WO2009107448A1 - チオールの検出方法 - Google Patents

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阿部　洋
伊藤　嘉浩
綾 柴田
美香 伊藤
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独立行政法人理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a novel compound capable of detecting thiols, particularly thiols present in biomolecules such as proteins, as well as a thiol detection reagent and a thiol detection method using the above compounds.
  • Cell thiol plays an important role in biological systems. Changes in thiol concentrations are associated with oxidative stress associated with toxicants and diseases. Glutathione is the most abundant cellular thiol and acts as an antioxidant, protecting cells from many carcinogens. Homocysteine is a risk factor for diseases such as cardiovascular disease and Alzheimer's disease. Thiol groups in cysteine residues are involved in the three-dimensional structure of proteins through the formation of disulfide bonds. Cysteine deficiency can cause serious health problems. Therefore, detection of intracellular thiols is very important for examining cell functions.
  • the Ellman reagent is a thiol detection reagent that has been widely used for a long time (Non-Patent Document 1).
  • this reagent assay is based on changes in absorbance and can only be used in vitro.
  • Several thiol detection methods have been reported involving sensitive fluorescent probes. Fluorescein derivatives protected with 2,4-dinitrobenzenesulfonyl ester have been reported (Non-patent Documents 2 and 3). This probe reacts with biological thiols and gives high fluorescence intensity in a short reaction time.
  • this probe has a problem that background fluorescence may be generated because the sulfonyl ester is hydrolyzed in an aqueous solution.
  • Non-patent Documents 4 and 5 Recently, fluorescent probes having 2,4-dinitrobenzenesulfonamide (DNB) groups have been reported (Non-patent Documents 4 and 5).
  • the sulfonamide group is resistant to hydrolysis and does not generate background fluorescence.
  • the present invention is a problem to be solved by providing a novel thiol detection reagent and a thiol detection method using the same, which can be used in vivo, and solves the problem of generation of background fluorescence due to hydrolysis. It was.
  • the present inventors synthesized a novel fluorogenic compound by protecting a general-purpose and inexpensive rhodamine or cresyl violet with a 2,4-dinitrosulfonyl group. Succeeded. Since the fluorescence generating compound of the present invention can react specifically with thiol and generate fluorescence, it is possible to visualize thiol in living cells. The present invention has been completed based on these findings.
  • a compound represented by the following formula (1) is provided.
  • the alkyl group in the formula, R 2 each independently 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or a hydrogen atom.
  • the present invention further provides a compound represented by the following formula (2).
  • each R 2 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or a hydrogen atom
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group, or a hydrogen atom
  • 4 represents a group containing an oxygen atom or a hydrogen atom, and R 3 and R 4 may be bonded to form a ring.
  • each R 2 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or a hydrogen atom.
  • the present invention further provides a thiol detection reagent comprising the above-described compound of the present invention.
  • a method for detecting a thiol which comprises detecting fluorescence generated by reacting the above-described compound of the present invention with a compound having a thiol group.
  • the reaction between the compound of the present invention and the compound having a thiol group is carried out intracellularly.
  • the compound having a thiol group is a biomolecule.
  • the fluorescence-generating compound of the present invention is useful as a thiol detection reagent for allowing visualization of thiols in living cells because it can specifically react with thiols to generate fluorescence.
  • a thiol detection reagent containing the fluorogenic compound of the present invention the localization of thiols in cells can be examined.
  • a novel fluorescent probe was prepared from rhodamine (Formula 2B).
  • Rhodamine dyes are most widely used as fluorescent labels for biomolecules because of their strong fluorescence and resistance to photo bleaching (loss of photosensitivity).
  • the fluorescent probe of the present invention can be applied to many rhodamine derivatives, and can produce multicolor fluorescence detection reagents for biological thiols.
  • Fluorescence-generating probe chemistry involves nucleophilic attack of the thiol group on the 2,4-niditrobenzenesulfonamide group and the resulting cleavage of the sulfonamide bond. Thereafter, the ring-opening lactone type rhodamine emits a fluorescent signal (Scheme 1).
  • the probe of the present invention was synthesized from commercially available rhodamine 110 in one step. The starting compound was treated with 2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride in DMF in the presence of KOt-Bu for 16 hours to give the desired probe in 10% yield.
  • Reaction formula 1 Reaction mechanism of the fluorogenic probe The 2,4-niditrobenzenesulfonamide group of the probe is cleaved by reaction with thiol to generate rhodamine, and a fluorescent signal is generated.
  • a green fluorescent probe with rhodamine as the basic skeleton.
  • a red fluorescent probe having cresyl violet (CV) as a basic skeleton was designed (Formula 1A).
  • This probe is quenched only by protecting one amino group of CV with a dinitrobenzenesulfonyl (DNs) group.
  • DNs dinitrobenzenesulfonyl
  • thiols are present, DNs as protecting groups are removed by nucleophilic substitution reaction, and fluorescence is generated.
  • This probe was produced by adding KOt-Bu and ClSO 2 Ph (NO 2 ) 2 to cresyl violet and reacting them.
  • Reaction formula 2 Reaction mechanism of fluorescence generating probe The 2,4-niditrobenzenesulfonamide group of the probe is cleaved by reaction with thiol to produce cresyl violet, and a fluorescence signal is generated.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the following formula (1).
  • each R 2 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or a hydrogen atom.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the following formula (1A).
  • the compound (probe) of the present invention is a compound represented by the following formula (2).
  • each R 2 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or a hydrogen atom
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group, or a hydrogen atom
  • 4 represents a group containing an oxygen atom or a hydrogen atom, and R 3 and R 4 may be bonded to form a ring.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the following formula (2A) or (2B).
  • each R 2 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or a hydrogen atom.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear or branched, and examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, and a hexyl group.
  • examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • examples of the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group.
  • examples of the group containing an oxygen atom include —O— and —OCO—.
  • the compound represented by formula (1) of the present invention (including the compound represented by formula (1A)) or the compound represented by formula (2) of the present invention (compound represented by formula (2A) or formula (2B)) Is also reacted with a compound having a thiol group, it emits fluorescence by the reaction of the above reaction formula 1. Therefore, for example, it is possible to examine the localization of thiol in a cell by incubating the cell with the above compound and acquiring a fluorescent image of the cell.
  • Example A1 Fluorescence measurement (method) The reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) using 100 nM probe (compound 2) and 10 mM cysteine. The fluorescence spectrum was acquired with a fluorescence spectrometer (FP-6500; JASCO). Fluorescence with excitation at 490 nm was acquired with a scan range of 450-650 nm.
  • Example A2 Reactivity of probe and thiol (method) The reactivity of the probe (compound 2) with several thiols was investigated by measuring the increase in fluorescence intensity at 522 nm. The reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) using 1 ⁇ M probe and 1 mM thiol.
  • the pKa value of 2-mercaptoethanol is 9.5, which is higher than that of other thiols. Therefore, the reaction with the DNB group should be slow.
  • the probe showed no activity against other biological substances such as glycine, ascorbic acid or hydrogen peroxide.
  • the probe was very stable in the biological environment. For example, no increase in fluorescence signal was detected even after the probe was heated in 55 mM Tris buffer (pH 7.4) at 55 ° C. for 24 hours. From the above, it was confirmed that the probe of the present invention showed excellent selectivity for biological thiols and no unnecessary fluorescence signal was generated.
  • Example A3 Observation with a fluorescence microscope (method)
  • HeLa cells were grown in MEM at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere. The cells were incubated for 15 minutes at 37 ° C. in the presence of 25 ⁇ M probe (compound 2) (1: 100 DMSO / PBS ( ⁇ ), v / v).
  • probe compound 2
  • cells were treated with 1 mM N-methylmaleimide in PBS ( ⁇ ) for 60 minutes at 37 ° C., washed three times with PBS ( ⁇ ) buffer, and then the cells were treated with 25 ⁇ M probe (1: 100 DMSO / Incubated for 15 minutes at 37 ° C. in the presence of PBS ( ⁇ ), v / v).
  • Fluorescence images were obtained with a fluorescence microscope (Axiovert 200M; CarlissZeiss) equipped with a mercury lamp using a digital camera (Cool HQ; Roper Scientific) and image software (MetaMorph; Molecular Devices).
  • the microscope settings are as follows. Excitation: 470/40 band pass filter, emission; 525/50 band pass filter, Irradiation time 300 msec.
  • FIG. 3 shows the results of taking pictures of the bright field image and the fluorescence image with a fluorescence microscope.
  • the probe of the present invention 25 ⁇ M
  • the cells showed a significant fluorescent signal (FIG. 3d).
  • a strong signal was localized in the cytoplasm.
  • the nucleus showed a weak fluorescent signal.
  • the probes of the present invention no fluorescent signal was observed (FIG. 3b).
  • the probe of the present invention can penetrate the cell membrane and image changes in the amount of thiols in living cells. That is, the fluorescent probe of the present invention can generate a signal in response to a thiol and can be applied to imaging of biological thiols in living cells.
  • Cresyl violet (250 mg, 0.691 mmol) was dissolved in 7 mL of DMF and ice-cooled.
  • KOt-Bu 155 mg, 1.38 mmol
  • ClSO 2 Ph (NO 2 ) 2 368 mmol, 1.38 mmol
  • the reaction mixture was diluted with ethyl acetate and partitioned with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and water. The organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was removed by distillation under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound 4 (30 mg, 0.061 mmol, 9%).
  • Example B1 Fluorescence measurement in solution (method) Probe (Compound 4) 100 nM and GSH 10 mM were reacted in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) at 37 ° C. for 30 minutes, and then measured using a spectrofluorometer (FP-6500; JASCO). (Excitation wavelength 540 nm).
  • Example B2 Flow cytometry (method) A probe (compound 4) 100 ⁇ M was added to HL60 and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and then measured by flow cytometry. Add 1 mM N-methylmaleimide (N-MMI), a blocking agent for thiols, to HL60, react at 37 ° C for 30 minutes, add 100 ⁇ M probe, react at 37 ° C for 15 minutes, and measure by flow cytometry Went.
  • N-MMI N-methylmaleimide
  • FIG. 6 shows the result of an attempt to quantify GSH in living cells by DNs-CV using flow cytometry.
  • DNs-CV a novel fluorescent compound
  • FIG. 1a shows the absorption spectrum of a 20 ⁇ M probe in 50 ⁇ mM Tris-HCl (pH 7.4) with and without (dotted line) 20 ⁇ mM Cys
  • FIG. 1 b shows 50 ⁇ m Tris-HCl (pH 7.4).
  • FIG. 2 shows the fluorescence intensity of 1 ⁇ M probe in the presence of 1 mM thiol in 50 mM mM Tris-HCl (pH 7.4).
  • FIG. 3 shows a fluorescence image of HeLa cells.
  • FIG. 4 shows the fluorescence intensity of a 1 ⁇ M probe (compound for comparison) in the presence of 1 mM thiol in 50 mM mM Tris-HCl (pH 7.4). Following the addition of thiol, the solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. 522 nm fluorescence was monitored by excitation at 490 nm.
  • 3'-thio dT represents 3'-phosphorothioate-2'-deoxythymidine; DTT represents dithiothreitol; GSH represents glutathione, L-Gly represents L-glycine, and Vc represents ascorbic acid.
  • FIG. 5 shows that the probe (compound 4) 100 nM and GSH 10 mM were reacted in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) at 37 ° C for 30 minutes and then measured using a spectrofluorometer (excitation). Wavelength 540 nm) results are shown.
  • FIG. 6 shows the results of measurement by flow cytometry after adding 100 ⁇ M probe (Compound 4) to HL60 and reacting at 37 ° C. for 15 minutes.

Abstract

　本発明の目的は、in vivoでも使用可能であると同時に、加水分解によるバックグラウンド蛍光の発生という問題を解消した、新規なチオール検出試薬及びそれを用いたチオール検出方法を提供することである。本発明によれば、下記式（１）で示される化合物が提供される。 （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）

Description

チオールの検出方法
　本発明は、チオール、特にタンパク質などの生体分子中に存在するチオールを検出することができる新規化合物、並びに上記化合物を用いたチオール検出試薬及びチオールの検出方法に関する。
　細胞のチオールは、生物系で重要な役割を担う。チオール濃度の変化は、毒物及び疾患と関連のある酸化ストレスに関連している。グルタチオンは、最も豊富な細胞チオールであり、抗酸化剤として作用して、細胞を多くの発癌物質から保護する。ホモシステインは、心臓血管疾患及びアルツハイマー病などの疾患の危険因子である。システイン残基中のチオール基は、ジスルフィド結合の形成を通じてタンパク質の三次元構造に関与している。システインの欠損は、重篤な健康問題を引き起こす可能性がある。従って、細胞内チオールの検出は、細胞の機能を調べるために非常に重要である。
　Ellman試薬は、古くから広く使用されているチオール検出試薬である（非特許文献１）。しかしながら、この試薬のアッセイは吸光度変化に基づくものであるため、in vitroでのみ使用可能である。感受性蛍光プローブを含む幾つかのチオール検出方法が報告されている。２，４－ジニトロベンゼンスルホニルエステルで保護されたフルオレセイン誘導体が報告されている（非特許文献２及び３）。このプローブは、生物学的チオールと反応して、短い反応時間で高い蛍光強度を与える。しかし、このプローブは、スルホニルエステルが水溶液中で加水分解されてしまうため、バックグラウンド蛍光を発生させる可能性があるという問題がある。
　最近、２，４－ジニトロベンゼンスルホンアミド（ＤＮＢ）基を有する蛍光プローブが報告されている（非特許文献４及び５）。スルホンアミド基は、加水分解に耐性であり、バックグラウンド蛍光も発生しない。
Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70. Maeda, H.; Matsuno, H.; Ushida, M.; Katayama, K.; Saeki, K.; Itoh, N. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2922.; Maeda, H.; Katayama, K.; Matsuno, H.; Uno, T. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 1810. Jiang, W.; Fu, Q.; Fan, H.; Ho, J.; Wang, W. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8445. Bouffard, J.; Kim, Y.; Swager, T. M.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Org. Lett. 2008, 10, 37.
　本発明は、in vivoでも使用可能であると同時に、加水分解によるバックグラウンド蛍光の発生という問題を解消した、新規なチオール検出試薬及びそれを用いたチオール検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、汎用され安価なローダミンまたはクレシルバイオレット　を、２，４－ジニトロスルホニル基で保護することにより、新規な蛍光発生型化合物を合成することに成功した。本発明の蛍光発生型化合物は、チオールと特異的に反応し、蛍光を発生することができるため、生細胞内でのチオールを可視化することができる。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
　本発明によれば、下記式（１）で示される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
　好ましくは、下記式（１Ａ）で示される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　本発明によればさらに、下記式（２）で示される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）
　好ましくは、下記式（２Ａ）で示される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
　さらに好ましくは、下記式（２Ｂ）で示される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　本発明によればさらに、上記した本発明の化合物を含むチオール検出試薬が提供される。
　本発明によればさらに、上記した本発明の化合物とチオール基を有する化合物とを反応させることによって生成する蛍光を検出することを含む、チオールの検出方法が提供される。
　好ましくは、本発明の化合物とチオール基を有する化合物との反応を細胞内で行う。
　好ましくは、チオール基を有する化合物は生体分子である。
　本発明の蛍光発生型化合物は、チオールと特異的に反応し、蛍光を発生することができるため、生細胞内でのチオールを可視化することができるためのチオール検出試薬として有用である。特に、本発明の蛍光発生型化合物を含むチオール検出試薬を用いることによって、細胞内におけるチオールの局在を調べることができる。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明では、ローダミンから新規な蛍光プローブを作成した（式２Ｂ）。ローダミン色素は蛍光が強く、photo bleaching（光感受性の喪失）に耐性を有していることから、生体分子の蛍光標識として最も広く使用されている。４５０から７００ｎｍの発光範囲を有する一群のローダミン誘導体が存在する。本発明の蛍光プローブは、多くのローダミン誘導体に適用でき、生物学的チオールに対する多色の蛍光検出試薬を製造することができる。
　蛍光発生プローブの化学には、２，４－ニジトロベンゼンスルホンアミド基に対するチオール基の求核攻撃と、それによるスルホンアミド結合の切断が関与する。その後、開環ラクトン型のローダミンが蛍光シグナルを放出する（反応式1）。本発明のプローブは、市販のローダミン１１０から一段階で合成した。出発化合物を、ＤＭＦ中でＫＯｔ－Ｂｕの存在下において２，４－ジニトロベンゼンスルホニルクロライドで１６時間処理して、目的のプローブを収率１０％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
反応式１：蛍光発生プローブの反応機構
プローブの２，４－ニジトロベンゼンスルホンアミド基がチオールとの反応により切断されてローダミンが生成し、蛍光シグナルが生成する。
　上記では、ローダミンを基本骨格とする緑色蛍光プローブを開発した。しかし、イメージングにおいては、より長波長側の蛍光、つまり赤色蛍光化合物が有用である。そこで、クレシルバイオレット（CV）を基本骨格とする赤色蛍光プローブ（DNｓ-CV）を設計した(式１Ａ)。このプローブは、CVの一つのアミノ基をジニトロベンゼンスルホニル(DNs)基で保護するだけで消光する。そして、チオール類が存在すると求核置換反応によって保護基であるDNsが除去され、蛍光が発生する。このプローブは、クレシルバイオレットに、KOt-BuとClSO2Ph(NO2)2 を加えて、反応させることによって製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
反応式２：蛍光発生プローブの反応機構
プローブの２，４－ニジトロベンゼンスルホンアミド基がチオールとの反応により切断されてクレシルバイオレットが生成し、蛍光シグナルが発生する。
　本発明の化合物は、下記式（１）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
　好ましくは、本発明の化合物は、下記式（１Ａ）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　本発明の化合物（プローブ）は、下記式（２）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）
　好ましくは、本発明の化合物は下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　本発明において、炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基を挙げることができる。
　本発明において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を挙げることができる。
　本発明において、アリール基としては、フェニル基、又はナフチル基を挙げることができる。
　本発明において、酸素原子を含む基としては、－Ｏ－、又は－ＯＣＯ－などを挙げることができる。
　本発明の式（１）で示される化合物（式（１Ａ）で示される化合物も含まれる）または本発明の式（２）で示される化合物（式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で示される化合物も含まれる）を、チオール基を有する化合物と反応させると、上記反応式１の反応により蛍光を発する。従って、例えば、細胞を上記化合物と一緒にインキュベートし、細胞の蛍光画像を取得することにより、細胞内におけるチオールの局在を調べることが可能である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（実施例Ａ）
合成例Ａ１：本発明のプローブの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ＤＭＦ（2ml）中のローダミン110（110.9mg, 0.28mmol）溶液に、ＴＨＦ（2ml）中のKOt-Bu（92.2mg, 0.82mmol, 3eq）溶液を０℃で滴下した。３０分後、反応液に、2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride（220.2mg, 0.83mmol, 3eq）を添加した。室温で２時間後、反応液に、2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride（223mg, 0.84mmol, 3eq）を添加した。１６時間後、反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で分液した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して上記化合物２（20.7mg, 0.03mmol, 10％）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 8.47-8.46 (d, 2H, J= 2.2), 8.37-8.34 (dd, 2H, J= 2.2, 11.0), 8.19-8.17 (d, 2H, J= 8.8), 7.91-7.89 (d, 1H, J= 7.1), 7.61-7.53 (m, 2H), 7.04-7.01 (m, 3H), 6.74-6.72 (dd, 2H, J= 2.2, 11.0), 6.53-6.51 (d, 2H, J= 8.5).
13C-NMR (99.5 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 168.97, 151.38, 149.84, 148.06, 137.38, 135.28, 133.07, 130.11, 129.16, 127.12, 126.62, 125.99, 125.10, 123.58, 120.31, 116.52, 115.68, 108.70.
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI-Q-TOF): [M-H]-C32H17N6O15S2: calcd. 789.0193; Found 789.0176
実施例Ａ１：蛍光測定
（方法）
　反応は、100ｎＭのプローブ（化合物２）と10ｍＭのシステインを用いて、50ｍＭ Tris-HCl(pH7.4)中で３７℃で３０分間行った。蛍光スペクトルは、蛍光スペクトル計（FP-6500; JASCO）により取得した。４９０ｎｍの励起による蛍光を、スキャン範囲４５０－６５０ｎｍで取得した。
（結果）
　蛍光応答を調べるために、（合成例Ａ１で合成した）プローブを、Tris-HCl緩衝液(50 mM, pH 7.4)中で、システインと一緒に、又はシステインなしで、溶液中でインキュベートした。得られた吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを図１に示す。システインなしの溶液は、ＤＮＢ基に由来する５１６ｎｍに最大吸収を示した。システインをプローブ溶液に添加した場合、最大吸収ピークは、ＤＮＢ基の切断により、４９８ｎｍの短波長側にシフトした（図１ａ）。蛍光特性も調べた。４９０ｎｍの励起では有意な蛍光は、システインなしのプローブでは観察されなかった。しかし、溶液にシステインを添加した後では、強い蛍光が５２０ｎｍ付近に生じ、蛍光は約3500倍に増加した（図１ｂ）。
実施例Ａ２：プローブとチオールとの反応性
（方法）
　プローブ（化合物２）と数種のチオールとの反応性を、５２２ｎｍにおける蛍光強度の増加を測定することによって調べた。反応は、１μＭのプローブと1ｍＭのチオールを用いて、50ｍＭ Tris-HCl(pH7.4)中で３７℃で３０分間行った。
　また、比較例として、下記式　（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 を有する化合物をプローブとして用いて、上記と同様に反応性を調べた。
（結果）
　本プローブを生物学的チオールの検出に応用する際には、選択性は重要な問題である。プローブはチオールに特異的に応答し、他の生物学的物質に対するシグナルを生成すべきではない。選択性を調べるために、プローブを幾つかの生物学的物質で処理し、蛍光シグナルを測定した。チオールに対するプローブの選択性は、生理条件下で生体関連物質を用いて５２２ｎｍの蛍光をモニターすることによって検証した。図２に示す通り、有意な蛍光強度の増加が、システイン、ホスホロチオエート、ジチオトレイトール及びグルタチオンについて観察された(５０～２００倍)。しかしながら、２－メルカプトエタノール（ＭＥ）との反応は、蛍光強度の増加は僅かであった (１１倍)。２－メルカプトエタノールのpKa値は、他のチオールの値よりも高い値である９．５である。従って、ＤＮＢ基との反応は遅いはずである。予想通り、プローブは、グリシン、アスコルビン酸又は過酸化水素などの他の生物学的物質に対して活性を示さなかった。 本プローブは、生物学的環境において非常に安定であった。例えば、プローブを50 mM Tris 緩衝液(pH 7.4)中で55℃で24時間加熱した後でも、蛍光シグナルの増加は検出されなかった。以上より、本発明のプローブは、生物学的チオールに対する優れた選択性を示し、不要な蛍光シグナルは生じないことが確認された。
　また、比較のために用いた式（３）の化合物の場合、ホスホロチオエートとのみ反応し(約950倍)、それ以外のチオール基とは反応が見られなかった（図４）。
実施例Ａ３：蛍光顕微鏡観察
（方法）
　生細胞試験のために、HeLa細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下においてＭＥＭ中で生育させた。細胞を、２５μＭのプローブ（化合物２）（1:100 DMSO/PBS(-), v/v）の存在下で３７℃で１５分間インキュベートした。コントロール実験として、細胞をPBS(-)中の1mM N－メチルマレイミドで３７℃で６０分間処理し、PBS(-)緩衝液で３回洗浄した後、細胞を２５μＭのプローブ（1:100 DMSO/PBS(-), v/v）の存在下で３７℃で１５分間インキュベートした。
　蛍光画像は、デジタルカメラ（Cool Snap HQ; Roper Scientific）及び画像ソフトウエア（MetaMorph; Molecular Devices）を用いて、水銀ランプを備えた蛍光顕微鏡（Axiovert 200M; Carl Zeiss）により取得した。顕微鏡の設定は、以下の通りである。励起；470/40 バンドパスフィルター, 発光; 525/50 バンドパスフィルター, 照射時間300 msec.
（結果）
　本発明のプローブの最も重要な用途は、生細胞のチオールのモニタリングである。この可能性を調べるために、HeLa細胞中の生物学的チオールを画像化することを試みた。明視野像及び蛍光画像の写真を蛍光顕微鏡で撮った結果を図３に示す。本発明のプローブ（25μＭ）と一緒に１５分間インキュベートした場合、細胞は有意な蛍光シグナルを示した（図３ｄ）。強いシグナルは細胞質に局在していた。一方、核は弱い蛍光シグナルを示した。対照的に、細胞をチオールブロッキング剤であるＮ－メチルマレイミドで前処理してから本発明のプローブで同様にインキュベートした場合には、蛍光シグナルは観察されなかった（図３ｂ）。この結果より、本発明のプローブは細胞膜を浸透し、生細胞のチオール量の変化を画像化できることが示された。即ち、本発明の蛍光プローブは、チオールに応答したシグナルを生成でき、生細胞内の生物学的チオールのイメージングに応用可能である。
（実施例Ｂ）
合成例Ｂ１：本発明のプローブの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　クレシルバイオレット ( 250 mg, 0.691 mmol ) をDMF 7mLに溶解し、氷冷した。そこに、THF 1mL に溶解した KOt-Bu ( 155 mg, 1.38 mmol ) を滴下し、アルゴン雰囲気下1時間撹拌した後、ClSO2Ph(NO2)2 ( 368 mmol, 1.38 mmol ) を加え、1時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水、水で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧蒸留により溶媒を除去した。残渣をシルカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物４ ( 30 mg, 0.061mmol, 9% )を得た。
　1H-NMR (300 MHz, DMSO ) : δ8.85-8.84( 1H, d, J= 1.3 Hz, Ar ), 8.71-8.69 ( 1H, d, J=8.0 Hz, Ar ) 8.60-8.57 ( 1H, d, J= 10.6 Hz, Ar ) 8.45-8.43 ( 1H, d, J= 8.76 Hz, Ar ) 8.36-8.34 ( 1H, d, J= 8.1 Hz, Ar ) 7.89-7.71 ( 5H, m, Ar) 7.19 ( 1H, s, Ar ) 7.03-7.00 ( 1H, d, J=11.0 Hz, Ar ) 6.76-6.75 ( 1H, d, J=2.2 Hz, Ar )
13C-NMR (99.5 MHz, DMSO ) : δ174.22, 163.10, 158.89, 151.77, 150.20, 148.64, 147.27, 139.76, 133.99, 133.22, 131.75, 131.45, 130.48, 129.40, 127.26, 125.50, 123.44, 122.66, 120.03, 117.49, 99.42, 97.17
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI-Q-TOF): [M+H]+ C22H14IN5O7S : calcd. 492.0608; Found 492.0604.
実施例Ｂ１：溶液中での蛍光測定
（方法）
　プローブ（化合物４）100 nM とGSH 10 mM を50 mM Tris-HCl(pH 7.4)中で37℃、30分間反応させた後、分光蛍光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて測定を行った(励起波長540 nm) 。
（結果）
　合成したプローブ（化合物４）の蛍光特性をGSH（Glutathione）と反応させることにより検討した。540nmの励起光で蛍光スペクトルを測定したところ、DNｓ-CV単体では蛍光を発生しないが、GSHを反応させることでDNs基が脱保護され、620nmに蛍光強度の増加が観察された(図５)。
実施例Ｂ２：フローサイトメトリー
（方法 ）
　HL60にプローブ（化合物４）100 μMを加え、37℃、15分間反応させた後、フローサイトメトリーにより測定をおこなった。HL60にチオール類のブロッキング剤であるN-メチルマレイミド(N-MMI)1mMを加え、37℃、30分間反応させた後、プローブ100 μMを加え、37℃、15分間反応させフローサイトメトリーにより測定を行った。
（結果）
　フローサイトメトリーを用いて、DNｓ-CVによる生細胞内でのGSHの定量を試みた結果を図６に示す。HL60 細胞をGSHのブロッキング剤であるN-メチルマレイミド（N-MMI）で処理した後にDNｓ-CVを導入したもの（+N-MMI）よりも、細胞にDNｓ-CVのみを導入した方(-N-MMI)が、蛍光強度が高かった。本プローブ（化合物４）では、定量的な測定が可能であった。この結果は、DNｓ-CVが選択的に生細胞内GSHと反応し蛍光を発生することを示している。以上の結果から、新規蛍光化合物であるDNｓ-CVは、有用な細胞内GSH活性検出剤であることが明らかとなった。
図１ａは、20 mM Cysあり（実線）及びなし（点線）での50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中の20 μMプローブの吸収スペクトルを示し、図１ｂは、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中で３７℃で３０分間インキュベーションした後の、10 mM Cysあり（実線）及びなし（点線）での100 nMプローブの蛍光スペクトルを示す。蛍光は、490nmの励起でモニターした。 図２は、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中において１ｍＭのチオールの存在下における１μＭのプローブの蛍光強度を示す。チオールの添加後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。５２２ｎｍの蛍光を、４９０ｎｍでの励起によりモニターした。３’－thio dT は ３’－ホスホロチオエート－２’－デオキシチミジン；ＤＴＴはジチオトレイトール；ＧＳＨはグルタチオン、Ｌ－GlyはＬ－グリシン、Vcはアスコルビン酸を示す。 図３は、HeLa細胞の蛍光画像を示す。 (a, b)Ｎ－メチルマレイミド(1 mM)で37℃で60分間前処理してから、プローブ(25 μM)と一緒に37℃で15分間インキュベートした細胞のコントロール画像； (c, d) プローブ(25 μM)と一緒に37℃で15分間インキュベートした細胞の画像； (a, c) 明視野像； (b, d) 蛍光画像：　顕微鏡の設定は以下の通りである。励起；470/40 バンドパスフィルター, 発光; 525/50 バンドパスフィルター, 照射時間300 msec. 図４は、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中において１ｍＭのチオールの存在下における１μＭのプローブ（比較用の化合物）の蛍光強度を示す。チオールの添加後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。５２２ｎｍの蛍光を、４９０ｎｍでの励起によりモニターした。３’－thio dT は ３’－ホスホロチオエート－２’－デオキシチミジン；ＤＴＴはジチオトレイトール；ＧＳＨはグルタチオン、Ｌ－GlyはＬ－グリシン、Vcはアスコルビン酸を示す。 図５は、プローブ（化合物４）100 nM とGSH 10 mM を50 mM Tris-HCl(pH 7.4)中で37℃、30分間反応させた後、分光蛍光光度計を用いて測定を行った(励起波長540 nm)結果を示す。 図６は、HL60にプローブ（化合物４）100 μMを加え、37℃、15分間反応させた後、フローサイトメトリーにより測定を行った結果を示す。

Claims (9)

  1. 下記式（１）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
  2. 下記式（１Ａ）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  3. 下記式（２）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）
  4. 下記式（２Ａ）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
  5. 下記式（２Ｂ）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  6. 請求項１から５の何れかに記載の化合物を含むチオール検出試薬。
  7. 請求項１から５の何れかに記載の化合物とチオール基を有する化合物とを反応させることによって生成する蛍光を検出することを含む、チオールの検出方法。
  8. 請求項１から５の何れかに記載の化合物とチオール基を有する化合物との反応を細胞内で行う、請求項７に記載のチオールの検出方法。
  9. チオール基を有する化合物が生体分子である、請求項７又は８に記載のチオールの検出方法。
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