JPWO2012074117A1 - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、Takahashiら(非特許文献4)は、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した。一方、Yuら(非特許文献5)は、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した。このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。
[1] 人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6Kからなる群より選択される1以上のタンパク質の活性化型のレベルを増大させることを含む、方法。
[2] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1およびS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを含む、上記[1]記載の方法。
[3] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[2]記載の方法。
[4] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[2]又は[3]記載の方法。
[5] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[3]又は[4]記載の方法。
[6] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[3]又は[4]記載の方法。
[7] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[3]記載の方法。
[8] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[2]又は[3]記載の方法。
[9] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[3]又は[8]記載の方法。
[10] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、上記[2]記載の方法。
[11] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤。
[12] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[11]記載の剤。
[13] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[11]又は[12]記載の剤。
[14] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[12]又は[13]記載の剤。
[15] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[12]又は[13]記載の剤。
[16] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[12]記載の剤。
[17] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[11]又は[12]記載の剤。
[18] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[12]又は[17]記載の剤。
[19] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、上記[11]記載の剤。
[20] 体細胞に核初期化物質と、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子とを接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法。
[21] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[20]記載の方法。
[22] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[20]又は[21]記載の方法。
[23] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[21]又は[22]記載の方法。
[24] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[21]又は[22]記載の方法。
[25] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[21]記載の方法。
[26] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[20]又は[21]記載の方法。
[27] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[21]又は[26]記載の方法。
[28] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、上記[20]記載の方法。
[29] 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、上記[20]記載の方法。
[30] 核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、上記[20]記載の方法。
[31] 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び/又はNanog及び/又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、上記[20]記載の方法。
[32] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子と、核初期化物質とを含有してなる、人工多能性幹細胞の誘導剤。
[33] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、上記[32]記載の剤。
[34] RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、上記[32]又は[33]記載の剤。
[35] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[33]又は[34]記載の剤。
[36] RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、上記[33]又は[34]記載の剤。
[37] 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、上記[32]記載の剤。
[38] PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする上記[33]記載の剤。
[39] AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、上記[32]又は[33]記載の剤。
[40] AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、上記[33]又は[39]記載の剤。
[41] p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、上記[32]記載の剤。
[42] 核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、上記[32]記載の剤。
[43] 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び/又はNanog及び/又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、上記[32]記載の剤。
[44] Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1又はS6Kをコードする外来性核酸を含む、人工多能性幹細胞。
[45] 前記外来性核酸がゲノムに組み込まれている、上記[44]記載の細胞。
[46] 下記の工程:
(1) 上記[20]〜[31]のいずれかに記載の方法により人工多能性幹細胞を製造する工程、及び
(2) 上記工程(1)で得られた人工多能性幹細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させる工程、
を含む、体細胞の製造方法。
[47] 人工多能性幹細胞の樹立効率改善のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用。
[48] 人工多能性幹細胞の製造のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用であって、該因子を核初期化物質とともに体細胞に接触させることを特徴とする、使用。
[49] 体細胞の製造における、上記[44]又は[45]記載の人工多能性幹細胞の使用。
[50] 体細胞の製造における細胞ソースとしての、上記[44]又は[45]記載の人工多能性幹細胞。
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、ラット、イヌ等)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、及びそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本明細書において「活性化型Rasタンパク質のレベルを増大させる物質」とは、Rasファミリーに属する1以上のタンパク質において、活性化型(GTP結合型)として存在するタンパク質レベルを増大させることができるものであれば、いかなる物質であってもよい。すなわち、Rasタンパク質やそれをコードする核酸自体や、Rasタンパク質を不活性化型(GDP結合型)から活性化型に変換させる反応(GDP-GTP交換反応)を促進するか、或いはRasタンパク質を活性化型から不活性化型に変換させる反応(GTP加水分解反応)を阻害することにより、結果的に活性化型のRasタンパク質レベルを増大させる物質も、本明細書における「活性化型Rasタンパク質のレベルを増大させる物質」に含まれる。
本明細書における「Rasファミリーメンバー」とは、癌原遺伝子として同定されたHRas、KRas、NRasとの一次構造上の相同性により同定されたRasサブファミリータンパク質のうち、Raf、PI3キナーゼ及びRalGEFから選ばれる1以上の分子、好ましくはPI3キナーゼ及び/又はRalGEFを標的因子とし、活性化型Rasタンパク質の作用により上記因子の下流のシグナル伝達経路(即ち、Raf/MAPキナーゼ経路(MAPキナーゼ経路)、PI3キナーゼ経路、Ral経路)を活性化しうるタンパク質を意味する。好ましいRasファミリーメンバーの例としては、HRas、KRas、NRas、ERas等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明で用いられる「Rasの標的因子(エフェクター)」としては、PI3キナーゼ、RalGEF及びRafが挙げられる。
本発明で用いられる「Rasの標的因子(エフェクター)の下流シグナル因子」としては、AKTファミリーメンバー、Rheb及びS6Kが挙げられ、「Rasの標的因子(エフェクター)の下流シグナルの活性化因子」としては、TCL1が挙げられる。
受容体チロシンキナーゼが増殖因子などの細胞外シグナルの刺激を受けて活性化されると自己リン酸化を起こし、これを認識するGrb2やShcなどのアダプタータンパク質を介してRasGEFであるSos、RasGRF、RasGRF2、RasGRP、SmgGDS、Vav、C3G等が細胞膜にリクルートされ、それによって細胞膜に局在するRasタンパク質が活性化される。従って、RasGEFやアダプタータンパク質を体細胞に導入することによっても、Rasタンパク質の活性化を介してiPS細胞の樹立効率を改善することができる。
本発明のタンパク性樹立効率改善因子(Rasファミリーメンバー、Rasの標的因子(エフェクター)、Rasの標的因子(エフェクター)の下流シグナル因子、そのシグナルの活性化因子及びRas活性化因子)をコードする核酸(「本発明の核酸性樹立効率改善因子」という場合もある)は、上記した本発明におけるRasファミリーメンバー(例、HRas、KRas、NRas、ERas等)、Rasの標的因子(エフェクター)(例、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf等)、Rasの標的因子(エフェクター)の下流シグナル因子(例、AKT1、AKT2、AKT3、Rheb、S6K等)、Rasの標的因子(エフェクター)の下流シグナルの活性化因子(例、TCL1等)又はRas活性化因子(例、RasGEF、受容体チロシンキナーゼアダプタータンパク質等)をコードするものであれば特に制限はない。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞に導入することにより、あるいは本発明の樹立効率改善因子と共に体細胞に接触させることにより、該体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), L-Mycで置換可能である。)
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, ERas, TclI
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
(以上、WO 2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2(またはKlf5), c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。)
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28(Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照)
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照)
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28(Cell Research (2008) 600-603を参照)
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照)
(14) Oct3/4, Klf4(Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008)を参照)
(15) Oct3/4, c-Myc(Nature 454:646-650 (2008)を参照)
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 14152-14157 (2010) を参照)
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4 (Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009))
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT(Science, 324: 797-801 (2009)を参照)
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
L-Myc NM_008506 NM_001033081
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記本発明の樹立効率改善因子に加え、他の樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる(Cell Stem Cell., 5(3): 237-241 (2009); WO2010/013845を参照)。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、または5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など)、または1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
本発明の樹立効率改善因子と核初期化物質(および他のiPS細胞の樹立効率改善物質)とを接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor(LIF)を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、通常、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および/または幹細胞因子(SCF)を添加することが望ましい。しかしながら、本発明の樹立効率改善因子を体細胞に接触させた場合、bFGFの非存在下でもbFGF存在下と同程度のヒトiPS細胞コロニーを得ることができる。
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞などの多能性幹細胞で報告されている分化誘導法(例えば、神経幹細胞への分化誘導法としては、特開2002-291469、膵幹様細胞への分化誘導法としては、特開2004-121165、造血細胞への分化誘導法としては、特表2003-505006に記載される方法などがそれぞれ例示される。この他にも、胚葉体の形成による分化誘導法としては、特表2003-523766に記載の方法などが例示される。)を利用して、iPS細胞から種々の細胞(例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等)への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞(即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など)に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞(例、肝細胞)は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
Rasファミリー(Nras、Hras、Kras及びEras)がiPS細胞の樹立に効果を及ぼすか否かを検討した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Hras
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Kras
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Eras
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, SVLS
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, SSVA
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, N17
Rasのシグナル伝達経路であるMAPキナーゼ経路、PI3キナーゼ経路、及びRal経路(RalGEF経路)の3つの経路のうち、いずれのシグナル伝達経路の活性化がiPS細胞樹立に効果を及ぼすのか検討を行った。実験は以下の組み合わせを用い、実施例1と同様の手法で行った。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Hras
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Kras
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Eras
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12T35S
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12Y40C
6歳の日本人女性の皮膚由来線維芽細胞(細胞名:TIG120)及び68歳の日本人女性の皮膚由来線維芽細胞(細胞名:1616)を用いて、前記実施例と同様の実験を以下の組み合わせで行った。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12Y40C (図3では単に「Y40C」と表記)
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Myr-PI3K(図3では単に「M-PI3K」と表記)
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, PI3K-CaaX(図3では単に「C-PI3K」と表記)
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G (図3では単に「E37G」と表記)
Rasの各シグナル伝達経路の活性化がiPS細胞樹立に及ぼす効果につき、前記実施例と同様の実験を以下の組み合わせで検討した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Hras
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Kras
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Eras
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12T35S
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Raf-CaaX
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, RalGDS-CaaX
Rasの各シグナル伝達経路の活性化がiPS細胞樹立に及ぼす効果につき、前記実施例と同様の実験を以下の組み合わせで検討した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, N17 (図5では「HRasN17」と表記)
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12T35S(図5では「HRasV12/S35」と表記)
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12E37G(図5では「HRasV12/G37」と表記)
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, V12Y40C(図5では「HRasV12/C40」と表記)
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Raf-CaaX
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, RalGDS-CaaX
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, PI3K-CaaX(図5では「p110-CaaX」と表記)
iPS細胞の樹立において、PI3キナーゼ経路、Ral経路およびMAPキナーゼ経路がそれぞれ相互に関連しているのか、それとも独立した経路であるのかを検討した。
bFGF非存在下でのRaf-CaaX、RalGDS-CaaXおよびPI3K-CaaXの効果を検討した。実験は実施例5や6と同様にして行った。結果を図7に示す。4遺伝子にRalGDS-CaaXを加えた場合に、bFGF非存在下でもbFGF存在下と同程度のコロニー数が観察された。
PI3Kの下流シグナルとしてのAKTがiPS細胞の樹立に効果を及ぼすか否か、およびAKTによるiPS細胞の樹立にc-MYCまたはGSK3βが影響を及ぼすか否かを検討した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, GSK3β S9A
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, p110-Caax
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, p110-KD
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, AKT1-KD
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, PTEN shRNA
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, TCL1
AKT関連のシグナル(PDK1、GSK3β、Wnt)がiPS細胞の樹立効率に及ぼす影響を検討した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, CHIR99021
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Wnt3a
前記実施例1と同様に皮膚細胞由来線維芽細胞(HDF:細胞名1616)へ以下の遺伝子を導入した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, p110-Caax
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, PTEN shRNA
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, AKT1 K179M
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1#2
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT2
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT3
9) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-SGK1
10) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, SGK1 K127M
11) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-ILK
12) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, ILK E359K
13) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-PDK1
14) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, GSK3 S9A
15) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Rheb
16) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, S6K1 T389E
17) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, FKBP12
前記実施例1と同様に皮膚細胞由来線維芽細胞(HDF:細胞名1616)へ以下の遺伝子を導入した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, c-MYC shRNA
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Rheb
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Rheb, c-MYC shRNA
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, S6K1 T389E
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, S6K1 T389E, c-MYC shRNA
いずれの場合でも、c-MYC shRNAを加えることでiPS細胞の樹立促進効果がなくなることから、これらの遺伝子によるiPS細胞の樹立促進にはc-MYCが必須であることが示された。
Myr-AKT1、RhebおよびS6K1 T389Eの導入によりc-MYCの発現量が上昇したことが確認された。このことより、Myr-AKT1、RhebおよびS6K1 T389Eはc-MYCの発現上昇を介してiPS細胞の樹立促進を行っている機序が示唆された。
前記実施例1と同様にヒト皮膚細胞由来線維芽細胞(HDF:細胞名1616)へ以下の遺伝子を導入した。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, p53 shRNA
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, p53 shRNA
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, p53 shRNA
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, p53 shRNA
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, GLIS1
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, GLIS1
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, GLIS1
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, GLIS1
Myr-AKT1およびGLIS1を同時に加えることで、iPS細胞コロニー数の増加が認められた。従って、GLIS1とAKT1の導入はiPS細胞の樹立促進の相乗効果を有することが示された。また、c-MYC shRNAによりいずれの場合でも、iPS細胞コロニー数が減少したことから、これらの効果はc-MYCを介した作用であることが示唆された。
2) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, p53 shRNA
3) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Mock, GLIS1
4) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, Mock
5) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, p53 shRNA
6) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, GLIS1
7) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, Mock
8) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, p53 shRNA
9) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC shRNA, GLIS1
10) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, Mock
11) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, p53 shRNA
12) ヒト由来のOct3/4, Sox2, Klf4, Myr-AKT1, c-MYC shRNA, GLIS1
Claims (50)
- 人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6Kからなる群より選択される1以上のタンパク質の活性化型のレベルを増大させることを含む、方法。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを含む、請求項1記載の方法。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項2記載の方法。
- RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項2又は3記載の方法。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項3又は4記載の方法。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項3又は4記載の方法。
- PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項3記載の方法。
- AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項2又は3記載の方法。
- AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項3又は8記載の方法。
- p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、請求項2記載の方法。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項11記載の剤。
- RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項11又は12記載の剤。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項12又は13記載の剤。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項12又は13記載の剤。
- PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項12記載の剤。
- AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項11又は12記載の剤。
- AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項12又は17記載の剤。
- p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、請求項11記載の剤。
- 体細胞に核初期化物質と、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子とを接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項20記載の方法。
- RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項20又は21記載の方法。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項21又は22記載の方法。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項21又は22記載の方法。
- PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項21記載の方法。
- AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項20又は21記載の方法。
- AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項21又は26記載の方法。
- p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を体細胞に接触させることを更に含む、請求項20記載の方法。
- 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、請求項20記載の方法。
- 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び/又はNanog及び/又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、請求項20記載の方法。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される因子と、核初期化物質とを含有してなる、人工多能性幹細胞の誘導剤。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー及びS6Kが恒常的活性化型である、請求項32記載の剤。
- RasファミリーメンバーがERas、HRas、NRas及びKRasからなる群より選択される、請求項32又は33記載の剤。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路、Ral経路及びMAPキナーゼ経路から選択される1以上のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項33又は34記載の剤。
- RasファミリーメンバーがPI3キナーゼ経路及び/又はRal経路を恒常的に活性化する、請求項33又は34記載の剤。
- 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klf4ファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Linファミリーのメンバー及びNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、請求項32記載の剤。
- PI3キナーゼがAKT経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化することを特徴とする請求項33記載の剤。
- AKTファミリーメンバーがAKT1, AKT2及びAKT3からなる群より選択される、請求項32又は33記載の剤。
- AKTファミリーメンバーがmTOR経路のシグナル伝達経路を恒常的に活性化する、請求項33又は38記載の剤。
- p53阻害薬、GLISファミリーメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子を更に含有する、請求項32記載の剤。
- 核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、請求項32記載の剤。
- 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2並びにc-Myc若しくはL-Myc及び/又はNanog及び/又はLin28若しくはLin28B、或いはそれらをコードする核酸である、請求項32記載の剤。
- Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1又はS6Kをコードする外来性核酸を含む、人工多能性幹細胞。
- 前記外来性核酸がゲノムに組み込まれている、請求項44記載の細胞。
- 下記の工程:
(1) 請求項20〜31のいずれか1項に記載の方法により人工多能性幹細胞を製造する工程、及び
(2) 上記工程(1)で得られた人工多能性幹細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させる工程、
を含む、体細胞の製造方法。 - 人工多能性幹細胞の樹立効率改善のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用。
- 人工多能性幹細胞の製造のための、Rasファミリーメンバー、PI3キナーゼ、RalGEF、Raf、AKTファミリーメンバー、Rheb、TCL1及びS6K、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1以上の因子の使用であって、該因子を核初期化物質とともに体細胞に接触させることを特徴とする、使用。
- 体細胞の製造における、請求項44又は45記載の人工多能性幹細胞の使用。
- 体細胞の製造における細胞ソースとしての、請求項44又は45記載の人工多能性幹細胞。
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