WO2012060480A1 - 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물 그리고 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질의 스크린 방법 - Google Patents
암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물 그리고 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질의 스크린 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2012060480A1 WO2012060480A1 PCT/KR2010/007634 KR2010007634W WO2012060480A1 WO 2012060480 A1 WO2012060480 A1 WO 2012060480A1 KR 2010007634 W KR2010007634 W KR 2010007634W WO 2012060480 A1 WO2012060480 A1 WO 2012060480A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cells
- seq
- amino acid
- acid sequence
- oligopeptide
- Prior art date
Links
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims abstract description 143
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 title claims abstract description 143
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 14
- 239000013077 target material Substances 0.000 title claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 37
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 title abstract 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 233
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 222
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 207
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 118
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 118
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 27
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000002257 antimetastatic agent Substances 0.000 claims description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 claims description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 2
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 claims description 2
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 32
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 10
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 abstract description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 45
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 44
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 42
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 30
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 27
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 22
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 22
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 10
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 9
- 102100037942 Suppressor of tumorigenicity 14 protein Human genes 0.000 description 8
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 7
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 6
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 101000661807 Homo sapiens Suppressor of tumorigenicity 14 protein Proteins 0.000 description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101100075830 Caenorhabditis elegans mab-5 gene Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010091175 Matriptase Proteins 0.000 description 3
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 101000661808 Mus musculus Suppressor of tumorigenicity 14 protein homolog Proteins 0.000 description 2
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000010393 epithelial cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000001316 polygonal cell Anatomy 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000038022 Chenopodium capitatum Species 0.000 description 1
- 235000004391 Chenopodium capitatum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000798702 Homo sapiens Transmembrane protease serine 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032471 Transmembrane protease serine 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940125648 antineoplastic drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000009786 epithelial differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124866 human papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000003358 metastasis assay Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940030749 prostate cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003518 stress fiber Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21109—Matriptase (3.4.21.109)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
Definitions
- the present invention relates to an antigen peptide that inhibits cancer metastasis, a cancer metastasis vaccine comprising the same, and a composition for inhibiting and treating cancer metastasis, wherein the antigen peptide that inhibits cancer metastasis by migration and invasion of cancer cells, a cancer metastasis vaccine comprising the same It relates to a composition for inhibiting and treating cancer metastasis.
- the present invention reveals that epithelial cell migration target epithelial cells and transendothelial migration (TEM) of cancer cells expressing it have a strong correlation with cancer metastasis, and use such endothelial cell permeation migration assays.
- the present invention relates to providing a technology for screening cancer metastasis-related target substances and cancer metastasis inhibitors.
- cancer is the largest refractory disease and various genes and proteins are involved, and cancer occurrence, inhibition and metastasis are controlled by a complex signaling system.
- research has been conducted to develop various diagnostic or anticancer agents for early diagnosis or treatment of cancer.
- studies on selective diagnostic agents or target anticancer agents using specific molecular targets have been actively conducted.
- target anticancer agent using a target protein associated with cancer
- target anticancer agents such as Avastin and Herceptin
- Avastin and Herceptin can predict the therapeutic effect and have an excellent therapeutic effect with fewer side effects.
- Avastin and Herceptin can predict the therapeutic effect and have an excellent therapeutic effect with fewer side effects.
- Avastin and Herceptin can predict the therapeutic effect and have an excellent therapeutic effect with fewer side effects.
- Avastin and Herceptin can predict the therapeutic effect and have an excellent therapeutic effect with fewer side effects.
- Avastin and Herceptin can predict the therapeutic effect and have an excellent therapeutic effect with fewer side effects.
- cancer has a good prognosis in combination with surgical surgery and chemotherapy at the initial onset, whereas when the cancer has progressed considerably, even with a targeted anticancer agent, it is difficult to cure and is likely to recur within 5 years after being cured.
- cancer cells often metastasize to other organs in addition to the site of the first onset, causing cancer patients to die.
- blood cancers such as leukemia, malignant lymphoma, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer and ovarian cancer is recognized.
- cancer metastasis which is difficult to treat in case of cancer recurrence, has a poor prognosis and decreases the survival rate of patients, needs to be screened early in patients with cancer history, and the mechanism of cancer metastasis and cancer metastasis in patients with cancer history.
- the social demands on how to prevent this in advance are very high.
- Epitin is the first protein identified in mouse thymic epithelial cells. Epitin has also been isolated from human epithelial cancer cells and may also be referred to as PRSS14, Matriptase, MT-SP1 or ST14. Epitin is markedly increased in most epithelial cell-derived cancer cells such as ovarian cancer, prostate cancer, cervical cancer and breast cancer, and recently, expression of activated macrophages has also been known.
- Epitin is functionally a type II transmembrane serine protease, which is structurally an intracellular domain, a transmembrane region (TM), an SEA domain, a CUB domain, an LDLRA (or LDL) domain, and a serine. It consists of an extracellular region that contains a serine protease domain (see FIG. 1).
- epitin has been known to be involved in normal epithelial cell differentiation and cancer development. Recently, epitin interacts with several proteolytic enzymes in the initial cancer development, progression and metastasis, leading to the migration of cancer cells through degradation of extracellular matrix, invasion and angiogenesis of the basement membrane. It has been reported to play an important role in angiogenesis.
- epitin is overexpressed in cancer cells and cancer tissues compared to normal cells, and thus is involved in all stages of cancer development, growth and metastasis.
- epitin is a new target protein for the diagnosis and treatment of cancer.
- the present inventors have studied intensively by paying attention to the fact that the mechanism of inhibiting cancer metastasis can be developed by elucidating the mechanism of cancer metastasis caused by epitin, and the cancer metastasis vaccine or monoclonal antibody treatment method can be developed based on this.
- the present inventors promoted the vascular endothelial cell permeation migration of cancer cells while the structural stability between vascular cells disappeared by epitin acting on the Tie2 protein, which plays an important role in vascular stability and degrading the Tie2 moiety including a ligand binding domain.
- the present inventors found that the reduction of the expression of epitin protein in 4T1 breast cancer cells in an in vitro test resulted in a significant decrease in the number of vascular endothelial permeation migration (TEM) cells, and in the animal test of blood vessels in mice. Injecting 4T1 breast cancer cells with reduced epitin protein expression into tumors showed tumor tumors (tumor nodules) metastasis to the lungs.
- TEM vascular endothelial permeation migration
- the present inventors have found a direct mechanism by which epitin plays a role in cancer metastasis, and by using a vaccine or antibody by identifying the correlation between epitin expression using various cancer cell lines and vascular endothelial cell permeation migration (TEM). It is now possible to provide a technological basis for controlling the progression and metastasis of Tin's cancer.
- TEM vascular endothelial cell permeation migration
- cancer vaccines are mostly used as a therapeutic vaccine to treat cancer with antibodies, and the human papilloma virus vaccine known to cause cancer is prevented. It has been developed and used as a vaccine, but side effects and ethical issues are being raised. Recently, prostate cancer vaccines and breast cancer vaccines using immune functions as clinical cancer vaccines are in clinical trials and are expected to be commercialized soon. Therefore, with the development of a target cancer therapy using monoclonal antibodies such as Herceptin, cancer vaccines that induce an immune response to a target protein associated with cancer without causing side effects in the human body have attracted great attention.
- monoclonal antibodies such as Herceptin
- U.S. Patent Publication No. US2004 / 0105853 A1 discloses a pharmacological composition using a substance that binds to an epitin-like serine protease gene product.
- an epitope of an epitin-like protein antigen is disclosed. Induction of antibodies by the whole epitin-like protein consisting of 200 to 500 amino acids without elucidation of the epidermal or epithelial metastasis mechanism, and anti-antibody against polynucleotides encoding epitin-like protein It only discloses expression silencing of epitin-like proteins by antisense polynucleotides that are supposed to be sensed.
- the antibody of the prior art is obtained by the immune response of a full length epitin-like protein, the specificity of the antibody is inferior and there is no data on activity in an animal model related to cancer progression and metastasis. Efficacy is difficult to be scientifically recognized and there is a problem that side effects are concerned. That is, it is difficult to generate antigen-specific monoclonal antibodies with long sequences of 200 to 500 amino acids described in the prior art, and is far from identifying tumor antigen oligopeptides directly related to cancer progression and metastasis. Was.
- the antisense polynucleotides of the prior art also have no proven efficacy, and the technology using antisense RNA can be implemented only at the cellular level and cannot be applied to individual units without the development of a drug delivery system.
- the prior art there is no case of developing an antisense polynucleotide having a long base sequence as a therapeutic agent for an individual unit, and thus, the prior art is not applicable at all in relation to cancer development, progression, and metastasis.
- cancer metastasis vaccine research using the situation is still insignificant.
- development of cancer vaccines or monoclonal antibodies that inhibit cancer metastasis may be regarded as a breakthrough in medical technology that can prevent cancer recurrence in patients with cancer history and prevent cancer metastasis that is fatal to patients.
- the present invention relates to an antigen peptide that inhibits cancer metastasis, a cancer metastasis vaccine comprising the same, and a composition for inhibiting and treating cancer metastasis, wherein the antigen peptide that inhibits cancer metastasis by migration and invasion of cancer cells, a cancer metastasis vaccine comprising the same To provide a composition for inhibiting and treating cancer metastasis.
- an object of the present invention is to find that the epithelial cell migration target epithelial cell (TEM) and epithelial migration (TEM) of cancer cells expressing it has a deep correlation with the cancer metastasis, this endothelial cell permeation migration assay It is to provide a base technology for screening cancer metastasis related target substances and cancer metastasis inhibitor using.
- TEM epithelial cell migration target epithelial cell
- TEM epithelial migration target epithelial cell
- TEM epithelial migration
- the present inventors have intensively studied the direct mechanism that epitin acts on cancer metastasis. As a result, the present inventors have investigated the correlation between epithelial expression level and vascular endothelial cell permeation migration using various cancer cell lines. To provide a technical basis for controlling the progression and metastasis of the cancer of chitin, antigen peptides and cancer metastasis vaccines containing the same have been found to induce antibodies and inhibit cancer metastasis in vitro and in vivo. To develop.
- epitopes and cancer metastasis vaccines may comprise oligopeptides of mouse origin, human origin, rat origin or rabbit origin.
- Antigen peptides that inhibit cancer metastasis of an embodiment of the present invention are oligopeptides having the amino acid sequence of KIDARVVGGTNADEGEWPWQ, oligopeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CGDGSDEEG), amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CSDGSDEKN) ) Oligopeptide, an oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (RQARVVGGTDADEGEWPWQ), an oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CGDNSDEQG), an oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (CSDGSDEKD), SEQ ID NO: At least one oligopeptide selected from the group consisting of an oligopeptide having an amino acid sequence of 10 (RQARVVGGTDADEGEWPWQ) and an oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (KQARVVG
- the cancer metastasis vaccine of one embodiment of the present invention comprises an oligopeptide having an amino acid sequence of KIDARVVGGTNADEGEWPWQ, an oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CGDGSDEEG), an oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CSDGSDEKN) Peptide, oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (RQARVVGGTDADEGEWPWQ), oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CGDNSDEQG), oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (CSDGSDEKD), amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 At least one oligopeptide selected from the group consisting of an oligopeptide having (RQARVVGGTDADEGEWPWQ) and an oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (KQARVVGGTNADEGEW
- cancer metastasis vaccine of one embodiment of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the oligopeptide administered as an active ingredient.
- Cancer metastasis vaccines of one embodiment of the present invention can be used, for example, with an adjuvant or immune enhancer (or "immune adjuvant") (adjuvnat), such as alum.
- the cancer metastasis vaccine of one embodiment of the present invention is a mineral such as aluminum sulfate, aluminum hydroxide, magnesium hydroxide, or aluminum phosphate, surfactant such as phosphorus lecithin and Pluronic polyol, polyanion, Oily emulsions and the like.
- the cancer metastasis vaccine of one embodiment of the present invention may be mixed in liposomes or may contain various sugars.
- Another embodiment of the cancer metastasis vaccine of the present invention is an oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (KQARVVGGTNADEGEWPWQ), an oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CGDGSDEEG), an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CSDGSDEKN) Oligopeptides, oligopeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (RQARVVGGTDADEGEWPWQ), oligopeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CGDNSDEQG), oligopeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (CSDGSDEKD), amino acids of SEQ ID NO: 10
- a nucleic acid encoding an antigen peptide that inhibits cancer metastasis preferably DNA
- an expression vector preferably a nucleic acid encoding an antigen peptide that inhibits cancer metastasis, preferably DNA
- the vector is administered to the animal to produce cancer immunity.
- DNA vaccines are described in WO2000 / 6602 or J. Immunol., 160, p. 1717, 1998 and the like can be technically implemented.
- the cancer metastasis inhibiting and therapeutic composition of one embodiment of the present invention is an oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (KQARVVGGTNADEGEWPWQ), an oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CGDGSDEEG), amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Oligopeptide with (CSDGSDEKN), oligopeptide with amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (RQARVVGGTDADEGEWPWQ), oligopeptide with amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CGDNSDEQG), oligopeptide with amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (CSDGSDEKD), Containing an antibody or an antibody induced by an immune response against at least one antigenic peptide selected from the group consisting of an oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (RQARVVGGTDADEGEWPWQ) and an oligopeptide having the amino acid sequence
- an antigen peptide which inhibits cancer metastasis of one embodiment of the present invention a cancer metastasis vaccine comprising the same, or a composition for inhibiting and treating cancer metastasis
- administration means introducing a predetermined substance into a patient by any suitable method.
- the administration route of the antigen peptide, cancer metastasis vaccine comprising the same, or a composition for inhibiting and treating cancer metastasis may be administered through any general route as long as they can reach the target tissue.
- it may include, but is not limited to, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, and the like.
- an effective amount of the antigenic peptide which inhibits cancer metastasis of one embodiment of the present invention, a cancer metastasis vaccine comprising the same, or a composition for inhibiting and treating cancer metastasis is required for administration in order to expect cancer metastasis suppression, prophylactic and therapeutic effect. Means quantity.
- an antigen peptide that inhibits cancer metastasis an cancer metastasis vaccine comprising the same, or a composition for inhibiting and treating cancer metastasis, 0.1 mg / kg to 100 mg / kg once daily It may be administered in a dose.
- Screening method of the cancer metastasis inhibitor of an embodiment of the present invention (a) culturing the endothelial cells to prepare an endothelial cell layer, (b) culturing the cells expressing epitin, and ( c) adding the epitin-expressing cells onto the endothelial cell layer, (d) counting the number of cells that have migrated through the endothelial cell layer to determine cancer metastasis reference values, and (e) Adding the cancer metastasis inhibiting candidate and performing the steps (a) to (c), counting the number of cells moved through the endothelial cell layer and comparing the cancer metastasis reference value obtained in the step (d). It includes.
- the candidate material inhibited the expression or activity of epitin, indicating that the endothelial cell layer permeation migration was reduced. This suggests that the candidate is an effective substance that inhibits cancer metastasis.
- Screening method of a cancer metastasis-related target material of an embodiment of the present invention (a) culturing the endothelial cells to prepare an endothelial cell layer, (b) culturing cells expressing cancer metastasis-related candidate target material is prepared (C) adding cells expressing the cancer metastasis-related candidate target material on the endothelial cell layer, and (d) counting the number of cells that have migrated through the endothelial cell layer and counting cancer metastasis reference values. And (e) preparing a cell having reduced expression or activity of a cancer metastasis-related candidate target material and adding it to the endothelial cell layer and counting the number of cells that have migrated through the endothelial cell layer.
- the cancer metastasis-related candidate target material may be involved in endothelial cell permeation migration. This suggests that the cancer metastasis-related candidate target material is a substance related to cancer metastasis.
- the endothelial cell layer may be an MS1 cell layer which is a mouse endothelial cell, and the cells added to the endothelial cell layer are 427.1.86 cells which are thymic epithelial cancer cells or 4T1 which are breast cancer cells. May be a cell.
- the present invention is not limited thereto, and of course, cancer cell lines derived from various cancer tissues may be used.
- the cells added to the endothelial cell layer may be labeled with a label such as fluorescent protein to facilitate counting the number of cells that have migrated through the endothelial cell layer.
- a fluorescent material such as rhodamine, FITC, or CFSE
- a fluorescent protein such as GFP, EGFP, YFP, CFP, or RFP
- the present invention is not limited thereto, and various labeling materials such as radioactive materials or light emitting materials known in the art may be used.
- the present invention it is possible to control epithelial cancer progression and metastasis by using a vaccine or an antibody by identifying the correlation between epitin expression level and vascular endothelial permeation migration using various cancer cell lines.
- the present invention reveals that epithelial cell permeation target of epithelial cancer and epithelial cell permeation of cancer cells expressing it has a strong correlation with cancer metastasis. It is possible to provide a base technology for screening substances and cancer metastasis inhibitors.
- the antigen peptides that inhibit cancer metastasis of the present invention and cancer metastasis vaccines comprising the same may function as cancer metastasis antigens to induce an immune response to produce antibodies, and inhibit metastasis of cancer cells, thereby preventing and treating cancer metastasis.
- 1 is a schematic diagram showing the protein structure of epitin.
- FIG. 2 is a diagram illustrating step-by-step endothelial cell permeation migration assay of the present invention.
- Figure 3 is a micrograph showing the shape and location of cells labeled with fluorescent proteins that migrated the endothelial cell layer in the endothelial cell permeation transfer assay of the present invention.
- Figure 4 is a graph comparing the number of GFP-427 cells and GFP-427-Epi-KD cells that permeate the MS1 endothelial cell layer using the endothelial cell permeation transfer assay of the present invention.
- 5 is a graph comparing the number of 427 cells and 427-Epi-KD cells that permeate the MS1 endothelial cell layer using the endothelial cell permeation migration assay of the present invention.
- FIG. 6 shows epitope gene knockdown from 4T1 cell line. Electrophoresis showing the results of Western blotting using the anti-epitin antibody mAb5 against clones and control clones (A7, D5, B3, C5, G3).
- FIG. 7 shows that in the endothelial cell permeation migration assay of the present invention, cells of the A7 and D5 clones expressing the epitin effectively penetrate the endothelial cell layer while the epitope expression is knocked down B3, C5 and G3
- the cells of the clones are graphs showing the inability to penetrate the endothelial cell layer easily.
- FIG. 8 shows that in the endothelial cell permeation migration assay of the present invention, TEM ability was restored in cells of AB-B3 clone obtained by transfecting B3 clone knocked down with epitin expression with pcDNA3.1 / metlipase. It is a graph showing that.
- FIG. 9 is a photograph of tumor nodules metastasized to the lungs of mice injected with clones derived from the 4T1 cell line.
- FIG. 10 is a graph counting the number of tumor nodules in FIG. 9 and quantifying each clone.
- FIG. 11 is a graph showing that endothelial cell migration of 4T1 cell lines is inhibited by mouse antibodies AG22-1, AG22-3, and AG22-5 immuno-induced by the antigen oligopeptide of the present invention.
- FIG. 12 is a graph showing the percentage of cancer cell migration when the antibody of FIG. 11 is administered.
- Figure 13 shows the immune enhancers, “immune enhancer + Epi-2LDL”, “immune enhancer + Epi-4LDL” in the mouse Adj, Adj + Epi-2LDL, Adj + Epi-4LDL and Adj + Epi-SP groups, respectively, in the first animal experiment. And survival curves measured for each group after immunization with immune enhancer + Epi-SP and injection of cancer cells.
- FIG. 14 is a photograph taken when the lungs of the mouse are removed and placed in a dish on the 19th day of the experiment of FIG. 13.
- FIG. 15 is a graph showing numerical values of lung weight and nodule number of Adj, Adj + Epi-2LDL, Adj + Epi-4LDL, and Adj + EpiSP groups after the experiment of FIG. 13.
- FIG. 16 is a graph showing the percentages obtained by dividing all individuals by their average values based on the average value of the nodule number of the Adj group after the experiment of FIG. 13.
- Figure 17 shows the immune enhancers, "immune enhancer + Epi-2LDL", “immune enhancer + Epi-4LDL” and “immune enhancer + in the mouse Adj, Adj + 2LDL, Adj + 4LDL, Adj + SP groups, respectively, in the second animal experiment After immunization with Epi-SP and injection of cancer cells, each group was photographed on the surface of the nodular lung.
- FIG. 20 is a graph showing the number of nodules numerically for each group after the experiment of FIG. 19.
- 21 is a graph showing the percentages obtained by dividing all individuals by their average value based on the average value of the nodule number of the Adj + 4T1 group after the experiment of FIG. 19.
- Figure 23 is a photograph showing that the antibody formed of the antigen oligopeptide of the present invention inhibits the fibrillation of 427.1.86 cells induced by epitin.
- FIG. 24 is a photograph showing that the antibody formed with the antigen oligopeptide of the present invention inhibits the fibrillation of MS1 cells induced by soluble epitin.
- Anti-epitin (anti-metlipase) antibody H-270
- anti-Tie2 antibody control shRNA lentivirus
- epitin shRNA lentivirus purchased from Santa Cruz Biotechnology, INC, USA.
- Anti-tubulin was purchased from Sigma, USA, and monoclonal antibody mAb5 was prepared as described in previous literature published by the inventors (EG Cho, MG Kim, C. Kim, SR Kim). , IS Seong, C. Chung, RH Schwartz, D.
- the pcDNA3 vector was purchased from Invitrogen Corporation, and the pcDNA3 / eGFP vector and the pcDNA3.1 / metlipase vector were prepared by recombining the eGFP gene and the metlipase gene into the pcDNA3 vector, respectively.
- BalB / c mice used to confirm the cancer metastasis to the lung was purchased from Korea Biolink (Korea, Chungcheongbuk-do) was used.
- Cancer cell lines (427.1.86, 4T1, etc.) were maintained in culture in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% FBS (Fetal Bovine Serum).
- DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
- FBS Fetal Bovine Serum
- MS1 a mouse endothelial cell
- DMEM medium supplemented with 5% FBS.
- 427 Epi-KD cell line knocked down meaning inhibiting or blocking expression
- the pSUPER-epi construct was recombined into a pcDNA3 vector encoding a neomycin resistance gene and then transfected into 427.1.86 cancer cells. After growing for 10 days in the presence of 800 ⁇ g / ml G418, a single cell whose protein and RNA expression levels were stably knocked down was selected to construct a 427 Epi-KD cell line.
- SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 the sequence portion of the bases shown in bold and underline indicates a sequence targeting epitin.
- GPF-427 and GFP-427 Epi-KD cell lines were constructed in a similar manner to 427 Epi-KD cell line construction, except that the pcDNA3 / eGFP vector was used instead of the pcDNA3 vector.
- 4T1 cells were trackfected with control shRNA lentiviral or epitin shRNA lentiviral (which is a lentivirus encoding shRNA that silences epitin expression) and the presence of 2 ⁇ g / ml puromycin 4T1 derived clones (A7, D5, B3, C5, G3) were obtained by single cell selection.
- A7 and D5 clones effectively express epitin as clones of 4T1 cells obtained by transfection with control shRNA lentivirus, while B3, C5 and G3 clones were transfected with epitin shRNA lentivirus. Epilone expression is knocked down as clones.
- the AB-B3 clone is a clone obtained by transfecting the B3 clone with pcDNA3.1 / metlipase, and effectively expresses a human-derived metlipase. The vectors were transfected into cells using lipofectamine (purchased from Invitrogen).
- Westing blotting assays used in the examples of the present invention were performed according to methods well known in the art. Protein samples were separated on 10% acrylamide gel under reducing conditions. A secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) was used for visualization of the separated proteins and treated with enhanced chemiluminescence reagents (Amersham).
- HRP horseradish peroxidase
- MS1 cells were tested for the difference in the degree of transendothelial cell migration (TEM) according to the level of epitin expression.
- TEM transendothelial cell migration
- a cancer cell line expressing a fluorescent protein was prepared and tested in a mouse cancer model using an imaging device to confirm the degree of cancer cell metastasis in the animal.
- epitope expression knocked down cell lines B3, C5 and G3 clones of FIGS. 6 to 8 were prepared and used in cell culture and cancer models of mice (see FIGS. 9 and 10).
- Example 1-1 Microscopy for migration between endothelial cells
- MS1 cells were cultured in gelatin-coated coverslips in 12-well plates to form a confluent monolayer.
- GFP-427 cells and GFP-427-Epi-KD cells stably expressing GFP fluorescent protein were isolated using Cellstripper TM (Cellgro) and resuspended in culture medium at a concentration of 10 5 cells / ml. 1 ml of cell resuspension was added to each MS1 monolayer. After 8 hours, cells were washed and fixed, stained with Rhodamine conjugated Paloidine (actin stained red), and fluorescence with 10X Planapochromat objective lens. Observation was made under a microscope (Axiovert 200M, Zeiss).
- the MS1 cells were cultured in an 8 ⁇ m pore chamber (Insert, Falcon) until they reached a dense state. Molecular Probes with 4T1 Cells TM ) And resuspended in serum-free DMEM medium. 10 stained with CFSE 5 doggy 4T1 cells were added to the MS1 cell layer and incubated for 4 hours. The cells were fixed with 3.7% formaldehyde (Sigma) and then unmigrated 4T1 cells were removed and washed. Images of CFSE-positive cells were obtained using an IX-51 microscope (Olympus) equipped with AxioCam MRm (Zeiss) and the number of cells analyzed by ImageJ (National Institute of Health) (FIG. 2, FIG. 7 and FIG. 8). Reference).
- Example 1-3 Correlation between Epitin Expression and Vascular Endothelial Permeation Migration
- rounded cells (FIG. 3C) based on the form visualized by GFP fluorescence protein and F-actin were GFP-427 cells or GFP-427 ⁇ attached to the MS1 endothelial layer.
- Epi-KD cells were counted, and spindle or polygonal cells (FIGS. 3 f and i) were counted as GFP-427 cells or GFP-427-Epi-KD cells that permeate the MS1 endothelial layer.
- round-shaped cells are observed as hemispheres (c 'in FIG. 3) attached on the MS1 cell layer, while spindle or polygonal cells are dispersed in the MS1 cell layer or located between MS1 cells.
- FIG. 4 compares the number of cells permeated and migrated relative to the total number of cells in epidermal expressing cells GFP-427 and epitin expressing knocked down cells GFP-427-Epi-KD.
- GFP-427 epitin-expressing cells
- GFP-427 Epi-KD epitin-expressing cells
- Example 1-4 Verification of the TEM Assay as a Cancer Transition Experimental Model through Experiments Using 4T1 Breast Cancer Cell Lines Instead of Epitin Overexpressing Cancer Cell Lines
- each point shown in Figures 7 and 8 represents the number of cells permeated in the microscopic field, the average value and the standard deviation for them are shown in the graph, the asterisk (*) has a statistically significant level p ⁇ 0.001 and an asterisk (**) indicate that the statistically significant level is p ⁇ 0.01.
- TEM ability is maintained in cells of A7 and D5 clones (epitin expression) induced by transfection of breast cancer cells 4T1 with control shRNAs.
- epitin plays an important role in endothelial cell migration. Suggests deep involvement in cancer metastasis.
- the transfection of epitope knocked down B3 clones with Matriptase vectors further reinforces the fact that the TEM ability is restored, which indicates that the TEM assay can be used as a cancer metastasis model with confidence. To prove that it can be.
- Clones derived from 5 x 10 4 4T1 cell lines in PBS solution were each routed through the tail vein of six Balb / c mice (purchased from Korea Biolink). Injected. Mice injected with clones derived from the 4T1 cell line were sacrificed after 14 days and lungs were stained by injecting Indian ink dissolved in PBS (available regardless of manufacturer as a general ink) through trachea. Stained lungs were dissected, washed appropriately with PBS, and images were taken for each clone to count tumor nodules (see Figure 9). The counted results were numerically graphed for each clone (see FIG. 10).
- FIG. 10 shows that the results confirmed by the naked eye are quantified, and epitin effectively induces cancer metastasis.
- the average value and standard deviation of the number of tumor nodules are shown in the graph for each clone, with an asterisk (*) indicating a statistical significance level p ⁇ 0.001 and an asterisk (**) indicating a statistical significance level p. It shows that it is ⁇ 0.01.
- Example 1 confirms again that epitin is an important substance related to cancer progression and metastasis, and shows that the endothelial cells of Example 1 have a close correlation with epithelial expression level and vascular endothelial cell permeation migration. Permeation transfer assays have proven to be an effective way to screen cancer metastasis-related targets and cancer metastasis inhibitors.
- epitin In order to control cancer metastasis using immunity, we tested whether the antigenicity of epitin can produce immune antibodies.Epitin is immune because epitine proteins are expressed in the thymus microenvironment, which plays an important role in causing immune tolerance. Responses are the most important identification process for cancer metastasis vaccine development and the possibility of monoclonal antibody development. Oligopeptides having high antigenic potential and capable of being immunogens in both humans and mice were selected and tested for antibody formation by immunization with mice.
- an oligopeptide having an amino acid sequence of KQARVVGGTNADEGEWPWQ is selected from KLH
- Three mice were immunized three times after binding to the mice, and after 3 days, serum was collected and subjected to ELISA analysis. Three mice with high antibody-forming amounts were selected. And to determine whether these antibodies (AG22-1, AG22-3, AG22-5) inhibits cancer metastasis by epitin, the endothelial cell permeation transfer assay (TEM) described in Example 1-2 was carried out It was.
- TEM endothelial cell permeation transfer assay
- vascular endothelial cells constituting the vascular endothelial cells were cultured in a Boyden chamber to form a dense layer, and 1x10 5 cells of a D5 clone effectively expressing epitin derived from a 4T1 cancer cell line.
- CFSE fluorescent substance
- the concentration of serum was given to promote the movement of cancer cells, and endothelial cell permeation migration assay was performed by controlling protein expression of cells or administering antibodies to determine factors involved in the movement of cancer cells.
- the number of cancer cell migrations at the time of antibody administration was expressed as a percentage when the antibody was not administered.
- mouse antibodies AG22-1, AG22-3, and AG22-5 immunized with the antigen oligopeptide of the present invention inhibit cancer cell migration of about 63%, 48%, and 34%, respectively, against cancer cells derived from the 4T1 cell line. It was observed that.
- the antigen oligopeptides of the present invention induce an immune response to produce antibodies and the resulting antibodies inhibit cancer cell migration in endothelial cell permeation migration assays, thereby making the antigen oligopeptides of cancer cells a cancer metastasis vaccine. It can be said to have an effect of inhibiting the metastasis process.
- an oligopeptide having an amino acid sequence of KQARVVGGTNADEGEWPWQ an oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CGDGSDEEG) or an oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CSDGSDEKN)
- Balb / c mice were used to determine whether cancer metastasis by induction of immune responses functions as a vaccine.
- Example 4-1 Vaccine efficacy test through primary animal experiment
- Oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 KQARVVGGTNADEGEWPWQ
- oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 CGDGSDEEG
- oligopeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 CSDGSDEKN
- Epi-4LDL oligopeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
- Adj, Adj + Epi-2LDL, Adj + Epi-4LDL, Adj + EpiSP were assigned to the immune enhancers (Adjuvant), “Immune Enhancer + Epi-2LDL”, “Immune Enhancer + Epi-4LDL” and “ Immunity Enhancer + Epi-SP ′′ was injected three times, once every three weeks.
- oligo peptide and CFA were mixed (50 ⁇ g oligo peptide + 100 ⁇ l CFA in 100 ⁇ l PBS solution) to each mouse.
- 4T1 cancer cells in each mouse 5 ⁇ 10 5 Dog / 200 ⁇ l PBS was injected intravenously.
- the weight of the mouse On the 19th day, the weight of the mouse, the lungs were removed separately, and the weight of the lungs and the number of nodules formed in the lungs were counted (see FIG. 14). To determine the weight of the lungs and the number of nodules, the mouse was killed, the lungs were removed separately, and the lungs were taken on a 35 mm dish. Counted. Marked "dead" in Figure 14 is the lung of a mouse that has already died before confirmation. Regardless of the size of the humps, they were counted, and when the humps were divided, they were counted as different humps. In addition, blood was drawn from the eyes to obtain serum.
- the survival rate of each group was 55.6% in Adj, 80% in Adj + Epi-2LDL, 87.5% in Adj + Epi4LDL, and 100% in Adj + EpiSP. The survival rate was the highest.
- the lung weight and nodule number of the Adj, Adj + Epi-2LDL, Adj + Epi-4LDL, and Adj + EpiSP groups were graphed (FIG. 15). 15 is shown using the mean value and the standard error. Lung weight was the heaviest in the Adj group, followed by Adj + Epi-2LDL, Adj + Epi-4LDL, and Adj + EpiSP.
- the number of nodules was highest in Adj group, followed by Adj + Epi-2LDL group, Adj + Epi-4LDL group, and Adj + EpiSP group. Percentages were obtained by dividing the entire individual by the average value based on the average value of the number of nodules in the Adj group, and again, a graph was drawn for each group by using the Prism 5 program (FIG. 16). 16 is shown using the mean value and the standard error. The number of nodules decreased by 14% in Adj + 2LDL group, 20% in Adj + 4LDL group and 42% in Adj + SP group compared to Adj group. Therefore, when immunized with the oligopeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 it can be seen that the most excellent cancer metastasis inhibitory effect.
- Example 4-2 Vaccine Potency Test via Secondary Animal Experiment
- Example 4-1 It was confirmed by the test in Example 4-1 that the antigen oligopeptide of the present invention effectively suppresses cancer metastasis in mice.
- the test was repeated using 20 mice in each group, increasing the number of mice.
- a total of four groups (Adj, Adj + 2LDL, Adj + 4LDL, Adj + SP) consisting of 20 mouse Balb / c per group, respectively, were used as immune enhancers (Adjuvant), "Immune Enhancer + Epi-2LDL”, “Immune Enhancers” + Epi-4LDL "and” Immune Enhancer + Epi-SP "were injected three times every three weeks.
- oligopeptide and CFA were mixed (50 ⁇ g oligopeptide in 100 ⁇ l PBS solution plus 100 ⁇ l CFA) intraperitoneally injected into each mouse, and from the second injection 20 ⁇ g oligopeptide was mixed with IFA (second injection).
- the number of nodules in the Adj group, Adj + 2LDL group, Adj + 4LDL group, and Adj + SP group was graphed.
- the total individual was divided by the average value to obtain a percentage, and again, a graph was drawn for each group by using the Prism 5 program (FIG. 18). 18 is shown using the mean value and the standard error.
- the number of nodules decreased by 58% in the Adj + 4LDL group, 62% in the Adj + 2LDL group and 70% in the Adj + SP group compared to the Adj group. Therefore, the results of experiments using 20 mice per group were also almost identical to those of Example 4-1, and it was confirmed once again that the antigen oligopeptide of the present invention can be used as an effective vaccine. there was.
- Oligopeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a control thereof to confirm whether the experimental results of Example 4-1 and Example 4-2 are due to the immunity of the antigen oligopeptide of the present invention
- An scrambled oligo peptide Epi-SP-Sc (EQGKGARDWPEWAVQGVNT; SEQ ID NO: 4) was made and the effects were compared.
- immunization was performed using the injection alum, an adjuvant that can be used in both mice and humans.
- 4T1 Con-D5 cell line expressing epitin and cancer cell line 4T1 EpiKD-B3 in which epitin expression was knocked down were used.
- a total of 11 groups of 5 Balb / c mice per group (Adj, Adj + SP, Adj + SP + 4T1Con-D5, Adj + SP + 4T1EpiKD-B3, Adj + Sc + 4T1Con-D5, Adj + Sc + 4T1EpiKD-B3, Adj + 4T1Con-D5, Adj + 4T1EpiKD-B3, 4T1Con-D5, 4T1EpiKD-B3, None) 8 groups (Adj, Adj + SP, Adj + SP + 4T1Con-D5, Adj + SP + 4T1EpiKD -B3, Adj + Sc + 4T1Con-D5, Adj + Sc + 4T1EpiKD-B3, None) 8 groups (Adj, Adj + SP, Adj
- mice On the 17th day after the cancer cell injection, the mice were weighed, 1 ml of black ink was added to the trachea to stain the lungs, and each lung was detached and taken in a dish. 19 is a photograph of the surface of the lung in which nodules occur in each group. Staining made clear the distinction between lungs and nodules, and counted the white nodules as nodules.
- the nodule number of mice immunized with immune enhancer + Epi-SP and injected with 4T1 con-D5 was immunized with immune enhancer + Epi-SP-Sc and injected with 4T1 con-D5.
- mice immunized with immune enhancer + Epi-SP and injected with 4T1 con-D5 was similar to the number of nodules in mice injected with 4T1 EpiKD-B3 knocked down.
- Graphpad prism 5 program was used to graph the number of nodules for each mouse group. 20 is shown using the mean value and the standard error. Nodules of mice immunized with Epi-SP were found in the Adj + SP + 4T1 group except for those that significantly exceeded the standard error of the mean value. The lowest number was found, and much more nodules were counted in the group of mice immunized with Epi-SP-Sc, mice immunized only with an adjuvant, and mice not immunized. Similar numbers of nodules were counted in the group of mice injected with 4T1 EpiKD-B3 knocked down with epitin expression, similar to the number of nodules in the Adj + SP + 4T1 group.
- the average value of the number of nodules in the Adj + 4T1 group was used as a reference to calculate the percentage by dividing the entire individual by the average value, and again, a graph was drawn for each group using the Prism 5 program (FIG. 21). 21 is shown using the mean value and the standard error.
- the number of nodules in the Adj + SP + 4T1 group was 74% lower than that in the Adj + 4T1 group, which was similar to that of other mouse groups injected with 4T1 EpiKD-B3 with knockdown epitin expression.
- Epi-SP antigen oligopeptide of the present invention and epi-SP-sc oligopeptide as a control group were immunized with mice and cancer cells were injected to compare the number of nodules metastasized to the lungs. Only the peptides had a reduced number of metastasized nodules. This shows that the Epi-SP antigen oligopeptides of the present invention can specifically inhibit cancer metastasis.
- nodules occurred less in the group of mice injected with 4T1 EpiKD-B3, a cancer cell line in which epitin was knocked down, than in the group injected with 4T1 con-D5.
- the number of nodules in the mouse group injected with 4T1 EpiKD-B3 was similar to that of the mouse group injected with 4T1 con-D5 after immunization with the Epi-SP antigen oligopeptide of the present invention.
- the method of immunizing with the Epi-SP antigen oligopeptide of the present invention and inhibiting the activity of epitin is similar to the injection of 4T1 EpiKD-B3 knocked down the epitin expression. It can be seen that the effect can be obtained.
- MCF7 cells which are human breast cancer cell lines
- H-270 anti-metlipase antibody
- Adj + SP anti-metlipase antibody
- the H-270 antibody was used as a control, indicated by the arrow is a band indicating the full size of the antigen. That is, as shown in Figure 22, when Western blotting with serum obtained from the immunized treated mice, the band at the same size as in the H-270 treatment that confirms the human metlipase upon electrophoresis Indicated.
- the antibody to the Epi-SP antigen oligopeptide of the present invention can bind to metlipase (or epitin) in MCF7 by showing a band at the same size as the band of H-270 for MCF7. It is known that anti-Epi-SP antigen oligopeptide antibodies formed in mice can also bind to metlipase (or epitin) in human cells, affecting the metastasis of cancer cells and inhibiting cancer progression and metastasis. Show that it is.
- Example 4-3 An in vitro experiment was further performed to confirm the effect of the antibody on the migration of cells among the functional effects of the antibody made through the procedure of Example 4-3.
- the cells used 427.1.86 cells of the mouse expressing epitin. 427.1.86 Cells were densely cultured, and then the blue layer was used to cut the cell layers, and the cloned antibodies were added at a 3: 2 ratio with the culture media. Then 20 hours of incubation and the movement of the cells were observed under a microscope. In the case of a, which the antibody was not added, cell migration was observed, whereas in the case of adding the four antibodies (c to f) to the antigen oligopeptide of the present invention obtained through the procedure of Example 4-3, the cells were added.
- CM conditioned medium
- 427.1.86 cells overexpressing epitin were added in consideration of the experimental purpose of confirming whether cell migration by epitin occurs and whether the antibody of the present invention inhibits it.
- Water-soluble epitin contained in was added and the migration of endothelial cells observed at this time was observed.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Abstract
본 발명은 다양한 암세포주를 이용한 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동의 상관관계를 규명함으로써 백신이나 항체를 이용하여 에피틴의 암의 진행과 전이를 제어할 수 있는 기술적 토대를 제공하고, 이에 기반하여 시험관내 및 생체내 시험에서 항체를 유도하고 암전이를 억제하는 것이 확인된 항원 펩타이드 및 이를 포함하는 암전이 백신을 제공한다.
Description
본 발명은 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 암세포의 이동과 침윤에 의한 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상피세포암 표적물질인 에피틴과 이를 발현하는 암세포의 내피세포 투과 이동(Transendothelial migration; TEM)이 암전이와 깊은 상관관계를 갖는 것을 밝히고, 이러한 내피세포 투과 이동 어세이를 이용하여 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질을 스크린하는 기반기술을 제공하는 것에 관한 것이다.
암은 최대의 난치성 질환으로 다양한 유전자 및 단백질이 관여하고 복잡한 신호전달체계에 의해 암 발생, 억제 및 전이 등이 조절되고 있는 것으로 보고되고 있다. 지금까지 암을 조기에 진단하거나 치료하기 위한 다양한 진단제 또는 항암제를 개발하기 위한 연구가 진행되어 왔는데, 최근에는 특정 분자단위 표적을 이용한 선택적 진단제 또는 표적 항암제에 대한 연구가 활발하다.
암 발생과 관련된 표적 단백질을 이용한 표적 항암제로서, 아바스틴(Avastin)과 허셉틴(Herceptin) 등 현재 상용화된 표적 항암제는 그 치료효과를 예측할 수 있고, 적은 부작용과 함께 뛰어난 치료 효과를 보이는 장점이 있다. 효과적인 표적 항암제의 개발을 위해서는 암에 대한 일반적인 분자적 이해와 함께 암 특이적 표적 단백질의 동정 및 기능 연구가 반드시 필요하다. 즉, 암발생 관련 표적 단백질을 밝히고 나면, 표적 단백질을 이용한 암발생 메커니즘의 분석이 용이하게 되고 항암제 후보물질의 다양한 유도체를 개발하여 최적의 항암 기능을 수행하는 구조-활성 연관성의 연구도 가능하다.
또한, 암은 초기 발병시 외과적 수술과 항암제 치료를 병행하면 예후가 좋은 반면에, 암 발생이 상당히 진행된 경우에는 표적 항암제를 사용하더라도 완치가 어렵고 완치된 이후에도 5년 내에 재발하는 확률이 높다. 뿐만아니라, 암은 재발하면 최초 발병 부위 외에 타기관으로 암세포가 전이하는 경우가 많아 암 환자를 사망에 이르게 한다. 일반적으로 잘 알려진 백혈병, 악성림프종 등과 같은 혈액암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암에 대한 조기검진 및 재발여부 검진의 필요성은 인정되고 있으나 극소수의 세포로부터 시작되는 암화 과정의 특성상 조기 검진은 기술적으로 어려움이 따른다. 특히, 암 재발시 치료가 어려우면서 예후가 나쁘고 환자의 생존율을 떨어뜨리는 암전이는 암 병력이 있는 환자에게 있어서 조기에 검진할 필요가 있으며, 암전이의 메카니즘을 규명하고 암 병력이 있는 환자에게 암전이를 사전에 예방할 수 있는 방법에 대한 사회적 요구는 매우 높다고 할 수 있다.
이러한 암전이와 관련하여 주목받는 표적 단백질로서 메트립타아제(Matriptase) 또는 에피틴(epithin)으로 불리는 단백질이 있다. 에피틴은 최초로 생쥐 흉선 상피세포에서 확인된 단백질이다. 또한, 에피틴은 인간의 상피암 세포로부터도 분리되었으며 다른 이름으로는 PRSS14, 메트립타아제(Matriptase), MT-SP1 또는 ST14 등으로 불리기도 한다. 에피틴은 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 유방암 등 대부분의 상피세포 유래 암 세포에서 그 발현이 현저히 증가되어 있으며, 최근 들어 활성화된 대식세포에서의 발현도 알려지게 되었다.
에피틴은 기능적으로는 타입II 막단백질 분해효소(type II transmembrane serine protease)로서, 구조적으로는 세포내 도메인과, 트랜스 멤브레인 영역(TM), SEA 도메인, CUB 도메인, LDLRA(또는 LDL) 도메인 및 세린 단백질분해효소(serine protease) 도메인을 포함하는 세포외 영역으로 구성되어 있다(도 1 참조). 종래까지 에피틴은 정상 상피세포 분화와 암 발생에 관여하는 것으로 알려져 있었다. 최근에는 에피틴이 최초 암발생, 진행 및 전이에 있어서 여러 단백질 분해효소들과 상호작용하여 세포외 기질(extracellular matrix)의 분해를 통한 암세포의 이동, 기저막(basement membrane)의 침윤(invasion)과 신생혈관생성(angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다. 이러한 지금까지의 연구결과들을 종합하면 에피틴은 정상세포에 비해 암 세포나 암 조직에서 과발현되어 있어 암의 발생, 성장 및 전이의 전 단계에서 관여하고 있는 물질임을 알 수 있다. 따라서, 에피틴은 암의 진단과 치료를 위한 새로운 표적 단백질이다.
이에 본 발명자들은 에피틴에 의한 암전이 메카니즘을 명확히 규명하면 암전이를 억제하는 방법을 개발할 수 있고, 이에 기초하여 암전이 백신이나 단클론 항체치료 방법을 개발할 수 있는 점에 주목하여 예의 연구를 거듭한 결과, 세포 외부로 절단되어 유리(shedding)된 수용성의 에피틴 모티브의 폴리펩티드가 신생혈관생성에 직접 관여한다는 의미있는 연구결과를 확인한 바가 있다. 또한, 본 발명자들은 에피틴이 혈관 안정성에 중요한 역할을 하는 Tie2 단백질에 작용하고 리간드 결합 도메인을 포함하는 Tie2 부분을 분해함으로써 혈관 세포들 사이의 구조적 안정성이 사라지면서 암세포의 혈관 내피세포 투과 이동이 촉진되고 이로 인해 암전이가 유발되는 메카니즘을 규명하기에 이르렀다. 구체적으로, 본 발명자들은 시험관내(in vitro) 시험에서 4T1 유방암 세포에서의 에피틴 단백질의 발현 감소는 혈관 내피세포 투과 이동(TEM) 세포수의 유의적인 감소를 유발하고, 동물시험에서 마우스의 혈관 내로 에피틴 단백질 발현이 감소된 4T1 유방암 세포를 주입한 경우 폐로 전이된 종양 결절(tumor nodules)이 감소된 것을 확인하였다.
즉, 본 발명자들은 에피틴이 암전이에 작용하는 직접적인 메카니즘을 밝혀냈으며, 다양한 암세포주를 이용한 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동(TEM)의 상관관계를 규명함으로써 백신이나 항체를 이용하여 에피틴의 암의 진행과 전이를 제어할 수 있는 기술적 토대를 제공할 수 있게 되었다.
한편, 암 백신과 암전이 백신의 세계적 경향을 살펴보면, 암 백신은 치료용 백신으로서는 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법이 대부분이고, 암을 유발하는 것으로 알려진 인유두종 바이러스(Human papilloma virus) 백신이 예방 백신으로 개발되어 사용되고 있으나 부작용과 윤리적 문제가 제기되고 있는 실정이다. 최근들어 새로운 암치료백신으로 면역기능을 이용한 전립선암 백신과 유방암 백신이 임상실험 중이고 곧 상용화될 전망이다. 따라서, 허셉틴과 같은 단클론 항체를 이용한 표적 암치료제의 개발과 함께 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 암과 관련된 표적 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 암백신이 큰 주목을 받고 있다.
이와 관련하여 미국공개특허 US2004/0105853 A1호에서는 에피틴-유사 세린 단백질분해효소 유전자 산물과 결합하는 물질을 이용한 약리학적 조성물을 개시하고 있으나, 상기 선행기술에서는 에피틴-유사 단백질 항원의 에피톱에 대한 규명이나 에피틴의 암전이 메카니즘의 규명 없이 200 내지 500개의 아미노산들로 구성된 에피틴-유사 단백질 전체를 이용한 면역반응으로 항체를 유도하는 것과, 에피틴-유사 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 안티센싱할 것으로 추측되는 안티센스 폴리뉴클레오티드에 의한 에피틴-유사 단백질의 발현 사일런싱(silencing)만을 개시하고 있을 뿐이다. 그러나, 상기 선행기술의 항체는 전장(full length) 에피틴-유사 단백질의 면역반응으로 얻은 것이기 때문에 항원 특이성이 떨어질 수 밖에 없고 암진행 및 전이과정과 관련한 동물모델에서의 활성에 대한 데이터가 없어 그 효능이 과학적으로 인정되기 어려우며 부작용이 우려되는 문제가 있다. 즉, 상기 선행기술에서 설명하고 있는 200 내지 500개 아미노산들의 긴 서열의 단백질로는 항원 특이적인 단클론 항체의 생성이 어려우며 암진행 및 전이과정과 직접적으로 관련된 종양 항원 올리고 펩타이드의 규명과는 거리가 먼 것이었다. 또한, 상기 선행기술의 안티센스 폴리뉴클레오티드 역시 그 효능이 전혀 입증되지 않은 것이고 안티센스 RNA를 이용한 기술은 세포 수준에서만 구현가능하고 개체 단위에는 약물전달시스템(drug delivery system)의 개발 없이는 적용이 불가능할 뿐만아니라 상기 선행기술과 같이 염기서열의 길이가 긴 안티센스 폴리뉴클레오티드를 개체 단위에 대한 치료제로 개발한 사례는 전무한 실정이므로 상기 선행기술은 암발생, 진행 및 전이와 관련하여 전혀 적용이 불가능한 기술이라고 할 수 있다.
즉, 전술한 바와 같은 종래의 암전이에 대한 연구는 여전히 초기 단계로 많은 사람들이 메카니즘의 연구없이 단순히 암전이에 작용하는 유전자나 단백질 등을 찾고 있으며, 정확한 암전이 메카니즘 규명을 기반으로 하는 표적 단백질을 이용한 암전이 백신 연구는 아직 미미한 실정이다. 이러한 관점에서, 암전이를 억제하는 암백신이나 단클론 항체의 개발은 암 병력이 있는 환자의 암 재발 방지와 환자에게 치명적인 암전이를 방지할 수 있는 획기적인 의료기술의 진보라고 할 수 있을 것이다.
본 발명은 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 암세포의 이동과 침윤에 의한 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상피세포암 표적물질인 에피틴과 이를 발현하는 암세포의 내피세포 투과 이동(Transendothelial migration; TEM)이 암전이와 깊은 상관관계를 갖는 것을 밝히고, 이러한 내피세포 투과 이동 어세이를 이용하여 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질을 스크린하는 기반기술을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 에피틴이 암전이에 작용하는 직접적인 메카니즘에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 다양한 암세포주를 이용한 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동의 상관관계를 규명함으로써 백신이나 항체를 이용하여 에피틴의 암의 진행과 전이를 제어할 수 있는 기술적 토대를 마련하였고, 이에 기반하여 시험관내 및 생체내 시험에서 항체를 유도하고 암전이를 억제하는 것이 확인된 항원 펩타이드 및 이를 포함하는 암전이 백신을 개발하기에 이르렀다.
이하, 본 발명의 명세서에서 사용되는 "에피틴"이라는 용어는 마우스 유래의 에피틴 뿐만아니라 인간 유래의 메트립타아제나 다른 이름의 오쏘로그(ortholog)를 포함하는 광의의 개념으로 사용된다. 따라서, 이하에서 정의되는 항원 펩타이드 및 암전이 백신은 마우스 기원, 인간 기원, 래트(rat) 기원 또는 토끼 기원의 올리고펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 암전이를 억제하는 항원 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 올리고펩타이드이다.
본 발명의 일실시예의 암전이 백신은 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 올리고펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 암전이 백신은 유효 성분으로서 투여되는 상기 올리고펩타이드 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 본 발명의 일실시예의 암전이 백신은 예를 들어, 알룸(alum)과 같은 항원 보조제 또는 면역 증강제(또는 "면역 보강제"라고도 함)(adjuvnat)와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예의 암전이 백신은 황산알루미늄, 수산화알루미늄, 수산화마그네슘, 또는 인산알루미늄과 같은 광물, 포스포러스 레시틴 및 풀루로닉 폴리올(Pluronic polyol)과 같은 계면활성제, 폴리아나이온(polyanion), 유성에멀젼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예의 암전이 백신은 리포솜 중에 혼합하거나, 각종 당류를 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예의 암전이 백신은 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 올리고펩타이드를 코딩하는 DNA를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 다른 일실시예의 암전이 백신에 있어서, 상기 암전이를 억제하는 항원 펩타이드를 코딩하는 핵산, 바람직하기는 DNA를 발현 벡터에 삽입한 후, 상기 벡터를 동물에 투여함으로써, 암 면역을 생기게 할 수 있다. 이와 같은 DNA 백신은 WO2000/6602 또는 J. Immunol., 160, p. 1717, 1998 등을 참조하여 기술적으로 구현할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예의 암전이 억제 및 치료용 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원 펩타이드에 대한 면역반응으로 유도된 항체 또는 이러한 항체를 함유하는 혈청을 포함한다. 바람직하기로는 상기 항체는 단클론항체인 것이 좋다.
한편, 본 발명의 일실시예의 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 또는 암전이 억제 및 치료용 조성물에 있어서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 또는 암전이 억제 및 치료용 조성물의 투여경로는 이들이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 일실시예의 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 또는 암전이 억제 및 치료용 조성물의 유효량은 암전이 억제, 예방 및 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 환자의 암종류, 암의 진행과 전이 상태, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 또는 암전이 억제 및 치료용 조성물을 투여하는 경우, 1일 1회 투여시 0.1㎍/㎏ ~ 100 ㎎/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 암전이 억제물질의 스크린 방법은, (a) 내피세포를 배양하여 내피세포 층을 준비하는 단계와, (b) 에피틴을 발현하는 세포를 배양하여 준비하는 단계와, (c) 상기 에피틴을 발현하는 세포를 상기 내피세포 층 상에 첨가하는 단계와, (d) 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 암전이 기준값을 결정하는 단계와, (e) 암전이 억제 후보물질을 첨가하여 상기 (a) 단계 내지 (c) 단계를 수행한 후 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 상기 (d) 단계에서 얻은 암전이 기준값과 비교하는 단계를 포함한다. 만약, 암전이 억제 후보 물질 첨가에 의해 내피세포 층을 투과 이동한 에피틴을 발현하는 세포의 수가 감소하면 상기 후보 물질이 에피틴의 발현이나 활성을 저해하여 내피세포 층 투과 이동을 감소시킨 것임을 알 수 있고, 이는 상기 후보물질이 암전이를 억제하는 유효한 물질임을 시사하는 것이다.
본 발명의 일실시예의 암전이 관련 표적물질의 스크린 방법은, (a) 내피세포를 배양하여 내피세포 층을 준비하는 단계와, (b) 암전이 관련 후보 표적물질을 발현하는 세포를 배양하여 준비하는 단계와, (c) 상기 암전이 관련 후보 표적물질을 발현하는 세포를 상기 내피세포 층 상에 첨가하는 단계와, (d) 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 암전이 기준값을 결정하는 단계와, (e) 암전이 관련 후보 표적물질의 발현 또는 활성을 감소시킨 세포를 준비한 후 이를 상기 내피세포 층 상에 첨가하고 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 상기 (d) 단계에서 얻은 암전이 기준값과 비교하는 단계를 포함한다. 만약, 암전이 관련 후보 표적물질의 발현 또는 활성을 감소시킨 세포의 경우 내피세포 층을 투과 이동한 세포의 수가 감소하면 상기 암전이 관련 후보 표적물질이 내피세포 층 투과 이동에 관여하는 것을 알 수 있고, 이는 상기 암전이 관련 후보 표적물질이 암전이와 관련된 물질임을 시사하는 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 내피세포 층은 쥐의 내피세포(Mouse endothelial cell)인 MS1 세포층일 수 있고, 내피세포 층에 첨가되는 세포는 흉선 상피세포암 세포인 427.1.86 세포 또는 유방암 세포인 4T1 세포일 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 각종 암조직에서 유래하여 구축된 암세포주가 사용될 수 있음은 물론이다. 또한, 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하는 것을 용이하게 하기 위해 상기 내피세포 층에 첨가되는 세포는 형광 단백질과 같은 표지물질로 표지될 수 있다. 예를 들어, 표지물질로는 로다민(rhodamine), FITC, CFSE와 같은 형광 물질, GFP, EGFP, YFP, CFP 또는 RFP와 같은 형광 단백질이 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 방사성 물질 또는 발광성 물질 등 다양한 표지물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 다양한 암세포주를 이용한 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동의 상관관계를 규명함으로써 백신이나 항체를 이용하여 에피틴의 암의 진행과 전이를 제어할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 상피세포암 표적물질인 에피틴과 이를 발현하는 암세포의 내피세포 투과 이동이 암전이와 깊은 상관관계를 갖는 것을 밝히고, 이러한 내피세포 투과 이동 어세이를 이용하여 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질을 스크린하는 기반기술을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 암전이를 억제하는 항원 펩타이드 및 이를 포함하는 암전이 백신은 암전이 항원으로서 기능하여 면역반응을 유도하여 항체를 생성하고, 암세포의 전이를 억제할 수 있어 암전이의 예방 및 치료에 매우 유용하다.
본 발명의 상기 및 다른 기술적 과제와 특징은 다음과 같은 도면을 참조하여 이루어지는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통하여 당업자에게 명확해 질 수 있을 것이다.
도 1은 에피틴의 단백질 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 내피세포 투과 이동 어세이를 단계별로 설명하는 도면이다.
도 3은 본 발명의 내피세포 투과 이동 어세이에 있어서 내피세포층을 이동한 형광단백질로 표지된 세포의 형상과 위치를 나타내는 현미경사진이다.
도 4는 본 발명의 내피세포 투과 이동 어세이를 이용하여 MS1 내피세포층을 투과 이동한 GFP-427 세포수와 GFP-427-Epi-KD 세포수를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 내피세포 투과 이동 어세이를 이용하여 MS1 내피세포층을 투과 이동한 427 세포수와 427-Epi-KD 세포수를 비교한 그래프이다.
도 6은 4T1 세포주로부터 유래한 에피틴 유전자 녹다운 클론들과 대조군 클론들(A7, D5, B3, C5, G3)에 대해 항-에피틴 항체인 mAb5를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 7은 본 발명의 내피세포 투과 이동 어세이에 있어서, 에피틴을 유효하게 발현하는 A7 및 D5 클론들의 세포들은 내피세포층을 유효하게 투과이동하는 반면에 에피틴 발현이 녹다운된 B3, C5 및 G3 클론들의 세포들은 내피세포층을 용이하게 투과이동하지 못하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 내피세포 투과 이동 어세이에 있어서, 에피틴 발현이 녹다운된 B3 클론을 pcDNA3.1/메트립타아제로 트랜스펙션시켜 얻은 AB-B3 클론의 세포들에서 TEM 능력이 회복된 것을 보여주는 그래프이다.
도 9는 4T1 세포주로부터 유래한 클론들이 주입된 마우스의 폐로 전이된 종양 결절을 촬영한 사진들이다.
도 10은 도 9의 종양결절들의 수를 계수하고 각 클론별로 수치화한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 항원 올리고펩타이드에 의해 면역 유도된 마우스 항체 AG22-1, AG22-3, AG22-5에 의해 4T1 세포주 유래의 암세포의 내피세포 이동이 저해된 것을 보여주는 그래프이다.
도 12는 도 11의 항체 투여시 암세포 이동수를 백분율로 표시한 그래프이다.
도 13은 1차 동물실험에서 마우스 Adj, Adj+Epi-2LDL, Adj+Epi-4LDL, Adj+Epi-SP 그룹에 각각 면역 증강제, "면역 증강제+Epi-2LDL", "면역 증강제+Epi-4LDL" 및 "면역 증강제+Epi-SP로 면역하고 암세포를 주입한 후 각 그룹별로 측정한 생존 곡선이다.
도 14는 도 13의 실험과정에서 19일째 되는날 마우스의 폐를 따로 떼어내 디쉬에 놓고 촬영한 사진이다.
도 15는 도 13의 실험 후 Adj, Adj+Epi-2LDL, Adj+Epi-4LDL, Adj+EpiSP 그룹의 폐무게 및 결절수를 수치화한 그래프이다.
도 16은 도 13의 실험 후 Adj 그룹의 결절수의 평균값을 기준으로 전체 개체를 그 평균 값으로 나누어 백분율을 구한 후 각 그룹별로 나타낸 그래프이다.
도 17은 2차 동물실험에서 마우스 Adj, Adj+2LDL, Adj+4LDL, Adj+SP 그룹에 각각 면역 증강제, "면역 증강제+Epi-2LDL", "면역 증강제+Epi-4LDL" 및 "면역 증강제+Epi-SP로 면역하고 암세포를 주입한 후 각 그룹별로 결절이 생긴 폐의 표면을 촬영한 사진이다.
도 18은 도 17의 실험 후 Adj, Adj+2LDL, Adj+4LDL, Adj+SP 그룹의 결절수를 수치화한 그래프 및 Adj 그룹의 결절수의 평균값을 기준으로 전체 개체를 그 평균 값으로 나누어 백분율을 구한 후 각 그룹별로 나타낸 그래프이다.
도 19는 3차 동물실험에서 각 그룹별로 "면역 증강제+Epi-SP" 및 "면역 증강제+Epi-SP-sc"로 면역하고 4T1 암세포(4T1 Con-D5 또는 4T1 EpiKD-B3)를 주입한 후 각 그룹별로 결절이 생긴 폐의 표면을 촬영한 사진이다.
도 20은 도 19의 실험 후 각 그룹별로 결절수를 수치화한 그래프이다.
도 21은 도 19의 실험 후 Adj+4T1 그룹의 결절수의 평균값을 기준으로 전체 개체를 그 평균 값으로 나누어 백분율을 구한 후 각 그룹별로 나타낸 그래프이다.
도 22는 Adj+SP+4T1 그룹에서 얻은 혈청으로 MCF7에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행한 전기영동결과 사진이다.
도 23은 본 발명의 항원 올리고 펩타이드로 형성된 항체가 에피틴에 의해 유도되는 427.1.86 세포의 세동이동을 억제하는 것을 보여주는 사진이다.
도 24는 본 발명의 항원 올리고 펩타이드로 형성된 항체가 수용성 에피틴에 의해 유도되는 MS1 세포의 세동이동을 억제하는 것을 보여주는 사진이다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
재료 및 방법
사용된 시약, 항체 및 실험동물 등
본 발명의 하기 실시예들에서 사용된 대부분의 시약들은 미국의 Invitrogen Corporation으로부터 구입하였다. 항-에피틴(항-메트립타아제) 항체(H-270), 항-Tie2 항체, 대조군 shRNA 렌티바이러스(short hairpin lentivirus) 및 에피틴 shRNA 렌티바이러스는 미국의 Santa Cruz Biotechnology, INC로부터 구입하였고, 항-튜불린(anti-tubulin)은 미국의 Sigma로부터 구입하였으며, 단클론 항체 mAb5는 본 발명자가 발표한 이전의 문헌에 기술된 바에 따라 준비하였다(E.G. Cho, M.G. Kim, C. Kim, S.R. Kim, I.S. Seong, C. Chung, R.H. Schwartz, D. Park, N-terminal processing is essential for release of epithin, a mouse type II membrane serine protease, J Biol Chem 276 (2001) 44581-44589). 그리고, pcDNA3 벡터는 Invitrogen Corporation에서 구입하였고, pcDNA3/eGFP 벡터 및 pcDNA3.1/메트립타아제 벡터는 각각 pcDNA3 벡터에 eGFP 유전자 및 메트립타아제 유전자를 재조합하여 준비하였다. 또한, 폐로 암전이가 되는 것을 확인하기 위해 사용된 BalB/c 마우스는 (주)대한바이오링크(대한민국, 충청북도 소재)로 구입하여 사용하였다.
사용된 세포주들 및 세포 배양
암세포주들(427.1.86, 4T1 등)은 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하여 유지시켰다. 그리고, 쥐의 내피세포(Mouse endothelial cell)인 MS1은 5% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 배양하여 유지시켰다. 또한, 에피틴을 과발현하는 427.1.86 암세포에서 에피틴을 녹다운(knock-down)(발현 억제 또는 차단 의미)시킨 427 Epi-KD 세포주를 구축하기 위해, 다음과 같은 2개의 합성 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 pSUPER-epi 구조체를 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 pcDNA3 벡터에 재조합한 후 427.1.86 암세포에 트랜스펙션시켰다. 그리고, 800㎍/ml G418의 존재 하에서 10일 동안 생장시킨 후 단백질과 RNA 발현 레벨이 안정적으로 녹다운된 단일 세포를 선정하여 이로부터 427 Epi-KD 세포주를 구축하였다.
정방향 스트랜드 (서열번호 5):
5'-GATCCCC GGTGCGCTTCAAACTCTTC TTCAAGAGA GAAGAGTTTGAAGCGCACC TTTTTA-3'
역방향 스트랜드 (서열번호 6):
5'-TCGATAAAAA GGTGCGCTTCAAACTCTTC TCTCTTGAA GAAGAGTTTGAAGCGCACC GGG-3'
상기 서열번호 5 및 서열번호 6에 있어서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 염기들의 서열부분은 에피틴을 표적으로 하는 서열을 나타낸다.
그리고, GPF-427 세포주 및 GFP-427 Epi-KD 세포주는 pcDNA3 벡터 대신에 pcDNA3/eGFP 벡터를 사용한 것을 제외하고는 427 Epi-KD 세포주 구축과 유사한 방법으로 구축하였다. 4T1 세포를 대조군 shRNA 렌티바이러스(short hairpin lentivirus) 또는 에피틴 shRNA 렌티바이러스(에피틴 발현을 사일런싱하는 shRNA를 코딩하는 렌티바이러스임)로 트랙스펙션시키고, 2 ㎍/ml 퓨로마이신(puromycin) 존재 하에서 생장시킨 후 단일 세포 선정과정을 통해 4T1 유래 클론들(A7, D5, B3, C5, G3)을 얻었다. A7 및 D5 클론들은 대조군 shRNA 렌티바이러스로 트랜스펙션시켜 얻은 4T1 세포의 클론들로서 에피틴을 유효하게 발현하고, 반면에 B3, C5 및 G3 클론들은 에피틴 shRNA 렌티바이러스로 트랜스펙션시켜 얻은 4T1 세포의 클론들로서 에피틴 발현이 녹다운되어 있다. 또한, AB-B3 클론은 상기 B3 클론을 pcDNA3.1/메트립타아제로 트랜스펙션시켜 얻은 클론으로서 다시 인간에서 유래된 메트립타아제를 유효하게 발현한다. 벡터들은 리포펙타민(Invitrogen에서 구입)을 이용하여 세포들에 트랜스펙션되었다.
웨스턴 블롯팅 분석법
본 발명의 실시예들에서 사용된 웨스팅 블롯팅 분석법은 당업계에 이미 잘 알려진 방법에 따라 실시하였다. 단백질 샘플들은 환원 조건 하에서 10% 아크릴아미드 겔(acrylamide gel)상에서 분리하였다. 분리된 단백질들의 시각화를 위해 HRP(horseradish peroxidase)가 접합된 2차 항체가 사용되었고, 증강된 화학발광 시약(enhanced chemiluminescence reagents)(Amersham)을 처리하였다.
실시예
실시예 1:
내피세포 투과 이동 어세이(Transendothelial migration assay)
에피틴을 발현하는 암세포의 전이 과정을 연구하기 위하여 에피틴 발현 정도에 따라 TEM(Transendothelial cell migration) 정도에 차이가 있는지를 MS1 세포를 이용하여 테스트하였다. 또한, 이미징 장비를 이용하여 동물 내 암세포 전이정도를 확인하기 위해 형광 단백질을 발현하는 암세포주를 마련하여 생쥐의 암 모델에서 테스트하였다. 또한, 에피틴 발현이 녹다운된 세포주들(도 6 내지 도 8의 B3, C5 및 G3 클론)을 마련하여 세포배양과 생쥐의 암 모델에서 이용하였다(도 9 및 도 10 참조). 본 실시예에서는 다양한 암세포주를 이용한 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동의 상관관계를 규명하고, 이를 생쥐의 암 모델에서 형광으로 염색한 암세포의 전이에 의해 확인함으로써 생쥐 혈관 내피세포 MS1을 이용한 내피세포 투과 이동 어세이(Transendothelial cell migration assay) 방법을 정립하였다(도 2 참조). 이하에서는 이에 대해 상세히 설명한다.
실시예
1-1: 내피세포 간의 이동에 대한 현미경 분석법
MS1 세포를 12-웰 플레이트의 젤라틴-코팅된 커버슬립에서 배양하여 밀집된 단일층(confluent monolayer)으로 형성하였다. 안정적으로 GFP 형광단백질을 발현하는 GFP-427 세포 및 GFP-427-Epi-KD 세포를 CellstripperTM(Cellgro)를 이용하여 분리하고 배양 배지에 105개 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 세포 재현탁액 1 ml을 각각의 MS1 단일층에 첨가하였다. 8시간 후 세포를 세척하고 고정한 다음, 세포를 로다민이 접합된 팔로이딘(Molecular probe)으로 염색하고(액틴을 적색으로 염색함), 10X 플라나포크로마트 대물렌즈(Planapochromat objective lens)가 장착된 형광 현미경(Axiovert 200M, Zeiss)으로 관찰하였다. AxioVision RE 소프트웨어(Zeiss)를 이용하여 이미지들을 분석하였다. 내피세포층을 이동한 세포를 GFP 형광단백질 및 F-액틴 패턴에 기반한 형태에 따라 분석하였다. 2X 디지털 줌 세팅 하의 40X/1.2W Korr 렌즈를 포함하는 LSM510으로 광학 절편(optical sections)을 획득하고 LSM 이미지 브라우저(Image Browser)(Carl Zeiss)를 이용하여 촬영된 이미지를 모아서 정리하였다(도 3 참조).
실시예 1-
2: 보이덴 챔버(Boyden Chamber)(Falcon)의 이용 방법
5×104 개의 MS1 세포가 밀집된 상태에 도달할 때까지 8㎛ 동공 챔버(pore Chamber; Insert, Falcon)에서 배양하였다. 4T1 세포를 CFSE(Molecular ProbesTM)로 염색하여 혈청이 없는 DMEM 배지에 재현탁하였다. CFSE로 염색된 105 개의 4T1 세포를 MS1 세포층에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 세포들을 3.7% 포름알데하이드(Sigma)로 고정한 후 이동되지 않은(unmigrated) 4T1 세포들을 제거하고 세척하였다. AxioCam MRm(Zeiss)가 장착된 IX-51 현미경(Olympus)을 이용하여 CFSE-양성 세포들의 이미지들을 얻었으며, 세포수를 ImageJ(National Institute of Health)로 분석하였다(도 2, 도 7 및 도 8 참조).
실시예 1-3: 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동의 상관관계 규명
도 3에 도시된 바와 같이, GFP 형광단백질 및 F-액틴에 의해 시각화된 형태에 기초하여 둥근 형태의 세포들(도 3의 c)은 MS1 내피세포층에 부착된 GFP-427 세포 또는 GFP-427-Epi-KD 세포로 계수하고, 스핀들이나 다각형의 세포들(도 3의 f 및 i)은 MS1 내피세포층을 투과 이동한 GFP-427 세포 또는 GFP-427-Epi-KD 세포로 계수하였다. 수직 절편으로 촬영한 이미지에서 둥근 형태의 세포들은 MS1 세포층 상에 부착된 반구형태(도 3의 c')로 관찰되는 반면에, 스핀들이나 다각형의 세포들은 MS1 세포층에 분산되거나 MS1 세포 사이에 위치하는 것(도 3의 f' 및 i')으로 관찰되었다. 도 3의 f에 표시된 "*"표는 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)를 나타낸다. 그리고, 3회에 걸친 실험을 통해 GFP 형광단백질 양성인 세포들에 있어서 필드 당 MS1 내피세포층에 부착된 GFP-427 세포수 및 MS1 내피세포층을 투과 이동한 GFP-427 세포수의 평균값을 구하고, 또한 관찰된 필드 당 MS1 내피세포층에 부착된 GFP-427-Epi-KD 세포수 및 MS1 내피세포층을 투과 이동한 GFP-427-Epi-KD 세포수의 평균값을 구한 후, MS1 내피세포층을 투과 이동한 GFP-427 세포수와 GFP-427-Epi-KD 세포수를 비교하였다(도 4 참조).
도 4는 에피틴을 발현하는 세포 GFP-427과 에피틴 발현이 녹다운된 세포 GFP-427-Epi-KD에 있어서 전체 세포수에 대해 투과 이동한 세포수를 백분율로 나타내어 비교하고 있다. 그 결과, 에피틴을 발현하는 세포(GFP-427)에서는 63%가 MS1 세포층을 투과 이동한 반면에, 에피틴 발현이 녹다운된 세포(GFP-427 Epi-KD)에서는 42%만이 MS1 세포층을 투과 이동하여 에피틴의 발현 감소가 TEM 능력을 감소시켰음을 알 수 있다. 도 5에서 재차 확인되는 바와 같이, TEM 어세이를 수행하면 에피틴을 다량 발현하는 흉선상포암 세포주 427을 shRNA로 트랜스펙션시켜 에피틴 발현을 녹다운시킨 427 Epi-KD 세포에서는 TEM 능력이 현저히 감소함을 알 수 있고, 이로부터 에피틴이 암세포의 내피세포 이동에 중요한 기능을 하고 있음을 확인할 수 있으며 에피틴이 암전이에도 관여함을 알 수 있다. 뿐만아니라 이는 TEM 어세이가 암전이 관련 표적 물질 확인 및 암전이 억제 물질 확인에 유효하게 활용될 수 있음을 보여주는 것이다. 한편, 도 4 및 도 5에서 에러 바(error bar)는 표준편차를 나타내고, 별표(*)는 통계학적 유의적 수준이 P <0.01인 것을 나타낸다.
실시예 1-4: 에피틴 과발현 암세포주가 아닌 4T1 유방암 세포주를 이용한 실험을 통해 TEM 어세이의 암전이 실험모델로서의 신뢰성 검증
마우스의 유방암 세포주인 4T1과 전술한 바와 같은 방식으로 4T1 세포주로부터 유래한 클론들(A7, D5, B3, C5, G3)을 이용하여 실험을 수행하였다. 우선, 4T1과 A7, D5, B3, C5, G3 클론에 대해 항-에피틴 항체인 mAb5를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하여 에피틴의 발현 수준을 체크하고 동일한 양이 로딩되었는지는 항-튜불린 밴드로 확인하였다(도 6 참조). 4T1 세포주 유래의 각 클론들에 대해 실시예 1-2에서 설명한 보이덴 챔버 방식을 이용한 TEM 어세이를 수행하여 MS1 내피세포층을 투과 이동한 세포수를 계수하고 이를 각 클론별로 수치화하여 그래프화하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 에피틴을 유효하게 발현하는 A7 및 D5 클론들의 세포들은 내피세포층을 유효하게 투과이동하는 반면에 에피틴 발현이 녹다운된 B3, C5 및 G3 클론들의 세포들은 내피세포층을 용이하게 투과이동하지 못하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 에피틴 발현이 녹다운된 B3 클론을 pcDNA3.1/메트립타아제로 트랜스펙션시켜 얻은 AB-B3 클론의 세포들은 메트립타아제의 발현으로 내피세포층을 유효하게 투과이동하여 TEM 능력을 회복한 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조). 한편, 도 7 및 도 8에서 표시된 각 점들은 현미경 관찰 필드에서 투과이동된 세포수를 나타내고, 이들에 대한 평균값과 표준 편차가 그래프에 표시되어 있으며, 별표(*)는 통계학적 유의적 수준이 p<0.001이고 별표(**)는 통계학적 유의적 수준이 p<0.01인 것을 나타낸다.
혈관 내피세포 투과 이동(transendothelial migration)이 암전이의 필수적인 단계임을 감안할 때, 유방암 세포인 4T1을 대조군 shRNA로 트랜스펙션시켜 유도한 A7 및 D5 클론들의 세포들(에피틴 발현)에서는 TEM 능력이 유지되었으나 유방암 세포인 4T1을 에피틴 shRNA로 트랜스펙션시켜 유도한 B3, C5 및 G3 클론들의 세포들(에피틴 녹다운)에서는 TEM 능력이 결여되었다는 사실은 에피틴이 내피세포 이동에 중요한 역할을 하며 나아가 암전이에 깊이 관여한다는 것을 시시한다. 특히, 에피틴 발현이 녹다운된 B3 클론을 다시 매트립타아제 벡터로 트랜스펙션시키면 TEM 능력이 회복된 점은 이러한 사실을 더욱 강력히 뒷받침하며, 이는 TEM 어세이가 암전이 실험모델로서 신뢰도를 갖고 이용될 수 있음을 입증하는 것이다.
실시예 2: 생체내(in vivo) 전이 어세이를 통한 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동의 상관관계 검증
PBS 용액 내의 5 x 104 개의 4T1 세포주로부터 유래한 클론들(A7, D5, B3, C5, G3)이 각각 6마리의 Balb/c 마우스[(주)대한바이오링크에서 구입]의 꼬리 정맥을 통해 주입되었다. 상기 4T1 세포주로부터 유래한 클론들이 주입된 마우스를 14일 후에 희생시키고 PBS에 녹여진 인디언 잉크(일반적인 먹물로 제조사에 관계없이 사용가능)를 기관(trachea)을 통해 주입하여 폐를 염색하였다. 염색된 폐를 해부하여 PBS로 적절하게 세척한 후, 각 클론 마다 이미지를 얻어 종양 결절(nodules)을 계수하였다(도 9 참조). 그리고 계수된 결과를 각 클론별로 수치화하여 그래프화하였다(도 10 참조).
도 9에 도시된 바와 같이, 에피틴을 유효하게 발현하는 A7 및 D5 클론들의 세포들이 주입된 마우스의 폐에서는 전체 표면이 종양 결절로 덮혀 있는 반면에, 에피틴 발현이 녹다운된 B3, C5 및 G3 클론들의 세포들이 주입된 마우스의 폐를 덮고 있는 종양 결절의 수는 현저히 감소됨을 알 수 있다. 도 10은 이러한 육안으로 확인한 결과를 수치화한 것으로서 에피틴이 암전이를 유효하게 유도하는 것을 보여준다. 도 10에는 각 클론 별로 종양 결절 수에 대한 평균값과 표준 편차가 그래프에 표시되어 있으며, 별표(*)는 통계학적 유의적 수준이 p<0.001이고 별표(**)는 통계학적 유의적 수준이 p<0.01인 것을 나타낸다.
이러한 생체내 실험 결과는 실시예 1의 내피세포 투과 이동 어세이 결과와 일치하였다. 따라서, 본 실시예는 에피틴이 암진행 및 전이에 관계하는 중요 물질임을 재차 확인시켜 주는 동시에 에피틴 발현 정도와 혈관 내피세포 투과 이동이 서로 밀접한 상관관계를 갖는 것을 보여줌으로써 실시예 1의 내피세포 투과 이동 어세이가 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질을 스크린하는 유효한 방법임을 입증하고 있다.
실시예 3: 본 발명의 암전이를 억제하는 항원 펩타이드의 항체 유도 여부 확인과 이 항체를 이용한 혈관 내피세포 투과 이동 어세이
면역성을 이용하여 암전이를 제어하기 위하여 에피틴의 항원성이 면역항체를 만들 수 있는지에 대해 시험하였다, 면역관용을 일으키는데 중요한 기능을 하는 흉선미세환경에서 에피틴 단백질이 발현하기 때문에 에피틴이 면역 반응을 일으키는지 여부는 암전이 백신 개발과 단클론 항체 개발 가능성에 있어서 가장 중요한 확인과정이다. 항원가능성이 높고 인간과 생쥐에 동시에 면역항원으로 가능한 올리고 펩타이드를 선정하여 마우스에 대해 면역을 시행하여 항체 형성을 검증하였다.
이를 위해 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드 또는 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드를 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)과 결합시켜 6마리의 마우스에 3회에 걸쳐 면역시킨 후 3일후 혈청을 회수하여 ELISA 분석을 하였고 항체 형성량이 많은 마우스 3마리를 선정하였다. 그리고 이들 항체(AG22-1, AG22-3, AG22-5)가 에피틴에 의한 암전이를 억제하는지 여부를 확인하기 위해 실시예 1-2에서 설명된 내피세포 투과 이동 어세이(TEM)를 수행하였다.
즉, 혈관 내피를 구성하는 혈관내피 세포(MS1)를 보이덴 챔버(Boyden chamber)에서 배양하여 밀집된 층을 형성하고, 4T1 암세포주로부터 유래한 에피틴을 유효하게 발현하는 D5 클론의 1x105 개 세포를 혈관내피 세포와 구별하기 위하여 CFSE라는 형광물질로 표지하고 내피세포층 상에 투여하였다. 이때 암세포의 이동을 촉진하기 위해서 혈청의 농도차를 주었으며, 암세포의 이동에 관여하는 인자들을 알아보기 위하여 세포의 단백질 발현을 조절하거나 항체를 투여하여 내피세포 투과 이동 어세이를 수행하였다. 그리고, 혈관내피세포의 반대편으로 이동하는 D5 암세포의 수를 계수하되, 항체를 첨가하지 않은 경우, 앞선 실험에서 유도된 항체(AG22-1, AG22-3, AG22-5)들을 각각 첨가한 경우 그리고 양성 대조군인 H270 항체를 사용한 경우로 나누어 측정하였다. 항체 AG22-1, AG22-3, AG22-5 및 H270 항체의 양은 일반적으로 사용되는 혈청의 양을 기준으로 본 실험에 이용하였고, 본 실험에 사용된 세포 배지의 양(0.5ml)을 기준으로 5㎕씩 사용하였다(1:100 희석비). 측정된 결과는 도 11에 도시된 바와 같으며 항체 AG22-1, AG22-3, AG22-5에 의해 암세포의 이동이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 도 12에는 항체가 투여되지 않은 경우를 100으로 하여 항체 투여시 암세포 이동수를 백분율로 표시하였다. 그 결과, 본 발명의 항원 올리고펩타이드에 의해 면역 유도된 마우스 항체 AG22-1, AG22-3, AG22-5는 4T1 세포주 유래의 암세포에 대해 각각 대략 63%, 48%, 34% 정도의 암세포 이동 억제력을 보이고 있음을 관찰하였다. 따라서, 본 발명의 항원 올리고펩타이드는 면역 반응을 유도하여 항체를 생성하고 생성된 항체는 내피세포 투과 이동 어세이에서 암세포 이동을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명의 항원 올리고펩타이드는 암전이 백신으로서 암세포의 전이 과정을 억제하는 효과가 있다고 할 수 있다.
실시예 4: 본 발명의 암전이를 억제하는 항원 펩타이드를 이용한 동물실험
실시예 3의 결과를 바탕으로 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드 또는 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드가 면역반응 유도에 의한 암전이 백신으로 기능하는지를 Balb/c 마우스를 이용하여 확인하였다.
실시예 4-1: 1차 동물실험을 통한 백신 효능 테스트
서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드(이하, "Epi-SP"로 약칭함), 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드(이하, "Epi-2LDL"로 약칭함) 또는 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드(이하, "Epi-4LDL"로 약칭함)가 4T1 암세포의 전이에 미치는 영향을 알아보기 위하여 한 그룹당 10마리의 마우스 Balb/c로 구성된 총 4개의 그룹(Adj, Adj+Epi-2LDL, Adj+Epi-4LDL, Adj+EpiSP)에 각각 면역 증강제(Adjuvant), "면역 증강제+Epi-2LDL", "면역 증강제+Epi-4LDL" 및 "면역 증강제+Epi-SP"를 3주에 한번씩 총 3번 주사하였다. 첫번째 주사시에서는 50㎍ 올리고 펩타이드와 CFA를 섞어(100㎕ PBS 용액 내의 50㎍ 올리고 펩타이드 + 100㎕ CFA) 각 마우스에 복강내 주사하였고, 두번째 주사시부터는 20㎍ 올리고 펩타이드를 IFA와 섞어 (100㎕ PBS 용액 내의 20㎍ 올리고 펩타이드 + 100㎕ IFA) 각 마우스에 복강내 주사하였다(면역증강제와 올리고 펩타이드의 부피비는 1:1로 조정). 그리고 세번째 주사 후 3일째 되는 날, 각 마우스에 4T1 암세포 5×105개/200㎕ PBS를 정맥주사하였다. 19일째 되는 날 마우스의 무게, 폐를 따로 떼어내 폐의 무게, 폐에 생긴 결절수를 세었다(도 14 참조). 폐의 무게와 결절수를 측정하기 위해 마우스를 죽인 후 폐만 따로 떼어내고 떼어낸 폐를 각각 35mm 디쉬(dish)에 올려놓고 사진을 찍고, 사진 상에 나타난 폐에서 흰색의 혹처럼 튀어나온 결절의 수를 세었다. 도 14에서 "사망(dead)"이라고 표시된 것은 확인하기 전에 이미 죽어있던 마우스의 폐이다. 혹의 크기와 관계없이 수를 세었고, 혹 사이가 갈라져 있을 경우에는 각각 다른 혹으로 생각하여 수를 세었다. 또한, 눈에서 피를 뽑아 혈청을 얻었다.
구체적으로, Graphpad prism 5 프로그램을 사용하여 각 그룹별로 전술한 실험결과에 대한 생존 곡선(survival curve)을 그렸다(도 13 참조). 4T1 암세포를 주사하고 17일째 되는 날, Adj 그룹의 9마리의 마우스 중 4마리가 죽었고, Adj+Epi-2LDL 그룹의 10마리의 마우스 중 1마리가 죽었다. 18일째 되는 날, Adj+Epi-2LDL 그룹에서 1마리가 더 죽었고, Adj+Epi-4LDL 그룹의 8마리의 마우스 중 1마리가 죽었다. 전이 여부(Metastasis)를 확인하는 19일째 되는 날까지 Adj+EpiSP 그룹의 마우스는 9마리 중 9마리 모두 살아남았다. 이를 도표로 정리하면 하기의 표 1과 같다.
표 1.암백신 3차 면역후 암세포 이식한 경우 19일째 생존률 결과
4T1 암세포를 주사한 후 19일째 되는 날, 각 그룹별 생존률은 Adj에서 55.6%, Adj+Epi-2LDL에서 80%, Adj+Epi4LDL에서 87.5%, 그리고 Adj+EpiSP에서 100%로서 Adj+EpiSP에서 가장 생존률이 높았다. 또한, Graphpad prism 5 프로그램을 사용하여 Adj, Adj+Epi-2LDL, Adj+Epi-4LDL, Adj+EpiSP 그룹의 폐무게 및 결절수를 그래프로 그렸다(도 15). 도 15는 평균값과 표준오차를 사용하여 나타내었다. 폐무게의 경우는 Adj 그룹에서 가장 무거웠고, Adj+Epi-2LDL 그룹, Adj+Epi-4LDL 그룹, Adj+EpiSP 그룹순으로 가벼웠다. 결절수는 Adj 그룹에서 가장 많았고, Adj+Epi-2LDL 그룹, Adj+Epi-4LDL 그룹, Adj+EpiSP 그룹순으로 적었다. Adj 그룹의 결절수의 평균값을 기준으로 놓고 전체 개체를 그 평균 값으로 나누어 백분율을 구하고, 다시 각각의 그룹별로 Prism 5 프로그램을 사용하여 그래프를 그렸다(도 16). 도 16은 평균값과 표준오차를 사용하여 나타내었다. Adj 그룹에 비해 Adj+2LDL 그룹에서 14%, Adj+4LDL 그룹에서 20%, Adj+SP 그룹에서 42% 정도 결절수가 감소하였다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩타이드로 면역을 하였을 때 암전이 억제효과가 가장 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 4-2: 2차 동물실험을 통한 백신 효능 테스트
실시예 4-1에서의 테스트를 통해 본 발명의 항원 올리고펩타이드가 마우스에서 암전이를 효과적으로 억제하는 것으로 확인이 되었는데, 이러한 결과가 개체간 차이나 실험상의 오류로 인한 우연한 결과인지를 확인하기 위해 그룹 당 마우스 마리수를 늘려 각 그룹당 20마리의 마우스를 사용하여 테스트를 반복하였다. 한 그룹당 20마리의 마우스 Balb/c로 구성된 총 4개의 그룹(Adj, Adj+2LDL, Adj+4LDL, Adj+SP)에 각각 면역 증강제(Adjuvant), "면역 증강제+Epi-2LDL", "면역 증강제+Epi-4LDL" 및 "면역 증강제+Epi-SP"를 3주에 한번씩 총 3번 주사하였다. 첫번째 주사시에서는 50㎍ 올리고 펩타이드와 CFA를 섞어(100㎕ PBS 용액 내의 50㎍ 올리고 펩타이드 + 100㎕ CFA) 각 마우스에 복강내 주사하였고, 두번째 주사시부터는 20㎍ 올리고 펩타이드를 IFA와 섞어 (두번째 주사시에는 100㎕ PBS 용액 내의 20㎍ 올리고 펩타이드 + 100㎕ IFA; 세번째 주사시에는 50㎕ PBS 용액 내의 20㎍ 올리고 펩타이드 + 50㎕ IFA) 각 마우스에 복강내 주사하였다(면역증강제와 올리고 펩타이드의 부피비는 1:1로 조정). 그리고 세번째 주사 후 3일째 되는날, 각 마우스에 4T1 암세포 1×105개/200㎕ PBS를 정맥주사하였다. 암세포를 주사한 후 28일째 되는 날 마우스의 무게를 측정하고, 기관에 검은색 잉크 1ml을 넣어 폐를 검은색으로 염색하였다. 기관에 검은색 잉크를 넣어 폐를 염색한 다음 각각의 폐를 떼어 내어 디쉬(dish)에 담아 사진을 찍었다. 염색을 통해 폐와 결절의 구분을 좀더 명확하게 할 수 있었고, 염색이 되지 않은 흰색 혹을 결절이라고 생각하여 수를 세었다. 도 17의 사진은 각 그룹별로 결절이 생긴 폐의 표면을 촬영한 사진이다. 암세포를 주사한 후 28일째 되는 날, 결절수는 Adj 그룹에서 가장 많았고, Adj+4LDL 그룹, Adj+2LDL 그룹, Adj+SP 그룹순으로 적었다.
Graphpad prism 5 프로그램을 사용하여 Adj 그룹, Adj+2LDL 그룹, Adj+4LDL 그룹, Adj+SP 그룹의 결절수를 그래프로 그렸다. 또한, Adj 그룹의 결절수의 평균값을 기준으로 놓고 전체 개체를 그 평균 값으로 나누어 백분율을 구하고, 다시 각각의 그룹별로 Prism 5 프로그램을 사용하여 그래프를 그렸다(도 18). 도 18은 평균값과 표준오차를 사용하여 나타내었다. Adj 그룹에 비해 Adj+4LDL 그룹에서 58%, Adj+2LDL 그룹에서 62%, Adj+SP 그룹에서 70% 정도 결절수가 감소하였다. 따라서, 한 그룹당 20마리의 마우스를 사용하여 다시 실험한 결과도 실시예 4-1의 실험결과와 거의 동일함을 알 수 있고 본 발명의 항원 올리고 펩타이드가 유효한 백신으로서 사용될 수 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.
실시예 4-3: 3차 동물실험을 통한 백신 효능 테스트
실시예 4-1 및 실시예 4-2의 실험결과가 본 발명의 항원 올리고 펩타이드의 면역에 의한 것인지를 확인하기 위해 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 올리고 펩타이드(Epi-SP)와, 이에 대한 대조군인 스크램블된(scrambled) 올리고 펩타이드 Epi-SP-Sc(EQGKGARDWPEWAVQGVNT; 서열번호 4)를 만들어 그 효과를 비교하였다. 그리고 암 전이 억제 모델이 마우스 뿐만 아니라 사람에게도 적용될 수 있는지 시험하기 위해서 쥐와 사람에 모두 사용할 수 있는 면역증강제(Adjuvant)인 임젝트 알룸(Imject alum)을 사용하여 면역하였다. 또한, 에피틴 발현이 녹다운된 암세포주와의 비교를 하기 위하여 에피틴을 발현하는 4T1 Con-D5 세포주와 에피틴 발현이 녹다운된 암세포주 4T1 EpiKD-B3을 사용하였다. 한 그룹당 5마리의 Balb/c 마우스로 구성된 총 11개의 그룹(Adj, Adj+SP, Adj+SP+4T1Con-D5, Adj+SP+4T1EpiKD-B3, Adj+Sc+4T1Con-D5, Adj+Sc+4T1EpiKD-B3, Adj+4T1Con-D5, Adj+4T1EpiKD-B3, 4T1Con-D5, 4T1EpiKD-B3, None)중 8개의 그룹(Adj, Adj+SP, Adj+SP+4T1Con-D5, Adj+SP+4T1EpiKD-B3, Adj+Sc+4T1Con-D5, Adj+Sc+4T1EpiKD-B3, Adj+4T1Con-D5, Adj+4T1EpiKD-B3)에 면역 증강제(Adjuvant), "면역 증강제+Epi-SP" 또는 "면역 증강제+Epi-SP-sc"를 3주에 한번씩 총 3번 주사하였다. 첫번째 주사시에서는 50㎍ 올리고 펩타이드를 임젝트 알룸(Imject alum)과 섞고 두번째 주사부터는 20㎍ 올리고 펩타이드를 임젝트 알룸(Imject alum)과 섞어(첫번째 주사-50㎕ PBS 용액 내의 50㎍ 올리고 펩타이드 + 50㎕ 임젝트 알룸; 두번째 주사-50㎕ PBS 용액 내의 20㎍ 올리고 펩타이드 + 50㎕ 임젝트 알룸) 각 마우스에 복강내 주사하였다(면역증강제와 올리고 펩타이드의 부피비는 1:1로 조정). 그리고 세번째 주사 후 3일째 되는 날, 각 마우스에 4T1 암세포(4T1 Con-D5 또는 4T1 EpiKD-B3) 5×105개/200㎕ PBS를 정맥주사하였다. 암세포를 주사한 후 17일째 되는 날 마우스의 무게를 측정하고, 기관에 검은색 잉크 1ml을 넣어 폐를 염색한 다음 각각의 폐를 떼어 내어 디쉬(dish)에 담아 사진을 찍었다. 도 19의 사진은 각 그룹별로 결절이 생긴 폐의 표면을 촬영한 사진이다. 염색을 통해 폐와 결절의 구분을 좀더 명확하게 할 수 있었고, 염색이 되지 않은 흰색 혹을 결절이라고 생각하여 수를 세었다. 암을 주사한 후 17일째 되는 날, 면역 증강제+Epi-SP로 면역하고 4T1 con-D5를 주입한 마우스의 결절수는 면역 증강제+Epi-SP-Sc로 면역하고 4T1 con-D5를 주입한 마우스의 결절수 보다 적었고, 면역증강제로만 면역하거나 면역하지 않고 4T1 con-D5를 주입한 마우스의 결절수 보다 적었다. 또한, 면역 증강제+Epi-SP로 면역하고 4T1 con-D5를 주입한 마우스의 결절수는 에피틴 발현이 녹다운된 4T1 EpiKD-B3를 주입한 마우스의 결절수와 비슷하였다.
Graphpad prism 5 프로그램을 사용하여 각 마우스 그룹별 노듈수를 그래프로 그렸다. 도 20은 평균값과 표준오차를 사용하여 나타내었다. Adj+SP+4T1 그룹에서 평균값의 표준오차를 크게 상회하는 값을 제외하고 비교하였을 때, 에피틴을 발현하는 암세포주 4T1 con-D5를 주사한 마우스 그룹 중에서는 Epi-SP로 면역한 마우스의 결절수가 가장 적었고, Epi-SP-Sc로 면역한 마우스나 면역증강제로만 면역한 마우스 그리고 면역처리를 하지 않은 마우스 그룹에서는 훨씬 많은 노듈수가 계수되었다. 에피틴 발현이 녹다운된 4T1 EpiKD-B3를 주사한 마우스 그룹에서는 모두 비슷한 결절수가 계수되었고, Adj+SP+4T1 그룹의 결절수와 유사하였다. 또한, Adj+4T1 그룹의 결절수의 평균값을 기준으로 놓고 전체 개체를 그 평균 값으로 나누어 백분율을 구하고, 다시 각각의 그룹별로 Prism 5 프로그램을 사용하여 그래프를 그렸다(도 21). 도 21은 평균값과 표준오차를 사용하여 나타내었다. Adj+4T1 그룹에 비해 Adj+SP+4T1 그룹의 결절수가 74% 감소하였고, 이는 에피틴 발현이 녹다운된 4T1 EpiKD-B3를 주사한 다른 마우스 그룹과 유사한 비율로 감소한 것이었다.
사람에서 사용되는 면역증강제인 알룸(Alum)을 사용한 경우에는 실시예 4-1 및 4-2의 CFA 및 IFA를 사용한 결과와 유사한 결과를 얻어 본 실험을 사람에게도 적용할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 Epi-SP 항원 올리고 펩타이드와 대조군인 Epi-SP-sc 올리고 펩타이드를 사용하여 마우스를 면역처리한 후 암세포를 주입하여 폐로 전이된 결절수를 비교한 결과, 본 발명의 Epi-SP 항원 올리고 펩타이드의 경우에만 전이된 결절수가 감소하였다. 이는 본 발명의 Epi-SP 항원 올리고 펩타이드가 특이적으로 암 전이를 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 에피틴 발현이 녹다운된 암세포주인 4T1 EpiKD-B3를 주사한 마우스 그룹에서는 결절의 형성이 4T1 con-D5를 주사한 마우스 그룹보다 적게 일어났다. 그리고, 4T1 EpiKD-B3를 주사한 마우스 그룹의 결절수는 본 발명의 Epi-SP 항원 올리고 펩타이드로 면역한 후 4T1 con-D5를 주사한 마우스 그룹의 결절수와 비슷하였다. 이를 통해 암세포 주사 후 폐로 전이된 결절을 억제하는데 있어서, 본 발명의 Epi-SP 항원 올리고 펩타이드로 면역하여 에피틴의 활성을 억제하는 방법이 에피틴 발현을 녹다운시킨 4T1 EpiKD-B3를 주사한 것과 비슷한 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
한편, 인간 유방암 세포주인 MCF7 세포의 세포파쇄물을 10% 젤에서 전기영동한 후 1차 항체로 항-메트립타아제 항체(H-270, Santacruz)와, 전술한 바와 같이 Adj+SP로 면역된 처리된 마우스로부터의 1번-4번 혈청 및 면역 후 암전이 실험을 한 마우스로부터의 5번 혈청을 사용하였다. H-270 항체는 컨트롤로 사용한 것으로서 화살표로 표시된 것이 항원 전체 크기(full size)를 나타내는 밴드이다. 즉, 도 22에서 확인되는 바와 같이, 면역된 처리된 마우스로부터 얻은 혈청으로 웨스턴 블롯팅을 하였을때, 인간의 메트립타아제를 전기영동시 확인시켜주는 H-270 처리에서와 같은 사이즈에서 밴드를 나타내었다. 결국, MCF7에 대해 H-270의 밴드와 같은 사이즈에서 밴드를 보이는 것을 통하여 본 발명의 Epi-SP 항원 올리고 펩타이드에 대한 항체가 MCF7에 있는 메트립타아제(또는 에피틴)와 결합할 수 있는 것을 알 수 있으며, 이는 마우스 내에서 형성된 항-Epi-SP 항원 올리고 펩타이드 항체가 인간 세포에 있는 메트립타아제(또는 에피틴)와도 결합하여 암세포의 전이에 영향을 주어 암진행 및 전이를 억제할 수 있다는 사실을 보여준다.
실시예 5: 세포이동 억제 시험
실시예 4-3의 과정을 통해 만들어진 항체의 기능적 효과 중 세포의 이동에 있어서의 항체의 효과를 확인하기 위한 시험관내(in vitro) 실험을 추가로 수행하였다. 세포는 에피틴을 발현하는 마우스의 427.1.86 세포를 사용하였다. 427.1.86 세포를 밀집되게 배양한 후 블루팁을 이용하여 세포층에 상처를 내고 배양배지(culture media)와 함께 각각 클론의 항체를 3:2의 비율로 더해 주었다. 그 후 20시간을 배양하고 세포의 이동을 현미경으로 관찰하였다. 항체를 넣어주지 않은 a번의 경우에는 세포의 이동이 관찰되는 반면에 실시예 4-3의 과정을 통해 얻은 본 발명의 항원 올리고 펩타이드에 대한 4가지 항체(c~f)를 각각 첨가한 경우에는 세포의 이동이 억제되는 것을 확인할 수 있다(도 23 참조). b번은 효과가 없다고 보여지는 음성(negative) 클론의 항체를 사용한 결과이며, g번은 하이브리도마(hybridoma)를 얻기 위해 면역한 마우스로부터 얻은 혈청(serum)을 사용한 결과이다. 이들 결과로부터 실시예 4-3의 과정을 통해 얻은 단클론 항체가 시험관내(in vitro) 실험에서 상피세포 암세포 자체의 이동을 억제한다고 볼 수 있다.
다음으로, 핏줄형성과 암의 전이에 중요하게 기능을 하는 내피 세포에서 위와 동일한 실험을 진행했다. 세포는 MS1을 사용하였고, 위와 동일한 방법으로 진행되었다. 그리고 에피틴에 의한 세포 이동이 일어나고 본 발명의 항체가 이를 억제 하는지 여부를 확인하려고 하는 실험목적을 감안하여 에피틴을 과발현하는 427.1.86 세포를 기른 조건배지(conditioned media; CM)를 첨가함으로써 CM에 포함된 수용성 에피틴을 첨가하고 이때 관찰되는 내피세포의 이동을 관찰하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, a번은 항체와 427.1.86 CM 모두 첨가하지 않은 경우에 MS1 세포 자체만으로 이동이 없음을 보여주고 있고, b번은 427.1.86 CM을 첨가하여 수용성 에피틴에 의한 세포의 이동이 유도되었음을 보여준다. d~g번은 본 발명의 항원 올리고 펩타이드에 대한 4가지 항체를 각각 첨가한 경우에는 세포의 이동이 억제되는 것을 보여주고, c번은 음성 클론의 항체, 그리고 h번은 하이브리도마(hybridoma)를 얻기 위해 면역한 마우스로부터 얻은 혈청(serum)을 사용한 결과를 보여준다. 도 24를 참조하면, 내피세포에서 수용성 에피틴에 의해 세포의 이동이 일어나며, 본 발명의 항원 올리고 펩타이드에 대한 항체에 의해 세포의 이동이 억제되는 것을 다시 한번 확인할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (14)
- 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 올리고펩타이드인 것을 특징으로 하는 암전이를 억제하는 항원 펩타이드.
- 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 올리고펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암전이 백신.
- 제2항에 있어서,항원 보조제 또는 면역 증강제를 더 포함하는 암전이 백신.
- 제2항 또는 제3항에 있어서,황산알루미늄, 수산화알루미늄, 수산화마그네슘, 인산알루미늄, 포스포러스 레시틴, 풀루로닉 폴리올(Pluronic polyol), 폴리아나이온(polyanion) 및 유성에멀젼으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 더 포함하는 암전이 백신.
- 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 올리고펩타이드를 코딩하는 DNA를 유효성분으로 포함하는 암전이 백신.
- 서열번호 1의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열(CGDGSDEEG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열(CSDGSDEKN)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열(CGDNSDEQG)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 9의 아미노산 서열(CSDGSDEKD)을 갖는 올리고펩타이드, 서열번호 10의 아미노산 서열(RQARVVGGTDADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열(KQARVVGGTNADEGEWPWQ)을 갖는 올리고펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원 펩타이드에 대한 면역반응으로 유도된 항체 또는 이러한 항체를 함유하는 혈청을 포함하는 암전이 억제 및 치료용 조성물.
- (a) 내피세포를 배양하여 내피세포 층을 준비하는 단계와, (b) 에피틴을 발현하는 세포를 배양하여 준비하는 단계와, (c) 상기 에피틴을 발현하는 세포를 상기 내피세포 층 상에 첨가하는 단계와, (d) 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 암전이 기준값을 결정하는 단계와, (e) 암전이 억제 후보물질을 첨가하여 상기 (a) 단계 내지 (c) 단계를 수행한 후 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 상기 (d) 단계에서 얻은 암전이 기준값과 비교하는 단계를 포함하는 암전이 억제물질의 스크린 방법.
- 제7항에 있어서,상기 내피세포 층은 쥐의 내피세포(Mouse endothelial cell)인 MS1 세포층인 것을 특징으로 하는 암전이 억제물질의 스크린 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서,상기 내피세포 층에 첨가되는 세포는 흉선 상피세포암 세포인 427.1.86 세포 또는 유방암 세포인 4T1 세포인 것을 특징으로 하는 암전이 억제물질의 스크린 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서,상기 내피세포 층에 첨가되는 세포는 표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 암전이 억제물질의 스크린 방법.
- (a) 내피세포를 배양하여 내피세포 층을 준비하는 단계와, (b) 암전이 관련 후보 표적물질을 발현하는 세포를 배양하여 준비하는 단계와, (c) 상기 암전이 관련 후보 표적물질을 발현하는 세포를 상기 내피세포 층 상에 첨가하는 단계와, (d) 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 암전이 기준값을 결정하는 단계와, (e) 암전이 관련 후보 표적물질의 발현 또는 활성을 감소시킨 세포를 준비한 후 이를 상기 내피세포 층 상에 첨가하고 상기 내피세포 층을 투과하여 이동한 세포수를 계수하여 상기 (d) 단계에서 얻은 암전이 기준값과 비교하는 단계를 포함하는 암전이 관련 표적물질의 스크린 방법.
- 제11항에 있어서,상기 내피세포 층은 쥐의 내피세포(Mouse endothelial cell)인 MS1 세포층인 것을 특징으로 하는 암전이 관련 표적물질의 스크린 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서,상기 내피세포 층에 첨가되는 세포는 흉선 상피세포암 세포인 427.1.86 세포 또는 유방암 세포인 4T1 세포인 것을 특징으로 하는 암전이 관련 표적물질의 스크린 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서,상기 내피세포 층에 첨가되는 세포는 표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 암전이 관련 표적물질의 스크린 방법.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020137011239A KR101500670B1 (ko) | 2010-11-02 | 2010-11-02 | 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물 그리고 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질의 스크린 방법 |
PCT/KR2010/007634 WO2012060480A1 (ko) | 2010-11-02 | 2010-11-02 | 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물 그리고 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질의 스크린 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/KR2010/007634 WO2012060480A1 (ko) | 2010-11-02 | 2010-11-02 | 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물 그리고 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질의 스크린 방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2012060480A1 true WO2012060480A1 (ko) | 2012-05-10 |
Family
ID=46024588
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/KR2010/007634 WO2012060480A1 (ko) | 2010-11-02 | 2010-11-02 | 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물 그리고 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질의 스크린 방법 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101500670B1 (ko) |
WO (1) | WO2012060480A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101644982B1 (ko) | 2015-07-23 | 2016-08-02 | 주식회사 엔솔바이오사이언스 | 신규 펩타이드 및 그 용도 |
KR102170077B1 (ko) | 2018-05-21 | 2020-10-27 | 인하대학교 산학협력단 | Prss14/st14의 자가분해 고리부분을 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이의 용도 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030092664A1 (en) * | 2002-10-09 | 2003-05-15 | Yonghong Xiao | Regulation of human epithin-like serine protease |
US20090155248A1 (en) * | 1999-09-30 | 2009-06-18 | The Regents Of The University Of California | Antibodies to MT-SP1 serine protease |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE60143880D1 (de) * | 2000-02-03 | 2011-03-03 | Dendreon Corp | Nukleinsäuren, welche für tramsmembran serin proteasen kodieren, die kodierten proteine und darauf basierende methoden |
KR101039751B1 (ko) * | 2008-10-16 | 2011-06-09 | 한국생명공학연구원 | Tmprss4―특이적인 인간항체 |
-
2010
- 2010-11-02 WO PCT/KR2010/007634 patent/WO2012060480A1/ko active Application Filing
- 2010-11-02 KR KR1020137011239A patent/KR101500670B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090155248A1 (en) * | 1999-09-30 | 2009-06-18 | The Regents Of The University Of California | Antibodies to MT-SP1 serine protease |
US20030092664A1 (en) * | 2002-10-09 | 2003-05-15 | Yonghong Xiao | Regulation of human epithin-like serine protease |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CHO, E. G. ET AL.: "N-terminal processing is essential for release of epithin, a mouse type II membrane serine protease.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 48, 30 November 2001 (2001-11-30), pages 44581 - 44589 * |
KIM, S. B. ET AL.: "Soluble epithin/PRSS 14 secreted from cancer cells contains active angiogenic potential.", MOLECULES AND CELLS., vol. 29, no. 6, June 2010 (2010-06-01), pages 617 - 23 * |
OBERST, M. D. ET AL.: "Expression of the serine protease matriptase and its inhibitor HAI-1 in epithelial overian cancer: correlation with clinical outcome and tumor clinicopathological parameters.", CLINICAL CANCER RESEARCH., vol. 8, no. 4, April 2002 (2002-04-01), pages 1101 - 1107 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20130099131A (ko) | 2013-09-05 |
KR101500670B1 (ko) | 2015-03-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI123050B (fi) | Melanooma-antigeeni | |
UA123392C2 (uk) | Пептид, здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (mhc) людини i класу, та його застосування для лікування раку | |
US8716230B2 (en) | Methods for treatment or prevention of diseases associated with functional disorder of regulatory T cells | |
CZ295997B6 (cs) | Farmaceutický prostředek s obsahem ligandu Notch a způsob tvorby T-buněk | |
EP2461835A1 (en) | Compositions containing jarid1b inhibitors and methods for treating cancer | |
US20190111120A1 (en) | Novel cancer antigen eef2 | |
WO2019117690A1 (ko) | Pd-l1에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 | |
KR20070110077A (ko) | 혈관 완전성을 조정하기 위한 방법 및 조성물 | |
WO2012060480A1 (ko) | 암전이를 억제하는 항원 펩타이드, 이를 포함하는 암전이 백신, 암전이 억제 및 치료용 조성물 그리고 암전이 관련 표적물질 및 암전이 억제물질의 스크린 방법 | |
Yan et al. | Tumor and stroma COL8A1 secretion induces autocrine and paracrine progression signaling in pancreatic ductal adenocarcinoma | |
JP2015529825A (ja) | 癌幹細胞に発現する分子をターゲットとした癌を診断、治療する方法 | |
KR101547297B1 (ko) | 면역내성암의 재발 및 암전이 예방 또는 치료용 조성물 | |
Jung et al. | A potential role of somatostatin and its receptor SSTR4 in the migration of hepatic oval cells | |
KR20240001099A (ko) | 유방암 진단용 조성물, 이를 포함하는 유방암 진단용 키트, 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 유방암의 발생 여부를 측정하는 방법 | |
KR20200076660A (ko) | Drg2 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 | |
KR101974509B1 (ko) | 보체 단백질의 간암 진단 용도 | |
JP6853553B2 (ja) | 筋力低下症および代謝性疾患の治療薬 | |
KR20150003946A (ko) | Drg2 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 | |
WO2019117691A1 (ko) | CD44v6에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 | |
CN109528749B (zh) | 长链非编码rna-h19在制备治疗垂体瘤药物中的用途 | |
WO2023101269A1 (ko) | SET7/9을 이용한 EndMT 관련 질환 진단 및 치료 용도 | |
KR101548319B1 (ko) | 면역내성암의 재발 및 암전이 예방 또는 치료용 조성물 | |
US11879012B2 (en) | Method of modulating cell proliferation | |
US20220193113A1 (en) | Novel therapeutic agent for gastrointestinal cancer and method for screening for the same | |
WO2023068820A1 (ko) | 암 치료 또는 예방용 조성물 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 10859283 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 20137011239 Country of ref document: KR Kind code of ref document: A |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 10859283 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |