JP6150297B2

JP6150297B2 - 蛍光発色剤、蛍光発色剤を含むイオン濃度センサー、蛍光発色剤を含む試薬、試薬を備える試薬キットおよび蛍光発色剤の合成方法

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Publication number: JP6150297B2
Application number: JP2013503619A
Authority: JP
Inventors: 康祐難波; 歩大澤; 圭持谷野
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC
Priority date: 2011-03-10
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2017-06-21
Anticipated expiration: 2032-03-08
Also published as: JPWO2012121356A1; CN103443101A; WO2012121356A1; US20140005410A1; EP2684881B1; EP2684881A4; EP2684881A1; US9222016B2

Description

本発明は、蛍光発色団を有する化合物、化合物を含むイオン濃度センサー、化合物を含む試薬、試薬を備える試薬キット、化合物の前駆体、および化合物の合成方法に関する。

有機ＥＬ素子などの発光性材料、バイオイメージングを用いた様々な生体関連的基礎研究、医療診断の現場に至るまで、蛍光性分子は様々な研究分野や産業に幅広く用いられており、現代科学技術の根幹を支える重要な化合物群である。

蛍光性分子はその用途に応じて、様々な特徴や機能が求められる。そのため、新たな特徴や機能を有する蛍光性化合物の創製が常に必要とされており、これらの蛍光分子の開発によって、様々な基礎研究や産業の発展が強力に推進される。

これまでに数多くの蛍光分子が開発されており、クマリンやアクリジンの様々な誘導体等が用いられている。また、生体関連的基礎研究などではＴＡＭＲＡ（ＣＡＳ登録番号：１５０３２２−０６−８）などが用いられている。

また、Ｓａｌｖｉらがペンタレンの一種である１，３，５−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルペンタレンが蛍光分子であることを報告している(非特許文献１)。

特開２００３−６８４６４号公報

Ａ．Ｆａｌｃｈｉ，Ｃ．Ｇｅｌｌｉｎｉ，Ｐ．Ｒ．Ｓａｌｖｉ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９８，１０２，５００６−５０１２Ｈ．Ｋｏｇａ，Ｍ．Ｈｉｒｏｂｅ，Ｔ．Ｏｋａｍｏｔｏ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９７８，Ｎｏ．１５，ｐｐ．１２９１−１２９４Ｏ．Ｔｓｕｇｅ，Ｈ．Ｓａｍｕｒａ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９７３，ｐｐ．１７５−１８０Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｏ．ＳｈｉｍｏｍｕｒａＣｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９７４，ｐｐ．９５１−９５４Ｉ．Ｍ．ＭｃＲｏｂｂｉｅ，Ｏ．Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ，Ｈ．Ｓｕｓｃｈｉｔｚｋｙ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９７６，Ｎｏ．１２，ｐｐ．９２５−９２８

これまでに数多くの蛍光分子が開発され、様々な分野に用いられているが、既存の蛍光分子には以下のような課題があった。

蛍光分子として機能するためには長いπ共役系を有することが必要であり、芳香族官能基が導入されることが多かった。このため非常に大きな（長い）分子のサイズのものが多く、水溶性が低かった。一方、生体関連的基礎研究や水質調査試薬に適用するためには水溶性の高い蛍光分子が望まれていた。

コンパクトな蛍光分子もあるものの、そういった蛍光分子は量子収率が十分ではないものが多かった。一方、細胞内への取り込み実験などの生体関連的基礎研究や医療診断への展開のためには、コンパクトな分子でありながらも、高い量子収率を有する蛍光分子の開発が望まれていた。また、様々な生体活性化合物や機能性化合物に既存の蛍光分子を導入する際の溶媒が制限されることがあった。さらに、期待される吸収・蛍光波長を有する分子を作成するための分子デザインは容易ではなかった。

ペンタレンは、その骨格はコンパクトではあるが、８π電子系の反芳香族化合物であり、非常に不安定な化合物であることが知られており、合成が困難であることが多く、簡便かつ迅速に合成することが可能な蛍光分子が必要とされていた。

たとえば、非特許文献１に記載された１，３，５−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルペンタレンは立体的に嵩高いｔｅｒｔ−ブチル基を３つ導入することで合成されているが、合成は困難であり、なおかつ、嵩高い置換基の存在により、ペンタレン骨格のコンパクトな構造を活用しきれていなかった。

また、特許文献１、非特許文献２〜５に記載されたペンタレン骨格を有する化合物についても、立体的に嵩高い置換基の導入やベンゾ縮環による安定化等を利用して合成されているが、合成プロセスにおける基質の適用範囲が狭い等によって、様々な置換基を有するペンタレン骨格を有する化合物の合成は困難であった。さらに、特許文献１、非特許文献２〜５に記載のペンタレン骨格を有する化合物が蛍光分子であるとの報告はされていない。

本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、蛍光発色団を有する化合物、化合物を含むイオン濃度センサー、化合物を含む試薬、試薬を備える試薬キット、化合物の前駆体を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記化合物の合成方法を提供することを目的とする。

本発明者は鋭意努力の結果、一般式１に示されるトリアザペンタレン骨格が非常に優れた蛍光発色団であることを初めて見出し、また、脱離基を有する有機アジ化物と、アルキンまたはその誘導体と、を、双極子付加環化反応させるトリアザペンタレン骨格の合成方法を見出した。

一般式１

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る化合物は、
蛍光発色団としてトリアザペンタレン骨格を有する。

前記化合物は一般式２

で示される構造を有してもよい。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、同一であっても、異なっていてもよく、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち２つ以上の基が互いに結合して環を形成していてもよい置換基を表す。）

前記Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５のうち少なくとも１つの置換基が電子求引基であってもよい。

前記Ｒ^２の置換基が電子供与基または電子求引基であり、前記Ｒ^４および／またはＲ^５の置換基が電子求引基であってもよい。

前記化合物は一般式３

で示される構成単位を有してもよい。
（式中、Ｒ^８は炭素数２以上の分岐していてもよいアルキレン基、または炭素数６以上の置換基を有していてもよいアリーレン基を表す。）

本発明の第２の観点に係るイオン濃度センサーは、
上記化合物を含む。

本発明の第３の観点に係る試薬は、
上記化合物を含む。

本発明の第４の観点に係る試薬キットは、上記試薬を少なくとも１つ備える。

少なくとも１つの前記試薬の最大蛍光波長が、４００ｎｍ以上４３０ｎｍ以下、４３０ｎｍ超過４８０ｎｍ以下、４８０ｎｍ超過５３０ｎｍ以下、５３０ｎｍ超過２０００ｎｍ以下からなる群から選択される最大蛍光波長であってもよい。

本発明の第５の観点に係る、上記化合物の前駆体は、
一般式４

で表される。
（Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、同一であっても、異なっていてもよい置換基を表す。Ｒ^６およびＲ^７は、同一であっても、異なっていてもよい置換基を表す。）

本発明の第６の観点に係る上記化合物の合成方法は、
脱離基を有する有機アジ化物と、アルキンまたはその誘導体と、を、双極子付加環化反応を促進させる触媒の存在下で、双極子付加環化反応させる工程を含むことを特徴とする。

一般式２

で示される構造を有する化合物を合成する上記化合物の合成方法は、
一般式４

で表される前記有機アジ化物と、
一般式５

で表される前記アルキンまたはその誘導体と、を、双極子付加環化反応を促進させる触媒の存在下で双極子付加環化反応させてもよい。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、同一であっても、異なっていてもよい置換基を表す。また、Ｒ^６およびＲ^７は、同一であっても、異なっていてもよい置換基を表す。）

本発明によれば、蛍光発色団を有する化合物、化合物を含むイオン濃度センサー、化合物を含む試薬、試薬を備える試薬キット、化合物の前駆体を提供することができる。
また、本発明によれば、上記化合物の合成方法を提供することができる。

本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。本発明の実施例の結果を示すグラフ図である。

本明細書における構造式において、立体構造などが特に示されていない場合、本明細書における構造式で表される化合物には、互変異性体、幾何異性体、光学異性体等の各種の立体異性体、およびそれらの混合物が含まれる。

本発明は、蛍光発色団としてトリアザペンタレン骨格を有する化合物に係わる。トリアザペンタレン骨格は一般式１に示される構造を有しており、トリアザペンタレン骨格を有する化合物とは、骨格が、水素や、置換基や他の分子と化学結合した化合物である。
以下、本発明を実施するための形態に係る、蛍光発色団としてトリアザペンタレン骨格を有する化合物およびその合成方法の例として、一般式２で示される構造を有する化合物およびその合成方法について詳細を説明する。

蛍光発色団として一般式２で示される構造を有する化合物およびその合成方法において、一般式２、一般式４、一般式５における置換基（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５）は本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、代表的な置換基（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５）の例としては以下のものが挙げられる。式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、同一であっても、異なっていてもよく、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち２つ以上の基が互いに結合して環を形成していてもよい。ただし、新たに結合して形成された環が芳香性を持たないことが好ましい。また、Ｒ^６およびＲ^７は、同一であっても、異なっていてもよい。また、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３，Ｒ^４および／またはＲ^５が置換基によって置換されず、水素原子であってもよい。

一般式２で示される構造を有する化合物であるトリアザペンタレン類のＲ^１〜Ｒ^５の置換基としては、置換基をさらに有していてもよいメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキル基；置換基をさらに有していてもよいシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などの好ましくは炭素数１〜１８のシクロアルキル基等を例示することができる。

また、一般式２で示される構造を有する化合物であるトリアザペンタレン類のＲ^１〜Ｒ^５の置換基としては、置換基をさらに有していてもよいフェニル基、メトキシフェニル基、メトキシカルボニルフェニル基、メチルエーテルケトンフェニル基、ビフェニル基、シアノフェニル基、ニトロフェニル基、トリル基、キシリル基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリール基；置換基をさらに有してもよいアルデヒド基、メチルケト基などのケト基、カルボキシ基、エステル基、アミド基などの好ましくは炭素数１〜１２のカルボニル基；置換基をさらに有してもよいメチル基やブチル基などの鎖状アルキル基、ベンジル基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキル基；置換基をさらに有してもよいトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基などの好ましくは炭素数３〜１２のシリル基；トリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）基などの好ましくは炭素数１〜１２のハロアルキルスルホネート基；トルエンスルホネート（Ｔｓ）基、ベンゼンスルホネート基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホネート基；メタンスルホネート（Ｍｓ）基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホネート基；アセトキシ等の好ましくは炭素数１〜１２のアルコキシカルボニル基；ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）などを例示することができる。

また、特に、Ｒ^５の置換基としては、置換基を有していないエチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキル基；置換基をさらに有しているメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキル基；置換基をさらに有していてもよいシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などの好ましくは炭素数１〜１８のシクロアルキル基；置換基を有していないメトキシフェニル基、メトキシカルボニルフェニル基、メチルエーテルケトンフェニル基、ビフェニル基、シアノフェニル基、ニトロフェニル基、トリル基、キシリル基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリール基；置換基をさらに有しているフェニル基、メトキシフェニル基、メトキシカルボニルフェニル基、メチルエーテルケトンフェニル基、ビフェニル基、シアノフェニル基、ニトロフェニル基、トリル基、キシリル基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリール基；アルデヒド基、メチルケト基などのケト基、カルボキシ基、エステル基、アミド基などの好ましくは炭素数１〜１２のカルボニル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基などの好ましくは炭素数３〜１８のシリル基；トリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）基などの好ましくは炭素数１〜１２のハロアルキルスルホネート基；トルエンスルホネート（Ｔｓ）基、ベンゼンスルホネート基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホネート基；メタンスルホネート（Ｍｓ）基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホネート基；アセトキシ等の好ましくは炭素数１〜１２のアルコキシカルボニル基；ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）などが挙げられ、なかでも後述する電子求引性を有する置換基であることが好ましい。

トリアザペンタレン骨格上に直接又は間接に導入される置換基は、電子求引性を有することが好ましく、下記に限定されるものではないが、シアノ基、好ましくは炭素数１〜１２のカルボキシル基；ニトロ基；アシル基；好ましくは炭素数２〜１８のアルキルオキシカルボニル基；ハロゲン原子などで置換されてもよい、２−シアノフェニル基、３−シアノフェニル基、４−シアノフェニル基などの好ましくは炭素数６〜３０のシアノフェニル基、メトキシカルボニルフェニル基などの好ましくは炭素数８〜３０のアルコキシカルボニルフェニル基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリール基；好ましくは炭素数７〜３０のアリールオキシカルボニル基；好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホニル基；好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホニル基；好ましくは炭素数１〜１２のハロアルキルスルホネート基；好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホネート基；好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホネート基；好ましくは炭素数２〜１８のエステル基；好ましくは炭素数１〜１８のアミド基、好ましくは炭素数１〜１２のペルフルオロアルキル基、好ましくは炭素数１〜１２のペルフルオロアルキルチオ基、好ましくは炭素数２〜１８のペルフルオロアルキルカルボニル基、置換基をさらに有していてもよい好ましくは炭素数２〜１８のスルホンアミド基、好ましくは炭素数２〜１８のアシルオキシ基、好ましくは炭素数１〜１２のカルバモイル基、好ましくは炭素数２〜１８のアルコキシカルボニル基、好ましくは炭素数２〜１８のジアルキルホスホノ基、好ましくは炭素数１２〜４０のジアリールホスホノ基、好ましくは炭素数１２〜４０のジアリールホスフィニル基、好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルフィニル基、好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルフィニル基、スルホニルオキシ基、好ましくは炭素数１〜１２のアシルチオ基、スルフォモイル基、好ましくは炭素数２〜１８のチオシアネート基、好ましくは炭素数１〜１２のチオカルボニル基、好ましくは炭素数２〜１８のアルコキシカルボニル基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子等を例示できる。本明細書において、電子求引性を有する官能基（電子求引基）とは、ハメットの置換基定数σ_p値が正の値である官能基または原子を指す。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５のうち少なくとも１つが電子求引性を有する官能基であることによって、一般式２で示される構造を有する化合物の蛍光発色の強度を大きくすることができる。また、後述する一般式２で示される構造を有する化合物の合成の収率を高めることができる。

ハロゲン原子で置換された、好ましくは炭素数６〜３０のアリール基としては、ペンタフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基などのフルオロフェニル基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホニル基としては、メシル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホニル基としては、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数１〜１２のハロアルキルスルホネート基としては、トリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホネート基としては、トルエンスルホネート（Ｔｓ）基、ベンゼンスルホネート基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホネート基としては、メタンスルホネート（Ｍｓ）基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数１〜１２のペルフルオロアルキル基としては、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数１〜１２のペルフルオロアルキルチオ基としては、トリフルオロメチルチオ基、ペンタフルオロエチルチオ基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数２〜１８のペルフルオロアルキルカルボニル基としては、トリフルオロアセチル基、ペンタフルオロエチルカルボニル基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数２〜１８のエステル基としては、メチルエステル基、エチルエステル基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数１〜１８のスルホンアミド基としては、スルホンアミド基、ジメチルアミノスルホニル基、ジエチルアミノスルホニル基、ジフェニルアミノスルホニル基等を例示することができる。

また、好ましくは炭素数２〜１８のアルコキシカルボニル基としては、アセトキシカルボニル基等を例示することができる。

さらに、ハメットの置換基定数σ_p値が０．２０以上である電子求引性を有する官能基がより好ましく、下記に限定されるものではないが、アシル基、アシルオキシ基、好ましくは炭素数１〜１２のカルバモイル基、好ましくは炭素数２〜１８のアルコキシカルボニル基、好ましくは炭素数７〜３０のアリールオキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基、好ましくは炭素数２〜１８のジアルキルホスホノ基、ジアールホスホノ基、好ましくは炭素数１２〜４０のジアリールホスフィニル基、好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルフィニル基、好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルフィニル基、好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホニル基、好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホニル基、好ましくは炭素数１〜１２のハロアルキルスルホネート基、好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホネート基、好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホネート基、スルホニルオキシ基、好ましくは炭素数１〜１２のアシルチオ基、スルファモイル基、好ましくは炭素数２〜１８のチオシアネート基、好ましくは炭素数１〜１２のチオカルボニル基等を例示することができる。電子求引性を有する官能基として、ハメットの置換基定数σ_p値が０．２０以上である官能基で置換することによって、一般式２で示される構造を有する化合物の蛍光発色の強度を、より大きくすることができる。また、後述する一般式２で示される構造を有する化合物の合成の収率を、より高めることができる。

また、トリアザペンタレン骨格のマイナス環であるＲ^４および／またはＲ^５の置換基が電子求引基であり、なおかつ、トリアザペンタレン骨格のプラス環であるＲ^１、Ｒ^２および／またはＲ^３が電子供与基または電子求引基で置換されることが好ましく、Ｒ^４およびＲ^５の置換基が上述の電子求引基であり、なおかつ、Ｒ^２が電子供与基または電子求引基で置換されることがより好ましい。この場合、Ｒ^１および／またはＲ^３は置換されてもよいし、置換されなくてもよい。さらに、Ｒ^５の置換基が上述の電子求引基であり、なおかつ、Ｒ^２の置換基が電子供与基または電子求引基であることが、より一層好ましい。この場合、Ｒ^１、Ｒ^３および／またはＲ^４は、置換されてもよいし、置換されなくてもよい。さらに、Ｒ^５の置換基が上述の電子求引基であり、なおかつ、Ｒ^２の置換基が電子供与基であることも、より一層好ましい。本明細書において、電子供与性を有する官能基（電子供与基）とは、ハメットの置換基定数σ_p値が負の値である官能基または原子を指す。

Ｒ^４および／またはＲ^５の置換基が電子求引基であり、なおかつ、Ｒ^２の置換基が電子供与基であることによって、Ｒ^４および／またはＲ^５の電子求引基の作用で、一般式２で示される構造を有する化合物の蛍光発色の色を調節しつつ、Ｒ^２の電子供与基とＲ^４および／またはＲ^５の電子求引基との間のＰｕｓｈ−Ｐｕｌｌ効果によって、一般式２で示される構造を有する化合物の蛍光発色の強度を、より高めることができる。すなわち、蛍光の検出力を、より高めることができる。

上述の電子供与基は、本実施形態の効果を奏する範囲で適宜選択され、以下に限定されるものではないが、たとえば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などの好ましくは炭素数１〜１８のシクロアルキル基；メトキシ基、エトキシ基、ブトキシ基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルコキシ基；フェニル基、メトキシフェニル基、メトキシカルボニルフェニル基、メチルエーテルケトンフェニル基、ビフェニル基、トリル基、キシリル基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリール基；アミノ基、置換基をさらに有していてもよいアシルオキシ基、カルバモイル基、スルホニルオキシ基、アシルチオ基、スルフォモイル基等の好ましくは炭素数１〜３０の酸素、硫黄、窒素等のヘテロ原子を含む官能基等を例示できる。

また、Ｒ^４および／またはＲ^５の置換基が電子求引基であり、なおかつ、Ｒ^２の置換基が電子求引基であることによって、Ｒ^４および／またはＲ^５の電子求引基の作用で、一般式２で示される構造を有する化合物の蛍光発色の色を調節しつつ、Ｒ^２の電子求引基によって一般式２で示される構造を有する化合物の蛍光波長を短波長側にシフトさせることが可能となり、Ｒ^２およびＲ^５の両方の電子求引基によって、蛍光波長および蛍光色を調節することができる。

一般式４で示される構造を有する化合物の置換基（Ｒ^６、Ｒ^７）は本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、代表的な置換基（Ｒ^６、Ｒ^７）としては、トリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）基などの好ましくは炭素数１〜１２のハロアルキルスルホネート基、トルエンスルホネート（Ｔｓ）基、ベンゼンスルホネート基などの好ましくは炭素数６〜３０のアリールスルホネート基、メタンスルホネート（Ｍｓ）基などの好ましくは炭素数１〜１２のアルキルスルホネート基、アセトキシ等の好ましくは炭素数２〜１８のアルコキシカルボニル基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）などを例示することができる。また、Ｒ^６および／またはＲ^７が置換されず、水素原子であってもよい。

一般式２で表される本発明の化合物は、下記反応式（１）に記載の方法により合成することができる。

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７は、一般式２、一般式４、一般式５と同じ意味を表す］
反応式（１）において、一般式４で示される構造を有する化合物（前駆体）と、一般式５で表されるアルキンまたはその誘導体と、を、溶媒中、塩基の存在下、双極子付加環化反応を促進する触媒の存在下、および、無リガンドもしくはリガンドの存在下で双極子付加環化反応させることにより、一般式２で示される構造を有する化合物を合成することができる。双極子付加環化反応とは、分子内に正と負の両電荷を有する分子（双極子）が不飽和結合に付加して新たな炭素環をつくる反応である。

反応式（１）で表される反応に用いられる溶媒は、本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、特に一般式２、一般式４および一般式５と反応しない限り、下記に限定されるものではないが、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、ジオキサン等のエーテル類、水、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ｔｅｒｔ−ブタノールやイソプロパノール等のアルコール類、水等を例示することができる。

反応式（１）で表される反応に用いられる塩基は、本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、たとえば、塩基性含窒素有機化合物を用いることができる。上記塩基性窒素含有有機化合物として、トリエチルアミン等のアルキルアミン類、ルチジン、ピリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、１，８− ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）等を例示することができる。また、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、および炭酸セシウム等の弱塩基性の無機塩基を用いることもできる。これらの塩基の使用量は特に制限されるものではなく、上記有機塩類を用いた場合には溶媒として使用することができる。

反応式（１）で表される反応に用いられる触媒は、本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、たとえば、銅触媒、例えば、単体の銅、ヨウ化銅（Ｉ）、塩化銅（Ｉ）、酸化銅（Ｉ）、臭化銅（Ｉ）トリストリフェニルホスフィン錯体、トリフルオロメタンスルホン酸銅（Ｉ）ベンゼン錯体等、および、ルテニウム触媒等の双極子付加環化反応を促進する触媒を例示することができる。ここで、ルテニウム触媒を用いた場合には、銅触媒を用いた場合と比べて、一般式２に示す構造におけるＲ^４の位置とＲ^５の位置とが逆になる。

反応式（１）で表される反応に用いられるリガンドは、溶液中で触媒がより均一になるよう、本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、特に一般式２、一般式４および一般式５と反応しない限り、下記に限定されるものではないが、たとえば、アミノアルコールやジアミンなどの多座配位型のアミン類等を用いることができる。多座配位型のアミン類として、下記に限定されるものではないが、ビス［２−（ジメチルアミノ）エチル］エーテル、Ｎ，Ｎ’−テトラメチルペンタン−１，５−ジアミン、５−ジメチルアミノ−１−ペンタノール等を例示することができる。

上記反応の反応温度および反応時間は本発明の目的に添う範囲で適宜選択され、反応はたとえば−２０℃〜６０℃で行うことができ、１０℃〜４０℃が好ましく、１５℃〜２５℃がより好ましい。また、反応時間はたとえば０．５時間〜１０時間とすることができ、０．５時間〜５時間が好ましく、１時間〜３時間がより好ましい。

上記反応の反応雰囲気は本発明の目的に添う範囲で適宜選択され、たとえば、ヘリウム、アルゴンなどの希ガス類、または窒素ガスなどの不活性ガスを用いることができる。また、空気中で反応させてもよい。

反応式（１）の一般式４で示される構造式を有する化合物（前駆体）は、たとえば、以下のように合成することができる。

まず、市販されているクロロプロパンジオールなどのハロゲン化アルコールを、たとえば、５０℃以上１５０℃以下の温度で、市販されているアジ化ナトリウム、４−ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４−アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、ジフェニルリン酸アジド、トリメチルシリルアジドなどのアジド化合物とＳ_Ｎ２置換反応させることによって化合物（アジ化アルコール）を得る（アジド化）。次に、生成されたアジ化アルコールを、たとえば、ドライアイス（登録商標）−アセトン冷媒等を用いて、−１００℃以上−１０℃以下の温度で、市販されている無水トリフルオロメタンスルホン酸などの有機スルホン酸とトリフラート化反応させる方法によって一般式４で示される構造式を有する化合物を合成することができる。

反応式（１）の一般式５で表されるアルキンまたはその誘導体は、市販されているもの以外は、アルケンまたはその誘導体の部分酸化などにより合成することができる。アルキンまたはその誘導体は、本発明の効果を奏する範囲で適宜選択され、内部アルキンまたはその誘導体でも末端アルキンまたはその誘導体でもよく、下記に限定されるものではないが、アセチレン、プロピン、フェニルアセチレン、ジフェニルアセチレン、プロピオール酸メチル、ニトロフェニルアセチレン、メトキシフェニルアセチレン、シアノフェニルアセチレン、メトキシカルボニルフェニルアセチレン等を例示することができる。

トリアザペンタレン骨格を有する化合物は、窒素上の非共有電子対の効果によって１０π電子系の芳香族化合物となるため、安定な化合物である。また、コンパクトな構造でありながら強い蛍光を発する蛍光分子であり、水溶性を有し、蛍光性を有する官能基を簡便に導入することができ、また、溶媒を変えることによっても蛍光波長を調節することが可能であり、簡便に効率よく合成することができるという多くの特性を兼ね備えた新しい蛍光分子である。そのため、一つの蛍光発色団で様々な波長領域での発光を可能にするトリアザペンタレン骨格を有する化合物によって、波長調節型の蛍光分子を提供することができる。

すなわち、本発明に係る蛍光発色団を有する化合物は、従来の蛍光分子と比較して、蛍光発色団としての基本構造が極めてコンパクトでありつつ、高い量子収率を有するため、蛍光の検出限界を大きく向上させることができる。

また、本発明に係る蛍光発色団を有する化合物はトリアザペンタレン骨格を有するため、吸収波長と蛍光波長との間の差（ストークスシフト）が大きい。そのため、本発明に係る蛍光発色団を有する化合物に光を当てる際、当てた光（バックグランド光）の波長と、検出される蛍光波長との間との差が大きくなるため、バックグラウンド光の色と検出される蛍光色とが重複しにくくなり、蛍光色をより明確に捉えることが可能となる。特に、本発明に係る蛍光発色団を用いることによって、たとえば、５００ｎｍを超える蛍光波長においても、たとえば、１００ｎｍ以上のストークスシフトを得ることが可能となり、また、たとえば、ニトロ基等のような光を吸収する傾向のある置換基を有する場合であっても、明確な蛍光を得ることができる。

また、本発明に係る蛍光発色団を有する化合物は、分子内に双性イオンを有するトリアゾリウムイオン構造を有するため、有機溶媒と水との両方に溶解性を示す両親媒性を有する。そのため、水溶液中で用いることができる。それゆえ、生体関連機能の研究に用いる際などに、より自然な形での蛍光観察が可能となる。

また、本発明に係る蛍光発色団を有する化合物は、蛍光クリック反応によって、水を含む種々の溶媒中で、一段階で容易に導入することが可能である。すなわち、蛍光クリック反応によって生じるトリアゾール環自体が蛍光基となるために、他の標識基や機能性分子との連結を行いながら、同時に蛍光標識基を導入することも可能である。

本実施形態に係る蛍光発色団を有する化合物においては、置換基Ｒ^１〜Ｒ^５の電子状態の違いによって、容易に蛍光波長を変化させる事ができる。本実施形態に係る蛍光分子はコンパクトな構造の中に大きな双極子モーメントを有しており、これが置換基（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５）と直結しているために、置換基（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５）の電子状態の変化によって、容易に遷移モーメントの変化を及ぼすことができる。すなわち、置換基（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５）を変えることによって、蛍光波長を容易に変化させることができる。加えて、溶媒の種類を変えることによって溶媒の極性を変化させて、上記化合物の蛍光波長を容易に変化させることができる。

本実施形態に係る蛍光発色団を有する化合物においては、置換基のハメット定数によって蛍光波長を予測することができる。そのため、蛍光発色団（トリアザペンタレン骨格）を変えることなく置換基を変えるだけで、同じ蛍光発色団を用いて、蛍光発色団を有する化合物の蛍光波長を設計し、蛍光色を調節することができる。それゆえ、蛍光発色団を有する化合物自体の物性や生物活性などをほとんど変えることなく（すなわち、各蛍光色において蛍光発色団を有する化合物の挙動をほとんど変えることなく）、蛍光色に合わせた分子設計を容易に行うことができる。一方、従来は、蛍光発色団自体を変えることによって蛍光色を調節していたため、蛍光色に合わせた分子設計は大変困難であり、なおかつ、化合物自体の物性や生物活性などが変わってしまうことがあった。

本実施形態においては、たとえば、３−クロロ−１，２−プロパンジオールなどの市販されている安価な化合物から２段階で容易に導かれるアジド化合物（前駆体）との反応によって、種々の置換基を有するトリアザペンタレン骨格を有する蛍光分子を、容易に、高い収率で合成することができる。そのため、様々な化合物への導入も容易であり、本発明に係る蛍光発色団を有する化合物を多くの分野に活用することができる。

本発明に係る化合物の蛍光分子は分子内に双性イオンを有するため、外部環境の変化を受けやすく、顕著なソルバトクロミック蛍光を示すことが可能である。そのため、周囲の極性の違いによって発光色の変化が観察されることから、細胞内等での蛍光発色団を有する化合物の局在化を発光色の変化によって知ることができる。従来のソルバトクロミック蛍光分子は上述のように分子サイズが大きいものが多く、細胞内への取り込みが難しいことがあったが、本実施形態に係る蛍光分子は構造が小さいため、細胞内に取り込むことが容易である。ゆえに、本実施形態に係る蛍光分子を試薬として用いることができる。試薬の用途は、本発明の効果を奏する範囲で適宜選択され、以下に限定されるものではないが、ケミカルバイオロジー、医療診断、細菌検出などに用いる生化学系試薬等を例示することができる。

また、本実施形態に係る試薬を組み合わせて試薬キットとして用いることもできる。すなわち、本実施形態においては、置換基を変えることで蛍光波長を調節できるため、置換基を変えることで様々な蛍光色を発する複数の試薬を作製し、本実施形態に係るそれらの複数の試薬、複数の試薬を溶解する溶解液、溶媒、他の試薬などを組み合わせることで試薬キットとして用いることができる。試薬キットに用いられる試薬の最大蛍光波長は、本実施形態の効果を奏する範囲で適宜選択され、以下に限定されるものではないが、たとえば、４００ｎｍ以上４３０ｎｍ以下の最大蛍光波長（青色の蛍光色）、４３０ｎｍ超過４８０ｎｍ以下の最大蛍光波長（緑色の蛍光色）、４８０ｎｍ超過５３０ｎｍ以下の最大蛍光波長（黄色の蛍光色）、５３０ｎｍ超過２０００ｎｍ以下の最大蛍光波長（赤色の蛍光波長）からなる群から選択され、それらのうち少なくとも１つの範囲内の最大蛍光波長を有する試薬を、本実施形態に係る試薬キットが備えていればよい。すなわち、本実施形態に係る試薬キットは、上記の４つの範囲の蛍光波長を有する本実施形態に係る試薬を１つだけ含んでもよいし、４つの範囲の蛍光波長を有する本実施形態に係る試薬のうちの２つを含んでもよいし、３つを含んでもよいし、４つを含んでもよい。たとえば、本実施形態に係る試薬キットは、４１５ｎｍの蛍光波長を有する本実施形態に係る試薬のみを含んでもよいし、４２０ｎｍの蛍光波長を有する本実施形態に係る試薬と、４５０ｎｍの蛍光波長を有する本実施形態に係る試薬と、５００ｎｍの蛍光波長を有する本実施形態に係る試薬と、５５０ｎｍの蛍光波長を有する本実施形態に係る試薬とを含んでもよい。

なお、本発明は上記実施の形態に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。

たとえば、本実施形態においては、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格において、一般式２で示されるようなＲ^１〜Ｒ^５の置換基で置換される形態について説明したが、本発明の効果を奏する範囲で、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格には置換基以外が結合してもよく、下記に限定されるものではないが、たとえば、ムギネ酸類等の金属キレート剤、シデロフォア、核酸、アミノ酸、テルペン、アルカロイド、ポリエーテル、ポリフェノール等の生物活性物質や、カリックスアレーン、ロタキサン、ポルフィリン、デンドリマー等の機能性分子、リン脂質、糖鎖、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質、天然や合成由来のポリマーなどの高分子等の分子等が結合してもよい。また、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格にベンゼン環などの芳香環が縮環してもよい。

また、本実施形態においては、Ｒ^１〜Ｒ^５の置換基が、一般式２で示される構造を有する化合物の合成段階で置換される形態について説明したが、上記化合物が合成された後にＲ^１〜Ｒ^５の置換基が置換されてもよい。また、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物の合成段階で前述の生物活性物質等の物質や、機能性分子や高分子等の分子等を結合させてもよいし、トリアザペンタレン骨格を有する化合物が合成された後に結合させてもよい。

また、本実施形態においては、一般式４で示される構造を有する化合物と、一般式５で示されるアルキンまたはその誘導体と、を、溶媒中、塩基の存在下、双極子付加環化反応を促進させる触媒の存在下、反応させることによって化合物を合成する形態について説明したが、脱離基とアジ基とを有する有機アジ化物と、アルキンまたはその誘導体と、を双極子付加環化反応を促進させる触媒の存在下、双極子付加環化反応させることによって一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物を合成できればよい。脱離基を有する有機アジド化合物は、本発明の効果を奏する範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、たとえば、トリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）基などのハロアルキルスルホネート基、トルエンスルホネート（Ｔｓ）基、ベンゼンスルホネート基などのアリールスルホネート基、メタンスルホネート（Ｍｓ）基などのアルキルスルホネート基と、たとえば、ムギネ酸類等の金属キレート剤、シデロフォア、核酸、アミノ酸、テルペン、アルカロイド、ポリエーテル、ポリフェノール等の生物活性物質や、カリックスアレーン、ロタキサン、ポルフィリン、デンドリマー等の機能性分子、リン脂質、糖鎖、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質、天然や合成由来のポリマーなどの高分子等の分子等を含む有機アジド化合物等を例示することができる。

本明細書において、「脱離基」とは、有機アジ化物とアルキンまたはその誘導体との反応において放出される原子または置換基のことをいい、本発明の効果を奏する範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、たとえば、トリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）基などのハロアルキルスルホネート基、トルエンスルホネート（Ｔｓ）基、ベンゼンスルホネート基などのアリールスルホネート基、メタンスルホネート（Ｍｓ）基などのアルキルスルホネート基、アセトキシ等のアルコキシカルボニル基、およびハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）などを例示することができる。

また、一般式２で示される構造を有する化合物のＲ^４もしくはＲ^５が、一般式３で示される環状の構成単位を有する置換基であってもよい。以下、Ｒ^４もしくはＲ^５の置換基が一般式３で示される環状の構成単位を有する化合物について説明する。一般式３において、ｎは整数を表し、Ｒ^８は炭素数２以上の分岐していてもよいアルキレン基、または炭素数６以上の置換基を有していてもよいアリーレン基を表す。

一般式３で表される環状の構成単位を有するＲ^４もしくはＲ^５は、本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、たとえば、ベンゾクラウンエーテル類やアルキルクラウンエーテル類等のクラウンエーテル類を例示することができる。

ベンゾクラウンエーテル類としては、ベンゾ−１８−クラウン６−エーテル、ベンゾ−１５−クラウン５−エーテル、ベンゾ−１２−クラウン４−エーテル等を例示することができる。

アルキルクラウンエーテル類としては、メチル−１８−クラウン６−エーテル、メチル−１５−クラウン５−エーテル、メチル−１２−クラウン４−エーテルなどのメチルクラウンエーテル類、エチル−１８−クラウン６−エーテル、エチル−１５−クラウン５−エーテル、エチル−１２−クラウン４−エーテルなどのエチルクラウンエーテル類等を例示することができる。

一般式２で示される構造を有する化合物のＲ^４もしくはＲ^５の官能基が一般式３で示される環状の構成単位を有する化合物は、たとえば、以下の反応式（２）のように合成することができる。

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７は、一般式２と同じ意味を表す。置換基Ｒ^８は炭素数２以上の分岐していてもよいアルキレン基、または炭素数６以上の置換基を有していてもよいアリーレン基を表す。Ｘは置換基を表す。］
たとえば、反応式（２）に示すように、一般式６で表される、エチニル基と、置換基Ｘと、置換基Ｒ^８とを分子内に有するクラウンエーテル化合物を、一般式４で表される構造を有する化合物（前駆体）と、溶媒中、塩基の存在下、触媒の存在下で反応させることによって、一般式７で表される、蛍光発色団としてのトリアザペンタレン骨格を有する蛍光分子を有する化合物が合成される。置換基Ｘは、本発明の目的に添う範囲で適宜選択され、下記に限定されるものではないが、水素、メチル基、フェニル基、トリメチルシリル基等を例示することができる。

反応式（２）で表される反応に用いられる溶媒、塩基、触媒、反応温度、および反応時間は、本発明の目的に沿う範囲で適宜選択され、たとえば、反応式（１）と同様とすることができる。

反応式（２）の一般式４で示される構造を有する化合物は、反応式（１）の一般式４で示される構造を有する化合物と同様に合成することができる。

Ｒ^４またはＲ^５の置換基が一般式３で示される環状の構成単位を含む、一般式２で示される構造を分子内に有する化合物は、金属イオンが添加されることによって蛍光強度が増大する。そのため、Ｒ^４またはＲ^５の置換基が一般式３で示される環状の構成単位を含む、一般式２で示される構造を分子内に有する化合物をイオン濃度センサーとして用いることができる。

本実施形態に係る、Ｒ^４またはＲ^５の置換基が一般式３で示される環状の構成単位を含む、一般式２で示される構造を分子内に有する化合物は分子内に双性イオンを有するため、たとえば水溶液中におけるイオン濃度センサーとしての高い機能を有することができる。

同様に、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物に、一般式３で示される環状の構成単位を含む、生物活性物質等の物質や、機能性分子や高分子などの分子が結合してもよく、同様に、一般式３で示される環状の構成単位を含む、一般式１で示される構造を分子内に有する化合物は、金属イオンが添加されることによって蛍光強度が増大する。そのため、一般式３で示される環状の構成単位を含む、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物をイオン濃度センサーとして用いることができる。また、同様に、一般式３で示される環状の構成単位を含む、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物は分子内に双性イオンを有するため、たとえば水溶液中におけるイオン濃度センサーとしての高い機能を有することができる。

また、一般式３で示される環状の構成単位を含まない、一般式１で示されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物や、一般式２で示される構造を分子内に有する化合物をイオン濃度センサーとして用いてもよい。この形態においても、上記化合物群は分子内に双性イオンを有するため、たとえば水溶液中におけるイオン濃度センサーとしての高い機能を有することができる。

また、本実施形態に係る蛍光発色団を有する化合物の少なくとも１つの置換基が、求核的または求電子的な置換基を有する化合物と縮合・置換・付加・クロスカップリングが可能な置換基であってもよい。縮合・置換・付加・クロスカップリングが可能な置換基は、本実施形態の効果を奏する範囲で適宜選択され、以下に限定されるものではないが、たとえば、アミノ基、アシルアミノ基、スルホ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオ基、エステル基、アミド基、チオアミド基、カルボニル基、アルデヒド基、トリフルオロメタンスルホネート基、無水カルボン酸、酸塩化物、塩素、臭素、ヨウ素、ホウ酸エステル基、ホウ酸基などを含む置換基を例示することができる。上記置換基で置換された場合も、本実施形態に係る蛍光発色団を有する化合物は水溶液中で蛍光を示し得る。

以下、本発明を実施例により、具体的に説明する。

（実施例１）
＜アジドジトリフラートの合成＞
化学式８で表される市販の３−クロロ−１，２−プロパンジオール（１．９ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を１７ｍＬの水に溶かし、化学式９で表されるアジ化ナトリウム（１．４ｇ、２０．８ｍｍｏｌ)を加えて、１００℃で８時間加熱還流した。ついで、反応溶液を０℃に冷却した後、反応混合物に食塩を加えて、酢酸エチル３０ｍＬを用いて５回抽出した。集めた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、および減圧下で濃縮することによって、化学式１０で表されるアジドジオールの粗生成物２．０ｇを得た（反応式（３））。

化学式１０で表されるアジドジオールの粗生成物を８７ｍＬのジクロロメタンに溶かし、この溶液をアセトン／ドライアイス（登録商標）浴中で冷却した。この反応溶液に、２，６−ルチジン（１０．１ｍＬ、８６．５ｍｍｏｌ)を加え、ついで化学式１１で表される無水トリフルオロメタンスルホン酸（Ｔｆ_２Ｏ）（５．８ｍＬ、３４．６ｍｍｏｌ)をゆっくり加えた。反応溶液をアセトン／ドライアイス（登録商標）浴中で冷却しながら１０分間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム溶液５０ｍＬをゆっくりと加え、室温（約２０℃）まで昇温した。この混合溶液をヘキサン５０ｍＬで３回抽出し、集めた有機層を飽和食塩水８０ｍＬで洗い、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、濾過、減圧濃縮によって、化学式１２で表されるアジドジトリフラートの粗生成物を得た。アジドジトリフラートの粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝９５／１、９０／１ｔｏ７／３)によって精製し、トリアザペンタレン化合物を合成する際の前駆体であるアジドジトリフラート（５．３８ｇ、収率８２％)を淡黄色油状物として得た（反応式（４））。

（実施例２）
＜トリアザペンタレン化合物（置換基がＣＯ_２ＣＨ_３)の合成＞
化学式１２で表されるアジドジトリフラート（３９０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１０２ｍＬに溶かした後、化学式１３で表されるプロピオール酸メチル（１３６ｍＬ、１．５３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（７１７ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ)、ヨウ化銅（９．７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下で、室温（約２０℃）で２時間撹拌した。その後、反応混合溶液をロータリーエバポレーターで直接減圧濃縮し、化学式１４で表されるメチルエステルトリアザペンタレンの粗生成物を得た。化学式１４で表されるトリアザペンタレン類の粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝８７／１３、６２／３８ｔｏ６０／４０）で精製し、化学式１４で表されるメチルエステルトリアザペンタレン（１５２ｍｇ、収率９０％)を淡黄色固形物として得た（反応式（５））。表１に示す置換基はいずれも、トリアザペンタレン骨格を有する化合物のＲ^５の位置に結合された。また、特に記載がない限り実施例１〜実施例２と同じ条件で、表１に示す官能基を有するトリアザペンタレン骨格を有する化合物を表１に示す収率で合成した。すなわち、反応式（５）の化学式１３におけるＣＯ_２ＣＨ_３の部分の置換基を、表１に示す置換基（Ｃ_４Ｈ_９、ＯＭｅ、ＴＭＳ、ＣＯ_２Ｍｅ、フェニル基、ビフェニル基、メトキシフェニル基、３−シアノフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシペルフルオロフェニル基、トリフルオロメタンスルホン酸エステルフェニル基、メチルエステルフェニル基、Ｏ−ＴＢＳ、１−シアノフェニル基、２−シアノフェニル基、クロロフェニル基）にそれぞれ代えることで、他の条件は実施例１〜実施例２と同じ条件で、表１に示す官能基がＲ^５の位置に結合されたトリアザペンタレン骨格を有するそれぞれの化合物を得た。表１中、（ｂ）は反応溶媒中のアセチレンの濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌとしたことを表し、（ｃ）は溶媒に水を用いたことを表す。また、表１中、ＴＭＳはトリメチルシリル基を表し、ＴＢＳはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を表す。

（実施例３）
＜トリアザペンタレン類の蛍光スペクトル測定＞
実施例１および実施例２と同様の方法で合成した種々のトリアザペンタレン類の蛍光スペクトルを測定した。以下、測定方法を具体的に述べる。

トリアザペンタレン類として、置換基がフェニル基、メトキシフェニル基、２−シアノフェニル基、メトキシカルボニルフェニル基、メチルエステル基、ジフェニル基、３−シアノフェニル基、ニトロフェニル基である化合物を用いた。

上記化合物を、ジクロロメタンを溶媒として用いて、それぞれ、表２に示す濃度の溶液とした。蛍光分光光度計（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｆ−４５００）を用いてそれぞれの紫外吸収スペクトルを測定し、表２に示すように吸収極大波長（λ_ｍａｘ）を３２６ｎｍ〜４１２ｎｍとした。吸収極大波長の強度（Ａｂｓ．）が０．１００±０．００５となるようにサンプル溶液の濃度を調整して、分光光度計（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ−３５００）を用いて、吸収極大波長と等しい励起波長（λ_ｅｘ）＝３２６ｎｍ〜４１２ｎｍでそれぞれの蛍光スペクトルを測定した。蛍光量子収率は、９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン（絶対蛍光量子収率＝０．９６）を基準物質として求めた。

測定の結果、図１および表２に示すように、電子求引基を導入した基質において、特に強い相対量子収率が得られる事が分かった。図１および表２において、置換基のＰｈはフェニル基を表し、Ｍｅはメチル基を表し、ＣＯ_２Ｍｅはメチルエステル基を表し、ＯＭｅはメチルアルコキシ基を表し、ＣＮはシアノ基を表す。また、表２において、λ_ｅｘは励起波長を表し、εはモル吸光係数を表し、λ_ｅｍは発光波長を表し、φ_ｒは９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン（絶対蛍光量子収率＝０．９６）を基準としたときの相対蛍光量子収率を表し、「−」は測定データがないことを表す。

表２に示すように、メチルエステル基のみを導入した非常に小さなトリアザペンタレン類においても、強い相対蛍光量子収率（φ_ｒ＝２１％）を示した。相対蛍光量子収率のより好ましい範囲は１０％以上であり、肉眼での観察がより容易になる。さらに、溶液中に酸を添加すると、相対蛍光量子収率がさらに向上することがわかっている。また、図１に示すように、メチルエステル基、ジフェニル基、シアンフェニル基で置換したトリアザペンタレン類において、より強い蛍光強度を得られることがわかった。

さらに、表２に示すように、従来の蛍光発色剤と異なり、置換基（Ｒ^１〜Ｒ^５）のパターンによって蛍光波長が顕著に変化したことがわかった。特に、後述の実施例６の表３および図４に示すように、置換基（Ｒ^１〜Ｒ^５）の電子求引性の上昇と共に蛍光波長が長波長側にシフトする傾向から、従来の蛍光性分子では難しかった蛍光波長のデザインが、本実施例に係る蛍光発色団としてトリアザペンタレン骨格を有する化合物においては可能である。置換する官能基のパターンと蛍光波長とをデータベース化することによって、望まれる蛍光波長を有する様々な蛍光分子の作成が可能となり、本実施例の蛍光性分子を多くの産業に広く用いることが可能となることがわかった。さらに、電子求引基の導入により、近赤外領域に波長をより容易に延長することによって、生体細胞へのダメージを低減し、かつ生体分子による消光をより抑制することができる蛍光分子を提供することができ、医療診断装置などのバイオイメージング産業に用いることができることがわかった。

（実施例４）
＜トリアザペンタレン類のソルバトクロミック蛍光＞
置換基が−ＰｈＣＮのトリアザペンタレン化合物の蛍光を種々の溶媒の下で測定した。以下、測定方法を具体的に述べる。

溶媒としては、ジクロロメタン（純正化学社製）、アセトニトリル（関東化学社製）、ベンゼン（ナカライテスク社製）、アセトン（ナカライテスク社製）をそれぞれ用いた。

置換基が−ＰｈＣＮのトリアザペンタレン化合物を上記溶媒にそれぞれ溶かした。それぞれの溶液濃度は、ジクロロメタンを溶媒として用いた溶液の濃度が５．８１×１０^−６ｍｏｌ／Ｌであり、アセトニトリルを溶媒として用いた溶液の濃度が３．６５×１０^−６ｍｏｌ／Ｌであり、ベンゼンを溶媒として用いた溶液の濃度が５．４３×１０^−６ｍｏｌ／Ｌであり、アセトンを溶媒として用いた溶液の濃度が６．６３×１０^−６ｍｏｌ／Ｌであった。蛍光分光光度計（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｆ−４５００）を用いて紫外吸収スペクトルを測定し、吸収極大波長（λ_ｍａｘ）を３８２ｎｍとした。吸収極大波長の強度（Ａｂｓ．）が０．１００±０．００５となるようにサンプル溶液の濃度を調整して、分光光度計（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ−３５００）を用いて、吸収極大波長と等しい励起波長（λ_ｅｘ）＝３８２ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。蛍光量子収率は、９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン（絶対蛍光量子収率＝０．９６）を基準物質として求めた。

蛍光スペクトルを測定したところ、顕著なソルバトクロミズムが観測された（図２）。なお、図２の縦軸は標準化された強度を表す（ＮｏｒｍａｌｉｚｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ）。

図２に示すように、溶媒の極性の変化に伴って蛍光波長が大きく変化しており、目視した際の発光色も変化していた。図２に示す各溶媒の溶媒極性パラメーターＥ_Ｔ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２５℃）は、ジクロロメタンがＥ_Ｔ＝４１．１、アセトンがＥ_Ｔ＝４２．３、アセトニトリルがＥ_Ｔ＝４６．０、ベンゼンがＥ_Ｔ＝３４．５であった。本測定によって、本実施例に係る蛍光発色剤はコンパクトな構造を有しながらも周囲の環境によって蛍光色を大きく変化させることがわかり、細胞内での蛍光発色剤の局在によって蛍光色を変化させるケミカルバイオロジー用試薬として用いることができることがわかった。

（実施例５）
＜トリアザペンタレン類を用いたイオン濃度センサー＞
市販のクラウンエーテルから２段階で誘導した、化学式１５で表されるアセチレン含有クラウンエーテル（４’−エチニルベンゾ−１８−クラウン６−エーテル）を、実施例１〜２で説明したトリアザペンタレン類の合成方法に適用し、化学式１６で表されるトリアザペンタレン類を分子内に含有するクラウンエーテルを合成した（反応式（６））。

化学式１５で表されるアセチレン含有クラウンエーテルは以下のように合成された。

はじめに、ＰｄＣｌ_２（ＰＰｈ_３）_２、ヨウ化銅、トリエチルアミンの存在下で、反応温度８０℃で、市販の４’−ブロモベンゾ−１８−クラウン６−エーテルに、トリ（イソプロピル）シリルアセチレンを反応させた。次に、その反応物にテトラブチルアンモニウムフッ化物を反応させて、脱シリル化することによって合成することができた。

化学式１６で表されるトリアザペンタレン類を分子内に含有するクラウンエーテルは種々の有機溶媒および水にも可溶であり、水溶液中でのカリウムイオンの添加による蛍光の変化を測定した。以下、測定方法を具体的に述べる。

化学式１６に表されるトリアザペンタレン類を含有するクラウンエーテルを水溶液にした。ここで、上記化合物の濃度が１．８４×１０^−４ｍｏｌ／Ｌであるサンプルを２つ準備し、上記化合物の濃度が３．０７×１０^−４ｍｏｌ／Ｌのサンプルを１つ準備した。カリウムイオンとして、化学式１７で表されるように、臭化カリウム（ＫＢｒ）を添加して均一な溶液とした（反応式（７））。臭化カリウムの添加量は、０当量（トリアザペンタレン類を含有するクラウンエーテルの化合物濃度が３．０７×１０^−４ｍｏｌ／Ｌのサンプルを使用）、１０当量（トリアザペンタレン類を含有するクラウンエーテルの化合物濃度が１．８４×１０^−４ｍｏｌ／Ｌのサンプルを使用）および１００当量（トリアザペンタレン類を含有するクラウンエーテルの化合物濃度が１．８４×１０^−４ｍｏｌ／Ｌのサンプルを使用）であった。

蛍光分光光度計（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｆ−４５００）を用いて紫外吸収スペクトルを測定し、吸収極大波長（λ_ｍａｘ）を３２０ｎｍと求めた。吸収極大波長の強度（Ａｂｓ．）が０．１００±０．００５となるようにサンプル溶液の濃度を調整した。分光光度計（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ−３５００）を用いて、励起波長（λ_ｅｘ）＝３２０ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。

図３のグラフに示すように、ＫＢｒの添加量の増大とともに蛍光強度が増強することが観測された。１０当量のＫＢｒの添加で蛍光強度の増大が観測され、１００当量の添加ではさらに大きな蛍光強度の増大が観測された。ＫＢｒの添加量と蛍光強度の増強との間に比例関係があることから、本実施例に係るトリアザペンタレン類を分子内に有するクラウンエーテル化合物をイオン濃度センサーとして利用することができることがわかった。

（実施例６）
表３に示す各化合物について、最大吸収波長（λ_ａｂｓ ^ｍａｘ）、最大蛍光波長（λ_ｅｍ ^ｍａｘ）、蛍光量子収率（Φ_Ｆ）を測定した。また、置換基のＨａｍｍｅｔｔ定数（σ_ｐ）を併せて表３に記載する。表３中、「−」は測定データがないことを示す。吸収波長、蛍光波長、蛍光量子収率の測定は実施例３と同様に行われた。ここで、１ｏ^ａおよび１ｒの化合物の合成方法は実施例８において後述される。表３に示す１ｅ、１ｎ、１ｆ、１ｇ、１ｌ、１ｋ、１ｈおよび１ｍの化合物は、実施例１〜２に記載された方法および条件で合成された。また、表３に示す１ａの化合物は、実施例１〜実施例２と同じ条件で、反応式（５）の化学式１３におけるＣＯ_２ＣＨ_３の部分を水素原子に代えることで、他の条件は実施例１〜実施例２と同じ条件で、水素原子がＲ^５の位置に結合されたトリアザペンタレン骨格を有する化合物１ａを得た。

＜Ｈａｍｍｅｔｔ定数＞
図４は、表３に示す１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｋ、１ｌ、１ｍおよび１ｎの各化合物のＨａｍｍｅｔｔ定数と最大蛍光波長とをプロットしてグラフ化した図である。図４に示されるように、本実施例に係る化合物の最大蛍光波長は、置換基のＨａｍｍｅｔｔ定数の増加に従って長い波長となる傾向があることがわかった。そのため、置換基を変えることで蛍光色を調節することができることがわかった。

＜ストークスシフト＞
表３に示す各化合物について、最大吸収波長と最大蛍光波長とのそれぞれの蛍光スペクトルを図５〜図１４に示す。図５〜図１４に示すように、本実施例に係るトリアザペンタレン骨格を有する化合物は、最大吸収波長と最大蛍光波長との間の差（ストークスシフト）が大きいことがわかった。

（実施例７）
＜二置換体の合成＞
化学式１８で表されるアジド（２０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ)を入れた１０ｍＬのナス型フラスコにテトラヒドロフラン（０．６８ｍＬ）を加え、均一の溶液になるまで室温で撹拌した。その溶液に、予め調製しておいたヨウ化銅・アミノエーテル錯体ＴＨＦ溶液（３４１ｍＬ、０．０３４ｍｍｏｌ、０．０１Ｍ)および化学式１９で表されるアルキン（８．７ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ)を順次加え室温で１２時間撹拌した。ここで、ヨウ化銅・アミノエーテル錯体ＴＨＦ溶液は、ヨウ化銅・アミノエーテル錯体溶液（０．０１Ｍ）：ヨウ化銅（１９ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ)および（Ｍｅ_２ＮＣＨ_２ＣＨ_２)_２Ｏ（１９ｍＬ、０．０１ｍｍｏｌ)をＴＨＦ（１０ｍＬ）に加えた後、ソニケーションを１分間行い、ついで室温で１０分間撹拌することでヨウ化銅・アミノエーテル錯体ＴＨＦ溶液錯体を得た。ついでその混合物を更に１２時間加熱還流した後、−７８℃に冷却し、ＫＨＭＤＳ（０．５５ｍＫＬ、１ＭのＴＨＦ溶液）を加え５分間撹拌した。−７８℃で酢酸を加えて反応を停止させた後、エーテルで反応溶液を薄め、エーテル層を水で洗浄した。エーテル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過、ロータリーエバポレーターによる濃縮によって化学式２０で表される粗生成物を得た。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（展開溶媒＝ヘキサン／酢酸エチル＝５／１から３／１）によって、化学式２０で表される化合物（９．７ｍｇ、６０％）を淡黄色固体として得た（反応式（８））。

＜二置換体の蛍光＞
表４〜表５に、二置換体の、吸収波長、蛍光波長、量子収率を示す。化学式２０で表される二置換体以外の二置換体は、化学式２０で表される二置換体と同様の方法で合成される。表４〜表５の数値は、ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液中で、励起波長３７０ｎｍの条件下で得られた。

表４〜表５に示すように、電子供与基がＲ^２に入り、電子求引基がＲ^５に入った２，５−置換体の量子収率はそれ以外の化合物よりも一層大きくなり、蛍光強度が一層大きくなることがわかった。また、電子求引基がＲ^２およびＲ^５の両方に入った２，５−置換体は、電子求引基がＲ^５の位置だけに入った２，５−置換体よりも蛍光波長が短波長側にシフトすることがわかった。

（実施例８）
＜ヘテロ原子を含む官能基との置換＞
化学式２１で表されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物（５７．１ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をメタノール（１．３ｍＬ）および水（０．４ｍＬ）溶媒に溶かし、その溶液を０℃において、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（１４．５ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）に加えた。混合物は室温において１６時間攪拌された後、減圧下で濃縮され、赤い非晶質材料として化学式２２で表されるトリアザペンタレン骨格を有するリチウム塩を得た。濃縮物はＤＭＦ（１．７ｍＬ）に溶解され、０℃まで冷却された。混合物にＥＤＣＩ（１４８ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびグリシンエチルエステル塩酸塩（９７ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物は室温において１８時間攪拌された後、５％のクエン酸水溶液（ｐＨ５以下）とともに冷却され、酢酸エチル（ｘ２）によって抽出された。混合有機層は塩水によって洗浄され、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、減圧下で濃縮された。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（展開溶媒＝ヘキサン／酢酸エチル＝３／２）によって精製し、化学式２３で表されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物を黄色の結晶として得た（４２．１ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、５２％）（反応式（９））。

他のヘテロ原子を含む官能基で置換されたトリアザペンタレン骨格を有する化合物も上述の方法と同様の方法で合成される。また、表３の化学式１ｋで表されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物のメチルエステル基を酸塩化物に置換する方法などを用いて合成することもできる。

ＣＨ_２Ｃｌ_２水溶液中で、励起波長３４０ｎｍの光を当てたところ、本実施例で合成された化学式２３で表されるトリアザペンタレン骨格を有する化合物も水溶液中で蛍光を示すことが確認された（蛍光波長：４１８ｎｍ）。

なお、本発明は上記実施例に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。

本出願は、２０１１年３月１０日に出願された日本国特許出願特願２０１１−０５３００９号に基づく。本明細書中にその明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明に係る蛍光発色団としてトリアザペンタレン骨格を有する化合物は、イオン濃度センサーとしての利用によって生体細胞内でのイオン濃度の測定などの基礎研究および医療診断に利用することができる。また、水質調査用の試薬として利用することができる。さらに、蛍光標識基として未知タンパクの探索や、低分子化合物の生体内での局在を明らかにするなどのケミカルバイオロジー用試薬として利用することができる。さらに、固体でも蛍光を発することから、発光性材料として利用することができる。

Claims

蛍光発色団として一般式２

で示される構造を有する蛍光発色剤。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、同一であっても、異なっていてもよく、前記Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５のうち少なくとも１つの置換基が電子求引基であり、前記Ｒ^４および／またはＲ^５の置換基が電子求引基であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち２つ以上の基が互いに結合して新たに環を形成しない置換基を表す。）
前記Ｒ^２の置換基が電子供与基または電子求引基である、
ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光発色剤。
一般式３

で示される構成単位を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光発色剤。
（式中、Ｒ^８は炭素数２以上の分岐していてもよいアルキレン基、または炭素数６以上の置換基を有していてもよいアリーレン基を表す。）
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の蛍光発色剤を含むイオン濃度センサー。
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の蛍光発色剤を含む試薬。
請求項５に記載の試薬を少なくとも１つ備える試薬キット。
少なくとも１つの前記試薬の最大蛍光波長が、４００ｎｍ以上４３０ｎｍ以下、４３０ｎｍ超過４８０ｎｍ以下、４８０ｎｍ超過５３０ｎｍ以下、５３０ｎｍ超過２０００ｎｍ以下からなる群から選択される最大蛍光波長である、
ことを特徴とする請求項６に記載の試薬キット。
一般式４

で表される有機アジ化物と、
一般式５

で表されるアルキンまたはその誘導体と、を、双極子付加環化反応を促進させる触媒の存在下で、双極子付加環化反応させる工程を含む、
ことを特徴とする、
一般式２

で示される構造を有する蛍光発色剤の合成方法。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、同一であっても、異なっていてもよく、前記Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５のうち少なくとも１つの置換基が電子求引基であり、前記Ｒ^４および／またはＲ^５の置換基が電子求引基であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち２つ以上の基が互いに結合して新たに環を形成しない置換基を表す。また、Ｒ^６およびＲ^７は、同一であっても、異なっていてもよい置換基を表し、ＯＲ ^６およびＯＲ ^７は、脱離基である。）