WO2012039499A1 - グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用 - Google Patents

グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2012039499A1
WO2012039499A1 PCT/JP2011/071926 JP2011071926W WO2012039499A1 WO 2012039499 A1 WO2012039499 A1 WO 2012039499A1 JP 2011071926 W JP2011071926 W JP 2011071926W WO 2012039499 A1 WO2012039499 A1 WO 2012039499A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
probe
general formulas
deprotection
gst
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/071926
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
阿部　洋
綾 柴田
伊藤　嘉浩
美香 伊藤
Original Assignee
独立行政法人理化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人理化学研究所 filed Critical 独立行政法人理化学研究所
Publication of WO2012039499A1 publication Critical patent/WO2012039499A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/16—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B51/00—Introduction of protecting groups or activating groups, not provided for in the preceding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D321/00—Heterocyclic compounds containing rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D317/00 - C07D319/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/9116—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • G01N2333/91165—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5) general (2.5.1)
    • G01N2333/91171—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5) general (2.5.1) with definite EC number (2.5.1.-)
    • G01N2333/91177—Glutathione transferases (2.5.1.18)

Definitions

  • the present invention relates to a deprotection method using glutathione-S-transferase, a method for measuring glutathione-S-transferase activity, a novel compound used in the method, and the like.
  • Glutathione-S-transferase (referred to herein as “GST”) is an enzyme that catalyzes the formation of a conjugate between an electrophilic compound and reduced glutathione.
  • GST plays a role of detoxifying or excreating electrophilic compounds, for example, by producing these conjugates.
  • GST belonging to a specific subgroup is known to have an activity related to a specific disease, and there is a need to measure the activity of GST and to use it for diagnosis of a specific disease. Furthermore, in the biochemical research field, many kits using GST have been developed, and the demand for accurately measuring the activity of GST is very high.
  • Non-Patent Document 1 describes a detector for thiols using a specific benzenesulfonyl group as a protecting group.
  • Non-Patent Document 1 the protecting group possessed by the thiol detector described in Non-Patent Document 1 is a GST substrate (electrophilic compound), and as a result, It was found that a protective group similar to this could be used for various detections using GST.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and provides a deprotection method using GST, a method for monitoring GST and / or a thiol substance, a novel compound used in the method, and the like. It is aimed.
  • the inventors of the present application have conducted intensive studies. As a result, it was found that the degree of deprotection can be made different in the presence and absence of GST by using a protecting group having a specific structure, and the present invention has been conceived.
  • the probe according to the present invention is a probe for monitoring glutathione-S-transferase and / or a thiol substance, and comprises a compound bonded to any protecting group represented by the following general formulas (1) to (3). It is characterized by including.
  • “A and / or B” is understood to include both A and B, and A or B.
  • R11 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , or NO 2 .
  • R12 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , C 2 H 5 , or NO 2 .
  • R13 represents CN.
  • * represents a binding site to the compound.
  • the method for monitoring a thiol substance according to the present invention comprises the step of coexisting the probe and glutathione-S-transferase in a sample to be monitored, and then measuring the degree of deprotection of the probe It is characterized by including.
  • the method for monitoring glutathione-S-transferase comprises the steps of allowing the probe and a thiol substance to coexist in a sample to be monitored, and then measuring the degree of deprotection of the probe It is characterized by including.
  • the method for monitoring glutathione-S-transferase and / or thiol substance according to the present invention comprises the step of adding the probe to a sample derived from the organism to be monitored, and then measuring the degree of deprotection of the probe. And a step of performing.
  • novel compound according to the present invention is characterized by being a compound represented by any one of the following general formulas (4) to (8).
  • a protecting group represented by any of the following general formulas (1) to (3) is bonded to * in the general formulas (4) to (8).
  • R1 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a protecting group represented by any one of the following general formulas (1) to (3).
  • any hydrogen atom in the general formulas (4) to (8) (excluding the hydrogen atom on the nitrogen atom bonded to the protecting group in the general formulas (5), (6) and (8)) is May be substituted by a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms,
  • R11 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , or NO 2 .
  • R12 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , C 2 H 5 , or NO 2 .
  • R13 represents CN.
  • * represents a binding site to the compound.
  • a compound bonded to a protecting group represented by any one of the following general formulas (1) to (3) is reacted with a thiol substance in the presence of glutathione-S-transferase.
  • the above compound is deprotected.
  • R11 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , or NO 2 .
  • R12 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , C 2 H 5 , or NO 2 .
  • R13 represents CN.
  • * represents a binding site to the compound.
  • FIG. 1 is a diagram showing a chemical structure of a probe (fluorescent probe) of the present invention having a protecting group used in Examples and Reference Examples.
  • FIG. 2 is a diagram showing the chemical structure of the probe (chemiluminescence probe and NMR probe) of the present invention having a protecting group used in Examples and Reference Examples. It is a figure which shows the result of the activity measurement of GST using a fluorescence probe. It is a figure which shows the signal background ratio of the various fluorescent probes for every reaction time obtained from the data shown in FIG. It is a figure which shows the result of the activity measurement of GST using a chemiluminescent probe. It is a figure which shows the result of the activity measurement of GST using a magnetic probe (NMR probe).
  • NMR probe magnetic probe
  • the monitoring probe according to the present invention is a probe for monitoring GST and / or thiol substances. These probes have in common that they contain a compound bonded to any of the protecting groups represented by the general formulas (1) to (3). The vicinity of these protecting groups is a structure that is sensitive to nucleophilic reaction by a thiol substance, but the fact that the reactivity of the nucleophilic reaction is greatly different in the presence and absence of GST is used. This is one of the features of the present invention.
  • R11 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , or NO 2 .
  • R12 represents CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , C 2 H 5 , or NO 2 .
  • R13 represents CN.
  • * represents a binding site to the compound.
  • the monitoring probe according to the present invention is a compound bonded to the protecting group represented by the general formula (2), wherein R12 is CN, COOC 4 H 9 , CF 3 , or C in the general formula (2). may preferably represent a 2 H 5, in the viewpoint of reactivity differs greater deprotection in the presence and absence of GST, R12 is represents CN, CF 3, or C 2 H 5 Some may be more preferred.
  • the above-mentioned compound contained in the monitoring probe according to the present invention has its amino group, ether group (—O— structure) or imino group (C ⁇ N—) from the viewpoint of deprotection reactivity in the presence of GST.
  • the compound is bonded to the protective group via the aromatic amino group, aromatic ether group or aromatic imino group.
  • the aromatic amino group refers to a group represented by Ar—NH— *
  • Ar represents an aromatic ring that may form a condensed ring
  • * represents a bonding site with a protecting group.
  • the aromatic ring is, for example, a furan ring, a thiophene ring, a pyrrole ring, an imidazole ring, a thiazole ring, an oxadiazole ring as a 5-membered monocyclic ring, a benzene ring, a pyridine ring, or a pyrazine ring as a 6-membered monocyclic ring.
  • Examples of the 5- or 6-membered condensed ring include a naphthalene ring, a phenanthrene ring, an azulene ring, a pyrene ring, a quinoline ring, an isoquinoline ring, a quinoxaline ring, a benzofuran ring, a carbazole ring, a dibenzothiophene ring, and an anthracene ring.
  • the aromatic ether group refers to a group represented by Ar—O— *, Ar represents an aromatic ring which may form a condensed ring, and * represents a bonding site with a protecting group. To express.
  • the aromatic ring is as exemplified for the aromatic amino group.
  • the above-mentioned compound constituting the monitoring probe according to the present invention only needs to contain at least one protecting group, and may contain two or more.
  • the degree of deprotection (for example, the difference in signal intensity caused by deprotection) can be further increased between the presence and absence of GST.
  • two or more protecting groups are contained, they may be different from each other, but are preferably the same protecting groups from the viewpoint that the same degree of deprotection occurs under the same conditions.
  • the number of protecting groups is preferably 2 or 3 or less, and more preferably 2 or less.
  • it is preferable that the said protective group is one.
  • An example of the compound bound to the protecting group and constituting the monitoring probe according to the present invention is represented by any one of the general formulas (4) to (8).
  • a protecting group represented by any one of the above general formulas (1) to (3) is bonded to *.
  • any hydrogen atom in the general formulas (4) to (8) (excluding the hydrogen atom on the nitrogen atom bonded to the protecting group in the general formulas (5), (6) and (8)) is And may be substituted with a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R1 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a protecting group represented by any one of the above general formulas (1) to (3).
  • R2 when R2 is a protecting group represented by any one of the above general formulas (1) to (3), the compound has a structure in which two of the protecting groups are contained.
  • examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear or branched, and examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, or a hexyl group. .
  • the method for monitoring a thiol substance according to the present invention comprises a step of allowing the monitoring probe according to the present invention and glutathione-S-transferase (GST) to coexist in a sample to be monitored, Measuring the degree of deprotection.
  • GST glutathione-S-transferase
  • monitoring of a thiol substance is a concept including determining the presence or absence of a thiol substance in a sample, or determining the absolute or relative amount of a thiol substance in a sample.
  • the “thiol substance” is not particularly limited as long as it is a compound having a thiol group (SH group).
  • Specific examples of the thiol substance include, but are not limited to, reduced glutathione, dithiothreitol, phosphorothioate, cysteine, and the like.
  • the origin of the thiol substance is not particularly limited, and may be a biological substance or a non-biological substance.
  • GST The type and origin of “GST” are not particularly limited, but those belonging to subtypes MGST1, ⁇ , ⁇ , ⁇ may be preferable.
  • the origin of the sample to be monitored in the present invention is not particularly limited, and it may be a biological sample or a non-biological sample.
  • the “biological sample” will be described later. If a thiol substance exists in the sample, the deprotection reaction of the compound in the monitoring probe proceeds by the catalytic action of GST. Then, the thiol substance can be monitored by measuring the degree of deprotection.
  • the step of measuring the degree of deprotection of the probe can be performed by various methods for measuring chemical, biological, or physical changes occurring during protection / deprotection, and the measurement method is particularly limited. Not. However, from the viewpoint of ease of measurement, the step of measuring the degree of deprotection is preferably performed by measuring a change in luminescence characteristics due to deprotection or a change in nuclear magnetic resonance signal due to deprotection. There is.
  • “Change in luminescence properties due to deprotection” means that light emission / non-light emission is switched, light emission intensity is changed, or light emission wavelength between a state in which a protective group is bonded and a state in which the protective group is not bonded (deprotected) From the viewpoint of ease of detection (measurement), it is preferable that light emission / non-light emission is switched.
  • “luminescence” is a concept including chemiluminescence, bioluminescence, emission under natural light (color development), and fluorescence emission generated by irradiation with predetermined excitation light. Note that the compound represented by the general formula (4) is a dioxetane-based compound that can perform chemiluminescence only when a protecting group is eliminated.
  • the dioxetane-based compound undergoes chemical decomposition accompanied by light emission only when the protective group is eliminated.
  • the compound represented by the general formula (6) is a rhodamine-based compound that can emit fluorescence by irradiation with a predetermined excitation light only when a protecting group is eliminated.
  • the compound represented by the general formula (7) is a cresyl violet compound that can emit fluorescence by irradiation with a predetermined excitation light only when a protecting group is eliminated.
  • the compound represented by the general formula (8) is a coumarin-based compound that can emit fluorescence by irradiation with a predetermined excitation light only when a protecting group is eliminated.
  • “Change in nuclear magnetic resonance signal due to deprotection” means a change that can be measured by the NMR method (nuclear magnetic resonance method) between a state in which a protecting group is bound and a state in which the protecting group is not bound (deprotected). It refers to what happens.
  • the compound represented by the general formula (5) is a coumarin compound that generates a chemical shift of a peak that can be measured by NMR (nuclear magnetic resonance) only when a protecting group is eliminated.
  • the step of allowing the monitoring probe and glutathione-S-transferase (GST) to coexist in the sample to be monitored may be performed under conditions that do not deactivate GST. It can be set as appropriate based on the above conditions. Further, the order in which the probe and GST coexist (add) in the sample is not particularly limited.
  • the step of measuring the degree of deprotection of the probe can be appropriately set by those skilled in the art according to each measurement method.
  • the GST monitoring method according to the present invention includes a step of allowing the monitoring probe according to the present invention and a thiol substance to coexist in a sample to be monitored, and then measuring the degree of deprotection of the probe. And a process.
  • GST monitoring refers to determining the presence or absence of GST in a sample, determining the absolute or relative amount of GST in a sample, and determining the absolute or relative activity of GST in a sample. It is a concept that includes.
  • the origin of the sample to be monitored in the present invention is not particularly limited, and it may be a biological sample or a non-biological sample.
  • the “biological sample” will be described later. If GST is present in the sample, the catalytic action causes the transfer of the thiol group derived from the thiol substance, and the deprotection reaction of the compound in the monitoring probe proceeds. Then, GST can be monitored by measuring the degree of deprotection.
  • the monitoring method is performed on a biological sample. That is, the method includes a step of adding the monitoring probe according to the present invention to a sample derived from an organism to be monitored, and a step of measuring the degree of deprotection of the probe.
  • biological samples The type of biological sample is not particularly limited, and specific examples include blood, lymph, spinal fluid, and various other body fluids; cells; tissues; organs; individuals; cell extracts (homogenates); .
  • the said probe for monitoring when using the thing more than a cell level as a biological sample, the said probe for monitoring must be what can be taken in in a cell. Any of the compounds represented by the above general formulas (4) to (8) can be taken up into cells.
  • GST and a thiol substance may be inherent, and in such a case, the deprotection of the compound proceeds only by adding the monitoring probe to the sample. If necessary, a predetermined amount of GST or thiol substance may be added to the sample to monitor the thiol substance or GST. In this case, the description in the above [Method for monitoring thiol substance] column and the description in the above [Method for monitoring GST] column are also considered.
  • the monitoring method using a biological sample can be a data acquisition method that can be used for diagnosis of a disease associated with GST.
  • the present invention also provides a novel compound represented by any one of the above general formulas (4) to (8).
  • One of the uses of these novel compounds is a probe for monitoring GST and / or thiol substances utilizing a catalytic reaction by GST as described above.
  • the structures of these new compounds are described in more detail in the column of (Examples of specific compounds (for new compounds)) in the column of [Monitoring probes] above.
  • the production method of these new compounds is not particularly limited, but a halogenated sulfonyl form of a protecting group (XO 2 S—: X is a halogen atom, preferably a chlorine atom) and a compound before the addition of the protecting group are produced.
  • XO 2 S— a halogenated sulfonyl form of a protecting group
  • X is a halogen atom, preferably a chlorine atom
  • the present invention also provides a kit comprising the above-described monitoring probe.
  • the kit is a kit for carrying out various monitoring methods as described above.
  • the kit is particularly suitable as a kit for GST detection as shown in the examples described later.
  • additional components are provided according to the environment in which the sample is monitored or the type of sample.
  • the above-described kit for detecting GST in a test tube includes an appropriate amount of a monitoring probe, 1 to 5 mM glutathione, and a buffer solution (for example, PBS or the like) showing a pH near neutrality.
  • a buffer solution for example, PBS or the like
  • the kit for detecting GST in living cells is provided with an appropriate amount of a monitoring probe and PBS or serum-free medium.
  • the kit for detecting GST in E. coli comprises an appropriate amount of a monitoring probe, 1 mM glutathione and PBS.
  • the appropriate concentration of the monitoring probe in the kit can vary according to the signal to be detected (characteristics of the deprotected compound).
  • the monitoring probe is used at a concentration in the range of 50-250 ⁇ M.
  • the monitoring probe is used at a concentration in the range of 1-25 ⁇ M.
  • the signal is a change in nuclear magnetic resonance signal caused by deprotection of a compound of the invention, the monitoring probe is used at a concentration in the range of 50-300 ⁇ M.
  • the monitoring probe is preferably contained in the concentration range as a final condition for detection. Therefore, the monitoring probe may be provided in the kit as a concentration exceeding the concentration range in a state before use. In such a case, for example, the kit further includes an instruction manual showing the ratio of the additional components provided in the kit and the components including the monitoring probe. . This allows the user to easily adjust the concentration of the monitoring probe during the use.
  • the “compound bonded to any protecting group represented by the above general formulas (1) to (3)” is an example of the “monitoring probe” described above, but the above general formula (1)
  • the structure is not particularly limited as long as it is a compound to which any of the protecting groups shown in (3) is bonded.
  • the definitions of “thiol substance” and “GST” are also as described above.
  • the compound emits light by elimination of any of the protecting groups represented by the general formulas (1) to (3), or exhibits physiological activity by deprotection.
  • Specific examples of the compound that emits light when the protecting group is eliminated include those represented by the general formula (4), (6), (7), or (8).
  • the application of the deprotection method using GST according to the present invention is not particularly limited, but 1) for controlling the removal of protecting groups in various synthesis reactions, 2) for monitoring thiols and / or GST as described above, and 3) physiology. It can be used for specific release of an active substance (for example, a drug delivery system in which a protective group is deprotected and a physiologically active substance is released only in the presence of GST).
  • the present invention preferably has the following aspects in accordance with the above description.
  • the compound is preferably bonded to the protective group via an amino group, an ether group or an imino group, and the compound is an aromatic amino group, an aromatic ether group or an aromatic group. More preferably, it is bonded to the protecting group via an imino group.
  • a more specific example of the probe according to the present invention is one in which the compound bonded to the protecting group is represented by any one of the following general formulas (4) to (8).
  • a protecting group represented by any one of the above general formulas (1) to (3) is bonded to * in the general formulas (4) to (8).
  • R1 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a protecting group represented by any one of the above general formulas (1) to (3).
  • any hydrogen atom in the general formulas (4) to (6) (excluding the hydrogen atom on the nitrogen atom bonded to the protective group in the general formulas (5), (6) and (8)) is And may be substituted with a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the step of measuring the degree of deprotection of the probe is preferably performed by measuring a change in luminescence characteristics due to deprotection or a change in nuclear magnetic resonance signal due to deprotection.
  • the change in the emission characteristic may be a change in the fluorescence emission characteristic under irradiation of predetermined excitation light.
  • the compound preferably emits light by deprotection or exhibits physiological activity by deprotection.
  • N which is bonded to the sulfonyl moiety in the protecting group, is bonded to the aromatic moiety via a double bond, unlike the other compounds, due to the structure of the condensed ring containing a heterocyclic ring. is doing.
  • the fluorescent probes shown in Examples 1 to 8, 12 to 14, and Reference Examples 1 to 5 do not emit fluorescence when a protective group is attached as shown in the following reaction formulas. It is deprotected in the presence of GST and GSH (reduced glutathione, which is a kind of thiol substance), and can emit fluorescence.
  • the chemiluminescent probes shown in Example 9 and Reference Examples 6 to 7, as shown in the following reaction formula do not exhibit chemical properties and do not exhibit luminescent properties in the state where a protective group is attached.
  • a light emission off / on type sensor that is deprotected in the presence of GSH to enable chemical decomposition with light emission.
  • the outline of the synthesis method is a compound in which a protecting group is attached by reacting a compound before provision of a protecting group with RSO 2 Cl in a predetermined solvent such as pyridine (NMR probe). Get.
  • NMR probes shown in Examples 10 to 11 and Reference Examples 8 to 9 are deprotected in the presence of, for example, GST and GSH to generate a signal detectable by NMR (peak chemical shift).
  • Example 1 Production Example of Monoacethyl_ (2-cyano-4-nitrobenzenesulfonamido) _rhodamine]
  • the compound shown in (b) of FIG. 1 was produced as shown below.
  • N-acethyl rhodamine (1.0 mg, 0.11 mmol) was dissolved in Pyridin / CH 2 Cl 2 (1 ml, 1: 1) and dissolved in CH 2 Cl 2 (0.5 ml) under ice cooling.
  • 4-nitrobenzenesulfonyl chloride (42.2 mg, 0.17 mmol, 1.6 eq: Reference Document 1) was added and stirred. The next day, after confirming the disappearance of the raw material by TLC, the reaction solution was diluted with EtOAc and separated with sat NaHCO 3 aq and H 2 O. After washing with saturated brine, the organic layer was dried over Na 2 SO 4 .
  • Example 2 Production example of Monoacethyl_ (2-buthoxy-4-nitrobenzenesulfonamido) _rhodamine
  • the compound shown in (c) in FIG. 1 was produced as shown below.
  • -4-nitrobenzenesulfonyl chloride (34.2 mg, 0.12 mmol, 2.0 eq: Reference Document 2) was added and stirred. The next day, after confirming the disappearance of the raw material by TLC, the reaction solution was diluted with EtOAc and separated with sat NaHCO 3 aq and H 2 O. After washing with saturated brine, the organic layer was dried over Na 2 SO 4 .
  • Example 4 Production Example of Monoacethyl_ (4-cyano-2-nitrobenzenesulfonamido) _rhodamine]
  • the compound shown in (e) of FIG. 1 was produced as shown below.
  • Example 5 Production example of Monoacethyl_ (4-buthoxy-2-nitrobenzenesulfonamido) _rhodamine]
  • the compound shown in (f) in FIG. 1 was produced as shown below.
  • N-acethyl rhodamine (16.0 mg, 0.04 mmol) was dissolved in pyridine / CH 2 Cl 2 (0.6 ml, 1: 1), and dissolved in CH 2 Cl 2 (0.5 ml) under ice cooling.
  • chlorosulfonyl) -3-nitrobenzoate (33.6 mg, 0.10 mmol, 2.7 eq: see also Reference Example 1) was added and stirred. The next day, after confirming the disappearance of the raw material by TLC, the reaction solution was diluted with EtOAc and separated with sat NaHCO 3 aq and H 2 O. After washing with saturated brine, the organic layer was dried over Na 2 SO 4 .
  • Example 6 Production example of Monoacethyl_ (4-trifluoromethyl-2-nitrobenzenesulfonamido) _rhodamine
  • the compound shown in (g) in FIG. 1 was produced as shown below.
  • Example 7 Production example of Monoacethyl_ (4-acethyl-2-nitrobenzenesulfonamido) _rhodamine]
  • the compound shown in (h) in FIG. 1 was produced as shown below.
  • N-acethyl rhodamine (80.2 mg, 0.16 mmol) was dissolved in pyridine / CH 2 Cl 2 (1.6 ml, 1: 1) and dissolved in CH 2 Cl 2 (0.5 ml) under ice cooling.
  • 2-pyridinesulfonyl chloride (56.1 mg, 0.25 mmol, 1.5 eq: Reference Document 4) was added and stirred. The next day, after confirming the disappearance of the raw material by TLC, the reaction solution was diluted with EtOAc and separated with sat NaHCO 3 aq and H 2 O. After washing with saturated brine, the organic layer was dried over Na 2 SO 4 .
  • Example 8 Production example of Monoacethyl_ (5-cyano-2-pyidinesulfonamido) _rhodamine]
  • the compound shown in (j) in FIG. 1 was produced as shown below.
  • N-acyl rhodamine (17.2 mg, 0.04 mmol) was dissolved in pyridine / CH 2 Cl 2 (0.6 ml, 1: 1) and dissolved in CH 2 Cl 2 (0.5 ml) under ice cooling. Add 2-pyridinesulfonyl chloride (2.1 eq) and stir. The next day, after confirming the disappearance of the raw materials by TLC, the reaction solution is diluted with EtOAc and separated with sat NaHCO 3 aq and H 2 O. After washing with saturated brine, the organic layer is dried over Na 2 SO 4 . The solvent was distilled off, and the residue was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (15.3 mg, 0.03 mmol, yield 68%).
  • the measurement results are summarized in FIG.
  • the structure of the protecting group excluding the sulfonyl group part of the probes numbered 1 to 11 in circles in FIG. 3 is also shown in the upper right in the figure.
  • the solid line indicates data in the presence of GST (GST +), and the broken line indicates data in the absence of GST (GST-).
  • the X axis of the graph in the figure shows the reaction time, and the Y axis shows the ratio (yield) at which fluorescence was generated.
  • FIG. 4 shows signal background ratios of various fluorescent probes for each reaction time obtained from the data shown in FIG. 3, that is, “yield shown by solid line / yield shown by broken line in FIG. .
  • the signal background ratio of the fluorescent probe (corresponding to (e), (g), (h) shown in FIG. 1) introduced with CN, Ac, or CF 3 group at the 4-position is extremely high. showed that.
  • the chemical structural formula shown in the lower part of FIG. 4 corresponds to the structure of the protecting group excluding the sulfonyl group part of each probe used for the measurement.
  • Example 9 Production Example of 1- (3- (4-acetyl-2-nitrobenzenesulfonate) -phenyl) -4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3,2′-adamantane)
  • the compound shown in (b) of the luminescent probe in FIG. 2 was produced as shown below.
  • the reaction conditions were such that the concentration of the luminescent probe was dissolved in 10 mM PBS (pH 7.4) so that the concentration was 50 ⁇ M, and the GSH concentration was further adjusted to 1 mM and the GST concentration to 10 ⁇ g / ml. Each was added and the luminescence was measured for 15 minutes (counting time 1s).
  • the numbers 1 to 3 in circles are the ones to which only the probe is added (probe only), the one to which the probe and GSH are added (probe + GSH), and the one to which the probe, GST and GSH are added.
  • the X axis indicates the reaction time
  • the Y axis indicates the amount of luminescence observed.
  • the luminescent probe introduced with an Ac group at the 4-position (corresponding to the luminescent probe shown in FIG. 2 (b)) showed a particularly high signal background ratio.
  • Example 10 4-cyano-2-nitro-N- (2-oxo-4- (trifluoromethyl) -2H-chromen-7-yl) benzenesulfonamide]
  • the compound shown in (b) of the NMR probe in FIG. 2 was produced as shown below.
  • Example 11 4-acetyl-2-nitro-N- (2-oxo-4- (trifluoromethyl) -2H-chromen-7-yl) benzenesulfonamide]
  • the compound shown in (c) of the NMR probe in FIG. 2 was produced as shown below.
  • Example 11 [Measurement of GST activity using the probe shown in Example 11]
  • the GST activity measurement using the magnetic probe (NMR probe) shown in Example 11 was performed using JEOL 500 MHz of JEOL Ltd. as an NMR apparatus.
  • the reaction conditions were dissolved in buffer (50 mM PBS (pH7.4), TFA 100 ⁇ M, D 2 O 20%) so that the concentration of the magnetic probe was 50 ⁇ M, GSH 4 mM and GST 10 ⁇ g / ml To react. After the reaction, the measurement was performed at 37 ° C. under the conditions of 470 MHz and 200 scan.
  • the measurement results are summarized in FIG.
  • the left side in FIG. 6 shows the NMR spectrum in the system to which the magnetic probe, GSH and GST are added
  • the right side in FIG. 6 shows the NMR spectrum in the system to which GST is not added (control).
  • the upper, middle, and lower stages in the figure indicate the NMR spectra after 0 minutes, 15 minutes, and 60 minutes from the start of the reaction in this order.
  • a peak chemical shift was observed as time passed.
  • no peak chemical shift was observed in the system without GST.
  • DNs-rhodamine having the chemical formula shown in (a) of FIG. 7 was synthesized as follows.
  • Rhodamine110 (100.9 mg, 0.28 mmol) in DMF (2 ml) and potassium t-butoxide (KOt-Bu) (92.2 mg, 0.82 mmol, 3 equivalents) in THF (2 ml) at 0 ° C It was dripped under. After 30 minutes, 2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride (220.2 mg, 0.83 mmol, 3 eq) was added to the resulting reaction mixture. After 2 hours at room temperature, 2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride (223 mg, 0.84 mmol, 3 eq) was added to the resulting reaction mixture.
  • Kt-Bu potassium t-butoxide
  • DNs-Coum Production example of 7- (2,4-dinitrophenylsulfonamido) -4-methyl-3-coumarinylacetic acid (DNs-Coum)]
  • DNs-Coum having the following chemical formula was synthesized as follows.
  • Example 14 Production example of (2,4-dinitrobenzenesulfonamido) _cresyl violet (DNs-CV)]
  • DNs-CV having the following chemical formula was synthesized as follows.
  • reference literature Synthesis and Characterization of a Series of Highly Fluorogenic Substrates for Glutathione Transferases, a General Strategy, J. Am. Chem. Soc., 2011, 2011, Vol. 133 (35), pp14109-14119 ) was also referred to.
  • DNs-Cl (2,4-Dinitrophenylsulfonamido) chloride
  • DNs-Cl 15 mg, 0.055 mmol, 2.0 equivalents
  • cresyl violet 10 mg, 0.027 mmol
  • pyridine 0.5 ml
  • the reaction mixture was diluted with EtOAc and washed with saturated aqueous sodium bicarbonate.
  • the organic layer was dried over Na 2 SO 4 and further evaporated to dryness in vacuo.
  • the residue was purified using flash column chromatography to obtain DNs-CV (4 mg, 0.810 ⁇ mol, 30%). DNs-CV identification data is shown below.
  • Example 15 Measurement of GST activity in various environments using the probes shown in Examples 12 to 14]
  • (1) GST detection method in living cells using fluorescent probes (Reference: Anal Biochem., 390, 52, 2009) Cells were seeded at a concentration of 3 ⁇ 10 4 cells / well on 8-well champ slides (Lab-Tek) and cultured in serum-free medium for 24 hours.
  • DNs-Rh obtained in Example 12 was added to each well at a concentration of 25 ⁇ M, and the inverted Nikon ECLIPSE TE2000-S fluorescence microscope was used at 100 magnifications for 5 minutes, 15 minutes, and 35 minutes. Observations were made during the exposure time.
  • wild-type MCF7 cells were pretreated with 100 ⁇ M NEM (N-ethylmaleimide: thiol binding inhibitor) for 15 minutes and then added with DNS-Rh and observed. However, no fluorescent signal was detected (results not shown).
  • the cells include wild type MCF7 cells (MCF7 wt), MCF7 cells transfected with sense strand cDNA of MGST1 (MGST1 sense transfected MCF7), and MCF7 cells transfected with antisense strand cDNA of MGST1 ( MGST1 antisense transfected MCF7) was prepared. The reaction occurring in the cell when GST and MGST1 coexist in the cell is shown in (a) of FIG. 7, and the result of the experiment is shown in (b) of FIG.
  • the GST activity measurement using the fluorescent probe DNs-Coum shown in Example 13 was performed in PBS buffer (10 mM, pH 7.4) with a probe concentration of 1 ⁇ M and a GSH concentration of 1 mM.
  • the ⁇ , ⁇ -GST concentration was added to 0 or 2 ⁇ g / ml, and the reaction was carried out at 37 ° C.
  • the fluorescence signal was analyzed using a fluorescence spectrophotometer (FP-6500; JASCO).
  • the excitation wavelength is 345 nm, and the fluorescence measurement wavelength is 400-550 nm.
  • the solid line indicates data in the presence of GST (with GST), and the broken line indicates data in the absence of GST (without GST), or in the absence of GST and GST (without GSH, GST). It is data in.
  • the X axis of the graph in the figure shows the fluorescence measurement wavelength, and the Y axis shows the fluorescence intensity.
  • the GST activity measurement using the fluorescent probe DNs-CV shown in Example 14 was performed in PBS buffer (10 mM, pH 7.4), the probe concentration was 1 ⁇ M, and the GSH concentration was 1 mM.
  • the ⁇ , ⁇ -GST concentration was added to 0 or 2 ⁇ g / ml, and the reaction was performed at 37 ° C.
  • the fluorescence signal was analyzed using a fluorescence spectrophotometer (FP-6500; JASCO).
  • the excitation wavelength is 540 nm and the fluorescence measurement wavelength is 500-750 nm.
  • the solid line indicates data in the presence of GST (with GST), and the broken line indicates data in the absence of GST (without GST), or in the absence of GST and GST (without GSH, GST). It is data in.
  • the X axis of the graph in the figure shows the fluorescence measurement wavelength, and the Y axis shows the fluorescence intensity.
  • 6-well plate is seeded with cells transfected with MGST1 expression vector and MCF7 cells (control) transfected with vector not expressing MGST1 at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / wel, 80-90% confluent These cells were cultured until ⁇ 48 hours.
  • Example 15 Measurement of GST activity in Escherichia coli using the luminescent probe shown in Example 9
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed with pEGX vector or pUC19 vector, and precultured at 37 ° C. using LB medium. Subsequently, main culture was performed at 37 ° C. until the turbidity of Escherichia coli reached 0.5, 1 mM IPTG (isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) was added, and further cultured at 37 ° C. for 3 hours.
  • the pEGX vector is a general-purpose plasmid vector that encodes GST protein
  • the pUC19 vector is a general-purpose plasmid vector (control) that does not encode GST protein.
  • GST activity measurement was performed using SpectraMax® L from Molecular Devices Japan Co., Ltd. as a luminescence measuring device.
  • the reaction conditions were adjusted so that the turbidity of Escherichia coli was 1.4, and the concentration of the luminescent probe shown in Example 9 was 0 or 50 ⁇ M, and the concentration of GSH was 1 mM. .4) In addition to the reaction.
  • the results are shown in FIG.
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed with pEGX vector or pUC19 vector, and pre-cultured at 37 ° C. using LB medium. Subsequently, main culture was performed at 37 ° C. until the turbidity of Escherichia coli became 0.5.
  • Luminescence imaging images of E. coli were taken using a Nikon TE2000 microscope and a HAMAMATSU ImagEM C9100-13 digital camera (Hamamatsu Photonics). The reaction conditions were adjusted so that the turbidity of E. coli was 2.0, and the concentration of the luminescent probe shown in Example 9 was 250 ⁇ M, and the concentration of GSH was 3 ⁇ mM. It was made to react in addition to 4). The results are shown in FIG.
  • FIG. 12 show the imaging results of E. coli DH5 ⁇ transformed with the pEGX vector, and (c) and (d) show the imaging results of E. coli DH5 ⁇ transformed with the pUC19 vector. Further, (a) and (c) are clear vision images, and (b) and (d) are light emission images.
  • Example 16 Measurement of GST activity in Escherichia coli using the NMR probe shown in Example 11
  • the measurement of GST activity in E. coli using the NMR probe shown in Example 11 was performed using JEOL 500 MHz of JEOL Ltd. as an NMR apparatus. Further, E. coli DH5 ⁇ was transformed and cultured under the same conditions as in Example 16.
  • the reaction conditions for measuring the GST activity were adjusted so that the turbidity of E. coli was 68.0, and the concentration of the NMR probe shown in Example 11 was 300 ⁇ M, and the concentration of GSH was 1 Mm.
  • the reaction was performed by adding to PBS (pH7.4), trifluoroacetic acid (TFA) 150 ⁇ M, D 2 O 20%).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • D 2 O is added to lock the NMR. The results are shown in FIG.
  • the object of the present invention is to provide a deprotection method using GST, a method for monitoring GST and / or a thiol substance, a novel compound used in the method, and the like.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

　本発明のプローブは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ及び／又はチオール性物質のモニタリング用プローブであって、下記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基が結合している化合物を含む。（一般式（１）～（３）における官能基及び記号の定義は明細書に記載の定義と同じである。）

Description

グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用
　本発明は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼの活性測定方法、及び当該方法に用いる新規化合物等に関する。
　グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（本明細書で「ＧＳＴ」と称する）は、親電子性化合物と還元型グルタチオンとの抱合体の生成反応を触媒する酵素である。生体内において、ＧＳＴは、これら抱合体を生成することにより、例えば、親電子性化合物を無毒化する、又は排出する役割を担っている。
　また、特定のサブグループに属するＧＳＴは、その活性が特定疾患と関連性を有することが知られており、ＧＳＴの活性を測定して特定疾患の診断に役立てるニーズもある。さらに、生化学の研究分野では、ＧＳＴを利用したキットが多数開発されており、ＧＳＴの活性を正確に測定するという要求は非常に高い。
　また、非特許文献１には、特定のベンゼンスルフォニル基を保護基として用いたチオール類の検出剤が記載されている。
Ｊ. Am. Chem. Soc. 2008, Nov 5; 130(44):14533-43
　本願発明者らは、まず、上記非特許文献１に記載のチオール類の検出剤が有する保護基がＧＳＴの基質（親電子性化合物）になることを初めて確認し、その結果、当該保護基又はこれに類似する保護基を、ＧＳＴを用いた各種検出に利用できる可能性を見出した。
　本願発明者らはさらに検討を重ねた結果、ＧＳＴを用いた検出の測定精度を左右する要因は様々なものが考えられるが、中でも極めて重要なものは、ＧＳＴの非存在下におけるバックグラウンドシグナルの程度であると考え、本願発明に想到するに至った。
　本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、ＧＳＴを用いた脱保護法、ＧＳＴ及び／又はチオール性物質のモニタリング方法、及び当該方法に用いる新規化合物等を提供することを目的としている。
　上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行なった。その結果、特定構造の保護基を用いれば、ＧＳＴの存在下と非存在下とで脱保護の程度を異ならせることができる事を見出し、本願発明に想到するに至った。
　すなわち、本発明にかかるプローブは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ及び／又はチオール性物質のモニタリング用プローブであって、下記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基と結合した化合物を含むことを特徴としている。なお、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」とは、Ａ及びＢ、Ａ又はＢの双方を含む意味で解する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
一般式（１）中で、Ｒ１１は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＮＯ２を表わす。一般式（２）中で、Ｒ１２は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、Ｃ２Ｈ５、又はＮＯ２を表わす。一般式（３）中で、Ｒ１３は、ＣＮを表わす。また、一般式（１）～（３）における＊は、化合物への結合部位を表わす。
　本発明にかかるチオール性物質のモニタリング方法は、上記のプローブと、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼとを、モニタリング対象となる試料中に共存させる工程と、次いで、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含むことを特徴としている。
　本発明にかかるグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼのモニタリング方法は、上記のプローブと、チオール性物質とを、モニタリング対象となる試料中に共存させる工程と、次いで、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含むことを特徴としている。
　本発明にかかるグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ及び／又はチオール性物質のモニタリング方法は、上記のプローブを、モニタリング対象となる生物由来の試料中に加える工程と、次いで、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含むことを特徴としている。
　本発明にかかる新規化合物は、下記一般式（４）～（８）の何れかで示される化合物であることを特徴としている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
一般式（４）～（８）中の＊には下記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基が結合している。一般式（４）中で、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基を表わす。一般式（６）中で、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～６のアルキル基、又は下記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基を表わす。また、一般式（４）～（８）中の任意の水素原子（但し、一般式（５）、（６）及び（８）における上記保護基と結合した窒素原子上の水素原子は除く）は、ハロゲン原子又は炭素数１～６のアルキル基により置換されていてもよく、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
一般式（１）中で、Ｒ１１は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＮＯ２を表わす。一般式（２）中で、Ｒ１２は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、Ｃ２Ｈ５、又はＮＯ２を表わす。一般式（３）中で、Ｒ１３は、ＣＮを表わす。また、一般式（１）～（３）における＊は、化合物への結合部位を表わす。
　本発明にかかる脱保護方法は、下記一般式（１）～（３）の何れかで示す保護基と結合した化合物と、チオール性物質とを、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼの存在下で反応させて、上記化合物を脱保護することを特徴としている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
一般式（１）中で、Ｒ１１は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＮＯ２を表わす。一般式（２）中で、Ｒ１２は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、Ｃ２Ｈ５、又はＮＯ２を表わす。一般式（３）中で、Ｒ１３は、ＣＮを表わす。また、一般式（１）～（３）における＊は、化合物への結合部位を表わす。
　本発明によれば、ＧＳＴを用いた脱保護法、ＧＳＴの活性測定方法、及び当該方法に用いる新規化合物等を提供することが出来るという効果を奏する。
図１は、実施例及び参考例に用いた保護基を有する本発明のプローブ（蛍光プローブ）の化学構造を示す図である。 図２は、実施例及び参考例に用いた保護基を有する本発明のプローブ（化学発光プローブ及びＮＭＲ用プローブ）の化学構造を示す図である。 蛍光発光プローブを用いたGSTの活性測定の結果を示す図である。 図３に示すデータから得た、反応時間毎の各種蛍光プローブのシグナルバックグラウンド比を示す図である。 化学発光プローブを用いたGSTの活性測定の結果を示す図である。 磁気プローブ（ＮＭＲプローブ）を用いたGSTの活性測定の結果を示す図である。 蛍光プローブを用いた生細胞内のGSTの活性測定で生じる反応、及び測定の結果を示す図である。 蛍光プローブを用いたGSTの活性測定の他の結果を示す図である。 蛍光プローブを用いたGSTの活性測定のさらに他の結果を示す図である。 蛍光プローブを用いたGSTの活性測定のさらに他の結果を示す図である。 化学発光プローブを用いた大腸菌内のGSTの活性測定の結果を示す図である。 化学発光プローブを用いて大腸菌内のGSTをイメージングにより検出した結果を示す図である。 磁気プローブ（ＮＭＲプローブ）を用いた大腸菌内のGSTの活性測定の結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　〔モニタリング用プローブ〕
　（概要）
　本発明にかかるモニタリング用プローブは、ＧＳＴ及び／又はチオール性物質のモニタリング用のプローブである。これらプローブは、上記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基と結合した化合物を含むことを共通点とする。これらの保護基の近傍は、チオール性物質による求核反応を感受する構造であるが、ＧＳＴの存在下と非存在下とで、当該求核反応の反応性が大きく異なることを利用した点が、本発明の特徴点の一つである。
　上記求核反応の反応性が、ＧＳＴの存在下と非存在下とで大きく異なるメカニズムは必ずしも定かではないが、保護基が示す電子吸引性の程度が一つの理由であると推定される。
　（保護基の詳細構造）
　なお、上記一般式（１）中で、Ｒ１１は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＮＯ２を表わす。一般式（２）中で、Ｒ１２は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、Ｃ２Ｈ５、又はＮＯ２を表わす。一般式（３）中で、Ｒ１３は、ＣＮを表わす。また、一般式（１）～（３）における＊は、化合物への結合部位を表わす。
　本発明にかかるモニタリング用プローブは、上記一般式（２）で示す保護基と結合した化合物であって、一般式（２）中で、Ｒ１２が、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＣ２Ｈ５を表わすものが好ましい場合があり、ＧＳＴの存在下と非存在下とで脱保護の反応性がより大きく異なるという観点では、Ｒ１２が、ＣＮ、ＣＦ３、又はＣ２Ｈ５を表わすものがより好ましい場合がある。
　（保護基と結合する構造の好適例）
　また、本発明にかかるモニタリング用プローブに含まれる上記化合物は、ＧＳＴの存在下での脱保護反応性の観点では、そのアミノ基、エーテル基（－Ｏ－の構造）又はイミノ基（Ｃ＝Ｎ－の構造）を介して上記保護基と結合していることが好ましい場合がある。さらに、上記化合物がその芳香族アミノ基、芳香族エーテル基又は芳香族イミノ基を介して上記保護基と結合していることがより好ましい場合がある。
　なお、芳香族アミノ基とは、Ａｒ－ＮＨ－＊で示される基を指しており、Ａｒとは縮合環を構成していてもよい芳香族環を表し、＊は保護基との結合部位を表す。なお、芳香族環とは、例えば、５員環単環としてフラン環、チオフェン環、ピロール環、イミダゾール環、チアゾール環、オキサジアゾール環、６員環単環としてベンゼン環、ピリジン環、ピラジン環、５又は６員環の縮合環としてナフタレン環、フェナンスレン環、アズレン環、ピレン環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、ベンゾフラン環、カルバゾール環、ジベンゾチオフェン環、アントラセン環等が挙げられる。
　なお、芳香族エーテル基とは、Ａｒ－Ｏ－＊で示される基を指しており、Ａｒとは縮合環を構成していてもよい芳香族環を表し、＊は保護基との結合部位を表す。なお、芳香族環とは、上記芳香族アミノ基にて例示した通りである。芳香族イミノ基とは、Ａｒ＝Ｎ－＊で示される基を指している。記号の定義は芳香族エーテル基と同じである。
　（保護基の数）
　本発明にかかるモニタリング用プローブを構成する上記化合物は、上記保護基を少なくとも一つ含んでいればよく、二つ以上含んでいてもよい。保護基を二つ以上含む場合は、ＧＳＴの存在下と非存在下との間で、脱保護性の程度（例えば脱保護により生じるシグナル強度の差）をより一層大きくすることができる。保護基を二つ以上含む場合は、互いに異なる保護基であってもよいが、同一の条件で同程度の脱保護が生じるという観点からは、互いに同一の保護基であることが好ましい。また、脱保護の容易さの観点では、保護基の数は二つ又は三つ以下であることが好ましく、二つ以下がより好ましい。なお、定量用途の場合は、上記保護基は１つであることが好ましい。
　（具体的な化合物の例（新規化合物について））
　本発明にかかるモニタリング用プローブを構成する、上記保護基と結合した上記化合物の一例は、上記一般式（４）～（８）の何れかに示すものである。なお、一般式（４）～（８）中の＊には上記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基が結合している。また、一般式（４）～（８）中の任意の水素原子（但し、一般式（５）、（６）及び（８）における上記保護基と結合した窒素原子上の水素原子は除く）は、ハロゲン原子又は炭素数１～６のアルキル基により置換されていてもよい。
　また、一般式（４）中で、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基を表し、より好ましくは炭素数１～３のアルキル基である。一般式（６）中で、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～６のアルキル基、又は上記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基を表わす。なお、一般式（６）中で、Ｒ２が上記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基である場合は、化合物中に上記保護基が二つ含まれた構造となる。
　なお、本発明において上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子が挙げられる。また、本発明において、炭素数１～６の上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状の何れでもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基が挙げられる。
　〔チオール性物質のモニタリング方法〕
　（概要）
　本発明にかかるチオール性物質のモニタリング方法は、本発明にかかる上記モニタリング用プローブと、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とを、モニタリング対象となる試料中に共存させる工程と、次いで、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含む。
　なお、「チオール性物質のモニタリング」とは、試料中のチオール性物質の有無を判定すること、或いは、試料中のチオール性物質の絶対量又は相対量を判定することを含む概念である。
　（チオール性物質）
　本発明において、「チオール性物質」とは、チオール基（ＳＨ基）を有する化合物であれば特に限定されない。チオール性物質として具体的には、例えば、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、ホスホロチオエート、システイン等が挙げられるが特にこれらに限定されない。チオール性物質の由来は、特に限定されず、生体由来の物質であってもよく、非生体由来の物質であってもよい。
　（ＧＳＴ）
　「ＧＳＴ」の種類及びその由来は特に限定されないが、サブタイプMGST1、μ、α、πに属するものが好ましい場合がある。
　（対象試料）
　本発明においてモニタリング対象となる試料の由来は特に限定されず、生体由来の試料であってもよく、非生体由来の試料であってもよい。「生体由来の試料」については後述する。当該試料中にチオール性物質が存在すれば、ＧＳＴの触媒作用により、モニタリング用プローブ中の上記化合物の脱保護反応が進行する。そして、当該脱保護の程度を測定することによりチオール性物質のモニタリングが可能となる。
　（脱保護の程度の測定法）
　上記プローブの脱保護の程度を測定する工程は、保護／脱保護の間で生じる化学的、生物的、又は物理的な変化を測定する様々な方法で行うことができ、その測定法は特に限定されない。但し、測定の簡便さの観点からは、当該脱保護の程度を測定する工程は、脱保護による発光特性の変化、又は脱保護による核磁気共鳴シグナルの変化を測定することにより行うことが好ましい場合がある。
　「脱保護による発光特性の変化」とは、保護基が結合した状態と、結合していない（脱保護された）状態とで、発光／非発光が切り替わる、発光強度が変化する、又は発光波長が変化する等の検出可能な発光特性の変化が生じることを指し、検出（測定）の容易さの観点では、発光／非発光が切り替わることが好ましい。ここで、「発光」とは、化学発光、生物発光、自然光下での発光（発色）の他、所定の励起光の照射により生じる蛍光発光を含む概念である。なお、上記一般式（４）に示す化合物は、保護基が脱離した場合にのみ化学発光が可能になるジオキセタン系の化合物である。当該ジオキセタン系の化合物は、保護基が脱離した場合にのみ発光を伴う化学分解が生じる。また、上記一般式（６）に示す化合物は、保護基が脱離した場合にのみ、所定の励起光の照射により蛍光発光が可能になるローダミン系の化合物である。また、上記一般式（７）に示す化合物は、保護基が脱離した場合にのみ、所定の励起光の照射により蛍光発光が可能になるクレシルバイオレット系の化合物である。また、上記一般式（８）に示す化合物は、保護基が脱離した場合にのみ、所定の励起光の照射により蛍光発光が可能になるクマリン系の化合物である。
　「脱保護による核磁気共鳴シグナルの変化」とは、保護基が結合した状態と、結合していない（脱保護された）状態とで、ＮＭＲ法（核磁気共鳴法）により測定可能な変化が生じることを指す。なお、上記一般式（５）に示す化合物は、保護基が脱離した場合にのみＮＭＲ法（核磁気共鳴法）により測定可能なピークのケミカルシフトを生じるクマリン系の化合物である。
　（各工程を行う条件等）
　上記モニタリング用プローブと、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とを、モニタリング対象となる試料中に共存させる工程は、ＧＳＴが失活しない条件で行えばよく、当業者であれば、ＧＳＴの活性試験等の条件を元に適宜設定可能である。また、試料中に、上記プローブとＧＳＴとを共存させる（加える）順番等も特に限定されるものではない。
　また、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程も、それぞれの測定方法に応じて、当業者であればその条件を適宜設定できるものである。
　〔ＧＳＴのモニタリング方法〕
　（概要）
　本発明に係るＧＳＴのモニタリング方法は、本発明にかかる上記モニタリング用プローブと、チオール性物質とを、モニタリング対象となる試料中に共存させる工程と、次いで、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含む。
　なお、「ＧＳＴのモニタリング」とは、試料中のＧＳＴの有無を判定すること、試料中のＧＳＴの絶対量又は相対量を判定すること、試料中のＧＳＴの絶対的又は相対的な活性を判定すること、を含む概念である。
　（対象試料）
　本発明においてモニタリング対象となる試料の由来は特に限定されず、生体由来の試料であってもよく、非生体由来の試料であってもよい。「生体由来の試料」については後述する。当該試料中にＧＳＴが存在すれば、その触媒作用により、チオール性物質由来のチオール基の転移が生じて、モニタリング用プローブ中の上記化合物の脱保護反応が進行する。そして、当該脱保護の程度を測定することによりＧＳＴのモニタリングが可能となる。
　（その他）
　「モニタリング用プローブ」、「チオール性物質」、「ＧＳＴ」、「プローブの脱保護の程度を測定する工程」、及び「各工程を行う条件等」は、上記〔チオール性物質のモニタリング方法〕欄の記載の説明と同じであり、詳細な記載は省略する。
　〔生物由来の試料におけるＧＳＴ及び／又はチオール性物質のモニタリング〕
　（概要）
　本発明にかかるＧＳＴのモニタリング方法、及び／又は、チオール性物質のモニタリング方法の好適な一例では、当該モニタリング方法を生物由来の試料を対象に行う。すなわち、本発明にかかる上記モニタリング用プローブを、モニタリング対象となる生物由来の試料中に加える工程と、次いで、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含む。
　（生物由来の試料）
　生物由来の試料の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、血液、リンパ液、髄液、その他の様々な体液；細胞；組織；器官；個体；細胞抽出物（ホモジネート）；等が挙げられる。なお、生物由来の試料として細胞レベル以上のものを使用する場合は、上記モニタリング用プローブが細胞内に取り込み可能なものでなければならない。上記一般式（４）～（８）で示される化合物は何れも細胞内に取り込み可能なものである。
　生物由来の試料中には、ＧＳＴ及びチオール性物質が内在している場合があり、その場合は当該試料中に上記モニタリング用プローブを加えるだけで、化合物の脱保護が進行する。また、必要に応じて、所定量のＧＳＴ又はチオール性物質を上記試料に加えて、チオール性物質又はＧＳＴのモニタリングを行ってもよい。この場合は、上記〔チオール性物質のモニタリング方法〕欄の記載、及び、上記〔ＧＳＴのモニタリング方法〕欄の記載も参酌される。
　（その他）
　「モニタリング用プローブ」、「チオール性物質」、「プローブの脱保護の程度を測定する工程」、「チオール性物質のモニタリング」、「ＧＳＴのモニタリング」、及び「各工程を行う条件等」は、上記〔チオール性物質のモニタリング方法〕欄及び上記〔ＧＳＴのモニタリング方法〕の記載の説明と同じであり、詳細な記載は省略する。
　また、生物由来の試料を用いた上記モニタリング法は、ＧＳＴが関連する疾患の診断用に利用可能なデータの取得方法となりうる。
　〔新規化合物〕
　（化合物の構造、製法、及びその用途）
　本願発明はまた、上記一般式（４）～（８）の何れかで示される新規化合物を提供する。これら新規化合物の１つの用途は、上述した通り、ＧＳＴによる触媒反応を利用したＧＳＴ及び／又はチオール性物質のモニタリング用のプローブである。なお、これら新規化合物の構造に関しては、上記〔モニタリング用プローブ〕の欄における（具体的な化合物の例（新規化合物について））の欄により詳細な記載を行っている。
　また、これら新規化合物の製造方法は特に限定されないが、保護基のハロゲン化スルフォニル体（ＸＯ２Ｓ－：Ｘはハロゲン原子、好ましくは塩素原子）と、保護基を付加する前の化合物とを製造し、これらを必要に応じて触媒を用いて反応させることにより容易に製造することができる。これら化合物の製造方法の詳細については、後述する実施例及び参考例の記載も参照される。
　〔モニタリング用プローブを備えているキット〕
　また、本発明は上述のモニタリング用プローブを備えているキットを提供する。当該キットは、上述したような種々のモニタリング方法を実施するためのキットである。当該キットは、後述の実施例に示す通り、ＧＳＴ検出用のキットとして特に好適である。試料をモニタリングする環境、又は試料の種類にあわせて、モニタリング用プローブのほかにさらなる構成要素を備えている。
　例えば、試験管内においてＧＳＴを検出する上記キットは、適量のモニタリング用プローブ、１～５ｍＭのグルタチオン、及び中性付近のｐＨを示す緩衝液（例えばＰＢＳなど）を備えている。また例えば、生細胞内のＧＳＴを検出する上記キットは、適量のモニタリング用プローブ、及びＰＢＳ若しくは無血清培地を備えている。また、大腸菌内のＧＳＴを検出する上記キットは、適量のモニタリング用プローブ、１ｍＭのグルタチオン及びＰＢＳを備えている。
　上記キットにおけるモニタリング用プローブの適切な濃度は、検出するシグナル（脱保護された化合物が示す特性）にしたがって変化し得る。上記シグナルが本発明の化合物の脱保護によって生じる化学発光である場合、上記モニタリング用プローブは、５０～２５０μＭの範囲の濃度において使用される。上記シグナルが本発明の化合物の脱保護によって生じる蛍光発光である場合、上記モニタリング用プローブは、１～２５μＭの範囲の濃度において使用される。上記シグナルが本発明の化合物の脱保護によって生じる核磁気共鳴シグナルの変化である場合、上記モニタリング用プローブは、５０～３００μＭの範囲の濃度において使用される。
　ここで、上記モニタリング用プローブは、検出にするときの最終的な条件として上記濃度範囲に収められることが好ましい。よって、上記モニタリング用プローブは、使用前の状態では上記濃度範囲を超える濃度として上記キットに備えられていてもよい。このような場合、例えば、上記キットは、キットに備えられているさらなる構成要素と、上記モニタリング用プローブを含む成分とをどのような比率に混合すべきかを示した取扱説明書をさらに備えている。これによって、上記使用時にユーザが簡便に上記モニタリング用プローブの濃度を調節し得る。
　〔ＧＳＴを用いた脱保護方法〕
　（概要）
　本発明にかかるＧＳＴを用いた脱保護方法は、上記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基と結合した化合物と、チオール性物質とを、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の存在下で反応させて、上記化合物を脱保護する方法である。
　ここで、「上記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基と結合した化合物」とは、一例は、上記説明の「モニタリング用プローブ」であるが、上記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基が結合された化合物であればその構造は特に限定されない。また、「チオール性物質」及び「ＧＳＴ」の定義も、上記説明の通りである。
　また、上記化合物の好ましい一態様では、上記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基の脱離により発光する、又は、脱保護により生理活性を示す。なお、保護基の脱離により発光する化合物の具体例としては、上記一般式（４）、（６）、（７）又は（８）に示すものが挙げられる。
　（応用例）
　本発明にかかるＧＳＴを用いた脱保護方法の用途は特に限定されないが、１）各種合成反応における保護基の脱離の制御用、２）上述したチオール及び／又はＧＳＴのモニタリング用、３）生理活性物質の特異的な放出用（一例としては、ＧＳＴの存在下でのみ保護基が脱保護されて生理活性物質が放出されるような、ドラッグデリバリーシステム）、等に用いることができる。
　〔本発明の好ましい態様〕
　本発明は、上述の記載にしたがって以下の態様であることが好ましい。
　本発明にかかるプローブは、上記化合物がそのアミノ基、エーテル基又はイミノ基を介して上記保護基と結合していることが好ましく、上記化合物がその芳香族アミノ基、芳香族エーテル基又は芳香族イミノ基を介して上記保護基と結合していることがより好ましい。
　本発明にかかるプローブのより具体的な一例は、上記保護基と結合した上記化合物が、下記一般式（４）～（８）の何れかに示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
一般式（４）～（８）中の＊には上記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基が結合している。一般式（４）中で、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基を表わす。一般式（６）中で、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～６のアルキル基、又は上記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基を表わす。また、一般式（４）～（６）中の任意の水素原子（但し、一般式（５）、（６）及び（８）における上記保護基と結合した窒素原子上の水素原子は除く）は、ハロゲン原子又は炭素数１～６のアルキル基により置換されていてもよい。
　本発明にかかるモニタリング方法において、上記プローブの脱保護の程度を測定する工程は、脱保護による発光特性の変化、又は、脱保護による核磁気共鳴シグナルの変化、を測定することにより行うことが好ましい。
　また、本発明にかかるモニタリング方法において、上記発光特性の変化は、所定の励起光の照射下での蛍光発光特性の変化であってもよい。
　本発明にかかる脱保護方法において、上記化合物は、脱保護により発光する、又は、脱保護により生理活性を示す、ことが好ましい。
　本発明について、以下の実施例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
　〔実施例、及び参考例の概要〕
　初めに、実施例１～８、１２～１４、及び参考例１～５に示す、脱保護により蛍光発光可能となる蛍光発光プローブについて、その合成方法の概要を説明する。合成方法の概要は、下記の反応式に示す通り、保護基を付与前の化合物（蛍光物質）とＲＳＯ２Ｃｌ（保護基のハロゲン化スルフォニル体）とを、ピリジン、トリクロロメチル等の所定の溶媒中で反応させる。なお、実施例１３～１４の化合物は、実施例１～８の化合物と脱保護されて蛍光物質になる部分の構造が異なるだけで、同じ製造方法によって得られる。実施例１４の化合物において、複素環を含んでいる縮合環の構造上、他の化合物とは異なり、保護基におけるスルフォニル部分と結合しているＮは、芳香族部分と二重結合を介して結合している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　また、実施例１～８、１２～１４、及び参考例１～５に示す蛍光発光プローブは、下記の反応式に示すように、保護基が付された状態では蛍光発光を示さないが、例えばＧＳＴ及びＧＳＨ（チオール性物質の一種である還元型グルタチオン）の存在下で脱保護されて蛍光発光可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　次に、実施例９、及び参考例６～７に示す、脱保護により化学発光可能となる化学発光プローブについて、その合成方法の概要を説明する。合成方法の概要は、下記の反応式に示す通り、保護基を付与前の化合物１とＲＳＯ２Ｃｌとを、ピリジン等の所定の溶媒中で反応させて保護基が付された化合物２を得る。次いで、化合物２に対して、所定の条件で酸化反応を行い、化学発光プローブたる化合物３を得る。なお、合成には、下記参考文献５の記載も参照される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　また、実施例９、及び参考例６～７に示す化学発光プローブは、下記の反応式に示すように、保護基が付された状態では化学分解が起こらず発光特性を示さないが、例えばＧＳＴ及びＧＳＨの存在下で脱保護されて発光を伴う化学分解が可能となるという、発光ｏｆｆ／ｏｎ型のセンサーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　次に、実施例１０～１１、及び参考例８～９に示す、脱保護によりＮＭＲで検出可能なシグナルを生じるＮＭＲプローブについて、その合成方法の概要を説明する。合成方法の概要は、下記の反応式に示す通り、保護基を付与前の化合物とＲＳＯ２Ｃｌとを、ピリジン等の所定の溶媒中で反応させて保護基が付された化合物（ＮＭＲプローブ）を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　また、実施例１０～１１、及び参考例８～９に示すＮＭＲプローブは、例えばＧＳＴ及びＧＳＨの存在下で脱保護されてＮＭＲで検出可能なシグナル（ピークのケミカルシフト）を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　さらに、本実施例、及び参考例では、適宜、以下の参考文献、
参考文献１） Angewandte Chemie, International Edition,2009, 48, 7591-7594.
参考文献２） Journal of the American Chemical Society, 1951, 73, 5125-5127.
参考文献３） GB patent 1426405
参考文献４） 国際公開公報WO 2009140309
参考文献５） Synthesis, 2006, 11, 1781‐1786
が参照される。
　〔参考例１：ＲＳＯ２Ｃｌ（保護基のハロゲン化スルフォニル体）の製造例〕
　本参考例では、以下に示す目的化合物１ａ～１ｃの製造例を具体的に示す。なお、その他のＲＳＯ２Ｃｌについても下記の方法に準じて製造し、或いは市販品の購入により入手可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　（１）butyl 2-(chlorosulfonyl)-5-nitrobenzoateの製造
　Glycylglycine (0.9139 g, 6.92 mmol, 1.3 eq)、Thioacetic acid (0.57 ml, 8.01 mmol, 1.5 eq)をDMF(10 ml)に溶解し、氷冷下、Cesium carbonate (5.1979 g, 15.95 mmol, 3.0 eq)を加え撹拌した。10分後、DMF(5 ml)に溶解したButyl 2-chloro-5-nitrobenzoate (0.5462 g, 2.74 mmol)を反応液にゆっくりと滴下した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、1M HCl、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣を乾燥させた。NCS(2.8802 g, 21.57 mmol, 4.0 eq)を2M HCl /MeCN溶液(=1:5, 8.4 ml)に溶解し、氷冷した。MeCN(3 ml)に残渣を溶解させた後に、反応液にゆっくりと滴下した。1時間後、反応液をEtOAcで希釈し、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物1aを得た(0.6362 g, 2.41 mmol, 66%)。目的化合物1aの１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ8.56-8.50(2H, m, ArSO2), 8.40-8.37(1H, d, J= 9.0 Hz, ArSO2), 4.48-4.43(2H, t, J= 6.8 Hz, Bu). 1.85-1.75(2H, m, Bu), 1.51-1.43(2H, m, Bu), 1.00-0.96(3H, t, J= 7.4 Hz, Bu).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3) :δ 163.87, 150.79, 145.54, 134.57, 130.79, 125.91, 125.32, 67.69, 30.16, 19.02, 13.62.。
　（２）butyl 4-(chlorosulfonyl)-3-nitrobenzoateの製造
　Glycylglycine (0.4302 g, 3.26 mmol, 1.3 eq)、Thioacetic acid (0.27 ml, 3.80 mmol, 1.5 eq)をDMF(10 ml)に溶解し、氷冷下、cesium carbonate (2.4342 g, 3.00 mmol, 3.0 eq)を加え撹拌した。10分後、DMF(5 ml)に溶解したButyl 4-chloro-3-nitrobenzoate (0.6427 g, 2.49 mmol)を反応液にゆっくりと滴下した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、1M HCl、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣を乾燥させた。NCS(1.3499 g, 10.11 mmol, 4.0 eq)を2M HCl /MeCN溶液(=1:5, 8.4 ml)に溶解し、氷冷した。MeCN(3 ml)に残渣を溶解させた後に、反応液にゆっくりと滴下した。1時間後、反応液をEtOAcで希釈し、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物1bを得た(0.5893 g, 1.83 mmol, 73%)。目的化合物1ｂの１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ8.47-8.44(2H, m, ArSO2), 8.35-8.32(1H, d, J= 9.0 Hz, ArSO2), 4.46-4.41(2H, t, J= 6.6 Hz, Bu). 1.84-1.75(2H, m, Bu), 1.54-1.42(2H, m, Bu), 1.02-0.97(3H, t, J= 7.4 Hz, Bu).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3) :δ 163.87, 150.79, 145.54, 134.57, 130.79, 125.91, 125.32, 67.69, 30.16, 19.02, 13.62.。
　（３）4-acetyl-2-nitrobenzene-1-sulfonyl chlorideの製造
　Glycylglycine (0.4773 g, 3.61 mmol, 1.3 eq)、Thioacetic acid (0.3 ml, 4.22 mmol, 1.5 eq)をDMF(10 ml)に溶解し、氷冷下、cesium carbonate (2.6886 g, 8.25 mmol, 3.0 eq)を加え撹拌した。10分後、DMF(5 ml)に溶解した4'-Chloro-3'-nitroacetophenone (0.5462 g, 2.74 mmol)を反応液にゆっくりと滴下した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、1M HCl、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣を乾燥させた。NCS(1.5076 g, 11.29 mmol, 4.0 eq)を2M HCl /MeCN溶液(=1:5, 8.4 ml)に溶解し、氷冷した。MeCN(3 ml)に残渣を溶解させた後に、反応液にゆっくりと滴下した。1時間後、反応液をEtOAcで希釈し、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物1cを得た(0.6362 g, 2.41 mmol, 88%)。目的化合物1ｃの１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ8.41-8.32(3H, m, ArSO2), 2.74(3H, s, Me).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3) :δ 193.70, 142.88, 138.38, 131.87, 131.20, 124.68, 26.87.。
　〔参考例２：Monoacethyl_(2,4-dinitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本参考例では、図１中の（ａ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine (75.6 mg, 0.18 mmol)をpyridine/CH2Cl2(=1:1, 1.8 ml)に溶解した。反応液を氷冷し、2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride (75.9 mg, 0.28 mmol, 1.5 eq)を加え撹拌した。翌日、反応液をCHCl3で希釈し、H2Oと分液した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た(41.6 mg, 0.07 mmol, 収率37%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (400MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 8.31-8.29(1H, d, J= 8.8 Hz, Ar), 8.06-8.04(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 8.01-7.99(1H, d, J= 7.6 Hz, Ar), 7.76(1H, s, Ar), 7.72-7.63(2H, m, Ar), 7.14-7.06(3H, m, Ar), 6.85-6.82(1H, dd, J= 10.8, 2.4 Hz, Ar), 6.67-6.63(2H, q, J= 4.9 Hz, Ar), 2.15 (3H, s, CH3). 13C-NMR (99.5 MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 170.1, 169.7, 152.3, 151.7, 151.1, 149.6, 148.1, 140.5, 138.8, 137.9, 135.3, 132.8, 129.9, 128.9, 127.9, 126.5, 125.9, 124.8, 123.7, 123.7, 120.1, 116.5, 115.3, 115.0, 113.2, 108.7, 108.6, 107.3, 107.2, 82.7, 23.5. HR-ESI-MS m/z: Calcd for C28H19N4O10S+([M+H]+) 603.08219, Found 603.07945.。
　〔実施例１：Monoacethyl_(2-cyano-4-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｂ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine(51.0 mg, 0.11 mmol)をPyridin/CH2Cl2(1 ml, 1:1)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた2-cyano-4-nitrobenzenesulfonyl chloride (42.2 mg, 0.17 mmol, 1.6 eq：参考文献１)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をPLCで精製し、目的化合物を得た(29.6 mg, 0.05 mmol, 収率48%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3/CD3OD) :δ8.66(1H, s, ArSO2), 8.58-8.55(1H, d, J= 8.4 Hz, ArSO2), 8.41-8.38(1H, d, J= 8.7 Hz, ArSO2), 8.01-7.99(1H, d, J= 6.3 Hz, Ar), 7.75(1H, s, Ar), 7.71-7.61(2H, m, Ar), 7.12(1H, s, Ar), 7.12-7.10(1H, d, J= 7.2 Hz, Ar), 7.06-7.03(1H, d, J= 10.2 Hz, Ar), 6.86-6.82(1H, d, J= 10.8 Hz, Ar), 6.67-6.64(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 2.15(3H, s, Ac).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 169.73, 152.48, 151.90, 151.27, 149.49, 147.02, 140.60, 137.76, 135.24, 132.06, 130.20, 129.94, 129.30, 128.13, 127.85, 126.15, 124.99, 123.79, 115.39, 115.17, 113.87, 113.35, 111.75, 107.48, 107.37, 82.45, 40.28, 23.87. ESI-Ms: (M-H)- calcd. 581.08, found 580.95.。
　〔実施例２：Monoacethyl_(2-buthoxy-4-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｃ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine (16.0 mg, 0.04 mmol)をpyridine/CH2Cl2(=1:1, 0.6 ml)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させたbutyl 2-(chlorosulfonyl)-5-nitrobenzoate (26.6 mg, 0.08 mmol, 2.0 eq：参考例１も参照)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(19.1 mg, 0.03 mmol, 収率68%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ8.62-8.61(1H, ds, J= 2.4 Hz, ArSO2), 8.37-8.37(1H, dd, J= 1.6, 8.7 Hz, ArSO2), 8.32(1H, s, ArSO2), 8.15-8.12(1H, d, J= 8.7 Hz, Ar), 8.01-7.98(1H, d, J= 7.5 Hz, Ar), 7.69-7.62(4H, m, Ar), 7.16-7.15(1H, ds, J= 2.4, Ar), 7.09-7.07(1H, d, J= 6.6 Hz, Ar), 6.98-6.93(1H, dd, J= 2.1, 8.4 Hz, Ar), 6.87-6.83(1H, dd, J= 2.1, 8.4 Hz, Ar), 6.67-6.62(2H, m, Ar), 4.53-4.49(2H, t, J= 6.8 Hz, CH2), 2.17(3H, s, Ac), 1.87-1.82(2H, m, CH2), 1.55-1.48(2H, m, CH2), 1.04-0.99(3H, t, J= 7.2 Hz, CH3).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3) :δ 168.68, 166.06, 151.78, 151.34, 149.80, 143.13, 140.15, 138.03, 135.34, 132.64, 130.01, 129.18, 128.32, 126.30, 126.14, 125.75, 125.16, 123.84, 117.22, 116.39, 115.45, 109.74, 107.64, 82.15, 67.77, 30.32, 19.04, 13.64. ESI-Ms: (M-H)- calcd. 656.14, found 656.01.。
　〔実施例３：Monoacethyl_(2-trifluoromethyl-4-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｄ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamin (23.7 mg, 0.06 mmol)をpyridine/CH2Cl2(=1:1, 0.6 ml)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた2-Trifluoromethyl-4-nitrobenzenesulfonyl chloride (34.2 mg, 0.12 mmol, 2.0 eq：参考文献２)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(17.6 mg, 0.03 mmol, 収率49%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ8.65(1H, s, ArSO2), 8.37-8.36(2H, m, ArSO2), 8.01-8.00(2H, d, J= 6.6 Hz, Ar), 7.69-7.65(3H, m, Ar), 7.09-6.88(3H, m, Ar), 6.67-6.63(2H, m, Ar), 2.20(3H, s, Ac).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3) :δ 177.72, 169.96, 169.56, 151.73, 151.25, 149.58, 143.33, 140.14, 137.82, 135.61, 133.67, 130.20, 129.26, 128.26, 127.08, 125.98, 125.26, 123.86, 115.97, 115.61, 108.66, 107.84, 82.60, 60.44, 24.49. ESI-Ms: (M-H)- calcd. 624.08, found 623.97.。
　〔実施例４：Monoacethyl_(4-cyano-2-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｅ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine (22.5 mg, 0.05 mmol)をpyridine/CH2Cl2(=1:1, 0.6 ml)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた4-cyano-2-nitrobenzenesulfonyl chloride (20.6 mg, 0.08 mmol, 1.8 eq：参考文献３)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(22.7 mg, 0.04 mmol, 収率84%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CD3OD) :δ8.32(1H, s, ArSO2), 8.19-8.17(1H, d, J= 8.4 Hz, ArSO2), 8.07-8.04(1H, d, J= 8.1 Hz, ArSO2), 8.00-7.98(1H, d, J= 6.9 Hz, Ar), 7.78-7.68(3H, m, Ar), 7.21(1H, ds, J= 2.4, Ar), 7.15-7.08(2H, m, Ar), 6.94-6.901(1H, dd, J= 2.1, 8.7 Hz, Ar), 6.71-6.65(2H, m, Ar), 2.13(3H, s, Ac).13C-NMR (75.5 MHz, CD3OD) :δ 171.95, 171.04, 154.18, 153.12, 152.63, 149.58, 147.44, 139.95, 137.09, 136.90, 136.81, 133.17, 131.39, 130.31, 129.88, 129.32, 127.48, 126.00, 125.08, 119.27, 117.70, 117.01, 116.80, 116.63, 114.97, 109.75, 108.43, 83.65, 23.98. ESI-Ms: (M-H)- calcd. 581.08, found 580.97.。
　〔実施例５：Monoacethyl_(4-buthoxy-2-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｆ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine(16.0 mg, 0.04 mmol)をpyridine/CH2Cl2(0.6 ml, 1:1)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させたbutyl 4-(chlorosulfonyl)-3-nitrobenzoate (33.6 mg, 0.10 mmol, 2.7 eq：参考例１も参照)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(13.8 mg, 0.02 mmol, 収率54%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ8.43-8.42(1H, ds, J= 1.8 Hz, ArSO2), 8.27-8.23(1H, dd, J= 1.2, 7.8 Hz, ArSO2), 8.07-8.04(1H, d, J= 8.4 Hz, ArSO2), 8.02-7.99(1H, dd, J= 1.5, 6.6 Hz, Ar), 7.68-7.63(3H, m, Ar), 7.19-7.18(1H, ds, J= 2.1, Ar), 7.11-7.09(1H, d, J= 6.6 Hz, Ar), 7.04-7.00(1H, dd, J= 1.8, 8.4 Hz, Ar), 6.93-6.89(1H, dd, J= 2.4, 9.0 Hz, Ar), 6.71-6.65(2H, m, Ar), 4.38-4.34(2H, t, J= 6.6 Hz, CH2), 2.19(3H, s, Ac), 1.77-1.70(2H, m, CH2), 1.48-1.40(2H, m, CH2), 0.98-0.93(3H, t, J= 7.4 Hz, CH3).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3) :δ 169.56, 168.98, 163.00, 152.66, 151.78, 151.30, 148.08, 140.18, 137.54, 136.16, 135.43, 135.21, 133.36, 132.00, 130.10, 129.31, 128.37, 126.21, 126.09, 125.21, 123.88, 117.17, 116.48, 115.59, 109.92, 107.67, 82.22, 66.45, 30.46, 24.57, 19.09, 13.64. ESI-MS (M-H)- Calcd.: 656.14, Found: 656.04.。
　〔実施例６：Monoacethyl_(4-trifluoromethyl-2-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｇ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine (14.4 mg, 0.04 mmol)をpyridine/CH2Cl2(=1:1, 0.6 ml)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた4-Trifluoromethyl-2-nitrobenzenesulfonyl chloride (21.0 mg, 0.07 mmol, 1.8 eq)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(8.5 mg, 0.01 mmol, 収率39%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CD3OD) :δ8.27-8.23(2H, m, ArSO2), 8.07-8.05(1H, d, J= 7.5 Hz, ArSO2), 8.02-7.99(1H, d, J= 8.1 Hz, Ar), 7.80-7.67(3H, m, Ar), 7.23-7.23(1H, d, J= 2.1 Hz, Ar), 7.16-7.10(2H, m, Ar), 6.96-6.93(1H, dd, J= 8.4, 2.1 Hz, Ar), 6.73-6.67(2H, m, Ar), 2.13(3H, s, Ac).ESI-Ms: (M-H)- calcd. 581.08, found 580.95. ESI-Ms: (M-H)- calcd. 624.08, found 623.96.。
　〔実施例７：Monoacethyl_(4-acethyl-2-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｈ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine (20.9 mg, 0.04 mmol)をpyridine/CH2Cl2(=1:1, 0.6 ml)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた4-acetyl-2-nitrobenzene-1-sulfonyl chloride (28.4 mg, 0.11 mmol, 2.5 eq：参考例１も参照)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(24.3 mg, 0.04 mmol, 収率94%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CD3OD) :δ8.31(1H, ds, J= 1.8 Hz, ArSO2), 8.24-8.20(1H, dd, J= 1.8, 8.1 Hz, ArSO2), 8.15-8.13(1H, d, J= 7.2 Hz, ArSO2), 8.99-7.97(1H, d, J= 6.6 Hz, Ar), 7.76-7.66(3H, m, Ar), 7.21-7.20(1H, ds, J= 1.8, Ar), 7.13-7.07(2H, m, Ar), 6.94-6.91(1H, dd, J= 2.7, 9.0 Hz, Ar), 6.68-6.63(2H, m, Ar), 2.58(3H, s, Ac) , 2.13(3H, s, Ac).13C-NMR (75.5 MHz, CD3OD) :δ 196.55, 171.92, 171.03, 154.15, 153.07, 152.62, 149.84, 142.85, 142.41, 140.23, 136.78, 136.15, 133.02, 132.65, 131.36, 130.22, 129.30, 127.48, 125.97, 125.40, 125.07, 117.53, 116.76, 114.96, 109.46, 108.40, 83.68, 26.85, 23.98. ESI-Ms: (M-H)- calcd. 598.10, found 598.00.。
　〔参考例３：Monoacethyl_(5-nitro-2-pyidinesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本参考例では、図１中の（ｉ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine(80.2 mg, 0.16 mmol)をpyridine/CH2Cl2(1.6 ml, 1:1)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた5-nitro-2-pyridinesulfonyl chloride (56.1 mg, 0.25 mmol, 1.5 eq：参考文献４)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(83.5 mg, 0.15 mmol, 収率91%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ11.36(1H, s, SO2-NH), 10.25(1H, s, NH-Ac), 9.48-9.47(1H, ds, J= 2.1Hz, ArSO2), 8.84-8.80(1H, dd, J= 2.1, 8.4 Hz, ArSO2), 8.34-8.31(1H, d, J= 8.4 Hz, ArSO2), 8.02-7.99(1H, d, J= 7.5 Hz, Ar), 7.86(1H, s, Ar), 7.80-7.72(2H, m, Ar), 7.27-7.25(1H, d, J= 7.5 Hz, Ar), 7.18-7.18(1H, ds, J= 1.8 Hz, Ar), 7.12-7.09(1H, dd, J= 1.8, 8.7 Hz, Ar), 6.95-6.92(1H, dd, J= 1.8, 8.4 Hz, Ar), 6.72-6.68(1H, dd, J= 1.5, 8.4 Hz, Ar), 2.07(3H, s, Ac).13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ 168.95, 168.52, 159.84, 152.26, 150.92, 150.57, 145.93, 145.84, 141.46, 139.49, 135.80, 134.83, 130.31, 129.19, 128.37, 125.60, 124.81, 123.98, 123.24, 115.43, 114.19, 112.64, 106.47, 105.95, 81.56, 24.09. ESI-Ms: (M-H)- calcd. 557.08, found 556.97.。
　〔実施例８：Monoacethyl_(5-cyano-2-pyidinesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本実施例では、図１中の（ｊ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine(17.2 mg, 0.04 mmol)をpyridine/CH2Cl2(0.6 ml, 1:1)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた5-Cyano-2-pyridinesulfonyl chloride (2.1 eq)を加え撹拌する。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液する。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させる。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(15.3 mg, 0.03 mmol, 収率68%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CDCl3/ CD3OD) :δ8.92-8.92(1H, ds, J= 1.2 Hz, ArSO2), 8.21-8.20(1H, dd, J= 1.8, - Hz, ArSO2), 8.16-8.13(1H, d, J= 9.3 Hz, ArSO2), 8.01-7.99(1H, d, J= 7.8 Hz, Ar), 7.72-7.63(3H, m, Ar), 7.16-7.15(1H, ds, J= 2.1, Ar), 7.12-7.10(1H, d, J= 6.9 Hz, Ar), 7.07-7.03(1H, dd, J= 1.8, 8.7 Hz, Ar), 6.90-6.87(1H, dd, J= 2.4, 8.4 Hz, Ar), 6.66-6.62(2H, m, Ar), 2.15(3H, s, Ac).13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3/ CD3OD) :δ 169.82, 169.74, 159.35, 152.55, 152.43, 151.70, 151.30, 141.89, 140.50, 138.66, 135.28, 129.92, 128.87, 128.11, 126.11, 124.96, 123.82, 122.55, 115.83, 115.36, 115.00, 114.92, 113.38, 112.90, 108.12, 107.38, 82.68, 23.86. ESI-MS (M-H)- Calcd.: 537.09, Found: 537.01.。
　〔参考例４：Monoacethyl_(2-pyidinesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本参考例では、図１中の（ｋ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine(21.2 mg, 0.04 mmol)をpyridine/CH2Cl2(0.6 ml, 1:1)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5 ml)に溶解させた2-pyridinesulfonyl chloride (18.4 mg, 0.10 mmol, 2.4 eq)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、sat NaHCO3 aq、H2Oと分液した。飽和食塩水で洗浄後、有機層をNa2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(20.6 mg, 0.04 mmol, 収率92%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300MHz, CD3OD) :δ 8.65-8.64(1H, ds, J= 4.5 Hz, Ar), 8.05-7.97(3H, m, Ar), 7.76-7.68(3H, m, Ar), 7.58-7.53(1H, m, Ar), 7.21-7.20(1H, d, J= 2.4 Hz, Ar), 7.14-7.09(2H, t, J= 8.3 Hz, Ar), 6.91-6.87(1H, dd, J= 2.1, 8.4 Hz, Ar), 6.67-6.64(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 6.63-6.60(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 2.13 (3H, s, CH3). 13C-NMR (99.5 MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 171.92, 171.13, 157.99, 154.20, 152.98, 152.74, 151.28, 142.37, 141.57, 139.73, 136.75, 131.31, 129.82, 129.31, 128.56, 127.57, 125.92, 125.11, 123.89, 116.86, 116.67, 115.61, 115.05, 108.47, 108.40, 83.94, 23.97. ESI-MS (M-H)- Calcd.: 512.10, Found: 511.98.。
　〔参考例５：Monoacethyl_(4-nitrobenzenesulfonamido)_rhodamineの製造例〕
　本参考例では、図１中の（ｌ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　N-acethyl rhodamine (71.9 mg, 0.18 mmol)をpyridine/CH2Cl2(=1:1, 2.4 ml)に溶解した。反応液を氷冷し、p-nitrobenzenesulfonyl chloride (57.1 mg, 0.26 mmol, 1.5 eq)を加え撹拌した。5時間後、反応液をCHCl3で希釈し、H2Oと分液した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た(41.0 mg, 0.07 mmol, 収率42%)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (400MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 8.59-8.58(1H, ds, J= 2.0 Hz, Ar), 8.47-8.44(1H, dd, J= 11.2, 2.4 Hz, Ar), 8.28-8.26(1H, d, J= 8.8 Hz, Ar), 8.01-7.99(1H, d, J= 7.6 Hz, Ar), 7.73-7.63(3H, m, Ar), 7.18-7.18(1H, ds, J= 2.0 Hz, Ar), 7.14-7.12(1H, d, J= 7.2 Hz, Ar), 7.08-7.06(1H, d, J= 8.8 Hz, Ar), 6.67-6.64(2H, q, J= 4.8 Hz, Ar), 2.16 (3H, s, CH3). 13C-NMR (99.5 MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 170.1, 169.8, 152.4, 151.7, 151.2, 149.9, 148.7, 144.9, 140.5, 138.9, 136.7, 135.3, 129.8, 128.8, 128.1, 127.9, 125.9, 124.8, 124.1, 123.7, 115.3, 114.6, 113.2, 107.5, 107.3, 82.7, 23.5. HR-ESI-MS m/z: Calcd for C28H20N3O8S+([M+H]+) 558.09711, Found 558.09681.。
　〔実施例１～８、及び参考例１～５に示すプローブを用いたＧＳＴの活性測定〕
　実施例１～８、及び参考例１～５に示すプローブを用いたGSTの活性測定は、プローブの濃度が1 μM、GSHの濃度が1 mM、α,π-GST の濃度が0 もしくは2 μg/mlとなるように、夫々をPBSバッファー（10 mM, pH 7.4）に添加して、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて解析した。励起波長は490 nm、蛍光波長は520 nmとした。
　測定結果は、図３にまとめて示す。なお、図３中で丸囲みの１～１１の番号を振ったプローブの、スルフォニル基部分を除く保護基の構造も同図中の右上に示す。同図中で実線で示すものはＧＳＴ存在下（ＧＳＴ＋）のデータであり、破線で示すものはＧＳＴ非存在下（ＧＳＴ－）のデータである。また、同図中のグラフのＸ軸は反応時間を示し、Ｙ軸は蛍光発光が生じた割合（収率）を示す。
　また、図４には、図３に示すデータから得た、反応時間毎の各種蛍光プローブのシグナルバックグラウンド比、即ち、「図３中で実線で示す収率／破線で示す収率」を示す。図４に示すように、4位にCN, Ac, 又はCF3基を導入した蛍光プローブ（図１中に示す（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）に相当）が著しく高いシグナルバックグラウンド比を示した。なお、図４の下部に示す化学構造式は、測定に用いた各プローブの、スルフォニル基部分を除く保護基の構造に相当する。
　〔参考例６：1-(3-(2,4-dinitrobenzenesulfonate)-phenyl)-4-methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2′-adamantane) の製造例〕
　本参考例では、図２中の発光プローブの（ａ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　（１）　中間体の合成
　まず、下記の化学式で示す合成中間体である、1-(3-(2,4-dinitrobenzene-1-sulfonate)-phenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylideneを以下の通り製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　1-(3-hydroxyphenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylidene(70 mg, 0.26 mmol：参考文献５)をpyridineに溶解し、氷冷下2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride (83 mg, 0.31 mmol, 1.2 eq)を加え、アルゴン（Ar）置換した環境下で撹拌した。一晩撹拌を継続した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水と飽和食塩水とで分液した。次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで有機層をろ過した後に濃縮した。残渣をPLCで精製し、目的化合物を得た(65 m g, 0.13 mmol, 収率50 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.63-1.88 (m, 12 H, adamantane), 2.31 (s, 1 H, adamantane), 3.13 (s, 1 H, adamantane), 3.16 (s, 3 H, OCH3), 7.24-7.49 (m, 4 H, ArH), 8.16-8.19(d, 1H, ArH, J=9 Hz), 8.47-8.50(d, 1H, ArH, J=9 Hz), 8.64(s, 1H, ArH)。
　（２）　1-(3-(2,4-dinitrobenzenesulfonate)-phenyl)-4-methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2′-adamantane)の合成
　上記得られた1-(3-(2,4-dinitrobenzene-1-sulfonate)-phenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylidene(84 mg, 0.17 mmol)をジクロロメタンに溶解した後、テトラフェニルポルフィルンを触媒量加えた。酸素をバブリングしながら、-78℃下、4時間可視光を照射した後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(63 m g, 0.14 mmol, 収率82 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 0.79-0.84 (d, 1 H, adamantane, J=12 Hz), 1.16-1.20 (d, 1 H, adamantane, J=12 Hz), 1.38-1.42 (d, 1 H, adamantane, J=12 Hz), 1.60-1.90 (m, 10 H, adamantane), 3.00 (s, 1 H, adamantane), 3.15 (s, 3 H, OCH3), 7.27(s, 1H, ArH), 7.41-7.44 (m, 2 H, ArH), 8.01-8.04(d, 1H, ArH, J=9 Hz), 8.14-8.17(d, 1H, ArH, J=9Hz), 8.31(s, 1H, ArH).。
　〔実施例９：1-(3-(4-acetyl-2-nitrobenzenesulfonate)-phenyl)-4-methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2′-adamantane) の製造例〕
　本実施例では、図２中の発光プローブの（ｂ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　（１）　中間体の合成
　まず、下記の化学式で示す合成中間体である、1-(3-(4-acetyl-2-nitrobenzene-1- sulfonate)-phenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylideneを以下の通り製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　1-(3-hydroxyphenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylidene (100 mg, 0.37 mmol：参考文献５)をpyridinに溶解し、氷冷下4-acetyl-2-nitrobenzene-1-sulfonyl chloride (215 mg, 0.81 mmol, 2.2 eq)を加え、アルゴン（Ar）置換した環境下で撹拌した。一晩撹拌を継続した。次いで4-acetyl-2-nitrobenzenesulfonyl chlorideを0.5 eq加え、5時間撹拌した。次いで反応液を酢酸エチルで希釈し、水と飽和食塩水とで分液した。次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで有機層をろ過した後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(138 m g, 0.28 mmol, 収率75 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.65-1.91 (m, 12 H, adamantane), 2.34 (s, 1 H, adamantane), 2.67 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 1 H, adamantane), 3.19 (s, 3 H, OCH3),7.06-7.36 (m, 4 H, ArH), 8.00-8.02(d, 1H, ArH, J=6 Hz), 8.11-8.13(d, 1H, ArH, J=6 Hz), 8.30(s, 1H, ArH).。
　（２）　1-(3-(4-acetyl-2-nitrobenzenesulfonate)-phenyl)-4-methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2′-adamantane)の合成
　上記得られた1-(3-(4-acetyl-2-nitrobenzene-1- sulfonate)-phenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylidene(86 mg, 0.17 mmol)をジクロロメタンに溶解した後、テトラフェニルポルフィルンを触媒量加えた。酸素をバブリングしながら撹拌し、-78℃下、2.5時間可視光を照射した後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(82 m g, 0.16 mmol, 収率93 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 0.78-0.82 (d, 1 H, adamantane, J=12 Hz), 1.14-1.18 (d, 1 H, adamantane, J=12 Hz), 1.38-1.42 (d, 1 H, adamantane, J=12 Hz), 1.68-1.91 (m, 10 H, adamantane), 2.68 (s, 3H, CH3), 2.97 (s, 1 H, adamantane), 3.13 (s, 3 H, OCH3), 7.27(s, 1H, ArH), 7.41-7.44 (m, 2 H, ArH), 8.01-8.04(d, 1H, ArH, J=9 Hz), 8.14-8.17(d, 1H, ArH, J=9Hz), 8.31(s, 1H, ArH).。
　〔参考例７：1-(3-(4-nitrobenzenesulfonate)-phenyl)-4-methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2′-adamantane)の製造例〕
　本参考例では、図２中の発光プローブの（ｃ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　（１）　中間体の合成
　まず、下記の化学式で示す合成中間体である、1-(3-(4-nitrobenzenesulfonate)-phenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylideneを以下の通り製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　1-(3-hydroxyphenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylidene (100 mg, 0.37 mmol：参考文献５)をpyridineに溶解し、氷冷下p-nitrobenzenesulfonyl chloride (361 mg, 1.63 mmol, 2.2 eq)を加え、アルゴン（Ar）置換した環境下で撹拌した。一晩撹拌を継続した。次いで反応液を酢酸エチルで希釈し、水と飽和食塩水で分液した。次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで有機層をろ過した後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(344 m g, 0.36 mmol, 収率99 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.57-1.88 (m, 12 H, adamantane), 1.92 (s, 1 H, adamantane), 2.36 (s, 1 H, adamantane), 3.17 (s, 3 H, OCH3),6.82(s, 1H, ArH), 6.97-7.01 (m, 3 H, ArH), 8.00-8.03(d, 2H, ArH, J=9 Hz), 8.33-8.36(d, 2H, ArH, J=9 Hz)
　（２）　1-(3-(4-nitrobenzenesulfonate)-phenyl)-4-methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2′-adamantane)の合成
　上記得られた1-(3-(4-nitrobenzenesulfonate)-phenyl)-1-methoxy-2-spiroadamantylidene (100 mg, 0.22 mmol)をジクロロメタンに溶解した後、テトラフェニルポルフィルンを触媒量加えた。酸素をバブリングしながら、-78℃下、2.5時間可視光を照射した後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(124 m g, 0.21 mmol, 収率99 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
１H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 0.71-0.75 (d, 1H, adamantane, J=12 Hz), 1.10-1.14 (d, 1H, adamantane, J=12 Hz),1.33-1.37 (d, 1H, adamantane, J=12 Hz), 1.53-1.76 (m, 10 H, adamantane), 2.92 (s, 1 H, adamantane), 3.08 (s, 3 H, OCH3), 7.07-7.54 (m, 4 H, ArH), 7.96-7.99 (d, 2H, ArH, J=9 Hz), 8.30-8.33(d, 2H, ArH, J=9 Hz)
　〔実施例９、及び参考例６～７に示す発光プローブを用いたＧＳＴの活性測定〕
　実施例９、及び参考例６～７に示す発光プローブを用いたGSTの活性測定は、発光測定機として、モレキュラーデバイス ジャパン株式会社のSpectraMax Lを用いて行った。また、反応条件は、発光プローブの濃度が50 μMとなるように10 mM PBS (pH7.4)に溶解し、ここにさらにGSHの濃度が1mM、GSTの濃度が10 μg/mlとなるように夫々を加え、15分間発光測定（counting time　1s）した。
　測定結果は、図５にまとめて示す。なお、図５中で丸囲みの１～３の番号は、それぞれプローブのみを添加したもの（probe only）、プローブとＧＳＨとを添加したもの（probe＋ＧＳＨ）、プローブとＧＳＴとＧＳＨとを添加したもの（probe＋ＧＳＴ＋ＧＳＨ）に相当するデータである。また、同図中のグラフのＸ軸は反応時間を示し、Ｙ軸は観測された発光量を示す。その結果、特に4位にAc基を導入した発光プローブ（図２中の発光プローブの（ｂ）に示すものに相当）が特に高いシグナルバックグラウンド比を示した。
　〔参考例８：2,4-dinitro-N-(2-oxo-4-(trifluoromethyl)-2H-chromen-7-yl)benzenesulfonamide〕
　本参考例では、図２中のＮＭＲ用プローブの（ａ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　coumarin151(70 mg, 0.305 mmol)をpyridineに溶解し、氷冷下2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride（ただしフッ素原子は19Ｆ）(106 mg, 0.40 mmol, 1.8 eq) を加え、アルゴン（Ar）置換した環境下で撹拌した。室温で30分間撹拌した後、65℃で5時間撹拌した。次いで室温で一晩攪拌を継続した。次いで反応液を酢酸エチルで希釈し、重曹水、水、飽和食塩水で分液した。有機層を硫酸Naで乾燥、ろ過した後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(14.6 m g, 0.032 mmol, 収率10 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.92(s, 1H, DNs-H),8.61-8.58 (d, 1 H, Ar-H, J=9.0 Hz), 8.36-8.33 (d, 1 H, Ar-H, J=9.0 Hz), 7.67-7.65 (d, 1 H, coumarin-H, J=6.0 Hz), 7.16(s, 1H, coumarin-H), 6.93(s, 1H, coumarin-H).13C-NMR (400 MHz, DMSO): δ =158.19, 154.61, 150.32, 147.78, 140.85, 138.93, 135.75, 131.65, 127.56, 126.26, 122.91, 120.64, 116.02, 115.61, 109.37, 106.54。
　〔実施例１０：4-cyano-2-nitro-N-(2-oxo-4-(trifluoromethyl)-2H-chromen-7-yl)benzenesulfonamide〕
　本実施例では、図２中のＮＭＲ用プローブの（ｂ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　coumarin151 (40 mg, 0.17 mmol)をpyridineに溶解し、氷冷下4-cyano-2-nitrobenzenesulfonyl chloride (56 mg, 0.23 mmol, 1.3 eq)を加え、アルゴン（Ar）置換した環境下で撹拌した。室温で30分間撹拌した後、4-cyano-2-nitrobenzenesulfonyl chlorideを1.3 eqを加え、一晩撹拌した。TLCにて原料の残存が確認されたため、50℃で2時間さらに撹拌した。次いで4-cyano-2-nitrobenzenesulfonyl chloride（ただしフッ素原子は19Ｆ）を0.6 eq加え、1時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、重層水、水、飽和食塩水で分液した。次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層をろ過した後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(27 m g, 0.061 mmol, 収率35 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.22-8.19 (d, 1 H, Ar-H, J=9.0 Hz), 8.04(s, 1H, Ar-H), 7.94-7.91 (d, 1 H, Ar-H, J=9.0 Hz), 7.59-7.55 (d, 1 H, coumarin-H, J=12.0 Hz), 7.27 (s, 1 H, coumarin-H), 7.19-7.15 (d, 1 H, coumarin-H, J=12.0 Hz), 6.45(s, 1H, coumarin-H). 13C-NMR (300 Hz, DMSO): δ = 158.219, 154.62, 147.54, 140.81, 136.97, 134.72, 130.82, 128.93, 126.25, 117.42, 115.91, 115.83, 109.37, 106.47, 59.73, 20.73, 14.06. ESI-MS (M-H)- Calcd.: 438.01, Found: 437.96.。
　〔実施例１１：4-acetyl-2-nitro-N-(2-oxo-4-(trifluoromethyl)-2H-chromen-7-yl)benzenesulfonamide〕
　本実施例では、図２中のＮＭＲ用プローブの（ｃ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　coumarin151(40 mg, 0.17 mmol)をpyridineに溶解し、氷冷下、4-acetyl-2-nitrobenzenesulfonyl chloride (60 mg, 0.23 mmol, 1.3 eq) を加え、アルゴン（Ar）置換した環境下で撹拌した。室温で30分間撹拌した後、4-acetyl-2-nitrobenzenesulfonyl chlorideを1.3 eqを加え、一晩撹拌した。TLCにて原料の残存が確認されたため、60℃で2時間さらに撹拌した。次いで4-acetyl-2-nitrobenzenesulfonyl chloride（ただしフッ素原子は19Ｆ）を0.6 eq加え、70℃で2時間撹拌した。次いで反応液を酢酸エチルで希釈し、重層水、水、飽和食塩水で分液した。次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層をろ過した後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た(34 m g, 0.074 mmol, 収率43 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ =11.82 (s, 1 H, NH) 8.51(s, 1H, Ar-H), 8.36-8.33 (d, 1 H, Ar-H, J=9.0 Hz), 8.29-8.26 (d, 1 H, Ar-H, J=9.0 Hz), 7.70-7.67 (d, 1 H, coumarin-H, J=9.0 Hz), 7.27-7.24 (d, 1 H, coumarin-H, J=9.0 Hz), 7.18 (s, 1 H, coumarin-H), 6.94(s, 1H, coumarin-H) , 2.65 (s, 1 H, Ac-H). 13C-NMR (300 Hz, DMSO): δ =195.58, 158.22, 154.63, 147.98, 141.45, 141.00, 139.00, 138.58, 133.88, 131.67, 130.68, 126.27, 124.39, 115.65, 115.55, 109.22, 106.13, 27.09. ESI-MS (M-H)- Calcd.: 455.02, Found: 454.96.。
　〔参考例９：2-nitro-N-(2-oxo-4-(trifluoromethyl)-2H-chromen-7-yl)benzenesulfonamide〕
　本参考例では、図２中のＮＭＲ用プローブの（ｄ）に示す化合物を以下に示す通り製造した。
　coumarin151(30 mg, 0.13 mmol)をpyridine (1 ml)に溶解し、氷冷下、p-nitrobenzenesulfonyl chloride（ただしフッ素原子は19Ｆ） (56.16 mg, 0.25 mmol, 2.0 eq) を加え、アルゴン（Ar）置換した環境下で一晩撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、重層水、水、飽和食塩水で分液した。次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで有機層をろ過した後濃縮した。残渣をPLCで精製し、目的化合物を得た(46 m g, 0.11 mmol, 収率79 %)。当該目的化合物の１H-NMRの結果を以下に示す。
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ =11.54 (s, 1 H, NH) 8.43-8.40(d, 2H, Ar-H, J= 8.8 Hz), 8.16-8.12 (d, 2 H, Ar-H, J=9.2 Hz), 7.65-7.63 (d, 1 H, coumarin-H, J=7.3 Hz), 7.24-7.7.18 (m, 2 H, coumarin-H), 6.92 (s, 1 H, coumarin-H). MALDI-Tof MS (M-H)- Calcd.: 413.01, Found: 413.02.。
　〔実施例１１に示すプローブを用いたＧＳＴの活性測定〕
　実施例１１に示す磁気プローブ（ＮＭＲプローブ）を用いたGSTの活性測定は、NMRの装置として日本電子株式会社のJEOL 500 MHzを用いて行った。反応条件はbuffer中(50 mM PBS (pH7.4), TFA 100 μM, D2O 20 %)に、磁気プローブの濃度が50 μMとなるように溶解し、GSH 4mM及び、GST 10 μg/mlを加え反応させた。反応後、37℃下、470 MHz、200scanの条件で測定した。
　測定結果は、図６にまとめて示す。なお、図６中の左側は、磁気プローブとGSHとGSTとを加えた系におけるＮＭＲスペクトルを、同図中の右側はGSTを加えない系（コントロール）におけるＮＭＲスペクトルを示す。また、同図中の上段、中段、下段は順に、反応開始後０分、１５分、６０分経過後のＮＭＲスペクトルを示す。同図に示すように、ＧＳＴが存在する系では時間が経過するに従いピークのケミカルシフトが観察された。一方、ＧＳＴが存在しない系ではピークのケミカルシフトが観察されなかった。
　〔実施例１２：DNs-rhodamineの製造例〕
　本実施例では図７中の（a）に化学式を示すDNs-rhodamine（DNs-Rh）を以下の通り合成した。なお、合成には、参考文献：Bioorg Med Chem Lett., 18, 2246, 2008の記述も参考にした。
　Rhodamine110（100.9 mg, 0.28 mmol）のDMF (2 ml)溶液に、カリウムt-ブトキシド （KOt-Bu）(92.2 mg, 0.82 mmol, 3当量)のTHF (2 ml)溶液を、０℃の温度条件下で滴下した。３０分後、得られた反応混合物に、２，４－ジニトロベンゼンスルホニルクロライド（220.2 mg, 0.83 mmol, 3当量）を添加した。室温で２時間後、得られた反応混合物に、２，４－ジニトロベンゼンスルホニルクロライド（223 mg, 0.84 mmol, 3当量）を添加した。１６時間後、反応混合物を酢酸エチル（EtOAc）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（sat NaHCO3）水溶液で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、さらに真空で蒸発乾燥させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィを用いて精製し、DNs-rhodamine（20.7 mg, 0.03 mmol, 10%）を得た。DNs-rhodamineの同定データを以下に示す。
1H-NMR (400MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 8.47-8.46 (d, 2H, J= 2.2), 8.37-8.34 (dd, 2H, J= 2.2, 11.0), 8.19-8.17 (d, 2H, J= 8.8), 7.91-7.89 (d, 1H, J= 7.1), 7.61-7.53 (m, 2H), 7.04-7.01 (m, 3H), 6.74-6.72 (dd, 2H, J= 2.2, 11.0), 6.53-6.51 (d, 2H, J= 8.5); 13C-NMR ( 99.5MHz, CDCl3/CD3OD ) :δ 168.97, 151.38, 149.84, 148.06, 137.38, 135.28, 133.07, 130.11, 129.16, 127.12, 126.62, 125.99, 125.10, 123.58, 120.31, 116.52, 115.68, 108.70; HRMS (ESI) m/z calcd for C32H17N6O15S2 (M-H) 789.0193; found 789.0176.。
　〔実施例１３：7-(2,4-dinitrophenylsulfonamido)-4-methyl-3-coumarinylacetic acid（DNs-Coum）の製造例〕
　本実施例では以下に化学式を示すDNs-Coumを以下の通り合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　なお、DNs-Coumの合成反応は、以下に示すとおり、中間体１、中間体２を経て、最終産物３（DNs-Coum）を順次得た。なお、合成には、参考文献：Chem Commun., 6586, 2009の記述も参考にした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　（メチル 7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセテート（中間体１）の合成）
　硫酸（５滴）を、7-アミノ-4-メチル-3-クマリニル-酢酸(43.1 mg, 0.18 mmol)のメタノール（40ｍL）溶液に添加した。反応混合液を還流下で１時間攪拌した。反応混合物を冷却し、その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加して反応をとめた。得られた反応混合物をCHCl3で抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、さらに真空で蒸発乾燥させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィを用いて精製し、中間体１（34.4 mg, 0.14 mmol, 75%）を得た。中間体１の同定データを以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) :δ7.47-7.45(1H, d, J= 8.0 Hz, Ar), 6.58-6.56(1H, dd, J= 8.0 Hz, Ar), 6.40(1H, ds, Ar), 6.06(2H, s, NH2), 3.59(2H, s, CH2CO), 3.30(3H, s, CH3), 2.27(3H, s, CH3); 13C-NMR (99.5 MHz, DMSO-d6) :δ170.91, 161.24, 153.99, 152.52, 149.94, 126.39, 112.00, 111.32, 108.88, 98.23, 51.63, 32.10, 14.70; HR-ESI-MS m/z: Calcd for C13H13NNaO4 +([M+Na]+) 270.0737, Found 270.0745.。
　（メチル 7-(2,4-ジニトロフェニルスルホンアミド)-4-メチルクマリン-3-アセテート （中間体２）の合成）
　得られた中間体１(29.6 mg, 0.12 mmol)のピリジン/CH2Cl2(=1:1, 1.2 ml)溶液に、2,4-ジニトロベンゼンスルホニルクロライド(52.5 mg, 0.20 mmol, 1.6 当量)を加えた。８時間後、反応混合液をCHCl3で希釈し、水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、さらに真空で蒸発乾燥させた。残留物をPLCを用いて精製し、中間体２（33.6 mg, 0.07 mmol, 56%）を得た。中間体２の同定データを以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) :δ8.51(1H, ds, Ar), 8.38-8.35(1H, dd, J= 12.0, 4.0 Hz, Ar), 8.19-0.17(1H, d, J= 8.0 Hz, Ar), 7.52-7.50(1H, d, J= 8.0 Hz, Ar), 7.01-6.98(1H, dd, J= 12.0, 4.0 Hz, Ar), 6.95(1H, ds, Ar), 3.58(2H, s, CH2CO), 2.27(3H, s, CH3), 1.19(3H, s, CH3); 13C-NMR (99.5 MHz, CD3OD) :δ172.82, 163.68, 154.51, 151.50, 151.02, 150.00, 133.37, 127.17, 127.03, 124.46, 120.96, 120.39, 119.39, 117.70, 116.30, 108.47, 52.64, 33.38, 15.23; HR-ESI-MS m/z: Calcd for C19H14N3O10S-([M-H]-) 476.0405, Found 476.0415.。
　（7-(2,4-ジニトロフェニルスルホンアミド)-4-メチル-3-クマリニル酢酸（最終産物３）の合成）
　０℃に冷却した、中間体２(43.5 mg, 0.09 mmol)のTHF (4.5 mL)溶液に、水酸化リチウム１水和物(28.7 mg, 0.68 mmol)の水溶液（4.5 mL）を加えた。反応混合液を０℃で３時間攪拌した後、全ての出発原料が消失するまで２時間室温で温めた。反応混合液に5体積% のHClを加えて酸性にした後、当該反応混合物をEtOAcで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、さらに真空で蒸発乾燥させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィを用いて精製し、最終産物３（41.8 mg, 0.09 mmol, 99%）を得た。最終産物３の同定データを以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) :δ8.72-8.71(1H, ds, J=2.0 Hz, Ar), 8.53-8.50(1H, dd, J= 11.2, 2.4 Hz, Ar), 8.32-8.29(1H, d, J= 8.8 Hz, Ar), 7.73-7.71(1H, d, J= 8.8 Hz, Ar), 7.24-7.21(1H, dd, J= 11.2, 2.4 Hz, Ar), 7.20(1H, s, Ar), 3.67(2H, s, CH2CO), 2.38(3H, s, CH3); 13C-NMR (99.5 MHz, CD3OD) :δ173.92, 163.04, 154.22, 151.92, 150.63, 149.81, 140.58, 138.05, 134.05, 127.78, 127.74, 121.68, 120.68, 118.68, 118.02, 108.82, 33.51, 15.30; HR-ESI-MS m/z: Calcd for C18H13N3O10S-([M-H]-) 476.0405, Found 476.0415.。
　〔実施例１４：(2,4-dinitrobenzenesulfonamido)_cresyl violet（DNs-CV）の製造例_〕
　本実施例では以下に化学式を示すDNs-CV を以下の通り合成した。なお、合成には、参考文献（Synthesis and Characterization of a Series of Highly Fluorogenic Substrates for Glutathione Transferases, a General Strategy, J. Am. Chem.Soc., 2011, 2011, Vol. 133 (35), pp14109-14119）の記述も参考にした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　(2,4-ジニトロフェニルスルホンアミド)クロライド（DNs-Cl：15 mg, 0.055 mmol, 2.0等量）を、０℃の温度条件下で、クレシルバイオレット(10 mg, 0.027 mmol)のピリジン(0.5 ml)溶液に加えた。室温に２０分間置いた後、反応混合液をEtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、さらに真空で蒸発乾燥させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィを用いて精製し、DNs-CV（4 mg, 0. 810 μmol, 30 %）を得た。DNs-CVの同定データを以下に示す。
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ8.86 (1H, s), 8.71-8.69(1H, d, J= 6.0 Hz), 8.61-8.59(1H, d, J= 6.3 Hz), 8.47-8.45(1H, d, J= 6.6 Hz), 8.37-8.35(1H, d, J= 6.0Hz), 7.89-7.72(5H, m), 7.32(1H, s), 7.04-7.02(1H, d, J= 6.0 Hz), 6.76 (1H, s). 13C-NMR (99.5 MHz, DMSO-d6): δ162.28, 157.34, 150.68, 149.27, 147.98, 147.21, 132.87, 131.44, 130.54, 129.59, 129.19, 126.84, 125.45, 119.81, 117.29, 99.40, 96.85. HRMS (ESI) m/z calculated for C22H13IN5O7S+ ([M+H]+) 491.0608, found: 491.0536.。
　〔実施例１５：実施例１２～１４に示すプローブを用いた、種々の環境におけるＧＳＴの活性測定〕
　（１）蛍光プローブを用いた生細胞内のGST検出方法(参考文献：Anal Biochem., 390, 52, 2009)
　８ウェルのチャンパースライド(Lab-Tek)に3 × 104 cells/wellの濃度で細胞を播種して、無血清培地中で２４時間培養した。次いで、実施例１２で得たDNs-Rhを25 μMの濃度で各ウェルに添加し、倒立型Nikon ECLIPSE TE2000-S蛍光顕微鏡を用いて、１００倍率で、５分、１５分、及び３５分の露光時間において観察を行った。なお、ネガティブコントロールとして、野生型のＭＣＦ７細胞を100 μMのNEM（N-エチルマレイミド：チオール結合阻害剤）で１５分間前処理したのちにDNS-Rhを添加したものを準備して観察を行ったが、蛍光シグナルは検出されなかった（結果は図示せず）。なお、上記細胞としては、野生型のＭＣＦ７細胞（ＭＣＦ７ｗｔ）、ＭＧＳＴ１のセンス鎖ｃＤＮＡがトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞（ＭＧＳＴ１ sense transfected ＭＣＦ７）、及びＭＧＳＴ１のアンチセンス鎖ｃＤＮＡがトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞（ＭＧＳＴ１ antisense transfected ＭＣＦ７）を準備した。ＧＳＴ及びＭＧＳＴ１が細胞内で共存する場合に細胞内で生じる反応を図７中の（ａ）に、上記実験の結果を図７中の（ｂ）に示した。
　（２）GSTの活性測定
　実施例１３に示す蛍光プローブDNs-Coumを用いたGSTの活性測定を、PBSバッファー（10 mM, pH 7.4）中で、プローブの濃度が1μM、GSH の濃度が1 mM、α,π-GST の濃度が0 もしくは2 μg/mlとなるように添加して、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて解析した。励起波長は345 nm、蛍光測定波長は400-550 nmである。
　測定結果は、図８に示す。同図中で実線で示すものはＧＳＴ存在下（with ＧＳＴ）のデータであり、破線で示すものはＧＳＴ非存在下（without ＧＳＴ）、又はＧＳＴとＧＳＴとが非存在下（without ＧＳＨ, ＧＳＴ）でのデータである。また、同図中のグラフのＸ軸は蛍光測定波長を示し、Ｙ軸は蛍光強度を示す。
　（３）GSTの活性測定
　実施例１４に示す蛍光プローブDNs-CVを用いたGSTの活性測定を、PBSバッファー中（10 mM, pH 7.4）で、プローブの濃度が1μM、GSHの濃度が1 mM、α,π-GSTの濃度が0 もしくは2 μg/mlとなるように添加して、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて解析した。励起波長は540 nm、蛍光測定波長は500-750 nmである。
　測定結果は、図９に示す。同図中で実線で示すものはＧＳＴ存在下（with ＧＳＴ）のデータであり、破線で示すものはＧＳＴ非存在下（without ＧＳＴ）、又はＧＳＴとＧＳＴとが非存在下（without ＧＳＨ, ＧＳＴ）でのデータである。また、同図中のグラフのＸ軸は蛍光測定波長を示し、Ｙ軸は蛍光強度を示す。
　（４）生細胞内検出（Synthesis and Characterization of a Series of Highly Fluorogenic Substrates for Glutathione Transferases, a General Strategy, J. Am. Chem.Soc., 2011, 2011, Vol. 133 (35), pp14109-14119の記載も参照）
　６ウェルプレートに、MGST1発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、及びMGST1を発現しないベクターでトランスフェクトされたMCF7細胞（コントロール）を1×105 cells/welの濃度で播種し、80-90%コンフルエントになるまでこれら細胞を培養した（～４８時間）。次いで、これら細胞を1×PBSで洗浄した後、フェノールレッドを含まない無血清DMEM(Gibco 21063) (共溶媒として0.2% DMSOを含む)中に、実施例１４で得た１種類のDNs-CVを添加した培地中で、これら細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベートの後、培地を、フェノールレッドを含まない新鮮な無血清DMEMと交換して、倒立型Nikon ECLIPSE TE2000-S蛍光顕微鏡を用いて、４００倍率下で、細胞の蛍光イメージを取得した。結果を図１０に示す。
　〔実施例１５：実施例９に示す発光プローブを用いた大腸菌内におけるＧＳＴの活性測定〕
　大腸菌DH5αをpEGXベクターまたはpUC19ベクターで形質転換し、LB培地を用いて３７℃で前培養した。次いで、大腸菌の濁度が0.5になるまで３７℃で本培養し、1ｍＭ　IPTG（イソプロピル　β-D-１-チオガラクトピラノシド）を加えた後さらに３７℃で3時間培養した。なお、pEGXベクターはGSTタンパク質をコードする汎用プラスミドベクターであり、pUC19ベクターはGSTタンパク質をコードしていない汎用プラスミドベクター（コントロール）である。
　GSTの活性測定は、発光測定機として、モレキュラーデバイス ジャパン株式会社のSpectraMax Lを用いて行った。また、反応条件は、大腸菌の濁度が1.4になるように調整し、実施例９に示す発光プローブの濃度が0又は50 μM、GSHの濃度が1mMとなるように夫々を10 mM PBS (pH7.4)に加えて反応させた。結果を図１１に示す。
　さらに、実施例９に示す発光プローブを用いて大腸菌内のGSTをイメージングにより検出する実験を行った。具体的には、大腸菌DH5αをpEGXベクターまたはpUC19ベクターで形質転換し、LB培地を用いて３７℃で前培養した。次いで、大腸菌の濁度が0.5になるまで３７℃で本培養し、1ｍＭ　IPTGを加えた後さらに３７℃で3時間培養した。大腸菌の発光イメージング画像は、Nikon TE2000顕微鏡、及びHAMAMATSU ImagEM C9100-13デジタルカメラ(浜松ホトニクス社製)を用いて撮影した。また、反応条件は、大腸菌の濁度が2.0になるように調整し、実施例９に示す発光プローブの濃度が250 μM、GSHの濃度が3 mMとなるように夫々を10 mM PBS (pH7.4)に加えて反応させた。結果を図１２に示す。
　なお、図１２中の（a）及び（b）はpEGXベクターで形質転換した大腸菌DH5αのイメージング結果を示し、（c）及び（d）はpUC19ベクターで形質転換した大腸菌DH5αのイメージング結果を示す。また、（a）及び（c）は明視画像であり、（b）及び（d）は発光画像である。
　〔実施例１６：実施例１１に示すＮＭＲプローブを用いた大腸菌内におけるＧＳＴの活性測定〕
　実施例１１に示すＮＭＲプローブを用いた大腸菌内におけるGSTの活性測定は、NMR装置として日本電子株式会社のJEOL 500 MHzを用いて行った。また、大腸菌DH5αの形質転換及び培養は、実施例１６と同一の条件で行った。
　GSTの活性測定における反応条件は、大腸菌の濁度を68.0になるように調整し、実施例１１に示すＮＭＲプローブの濃度が300 μM、GSHの濃度が1 Mmとなるように夫々をバッファー(50 mM PBS (pH7.4), トリフルオロ酢酸（TFA）150 μM, D2O 20 %)に加えて反応させた。反応後、JEOL 500 MHzを用いて、37℃下で、470 MHz、500scanの条件でＮＭＲのシグナルを測定した。なお、TFAは基準ピーク用に、D2OはＮＭＲのロックをかけるために添加されている。結果を図１３に示す。
　本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明は、ＧＳＴを用いた脱保護法、ＧＳＴ及び／又はチオール性物質のモニタリング方法、及び当該方法に用いる新規化合物等を提供することを目的としている。

Claims (12)

  1. 　グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ及び／又はチオール性物質のモニタリング用プローブであって、下記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基と結合した化合物を含むことを特徴とするプローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （一般式（１）中で、Ｒ１１は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＮＯ２を表わす。一般式（２）中で、Ｒ１２は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、Ｃ２Ｈ５、又はＮＯ２を表わす。一般式（３）中で、Ｒ１３は、ＣＮを表わす。また、一般式（１）～（３）における＊は、化合物への結合部位を表わす。）
  2. 　上記化合物がそのアミノ基、エーテル基、又はイミノ基を介して上記保護基と結合していることを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
  3. 　上記化合物がその芳香族アミノ基、芳香族エーテル基、又は芳香族イミノ基を介して上記保護基と結合していることを特徴とする請求項２に記載のプローブ。
  4. 　上記保護基と結合した上記化合物が、下記一般式（４）～（８）の何れかに示すものであることを特徴とする請求項３に記載のプローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （一般式（４）～（８）中の＊には上記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基が結合している。一般式（４）中で、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基を表わす。一般式（６）中で、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～６のアルキル基、又は上記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基を表わす。また、一般式（４）～（８）中の任意の水素原子（但し、一般式（５）、（６）及び（８）における上記保護基と結合した窒素原子上の水素原子は除く）は、ハロゲン原子又は炭素数１～６のアルキル基により置換されていてもよい。）
  5. 　請求項１から４の何れか一項に記載のプローブと、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼとを、モニタリング対象となる試料中に共存させる工程と、次いで、
    　上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含むことを特徴とするチオール性物質のモニタリング方法。
  6. 　請求項１から４の何れか一項に記載のプローブと、チオール性物質とを、モニタリング対象となる試料中に共存させる工程と、次いで、
    　上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含むことを特徴とするグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼのモニタリング方法。
  7. 　請求項１から４の何れか一項に記載のプローブを、モニタリング対象となる生物由来の試料中に加える工程と、次いで、
    　上記プローブの脱保護の程度を測定する工程と、を含むことを特徴とするグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ及び／又はチオール性物質のモニタリング方法。
  8. 　上記プローブの脱保護の程度を測定する工程は、脱保護による発光特性の変化、又は、脱保護による核磁気共鳴シグナルの変化、を測定することにより行うことを特徴とする請求項５から７の何れか一項に記載のモニタリング方法。
  9. 　上記発光特性の変化は、所定の励起光の照射下での蛍光発光特性の変化であることを特徴とする請求項８に記載のモニタリング方法。
  10. 　下記一般式（４）～（８）の何れかで示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （一般式（４）～（８）中の＊には下記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基が結合している。一般式（４）中で、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基を表わす。一般式（６）中で、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～６のアルキル基、又は下記一般式（１）～（３）の何れかに示す保護基を表わす。また、一般式（４）～（８）中の任意の水素原子（但し、一般式（５）、（６）及び（８）における上記保護基と結合した窒素原子上の水素原子は除く）は、ハロゲン原子又は炭素数１～６のアルキル基により置換されていてもよい）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （一般式（１）中で、Ｒ１１は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＮＯ２を表わす。一般式（２）中で、Ｒ１２は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、Ｃ２Ｈ５、又はＮＯ２を表わす。一般式（３）中で、Ｒ１３は、ＣＮを表わす。また、一般式（１）～（３）における＊は、化合物への結合部位を表わす。）
  11. 　下記一般式（１）～（３）で示す何れかの保護基と結合した化合物と、チオール性物質とを、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼの存在下で反応させて、上記化合物を脱保護することを特徴とする脱保護方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （一般式（１）中で、Ｒ１１は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、又はＮＯ２を表わす。一般式（２）中で、Ｒ１２は、ＣＮ、ＣＯＯＣ4Ｈ9、ＣＦ３、Ｃ２Ｈ５、又はＮＯ２を表わす。一般式（３）中で、Ｒ１３は、ＣＮを表わす。また、一般式（１）～（３）における＊は、化合物への結合部位を表わす。）
  12. 　上記化合物は、脱保護により発光する、又は、脱保護により生理活性を示す、ことを特徴とする請求項１１に記載の脱保護方法。
PCT/JP2011/071926 2010-09-24 2011-09-26 グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用 WO2012039499A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010214260 2010-09-24
JP2010-214260 2010-09-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012039499A1 true WO2012039499A1 (ja) 2012-03-29

Family

ID=45873978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/071926 WO2012039499A1 (ja) 2010-09-24 2011-09-26 グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2012039499A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107915705A (zh) * 2017-11-21 2018-04-17 济南大学 一种二硫苏糖醇荧光探针

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009107448A1 (ja) * 2008-02-29 2009-09-03 独立行政法人理化学研究所 チオールの検出方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009107448A1 (ja) * 2008-02-29 2009-09-03 独立行政法人理化学研究所 チオールの検出方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HATSUO MAEDA ET AL.: "2,4-Dinitrobenzenesulfonyl Fluoresceins as Fluorescent Alternatives to Ellman's Reagent in Thiol-Quantification Enzyme Assays", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, vol. 44, no. 19, 2005, pages 2922 - 2925, XP008141444, DOI: doi:10.1002/anie.200500114 *
ITO ET AL.: "Gedokukei Koso Glutathione S- Transferase no Seisaibonai Kan'i Kenshutsu Probe no Kaihatsu", FORUM 2009: PHARMACEUTICAL HEALTH SCIENCE ENVIRONMENTAL TOXICOLOGY KOEN YOSHISHU, 2009, pages 129 *
JEAN BOUFFARD ET AL.: "A Highly Selective Fluorescent Probefor Thiol Bioimaging", ORGANIC LETTERS, vol. 10, no. 1, 2008, pages 37 - 40, XP008141443, DOI: doi:10.1021/ol702539v *
SHIBATA ET AL.: "Dinitrobenzenesulfonyl Hogoki o Mochiita Shinki Glutathione-S-Transferase Kenshutsu Probe no Kaihatsu", DAI 28 KAI ABSTRACTS OF SYMPOSIUM ON MEDICINAL CHEMISTRY, 2009, pages 354 - 355 *
YUUTA FUJIKAWA ET AL.: "Design and Synthesis of Highly Sensitive Fluorogenic Substrates for Glutathione S-Transferase and Application for Activity Imaging in Living Cells", J. AM. CHEM. SOC., vol. 130, 2008, pages 14533 - 14543 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107915705A (zh) * 2017-11-21 2018-04-17 济南大学 一种二硫苏糖醇荧光探针
CN107915705B (zh) * 2017-11-21 2021-04-30 济南大学 一种二硫苏糖醇荧光探针

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9714260B2 (en) Asymmetrical Si rhodamine and rhodol synthesis
JP5228190B2 (ja) パーオキシナイトライト蛍光プローブ
US8143069B2 (en) Fluorescent probe and method of measuring hypochlorite ion
US10520509B2 (en) Fluorescent probes for detecting hydrogen polysulfides
JP2007091695A (ja) 新規ルシフェリン誘導体
JP6275689B2 (ja) 蛍光プローブ
JP6150297B2 (ja) 蛍光発色剤、蛍光発色剤を含むイオン濃度センサー、蛍光発色剤を含む試薬、試薬を備える試薬キットおよび蛍光発色剤の合成方法
WO2018174253A1 (ja) ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途
WO2012039499A1 (ja) グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用
JP7339675B2 (ja) カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ
WO2006019105A1 (ja) 蛍光ラベル化剤
JP5585960B2 (ja) チオールの検出方法
JP2018145126A (ja) カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ
Tietz et al. Pyrimidine-based fluorescent COX-2 inhibitors: synthesis and biological evaluation
WO2021177060A1 (ja) Ｌｔａ１基質となる蛍光プローブ
Gu et al. Synthesis and spectral properties of 6′-triazolyl-dihydroxanthene-hemicyanine fused near-infrared dyes
EP3870044B1 (en) Complexes and ligands
JP2018025399A (ja) ハイドロポリスルフィド検出用蛍光プローブ
WO2002102795A1 (fr) Sondes fluorescentes pour le zinc
JP2004101389A (ja) アルミニウムイオン及び／又は第二鉄イオン測定用プローブ
KR101125058B1 (ko) 물질 표지용 화합물 및 그 제조방법
JP5360609B2 (ja) 低酸素環境測定用試薬
US11117888B2 (en) Irreversible inhibitors of pyruvate kinase M2 and the use thereof
CN113461640B (zh) Lpar1抑制剂、医药用途及其制备方法
WO2015125851A1 (ja) 神経伝達物質受容体のリガンドスクリーニングシステムの開発

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11826941

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11826941

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP