。
[26] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[20]又は[21]記載の方法。
[27] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[21]又は[26]記載の方法。
[28] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、上記[20]記載の方法。
[29] 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、上記[20]記載の方法。
[30] 核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、上記[20]記載の方法。
[31] 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び／又はNanog及び／又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、上記[20]記載の方法。
[32] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子と、核初期化物質とを含有してなる、人工多能性幹細胞の誘導剤。
[33] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[32]記載の剤。
[34] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[32]又は[33]記載の剤。
[35] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[33]又は[34]記載の剤。
[36] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[33]又は[34]記載の剤。
[37] 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、上記[32]記載の剤。
[38] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[33]記載の剤。
[39] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[32]又は[33]記載の剤。
[40] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[33]又は[39]記載の剤。
[41] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、上記[32]記載の剤。
[42] 核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、上記[32]記載の剤。
[43] 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び／又はNanog及び／又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、上記[32]記載の剤。
[44] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1又はS6Kをコードする外来性核酸を含む、人工多能性幹細胞。
[45] 前記外来性核酸がゲノムに組み込まれている、上記[44]記載の細胞。
[46] 下記の工程：
(1) 上記[20]～[31]のいずれかに記載の方法により人工多能性幹細胞を製造する工程、及び
(2) 上記工程(1)で得られた人工多能性幹細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させる工程、
を含む、体細胞の製造方法。
[47] 人工多能性幹細胞の樹立効率改善のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用。
[48] 人工多能性幹細胞の製造のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用であって、該因子を核初期化物質とともに体細胞に接触させることを特徴とする、使用。
[49] 体細胞の製造における、上記[44]又は[45]記載の人工多能性幹細胞の使用。
[50] 体細胞の製造における細胞ソースとしての、上記[44]又は[45]記載の人工多能性幹細胞。
　核初期化の際にRasタンパク質、その標的因子であるPI3キナーゼ、RalGEF若しくはRaf、又はその関連因子であるAKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1若しくはS6Kの活性化型分子のレベルを増大させると、iPS細胞の樹立効率を顕著に向上させることができるので、従来樹立効率の低かったc-Mycを除く3因子によるiPS細胞誘導などに特に有用である。
図1は、実施例1の結果を示すグラフである。図中、縦軸はOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4遺伝子導入により得られたコロニー数を１とした場合（図中Red）のiPSコロニー数の倍率変化（Fold change）を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図2は、実施例2の結果を示すグラフである。図中、縦軸はOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4遺伝子導入により得られたコロニー数を１とした場合（図中Red）のiPSコロニー数の倍率変化（Fold change）を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図3は、実施例3の結果を示すグラフである。左図はTig-120細胞を用いた結果であり、右図は1616細胞を用いた結果である。図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図4は、実施例4の結果を示すグラフである。図中、縦軸はOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4遺伝子導入により得られたコロニー数を１とした場合（図中Red）のiPSコロニー数の倍率変化（Fold change）を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図5は、実施例5の結果を示すグラフである。図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2, Klf4およびc-Myc遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図6は、実施例6の結果を示すグラフである。図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2, Klf4およびc-Myc遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図7は、実施例7の結果を示すiPS細胞コロニーのアルカリフォスファターゼ染色像である。各数値はiPS細胞コロニー数を示す。 図8は、実施例8の結果を示すグラフである。図8A中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子とMockの2倍量, Mock およびMyr-AKT1, Mock およびc-MYC shRNA, Myr-AKT1およびc-MYC shRNA, またはMyr-AKT1およびGSK3βS9Aとの組み合わせを示す。図8B中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図9は、実施例9の結果を示すグラフである。図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図10は、実施例10の結果を示すグラフである。図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。また横軸は、Oct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。 図11は、実施例11の結果を示すグラフおよび写真である。図11Aにおいて、縦軸はiPS細胞コロニー数を示し、横軸は、c-Myc shRNA存在下あるいは非存在下におけるOct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。一方、図11Bは、ヒト由来の皮膚線維芽細胞にMock, Myr-AKT1, Rheb, S6K1 T389Eまたはp53 shRNAをそれぞれ導入した際の細胞内のc-Myc, p-AKT（リン酸化AKT）, AKT, p-S6K1（リン酸化S6K1）, S6K1, p-TSC2（リン酸化TSC2）およびTSC2のタンパク質の発現をWestern blot法で測定した結果を示す。 図12は、実施例12の結果を示すグラフである。図12Aは、ヒト由来の皮膚線維芽細胞に導入した結果を示し、図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。横軸は、p53 shRNA存在下あるいは非存在下におけるOct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。図12Bは、ヒト由来の皮膚線維芽細胞に導入した結果を示し、図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。横軸は、GLIS1存在下あるいは非存在下におけるOct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。図12Cは、ヒト由来の歯髄細胞に導入した結果を示し、図中、縦軸はiPS細胞コロニー数を示す。横軸は、p53 shRNA存在下あるいは非存在下におけるOct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示すと共に、GLIS1存在下あるいは非存在下におけるOct3/4, Sox2およびKlf4遺伝子と横軸に示す各遺伝子との組み合わせを示す。
　本発明は、体細胞の核初期化工程において、活性化型のRasタンパク質、活性化型のその標的因子、活性化型のRasの標的因子の下流シグナル因子又はそのシグナルの活性化因子の細胞内レベルを増大させることによる、iPS細胞の樹立効率の改善方法を提供する。活性化型のRasタンパク質、活性化型のその標的因子、活性化型のRasの標的因子の下流シグナル因子又はそのシグナルの活性化因子の細胞内レベルを増大させる手段は特に制限されないが、例えば、Rasファミリーのメンバーであるタンパク質、その標的因子であるPI3キナーゼ、RalGEF若しくはRaf、Rasの標的因子の下流シグナル因子又はそのシグナルの活性化因子であるAKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1若しくはS6K、又はそれらをコードする核酸、或いはRasタンパク質を活性化型に変換させる反応を促進する物質又はRasタンパク質を不活性化型に変換させる反応を阻害する物質を、体細胞に接触させる方法などが挙げられる。
　ここで体細胞の核初期化は、体細胞に核初期化物質を導入することにより行われるので、本発明はまた、体細胞に上記物質と核初期化物質とを接触させることによる、iPS細胞の製造方法を提供する。尚、本明細書では、核初期化物質のみではiPS細胞が樹立できず、活性化型のRasタンパク質レベル等を増大させることによりiPS細胞が樹立される場合も、「樹立効率の改善」に該当するものとして取り扱う。
 (a) 体細胞ソース
　本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、ラット、イヌ等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人又はHLAの遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの遺伝子型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの遺伝子型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA（例えばHLA-A、HLA-B及びHLA-DRの3遺伝子座、或いはさらにHLA-Cを加えた4遺伝子座）の遺伝子型がすべて同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。また、ヒトに投与（移植）しない場合、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人又は薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取することが望ましい。
　哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質及び活性化型Rasタンパク質のレベルを増大させる物質（さらに必要に応じて、後述する他のiPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
 (b) Rasタンパク質、その標的因子の活性化型分子、Ras標的因子の下流シグナル因子又はそのシグナルの活性化因子のレベルを増大させる物質
　本明細書において「活性化型Rasタンパク質のレベルを増大させる物質」とは、Rasファミリーに属する1以上のタンパク質において、活性化型（GTP結合型）として存在するタンパク質レベルを増大させることができるものであれば、いかなる物質であってもよい。すなわち、Rasタンパク質やそれをコードする核酸自体や、Rasタンパク質を不活性化型（GDP結合型）から活性化型に変換させる反応（GDP-GTP交換反応）を促進するか、或いはRasタンパク質を活性化型から不活性化型に変換させる反応（GTP加水分解反応）を阻害することにより、結果的に活性化型のRasタンパク質レベルを増大させる物質も、本明細書における「活性化型Rasタンパク質のレベルを増大させる物質」に含まれる。
　本明細書において「活性化型のRasタンパク質標的因子のレベルを増大させる物質」とは、PI3キナーゼ、RalGEF及びRafの3つのRasタンパク質標的因子のうちの1以上の因子、好ましくは1若しくは2因子、より好ましくはPI3キナーゼ及び／又はRalGEFの活性化型の細胞内レベルを増大させることができるものであれば、いかなる物質であってもよい。すなわち、PI3キナーゼ、RalGEF若しくはRaf又はそれをコードする核酸自体や、細胞内のこれら標的因子を細胞膜にリクルートする局在化因子、例えば活性化型のRasタンパク質も、本明細書における「活性化型のRasタンパク質標的因子のレベルを増大させる物質」に含まれる。
　本明細書において「Ras標的因子の下流シグナル因子又はそのシグナルの活性化因子のレベルを増大させる物質」とは、Rasタンパク質標的因子のさらに下流シグナルの因子もしくはこのシグナルの活性化因子であるAKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1若しくはS6Kであり、好ましくはAKTファミリーメンバーの活性化型、Rheb、TCL1若しくはS6Kの活性化型の細胞内レベルを増大させることができるものであれば、いかなる物質であってもよい。すなわち、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1若しくはS6K又はそれをコードする核酸自体や、細胞内のAKTファミリーメンバーを細胞膜にリクルートする局在化因子、例えば活性化型のPI3キナーゼも、本明細書における「活性化型のRasタンパク質関連因子のレベルを増大させる物質」に含まれる。
　以下、Rasタンパク質、その標的因子又はRas標的因子の下流シグナル因子の活性化型分子およびそのシグナルの活性化因子のレベルを増大させる物質を包括して、「本発明の樹立効率改善因子」という場合がある。
 (b1) Rasファミリーメンバー
　本明細書における「Rasファミリーメンバー」とは、癌原遺伝子として同定されたHRas、KRas、NRasとの一次構造上の相同性により同定されたRasサブファミリータンパク質のうち、Raf、PI3キナーゼ及びRalGEFから選ばれる1以上の分子、好ましくはPI3キナーゼ及び／又はRalGEFを標的因子とし、活性化型Rasタンパク質の作用により上記因子の下流のシグナル伝達経路（即ち、Raf/MAPキナーゼ経路（MAPキナーゼ経路）、PI3キナーゼ経路、Ral経路）を活性化しうるタンパク質を意味する。好ましいRasファミリーメンバーの例としては、HRas、KRas、NRas、ERas等が挙げられるが、これらに限定されない。
　HRasタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：2で表されるアミノ酸配列からなるマウスHRas（RefSeq Accession No. NP_032310）、配列番号：4で表されるアミノ酸配列からなるヒトHRas（RefSeq Accession No. NP_001123914）、或いは他の哺乳動物におけるそのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のHRasを用いることが望ましいが、異種HRasを用いることもできる。
　KRasタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：6で表されるアミノ酸配列からなるマウスKRas（RefSeq Accession No. NP_067259）、配列番号：8で表されるアミノ酸配列からなるヒトKRas（RefSeq Accession No. NP_203524）、或いは他の哺乳動物におけるそのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のKRasを用いることが望ましいが、異種KRasを用いることもできる。
　NRasタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：10で表されるアミノ酸配列からなるマウスNRas（RefSeq Accession No. NP_035067）、配列番号：12で表されるアミノ酸配列からなるヒトNRas（RefSeq Accession No. NP_002515）、或いは他の哺乳動物におけるそのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のNRasを用いることが望ましいが、異種NRasを用いることもできる。
　ERasタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：14で表されるアミノ酸配列からなるマウスERas（RefSeq Accession No. NP_853526）、配列番号：16で表されるアミノ酸配列からなるヒトERas（RefSeq Accession No. NP_853510）、或いは他の哺乳動物におけるそのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアントなどがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のERasを用いることが望ましいが、異種ERasを用いることもできる。
　Rasタンパク質のアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）のblastpプログラムを用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。上記条件下でヒトHRasとマウスHRasとは100%、ヒトKRasとマウスKRasとは約89%、ヒトNRasとマウスNRasとは約99%のアミノ酸同一性を示す。Rasタンパク質はN末端から164アミノ酸の領域が極めて高度に保存されており、当該領域ではヒトKRasとマウスKRasとは約98%、ヒトNRasとマウスNRasとは100%のアミノ酸同一性を示す。また、当該領域におけるヒトHRasとヒトKRasとのアミノ酸同一性は約95%、ヒトHRasとヒトNRasとのアミノ酸同一性は約92%である。当該領域の中でも、グアニンヌクレオチドとの結合に関与する5つのドメイン（G1～G5）、標的因子との結合に関与するエフェクタードメインは特によく保存されている。さらに、多様性に富むC末端側配列の中でも、C末端の4アミノ酸残基はCaaxモチーフ（C: システイン、a: 脂肪族アミノ酸、x: 任意のアミノ酸; 配列番号:17）と呼ばれて高度に保存されており、翻訳後修飾を受けてシステイン残基にファルネシル基が付加され、続いて末端3アミノ酸の切断、新たに露出したC末端システインのメチルエステル化が起こる。かかる脂質修飾によりRasタンパク質は細胞膜の内表面と強く結合する。
　HRas、KRas、NRasなどの多くのRasタンパク質は、通常GDPが結合した不活性化型として存在し、上流からのシグナルを受けるとGTPが結合した活性化型に変換されるが、種々のがん細胞から恒常的に活性化されたRas変異体が単離されており、恒常的な活性化に寄与する数多くのアミノ酸置換が報告されている。このようなRasタンパク質の恒常的活性化変異体を体細胞へ導入すれば、効率よく活性化型のRasタンパク質レベルを増大させることができる。例えば、H-、K-及びN-Rasの12番目のグリシンがバリンに置換された変異体は、Rasの下流の3つのシグナル伝達経路（PI3キナーゼ経路、Ral経路、MAPキナーゼ経路）のすべてを活性化する恒常的活性化型変異体である。また、上記変異に加えてさらに35番目のスレオニンがセリンに置換された二重変異体、37番目のグルタミン酸がグリシンに置換された二重変異体及び40番目のチロシンがシステインに置換された二重変異体は、それぞれMAPキナーゼ経路、Ral経路及びPI3キナーゼ経路を選択的に活性化する恒常的活性化型変異体である。
　ヒト及びマウスERasは、HRasと全体では40%程度の相同性であるが、Rasの機能に必須なG1～G5及びエフェクタードメイン、膜局在化に必要なCaaxモチーフは保存されている。H-、K-及びN-Rasの12番目のグリシン、59番目のアラニン及び63番目のグルタミン酸のうち、1つでも他のアミノ酸に置換されると恒常的活性化型となるが、ヒトERasでは2つ、マウスERasでは3つのアミノ酸が他のRasとは異なっており、Rasの下流の3つのシグナル伝達経路のうちPI3キナーゼ経路を恒常的に活性化することが知られている。
　本発明で用いられる恒常的活性化型のRasタンパク質は、Rasの下流の3つのシグナル伝達経路（PI3キナーゼ経路、Ral経路、MAPキナーゼ経路）の少なくとも1つを恒常的に活性化し得るものであれば特に制限はないが、好ましくはPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路のうちの1つもしくは2つのシグナル伝達経路を恒常的に活性化するものであり、より好ましくはPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化するものである。PI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化するRasタンパク質の具体例として、ERasや、H-、K-又はN-Rasの12番目のグリシンがバリンに置換され、かつ37番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるか、40番目のチロシンがシステインに置換された二重変異体などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、本発明で用いられるRasタンパク質は、Rasの下流の3つのシグナル伝達経路のいずれもが恒常的に不活性化されない限り、好ましくはPI3キナーゼ経路及びRal経路のいずれもが恒常的に不活性化されない限り、上記のいずれかのRasタンパク質のアミノ酸配列において、1又は2以上、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～数（5, 4, 3, 2）個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。或いは、上記のいずれかのRasタンパク質のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。好ましくは、膜局在化に必要なCaaxモチーフが保存され、かつRasの機能に必須なG1（10～17番目のアミノ酸）、G2（32～36番目のアミノ酸）、G3（57～60番目のアミノ酸）、G4（116～119番目のアミノ酸）、G5（145～147番目のアミノ酸）ドメイン、及びエフェクタードメイン（26～45番目のアミノ酸）が保存されているか、或いは恒常的な活性化をもたらすように変異されているものが挙げられる。
 (b2) Rasの標的因子（エフェクター）
　本発明で用いられる「Rasの標的因子（エフェクター）」としては、PI3キナーゼ、RalGEF及びRafが挙げられる。
　本発明におけるPI3キナーゼは、Rasの標的因子となるクラスIA PI3キナーゼであり、p110触媒サブユニット（α、β及びδの3つのアイソフォームがある）と調節サブユニット（p85α、p85β、p55γ及びそれらのスプライシングバリアントがある）とからなる。このうち、Rasとの結合に関与するドメイン及びホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸（PIP2）からホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸（PIP3）へのリン酸化反応を触媒するキナーゼドメインを有するp110を、本発明の樹立効率改善因子として好ましく用いることができる。
　p110タンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：19で表されるアミノ酸配列からなるマウスp110α（RefSeq Accession No. NP_032865）、配列番号：21で表されるアミノ酸配列からなるヒトp110α（RefSeq Accession No. NP_006209）、マウスp110β（RefSeq Accession No. NP_083370）、ヒトp110β（RefSeq Accession No. NP_006210）、マウスp110δ（RefSeq Accession No. NP_0010250058）、ヒトp110δ（RefSeq Accession No. NP_005017）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のp110を用いることが望ましいが、異種p110を用いることもできる。
　RalGEFタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：23で表されるアミノ酸配列からなるマウスRalGDS（RefSeq Accession No. NP_033084）、配列番号：25で表されるアミノ酸配列からなるヒトRalGDS（RefSeq Accession No. NP_006266）、マウスRgl（RefSeq Accession No. NP_058542）、ヒトRgl（RefSeq Accession No. NP_055964）、マウスRlf/Rgl2（RefSeq Accession No. NP_033085）、ヒトRlf/Rgl2（RefSeq Accession No. NP_004752）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のRalGEFを用いることが望ましいが、異種RalGEFを用いることもできる。
　Rafタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：27で表されるアミノ酸配列からなるマウスc-Raf（RefSeq Accession No. NP_084056）、配列番号：29で表されるアミノ酸配列からなるヒトc-Raf（RefSeq Accession No. NP_002871）、マウスA-Raf（RefSeq Accession No. NP_033833）、ヒトA-Raf（RefSeq Accession No. NP_001645）、マウスB-Raf（RefSeq Accession No. NP_647455）、ヒトB-Raf（RefSeq Accession No. NP_004324）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のRafを用いることが望ましいが、異種Rafを用いることもできる。
　PI3キナーゼ、RalGEF、RafなどのRas標的因子は、活性化型Rasとの結合を介して細胞膜の内表面に局在化することにより活性化され、下流のシグナル伝達経路を活性化する。従って、これら標的因子の恒常的活性化型変異体を体細胞へ導入すれば、効率よく活性化型の該Ras標的因子のレベルを増大させることができる。例えば、Ras標的因子は膜に局在化することにより活性化されるので、該標的因子のN末端若しくはC末端に膜局在化シグナル配列を付加することにより、該標的因子の恒常的活性化型変異体を作製することができる。例えば、該標的因子のN末端にミリストイル化シグナル配列（例えば、c-Src由来のミリストイル化シグナル配列 (MGSSKSKPKDPSQRRRRIRT; 配列番号: 30)）を付加するか（例、実施例3のMyr-PI3K等）、或いはC末端にCaaxモチーフを付加することにより（例、実施例3のPI3K-CaaX、実施例4のRalGDS-Caax、Raf-CaaX等）、膜局在性の恒常的活性化型変異体とすることができる。その他の恒常的活性化型変異体として、例えば、p110αの1047番目のヒスチジンがアルギニンに置換されたPI3キナーゼ変異体、p110αの545番目のグルタミン酸がリジンに置換されたPI3キナーゼ変異体、p110αの227番目のリジンがグルタミン酸に置換されたPI3キナーゼ変異体、p110のN末端側の108アミノ酸（調節サブユニット結合ドメイン）を欠失したPI3キナーゼ変異体、c-RafのN末端側の305アミノ酸（Ras結合ドメインを含む）を欠失したRaf変異体、B-Rafの600番目のバリンがグルタミン酸に置換されたRaf変異体、c-Rafの340番目のチロシンがアスパラギン酸に置換されたRaf変異体などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で用いられる恒常的活性化型のRas標的因子は、好ましくはPI3キナーゼ（p110）又はRalGEFの恒常的活性化変異体であり、具体的には、後記実施例で用いられるMyr-PI3K、PI3K-CaaX、RalGDS-CaaX等が挙げられる。
　本発明で用いられる恒常的活性化型のPI3キナーゼは、AKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化するものである。
　また、本発明で用いられるRas標的因子は、該標的因子の下流のシグナル伝達経路が恒常的に不活性化されない限り、上記のいずれかのRas標的因子のアミノ酸配列において、1又は2以上、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～数（5, 4, 3, 2）個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。或いは、上記のいずれかのRasタンパク質のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
 (b3) Rasの標的因子（エフェクター）の下流シグナル因子およびそのシグナルの活性化因子
　本発明で用いられる「Rasの標的因子（エフェクター）の下流シグナル因子」としては、AKTファミリーメンバー、Rheb及びS6Kが挙げられ、「Rasの標的因子（エフェクター）の下流シグナルの活性化因子」としては、TCL1が挙げられる。
　本明細書における「AKTファミリーメンバー」とは、ウイルス性癌遺伝子であるv-Aktの相同遺伝子として同定され、その下流にあるmTORの活性化へとシグナルを伝達し得るタンパク質である。好ましいAKTファミリーメンバーの例としては、AKT1、AKT2、AKT3等が挙げられるが、これには限定されない。AKTタンパク質の好ましい例としては、例えば配列番号：35で表わされるアミノ酸配列からなるマウスAkt1（RefSeq Accession No. NP_001159366）、配列番号：37で表わされるアミノ酸配列からなるヒトAKT1（RefSeq Accession No. NP_001014432）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント（例えば、RefSeq Accession No. NP_033782、RefSeq Accession No. NP_001014431、RefSeq Accession No. NP_005154など）、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のAKTファミリーメンバーを用いることが望ましいが、異種AKTファミリーメンバーを用いることもできる。
　Rhebタンパク質の好ましい例としては、例えば配列番号：39で表わされるアミノ酸配列からなるマウスRheb（RefSeq Accession No. NP_444305）、配列番号：41で表わされるアミノ酸配列からなるヒトRHEB（RefSeq Accession No. NP_005605）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のRhebを用いることが望ましいが、異種Rhebを用いることもできる。
　TCL1タンパク質の好ましい例としては、例えば配列番号：43で表わされるアミノ酸配列からなるマウスTcl1（RefSeq Accession No. NP_033363）、配列番号：45で表わされるアミノ酸配列からなるヒトTCL1A（RefSeq Accession No. NP_001092195）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント（例えば、RefSeq Accession No. NP_068801など）、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のTCL1を用いることが望ましいが、異種TCL1を用いることもできる。
　S6Kタンパク質の好ましい例としては、例えば配列番号：47で表わされるアミノ酸配列からなるS6K（RefSeq Accession No. NP_001107806）、配列番号：49で表わされるアミノ酸配列からなるヒトS6K1（RefSeq Accession No. NP_003152）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント（例えば、RefSeq Accession No. NP_082535など）、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のS6Kを用いることが望ましいが、異種S6Kを用いることもできる。
　AKTファミリーメンバーは、活性化型RasやPI3キナーゼ等との結合を介して細胞膜の内表面に局在化することにより活性化され、下流のシグナル伝達経路を活性化する。従って、AKTファミリーメンバーの恒常的活性化型変異体を体細胞へ導入すれば、効率よく下流シグナル因子のレベルを増大させることができる。例えば、AKTファミリーメンバーは膜に局在化することにより活性化されるので、該標的因子のN末端若しくはC末端に膜局在化シグナル配列を付加することにより、該標的因子の恒常的活性化型変異体を作製することができる。例えば、該標的因子のN末端にミリストイル化シグナル配列（例えば、c-Src由来のミリストイル化シグナル配列 (MGSSKSKPKDPSQRRRRIRT; 配列番号: 30)）を付加することにより（例、実施例8のMyr-AKT1等）、膜局在性の恒常的活性化型変異体とすることができる。その他の恒常的活性化型変異体として、例えば、AKT1の40番目のグルタミン酸がリシンに置換されたPI3キナーゼ変異体（E40K-AKT1）、AKT1の17番目のグルタミン酸がリジンに置換されたPI3キナーゼ変異体（E17K-AKT1）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、S6Kタンパク質は、通常389番目のトレオニンがリン酸化されることで活性化型に変換されるが、この389番目をグルタミン酸へ変換することで、恒常的に活性化することが報告されている。このようなS6Kタンパク質の恒常的活性化変異体を体細胞へ導入すれば、効率よく活性化型のS6Kタンパク質レベルを増大させることができる。
　また、本発明で用いられるRasの標的因子（エフェクター）の下流シグナル因子およびこのシグナルの活性化因子は、さらなる下流のシグナル伝達経路が恒常的に不活性化されない限り、上記のいずれかのRasの標的因子（エフェクター）の下流シグナル因子およびこのシグナルの活性化因子のアミノ酸配列において、1又は2以上、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～数（5, 4, 3, 2）個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。或いは、上記のいずれかのAKTファミリーメンバー、Rheb、S6K及びTCL1タンパク質のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
　本発明で用いられる恒常的活性化型のRasの標的因子（エフェクター）の下流シグナル因子およびこのシグナルの活性化因子は、好ましくはAKTファミリーメンバー又はS6Kの恒常的活性化変異体であり、具体的には、後記実施例で用いられるMyr-AKT1、Myr-AKT2、Myr-AKT3、S6K1 T389E等が挙げられる。
 (b4) Ras活性化因子
　受容体チロシンキナーゼが増殖因子などの細胞外シグナルの刺激を受けて活性化されると自己リン酸化を起こし、これを認識するGrb2やShcなどのアダプタータンパク質を介してRasGEFであるSos、RasGRF、RasGRF2、RasGRP、SmgGDS、Vav、C3G等が細胞膜にリクルートされ、それによって細胞膜に局在するRasタンパク質が活性化される。従って、RasGEFやアダプタータンパク質を体細胞に導入することによっても、Rasタンパク質の活性化を介してiPS細胞の樹立効率を改善することができる。
　Sosタンパク質の好ましい例としては、マウスSos1（RefSeq Accession No. NP_033257）、ヒトSos1（RefSeq Accession No. NP_005624）、マウスSos2（RefSeq Accession No. XP_127051）、ヒトSos2（RefSeq Accession No. NP_008870）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のSosを用いることが望ましいが、異種Sosを用いることもできる。人工の活性化型変異体の例としては、前記したC末端にCaaxモチーフを付加するか、N末端にミリストイル化シグナルを付加した膜局在性変異体が挙げられる。
　RasGRF、RasGRF2、RasGRP、SmgGDS、Vav、C3G等の他のRasGEFタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、それらの多型バリアント、スプライシングバリアントも知られている。また、これらのタンパク質の活性化型変異体の例としては、前記したC末端にCaaxモチーフを付加するか、N末端にミリストイル化シグナルを付加した膜局在性変異体が挙げられる。
　Grb2タンパク質の好ましい例としては、マウスGrb2（RefSeq Accession No. NP_032189）、ヒトGrb2（RefSeq Accession No. NP_002077）、或いは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体や多型バリアント、スプライシングバリアント、天然及び人工の活性化型変異体などがあげられる。導入対象である体細胞の動物種に応じて、これと同種のGrb2を用いることが望ましいが、異種Grb2を用いることもできる。人工の活性化型変異体の例としては、前記したC末端にCaaxモチーフを付加するか、N末端にミリストイル化シグナルを付加した膜局在性変異体が挙げられる。
　(b1)～(b4)のタンパク質（「本発明のタンパク性樹立効率改善因子」という場合もある）は、例えば、ヒトもしくは他の哺乳動物 (例えば、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌなど) の細胞・組織［例えば、胸腺、骨髄、脾臓、脳、脊髄、心臓、骨格筋、腎臓、肺、肝臓、膵臓もしくは前立腺の細胞・組織、これら細胞の前駆細胞、幹細胞または癌細胞など］から自体公知のタンパク質分離精製技術を用いて単離することもできるが、好ましくは、上記細胞・組織から常法に従ってcDNAをクローニングし、適当な宿主細胞で発現させて組換えタンパク質として調製される。上記の種々の活性化型変異体は、自体公知の遺伝子組換え技術により、点変異を導入したり、あるいは末端に膜局在化シグナル配列を付加することにより作製することができる。
　本発明のタンパク性樹立効率改善因子の体細胞への導入は、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）もしくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）およびProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）およびChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。本発明のタンパク性樹立効率改善因子を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
　PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT(Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。
　本発明のタンパク性樹立効率改善因子をコードするcDNAとPTD配列もしくはCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
　マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
　その他、エレクトロポレーション法、セミインタクトセル法（Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365(2006))、Wr-t ペプチドによる導入法（Kondo, E. et al., Mol. Cancer Ther. 3(12), 1623-1630(2004))などのタンパク質導入法も用いることができる。
　タンパク質導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回または4回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば6～48時間、好ましくは12～24時間が挙げられる。
 (b5) 本発明のタンパク性樹立効率改善因子をコードする核酸
　本発明のタンパク性樹立効率改善因子（Rasファミリーメンバー、Rasの標的因子（エフェクター）、Rasの標的因子（エフェクター）の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子及びRas活性化因子）をコードする核酸（「本発明の核酸性樹立効率改善因子」という場合もある）は、上記した本発明におけるRasファミリーメンバー（例、HRas、KRas、NRas、ERas等）、Rasの標的因子（エフェクター）（例、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf等）、Rasの標的因子（エフェクター）の下流シグナル因子（例、AKT1、AKT2、AKT3、Rheb、S6K等）、Rasの標的因子（エフェクター）の下流シグナルの活性化因子（例、TCL1等）又はRas活性化因子（例、RasGEF、受容体チロシンキナーゼアダプタータンパク質等）をコードするものであれば特に制限はない。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。
　本発明の核酸性樹立効率改善因子は、例えば、ヒトもしくは他の哺乳動物 (例えば、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌなど) の細胞・組織［例えば、胸腺、骨髄、脾臓、脳、脊髄、心臓、骨格筋、腎臓、肺、肝臓、膵臓もしくは前立腺の細胞・組織、これら細胞の前駆細胞、幹細胞または癌細胞など］由来のcDNAから、常法に従ってクローニングすることができる。
　HRasをコードする核酸としては、例えば、配列番号：1もしくは3で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：1もしくは3で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつRasの下流の3つのシグナル伝達経路の少なくとも1つ、好ましくはPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　KRasをコードする核酸としては、例えば、配列番号：5もしくは7で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：5もしくは7で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつRasの下流の3つのシグナル伝達経路の少なくとも1つ、好ましくはPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　NRasをコードする核酸としては、例えば、配列番号：9もしくは11で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：9もしくは11で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつRasの下流の3つのシグナル伝達経路の少なくとも1つ、好ましくはPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　ERasをコードする核酸としては、例えば、配列番号：13もしくは15で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：13もしくは15で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつRasの下流の3つのシグナル伝達経路の少なくとも1つ、好ましくはPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　PI3キナーゼの触媒サブユニット（p110）をコードする核酸としては、例えば、配列番号：18もしくは20で表される塩基配列を含有するp110αをコードする核酸、または配列番号：18もしくは20で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、PI3キナーゼ経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。あるいは、マウスp110β（RefSeq Accession No. NM_029094）、ヒトp110β（RefSeq Accession No. NM_006219）、マウスp110δ（RefSeq Accession No. NM_001029837）、ヒトp110δ（RefSeq Accession No. NM_005026）のcDNA配列を含有する核酸、または該cDNA配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、PI3キナーゼ経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　RalGEFをコードする核酸としては、例えば、配列番号：22もしくは24で表される塩基配列を含有するRalGDSをコードする核酸、または配列番号：22もしくは24で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、Ral経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。あるいは、マウスRgl（RefSeq Accession No. NM_016846）、ヒトRgl（RefSeq Accession No. NM_015149）、マウスRlf/Rgl2（RefSeq Accession No. NM_009059）、ヒトRlf/Rgl2（RefSeq Accession No. NM_004761）のcDNA配列を含有する核酸、または該cDNA配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、Ral経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　Rafをコードする核酸としては、例えば、配列番号：26もしくは28で表される塩基配列を含有するc-Rafをコードする核酸、または配列番号：26もしくは28で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、MAPキナーゼ経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。あるいは、マウスA-Raf（RefSeq Accession No. NM_009703）、ヒトA-Raf（RefSeq Accession No. NM_001654）、マウスB-Raf（RefSeq Accession No. NM_139294）、ヒトB-Raf（RefSeq Accession No. NM_004333）のcDNA配列を含有する核酸、または該cDNA配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、MAPキナーゼ経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　Sosをコードする核酸としては、例えば、マウスSos1（RefSeq Accession No. NM_009231）、ヒトSos1（RefSeq Accession No. NM_005633）、マウスSos2（RefSeq Accession No. XM_127051）、ヒトSos2（RefSeq Accession No. NM_006939）のcDNA配列を含有する核酸、または該cDNA配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、Rasタンパク質を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　RasGRF、RasGRF2、RasGRP、SmgGDS、Vav、C3G等の他のRasGEFのcDNA配列は公知であり、それらの多型バリアント、スプライシングバリアントも知られている。
　Grb2をコードする核酸としては、例えば、マウスGrb2（RefSeq Accession No. NM_008163）、ヒトGrb2（RefSeq Accession No. NM_002086）のcDNA配列を含有する核酸、または該cDNA配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつ受容体チロシンキナーゼを認識して結合し、RasGEFを細胞膜にリクルートしてRasタンパク質を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　AKTファミリーメンバーの一例としてAKT1をコードする核酸としては、例えば、配列番号：34もしくは36で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：34もしくは36で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつAKT経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　Rhebをコードする核酸としては、例えば、配列番号：38もしくは40で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：38もしくは40で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつ下流のmTOR経路を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　TCL1をコードする核酸としては、例えば、配列番号：42もしくは44で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：42もしくは44で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつAKT1タンパク質を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　S6Kをコードする核酸としては、例えば、配列番号：46もしくは48で表される塩基配列を含有する核酸、または配列番号：46もしくは48で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、かつS6Kタンパク質を活性化し得るタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　各配列番号で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸としては、各配列番号で表される塩基配列と約80%以上、好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上の同一性を有する塩基配列を含有する核酸が用いられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50～65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
　本発明のタンパク性樹立効率改善因子は、好ましくは、Rasタンパク質の恒常的活性化型分子、Rasの標的因子（エフェクター）の恒常的活性化型分子、Rasの標的因子の下流シグナル因子の恒常的活性化型分子、Rasの標的因子の下流シグナルの活性化分子並びにRas活性化因子の恒常的活性化型分子である。従って、本発明の核酸性樹立効率改善因子は、好ましくは、上記の恒常的活性化型分子をコードする核酸である。当該核酸は、上述のようにして得られる野生型分子をコードする核酸に、部位特異的変異誘発により目的のアミノ酸置換を導入したり、あるいは、膜局在化シグナル配列をコードするオリゴヌクレオチドを、リガーゼやPCRを用いて、その末端に付加することにより調製することができる。
　本発明の核酸性樹立効率改善因子の体細胞への導入は、自体公知の細胞への遺伝子導入方法を用いて実施することができる。Rasタンパク質、Ras標的因子、Rasの標的因子の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子またはRas活性化因子をコードする核酸は、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。
　用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用され得る。
　発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　Rasタンパク質、Ras標的因子、Rasの標的因子の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子またはRas活性化因子をコードする核酸は、単独で発現ベクター上に組み込んでもよいし、1以上の初期化遺伝子とともに1つの発現ベクターに組み込んでもよい。遺伝子導入効率の高いレトロウイルスやレンチウイルスベクターを用いる場合は前者が、プラスミド、アデノウイルス、エピソーマルベクターなどを用いる場合は後者を選択することが好ましい場合があるが、特に制限はない。
　上記において、Rasタンパク質、Ras標的因子、Rasの標的因子の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子またはRas活性化因子をコードする核酸と、1以上の初期化遺伝子とを、1つの発現ベクターに組み込む場合、これら複数の遺伝子は、好ましくはポリシストロニック発現を可能にする配列を介して発現ベクターに組み込むことができる。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。
　Rasタンパク質、Ras標的因子、Rasの標的因子の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子またはRas活性化因子をコードする核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) および Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。iPS細胞を再生医療のための細胞ソースとして利用する場合、Rasタンパク質、Ras標的因子、Rasの標的因子の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子またはRas活性化因子の発現（再活性化）またはそれらの外来性核酸が組み込まれた近傍に存在する内因性遺伝子の活性化は、iPS細胞由来の分化細胞から再生された組織における発癌リスクを高める可能性があるので、Rasタンパク質、Ras標的因子またはRas活性化因子をコードする核酸は細胞の染色体に組み込まれず、一過的に発現することが好ましい。かかる観点からは、染色体への組込みが稀なアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段は、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。また、アデノ随伴ウイルスも染色体への組込み頻度が低く、アデノウイルスベクターと比べて細胞毒性や炎症惹起作用が低いので、別の好ましいベクターとして挙げられる。センダイウイルスベクターは染色体外で安定に存在することができ、必要に応じてsiRNAにより分解除去することができるので、同様に好ましく利用され得る。センダイウイルスベクターについては、J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) や特許第3602058号に記載のものを用いることができる。
　レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre/loxPシステムを用いて、不要となった時点でRasタンパク質、Ras標的因子またはRas活性化因子をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後で、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー－プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、もしくはSV40などのポリアデニル化配列で置換した3’-自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre-loxPシステムおよびSIN LTRを用いる具体的手段は、Soldner et al., Cell, 136: 964-977 (2009)、Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009) などに開示されている。
　一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。
　プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上(たとえば3回または4回)繰り返して行うことができる。
　尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre-loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature,458: 766-770 (2009) に開示されている。
　別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピゾーマルベクターが挙げられる。エピゾーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)に開示されている。必要に応じて、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターに、Rasタンパク質、Ras標的因子またはRas活性化因子をコードする核酸を挿入した発現ベクターを構築し、これを体細胞に導入することもできる。
　該エピゾーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。
　また、エピゾーマル発現ベクターは、Rasタンパク質、Ras標的因子、Rasの標的因子の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子またはRas活性化因子をコードする核酸の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピゾーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　本発明で使用されるloxP配列としては、バクテリオファージP1由来の野生型loxP配列（配列番号：31）の他、導入遺伝子の複製に必要なベクター要素を挟む位置に同方向で配置された場合に、組換えを起こしてloxP配列間の配列を欠失させ得る任意の変異loxP配列が挙げられる。変異loxP配列としては、例えば、5’側反復配列に変異のあるlox71（配列番号：32）、3’側反復配列に変異のあるlox66（配列番号：33）、スペーサー部分に変異のあるlox2272やlox511などが挙げられる。該ベクター要素の5’側および3’側に配置される2つのloxP配列は、同一であっても異なっていてもよいが、スペーサー部分に変異のある変異loxP配列の場合は同一のもの（例、lox2272同士、lox511同士）が用いられる。好ましくは、5’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox71）と3’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox66）との組合せが挙げられる。この場合、組換えの結果染色体上に残るloxP配列は5’側および3’側の反復配列に二重変異を有するため、Creリコンビナーゼに認識されにくく、不必要な組換えにより染色体の欠失変異を起こすリスクが低減される。lox71とlox66とを用いる場合、前記ベクター要素の5’側および3’側にいずれの変異loxP配列を配置してもよいが、変異部位がloxP配列の外端に配置されるような向きで変異loxP配列を挿入する必要がある。
　2つのloxP配列は、導入遺伝子の複製に必要なベクター要素（即ち、複製開始点、または複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子配列）の5’側および3’側に、同方向に配置される。loxP配列が挟むベクター要素は、複製開始点、または複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子配列のいずれか一方だけであってもよいし、両方であってもよい。
　エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
　iPS細胞から導入遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクター要素内部および／またはloxP配列近傍の塩基配列を含む核酸をプローブまたはプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析またはPCR分析を行い、バンドの有無または検出バンドの長さを調べることにより実施することができる。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法と用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
 (c) 核初期化物質
　本発明において「核初期化物質」とは、体細胞に導入することにより、あるいは本発明の樹立効率改善因子と共に体細胞に接触させることにより、該体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, ERas, TclI
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2（またはKlf5）, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008)を参照）
(15) Oct3/4, c-Myc（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 14152-14157 (2010) を参照)
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4 (Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009))
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
　上記(1)-(24)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。さらに上記(1)-(24)においてc-MycまたはLin28を核初期化物質として含む場合、c-MycまたはLin28に代えてそれぞれL-MycまたはLin28Bを用いることもできる。
　また、上記(1)-(24)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(24)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
　これらの組み合わせの中で、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-MycもしくはL-Myc, Nanog, Lin28もしくはLin28BおよびSV40LTから選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
　とりわけ、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、c-Mycを用いない初期化因子の組み合わせが好ましい。例えばOct3/4, Sox2およびKlf4の3因子の組み合わせ（即ち、上記(9)）、Oct3/4, Sox2, Klf4およびL-Mycの4因子の組み合わせ（即ち、上記(2)）、またはこれらの組み合わせを含みかつc-Mycを含まない組み合わせを例示することができる。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Sox2およびKlf4の3因子、Oct3/4, Sox2, Klf4およびL-Mycの4因子のほか、Oct3/4, Sox2, Klf4およびc-Mycの4因子、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc/L-Mycおよび／またはNanogおよび／またはLin28/Lin28Bの5または6因子、さらにSV40 Large Tを加えた6または7因子などを例示することができる。
　上記の各タンパク性因子のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28B、Esrrb、Esrrg、L-Mycのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子名　　マウス　　　　　ヒト　　　
Lin28　　　 NM_145833　　　 NM_024674
Lin28b　　　NM_001031772　　NM_001004317
Esrrb　　　 NM_011934　　　 NM_004452
Esrrg　　　 NM_011935　　　 NM_001438
L-Myc　　　 NM_008506　　　 NM_001033081
　核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、上記本発明の核酸性樹立効率改善因子の場合と同様にして、ウイルスベクター、エピゾーマルベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。必要に応じて、上記Cre-loxPシステムやpiggyBacトランスポゾンシステムを利用することもできる。尚、核初期化物質として2以上のタンパク性因子をコードする核酸を細胞に導入する場合、各核酸を別個のベクターに担持させてもよいし、複数の核酸をタンデムに繋いでポリシストロニックベクターとすることもできる。後者の場合、効率的なポリシストロニック発現を可能にするために、口蹄疫ウイルスの2A self-cleaving peptideを各核酸の間に連結することが望ましい（Science, 322, 949-953, 2008など参照）。
　核初期化物質の体細胞への接触は、(a) 該物質がタンパク性因子である場合、上記本発明のタンパク性樹立効率改善因子と同様にして、(b) 該物質が(a)のタンパク性因子をコードする核酸である場合、上記本発明の核酸性樹立効率改善因子と同様にして、それぞれ実施することができる。
 (d) 他のiPS細胞の樹立効率改善物質
　従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記本発明の樹立効率改善因子に加え、他の樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
　他のiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸（VPA）、トリコスタチンA（TSA）、酪酸ナトリウム（Cell Stem Cell, 7: 651-655 (2010)）、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine (5’azaC)）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNA、shRNA、ドミナントネガティブ体など (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008); Nature 460, 1132-1135 (2009))）、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤; PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295 (以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）、3’-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) acitvator（例、PS48 (Cell Stem Cell, 7: 651-655 (2010)) など）、GLISファミリーメンバー（例、GLIS1 (Nature, 474: 225-229 (2011)) 、WO2010/098419など）等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
　尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質およびiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
　iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合に応じて、本発明の樹立効率改善因子についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。一方、該物質が(c) 低分子化合物である場合、該物質の体細胞への接触は、該因子を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたは他の哺乳動物より単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地（改善因子としてKSRを用いない場合は、約5～20%の胎仔ウシ血清を含んでもよい）など）中に、該溶液を因子濃度が上記の範囲となるように添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。接触期間は体細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておくこともできる。
　本発明の樹立効率改善因子を含む、iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
 (e) 培養条件による樹立効率の改善
　体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる（Cell Stem Cell., 5(3): 237-241 (2009); WO2010/013845を参照）。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、または5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など）、または1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
　細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
　低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への本発明の樹立効率改善因子および核初期化物質の接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に本発明の樹立効率改善因子および核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2,3,4,5,6,7,8または9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
　低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上または10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下または30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
　さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期および好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
 (f) iPS細胞の選択および確認
　本発明の樹立効率改善因子と核初期化物質（および他のiPS細胞の樹立効率改善物質）とを接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、通常、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。しかしながら、本発明の樹立効率改善因子を体細胞に接触させた場合、bFGFの非存在下でもbFGF存在下と同程度のヒトiPS細胞コロニーを得ることができる。
　また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、本発明の樹立効率改善因子および核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
　iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanogまたはOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子および／またはレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性および／またはレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）由来のMEFやTTF、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）由来のMEFやTTF等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。
　選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）および目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、アルカリフォスファターゼ染色や、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
　Rasタンパク質、Ras標的因子またはRas活性化因子をコードする核酸を体細胞に導入した場合、得られるiPS細胞は、当該外来性核酸を含む点で、従来公知のiPS細胞とは異なる新規細胞である。特に、当該外来性核酸がレトロウイルスやレンチウイルス等を用いて体細胞に導入された場合、当該外来性核酸は通常、得られるiPS細胞のゲノム中に組み込まれているので、外来性核酸を含むという形質は安定に保持される。
 (g) iPS細胞の用途
　このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞などの多能性幹細胞で報告されている分化誘導法（例えば、神経幹細胞への分化誘導法としては、特開2002-291469、膵幹様細胞への分化誘導法としては、特開2004-121165、造血細胞への分化誘導法としては、特表2003-505006に記載される方法などがそれぞれ例示される。この他にも、胚葉体の形成による分化誘導法としては、特表2003-523766に記載の方法などが例示される。）を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１：RasファミリーがヒトiPS細胞樹立に及ぼす効果の検討
　Rasファミリー（Nras、Hras、Kras及びEras）がiPS細胞の樹立に効果を及ぼすか否かを検討した。
　成人（白人女性、73歳）の皮膚由来線維芽細胞（HDF：細胞名1503）に対して、Takahashi, K.ら, Cell, 131:861-872 (2007)に記載の方法に従い、レンチウイルス(pLenti6/UbC-Slc7a1)を用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。この細胞（1×105個/well、6 well plate）に対して、Takahashi, K.ら, Cell, 131:861-872 (2007) に記載の方法に従い、以下の遺伝子をレトロウイルスで導入し、生じたiPS細胞コロニー数を4遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）導入の場合と比較した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nras
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Hras
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Kras
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Eras
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, SVLS
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, SSVA
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, N17
　ここで「V12」とはHRasの12番目のグリシンをバリンに置換したHRasの恒常的活性型変異体を指す。V12はRasの3つのシグナル伝達経路であるMAPキナーゼ経路、PI3キナーゼ経路、及びRal経路（RalGEF経路）のいずれの経路も活性化することが知られている。
　また「SVLS」とはH-RasのC末端4アミノ酸CVLSをSVLSに置換したことにより細胞膜への局在が不能となった不活性型変異体であり、「SSVA」とはE-RasのC末端4アミノ酸CSVAをSSVAに置換したことにより細胞膜への局在が不能となった不活性型変異体である。
　また「N17」とはH-Rasの17番目のセリンをアスパラギンに置換した不活性型変異体（ドミナントネガティブ変異体）である。
　ウイルス感染から7日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った（2.5×105個/100 mmディッシュ）。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）を用いた。感染10日後から霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL) に4 ng/mlの組換えヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。感染から24日目にiPS細胞コロニー数を測定し、4遺伝子導入により得られたコロニー数を１とした場合（図中Red）の倍率変化（Fold change）を図1に示す。図１は3回の実験の平均値である。4遺伝子にErasを加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数が劇的に増加した。ErasはPI3キナーゼ経路を活性化することが知られていることから、Rasのシグナル伝達経路の中でも特にPI3キナーゼ経路の活性化がiPS細胞の樹立促進に寄与していることが示唆された。また他のRas（Nras、Hras、Kras）を加えた場合も、ErasほどではないがヒトiPS細胞コロニー数の増加が認められた。
実施例2：Rasのシグナル伝達経路がヒトiPS細胞樹立に及ぼす効果の検討(1)
　Rasのシグナル伝達経路であるMAPキナーゼ経路、PI3キナーゼ経路、及びRal経路（RalGEF経路）の3つの経路のうち、いずれのシグナル伝達経路の活性化がiPS細胞樹立に効果を及ぼすのか検討を行った。実験は以下の組み合わせを用い、実施例１と同様の手法で行った。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nras
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Hras
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Kras
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Eras
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12T35S
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12Y40C
　ここで「V12T35S」とはHRasの12番目のグリシンをバリンに置換し、かつ35番目のスレオニンをセリンに置換することにより、MAPキナーゼ経路が選択的に恒常的活性化された変異体である。
　また「V12E37G」とはHRasの12番目のグリシンをバリンに置換し、かつ37番目のグルタミン酸をグリシンに置換することにより、Ral経路が選択的に恒常的活性化された変異体である。
　また「V12Y40C」とはHRasの12番目のグリシンをバリンに置換し、かつ40番目のチロシンをシステインに置換することにより、PI3キナーゼ経路が選択的に恒常的活性化された変異体である。
　ウイルス感染から7日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った（2.5×105個/100 mmディッシュ）。感染10日後から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlの組換えヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。感染から24日目にiPS細胞コロニー数を測定し、4遺伝子導入により得られたコロニー数を１とした場合（図中Red）の倍率変化（Fold change）を図2に示す。図2は3回の実験の平均値である。実施例1と同様に4遺伝子にErasを加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数が劇的に増加した。またV12E37G又はV12Y40Cを加えた場合も、同様にヒトiPS細胞コロニー数の劇的な増加が認められた。V12T35Sを加えた場合は効果は低かった。以上の結果より、PI3キナーゼ経路及びRal経路の活性化がiPS細胞の樹立促進に寄与していることが示された。
実施例3： 異なる細胞に対する効果の検討
　6歳の日本人女性の皮膚由来線維芽細胞（細胞名：TIG120）及び68歳の日本人女性の皮膚由来線維芽細胞（細胞名：1616）を用いて、前記実施例と同様の実験を以下の組み合わせで行った。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Eras
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12Y40C (図3では単に「Y40C」と表記）
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Myr-PI3K（図3では単に「M-PI3K」と表記）
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, PI3K-CaaX（図3では単に「C-PI3K」と表記）
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G (図3では単に「E37G」と表記）
　ここで「Myr-PI3K（M-PI3K）」とは、N末端にミリストイル化シグナル配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のPI3キナーゼである。
　また「PI3K-CaaX（C-PI3K）」とは、C末端にCaaxモチーフ配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のPI3キナーゼ触媒サブユニットである。
　ウイルス感染から7日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った（0.5×105個/100 mmディッシュ）。感染10日後から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlの組換えヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。感染から24日目のiPS細胞コロニー数を図3に示す。図3は3回の実験の平均値である。実施例2と同様に4遺伝子にEras、V12Y40C（Y40C）又はV12E37G（E37G）を加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数の増加が認められた。またPI3キナーゼの恒常的活性体を加えた場合も、同様にコロニー数の増加が認められた。以上の結果より、PI3キナーゼ経路及びRal経路の活性化がiPS細胞の樹立促進に寄与することが確認され、またHDF1503以外の細胞にも同様の効果を示すことが確認された。
実施例4：Rasのシグナル伝達経路がヒトiPS細胞樹立に及ぼす効果の検討(2)
　Rasの各シグナル伝達経路の活性化がiPS細胞樹立に及ぼす効果につき、前記実施例と同様の実験を以下の組み合わせで検討した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nras
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Hras
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Kras
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Eras
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12T35S
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Raf-CaaX
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, RalGDS-CaaX
　ここで「Raf-CaaX」とはMAPキナーゼ経路に存在するMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MAPKKK)のC末端にCaaxモチーフ配列を付加したことにより膜局在性となった恒常的活性化体である。
　また「RalGDS-Caax」とはRasサブファミリーに属するG蛋白であるRalを活性化する、Rasの標的タンパク質のC末端にCaaxモチーフ配列を付加したことにより膜局在性となった恒常的活性化体である。
　ウイルス感染から7日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った（2.5×105個/100 mmディッシュ）。感染10日後から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlの組換えヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。感染から24日目にiPS細胞コロニー数を測定し、4遺伝子導入により得られたコロニー数を１とした場合（図中Red）の倍率変化（Fold change）を図4に示す。図4は3回の実験の平均値である。
　実施例2及び3と同様に4遺伝子にV12E37Gを加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数が劇的に増加し、またRal活性化因子であるRalGDSの恒常的活性化体を加えた場合も同様の効果が認められたことから、Ral経路の活性化がiPS細胞の樹立促進に寄与することが確認された。一方、V12T35SやRafの恒常的活性化体を加えた場合は効果が低かったことから、MAPキナーゼ経路はiPS細胞の樹立にあまり寄与していないことが示唆された。
実施例5：Rasのシグナル伝達経路がヒトiPS細胞樹立に及ぼす効果の検討(3)
　Rasの各シグナル伝達経路の活性化がiPS細胞樹立に及ぼす効果につき、前記実施例と同様の実験を以下の組み合わせで検討した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12（図5では「HRasV12」と表記）
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, N17 (図5では「HRasN17」と表記）
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12T35S（図5では「HRasV12/S35」と表記）
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G（図5では「HRasV12/G37」と表記）
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12Y40C（図5では「HRasV12/C40」と表記）
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Raf-CaaX
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, RalGDS-CaaX
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, PI3K-CaaX（図5では「p110-CaaX」と表記）
　ウイルス感染から7日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った（2.5×105個/100 mmディッシュ）。感染8日後から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlの組換えヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。感染から24日目のiPS細胞コロニー数を図5に示す。図5は3回の実験の平均値である。実施例1～4と同様に、4遺伝子にV12E37G、V12Y40C、RalGDS-CaaXまたはPI3K-CaaXを加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数の顕著な増加が認められた。以上の結果より、PI3キナーゼ経路およびRal経路の活性化がiPS細胞の樹立促進に寄与することが確認され、一方MAPキナーゼ経路はiPS細胞の樹立にあまり寄与していないことが示唆された。
実施例6：Rasの各シグナル伝達経路の関連性の検討
　iPS細胞の樹立において、PI3キナーゼ経路、Ral経路およびMAPキナーゼ経路がそれぞれ相互に関連しているのか、それとも独立した経路であるのかを検討した。
　実験は実施例5と同様の方法で行った。結果を図6に示す。図6は3回の実験の平均値である。ERasにV12Y40Cを加えた場合（図6中ERas+HRasV12/C40）は、いずれもPI3キナーゼ経路を活性化する因子であることから相加効果（増強効果）は認められなかった。一方、ERasにV12E37Gを加えた場合（図6中ERas+HRasV12/G37）、およびV12E37GにV12Y40Cを加えた場合（図6中HrasV12/G37+C40）は、いずれも相加効果（増強効果）が認められたことから、Ral経路とPI3キナーゼ経路は、別々の独立した作用によりiPS細胞樹立促進に関与していることが示された。
実施例7：bFGF非存在下での効果の検討
　bFGF非存在下でのRaf-CaaX、RalGDS-CaaXおよびPI3K-CaaXの効果を検討した。実験は実施例5や6と同様にして行った。結果を図7に示す。4遺伝子にRalGDS-CaaXを加えた場合に、bFGF非存在下でもbFGF存在下と同程度のコロニー数が観察された。
実施例8：AKTがヒトiPS細胞樹立に及ぼす効果の検討
　PI3Kの下流シグナルとしてのAKTがiPS細胞の樹立に効果を及ぼすか否か、およびAKTによるiPS細胞の樹立にc-MYCまたはGSK3βが影響を及ぼすか否かを検討した。
　前記実施例1と同様にヒト皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616、Cell applications社から購入）へ以下の遺伝子を導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, GSK3β S9A
　ここで「Myr-AKT1」とは、N末端にミリストイル化シグナル配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のAKT1である。
　また「c-MYC shRNA」とは、c-MYCを標的としたshRNAであり、ここでは、Addgene社より購入したpRetrosuper Myc shRNA （Plasmid 15662）を用いた。
　また「GSK3β S9A」とは、GSK3βの9番目のセリンをアラニンに置換することにより、プロテアーゼにより分解されない恒常活性型の変異体である。
　感染から32日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図8Aに示す。
　Myr-AKT1を加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数が有意に増加した。また、この効果は、c-MYCのshRNAを加えることでなくなったことから、AKT1の活性化によるiPS細胞の樹立促進にはc-MYCが必須であることが示された。一方、GSK3β S9Aでは影響を受けていないことから、AKT1の下流シグナルとしてGSK3βのリン酸化は関与していないことが示された。
　また、培養条件を変え（5×105個/well）、同じくヒト皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616、Cell applications社から購入）へ以下の遺伝子を導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, p110-Caax
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, p110-KD
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, AKT1-KD
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, PTEN shRNA
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, TCL1
　ここで「p110-Caax」とは、前述した「PI3K-CaaX」と同等物である。
　また「p110-KD」とは、キナーゼドメインを欠損させた変異体である不活性化型PI3Kである。
　また「AKT1-KD」とは、キナーゼドメインを欠損させた変異体である不活性化型AKT1である。
　また「PTEN shRNA」とは、PI3K経路を抑制するPTEN（phosphatase and tensin homolog）に対するshRNAであり、ここでは、Addgene社より購入したpMKO.1 puro PTEN shRNA（Plasmid 10669）を用いた。
　感染から7日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図8Bに示す。
　先の実験と同様に、Myr-AKT1を加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数が有意に増加した。また、AKT1の活性化因子であるTCL1を加えることでも同様の効果が認められたことから、iPS細胞の樹立促進にはAKT1の活性化が関与していることが示唆された。
実施例9：AKT関連のシグナルがヒトiPS細胞樹立に及ぼす効果の検討
　AKT関連のシグナル（PDK1、GSK3β、Wnt）がiPS細胞の樹立効率に及ぼす影響を検討した。
　前記実施例1と同様に皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616）へ以下の遺伝子を各低分子化合物の存在下で導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, PS48
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, CHIR99021
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Wnt3a
　ここで「PS48」とは、PDK1のPIF結合ポケット部位に選択的に結合し、PDK1を活性化する薬剤である。本実験では、10 μMを培地へ添加した。Sigma社から購入し使用した。
　また「CHIR99021」とは、GSK3βに対する高度な選択性を示す阻害剤である。本実験では、1 μMを培地へ添加したStemgent社から購入し使用した。
　また「Wnt3a」は、R&D systems社より購入し、10 ng/mlを培地へ添加した。
　感染から32日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図9に示す。
　PS48およびWnt3aを加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数が有意に増加した。一方、CHIR99021を加えた場合は、iPS細胞コロニー数が減少傾向であった。以上より、PI3Kシグナルの下流であるPDK1およびWntシグナルは、iPS細胞の樹立促進へ関与するが、GSK3βのリン酸化の阻害はiPS細胞の樹立へ関与していないことが示された。
実施例10：AKTファミリーおよびmTORシグナルがヒトiPS細胞樹立に及ぼす効果の検討
　前記実施例1と同様に皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616）へ以下の遺伝子を導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, p110-Caax
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, PTEN shRNA
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, AKT1 K179M
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1#2
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT2
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT3
9) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-SGK1
10) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, SGK1 K127M
11) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-ILK
12) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, ILK E359K
13) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-PDK1
14) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, GSK3 S9A
15) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Rheb
16) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, S6K1 T389E
17) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, FKBP12
　ここで「p110-Caax」とは、前述した「PI3K-CaaX」と同等物である。
　また「PTEN shRNA」とは、PI3K経路を抑制するPTEN（phosphatase and tensin homolog）に対するshRNAであり、ここでは、Addgene社より購入したpMKO.1 puro PTEN shRNA（Plasmid 10669）を用いた。
　また「Myr-AKT1#2」とは、Myr-AKT1とは基本骨格のプラスミドが異なる恒常活性化型のAKT1である 。
　また「AKT1 K179M」とは、キナーゼ領域が変異した不活性型のドミナントネガティブAKT1のことである。
　また「Myr-AKT2」とは、N末端にミリストイル化シグナル配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のAKT2である。
　また「Myr-AKT3」とは、N末端にミリストイル化シグナル配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のAKT3である。
　また「Myr-SGK1」とは、mTORC2/SGK1経路において重要な制御因子でありインスリン情報伝達系におけるプロテインキナーゼであるSGK1 （Serum/glucocorticoid regulated kinase）のN末端にミリストイル化シグナル配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のSGK1である。
　また「SGK1 K127M 」とは、SGK1の127番目のリジンをメチオニンに置換することにより、キナーゼ領域が変異したドミナントネガティブ型のSGK1である。
　また「Myr-ILK」とは、PI3KシグナルにおいてAKTの上流に位置するセリン/スレオニンキナーゼであるILK（Integrin Linked Kinase： インテグリン結合キナーゼ）のN末端にミリストイル化シグナル配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のILKである。ILKはAKTの上流にあるPDKと結合することで、PI3K/AKT経路を阻害する。
　また「ILK E359K」とは、ILKの359番目のグルタミン酸をリジンに置換することにより、キナーゼ領域が変異したドミナントネガティブ型のILKである。
　また「Myr-PDK1」とは、PDKサブファミリー内に含まれるPDK1のN末端にミリストイル化シグナル配列を付加したことにより膜に局在する恒常的活性型のPDK1である。
　また「S6K1 T389E」とは、S6K1の389番目のスレオニンをグルタミン酸に置換することにより、恒常活性型のS6K1変異体である。
　感染から32日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図10に示す。
　実施例3と同様に、p110-Caaxを加えることでiPS細胞コロニー数の増加が認められた。同様に、PTEN shRNAでもiPS細胞コロニー数の増加が認められたことから、PI3KはiPS細胞の樹立促進に重要であることが示された。実施例8と同様に、Myr-AKT1ではiPS細胞コロニー数の増加が認められ、AKTファミリーである、AKT2およびAKT3でも同様の結果が得られた。
　また、Rheb、S6K1 T389Eを加えることにより、ヒトiPS細胞コロニー数が劇的に増大した。Rhebは、mTORを活性化する因子であり、一方でS6K1はmTORの下流因子であることから、mTORシグナル経路の活性化が、iPS細胞の樹立促進に寄与していることが示唆された。
実施例11： mTORシグナル関連遺伝子のヒトiPS細胞樹立に及ぼすc-MYCの検討
　前記実施例1と同様に皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616）へ以下の遺伝子を導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, c-MYC shRNA
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Rheb
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Rheb, c-MYC shRNA
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, S6K1 T389E
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, S6K1 T389E, c-MYC shRNA
　感染から32日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図11Aに示す。
いずれの場合でも、c-MYC shRNAを加えることでiPS細胞の樹立促進効果がなくなることから、これらの遺伝子によるiPS細胞の樹立促進にはc-MYCが必須であることが示された。
　さらに、皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616）へMock、Myr-AKT1、Rheb、S6K1 T389Eおよびp53 shRNA導入して7日後の細胞内タンパク質を定法により回収し、Western blotによりc-MYC、p-AKT、AKT、p-S6K1、S6K1、p-TSC2およびTSC2の発現量を確認した。
　ここで「p53 shRNA」は、p53に対するshRNAであり、Hong H, et al., Nature. 460:1132-1135 (2009)に記載の配列を用いた。
　結果を図11Bに示す。
　Myr-AKT1、RhebおよびS6K1 T389Eの導入によりc-MYCの発現量が上昇したことが確認された。このことより、Myr-AKT1、RhebおよびS6K1 T389Eはc-MYCの発現上昇を介してiPS細胞の樹立促進を行っている機序が示唆された。
　また、p53 shRNAの導入によりリン酸化型のAKTが増加している。Hong H らはp53の阻害によりiPS細胞の樹立促進をすることを示していることから、p53の阻害はAKTのリン酸化を介してiPS細胞の樹立を促進していることが示唆された。
実施例12： p53の阻害およびGLIS1の導入によるヒトiPS細胞樹立促進に及ぼすAKT1の効果の検討
　前記実施例1と同様にヒト皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616）へ以下の遺伝子を導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, p53 shRNA
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, p53 shRNA
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, p53 shRNA
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, p53 shRNA
　感染から32日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図12Aに示す。
　Myr-AKT1およびp53 shRNAを同時に加えることで、iPS細胞コロニー数の増加が認められた。従って、p53shRNAとAKT1の導入はiPS細胞の樹立促進の相乗効果を有することが示された。また、c-MYC shRNAによりいずれの場合でも、iPS細胞コロニー数が減少したことから、これらの効果はc-MYCを介した作用であることが示唆された。
　さらに、ヒト皮膚細胞由来線維芽細胞（HDF：細胞名1616）へ以下の遺伝子を導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, GLIS1
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, GLIS1
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, GLIS1
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, GLIS1
　感染から32日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図12Bに示す。
Myr-AKT1およびGLIS1を同時に加えることで、iPS細胞コロニー数の増加が認められた。従って、GLIS1とAKT1の導入はiPS細胞の樹立促進の相乗効果を有することが示された。また、c-MYC shRNAによりいずれの場合でも、iPS細胞コロニー数が減少したことから、これらの効果はc-MYCを介した作用であることが示唆された。
　さらに、他の細胞株において、同様の効果を調べるため、ヒト歯髄細胞（DP：細胞名DP31）へ以下の遺伝子を導入した。
1) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, Mock
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, p53 shRNA
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, GLIS1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, Mock
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, p53 shRNA
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, GLIS1
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, Mock
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, p53 shRNA
9) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, GLIS1
10) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, Mock
11) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, p53 shRNA
12) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, GLIS1
　感染から32日目に、iPS細胞コロニー数を測定した結果を図12Cに示す。
　上記の結果と同様に、Myr-AKT1およびp53 shRNA又はMyr-AKT1およびGLIS1を同時に加えることで、iPS細胞コロニー数の増加が認められた。これより、体細胞種に関わらずAKT1の導入およびp53 の阻害又はAKT1およびGLIS1の導入によるiPS細胞の樹立促進の相乗効果を有することが示された。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は米国仮特許出願No. 61/419,320を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。

Claims (50)

  1. 　人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6Kからなる群より選択される1以上のタンパク質の活性化型のレベルを増大させることを含む、方法。
  2. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを含む、請求項1記載の方法。
  3. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項2記載の方法。
  4. 　RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項2又は3記載の方法。
  5. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項3又は4記載の方法。
  6. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項3又は4記載の方法。
  7. 　PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項3記載の方法。
  8. 　AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項2又は3記載の方法。
  9. 　AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項3又は8記載の方法。
  10. 　p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、請求項2記載の方法。
  11. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤。
  12. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項11記載の剤。
  13. 　RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項11又は12記載の剤。
  14. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項12又は13記載の剤。
  15. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項12又は13記載の剤。
  16. 　PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項12記載の剤。
  17. 　AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項11又は12記載の剤。
  18. 　AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項12又は17記載の剤。
  19. 　p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、請求項11記載の剤。
  20. 　体細胞に核初期化物質と、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子とを接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法。
  21. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項20記載の方法。
  22. 　RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項20又は21記載の方法。
  23. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項21又は22記載の方法。
  24. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項21又は22記載の方法。
  25. 　PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項21記載の方法。
  26. 　AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項20又は21記載の方法。
  27. 　AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項21又は26記載の方法。
  28. 　p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、請求項20記載の方法。
  29. 　核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
  30. 　核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、請求項20記載の方法。
  31. 　核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び／又はNanog及び／又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、請求項20記載の方法。
  32. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子と、核初期化物質とを含有してなる、人工多能性幹細胞の誘導剤。
  33. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項32記載の剤。
  34. 　RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項32又は33記載の剤。
  35. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項33又は34記載の剤。
  36. 　RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び／又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項33又は34記載の剤。
  37. 　核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、請求項32記載の剤。
  38. 　PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項33記載の剤。
  39. 　AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項32又は33記載の剤。
  40. 　AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項33又は38記載の剤。
  41. 　p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、請求項32記載の剤。
  42. 　核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、請求項32記載の剤。
  43. 　核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び／又はNanog及び／又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、請求項32記載の剤。
  44. 　Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1又はS6Kをコードする外来性核酸を含む、人工多能性幹細胞。
  45. 　前記外来性核酸がゲノムに組み込まれている、請求項44記載の細胞。
  46. 　下記の工程：
    (1) 請求項20～31のいずれか1項に記載の方法により人工多能性幹細胞を製造する工程、及び
    (2) 上記工程(1)で得られた人工多能性幹細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させる工程、
    を含む、体細胞の製造方法。
  47. 　人工多能性幹細胞の樹立効率改善のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用。
  48. 　人工多能性幹細胞の製造のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用であって、該因子を核初期化物質とともに体細胞に接触させることを特徴とする、使用。
  49. 　体細胞の製造における、請求項44又は45記載の人工多能性幹細胞の使用。
  50. 　体細胞の製造における細胞ソースとしての、請求項44又は45記載の人工多能性幹細胞。
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