WO2012042807A1 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 - Google Patents

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 Download PDF

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WO2012042807A1
WO2012042807A1 PCT/JP2011/005364 JP2011005364W WO2012042807A1 WO 2012042807 A1 WO2012042807 A1 WO 2012042807A1 JP 2011005364 W JP2011005364 W JP 2011005364W WO 2012042807 A1 WO2012042807 A1 WO 2012042807A1
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light
metal film
unit
excitation light
excitation
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Application number
PCT/JP2011/005364
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English (en)
French (fr)
Inventor
和田　滋
Original Assignee
コニカミノルタホールディングス株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a surface plasmon resonance fluorescence analysis apparatus and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method for detecting a specimen contained in a sample liquid using surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • a surface plasmon resonance fluorescence analysis (surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy: SPFS) method is known as a method for detecting a sample (a substance to be detected) with high sensitivity in bioassay for detecting proteins, DNA, and the like.
  • the SPFS method in a prism in which a metal film made of gold, silver or the like is formed on a predetermined surface, excitation light is incident on the metal film from the prism side so as to satisfy the total reflection condition on the predetermined surface, When excitation light is reflected on the metal film, light (evanescent wave) that exudes from the metal film is used.
  • light evanescent wave
  • the SPFS method when the excitation light is totally reflected on the metal film, an evanescent wave that exudes from the metal film causes an analyte contained in the sample liquid that flows on the surface of the metal film or attached to the specimen. Fluorescence (excitation fluorescence) emitted by the excited fluorescent substance (labeling substance) is analyzed. Thereby, the presence or the amount of the specimen can be detected.
  • excitation light is incident from the prism side toward the metal film so as to satisfy the total reflection condition with respect to the predetermined surface, and the incident angle of the excitation light with respect to the metal film is changed. Then, the intensity of the reflected light is measured. Since the surface plasmon resonance occurs in the metal film when the amount of reflected light received in this measurement is minimized, the incident angle of the excitation light to the metal film when the amount of received light is minimized is the metal. The excitation light incident angle sufficiently enhances the electric field near the surface of the film.
  • An object of the present invention is to provide a surface plasmon resonance fluorescence analyzer and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method that can detect a specimen with higher accuracy.
  • the first optical filter that blocks the light having the wavelength of the excitation light is retracted from between the light receiving unit and the metal film.
  • the first optical filter is inserted between the light receiving unit and the metal film. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a surface plasmon resonance fluorescence analyzer and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method that can detect a specimen with higher accuracy.
  • FIG. 1 is a functional block diagram showing a configuration in a state where an analysis chip is installed in the surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is an enlarged view showing the configuration of the chip holding part of the surface plasmon resonance fluorescence analyzer and the analysis chip held by the chip holding part.
  • FIG. 3 is a diagram showing the polarization state of the excitation light in the surface plasmon resonance fluorescence analyzer and the irradiation region of the excitation light on the metal film.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a measurement optical system of the surface plasmon resonance fluorescence analyzer.
  • FIG. 5 is a flowchart showing a basic sequence for analyzing a sample in the surface plasmon resonance fluorescence analyzer.
  • FIG. 6 is a flowchart showing the resonance angle scanning sequence of FIG.
  • FIG. 7 is a flowchart showing the optimum position scanning sequence of FIG.
  • FIG. 8 is a flowchart showing the birefringence measurement sequence of FIG.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the excitation fluorescence measurement sequence of FIG.
  • FIG. 10A is a diagram for explaining the second positioning of the reflecting member in the surface plasmon resonance fluorescence analyzer
  • FIG. 10B shows the irradiation region moved to the center position of the measurement region. It is a figure which shows a state.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analyzer (hereinafter also simply referred to as “analyzer”) allows excitation light incident on the prism to be reflected at the reflection interface so that the total reflection condition is satisfied with respect to the reflection interface of the prism.
  • an evanescent wave enhanced electric field
  • analyte a fluorescent substance labeled (attached) to a substance to be detected
  • the analyzer detects the specimen by detecting the amount of fluorescent light generated by the excitation of the fluorescent substance.
  • the analyzer includes a chip holding unit 12 that holds an analysis chip 50, an excitation light emitting unit 20 that emits excitation light to the analysis chip 50 held in the chip holding unit 12, and an analysis
  • the optical measurement unit 40 that measures the intensity of the light generated in the chip 50 and the components of the analyzer 10 such as the chip holding unit 12, the excitation light emitting unit 20, and the optical measurement unit 40 are controlled, and various A control processing unit 14 (control unit) that performs arithmetic processing and a display unit 16 that displays various types of information such as arithmetic results are provided.
  • the analyzer 10 also includes a preprocessing unit (not shown) that performs preprocessing of blood from the patient.
  • the pretreatment unit accepts a reagent chip (not shown), performs pretreatment (blood cell separation, dilution, mixing, etc.) of blood injected into the reagent chip to generate a sample liquid, Injection into the analysis chip 50.
  • the reagent chip is provided with a plurality of storage units, and in each storage unit, a reagent, a diluting solution, a cleaning solution, and the like are individually sealed in addition to blood and the like.
  • the analysis chip 50 includes a prism 51, a metal film 55 formed on the surface of the prism 51, and a sample solution or a cleaning solution containing a specimen in contact with the metal film 55 on the metal film 55. And a flow path member 57 that forms a flow path 58 that flows while flowing.
  • the analysis chip 50 of this embodiment is replaced every time a sample is detected (analyzed).
  • the prism 51 is formed such that an incident surface 52 through which the excitation light ⁇ from the excitation light emitting unit 20 is incident on the inside of the prism 51 and a metal film 55 on which the excitation light ⁇ incident on the prism 51 is reflected are formed.
  • the surface includes a surface (predetermined surface) 53 and an emission surface 54 on which the excitation light ⁇ reflected by the metal film 55 is emitted to the outside of the prism 51.
  • the prism 51 is made of transparent glass or resin.
  • the exit surface 54 is a surface that first strikes after the excitation light ⁇ is reflected by the metal film 55.
  • the exit surface 54 is formed on the optical surface in the same manner as the entrance surface 52 so that the light of the S wave component of the excitation light ⁇ reflected by the metal film 55 does not stay inside the prism 51.
  • the prism 51 of this embodiment is made of a transparent resin having a refractive index of about 1.4 to 1.6.
  • the prism 51 may be made of glass.
  • the prism 51 may have any shape that includes the incident surface 52, the film forming surface 53, and the exit surface 54 on the surface of the prism 51. That is, in the prism 51, the excitation light ⁇ incident inside from the incident surface 52 is totally reflected by the metal film 55 on the film formation surface 53, and this excitation light ⁇ (specifically, the S wave component of the excitation light ⁇ ) is reflected. Any shape may be used as long as it is emitted from the exit surface 54 without being irregularly reflected inside the prism 51.
  • the metal film 55 is a metal thin film formed (formed) on the film formation surface 53 of the prism 51.
  • the metal film 55 of this embodiment is made of gold.
  • the metal film 55 has an evanescent wave generated by reflecting the excitation light ⁇ incident on the prism 51 on the film formation surface 53 on which the metal film 55 is formed so as to satisfy the total reflection condition with respect to the film formation surface 53. Amplifies (enhanced electric field). That is, the metal film 55 is provided on the film formation surface 53, and surface plasmon resonance occurs in the metal film 55, so that the excitation light ⁇ is totally reflected on the surface without the metal film 55 (film formation surface 53). Compared with the case where a wave is generated, the formed evanescent wave is amplified (that is, an enhanced electric field is formed in the vicinity of the surface 55a of the metal film 55).
  • the material of the metal film 55 is not limited to gold, but may be any metal that causes surface plasmon resonance.
  • the metal film 55 may be silver, copper, aluminum or the like (including an alloy).
  • a capturing body 56 for capturing a specific antigen is fixed to the surface (surface opposite to the prism 51) 55a of the metal film 55.
  • the capturing body 56 is fixed to the surface 55a of the metal film 55 by surface treatment.
  • the flow path member 57 is provided on the film formation surface 53 (specifically, the metal film 55) of the prism 51, thereby forming a flow path 58 through which the sample liquid flows in cooperation with the film formation surface 53.
  • the flow path member 57 is formed of a transparent resin.
  • the flow path member 57 is bonded to the prism 51 by adhesive, welding such as laser welding or ultrasonic welding, pressure bonding using a clamp member, or the like.
  • the flow path 58 has a shape such that a region where the metal film 55 and the sample solution are in contact with each other is wider than a measurement region of the light measurement unit 40.
  • the sample liquid pretreated by the pretreatment unit is injected (supplied) into the flow path 58.
  • the analysis chip 50 into which the sample liquid has been injected is transported to the chip holding unit 12 when the reaction between the capturing body 56 fixed on the metal film 55 and the specimen (specific antigen) is completed.
  • the analysis chip 50 conveyed to the chip holding unit 12 is held by the chip holding unit 12 so as to be in a predetermined posture with respect to the analyzer 10.
  • the chip holding unit 12 holds the analysis chip 50 so that the analysis chip 50 is in a predetermined posture with respect to the analyzer 10 when detecting the specimen.
  • the predetermined posture means that the excitation light ⁇ emitted from the excitation light emitting unit 20 is incident on the inside of the prism 51 from the incident surface 52 so as to satisfy the total reflection condition with respect to the film formation surface 53.
  • the posture is such that the light ⁇ is reflected by the metal film 55.
  • the chip holding unit 12 holds the analysis chip 50 in a detachable manner.
  • the chip holding unit 12 of this embodiment holds the analysis chip 50 so that the prism 51 is positioned below the flow path member 57.
  • the analyzing apparatus 10 In the analyzing apparatus 10, light absorption is performed near the emission surface 54 of the analysis chip 50 held by the chip holding unit 12 so that the influence of the light emitted from the emission surface 54 does not reach the light measurement unit 40.
  • a body (not shown) is arranged.
  • the excitation light emitting unit 20 causes the excitation light ⁇ to enter the prism 51 so as to be reflected by the metal film 55 of the prism 51 included in the analysis chip 50 held in the chip holding unit 12.
  • the excitation light emitting unit 20 includes a light source unit 21 that emits linearly polarized excitation light, and an excitation optical system 30 that guides the excitation light ⁇ emitted from the light source unit 21 to the incident surface 52 of the prism 51.
  • the light source unit 21 includes a light source unit unit 23 including an excitation light source 22 and a first wave shaping unit 24 that waves the excitation light ⁇ emitted from the excitation light source 22.
  • the light source unit 21 of the present embodiment emits excitation light ⁇ downward.
  • the excitation light source 22 of this embodiment is a laser diode.
  • the light source unit 23 includes an excitation light source 22 and a temperature adjustment circuit 25 that performs temperature adjustment (temperature adjustment) of the excitation light source 22.
  • This light source unit 23 collimates the excitation light ⁇ emitted from the excitation light source 22 and also positions the excitation light source 22 so that the excitation light ⁇ enters the metal film 55 of the prism 51 from the short axis side. Adjust and hold. This is due to the following reason.
  • the excitation light ⁇ emitted from the excitation light source (laser diode) 22 has a flat shape even when it is comomitted, and the polarization direction is substantially biased in one direction. For this reason, the posture of the excitation light source 22 is adjusted, and this adjusted posture is maintained, so that the excitation light ⁇ is totally reflected on the film formation surface 53 (a shallow angle with respect to the film formation surface 53). Thus, when the light enters the prism 51, the outline shape of the irradiation region on the film formation surface 53 of the excitation light ⁇ becomes approximately circular (see FIG. 3).
  • the temperature adjustment circuit 25 is a regression circuit for adjusting the temperature of the excitation light source (laser diode) 22. Specifically, the temperature adjustment circuit 25 monitors the light amount branched from the light beam of the excitation light ⁇ after collimation by a photodiode or the like (not shown), and thereby the wavelength and light amount of the emitted excitation light ⁇ are determined. The temperature of the excitation light source 22 is adjusted so as to be constant. This is because the wavelength of light emitted from the excitation light source 22 and the emission energy vary depending on the temperature.
  • the first wave shaping unit 24 waves the excitation light ⁇ emitted from the light source unit 23 by a plurality of filters (optical filters), and makes the excitation light ⁇ have an excitation wavelength with a unique polarization direction.
  • the first harmonizing unit 24 includes a first bandpass filter (hereinafter simply referred to as “first BPF”) 26, a linear polarization filter (hereinafter simply referred to as “LPF”) 27, and a first. 1 ND filter (hereinafter simply referred to as “first NDF”) 28.
  • first BPF first bandpass filter
  • LPF linear polarization filter
  • first NDF first. 1 ND filter
  • the LPF 27 filters the light emitted from the excitation light source 22 into pure linearly polarized light because it has a slight phase difference component.
  • the first NDF 28 is a so-called neutral density filter. That is, the first NDF 28 adjusts the amount of the excitation light ⁇ emitted from the light source unit 21 by dimming the light emitted from the excitation light source 22. Depending on the intensity of the emitted light emitted from the excitation light source 22, the first NDF 28 may not be provided in the first wave shaping unit 24.
  • the excitation optical system 30 guides the excitation light ⁇ from the light source unit 21 to the prism 51 of the analysis chip 50 held in the chip holding unit 12.
  • This excitation optical system 30 includes a polarization direction adjusting unit 31 that changes the polarization direction of the excitation light ⁇ , a shaping optical system 32 that adjusts the contour shape of the beam of the excitation light ⁇ , and the excitation light ⁇ into the prism 51.
  • An incident path adjusting unit 35 that changes the incident path to change the reflection position of the excitation light ⁇ on the metal film 55 and the incident angle ⁇ of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 55.
  • the polarization direction adjusting unit 31 includes a half-wave plate 33 and a rotation driving unit 34 that rotates the half-wave plate 33.
  • the half-wave plate 33 is disposed on the optical path of the excitation optical system 30 and is used as a polarization rotator that continuously rotates the polarization direction of the excitation light ⁇ .
  • the rotation driving unit 34 rotates the polarization direction of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 55 by rotating the half-wave plate 33.
  • the rotation drive unit 34 of the present embodiment has a step motor, and drives the step motor based on an instruction signal from the control processing unit 14 to rotate the half-wave plate 33. When the half-wave plate 33 rotates in this way, the polarization direction of the excitation light ⁇ linearly polarized in the first wave rectifier 24 rotates.
  • the rotation drive unit 34 rotates the half-wave plate 33 to maximize the evanescent wave in the metal film 55 (that is, the electric field enhancement of the enhanced electric field formed in the vicinity of the surface 55a of the metal film 55). It is possible to freely change the polarization direction from the condition where the degree is the maximum) to the condition where no exudation occurs (that is, the condition where no enhanced electric field is formed near the surface 55a of the metal film 55).
  • the shaping optical system 32 adjusts the beam size of the excitation light ⁇ and the contour shape of the beam by a slit, a zoom function or the like so that the contour of the irradiation region of the excitation light ⁇ in the metal film 55 becomes a circle having a predetermined diameter. .
  • region of the excitation light (alpha) in the metal film 55 of this embodiment is adjusted so that it may become smaller than the measurement area
  • the light measurement part 40 can measure the light resulting from surface plasmon resonance and the enhanced electric field based on this surface plasmon resonance.
  • the incident path adjustment unit 35 includes a reflection member 36 that reflects the excitation light ⁇ from the light source unit 21 and a reflection member drive unit (drive unit) 37 that drives the reflection member 36.
  • the reflecting member 36 has a reflecting surface 36a that reflects the excitation light ⁇ .
  • the reflecting member 36 of this embodiment is a reflecting mirror.
  • a dielectric multilayer film in which a phase shift, dimming, etc. do not occur between the excitation light ⁇ before entering the reflection surface 36a and the excitation light ⁇ after being reflected by the reflection surface 36a.
  • a dielectric multilayer film in which neither the P wave component nor the S wave component has the wavelength dependency at the excitation light wavelength is formed on the reflecting surface 36a.
  • a non-reflective light absorbing material that absorbs the excitation light ⁇ without reflecting is attached to the back surface 36b of the reflecting member 36.
  • the non-reflective absorbing material is, for example, an absorbing ND film, a flocking cloth or the like.
  • the reflecting member driving unit 37 is provided on the stage 37a, a rotation driving mechanism (not shown) that supports and rotates the reflecting member 36, and a reciprocating driving mechanism (not shown) that reciprocates the stage 37a. And having.
  • the rotation driving mechanism changes the direction of the reflecting surface 36a by rotating the reflecting member 36 (see arrow ⁇ in FIG. 1).
  • the rotation drive mechanism is a reflective surface with respect to a surface (the paper surface in FIG. 1) including the optical path of the excitation light ⁇ incident on the reflective member 36 and the optical path of the excitation light ⁇ after being reflected by the reflective member 36.
  • the reflecting member 36 is supported so that 36a is in an orthogonal posture.
  • the rotation drive mechanism rotates the reflecting surface 36a along the surface including the optical path while maintaining the orthogonal posture of the reflecting member 36 (the reflecting surface 36a is orthogonal to the surface including the optical path). As described above, the reflecting member 36 is rotated based on the instruction signal from the control processing unit 14.
  • the rotation drive mechanism has a rotation motor, and the reflection member 36 is rotationally driven directly or indirectly by the rotation motor to change the direction of the reflection surface 36a. Further, the rotation drive mechanism may rotate the reflecting member 36 to a position where the excitation light ⁇ from the light source unit 21 is incident on the back surface 36 b of the reflecting member 36 based on an instruction signal from the control processing unit 14.
  • the reflection member 36 is attached to the rotation drive mechanism so that the center of gravity passes near the rotation center, and the rotation motor is set so that the torque is sufficiently large.
  • the rotary motor of this embodiment is a high-resolution step motor.
  • the rotary motor rotates the reflecting member 36 in accordance with an instruction signal from the control processing unit 14 so as to have a predetermined angular interval (that is, stepwise in the rotation direction).
  • the predetermined interval is related to the resolution in adjusting the direction of the reflecting surface 36a, and is appropriately set according to the performance of the apparatus.
  • the reciprocating drive mechanism linearly moves the stage 37a, that is, the reflecting member 36 along the optical axis of the excitation light ⁇ from the light source unit 21 (see arrow ⁇ in FIG. 1).
  • the reciprocating drive mechanism of the present embodiment reciprocates the stage 37a in the optical axis direction of the excitation light ⁇ from the light source unit 21, that is, in the vertical direction.
  • a step motor is controlled by an instruction signal from the control processing unit 14, and a stage 37a on which the rotational drive mechanism and the reflecting member 36 are mounted by a screw feed mechanism driven by the step motor. Reciprocates vertically.
  • the reciprocating drive mechanism follows the instruction signal from the control processing unit 14 and keeps the direction of the reflecting surface 36a with respect to the optical axis of the excitation light ⁇ from the light source unit 21 constant, while keeping the reflecting member 36 at a predetermined position on the optical axis. 36 is moved with high accuracy.
  • the light measurement unit 40 includes a light receiving unit 41, a measurement optical system 42 that guides light from the analysis chip 50 to the light receiving unit 41, a second wave shaping unit 43 that waves the light guided in the measurement optical system 42, Have
  • the light measurement unit 40 has an intensity (in this embodiment, the light generated in the metal film 55 of the analysis chip 50 and a region adjacent to the metal film 55 (hereinafter, also simply referred to as “light generated in the metal film 55”). Light intensity).
  • the light receiving unit 41 receives light and outputs an intensity signal corresponding to the amount of light.
  • a photomultiplier tube (PMT) having a high sensitivity and a high S / N ratio is used as the light receiving unit 41 in order to detect weak light such as fluorescence generated by exciting a fluorescent substance labeled on the specimen.
  • the light receiving unit 41 is not limited to the PMT, and may be a cooled CCD type image sensor or the like.
  • the measurement optical system 42 is a conjugate optical system that is hardly affected by stray light, and includes a condenser lens 44 and an imaging lens 45.
  • the measurement optical system 42 of this embodiment is a two-group conjugate optical system in which light traveling between groups, that is, between the condenser lens 44 and the imaging lens 45, becomes parallel light or substantially parallel light.
  • the second wave shaping unit 43 removes the excitation light component (for example, plasmon scattered light, Raman scattered light, diffused light, etc.) from the light guided in the measurement optical system 42, and the light guided in the measurement optical system 42. Adjust the light intensity (intensity).
  • the second wave rectifying unit 43 switches the position of the second band-pass filter (first optical filter) 46, the second ND filter (second optical filter) 47, and the filters 46 and 47. Part 48.
  • the second band-pass filter (hereinafter simply referred to as “second BPF”) 46 blocks light of the wavelength of the excitation light ⁇ (excitation wavelength).
  • the second BPF 46 causes the light receiving unit 41 to emit light having a wavelength other than the wavelength of the fluorescence (the light generated when the fluorescent substance labeled on the specimen is excited by the enhanced electric field) (for example, leakage light from the excitation light emitting unit 20). And plasmon scattered light, diffused light, etc.) can be prevented from entering. That is, the second BPF 46 removes noise components from the light incident on the light receiving unit 41, thereby improving the detection accuracy and sensitivity of weak fluorescence in the light receiving unit 41.
  • the second ND filter 47 (hereinafter simply referred to as “second NDF”) is a so-called attenuating filter, which attenuates incident light and emits it.
  • the second NDF 47 is a light receiving unit (PMT in the present embodiment) for detecting weak light (fluorescence in the present embodiment) by dimming plasmon scattered light or diffused light guided in the measurement optical system 42. ) 41 can measure plasmon scattered light and the like. Specifically, the amount of light to be measured for obtaining the incident angle ⁇ 1 of the excitation light ⁇ that maximizes the enhanced electric field is much larger than the amount of excitation fluorescence measured at the time of detection of the specimen.
  • the second NDF 47 reduces the light to be measured in order to obtain the incident angle ⁇ 1 of the excitation light ⁇ that maximizes the enhanced electric field, thereby preventing the light receiving unit 41 from being damaged. Can be removed.
  • the second BPF 46 and the second NDF 47 share a common holding frame 49 so as to be aligned along the same plane that is substantially perpendicular to the optical axis (specifically, a plane that is substantially orthogonal to the optical axis of the light traveling through the measurement optical system 42). Is held in.
  • the position switching unit 48 switches the positions of the second BPF 46 and the second NDF 47 between the filtering position and the retracted position.
  • the filtering position is a position on the optical path in the measurement optical system 42. Specifically, the filtering position is between the condenser lens 44 and the imaging lens 45, and each of the filters 46 and 47 is orthogonal to the optical axis of the parallel light or the substantially parallel light between the lenses 44 and 45 and the parallel. It is a position that crosses light or substantially parallel light.
  • the analyzer 10 can detect the sample with high accuracy. That is, when the second BPF 46 or the second NDF 47 is inclined with respect to the optical axis of parallel light or the like traveling between the lenses 44 and 45, the optical axis of the light passing through the second BPF 46 or the second NDF 47 is shifted, so that optical measurement is performed. The measurement accuracy in the part 40 decreases.
  • the retracted position is a position deviated from the optical path in the measurement optical system 42.
  • the position switching unit 48 is configured so that the second NDF 47 is in the retracted position when the second BPF 46 is in the filtering position (see FIG. 4), and the second NDF 47 is in the filtering position when the second BPF 46 is in the retracted position. Switch each position.
  • the position switching unit 48 of the present embodiment reciprocates the holding frame 49 along the plane in which the second BPF 46 and the second NDF 47 are arranged (see the arrow ⁇ in FIG. 4), thereby changing the position of each filter 46, 47. Switch. As a result, the positions of the two filters 46 and 47 are switched simultaneously by one drive source.
  • the position switching unit 48 switches the positions of the filters 46 and 47 in accordance with the instruction signal from the control processing unit 14.
  • the 2nd BPF46 and the 2nd NDF47 are provided in the 2nd wave shaping part 43 of this embodiment, it is not limited to this. If the amount of light to be measured does not exceed the allowable amount of the light receiving unit 41, the second NDF 47 may not be provided in the second wave shaping unit 43. Further, a configuration in which the light receiving unit is switched by the light to be measured, that is, a configuration in which the analyzer switches between the light receiving unit 41 for receiving the fluorescence and the light receiving unit for receiving the light having a light quantity larger than the fluorescence. Even when the second NDF 47 is provided, the second NDF 47 may not be provided.
  • the position switching unit 48 reciprocates the holding frame 49 to switch the positions of the filters 46 and 47.
  • the disc-shaped holding frame holds the filters 46 and 47 so that the second BPF 46 and the second NDF 47 are aligned on the same plane, and the position switching unit rotates the intermediate position between the second BPF 46 and the second NDF 47.
  • a disc-shaped holding frame may be rotated about the center.
  • the positions of the filters 46 and 47 are switched.
  • the position switching unit may have two drive sources, and the switching of the position of the second BPF 46 and the switching of the position of the second NDF 47 may be performed by separate driving sources.
  • the control processing unit 14 controls each component constituting the analyzer 10. For example, when the analysis apparatus 10 analyzes a sample, the control processing unit 14 controls the light source unit 21, the polarization direction adjustment unit 31, the incident path adjustment unit 35, the light measurement unit 40, and the like. Thereby, in the said analyzer 10, a resonance angle scanning process, an optimal position scanning process, a birefringence measurement process, an excitation fluorescence measurement process, etc. are performed. Further, when analyzing the sample, the control processing unit 14 calculates based on an output signal sent from the light measuring unit 40 (specifically, the light receiving unit 41), and measures the fluorescence measured by the light measuring unit 40.
  • the control processing unit 14 calculates based on an output signal sent from the light measuring unit 40 (specifically, the light receiving unit 41), and measures the fluorescence measured by the light measuring unit 40.
  • control processing unit 14 counts the number of fluorescences per unit area detected by the light measurement unit 40, calculates the amount of increase in fluorescence over time, and the like.
  • the calculation result by the control processing unit 14 is output to the display unit 16 connected to the control processing unit 14. Details of specific control and calculation by the control processing unit 14 will be described later.
  • the display unit 16 displays the calculation result in the control processing unit 14 based on the output signal from the control processing unit 14.
  • the display unit 16 may display a calculation result or the like on a screen like a liquid crystal display, or may print out the calculation result or the like like like a printer.
  • the display unit 16 may be a combination of screen display and printout.
  • FIG. 5 is a flowchart showing a basic sequence for analyzing a sample in the analyzer 10.
  • FIG. 6 is a flowchart showing a resonance angle scanning sequence.
  • FIG. 7 is a flowchart showing the optimum position scanning sequence.
  • FIG. 8 is a flowchart showing a birefringence measurement sequence.
  • FIG. 9 is a flowchart showing an excitation fluorescence measurement sequence.
  • the reagent chip into which the blood or the like has been injected is set in the pretreatment unit of the analyzer 10.
  • the control processing unit 14 performs preprocessing (blood cell separation, dilution, mixing, etc.) of the set reagent chip such as blood by the preprocessing unit to generate a sample solution.
  • the control processing unit 14 injects the sample liquid after the pre-processing into the flow path 58 of the analysis chip 50 by the pre-processing unit.
  • the capturing body 56 fixed on the surface captures the specimen (specific antigen).
  • the preprocessing unit reacts the capturing body 56 with the specimen.
  • the capturing body 56 captures a specimen labeled with a fluorescent substance (in this embodiment, a fluorescent dye), but the present invention is not limited to this.
  • the fluorescent substance may be injected into the analysis chip 50 after the capturing body 56 captures the specimen, whereby the fluorescent substance may be labeled with respect to the specimen captured by the capturing body 56.
  • the analysis chip 50 subjected to the reaction is transported to the chip holding unit 12 and is held by the chip holding unit 12 (step S1).
  • the excitation light source 22 (in this embodiment, a laser diode) 22 is constantly temperature-controlled by the temperature adjustment circuit 25 and maintained at a constant temperature in order to output output light having a stable wavelength with little wavelength fluctuation.
  • This is indispensable in an apparatus for quantifying proteins and the like in blood because the surface plasmon resonance conditions and the amount of evanescent wave (enhanced electric field) ooze out when the wavelength is shifted. Since it takes time to reach the maintenance temperature, the temperature of the excitation light source 22 is normally constantly maintained by the temperature adjustment circuit 25 from when the analyzer 10 is turned on.
  • the control processing unit 14 performs scanning (resonance angle scanning) under the optimum surface plasmon resonance condition in the analysis chip 50. Based on the scanning result, the control processing unit 14 causes the excitation light ⁇ to be incident on the metal film 55 at an incident angle (excitation incident angle ⁇ 1) at which the electric field strength of the enhanced electric field generated in the metal film 55 is the largest. Then, the reflecting member 36 is positioned (first positioning) (step S2).
  • control processing unit 14 drives the reflecting member 36 by the reflecting member driving unit 37, thereby causing the excitation light ⁇ to be incident on the metal film 55 of the prism 51 included in the analysis chip 50 (excitation incident angle).
  • a scan of ⁇ 1) is performed. More specifically, an enhanced electric field (evanescent wave) based on surface plasmon resonance is generated in the metal film 55 of the prism 51 depending on the material, shape, flow path filling liquid (sample liquid) refractive index, and the like of the prism 51 included in the analysis chip 50.
  • the incident angle ⁇ 1 of the excitation light having the highest intensity is determined.
  • the excitation light incident condition fluctuates due to the molecular weight of the sample captured by the capturing body 56, the substance constituting the molecule, the manufacturing error on the prism 51 side, and the like. Therefore, the control processing unit 14 causes the excitation light ⁇ to be incident on the metal film 55 so that the incident angle is less than ⁇ 10 ° with the excitation incident angle ⁇ 1a based on the design as the center. Then, based on the amount of light generated in the metal film 55 at this time, the excitation incident angle ⁇ 1 in the analysis chip 50 is obtained.
  • control processing unit 14 moves the second BPF 46 to the retracted position and moves the second NDF 47 to the filtering position by the position switching unit 48 of the second wave shaping unit 43 (step S21).
  • the half-wave plate 33 of the polarization direction adjusting unit 31 has the largest P wave component in the excitation light ⁇ incident on the metal film 55 when the excitation light ⁇ is emitted from the excitation light emitting unit 20. In addition, it is in a state (initial state) required by design.
  • the control processing unit 14 moves the reflecting member 36 to the maximum separation position by the rotation driving mechanism and the reciprocating driving mechanism of the reflecting member driving unit 37 (step S22).
  • the maximum separation position means that the excitation light ⁇ is reflected at a specific position of the metal film 55 (in the measurement region of the light measurement unit 40 in the present embodiment) when the excitation light ⁇ is emitted from the excitation light emitting unit 20.
  • the position of the reflecting member 36 and the direction of the reflecting surface 36a are such that the incident angle ⁇ at which the evanescent wave does not ooze out in the region near the surface 55a of the metal film 55.
  • control processing unit 14 measures the amount of light generated in the metal film 55 by the light measuring unit 40. Then, the control processing unit 14 acquires the measurement result from an output signal from the light measuring unit 40 (specifically, the light receiving unit 41).
  • the light measured by the light measuring unit 40 when the reflecting member 36 is at the maximum separation position is the surface diffused light SK in the prism 51.
  • the control processing unit 14 stores the incident angle ⁇ of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 55 and the amount of light measured by the light measurement unit 40 in association with each other (step S23).
  • the light received by the light receiving unit 41 includes light having the same wavelength as the excitation wavelength of the excitation light ⁇ .
  • the light having the same wavelength as the excitation wavelength is plasmon scattered light, Raman scattered light, diffused light or the like generated in the metal film 55.
  • the light having the same wavelength as the excitation wavelength is enhanced by surface plasmon resonance generated in the metal film 55.
  • the control processing unit 14 retracts the second BPF 46 from the optical path of the measurement optical system 42 by the position switching unit 48, so that the light receiving unit 41 receives the light having the excitation wavelength, and thereby the light generated in the metal film 55. The amount of light is accurately measured.
  • the light receiving unit 41 that measures excitation fluorescence with a small amount of light measures surface plasmon scattered light, diffused light, or the like that has a much larger amount of light than the excitation fluorescence.
  • the position switching unit 48 retracts the second BPF 46 to the retracted position and moves the second NDF 47 to the filtering position, so that the same light receiving unit (PMT in the present embodiment) 41 is provided. The amount of light (scattered light or the like and excitation fluorescence) can be measured.
  • the control processing unit 14 adjusts the position of the reflecting member 36 by the incident path adjusting unit 35 in a state where the excitation light ⁇ is emitted from the light source unit 21. Specifically, the control processing unit 14 rotates the direction of the reflecting surface 36a by the rotation driving mechanism so as not to shift the irradiation position of the excitation light ⁇ on the metal film 55 (Step S24), and the reflection member by the reciprocating driving mechanism. The position 36 is moved (step S25). Specifically, the control processing unit 14 reflects the position of the reflecting member 36 and the excitation light ⁇ reflected by the reflecting surface 36 a at that position so as to enter the prism 51 and reach a specific position of the metal film 55. A table in which the orientation of the surface 36a is associated is stored in advance.
  • step S24 and step S25 after one of the steps is performed first, the other step may be performed, or both steps may be performed simultaneously.
  • the light measurement unit 40 measures the amount of light generated in the metal film 55 and outputs the measurement result to the control processing unit 14, and the control processing unit 14 stores the measurement result in association with the incident angle ⁇ ( Step S26).
  • control processing unit 14 measures the amount of light by the light measurement unit 40 while changing the incident angle ⁇ so that the irradiation position on the metal film 55 is not shifted, and stores the measurement result.
  • the control processing unit 14 measures the amount of light in a predetermined scanning region (for example, an incident angle ⁇ of less than ⁇ 10 ° with the excitation incident angle ⁇ 1a based on the design as a center) by the light measuring unit 40, and then the light source The emission of the excitation light ⁇ from the unit 21 is stopped (step S27). Then, the control processing unit 14 selects the maximum value and the minimum value of the stored light amount, and stores them (step S28). Further, the control processing unit 14 drives the reflecting member 36 by the reflecting member driving unit 37 so as to be in the position of the reflecting member 36 and the direction of the reflecting surface 36a when the maximum light amount is obtained (step S29).
  • a predetermined scanning region for example, an incident angle ⁇ of less than ⁇ 10 ° with the excitation incident angle ⁇ 1a based on the design as a center
  • the control processing unit 14 reflects the irradiation position (incident position) of the excitation light ⁇ onto the metal film 55 so as to be the center of the measurement region of the light measurement unit 40.
  • the member 36 is positioned (second positioning) (step S3).
  • the control processing unit 14 moves the reflecting member 36 to the upper end position by the reciprocating driving mechanism of the reflecting member driving unit 37 (step S31).
  • This upper end position is a position where the incident position is outside the measurement region of the light measurement unit 40 when the excitation light ⁇ is incident on the metal film 55 (see position A in FIG. 10A).
  • the control processing unit 14 causes the light source unit 21 to emit excitation light ⁇ when the reflecting member 36 is at this position, and measures the amount of light generated in the metal film 55 at this time by the light measuring unit 40, and the measurement result is obtained.
  • Store step S32.
  • the control processing unit 14 determines whether or not the reflecting member 36 is at the lower end position (step S33). Details of the lower end position will be described later.
  • the control processing unit 14 moves the reflecting member 36 downward by a predetermined amount by the reciprocating drive mechanism (step S34). At this time, the control processing unit 14 moves the reflecting member 36 only by the reciprocating driving mechanism without rotating the reflecting member 36 by the rotation driving mechanism. That is, the control processing unit 14 moves only the position of the reflecting member 36 without changing the direction of the reflecting surface 36 a with respect to the excitation light ⁇ from the light source unit 21.
  • the control processing unit 14 emits excitation light from the light source unit 21, measures the amount of light generated in the metal film 55 at this time by the light measurement unit 40, and stores the measurement result ( Step S32). Then, the control processing unit 14 determines whether or not the reflecting member 36 is at the lower end position (step S33). The control processing unit 14 repeats step S32 to step S34 in order until the reflecting member 36 moves to the lower end position.
  • the control processing unit 14 determines whether or not the reflection member has reached the lower end position based on whether or not the light amount has decreased by 50% compared to the maximum light amount among the respective light amounts stored by the measurement result by the light measurement unit 40. To do. Specifically, since the irradiation region of the excitation light ⁇ is outside the measurement region of the light measurement unit 40 in the metal film 55, the amount of light measured by the light measurement unit 40 is small. When the reflecting member 36 gradually moves downward and the irradiation region of the excitation light ⁇ enters the measurement region of the light measurement unit 40 (see position B in FIG. 10A), the measurement is performed by the light measurement unit 40. The amount of light emitted increases gradually.
  • the control processing unit 14 stores the intensity of these lights and the vertical position of the reflecting member 36 when the intensity is measured in association with each other, and the measured light falls by 50% of the maximum light quantity. Judge whether or not. Then, the control processing unit 14 determines that the reflecting member 36 has reached the lower end position when the amount of light measured by the light measuring unit 40 falls by 50% of the maximum amount of light.
  • control processing unit 14 determines that the reflecting member 36 has moved to the lower end position, the control processing unit 14 selects a value that is 50% lower than the maximum light amount from each value of the stored light amount (step S35). At this time, there are two values to be selected (see position B and position D in FIG. 10A). The control processing unit 14 selects the position of the reflecting member 36 when the light amount measured by the light measurement unit 40 falls by 50% of the maximum light amount. Then, the control processing unit 14 calculates the center position (see the position Ce in FIG. 10A) and stores it (step S36). The control processing unit 14 moves the reflection member 36 by the reciprocating drive mechanism to move the irradiation region to the obtained center position Ce (see step S37, FIG. 10B).
  • the amount of autofluorescence for each analysis chip 50 measured by the light measurement unit 40 can be made constant.
  • fluorescence is generated inside the prism 51 by the excitation light ⁇ traveling in the prism 51 (autofluorescence).
  • This fluorescence is weak compared to scattered light or the like (plasmon scattered light or diffused light) generated in the metal film 55.
  • the fluorescence since the fluorescence has the same level as the excitation fluorescence emitted from the fluorescent substance labeled on the sample when the concentration of the sample in the sample solution is low, it becomes noise in the measurement of the excitation fluorescence.
  • the autofluorescence is weak, most of the light in the vicinity of the irradiation region of the excitation light ⁇ in the metal film 55 can cause noise in the measurement of the excitation fluorescence. Since the excitation light ⁇ reflected by the metal film 55 is almost eliminated when surface plasmon resonance occurs, autofluorescence from the incident side (left side in FIG. 10A) of the measurement region of the light measurement unit 40 is generated. It becomes a problem. The amount of autofluorescence is proportional to the optical path length. For this reason, for each analysis of the specimen, it is necessary to adjust the irradiation position of the excitation light ⁇ so that the optical path length on the incident side in the measurement region of the light measurement unit 40 is constant.
  • the excitation light in the measurement region of the light measurement unit 40 is adjusted so that the irradiation position of the excitation light ⁇ is always centered in the measurement region of the light measurement unit 40 for each analysis of the specimen.
  • the optical path length on the incident side of ⁇ is constant.
  • the control processing unit 14 measures the birefringence (step S4). Then, the control processing unit 14 improves the measurement accuracy of the specimen by considering the birefringence when measuring the excitation fluorescence from the fluorescent substance labeled on the specimen. Specifically, birefringence occurs when light is transmitted through the medium. Birefringence increases when light passes through a dielectric such as resin. This birefringence is caused by a density difference or the like in the medium, and this density difference occurs when the medium is formed. Therefore, the degree of birefringence differs depending on the individual prism 51.
  • phase rotation occurs in the excitation light ⁇ traveling through the prism 51 due to birefringence and only the P wave is desired to be incident on the metal film 55, an S wave component is generated in the excitation light ⁇ due to the phase rotation due to the birefringence. .
  • the amount of excitation fluorescence excited by the enhanced electric field decreases in accordance with the amount of S wave component generated by this birefringence. Therefore, the detection accuracy and sensitivity of the sample in the analyzer 10 are improved by the control processing unit 14 correcting this decrease.
  • control processing unit 14 emits the excitation light ⁇ from the light source unit 21, and the light measurement unit 40 measures the amount of light generated in the metal film 55.
  • the half-wave plate 33 is in an initial state (step S41).
  • the control processing unit 14 rotates the half-wave plate 33 by the rotation drive unit, and changes the light amount measured by the light measurement unit 40 to the rotation position of the half-wave plate 33 (the rotation angle from the initial state). ) And stored (step S42 and step S43).
  • the control processing unit 14 rotates the half-wave plate 33, the P wave component and the S wave component of the excitation light ⁇ incident on the metal film 55 are increased or decreased, respectively.
  • the amount of light measured by the light measurement unit 40 increases or decreases. At this time, if the P wave component increases in the excitation light ⁇ , the S wave component decreases accordingly, and if the P wave component decreases, the S wave component increases accordingly. As the P wave component increases in the excitation light ⁇ incident on the metal film 55, the amount of light measured by the light measurement unit 40 increases. On the other hand, the amount of light measured by the light measurement unit 40 decreases as the S wave component increases. This is because the P wave component contributes to surface plasmon resonance, but the S wave component does not contribute to surface plasmon resonance.
  • the control processing unit 14 repeats step S42 and step S43 in order until the maximum value DRmax and the minimum value DRmin of the light amount of light measured by the light measurement unit 40 are obtained (step S44).
  • the control processing unit 14 selects the maximum value DRmax and the minimum value DRmin from the stored light amount and the rotational position of the half-wave plate 33 (step S45). ) And the rotational position of the half-wave plate 33 when these values are obtained (specifically, the first rotational position when the maximum value DRmax is obtained and the minimum value DRmin are obtained). Are selected and stored.
  • control processing unit 14 uses the following formulas (1) and (2) from the stored maximum value DRmax and minimum value DRmin and the amount of surface diffused light SK stored in the resonance angle scanning step. Then, the major axis rotation amount ⁇ i due to the birefringence in the prism 51 and the correction coefficient K are derived and stored (step S46).
  • control processing unit 14 rotates the half-wave plate 33 to the rotation position when the maximum value DRmax is obtained by the rotation driving unit 34. Accordingly, the excitation light ⁇ is incident on the metal film 55 in a state where the P wave component is the largest (that is, in a state where the S wave component is the smallest).
  • the control processing unit 14 irradiates the reflection member 36 in the state in which the first positioning and the second positioning are performed by the light source unit 21 with the excitation light ⁇ .
  • the excitation light ⁇ causes surface plasmon resonance in the metal film 55.
  • the fluorescent substance labeled on the specimen captured by the capturing body 56 of the metal film 55 is excited by the enhanced electric field based on the surface plasmon resonance to emit fluorescence (excitation fluorescence).
  • the control process part 14 measures excitation fluorescence by the light measurement part 40 (step S5).
  • control processing unit 14 causes the position switching unit 48 to move the second BPF 46 to the filtering position and retracts the second NDF 47 to the retreat position (step S51: see FIGS. 1 and 4). Then, the control processing unit 14 uses the rotation driving mechanism of the reflecting member driving unit 37 so that the excitation light ⁇ emitted from the light source unit 21 is incident on the non-reflecting light absorbing material provided on the back surface 36b of the reflecting member 36. The reflecting member 36 is rotated (step S52). As a result, the excitation light ⁇ is not incident on the prism 51. At this time, the control processing unit 14 performs measurement with the light measurement unit 40, and stores the output (dark noise DN) from the light measurement unit 40 at this time (step S53).
  • the control processing unit 14 rotates the reflecting member 36 again by the rotation driving mechanism of the reflecting member driving unit 37 so that the excitation light ⁇ from the light source unit 21 is incident on the reflecting surface 36a of the reflecting member 36 again (step S54). .
  • the direction of the reflecting surface 36a at this time is the direction set in step S29 of the resonance angle scanning process.
  • the control processing unit 14 emits the excitation light ⁇ from the light source unit 21, measures the amount of excitation fluorescence caused by the enhanced electric field generated in the vicinity of the metal film 55 by the light measurement unit 40, and stores this (step S55). . Thereby, the control processing unit 14 obtains the measurement maximum light quantity (first light quantity value) Smax. This is because the light quantity generated in the metal film 55 when the half-wave plate 33 is obtained in the first rotation position obtained in the birefringence measurement step (that is, when the excitation light ⁇ is incident on the metal film 55 is the maximum value DRmax. This is because the intensity of the enhanced electric field in the vicinity of the metal film 55 is maximized.
  • the control processing unit 14 determines the second rotation position obtained in the birefringence step (that is, the amount of light generated in the metal film 55 when the excitation light ⁇ is incident on the metal film 55 becomes the minimum value DRmin.
  • the half-wave plate 33 is rotated by the rotation drive unit 34 to the rotation position) (step S56).
  • the control process part 14 measures the light quantity of excitation fluorescence by the light measurement part 40, and memorize
  • the control processing unit 14 Based on the stored measurement maximum light quantity Smax, measurement minimum light quantity Smin, and dark noise DN, the control processing unit 14 performs self-measurement in the prism as shown in the following formulas (3-1) to (8).
  • the fluorescence light quantity h and the excitation fluorescence light quantity H are derived and stored (step S58).
  • the amount of excitation fluorescence when Smax is obtained is H1
  • the amount of autofluorescence is h1
  • the amount of excitation fluorescence when Smin is obtained is H2
  • the amount of autofluorescence is h2.
  • the control processing unit 14 obtains the amount H of excitation fluorescence by the following approximate expression (9).
  • control processing unit 14 obtains the amount H of excitation fluorescence by the following approximate expression (10).
  • control processing unit 14 obtains the true excitation fluorescence light amount H from which the influence of birefringence and the like is removed, and stores this in association with the specimen number (step S6). Then, the control processing unit 14 erases other memory. In addition, the control processing unit 14 outputs information based on the excitation fluorescence light amount H stored in association with the specimen number to the display unit 16. The display unit 16 displays information based on the light amount H.
  • control processing unit 14 returns the reflecting member 36 to the initial position (step S7), and ends the series of measurements.
  • the amount of light generated in the metal film 55 by surface plasmon resonance is measured, whereby excitation light to the metal film 55 that maximizes the intensity of the enhanced electric field formed in the vicinity of the surface 55a of the metal film 55.
  • An ⁇ incident angle (excitation incident angle) ⁇ 1 can be obtained with high accuracy.
  • the light generated in the metal film 55 is light having an excitation wavelength such as plasmon scattered light or surface diffused light. Therefore, when the position of the second BPF 46 that blocks this wavelength component is switched to the retracted position, the increase or decrease in the amount of light generated in the metal film 55 based on the surface plasmon resonance is accurately measured.
  • the second BPF 46 is placed on the optical path of the measurement optical system 42, so that light components having excitation wavelengths such as plasmon scattered light and surface diffused light are measured from the light measured by the light measurement unit 40. Is removed. Thereby, the excitation fluorescence emitted from the fluorescent substance labeled on the specimen is accurately measured. Therefore, the signal obtained by measurement has a high S / N ratio, and it is possible to detect a sample with high accuracy and high sensitivity.
  • the influence of autofluorescence in the prism 51 is removed from the measurement result, thereby ensuring a wide dynamic range.
  • the half-wave plate 33 is adjusted so that the polarization direction of the excitation light ⁇ is in a state where the S wave component is maximized when reflected by the metal film 55, and the light measurement unit 40 measures the excitation fluorescence.
  • the amount of autofluorescence in the prism 51 is obtained.
  • the incident angle ⁇ of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 55 can be changed by driving the reflecting member 36, the reflection position of the excitation light ⁇ on the metal film 55 by changing the incident angle ⁇ is changed. Deviation is suppressed. That is, according to the above configuration, the incident angle ⁇ of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 55 is changed by changing and adjusting the position of the reflecting member 36 and the direction of the reflecting surface 36a. For this reason, the number of movable parts, the weight of the movable part, and the like can be suppressed as compared with the conventional case where the incident angle ⁇ is adjusted by moving the entire excitation optical system including a light source and a plurality of lenses.
  • the analyzer 10 causes one excitation light ⁇ to enter the prism 51 to generate an enhanced electric field based on surface plasmon resonance in the vicinity of the metal film 55, a plurality of excitation lights having different incident angles ⁇ as in the prior art. This prevents the amount of autofluorescence from increasing as in the case where ⁇ , ⁇ ,... Thereby, in the signal obtained by measuring the light generated in the vicinity of the metal film 55 by surface plasmon resonance, a decrease in the SN ratio due to autofluorescence is suppressed.
  • the incident angle ⁇ of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 55 is set with high accuracy so that the electric field strength of the enhanced electric field due to surface plasmon resonance is maximized.
  • the absorption peak in the angle spectrum of the reflected light in the metal film 55 and the peak of the electric field intensity of the enhanced electric field are shifted from each other, but light (light generated in the metal film 55) generated due to surface plasmon resonance is shifted.
  • the intensity peak coincides with the electric field intensity peak of the enhanced electric field. Therefore, the excitation light ⁇ to the metal film 55 is adjusted by adjusting the reflection member 36 so that the position of the reflection member 36 and the direction of the reflection surface 36a when the light amount of light generated in the metal film 55 becomes maximum. Is the excitation incident angle ⁇ 1 at which the electric field strength of the enhanced electric field is the largest.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analysis apparatus and the surface plasmon resonance fluorescence analysis method of the present invention are not limited to the above-described embodiments, and various changes can be made without departing from the scope of the present invention. is there.
  • the analysis chip 50 is replaced every time the sample is detected, but the present invention is not limited to this. That is, the analyzer 10 may be an analyzer in which an analysis chip is incorporated in a part of the analyzer 10 and a sample is detected by repeatedly using one analysis chip.
  • the control processing unit 14 determines the excitation incident angle ⁇ 1, and the light generated in the metal film 55 while continuously changing the incident angle ⁇ of the excitation light ⁇ to the metal film 55.
  • strength in the said embodiment, light quantity
  • the control processing unit 14 measures the amount of light generated in the metal film 55 at each incident angle ⁇ while changing the incident angle ⁇ intermittently (for example, in increments of 1 °) within the first range.
  • the incident angle ⁇ is set to be smaller than the first scan (for example, the incident angle is set in increments of 0.1 °).
  • a second scan that measures the amount of light generated in the metal film 55 intermittently or while continuously changing the incident angle ⁇ may be performed.
  • the control processing unit 14 narrows down the second scanning range by the first scanning in discrete steps, and then finely scans within the narrowed range, whereby the light generated in the metal film 55 becomes the maximum light amount.
  • the incident angle ⁇ 1 may be obtained. Note that the second range is included in the first range.
  • the control processing unit 14 changes the incident angle ⁇ in increments of 1 ° within an incident angle ⁇ range (first range) of less than ⁇ 10 ° centered on the excitation incident angle ⁇ 1a based on the design. .
  • the control processing unit 14 measures the amount of light generated in the metal film 55 at each incident angle ⁇ (first scanning), and stores the result in association with the corresponding incident angle ⁇ .
  • the control processing unit 14 increments by 0.1 ° within the range (second range) of the incident angle ⁇ within ⁇ 1 ° around the incident angle ⁇ at which the maximum light quantity is obtained in the first scanning.
  • the incident angle ⁇ is continuously changed.
  • the control processing unit 14 measures the amount of light generated in the metal film 55 (second scanning), and stores the result in association with the corresponding incident angle ⁇ .
  • the control processing unit 14 sets the incident angle ⁇ when the maximum amount of light is obtained in the second scanning as the excitation incident angle ⁇ 1. In this way, the excitation incident angle ⁇ 1 at which the enhanced electric field is the largest can be efficiently obtained as compared with the case where the entire first range is finely scanned.
  • the first scanning and the second scanning are performed, and the chip holding unit 12 holds the plurality of analysis chips 50 in order, and analyzes the specimen one after another.
  • the first scan may be performed only for the first analysis chip 50, and only the second scan may be performed for the second and subsequent analysis chips 50.
  • the control processing unit 14 applies the first analysis chip 50 to the first analysis chip 50 in the same manner as described above, for example, the range of the incident angle ⁇ less than ⁇ 10 ° with the excitation incident angle ⁇ 1a based on the design as the center (first In the range), the incident angle ⁇ is changed in increments of 1 °.
  • the control processing unit 14 measures the amount of light generated in the metal film 55 at each incident angle ⁇ (first scanning), and stores the result in association with the corresponding incident angle ⁇ . Then, the control processing unit 14 increments by 0.1 ° within the range (second range) of the incident angle ⁇ within ⁇ 3 ° around the incident angle ⁇ at which the maximum light quantity is obtained in the first scanning.
  • the incident angle ⁇ is continuously changed.
  • control processing unit 14 measures the amount of light generated in the metal film 55 (second scanning), and stores the result in association with the corresponding incident angle ⁇ . Then, the control processing unit 14 sets the incident angle ⁇ when the maximum amount of light is obtained in the second scanning as the excitation incident angle ⁇ 1 in the first analysis chip 50.
  • the control processing unit 14 performs 0 for the second analysis chip 50 within the second scan range obtained in the first scan to the first analysis chip 50 without performing the first scan. Change the incident angle ⁇ in increments of 1 ° or continuously. At this time, the control processing unit 14 measures the amount of light generated in the metal film 55 (second scanning), and stores the result in association with the corresponding incident angle ⁇ . Then, the control processing unit 14 sets the incident angle ⁇ when the maximum amount of light is obtained in the second scanning as the excitation incident angle ⁇ 1 in the second analysis chip 50. Thus, for the second and subsequent analysis chips 50, the control processing unit 14 performs only a scan (second scan) within the second range obtained by the first analysis chip 50, Analysis time can be shortened.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analyzer is a surface plasmon resonance fluorescence analyzer that measures fluorescence emitted from a fluorescent substance attached to a specimen by being excited by an electric field based on surface plasmon resonance, and has a predetermined surface.
  • An analysis chip including a prism having a metal film formed thereon is reflected by a chip holding unit that can be detachably attached, and a metal film of the prism included in the analysis chip held by the chip holding unit. In this way, an excitation light emitting part that makes excitation light enter the prism, and the excitation light is reflected by the metal film, so that the intensity of the light generated on the surface opposite to the prism in the metal film is measured.
  • the light measuring unit includes a light receiving unit that receives light generated in the metal film, a measurement optical system that guides light generated in the metal film to the light receiving unit, and a first light that blocks light having a wavelength of the excitation light.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analyzer is a surface plasmon resonance fluorescence analyzer that measures the fluorescence emitted when a fluorescent substance attached to a specimen is excited by an electric field based on surface plasmon resonance, and a metal is formed on a predetermined surface.
  • a light measuring unit capable of measuring the intensity of light generated on the surface of the film opposite to the prism, and a control unit for controlling the excitation light emitting unit and the light measuring unit.
  • the light measuring unit includes a light receiving unit that receives light generated in the metal film, a measurement optical system that guides light generated in the metal film to the light receiving unit, and a first light that blocks light having a wavelength of the excitation light.
  • the intensity of the electric field (enhanced electric field) formed in the vicinity of the surface of the metal film by measuring the intensity of light generated on the surface of the metal film (surface opposite to the prism) by surface plasmon resonance.
  • the angle of incidence of the excitation light on the metal film that maximizes can be obtained with high accuracy.
  • the first optical filter that blocks this wavelength component is switched to the retracted position. The increase / decrease in the intensity of light generated on the surface side of the metal film based on plasmon resonance can be measured with high accuracy.
  • the first optical filter is placed on the optical path of the measurement optical system, so that the component of the plasmon scattered light or the surface diffused light that is the excitation wavelength is changed from the light measured in the light measurement unit.
  • the fluorescence emitted by the fluorescent substance attached to the specimen excited by the enhanced electric field can be accurately measured.
  • the signal-to-noise ratio of the signal obtained by measurement is high, and the specimen can be detected with high accuracy and high sensitivity.
  • the light measurement unit includes a second optical filter that attenuates and emits incident light
  • the position switching unit includes the first optical filter at a filtering position. The position of each optical filter can be switched so that sometimes the second optical filter is in the retracted position, and the second optical filter is in the filtering position when the first optical filter is in the retracted position. It is preferable.
  • the light receiving portion of the light measuring portion it is possible to prevent the light receiving portion of the light measuring portion from being damaged by the light generated on the surface side of the metal film measured in order to obtain the incident angle of the excitation light that maximizes the enhanced electric field.
  • the amount of light measured to obtain the incident angle of the excitation light that maximizes the enhanced electric field is much larger than the amount of fluorescence measured when detecting the specimen. For this reason, when a common light receiving unit is used, the light measured to obtain the incident angle of the excitation light that maximizes the enhanced electric field is attenuated by the second optical filter, thereby damaging the light receiving unit. Is prevented.
  • the measurement optical system is a two-group conjugate optical system in which light traveling between groups becomes parallel light or substantially parallel light, and the filtering position is set by the first optical filter and the second optical filter in the group. It is preferably a position that is perpendicular to the optical axis of the parallel light or substantially parallel light between them and crosses the parallel light or substantially parallel light.
  • the specimen is detected with high accuracy. That is, if the first optical filter or the second optical filter is inclined with respect to the optical axis of parallel light or the like traveling between the groups, the light that has passed through the first optical filter or the second optical filter Since the optical axis is shifted, the measurement accuracy in the optical measurement unit is lowered.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analysis method is a surface plasmon resonance fluorescence analysis method for measuring light emitted when a fluorescent substance attached to a specimen is excited by an electric field based on surface plasmon resonance, A prism having a metal film formed on the surface thereof, a preparatory step of flowing a sample solution containing the specimen on the metal film, and excitation light for generating surface plasmon resonance in the metal film in the prism
  • the incident angle of the excitation light to the metal film is changed while the excitation light is reflected at a specific position of the metal film, and the excitation light is reflected by the metal film.
  • the resonance angle scanning step of measuring the intensity of light generated on the surface of the metal film opposite to the prism Based on the resonance angle scanning step of measuring the intensity of light generated on the surface of the metal film opposite to the prism, and the light measurement result in the resonance angle scanning step. While irradiating a specific position of the metal film with the excitation light so as to have an incident angle, the light generated on the surface opposite to the prism of the metal film is reflected by the excitation light.
  • the measuring step includes a position switching step of placing the first optical filter between the light receiving unit and the metal film.
  • the intensity of light generated on the surface side of the metal film by surface plasmon resonance is measured, so that the intensity of the electric field (enhanced electric field) formed near the surface of the metal film is maximized.
  • the incident angle of the excitation light can be obtained with high accuracy.
  • the light generated on the surface side of the metal film is light having an excitation wavelength such as plasmon scattered light or surface diffused light. For this reason, when the first optical filter that blocks this wavelength component is withdrawn from between the light receiving portion and the metal film, the intensity of light generated on the surface side of the metal thin film on the surface side based on surface plasmon resonance can be accurately increased or decreased. Measured.
  • the first optical filter is inserted between the light receiving unit and the metal film, so that the components of plasmon scattered light and surface diffused light, which are excitation wavelengths, are received from the light received by the light receiving unit. Excluded.
  • the fluorescence emitted when the fluorescent substance attached to the specimen is excited by the enhanced electric field is accurately measured.
  • the signal-to-noise ratio of the signal obtained by measurement is high, and the specimen can be detected with high accuracy and high sensitivity.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analysis apparatus and the surface plasmon resonance fluorescence analysis method according to the present invention cause the fluorescent material contained in the specimen to emit light using the electric field of the evanescent wave generated by the surface plasmon resonance, and this fluorescence It is useful for measuring a sample by detecting the sample, and is suitable for more accurately detecting the sample.

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Abstract

　本発明は、プリズム５１の金属膜５５上に試料液が流され、励起光αがプリズム５１内に入射して金属膜５５の特定の位置において反射する状態を保ちながら入射角θが変更されると共に、金属膜５５において生じる励起波長の光の強度が測定され、この測定結果に基づく入射角θ１となるように励起光αが金属膜５５の特定の位置に照射されつつ、金属膜５５において生じた励起蛍光が受光部４１によって受光されてその強度が測定され、励起波長の光が測定されるときには励起光の波長の光を遮る光フィルタ４６が受光部４１と金属膜５５との間から退避させられると共に、励起蛍光を測定するときには光フィルタ４６が受光部４１と金属膜５５との間に入れられる。

Description

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法
　本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して試料液中に含まれる検体の検出を行う表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に関するものである。
　従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、検体（被検出物質）を高感度に検出する方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光：ＳＰＦＳ）法が知られている。
　ＳＰＦＳ法は、金や銀等からなる金属膜が所定の面上に形成されたプリズムにおいて、前記所定の面に対して全反射条件となるようにプリズム側から金属膜に励起光を入射させ、金属膜において励起光が反射する際にこの金属膜からしみ出す光（エバネッセント波）を利用する。具体的に、ＳＰＦＳ法は、励起光が金属膜において全反射する際に、この金属膜からしみ出すエバネッセント波によって、金属膜の表面上に流した試料液中に含まれる検体又はこの検体に付された蛍光物質（標識物質）が励起されて発する蛍光（励起蛍光）を分析する。これにより、上記検体の存在又はその量を検出することができる。
　このようなＳＰＦＳ法を利用する光学測定では、金属膜の表面近傍の電場（増強電場）が表面プラズモン共鳴によって十分に増強されるよう、個々のプリズムや反応場の状況に応じた励起光入射角（詳しくは、金属膜に対する入射角）が設定される必要がある。
　特許文献１に記載の方法によれば、前記所定の面に対して全反射条件となるようにプリズム側から金属膜に向けて励起光が入射させられ、金属膜に対する励起光の入射角が変更されつつその反射光の強度が測定される。そして、この測定において反射光の受光光量が最小となったときに金属膜に表面プラズモン共鳴が生じているため、この受光光量が最小になったときの金属膜への励起光の入射角が金属膜の表面近傍の電場を十分に増強する励起光入射角とされる。
　しかし、金属膜近傍の電場強度が最大になる励起光の入射角と、反射した励起光の受光光量が最小となる入射角との間には、所定のずれがある。そのため、上記のように反射した励起光の受光光量に基づいて検体の検出時の励起光の入射角が設定されると、上記のずれのために電場強度が最大のときよりも低い増強電場において検体の検出が行われる。その結果、上記の方法では、電場強度が最大の増強電場による検体の検出時よりも、感度及び精度が低下する。
日本国特開２００６－２７５５３５号公報
　本発明の目的は、より精度よく検体の検出を行うことができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置、及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することである。
　本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、共鳴角の走査では、励起光の波長の光を遮る第１の光フィルタを受光部と金属膜との間から退避させ、検体の測定では、前記第１の光フィルタを受光部と金属膜との間に入れる。このため、本発明によれば、より精度よく検体の検出を行うことができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置、及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することができる。
　上記並びにその他の本発明の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な記載と添付図面から明らかになるであろう。
図１は、本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置に分析チップが設置された状態の構成を示す機能ブロック図である。 図２は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置のチップ保持部及びこのチップ保持部に保持された状態の分析チップの構成を示す拡大図である。 図３は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における励起光の偏光状態及び金属膜における励起光の照射領域を示す図である。 図４は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の測定光学系を説明するための図である。 図５は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において検体を分析するときの基本シーケンスを示すフローチャートである。 図６は、図５の共鳴角走査シーケンスを示すフローチャートである。 図７は、図５の最適位置走査シーケンスを示すフローチャートである。 図８は、図５の複屈折測定シーケンスを示すフローチャートである。 図９は、図５の励起蛍光測定シーケンスを示すフローチャートである。 図１０（Ａ）は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における反射部材の第２の位置決めを説明するための図であり、図１０（Ｂ）は、測定領域の中心位置に照射領域を移動させた状態を示す図である。
　以下、本発明の一実施形態について、添付図面を参照しつつ説明する。
　本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下、単に「分析装置」とも称する。）は、プリズムの反射界面に対して全反射条件となるように当該プリズムに入射した励起光が反射界面において反射したときの当該反射界面からしみ出すエバネッセント波（増強電場）を利用し、被検出物質（以下、単に「検体」とも称する。）に標識された（付された）蛍光物質を励起させる。そして、分析装置は、この蛍光物質の励起により生じた蛍光の光量を検出することによって検体の検出を行う。
　分析装置は、図１に示すように、分析チップ５０を保持するチップ保持部１２と、チップ保持部１２に保持された状態の分析チップ５０に励起光を出射する励起光射出部２０と、分析チップ５０において生じた光の強度を測定する光測定部４０と、これらチップ保持部１２、励起光射出部２０、及び光測定部４０等の分析装置１０の各構成要素の制御を行うと共に、各種演算処理を行う制御処理部１４（制御部）と、演算結果等の各種情報を表示する表示部１６と、を備える。また、分析装置１０は、患者からの血液等の前処理を行う前処理部（図示省略）も備える。この前処理部は、試薬チップ（図略）を受け入れ、この試薬チップに注入されている血液等の前処理（血球分離や希釈、混合等）を行って試料液を生成し、この試料液を分析チップ５０に注入する。試薬チップには、複数の収納部が設けられ、各収納部には、血液等の他に、試薬、希釈液、洗浄液等が個別に封入されている。
　分析チップ５０は、図２にも示すように、プリズム５１と、プリズム５１の表面に形成される金属膜５５と、検体を含む試料液や洗浄液等が金属膜５５上を当該金属膜５５に接しつつ流れる流路５８を形成する流路部材５７と、を備える。本実施形態の分析チップ５０は、検体の検出（分析）毎に交換される。
　プリズム５１は、励起光射出部２０からの励起光αをプリズム５１の内部に入射させる入射面５２と、プリズム５１の内部に入射した励起光αが反射される金属膜５５が形成される成膜面（所定の面）５３と、金属膜５５によって反射された励起光αがプリズム５１の外部に射出される射出面５４と、を表面に含む。このプリズム５１は、透明なガラス又は樹脂により形成される。射出面５４は、励起光αが金属膜５５によって反射された後に最初に当る面である。射出面５４は、金属膜５５によって反射された励起光αのＳ波成分の光がプリズム５１の内部に留まらないように、入射面５２と同様に、光学面に形成される。本実施形態のプリズム５１は、屈折率が１．４～１．６程度の透明な樹脂により形成されている。尚、プリズム５１は、ガラスにより形成されてもよい。また、プリズム５１は、入射面５２と成膜面５３と射出面５４とを当該プリズム５１の表面に含む形状であればよい。即ち、プリズム５１は、入射面５２から内部に入射した励起光αが成膜面５３上の金属膜５５によって全反射され、この励起光α（詳細には、励起光αのＳ波成分）がプリズム５１の内部において乱反射して留まらずに射出面５４から外部に射出される形状であればよい。
　金属膜５５は、プリズム５１の成膜面５３上に成膜（形成）された金属製の薄膜である。本実施形態の金属膜５５は、金により形成されている。この金属膜５５は、成膜面５３に対して全反射条件となるようにプリズム５１内に入射した励起光αが金属膜５５の形成された成膜面５３において反射することにより生じたエバネッセント波（増強電場）を増幅する。即ち、成膜面５３上に金属膜５５が設けられ、この金属膜５５に表面プラズモン共鳴が生じることにより、金属膜５５のない面（成膜面５３）において励起光αが全反射してエバネッセント波が生じた場合に比べ、形成されるエバネッセント波が増幅されている（即ち、金属膜５５の表面５５ａ近傍に増強電場が形成される）。
　尚、金属膜５５の素材は、金に限定されず、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であればよい。例えば、金属膜５５は、銀、銅、アルミ等（合金を含む）であってもよい。
　また、金属膜５５の表面（プリズム５１と反対側の面）５５ａには、特定の抗原を捕捉するための捕捉体５６が固定されている。この捕捉体５６は、表面処理によって金属膜５５の表面５５ａに固定される。
　流路部材５７は、プリズム５１の成膜面５３（詳しくは、金属膜５５）上に設けられ、これにより、成膜面５３と共同して試料液が流れる流路５８を形成する。流路部材５７は、透明な樹脂により形成される。この流路部材５７は、接着剤、レーザ溶着や超音波溶着等の溶着、クランプ部材を用いた圧着等によりプリズム５１に接合される。流路５８は、金属膜５５と試料液とが接する領域が光測定部４０の測定領域よりも広くなるような形状を有する。
　以上のように構成される分析チップ５０は、分析装置１０の前処理部に設置されると、この前処理部による前処理の終わった試料液が流路５８内に注入（供給）される。そして、試料液が注入された分析チップ５０は、金属膜５５上に固定された捕捉体５６と検体（特定の抗原）との反応が終了すると、チップ保持部１２まで搬送される。チップ保持部１２まで搬送された分析チップ５０は、分析装置１０に対して所定の姿勢となるようにチップ保持部１２に保持される。
　チップ保持部１２は、検体の検出のときに分析チップ５０が分析装置１０に対して所定の姿勢となるように当該分析チップ５０を保持する。前記所定の姿勢とは、励起光射出部２０から射出された励起光αが成膜面５３に対して全反射条件となるように入射面５２からプリズム５１の内部に入射し、この入射した励起光αが金属膜５５において反射されるような姿勢である。また、チップ保持部１２は、着脱可能に分析チップ５０を保持する。本実施形態のチップ保持部１２は、流路部材５７の下側にプリズム５１が位置する姿勢となるように分析チップ５０を保持する。
　尚、分析装置１０では、射出面５４から射出された光の影響が光測定部４０に及ばないように、チップ保持部１２に保持された状態の分析チップ５０の射出面５４近傍に、光吸収体（図示省略）が配置されている。
　励起光射出部２０は、チップ保持部１２において保持された状態の分析チップ５０に含まれるプリズム５１の金属膜５５によって反射されるように、当該プリズム５１内に励起光αを入射させる。具体的に、励起光射出部２０は、直線偏光された励起光を射出する光源部２１と、光源部２１から出射された励起光αをプリズム５１の入射面５２まで案内する励起光学系３０と、を有する。
　光源部２１は、励起光源２２を含む光源ユニット部２３と、励起光源２２から射出された励起光αを整波する第１整波部２４と、を有する。本実施形態の光源部２１は、下方に向けて励起光αを射出する。本実施形態の励起光源２２は、レーザーダイオードである。
　光源ユニット部２３は、励起光源２２と、この励起光源２２の温度調整（温調）を行う温調回路２５と、を有する。この光源ユニット部２３は、励起光源２２が射出した励起光αの平行化（コメリート）を行うと共に、プリズム５１の金属膜５５に励起光αが短軸側から入射するように励起光源２２の姿勢を調整して保持する。これは、以下の理由による。
　励起光源（レーザーダイオード）２２から射出される励起光αは、コメリートされても形状が扁平であり且つ偏光方向が概ね一方向に偏っている。このため、励起光源２２の姿勢が調整され、この調整後の姿勢が保持されることによって、励起光αが成膜面５３に対して全反射条件（成膜面５３に対して浅い角度）となるようにプリズム５１内に入射したときに、励起光αの成膜面５３における照射領域の輪郭形状が凡そ円形になる（図３参照）。
　温調回路２５は、励起光源（レーザーダイオード）２２の温調を行うための回帰回路である。具体的に、温調回路２５は、コリメート化後に励起光αの光線から分岐させた光線光量をフォトダイオード等（図示省略）により監視し、これにより、射出される励起光αの波長及び光量が一定となるように励起光源２２の温度を調整する。これは、温度によって励起光源２２が射出する光の波長と射出エネルギーとが変動するためである。
　第１整波部２４は、複数のフィルタ（光フィルタ）によって光源ユニット部２３から射出された励起光αを整波し、当該励起光αを偏光方向が一意な励起波長にする。具体的に、第１整波部２４は、第１バンドパスフィルタ（以下、単に「第１ＢＰＦ」と称する。）２６と、直線偏光フィルタ（以下、単に「ＬＰＦ」と称する。）２７と、第１ＮＤフィルタ（以下、単に「第１ＮＤＦ」と称する。）２８と、を有する。第１ＢＰＦ２６は、励起光源２２からの射出光が若干の波長分布幅を有しているため、これを中心波長のみの挟帯域にろ波する。また、ＬＰＦ２７は、励起光源２２からの射出光が若干の異位相差成分を有しているため、これを純粋な直線偏光にろ波する。また、第１ＮＤＦ２８は、いわゆる減光フィルタである。即ち、第１ＮＤＦ２８は、励起光源２２から射出された光を減光することにより、光源部２１から射出される励起光αの光量を調整する。尚、励起光源２２から射出される射出光の強度によっては、第１整波部２４に第１ＮＤＦ２８が設けられなくてもよい。
　励起光学系３０は、光源部２１からチップ保持部１２に保持された状態の分析チップ５０のプリズム５１まで励起光αを案内する。この励起光学系３０は、励起光αの偏光方向を変更する偏光方向調整部３１と、励起光αのビームの輪郭形状等を調整する整形光学系３２と、励起光αのプリズム５１内への入射経路を変更して金属膜５５における励起光αの反射位置や金属膜５５に対する励起光αの入射角θを変更する入射経路調整部３５と、を有する。
　偏光方向調整部３１は、１／２波長板３３と、この１／２波長板３３を回転させる回転駆動部３４と、を有する。
　１／２波長板３３は、励起光学系３０の光路上に配置され、励起光αの偏光方向を連続的に回転させる偏光回転子として用いられる。回転駆動部３４は、１／２波長板３３を回転させることにより、金属膜５５に対する励起光αの偏光方向を回転させる。本実施形態の回転駆動部３４は、ステップモーターを有し、制御処理部１４からの指示信号に基づいてステップモーターを駆動して１／２波長板３３を回転させる。このように１／２波長板３３が回転すると、第１整波部２４において直線偏光された励起光αの偏光方向が回転する。これにより、金属膜５５に入射する励起光αにおけるＰ波成分の量とＳ波成分の量とが変化する。即ち、回転駆動部３４が１／２波長板３３を回転させることにより、金属膜５５においてエバネッセント波が最大限しみ出す条件（即ち、金属膜５５の表面５５ａ近傍に形成される増強電場の電場増強度が最大となる条件）から全くしみ出さない条件（即ち、金属膜５５の表面５５ａ近傍に増強電場が全く形成されない条件）まで偏光方向を自在に変化させることが可能となる。
　整形光学系３２は、金属膜５５における励起光αの照射領域の輪郭が所定の直径を有する円形になるように、スリットやズーム機能等によって励起光αのビームサイズやビームの輪郭形状を調整する。尚、本実施形態の金属膜５５における励起光αの照射領域は、光測定部４０における測定領域よりも小さくなるように調整される（図１０（Ｂ）参照）。これにより、金属膜５５における励起光αの照射領域が僅かにずれても、表面プラズモン共鳴及びこの表面プラズモン共鳴に基づく増強電場に起因する光を光測定部４０が測定することができる。
　入射経路調整部３５は、光源部２１からの励起光αを反射する反射部材３６と、この反射部材３６を駆動する反射部材駆動部（駆動部）３７とを有する。
　反射部材３６は、励起光αを反射する反射面３６ａを有する。本実施形態の反射部材３６は、反射鏡である。この反射部材３６では、反射面３６ａに入射する前の励起光αと、当該反射面３６ａによって反射された後の励起光αと、において位相のずれや減光等が生じない誘電体多層膜（詳しくは、励起光波長においてＰ波成分とＳ波成分とのいずれとも波長依存性をなくした誘電体多層膜）が反射面３６ａ上に成膜されている。これにより、当該分析装置１０における検体の検出精度及び感度が向上する。
　また、反射部材３６の裏面３６ｂには、励起光αを反射することなく吸収する無反射光吸収物質が貼り付けられている。無反射吸収物質は、例えば、吸収型ＮＤフィルム、植毛布等である。
　反射部材駆動部３７は、ステージ３７ａと、このステージ３７ａに設けられ、反射部材３６を支持すると共に回転駆動する回転駆動機構（図示省略）と、ステージ３７ａを往復駆動する往復駆動機構（図示省略）と、を有する。
　回転駆動機構は、反射部材３６を回転させる（図１の矢印β参照）ことにより、反射面３６ａの向きを変える。具体的に、回転駆動機構は、反射部材３６に入射する励起光αの光路と、反射部材３６による反射後の励起光αの光路と、を含む面（図１の紙面）に対して反射面３６ａが直交する姿勢となるように反射部材３６を支持する。そして、回転駆動機構は、前記反射部材３６の前記直交姿勢（反射面３６ａが前記光路を含む面に対して直交する姿勢）を維持しつつ反射面３６ａが前記光路を含む面に沿って回転するように、制御処理部１４の指示信号に基づいて反射部材３６を回転させる。この回転駆動機構は、回転モーターを有し、この回転モーターによって直接又は間接に反射部材３６を回転駆動して反射面３６ａの向きを変える。また、回転駆動機構は、制御処理部１４からの指示信号に基づいて、光源部２１からの励起光αが反射部材３６の裏面３６ｂに入射する位置まで反射部材３６を回転させることもある。本実施形態では、重心が回転中心近くを通るように反射部材３６が回転駆動機構に取り付けられ、回転モーターは、トルクが十分な大きさとなるように設定されている。本実施形態の回転モーターは、高分解能のステップモーターである。この回転モーターは、制御処理部１４からの指示信号によって、所定の角度間隔となるように（即ち、回転方向において段階的に）反射部材３６を回転させる。前記所定の間隔は、反射面３６ａの向きの調整における分解能に関係し、本機の性能によって適宜に設定される。
　往復駆動機構は、光源部２１からの励起光αの光軸に沿って、ステージ３７ａ、即ち、反射部材３６を直線的に移動させる（図１における矢印γ参照）。本実施形態の往復駆動機構は、光源部２１からの励起光αの光軸方向、即ち、上下方向にステージ３７ａを往復駆動する。具体的に、往復駆動機構では、制御処理部１４からの指示信号によりステップモーターが制御され、このステップモーターにより駆動されるねじ送り機構によって、回転駆動機構と反射部材３６とが搭載されたステージ３７ａが上下方向に往復移動する。即ち、往復駆動機構は、制御処理部１４の指示信号に従い、光源部２１からの励起光αの光軸に対する反射面３６ａの向きを一定に保ったまま、前記光軸上の所定位置に反射部材３６を高精度に移動させる。
　光測定部４０は、受光部４１と、分析チップ５０から受光部４１まで光を案内する測定光学系４２と、測定光学系４２において案内される光を整波する第２整波部４３と、を有する。また、光測定部４０は、分析チップ５０の金属膜５５及びこの金属膜５５と隣接する領域において生じる光（以下、単に「金属膜５５において生じる光」とも称する。）の強度（本実施形態では光量）を測定する。
　受光部４１は、光を受光してその光量に応じた強度信号を出力する。本実施形態では、検体に標識された蛍光物質を励起させることによって生じる蛍光等の微弱な光を検出するため、感度とＳ／Ｎ比の高い光電子倍増管（Photomultiplier Tube：ＰＭＴ）が受光部４１として用いられる。尚、受光部４１は、ＰＭＴに限定されず、冷却ＣＣＤ型イメージセンサ等でもよい。
　測定光学系４２は、図４にも示すように、迷光の影響を受け難い共役光学系であり、集光レンズ４４と結像レンズ４５とを有する。本実施形態の測定光学系４２は、群間、即ち、集光レンズ４４と結像レンズ４５との間を進行する光が平行光若しくは略平行光となる２群共役光学系である。
　第２整波部４３は、測定光学系４２において案内される光から励起光成分（例えば、プラズモン散乱光やラマン散乱光、拡散光等）を除去し、測定光学系４２において案内される光の光量（強度）を調整する。この第２整波部４３は、第２バンドパスフィルタ（第１の光フィルタ）４６と、第２ＮＤフィルタ（第２の光フィルタ）４７と、各フィルタ４６，４７の位置の切り換えを行う位置切換部４８と、を有する。
　第２バンドパスフィルタ（以下、単に「第２ＢＰＦ」と称する。）４６は、励起光αの波長（励起波長）の光を遮る。これにより、第２ＢＰＦ４６は、受光部４１に蛍光（検体に標識された蛍光物質が増強電場により励起して生じた光）の波長以外の波長の光（例えば、励起光射出部２０からの漏れ光やプラズモン散乱光、拡散光等）が入射することを防ぐことができる。即ち、第２ＢＰＦ４６は、受光部４１に入射する光からノイズ成分を除去し、これにより受光部４１における微弱な蛍光の検出精度及び感度の向上を図る。
　第２ＮＤフィルタ４７（以下、単に「第２ＮＤＦ」と称する。）は、いわゆる減光フィルタであり、入射した光を減衰させて出射する。この第２ＮＤＦ４７は、測定光学系４２において案内されるプラズモン散乱光や拡散光等を減光することにより、微弱な光（本実施形態では蛍光）を検出するための受光部（本実施形態ではＰＭＴ）４１においてプラズモン散乱光等を測定することを可能とする。具体的には、検体の検出のときに測定する励起蛍光の光量に比べて、増強電場が最大となる励起光αの入射角θ１を求めるために測定する光の光量が非常に大きい。このため、共通の受光部４１が用いられる場合、増強電場が最大になる励起光αの入射角θ１を求めるために測定する光を第２ＮＤＦ４７によって減光することにより、受光部４１の損傷が防がれる。
　これら第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とは、光軸に対して略垂直な同一平面（詳しくは、測定光学系４２を進む光の光軸と略直交する平面）に沿って並ぶように共通の保持フレーム４９に保持されている。
　位置切換部４８は、第２ＢＰＦ４６及び第２ＮＤＦ４７の位置をフィルタリング位置と退避位置との間において切り換える。
　尚、フィルタリング位置とは、測定光学系４２における光路上の位置である。具体的に、フィルタリング位置は、集光レンズ４４と結像レンズ４５との間において、各フィルタ４６，４７がこれらレンズ４４，４５間の平行光若しくは略平行光の光軸と直交し且つ当該平行光若しくは略平行光を横断する位置である。これにより、分析装置１０では、検体を精度よく検出することができる。即ち、第２ＢＰＦ４６又第２ＮＤＦ４７がレンズ４４，４５間を進行する平行光等の光軸に対して傾斜していると、第２ＢＰＦ４６又は第２ＮＤＦ４７を通過した光の光軸がシフトするため、光測定部４０における測定精度が低下する。
　一方、退避位置とは、測定光学系４２における光路から外れた位置である。
　位置切換部４８は、第２ＢＰＦ４６がフィルタリング位置のときに第２ＮＤＦ４７が退避位置となり（図４参照）、第２ＢＰＦ４６が退避位置のときに第２ＮＤＦ４７がフィルタリング位置となるように、各フィルタ４６，４７の位置をそれぞれ切り換える。本実施形態の位置切換部４８は、第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とが並んでいる平面に沿って保持フレーム４９を往復移動させる（図４の矢印δ参照）ことにより、各フィルタ４６，４７の位置の切り換えを行う。これにより、二つのフィルタ４６，４７の位置の切り換えが１つの駆動源によって同時に行われる。
　この位置切換部４８は、制御処理部１４からの指示信号に従って各フィルタ４６，４７の位置の切り換えを行う。
　尚、本実施形態の第２整波部４３には、第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とが設けられているが、これに限定されない。測定される光の光量が受光部４１の許容量を超えなければ、第２整波部４３に第２ＮＤＦ４７が設けられていなくてもよい。また、測定する光によって受光部が切り換えられる構成、即ち、分析装置が、蛍光を受光するための受光部４１と、蛍光よりも光量の大きな光を受光するための受光部と、を切り換える構成を有する場合にも、第２ＮＤＦ４７がなくてもよい。
　また、本実施形態では、位置切換部４８が保持フレーム４９を往復移動させることによって、各フィルタ４６，４７の位置の切り換えが行われているが、これに限定されない。例えば、第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とが同一平面上に並ぶように、円板状の保持フレームが各フィルタ４６，４７をそれぞれ保持し、位置切換部がこの第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７との中間位置を回転中心にして円板状の保持フレームを回転させてもよい。この構成によっても、各フィルタ４６，４７の位置の切り換えが行われる。また、位置切換部が２つの駆動源を有し、第２ＢＰＦ４６の位置の切り換えと第２ＮＤＦ４７の位置の切り換えとが別々の駆動源によって行われてもよい。
　制御処理部１４は、当該分析装置１０を構成する各構成要素の制御を行う。例えば、当該分析装置１０が検体を分析するときに、制御処理部１４が、光源部２１、偏光方向調整部３１、入射経路調整部３５、及び光測定部４０等を制御する。これにより、当該分析装置１０では、共鳴角走査工程、最適位置走査工程、複屈折測定工程、励起蛍光測定工程等が行われる。また、制御処理部１４は、検体を分析するときに、光測定部４０（詳しくは、受光部４１）から送られてきた出力信号に基づいて演算し、この光測定部４０により測定された蛍光に関する分析を行う。例えば、制御処理部１４は、光測定部４０により検出した単位面積あたりの蛍光の数のカウントや、時間の経過に伴う蛍光の増加量の算出等を行う。制御処理部１４による演算結果は、この制御処理部１４に接続される表示部１６に出力される。尚、制御処理部１４による具体的な制御や演算についての詳細は後述する。
　表示部１６は、制御処理部１４からの出力信号に基づき、制御処理部１４における演算結果を表示する。表示部１６は、液晶ディスプレイ等のように演算結果等を画面に表示するものでもよく、プリンター等のように演算結果等をプリントアウトするものであってもよい。また、表示部１６は、画面の表示とプリントアウトとを組み合わせたものでもよい。
　以上の構成の分析装置１０における検体の分析について、図５乃至図９も参照しつつ以下に説明する。尚、制御処理部１４による分析装置１０の各構成要素の制御、及び制御処理部１４で行われる演算等についての詳細も併せて説明する。
　図５は、当該分析装置１０において検体を分析するときの基本シーケンスを示すフローチャートである。図６は、共鳴角走査シーケンスを示すフローチャートである。図７は、最適位置走査シーケンスを示すフローチャートである。図８は、複屈折測定シーケンスを示すフローチャートである。図９は、励起蛍光測定シーケンスを示すフローチャートである。
<前処理工程>
　患者から血液等が採取され、この採取された血液等が試薬チップに注入される。この血液等が注入された試薬チップが分析装置１０の前処理部にセットされる。制御処理部１４は、このセットされた試薬チップの血液等の前処理（血球分離や希釈、混合等）を前処理部によって行い、試料液を生成する。次に、分析チップ５０が前処理部に設置されると、制御処理部１４は、前処理の終わった試料液を前処理部によって分析チップ５０の流路５８内に注入し、金属膜５５の表面に固定された捕捉体５６に検体（特定の抗原）を捕捉させる。即ち、前処理部は、捕捉体５６と検体とを反応させる。本実施形態では、捕捉体５６が、蛍光物質（本実施形態では、蛍光色素）が標識された検体を捕捉しているが、これに限定されない。例えば、捕捉体５６が検体を捕捉した後に分析チップ５０に蛍光物質が注入されることにより、この蛍光物質が捕捉体５６に捕捉された状態の検体に対して標識されてもよい。
　前記反応が行われた分析チップ５０は、チップ保持部１２まで搬送され、チップ保持部１２に保持される（ステップＳ１）。
<励起光源２２の温調>
　一方、励起光源（本実施形態では、レーザーダイオード）２２は、波長変動の少ない安定的な波長の出力光を出力させるために、温調回路２５によって常に温調されて定温に維持される。これは、波長がずれると表面プラズモン共鳴条件やエバネッセント波（増強電場）のしみ出し量が変化するため、血液中のタンパク質等を定量する装置において必須である。維持温度になるまでに時間がかかるため、通常、励起光源２２は、分析装置１０の電源投入時から温調回路２５によって常に温度維持される。
<共鳴角走査工程>
　分析チップ５０がチップ保持部１２に保持されると、制御処理部１４は、当該分析チップ５０における最適な表面プラズモン共鳴条件の走査（共鳴角走査）を行う。そして、この走査の結果に基づき、制御処理部１４は、金属膜５５において生じる増強電場の電場強度が最も大きくなる入射角（励起入射角θ１）で励起光αが金属膜５５に入射するように、反射部材３６の位置決め（第１の位置決め）を行う（ステップＳ２）。
　具体的には、制御処理部１４は、反射部材駆動部３７によって反射部材３６を駆動することにより、分析チップ５０に含まれるプリズム５１の金属膜５５への励起光αの入射条件（励起入射角θ１）の走査を行う。詳しくは、分析チップ５０に含まれるプリズム５１の材質、形状、流路充填液（試料液）屈折率等により、当該プリズム５１の金属膜５５において、表面プラズモン共鳴に基づく増強電場（エバネッセント波）の強度が最も大きくなる励起光の入射角θ１は決まっている。しかし、捕捉体５６に捕捉された検体の分子量やこの分子を構成する物質、プリズム５１側の製造誤差等により、励起光入射条件（励起入射角θ１）のゆらぎが発生する。このため、制御処理部１４は、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角度となるように励起光αを金属膜５５に入射させる。そして、このときに金属膜５５において生じる光の光量に基づいて当該分析チップ５０における励起入射角θ１が求められる。
　より詳しくは、先ず、制御処理部１４が第２整波部４３の位置切換部４８により第２ＢＰＦ４６を退避位置に移動させると共に、第２ＮＤＦ４７をフィルタリング位置に移動させる（ステップＳ２１）。このとき、偏光方向調整部３１の１／２波長板３３は、励起光射出部２０から励起光αが射出されたときに金属膜５５へ入射する励起光αにおいてＰ波成分が最も多くなるように、設計的に求められた状態（初期状態）となっている。
　制御処理部１４は、反射部材駆動部３７の回転駆動機構と往復駆動機構とにより、反射部材３６を最大離反位置に移動させる（ステップＳ２２）。この最大離反位置とは、励起光射出部２０から励起光αが射出されたときに、励起光αが金属膜５５の特定の位置（本実施形態では光測定部４０の測定領域内）において反射された状態で、且つ、金属膜５５の表面５５ａ近傍領域にエバネッセント波がしみ出さない入射角θとなる、反射部材３６の位置及び反射面３６ａの向きである。
　この状態において、制御処理部１４は、金属膜５５において生じた光の光量を光測定部４０によって測定する。そして、制御処理部１４は、その測定結果を、光測定部４０（詳しくは受光部４１）からの出力信号によって取得する。この反射部材３６が最大離反位置のときに光測定部４０が測定する光は、プリズム５１における表面拡散光ＳＫである。
　制御処理部１４は、励起光αの金属膜５５に対する入射角θと、光測定部４０により測定した光の光量と、を関連付けて記憶する（ステップＳ２３）。このとき、第２ＢＰＦ４６が退避位置であるため、受光部４１が受光する光には、励起光αの励起波長と同じ波長の光が含まれる。この励起波長と同じ波長の光は、金属膜５５において生じたプラズモン散乱光やラマン散乱光、拡散光等である。これら励起波長と同じ波長の光は、金属膜５５において生じた表面プラズモン共鳴によって増強される。このため、前記励起波長と同じ波長の光の光量は、検体に標識された蛍光物質が励起して発した励起蛍光の光量に比べて十分に大きい。そこで、制御処理部１４が第２ＢＰＦ４６を位置切換部４８によって測定光学系４２の光路上から退避させることにより、受光部４１が励起波長の光を受光し、これにより、金属膜５５において生じる光の光量が精度よく測定される。
　尚、本実施形態では、光量の小さな励起蛍光を測定する受光部４１が、励起蛍光よりも光量が非常に大きな表面プラズモン散乱光や拡散光等を測定する。このため、本実施形態の分析装置１０では、位置切換部４８が第２ＢＰＦ４６を退避位置に退避さると共に第２ＮＤＦ４７をフィルタリング位置に移動させることにより、同一の受光部（本実施形態ではＰＭＴ）４１が、両光（散乱光等と励起蛍光）の光量を測定できる。
　制御処理部１４は、光源部２１から励起光αを射出させた状態において、入射経路調整部３５により、反射部材３６の位置を調整する。具体的に、制御処理部１４は、金属膜５５上における励起光αの照射位置をずらさないように、回転駆動機構によって反射面３６ａの向きを回転させる（ステップＳ２４）と共に往復駆動機構によって反射部材３６の位置を移動させる（ステップＳ２５）。詳しくは、制御処理部１４は、反射部材３６の位置と、その位置において反射面３６ａにより反射された励起光αがプリズム５１内に入射して金属膜５５の特定の位置に到達するような反射面３６ａの向きと、を対応づけたテーブルを予め記憶している。そして、制御処理部１４は、このテーブルに基づいて、回転駆動機構と往復移動機構とを制御して反射部材３６を移動させる。これにより、機構的に互いにリンクしていない往復駆動機構と回転駆動機構とによって反射部材３６の位置の変更と反射面３６ａの向きの調整とを行っても、金属膜５５における励起光αの照射位置を変えることなく金属膜５５に対する入射角θだけを変更することができる。尚、このステップＳ２４とステップＳ２５とにおいては、いずれか一方のステップが先に行われた後に他方のステップが行われてもよく、また、両ステップが同時に行われてもよい。
　光測定部４０は、金属膜５５において生じた光の光量を測定してその測定結果を制御処理部１４に出力し、制御処理部１４は、入射角θと関連付けてこの測定結果を記憶する（ステップＳ２６）。
　このように、制御処理部１４は、金属膜５５における照射位置がずれないようにして入射角θを変更しつつ光測定部４０により光の光量を測定し、その測定結果を記憶する。
　制御処理部１４は、所定の走査領域（例えば、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角θ）における光の光量の測定を光測定部４０によって行った後、光源部２１からの励起光αの射出を止める（ステップＳ２７）。そして、制御処理部１４は、記憶した光量の最大値と最小値とを選出し、これらを記憶する（ステップＳ２８）。また、制御処理部１４は、最大光量が得られたときの反射部材３６の位置及び反射面３６ａの向きとなるように反射部材駆動部３７によって反射部材３６を駆動する（ステップＳ２９）。
<最適位置走査工程>
　反射部材３６の第１の位置決めが終わると、制御処理部１４は、金属膜５５への励起光αの照射位置（入射位置）が光測定部４０の測定領域の中心部となるように、反射部材３６の位置決め（第２の位置決め）を行う（ステップＳ３）。
　詳しくは、先ず、制御処理部１４は、反射部材駆動部３７の往復駆動機構によって反射部材３６を上端位置に移動させる（ステップＳ３１）。この上端位置とは、励起光αが金属膜５５に入射したときに、その入射位置が光測定部４０の測定領域よりも外側となる位置である（図１０（Ａ）の位置Ａ参照）。制御処理部１４は、反射部材３６がこの位置のときに光源部２１により励起光αを射出させ、このときに金属膜５５において生じる光の光量を光測定部４０により測定し、その測定結果を記憶する（ステップＳ３２）。制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置か否かを判断する（ステップＳ３３）。この下端位置についての詳細は後述する。制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置でないと判断すると、往復駆動機構によって反射部材３６を所定量下方に移動させる（ステップＳ３４）。このとき、制御処理部１４は、回転駆動機構により反射部材３６を回転させることなく、往復駆動機構のみによって反射部材３６を移動させる。即ち、制御処理部１４は、光源部２１からの励起光αに対する反射面３６ａの向きを変えることなく、反射部材３６の位置のみを移動させる。反射部材３６が移動後、制御処理部１４は、光源部２１から励起光を射出させ、このときに金属膜５５において生じる光の光量を光測定部４０により測定し、その測定結果を記憶する（ステップＳ３２）。そして、制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置か否かを判断する（ステップＳ３３）。制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置に移動するまで、このステップＳ３２～ステップＳ３４を順に繰り返す。
　制御処理部１４は、光測定部４０による測定結果が記憶した各光量のうちの最大光量と比べて光量が５０％減少したか否かにより、反射部材が下端位置に到達したか否かを判断する。詳しくは、最初は、金属膜５５において励起光αの照射領域が光測定部４０の測定領域の外であるため、光測定部４０により測定される光量は小さい。そして、反射部材３６が次第に下方に移動し、励起光αの照射領域が光測定部４０の測定領域内に入ってくると（図１０(Ａ)の位置Ｂ参照）、光測定部４０により測定される光の光量が次第に大きくなる。更に反射部材３６が下方に移動し、励起光αの照射領域全体が光測定部４０の測定領域内に完全に含まれた状態となったとき（図１０（Ａ）の位置Ｃ参照）に、光測定部４０によって測定される金属膜５５において生じる光の光量は最大となる。そして、更に反射部材３６が下方に移動すると、励起光αの照射領域が光測定部４０の測定領域における反対側の端部から外側に移動する（図１０(Ａ)の位置Ｄ参照）ため、光測定部４０により測定される光の光量が減少する。即ち、ケラレ（光量落ち）が発生する。制御処理部１４は、これらの光の強度と、その強度が測定されたときの反射部材３６の上下方向の位置と、を関連付けて記憶すると共に、測定される光が最大光量の５０％落ちとなったか否かを判断する。そして、制御処理部１４は、光測定部４０により測定される光の光量が最大光量の５０％落ちとなったときに、反射部材３６が下端位置に到達したと判断する。
　制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置に移動したと判断すると、記憶している光量の各値から最大光量の５０％落ちとなっている値を選出する（ステップＳ３５）。このとき、選出される値は、２つある（図１０(Ａ)の位置Ｂと位置Ｄ参照）。制御処理部１４は、光測定部４０により測定される光量が最大光量の５０％落ちとなったときの反射部材３６の位置をそれぞれ選出する。そして、制御処理部１４は、その中心位置（図１０(Ａ)の位置Ｃｅ参照）を算出し、これを記憶する（ステップＳ３６）。制御処理部１４は、往復動駆動機構により反射部材３６を移動させて、求めた中心位置Ｃｅに照射領域を移動させる（ステップＳ３７、図１０（Ｂ）参照）。
　これにより、光測定部４０により測定される分析チップ５０毎の自家蛍光の光量を一定にすることができる。詳しくは、プリズム５１内を進行する励起光αにより、プリズム５１内部において蛍光が発生する（自家蛍光）。この蛍光は、金属膜５５において生じる散乱光等（プラズモン散乱光や拡散光等）に比べて微弱である。しかし、前記蛍光は、試料液中の検体の濃度が低い場合にこの検体に標識された蛍光物質が発する励起蛍光と比べた場合に同等レベルとなるため、励起蛍光の測定においてノイズとなる。この自家蛍光は微弱であるため、励起蛍光の測定においてノイズとなり得るのは、金属膜５５における励起光αの照射領域近傍の光が殆どである。表面プラズモン共鳴が生じているときに金属膜５５によって反射される励起光αが殆んどなくなるため、光測定部４０の測定領域の入射側（図１０（Ａ）における左側）からの自家蛍光が問題となる。この自家蛍光の光量は光路長に比例する。このため、検体の分析毎に、光測定部４０の測定領域にある入射側の光路長が一定になるように、励起光αの照射位置を調整することが必要となる。そこで、上記のようにして、検体の分析毎に、光測定部４０の測定領域において励起光αの照射位置が常に中心となるように調整することにより、光測定部４０の測定領域における励起光αの入射側の光路長が一定となる。その結果、分析チップ５０（プリズム５１）毎の自家蛍光の差が抑えられ、検体の分析精度を向上させることができる。
<複屈折測定工程>
　次に、励起光αがプリズム５１中を進行する際に複屈折が生じるため、制御処理部１４は、この複屈折を測定する（ステップＳ４）。そして、制御処理部１４は、検体に標識された蛍光物質からの励起蛍光の測定の際に前記複屈折を考慮することにより、検体の測定精度を向上させる。詳しくは、複屈折は、媒体中を光が透過する際に生じる。光が樹脂等の誘電体を透過する場合に複屈折が大きくなる。この複屈折は、媒体中の密度差等によって生じ、この密度差は媒体の成形時に生じる。そのため、個々のプリズム５１によって複屈折の度合いが異なる。複屈折によりプリズム５１中を進む励起光αに位相回転が生じ、金属膜５５に対してＰ波だけ入射させたいにも関わらず、この複屈折による位相回転によって励起光αにＳ波成分が生じる。この複屈折によって生じたＳ波成分の量に応じて増強電場によって励起された励起蛍光の光量が減少する。そのため、制御処理部１４がこの減少分を補正することにより、分析装置１０における検体の検出精度及び感度が向上する。
　具体的に、制御処理部１４は、光源部２１から励起光αを射出させ、金属膜５５において生じた光の光量を光測定部４０によって測定する。このとき、１／２波長板３３は、初期状態である（ステップＳ４１）。そして、制御処理部１４は、１／２波長板３３を回転駆動部によって回転させつつ、光測定部４０により測定した光の光量を１／２波長板３３の回転位置（初期状態からの回転角度）と関連付けて記憶する（ステップＳ４２及びステップＳ４３）。制御処理部１４が１／２波長板３３を回転させることにより、金属膜５５に入射する励起光αのＰ波成分とＳ波成分とがそれぞれ増減する。このＰ波成分とＳ波成分との増減に伴って、光測定部４０により測定される光の光量が増減する。このとき、励起光αにおいてＰ波成分が多くなるとこれに伴ってＳ波成分が少なくなり、Ｐ波成分が少なくなるとこれに伴ってＳ波成分が多くなる。そして、金属膜５５に入射する励起光αにおいてＰ波成分が多くなるほど、光測定部４０により測定される光の光量が大きくなる。一方、Ｓ波成分が多くなるほど光測定部４０により測定される光の光量が小さくなる。これは、Ｐ波成分は表面プラズモン共鳴に寄与するが、Ｓ波成分は表面プラズモン共鳴に寄与しないためである。
　制御処理部１４は、光測定部４０により測定される光の光量の最大値ＤＲｍａｘと最小値ＤＲｍｉｎが得られるまで、ステップＳ４２及びステップＳ４３を順に繰り返す（ステップＳ４４）。制御処理部１４は、最大値ＤＲｍａｘと最小値ＤＲｍｉｎとが得られると、記憶した光量と１／２波長板３３の回転位置とから、これら最大値ＤＲｍａｘと最小値ＤＲｍｉｎとを選出する（ステップＳ４５）と共に、これら各値が得られたときの１／２波長板３３の回転位置（具体的には、最大値ＤＲｍａｘが得られたときの第１回転位置と、最小値ＤＲｍｉｎが得られたときの第２回転位置と）を選出し、これらを記憶する。
　次に、制御処理部１４は、記憶した最大値ＤＲｍａｘ及び最小値ＤＲｍｉｎと、共鳴角走査工程において記憶していた表面拡散光ＳＫの光量とから、以下の式（１）及び式（２）により、当該プリズム５１における複屈折による長軸回転量θｉと、補正係数Ｋとを導出し、これらを記憶する（ステップＳ４６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　そして、制御処理部１４は、回転駆動部３４により最大値ＤＲｍａｘが得られたときの回転位置まで１／２波長板３３を回転させる。これにより、Ｐ波成分が最も多い状態で（即ち、Ｓ波成分が最も少ない状態で）励起光αが金属膜５５に入射する。
<励起蛍光測定工程>
　次に、制御処理部１４は、第１の位置決め及び第２の位置決めが行われた状態の反射部材３６に対して光源部２１により励起光αを照射する。これにより、励起光αが金属膜５５に表面プラズモン共鳴を生じさせる。この表面プラズモン共鳴に基づく増強電場によって金属膜５５の捕捉体５６に捕捉された検体に標識された蛍光物質が励起して蛍光（励起蛍光）を発する。そして、制御処理部１４は、光測定部４０により励起蛍光の測定を行う（ステップＳ５）。
　具体的に、制御処理部１４は、位置切換部４８により第２ＢＰＦ４６をフィルタリング位置に移動させると共に第２ＮＤＦ４７を退避位置に退避させる（ステップＳ５１：図１及び図４参照）。そして、制御処理部１４は、光源部２１から射出される励起光αが反射部材３６の裏面３６ｂに設けられた無反射光吸収物質に入射するように、反射部材駆動部３７の回転駆動機構により反射部材３６を回転させる（ステップＳ５２）。これにより、プリズム５１に励起光αが入射していない状態となる。このとき、制御処理部１４は、光測定部４０により測定を行い、このときの光測定部４０からの出力（暗ノイズＤＮ）を記憶する（ステップＳ５３）。制御処理部１４は、再び、反射部材３６の反射面３６ａに光源部２１からの励起光αが入射するように、反射部材駆動部３７の回転駆動機構により反射部材３６を回転させる（ステップＳ５４）。このときの反射面３６ａの向きは、共鳴角走査工程のステップＳ２９において設定された向きである。
　制御処理部１４は、光源部２１から励起光αを射出させ、金属膜５５近傍に生じた増強電場に起因する励起蛍光の光量を光測定部４０により測定し、これを記憶する（ステップＳ５５）。これにより、制御処理部１４は、測定最大光量（第１光量値）Ｓｍａｘを得る。これは、１／２波長板３３が複屈折測定工程において求められた第１回転位置（即ち、励起光αが金属膜５５に入射したときに金属膜５５において生じる光の光量が最大値ＤＲｍａｘとなる回転位置）まで回転させられているため、金属膜５５近傍の増強電場の強度が最も大きくなっているからである。
　次に、制御処理部１４は、複屈折工程において求められた第２回転位置（即ち、励起光αを金属膜５５に入射させたときに金属膜５５で生じる光の光量が最小値ＤＲｍｉｎとなる回転位置）まで回転駆動部３４によって１／２波長板３３を回転させる（ステップＳ５６）。そして、制御処理部１４は、光測定部４０により励起蛍光の光量を測定し、これを記憶する（ステップＳ５７）。これにより、制御処理部１４は、測定最小光量（第２光量値）Ｓｍｉｎを得る。
　制御処理部１４は、記憶している測定最大光量Ｓｍａｘと、測定最小光量Ｓｍｉｎと、暗ノイズＤＮとから、以下の式（３－１）～式（８）に示すようにして、プリズムにおける自家蛍光の光量ｈと、励起蛍光の光量Ｈとを導出し、これを記憶する（ステップＳ５８）。ここで、Ｓｍａｘが得られたときの励起蛍光の光量をＨ１、自家蛍光の光量をｈ１とし、Ｓｍｉｎが得られたときの励起蛍光の光量をＨ２、自家蛍光の光量をｈ２とする。
　まず、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
より、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　また、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
より、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　そして、式（４）と式（６）とにより、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
が得られ、複屈折測定工程で求めた補正係数Ｋが用いられて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
が導出される。
　尚、プリズム５１が複屈折のない、若しくは微小な材料（樹脂も含む）で形成されている場合、制御処理部１４は、以下の近似式（９）により、励起蛍光の光量Ｈを求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　さらに、暗ノイズ（ＤＮ）が非常に少ない測定系の場合、制御処理部１４は、以下の近似式（１０）により、励起蛍光の光量Ｈを求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
<記憶・表示工程>
　以上のようにして制御処理部１４は、複屈折の影響等を取り除いた真の励起蛍光の光量Ｈを求めた後、これを検体番号と関連付けて記憶する（ステップＳ６）。そして、制御処理部１４は、その他の記憶を消去する。また、制御処理部１４は、この検体番号と関連付けて記憶した励起蛍光の光量Ｈに基づく情報を表示部１６に出力する。表示部１６は、前記光量Ｈに基づく情報を表示する。
　最後に、制御処理部１４は、反射部材３６を初期位置に復帰させて（ステップＳ７）、一連の測定を終了する。
　本実施形態によれば、　高感度且つ高精度の検体の検出が可能となる。具体的には、表面プラズモン共鳴によって金属膜５５において生じる光の光量が測定されることにより、金属膜５５の表面５５ａ近傍に形成される増強電場の強度が最大となる金属膜５５への励起光αの入射角（励起入射角）θ１が精度よく得られる。このとき、金属膜５５において生じる光は、プラズモン散乱光や表面拡散光等の励起波長の光である。このため、この波長成分を遮る第２ＢＰＦ４６の位置が退避位置に切り換えられることにより、表面プラズモン共鳴に基づいて金属膜５５において生じる光の光量の増減が精度よく測定される。しかも、検体の検出時においては、測定光学系４２の光路上に第２ＢＰＦ４６が入れられることにより、光測定部４０において測定される光からプラズモン散乱光や表面拡散光等の励起波長の光の成分が除かれる。これにより、検体に標識された蛍起物質が発した励起蛍光が精度よく測定される。従って、測定により得られる信号のＳＮ比が高く、高精度且つ高感度な検体の検出が可能となる。
　また、本実施形態によれば、測定結果からプリズム５１における自家蛍光の影響が取り除かれ、これにより、広範なダイナミックレンジが確保される。
　詳しくは、金属膜５５に対する励起光αの偏光方向を変えつつ金属膜５５に生じる光が測定されることにより、検出された光の光量（強度）の増減から金属膜５５によって反射されるときの励起光においてＳ波成分（表面プラズモン共鳴に寄与する成分）が最も多くなるときの１／２波長板３３の回転位置と、前記励起光においてＰ波成分（表面プラズモン共鳴に寄与する成分）が最も多くなるときの１／２波長板３３の回転位置とがそれぞれ求められる。そして、励起光αの偏光方向が金属膜５５での反射時においてＳ波成分の最も多くなる状態となるように１／２波長板３３が調整され、光測定部４０が励起蛍光を測定することにより、プリズム５１における自家蛍光の光量が求められる。これにより、１／２波長板３３が調整されて励起光αの偏光状態が金属膜５５へ入射した時にＰ波成分が最も多くなる状態となったときの光測定部４０による励起蛍光の測定結果から、自家蛍光の影響を取り除くことができ、励起蛍光の抽出が可能となる。その結果、当該分析装置１０では、自家蛍光の影響が抑えられて励起蛍光が精度よく検出され、広範なダイナミックレンジが確保される。
　また、本実施形態によれば、反射部材３６の駆動によって金属膜５５に対する励起光αの入射角θを変えることができるため、入射角θの変更による金属膜５５における励起光αの反射位置のずれが抑えられる。即ち、上記の構成によれば、反射部材３６の位置と反射面３６ａの向きとの変更及び調整により金属膜５５に対する励起光αの入射角θが変わる。このため、従来のように光源や複数のレンズ等からなる励起光学系全体を動かして入射角θが調整される場合に比べて可動部品の数及び可動部分の重量等が抑えられる。これにより、可動部分における駆動誤差やガタつきが抑制される。その結果、励起光αの入射角θが変更されることによる、金属膜５５における励起光αの反射位置のずれが好適に抑制される。
　しかも、分析装置１０は、プリズム５１内に１つの励起光αを入射させて金属膜５５近傍に表面プラズモン共鳴に基づく増強電場を生じさせるため、従来のように入射角θの異なる複数の励起光α、α、…をプリズム５１内に同時に入射させる場合のように自家蛍光の光量が増加することを防止する。これにより、表面プラズモン共鳴によって金属膜５５近傍に生じた光が測定されることにより得られる信号において、自家蛍光に起因するＳＮ比の低下が抑えられる。
　また、本実施形態によれば、表面プラズモン共鳴による増強電場の電場強度が最も大きくなるように、金属膜５５に対する励起光αの入射角θが精度よく設定される。具体的には、金属膜５５における反射光の角度スペクトルにおける吸収ピークと、増強電場の電場強度のピークとはズレてるが、表面プラズモン共鳴に起因して生じる光（金属膜５５において生じる光）の強度ピークは、増強電場の電場強度のピークと一致する。そのため、この金属膜５５において生じる光の光量が最大となったときの反射部材３６の位置及び反射面３６ａの向きとなるように反射部材３６が調整されることにより、金属膜５５に対する励起光αの入射角が、増強電場の電場強度が最も大きくなる励起入射角θ１となる。
　尚、本発明の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
　上記実施形態の分析装置１０では、検体の検出毎に分析チップ５０が交換されるが、これに限定されない。即ち、分析装置１０の一部に分析チップが組み込まれ、一つの分析チップが繰り返し利用されて検体の検出が行われる分析装置１０であってもよい。
　上記実施形態では、共鳴角走査工程において、制御処理部１４は、励起入射角θ１を求める際に、金属膜５５への励起光αの入射角θを連続的に変えながら金属膜５５において生じる光の強度（上記実施形態では光量）を測定しているが、これに限定されない。
　例えば、制御処理部１４は、第１の範囲内において、入射角θを断続的に（例えば、入射角を１°刻みで）変えながら各入射角θにおける金属膜５５において生じる光の光量を測定する第１の走査と、この第１の走査の結果に基づく第２の範囲内において、入射角θを第１の走査より小さい間隔となるように（例えば、入射角を０．１°刻みで）断続的に、若しくは入射角θを連続的に変えつつ金属膜５５において生じる光の光量を測定する第２走査と、を行ってもよい。即ち、制御処理部１４は、離散ステップによる第１の走査によって第２の走査の範囲を絞り込み、その後、この絞り込んだ範囲内を細かく走査することによって金属膜５５において生じる光が最大光量となる励起入射角θ１を求めてもよい。尚、第２の範囲は第１の範囲に含まれている。
　詳しくは、制御処理部１４は、例えば、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角θの範囲（第１の範囲）内において１°刻みで入射角θを変更する。このとき、制御処理部１４は、各入射角θにおける金属膜５５において生じる光の光量を測定し（第１の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、第１の走査において最大光量が得られた入射角θを中心にして±１°以内の入射角θの範囲（第２の範囲）内において０．１°刻み又は連続的に入射角θを変更する。このとき、制御処理部１４は、金属膜５５において生じる光の光量を測定し（第２の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、この第２の走査において、最大光量が得られたときの入射角θを励起入射角θ１とする。このようにすれば、第１の範囲全体を細かく走査する場合に比べて、増強電場が最も大きくなる励起入射角θ１が効率よく求められる。
　尚、共鳴角走査工程において第１の走査と第２の走査とが行われる場合であって、チップ保持部１２が複数の分析チップ５０を順に保持し、次々に検体の分析を行う分析装置１０においては、最初の分析チップ５０に対してのみ第１の走査が行われ、２つ目以降の分析チップ５０に対しては、第２の走査のみが行われるようにしてもよい。
　詳しくは、制御処理部１４は、最初の分析チップ５０に対し、上記と同様にして、例えば、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角θの範囲（第１の範囲）内において１°刻みで入射角θを変更する。このとき、制御処理部１４は、各入射角θにおける金属膜５５において生じる光の光量を測定し（第１の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、第１の走査において最大光量が得られた入射角θを中心にして±３°以内の入射角θの範囲（第２の範囲）内において０．１°刻み又は連続的に入射角θを変更する。このとき、制御処理部１４は、金属膜５５において生じる光の光量を測定し（第２の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、この第２の走査において、最大光量が得られたときの入射角θを最初の分析チップ５０における励起入射角θ１とする。
　次に、制御処理部１４は、２つ目の分析チップ５０に対し、第１の走査を行うことなく最初の分析チップ５０への第１の走査において得られた第２の走査範囲内において０．１°刻み又は連続的に入射角θを変更する。このとき、制御処理部１４は、金属膜５５において生じる光の光量を測定し（第２の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、この第２の走査において、最大光量が得られたときの入射角θを２つ目の分析チップ５０における励起入射角θ１とする。このように、２つ目以降の分析チップ５０に対しては、制御処理部１４が最初の分析チップ５０によって得られた第２の範囲内における走査（第２の走査）のみを行うことにより、分析時間の短縮を図ることができる。
［実施の形態の概要］
　以上の実施形態をまとめると、以下の通りである。
　本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、所定の面上に金属膜が形成されたプリズムを含む分析チップを、着脱できるように保持可能なチップ保持部と、前記チップ保持部に保持された状態の前記分析チップに含まれるプリズムの金属膜によって反射されるように当該プリズム内に励起光を入射させる励起光射出部と、前記励起光が前記金属膜によって反射されることにより、当該金属膜における前記プリズムと反対の面側において生じる光の強度を測定可能な光測定部と、前記励起光射出部と前記光測定部とを制御する制御部と、を備える。そして、前記励起光射出部は、前記プリズム内に入射した励起光が前記金属膜の特定の位置において反射された状態を保ちつつ当該励起光の前記金属膜に対する入射角を変更可能であり、前記光測定部は、前記金属膜において生じた光を受光する受光部と、前記金属膜において生じた光を前記受光部まで案内する測定光学系と、前記励起光の波長の光を遮る第１の光フィルタと、前記測定光学系における光路上のフィルタリング位置と前記光路から外れた退避位置との間において前記第１の光フィルタの位置を切り換える位置切換部と、を有し、前記制御部は、前記励起光の金属膜に対する入射角を前記励起光射出部によって変更しつつ前記金属膜において生じた光の強度を前記光測定部によって測定するときに、前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によって退避位置とし、前記金属膜において生じた光の強度を測定した後に前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によってフィルタリング位置とする。
　また、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、所定の面上に金属膜が形成されたプリズムと、前記プリズムの金属膜によって反射されるように当該プリズム内に励起光を入射させる励起光射出部と、前記励起光が前記金属膜によって反射されることにより、当該金属膜における前記プリズムと反対の面側において生じる光の強度を測定可能な光測定部と、前記励起光射出部と前記光測定部とを制御する制御部と、を備える。そして、前記励起光射出部は、前記プリズム内に入射した励起光が前記金属膜の特定の位置において反射された状態を保ちつつ当該励起光の前記金属膜に対する入射角を変更可能であり、前記光測定部は、前記金属膜において生じた光を受光する受光部と、前記金属膜において生じた光を前記受光部まで案内する測定光学系と、前記励起光の波長の光を遮る第１の光フィルタと、前記測定光学系における光路上のフィルタリング位置と前記光路から外れた退避位置との間において前記第１の光フィルターの位置を切り換える位置切換部と、を有し、前記制御部は、前記励起光の金属膜に対する入射角を前記励起光射出部によって変更しつつ前記金属膜において生じた光の強度を前記光測定部によって測定するときに、前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によって退避位置とし、前記金属膜において生じた光の強度を測定した後に前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によってフィルタリング位置としてもよい。
　これらの構成によれば、検体の高感度且つ高精度な検出が可能となる。具体的には、表面プラズモン共鳴によって金属膜の表面（プリズムと反対側の面）側に生じる光の強度が測定されることにより、金属膜の表面近傍に形成される電場（増強電場）の強度が最大となる金属膜への励起光の入射角が精度よく得られる。このとき、金属膜の表面側で生じる光は、プラズモン散乱光や表面拡散光等の励起波長の光であるため、この波長成分を遮る第１の光フィルタが退避位置に切り換えられることにより、表面プラズモン共鳴に基づいて金属膜の表面側において生じる光の強度の増減が精度よく測定できる。
　しかも、検体の検出時においては、測定光学系の光路上に第１の光フィルタが入れられることにより、光測定部において測定される光から励起波長であるプラズモン散乱光や表面拡散光の成分が除かれ、これにより、検体に付された蛍起物質が増強電場により励起されて発した蛍光が精度よく測定できる。
　従って、測定により得られる信号のＳＮ比が高く、検体の高精度且つ高感度な検出が可能となる。
　上記の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置では、前記光測定部は、入射した光を減衰させて出射する第２の光フィルタを有し、前記位置切換部は、前記第１の光フィルタがフィルタリング位置のときに前記第２の光フィルタが退避位置となり、前記第１の光フィルタが退避位置のときに前記第２の光フィルタがフィルタリング位置となるように、各光フィルタの位置をそれぞれ切り換え可能であることが好ましい。
　かかる構成によれば、増強電場が最大になる励起光の入射角を求めるために測定される金属膜の表面側に生じる光によって光測定部の受光部が損傷することを防ぐことができる。具体的には、検体の検出のときに測定される蛍光の光量に比べて、増強電場が最大になる励起光の入射角を求めるために測定される光の光量が非常に大きい。このため、共通の受光部が用いられる場合に、増強電場が最大になる励起光の入射角を求めるために測定される光が第２の光フィルタによって減光されることにより、受光部の損傷が防がれる。
　前記測定光学系は、群間を進行する光が平行光若しくは略平行光となる２群共役光学系であり、前記フィルタリング位置は、前記第１の光フィルタ及び前記第２の光フィルタが前記群間における平行光若しくは略平行光の光軸と直交し且つ当該平行光若しくは略平行光を横断する位置であることが好ましい。
　かかる構成によれば、検体が精度よく検出される。即ち、第１の光フィルタ又第２の光フィルタが群間を進行する平行光等の光軸に対して傾斜していると、第１の光フィルタ又は第２の光フィルタを通過した光の光軸がシフトするため、光測定部における測定精度が低下する。
　また、本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、所定の面上に金属膜が形成されたプリズムを用意し、前記金属膜上に前記検体を含む試料液を流す準備工程と、前記金属膜に表面プラズモン共鳴を生じさせるための励起光を前記プリズム内に入射させて当該励起光が前記金属膜の特定の位置において反射した状態を保ちながら当該励起光の金属膜への入射角を変更すると共に、前記励起光が前記金属膜によって反射されることにより当該金属膜における前記プリズムと反対の面側において生じる光の強度を測定する共鳴角走査工程と、前記共鳴角走査工程における光の測定結果に基づく入射角となるように前記励起光を前記金属膜の特定の位置に照射しつつ、前記励起光が金属膜で反射することにより当該金属膜のプリズムと反対の面側において生じた光を当該光の強度を測定する受光部によって受光してその強度を測定する測定工程と、前記共鳴角走査工程では前記励起光の波長の光を遮る第１の光フィルタを前記受光部と前記金属膜との間から退避させると共に、前記測定工程では前記第１の光フィルタを前記受光部と前記金属膜との間に入れる位置切換工程と、を備える。
　かかる構成によれば、表面プラズモン共鳴によって金属膜の表面側に生じる光の強度が測定されることにより、金属膜の表面近傍に形成される電場（増強電場）の強度が最大となる金属膜への励起光の入射角が精度よく得られる。このとき、金属膜の表面側において生じる光は、プラズモン散乱光や表面拡散光等の励起波長の光である。このため、この波長成分を遮る第１の光フィルタが受光部と金属膜との間から退避させられることにより、表面プラズモン共鳴に基づいて金属薄膜の表面側において生じる光の強度の増減が精度よく測定される。しかも、検体の検出時において、受光部と金属膜との間に第１の光フィルタが入れられることにより、受光部において受光される光から励起波長であるプラズモン散乱光や表面拡散光の成分が除かれる。これにより、検体に付された蛍起物質が増強電場により励起されて発した蛍光が精度よく測定される。その結果、測定により得られる信号のＳＮ比が高く、検体の高精度且つ高感度な検出が可能となる。
　以上のように、本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、表面プラズモン共鳴によって生じたエバネッセント波の電場を利用して検体に含まれる蛍光物質を発光させ、この蛍光を検出することにより検体を測定するのに有用であり、検体の検出をより精度よく行うことに適している。

Claims (5)

  1. 　検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    　所定の面上に金属膜が形成されたプリズムを含む分析チップを、着脱できるように保持可能なチップ保持部と、
    　前記チップ保持部に保持された状態の前記分析チップに含まれるプリズムの金属膜によって反射されるように当該プリズム内に励起光を入射させる励起光射出部と、
    　前記励起光が前記金属膜によって反射されることにより、当該金属膜の前記プリズムと反対の面側において生じる光の強度を測定可能な光測定部と、
    　前記励起光射出部と前記光測定部とを制御する制御部と、を備え、
    　前記励起光射出部は、前記プリズム内に入射した励起光が前記金属膜の特定の位置において反射された状態を保ちつつ当該励起光の前記金属膜に対する入射角を変更可能であり、
    　前記光測定部は、前記金属膜において生じた光を受光する受光部と、前記金属膜において生じた光を前記受光部まで案内する測定光学系と、前記励起光の波長の光を遮る第１の光フィルタと、前記測定光学系における光路上のフィルタリング位置と前記光路から外れた退避位置との間において前記第１の光フィルタの位置を切り換える位置切換部と、を有し、
    　前記制御部は、前記励起光の金属膜に対する入射角を前記励起光射出部によって変更しつつ前記金属膜において生じた光の強度を前記光測定部によって測定するときに、前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によって退避位置とし、前記金属膜において生じた光の強度を測定した後に前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によってフィルタリング位置とすることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  2. 　検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    　所定の面上に金属膜が形成されたプリズムと、
    　前記プリズムの金属膜によって反射されるように当該プリズム内に励起光を入射させる励起光射出部と、
    　前記励起光が前記金属膜によって反射されることにより、当該金属膜における前記プリズムと反対の面側において生じる光の強度を測定可能な光測定部と、
    　前記励起光射出部と前記光測定部とを制御する制御部と、を備え、
    　前記励起光射出部は、前記プリズム内に入射した励起光が前記金属膜の特定の位置において反射された状態を保ちつつ当該励起光の前記金属膜に対する入射角を変更可能であり、
    　前記光測定部は、前記金属膜において生じた光を受光する受光部と、前記金属膜において生じた光を前記受光部まで案内する測定光学系と、前記励起光の波長の光を遮る第１の光フィルタと、前記測定光学系における光路上のフィルタリング位置と前記光路から外れた退避位置との間において前記第１の光フィルターの位置を切り換える位置切換部と、を有し、
    　前記制御部は、前記励起光の金属膜に対する入射角を前記励起光射出部によって変更しつつ前記金属膜において生じた光の強度を前記光測定部によって測定するときに、前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によって退避位置とし、前記金属膜において生じた光の強度を測定した後に前記第１の光フィルタの位置を前記位置切換部によってフィルタリング位置とすることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  3. 　前記光測定部は、入射した光を減衰させて出射する第２の光フィルタを有し、
    　前記位置切換部は、前記第１の光フィルタがフィルタリング位置のときに前記第２の光フィルタが退避位置となり、前記第１の光フィルタが退避位置のときに前記第２の光フィルタがフィルタリング位置となるように、各光フィルタの位置をそれぞれ切り換え可能であることを特徴とする請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  4. 　前記測定光学系は、群間を進行する光が平行光若しくは略平行光となる２群共役光学系であり、
    　前記フィルタリング位置は、前記第１の光フィルタ及び前記第２の光フィルタが前記群間における平行光若しくは略平行光の光軸と直交し且つ当該平行光若しくは略平行光を横断する位置であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  5. 　検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
    　所定の面上に金属膜が形成されたプリズムを用意し、前記金属膜上に前記検体を含む試料液を流す準備工程と、
    　前記金属膜に表面プラズモン共鳴を生じさせるための励起光を前記プリズム内に入射させて当該励起光が前記金属膜の特定の位置において反射した状態を保ちながら当該励起光の金属膜への入射角を変更すると共に、前記励起光が前記金属膜によって反射されることにより当該金属膜における前記プリズムと反対の面側において生じる光の強度を測定する共鳴角走査工程と、
    　前記共鳴角走査工程における光の測定結果に基づく入射角となるように前記励起光を前記金属膜の特定の位置に照射しつつ、前記励起光が金属膜で反射することにより当該金属膜のプリズムと反対の面側において生じた光を当該光の強度を測定する受光部によって受光してその強度を測定する測定工程と、
    　前記共鳴角走査工程では前記励起光の波長の光を遮る第１の光フィルタを前記受光部と前記金属膜との間から退避させると共に、前記測定工程では前記第１の光フィルタを前記受光部と前記金属膜との間に入れる位置切換工程と、を備えることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015059803A (ja) * 2013-09-18 2015-03-30 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法
WO2016147937A1 (ja) * 2015-03-17 2016-09-22 コニカミノルタ株式会社 検出装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004527741A (ja) * 2001-03-14 2004-09-09 バイアコア アーベー 全反射分光法のための装置および方法
JP2008268063A (ja) * 2007-04-23 2008-11-06 Sanyo Electric Co Ltd エバネッセント波発生装置及びそれを用いた観察装置
JP2009204476A (ja) * 2008-02-28 2009-09-10 Fujifilm Corp センシング装置
JP2010091553A (ja) * 2008-09-09 2010-04-22 Konica Minolta Holdings Inc 生体分子の検出方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004527741A (ja) * 2001-03-14 2004-09-09 バイアコア アーベー 全反射分光法のための装置および方法
JP2008268063A (ja) * 2007-04-23 2008-11-06 Sanyo Electric Co Ltd エバネッセント波発生装置及びそれを用いた観察装置
JP2009204476A (ja) * 2008-02-28 2009-09-10 Fujifilm Corp センシング装置
JP2010091553A (ja) * 2008-09-09 2010-04-22 Konica Minolta Holdings Inc 生体分子の検出方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015059803A (ja) * 2013-09-18 2015-03-30 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法
WO2016147937A1 (ja) * 2015-03-17 2016-09-22 コニカミノルタ株式会社 検出装置
JPWO2016147937A1 (ja) * 2015-03-17 2017-12-28 コニカミノルタ株式会社 検出装置
US10267735B2 (en) 2015-03-17 2019-04-23 Konica Minolta, Inc. Surface plasmon-field enhanced fluorescence detection device

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