WO2012033162A1 - 毛成長制御方法、毛成長制御剤の評価又は選択方法、及び毛成長抑制剤 - Google Patents

毛成長制御方法、毛成長制御剤の評価又は選択方法、及び毛成長抑制剤 Download PDF

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hair growth
extract
protein
test substance
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安曇 長澤
一ノ瀬　進
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a hair growth control method, a hair growth control agent evaluation or selection method, and a hair growth inhibitor.
  • Biological hair and body hair protect biologically important organs such as the head, chest and limbs.
  • hair on limbs and the like is preferably not in terms of aesthetic appearance.
  • Examples of the method for removing body hair include a mechanical removal method using a shaver, a hair removal device, and the like, and a removal method by chemical action using a hair removal agent or a hair removal agent.
  • these hair removal methods may be accompanied by physical or chemical irritation to the skin and are still insufficient in terms of hair suppression action, so that the hair removal treatment is performed again after a certain period of time. There must be. Reduction of body hair removal processing is desired.
  • Patent Documents 1 to 3 Conventionally, when evaluating or selecting a hair restorer or a hair suppressant, it is applied to the skin of a living body (Patent Documents 1 to 3), or in vitro, human, mouse or rat, or pig hair follicle organ After the candidate substance was administered to the culture, the degree of hair elongation and hair follicle growth was measured, and the hair growth or hair-loss action of the candidate substance was evaluated based on the measurement results (Patent Documents 4 to 7, Non-patent documents 1 to 3). Considering the efficiency and accuracy of evaluation, in vitro testing is more preferable.
  • organ culture of hair follicles in vitro may be difficult to obtain sample hair follicles, it takes time to cultivate, and several days before hair growth and hair follicle growth are observed. Therefore, there is a problem that it takes time to evaluate.
  • an in vitro screening system for evaluating or selecting hair restorers or hair suppressants more efficiently.
  • Patent Document 7 observes that heat shock proteins HSP-27, HSP-70 and HSP-90 are present in human hair follicles, and that hair fiber growth is significantly reduced by administration of HSP-27 antibody to hair follicles. It has been described that the growth of human hair follicles was reduced in a dose-dependent manner by the administration of HSP-90 specific inhibitor geldanamycin or HSP synthesis inhibitor KNK437. However, since there are many types of heat shock proteins and their functions are diverse, the molecular mechanism by which the above heat shock proteins are involved in hair growth is not clear, and whether other heat shock proteins can be involved in hair growth. Can not be predicted.
  • Funabarasou (Cynanchum atratum) is a perennial plant of the Asclepiadaceae vincetoxicum, the root has been used for Kampo agent such as Shirozenmaiyu.
  • Funabara Sou is known to have medicinal effects such as cool fever, antipyretic, diuretic action and the like, and as its medicinal ingredient, Cynanchol having a cardiac glycoside action is known.
  • Patent Document 8 discloses a herbal extract for skin growth containing a herbal extract containing white rose and a herbal extract having an lyostatic action, an active ingredient thereof, a herbal extract having an angiogenic activity and an active ingredient thereof.
  • Patent Document 9 describes the use of a composition containing an extract of a plant belonging to the genus Calyceae for cosmetic treatment of human skin including inhibition, suppression or delay of hair growth. However, it was not clear what the effect of beech roses alone on hair growth.
  • the present invention provides a hair growth control method comprising the step of controlling the activation level of DnaJC6 in hair tissue.
  • the present invention provides the following steps (A) to (C): (A) a step of measuring the expression level of DnaJC6 in cells capable of expressing DnaJC6 in the presence and absence of a test substance; (B) comparing the expression level of DnaJC6 in the cell in the presence of the test substance with the expression level of DnaJC6 in the cell in the absence of the test substance; and (C) in the presence and absence of the test substance.
  • a method for evaluating or selecting a hair growth regulator comprising: Yet another aspect of the present invention is beech grass or an extract thereof for use in hair growth inhibition. Alternatively, it is the use of beech grass or an extract thereof in the manufacture of a medicament or cosmetic for suppressing hair growth. In yet another aspect, the present invention provides a method for inhibiting hair growth comprising applying beech grass or an extract thereof to skin tissue where hair growth inhibition is desired. In another aspect, the present invention provides a hair growth inhibitor containing beech grass or an extract thereof as an active ingredient.
  • non-therapeutic is a concept that does not include a medical act, that is, a treatment act on the human body by treatment.
  • hair growth control means an action of promoting or suppressing the growth of hair or hair follicle, or an action of increasing or decreasing hair diameter. That is, “hair growth control” in the present specification is a concept including promotion and suppression of hair growth.
  • DnaJC6 is a protein classified as a heat shock protein. There are many families of heat shock proteins, for example, broadly divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, HSP27, and HSP10 families. Among these, DnaJC6 is a molecular chaperone belonging to the DNAJ / HSP40 family.
  • DnaJC6 gene refers to a promoter that controls a gene encoding DnaJC6, its mRNA, and a gene encoding DnaJC6, respectively.
  • the present invention relates to a hair growth control method by controlling gene expression, a method for evaluating or selecting a hair growth control agent using gene expression as an index, and a hair growth inhibitor.
  • the present inventors can control hair growth by controlling the expression of DnaJC6, can efficiently evaluate or select a substance that controls hair growth by using the expression of DnaJC6 as an index, and hair growth. As a result of searching for a substance that suppresses hair, it was found that beech grass or its extract has an action of suppressing hair growth.
  • hair growth can be controlled at a desired part of the animal body. Further, according to the present invention, it is possible to evaluate or select a hair growth control agent in vitro simply, quickly and efficiently. Moreover, according to this invention, hair growth suppression can be implement
  • the present invention provides a hair growth control method comprising the step of controlling the activation level of DnaJC6 in hair follicle tissue.
  • tissue examples include animal living tissue and animal living tissue.
  • the animal is preferably a human or non-human mammal, more preferably a human.
  • the animal includes animals that require hair growth control, for example, animals that desire or do not desire hair growth or hair growth, animals that desire hair removal or hair removal, animals that do not desire hair removal, and the like.
  • tissues derived from living bodies include tissues collected from animals and cultures thereof.
  • the activation level is controlled by, for example, the abundance of the DnaJC6 protein in the tissue, the activation of the DnaJC6 protein, the expression of the DnaJC6 protein, the expression of the gene or mRNA encoding the DnaJC6 protein, or the promoter of the gene encoding the DnaJC6 protein. Can be achieved by controlling the activation of. These may be controlled independently or in combination.
  • the controlling step may be a step of suppressing hair growth by reducing the activation level of DnaJC6.
  • Means for reducing the activation level of DnaJC6 include, for example, inactivation of DnaJC6 protein using an antibody specific for DnaJC6 protein, transcription of DnaJC6 gene to mRNA by inhibiting the activity of DnaJC6 gene promoter. Examples thereof include suppression, suppression of translation from DnaJC6 mRNA to protein by means such as RNAi.
  • the activation level is preferably reduced by 20% or more, more preferably 50% or more, as the activity of the promoter of the DnaJC6 gene.
  • the expression level of DnaJC6 mRNA is preferably decreased by 10% or more, more preferably 20% or more. The decrease in the activation level of DnaJC6 suppresses the hair growth of the tissue.
  • the controlling step may be a step of promoting hair growth by enhancing the activation level of DnaJC6.
  • means for enhancing the activation level of DnaJC6 include introduction of the DnaJC6 gene into cells of the tissue, introduction of an expression vector containing the DnaJC6 gene into cells of the tissue, and increase of the activity of the promoter of the DnaJC6 gene. Include promotion of transcription from the DnaJC6 gene to mRNA, suppression of degradation of DnaJC6 mRNA, suppression of degradation of DnaJC6 protein, and the like.
  • the activation level is preferably increased by 20% or more, more preferably 50% or more as the activity of the promoter of the DnaJC6 gene.
  • the expression level of DnaJC6 mRNA is preferably increased by 10% or more, more preferably 20% or more.
  • a method for evaluating or selecting a hair growth regulator comprising the following steps (A) to (C) is provided: (A) a step of measuring the expression level of DnaJC6 in cells capable of expressing DnaJC6 in the presence and absence of a test substance; (B) comparing the expression level of DnaJC6 in the cell in the presence of the test substance with the expression level of DnaJC6 in the cell in the absence of the test substance; and (C) in the presence and absence of the test substance.
  • Examples of the “cell capable of expressing DnaJC6” include a cell having a DnaJC6 gene inherently and capable of expressing it, and a cell introduced exogenously to express the DnaJC6 gene.
  • the cell may be a cell collected from a living body, a cell contained in a tissue or organ collected from a living body, or a cultured cell.
  • the cell is derived from a mammal.
  • Examples of cells that naturally have the DnaJC6 gene and are capable of expressing it include cells derived from any tissue of the living body, but preferably cells derived from skin collected from mammals such as mammals.
  • Cells that have been able to express the DnaJC6 gene exogenously can be obtained by introducing an expression vector incorporating the DnaJC6 gene into any mammalian cell and transforming the cell. Methods for producing an expression vector incorporating the DnaJC6 gene and methods for introducing the expression vector into mammalian cells are well known to those skilled in the art.
  • test substance is not particularly limited as long as it is a substance desired to be used as a hair growth control agent.
  • the expression level of DnaJC6 in cells capable of expressing DnaJC6 is measured in the presence and absence of the test substance.
  • the expression level of DnaJC6 is measured before and after administration of a test substance to cells, in a test substance addition group and a test substance non-addition group, or in a test substance addition group and a control substance addition group, respectively.
  • the measurement of the expression level of DnaJC6 can be carried out using as an index the expression of DnaJC6 protein, the expression of a gene or mRNA encoding DnaJC6 protein, the amount of activation of the promoter of the gene encoding DnaJC6 protein, or the like. These indicators may be measured alone or in combination.
  • the measurement may be performed according to a method known in the art as a method for measuring a parameter used as an index (for example, protein expression, gene or mRNA expression, promoter activation, etc.).
  • methods for measuring the expression level of a gene or mRNA encoding DnaJC6 protein include polymerase chain reaction (PCR) methods such as RT-PCR, Real-time RT-PCR, Northern blotting method, RNase protection assay method, DNA array Analysis and the like.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a method for measuring the expression level of DnaJC6 protein agarose gel electrophoresis, SDS-PAGE, chromatography, immunoassay (for example, immunohistochemistry using an antibody specific for DnaJC6 protein, ELISA method, RIA method, Western blot method, immunoprecipitation, etc.), colorimetric determination method, fluorescence / optical measurement method, mass spectrometry, electron microscope observation, etc., and combinations thereof, but are not limited thereto.
  • Western blotting method, ELISA method, or RIA method using an antibody specific for DnaJC6 protein is preferable.
  • the value measured in the step (A) is compared between the case where the test substance is present and the case where it is absent. For example, before and after administration of the test substance, or by comparing the test substance addition group with the test substance non-addition group or the control substance addition group.
  • the expression of DnaJC6 protein measured in (A) the expression of a gene or mRNA encoding DnaJC6 protein, the amount of activation of the promoter of the gene encoding DnaJC6 protein, etc. before and after administration of the test substance Comparison is made between the added group and the test substance non-added group, or between the test substance added group and the control substance added group. Preferably, the comparison is made statistically.
  • the hair growth control effect of the test substance is evaluated based on the comparison result obtained in the above (B).
  • a substance that has affected the expression of DnaJC6 can be selected as a hair growth regulator.
  • the test substance can be selected as a hair growth regulator.
  • a test substance that decreases the expression level of DnaJC6 is selected as a hair growth inhibitor.
  • the substance is a hair growth inhibitor. Selected as. It is preferable that the decrease in the expression level is statistically significant.
  • a test substance that increases the expression level of DnaJC6 is selected as a hair growth promoter.
  • the expression level of DnaJC6 mRNA in the presence of the test substance is preferably increased by 10% or more, more preferably by 20% or more compared to the case in the absence of the test substance, the substance is a hair growth promoter. Selected as. It is preferable that the decrease in the expression level is statistically significant.
  • a method including the following steps (a) to (d) can be mentioned as a preferred example: (A) introducing a reporter gene controlled by a promoter of a gene encoding DnaJC6 into a cell capable of expressing DnaJC6; (B) measuring the amount of the reporter gene expression product in the cell in the presence and absence of the test substance; (C) comparing the amount of the reporter gene expression product in the cell in the presence of the test substance with the amount of the reporter gene expression product in the cell in the absence of the test substance; and (d) the presence of the test substance A step of selecting the test substance as a hair growth regulator when the amount of the reporter gene expression product is significantly different between under and in the absence.
  • the promoter used for the measurement is preferably the human DnaJC6 promoter.
  • the human DnaJC6 promoter one to several (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) promoters having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. ) Are substituted, deleted, inserted, added, and controlled by a transcription factor similar to the promoter having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 to control the expression of downstream genes.
  • a reporter gene controlled by the promoter of the gene encoding DnaJC6 is introduced into a cell capable of expressing DnaJC6.
  • a reporter gene is operably linked downstream of the promoter.
  • the reporter gene is selected from the group consisting of luciferase, chloramphenicol acetyltransferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, and green fluorescent protein.
  • the above (b) to (d) are the same as the above (A) to (C) except that the measurement target is the amount of the reporter gene expression product. That is, in (d) above, when the amount of the reporter gene expression product of the cells is significantly different between in the presence and absence of the test substance, the test substance is selected as a hair growth regulator. Can do.
  • the test substance that decreases the amount of the reporter gene expression product can be selected as a hair growth inhibitor, and the test substance that increases the amount of the reporter gene expression product can be selected as a hair growth promoter.
  • the decrease in the amount of reporter gene expression product in the presence of the test substance is preferably 20% or more, more preferably 50% or more compared to the absence of the test substance, the substance is a hair growth inhibitor. Selected as an agent.
  • the increase in the amount of the reporter gene expression product in the presence of the test substance is preferably 20% or more, more preferably 50% or more, compared to the case where the test substance is absent, the substance is used for hair growth. Selected as an accelerator. It is preferable that the decrease in the expression level is statistically significant.
  • the hair growth control agent thus obtained can be used for hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, hair growth suppression, or the like, or hair growth agents, hair growth agents, hair removal agents, hair removal agents, hair growth inhibition. It can be an active ingredient such as an agent.
  • the hair growth regulator by administering the hair growth regulator to a subject in need of promoting or suppressing hair growth such as hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, hair growth inhibition, etc. Hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, hair growth inhibition, etc. can be realized by promoting or suppressing.
  • the hair growth regulator may be used as a composition for hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, hair growth suppression, etc., as a medicine, quasi-drug, cosmetic or food and drink, or for their production. Can be used for
  • beech grass extract has an effect of significantly suppressing the elongation of human organ cultured hair. Therefore, beech grass or its extract is useful as a hair growth inhibitor.
  • beech rose or an extract thereof can exert effects such as suppression of hair growth or hair growth, hair removal, and hair removal through the hair growth suppressing action. That is, beech grass or an extract thereof can be used for hair growth inhibition, hair growth or hair growth inhibition, hair removal, hair removal, and the like.
  • the use can be in humans or non-human animals, or specimens derived therefrom, and can be therapeutic or non-therapeutic.
  • the present invention provides a hair growth inhibitor containing beech grass or an extract thereof as an active ingredient.
  • the hair growth inhibitor of the present invention consists essentially of beech grass or its extract.
  • the hair growth inhibitor can be used for hair growth or hair growth inhibition, or for hair removal or hair removal.
  • “Funabarasou” refers to the perennial plant Cynanchum atratum belonging to the genus Gullaceae
  • “Funabara extract” means an extract obtained from Amaranthus.
  • the extract may be an extract from any part of beech grass, for example, whole grass or root, or a combination thereof, but an extract from root is preferred.
  • the part may be subjected to the extraction step as it is, or may be subjected to the extraction step after being pulverized, cut or dried.
  • the extract of beech roses according to the present invention is extracted by extracting the beech roses at room temperature (eg, 4 to 50 ° C.) or under heating (room temperature to solvent boiling point), or using an extraction device such as a Soxhlet extractor. Can be obtained.
  • Either a polar solvent or a nonpolar solvent can be used as a solvent for extraction.
  • the solvent include water; alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; polyhydric alcohols such as propylene glycol and butylene glycol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; methyl acetate and ethyl acetate Esters; linear and cyclic ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether; polyethers such as polyethylene glycol; hydrocarbons such as squalane, hexane, cyclohexane and petroleum ether; aromatic hydrocarbons such as toluene; dichloromethane and chloroform And halogenated hydrocarbons such as dichloroethane; and supercritical carbon dioxide; pyridines; organic solvents such as oils and fats, other oils such as wax; and mixtures thereof.
  • Preferable examples include water, alcohols and a
  • the mixing ratio (volume ratio) of alcohols and water in the aqueous alcohol solution is preferably 0.001 to 100: 99.999 to 0, more preferably 5 to 95:95 to 5, and 20 to 80:80 to 20 Is more preferable, 30 to 70:70 to 30 is still more preferable, and 40 to 60:60 to 40 is still more preferable.
  • the ethanol concentration is preferably 40 to 60% by volume.
  • the amount of the solvent used is preferably 1 to 100 mL with respect to 1 g of beech root (dry mass conversion), and the extraction time is preferably 1 minute to 2 months, more preferably 10 minutes to 4 weeks.
  • the extraction temperature at this time is 0 ° C. to the boiling point of the solvent, more preferably 10 to 60 ° C., and further preferably 15 to 40 ° C.
  • the extraction means for obtaining the extract specifically, solid-liquid extraction, liquid-liquid extraction, immersion, decoction, leaching, reflux extraction, ultrasonic extraction, microwave extraction, stirring, and the like can be used.
  • a preferred example of immersion is immersion at 15 to 40 ° C. for 1 hour to 4 weeks.
  • solid-liquid extraction with stirring is desirable.
  • suitable conditions for this solid-liquid extraction include stirring at 1000 to 5000 rpm under 10 to 100 ° C. (preferably 20 to 100 ° C.) for 1 to 30 minutes.
  • a means for extracting under a so-called non-oxidizing atmosphere while removing dissolved oxygen by bubbling degassing or inert gas such as nitrogen gas may be used in combination.
  • Beech grass or an extract thereof is a composition for hair growth inhibition, hair growth or hair growth inhibition, hair removal or hair removal, a pharmaceutical, a quasi-drug, a cosmetic, a food or drink, or a raw material thereof, or It can be used as feed or its raw material, or can be used for their production.
  • the composition, medicine, quasi-drug, cosmetic, food and drink or raw material thereof, or feed or raw material thereof can be produced or used for human or non-human animals.
  • beech grass or an extract thereof is a composition for suppressing hair growth, for suppressing hair growth or hair growth, or for hair removal or hair removal, a pharmaceutical, a quasi-drug, a cosmetic, a food or drink, a feed, Or it can mix
  • the above-mentioned medicine or quasi-drug contains beech grass or an extract thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical or quasi drug can be administered in any dosage form.
  • the administration form may be oral administration or parenteral administration such as external preparation.
  • oral dosage forms include solid dosage forms such as tablets, coated tablets, granules, powders, capsules, and liquid dosage forms such as elixirol, syrups and suspensions, and parenteral dosage forms. Examples thereof include injection, infusion, transdermal, transmucosal, nasal, enteral, inhalation, suppository, bolus, and patch.
  • the above-mentioned medicine and quasi-drug may contain beech grass or an extract thereof alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include excipients, coating agents, binders, extenders, disintegrants, surfactants, lubricants, diluents, dispersants, buffers, osmotic pressure adjusting agents, pH adjusting agents, Dispersants, emulsifiers, preservatives, stabilizers, antioxidants, colorants, UV absorbers, moisturizers, thickeners, activity enhancers, anti-inflammatory agents, bactericides, fragrances, flavoring agents, flavoring agents, etc. It is done.
  • the said pharmaceutical and quasi-drug may contain another active ingredient and a pharmacological component, as long as the hair growth inhibitory action of a beech rose or its extract is not lost.
  • the above-mentioned medicine or quasi-drug can be produced from common beech or extract thereof, or in combination with the above-mentioned carrier and / or other active ingredients and pharmacological ingredients as required.
  • the content of beech grass or extract thereof in the medicine or quasi-drug is usually 0.001 to 99.999% by mass in terms of dry matter of the extract, and 0.01 to 20% by mass. preferable.
  • the cosmetic contains beech rose or an extract thereof as an active ingredient.
  • the cosmetic may contain beech grass or its extract alone, or may be contained in combination with a carrier acceptable as a cosmetic.
  • carrier acceptable as a cosmetic examples include excipients, coating agents, binders, extenders, disintegrants, surfactants, lubricants, diluents, dispersants, buffers, osmotic pressure adjusting agents, pH adjusting agents, Dispersants, emulsifiers, preservatives, stabilizers, antioxidants, colorants, UV absorbers, moisturizers, thickeners, activity enhancers, anti-inflammatory agents, bactericides, fragrances, flavoring agents, flavoring agents, etc. It is done.
  • the cosmetic is other active ingredients and cosmetic ingredients such as moisturizer, whitening agent, UV protection agent, cell activator, cleaning agent, It may contain keratolytic agents, makeup ingredients (for example, makeup bases, foundations, funny, powder, teak, lipstick, eye makeup, eyebrow, mascara, etc.).
  • makeup ingredients for example, makeup bases, foundations, funny, powder, teak, lipstick, eye makeup, eyebrow, mascara, etc.
  • cosmetic forms include creams, emulsions, lotions, suspensions, foams, gels, powders, packs, sheets, patches, sticks, cakes, and any other form that can be used for cosmetics.
  • it may be in the form of a hair removal or hair removal lotion, emulsion, cream, foam, gel or the like.
  • the above cosmetics can be produced from common beech or its extract, or in combination with the above carriers and / or other active ingredients and cosmetic ingredients as required.
  • the content of beech rose or its extract in the cosmetic is usually 0.0001 to 99.999% by mass, preferably 0.001 to 10% by mass, in terms of dry matter of the extract.
  • the above-mentioned food and drink or feed, or the raw materials thereof are intended and necessary for functions such as suppression of hair growth, suppression of hair growth or hair growth, or hair removal or hair removal, which contains beech grass or an extract thereof as an active ingredient.
  • the food may be a food, a functional food, a food for a sick person, a food for specified health use, a pet food or the like, or a raw material thereof.
  • the kind of said food / beverage products is not specifically limited.
  • Examples of the beverage include all beverages such as fruit juice beverages, carbonated beverages, tea beverages, milk beverages, alcoholic beverages, and soft drinks.
  • the form of the food may be any form such as solid, semi-solid, liquid, etc., and may be tablet form, pill form, tablet, capsule form, liquid form, syrup form, powder form, granule form, etc. Also good.
  • food breads, noodles, pasta, jelly-like foods, various snacks, cakes, confectionery, ice creams, soups, dairy products, frozen foods, instant foods, other processed foods, seasonings, And supplements.
  • the kind of the feed is not particularly limited, and may be a feed for any animal, and the form thereof may be any form as in the case of the food.
  • the above-mentioned food and drink or feed, or their raw materials may contain beech grass or its extract alone, or other foods, solvents, softeners, oils, emulsifiers, preservatives, aromatics, stabilizers Further, additives such as a colorant, an antioxidant, a moisturizing agent, and a thickener may be contained in combination.
  • the content of beech grass or its extract in the food or drink or feed is usually 0.0001 to 99.999% by mass, preferably 0.001 to 10% by mass, in terms of dry matter of the extract. .
  • a method for inhibiting hair growth characterized by administering beech grass or an extract thereof.
  • beech grass or an extract thereof is administered in an effective amount to a subject in need thereof for hair growth inhibition, hair growth or hair growth inhibition, hair removal or hair removal.
  • beech grass or an extract thereof is taken in an effective amount by a subject in need thereof for hair growth inhibition, hair growth or hair growth inhibition, hair removal or hair removal.
  • Subjects to be administered or ingested include animals, preferably humans or non-human mammals, more preferably humans.
  • the subject to be administered or ingested can be an animal-derived tissue, organ, cell, or fraction thereof.
  • the tissue, organ, cell, or fraction thereof is preferably a naturally-derived or biologically or bioengineered tissue, organ, cell, or fraction thereof having hair growth ability. is there.
  • the tissue, organ, cell, or fraction thereof is derived from the skin.
  • beech grass or its extract is applied to the above-listed areas where hair growth suppression is desired in the target skin tissue.
  • Preferred dosages and intakes may vary according to the subject's species, weight, sex, age, condition or other factors.
  • the dose, route, interval, and amount and interval of intake can be determined appropriately by those skilled in the art.
  • the dosage when applied to human skin, is preferably 0.01 to 1000 mg / day, 0.1 to 100 mg / day per adult, as a beech extract (in terms of dried extract). Day is more preferred.
  • each luciferase activity was measured.
  • the luciferase assay was performed using the Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega). After removing the medium, Dual-Glo luciferase reagent diluted 2-fold with PBS was added, and after stirring, the firefly luciferase activity was measured about 20 minutes later. Thereafter, an equal amount of Dual-Glo Stop & Glo reagent was added, and after stirring, Renilla luciferase activity was measured. In both cases, the measurement time for luciferase activity was 2 seconds.
  • DnaJC6 promoter activity inhibition rate (%) ⁇ (Solvent control addition group-test substance addition group) / solvent control addition group ⁇ ⁇ 100
  • RNA was extracted from MeWo cells cultured for 24 hours using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). The preparation of total RNA was performed according to the attached instruction manual. The total RNA was subjected to heat treatment at 65 ° C. for 5 minutes after adjusting the concentration, and used after rapid cooling. For the reverse transcription reaction, a fixed amount of total RNA and Oligo (dT) 20 were used, and ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) was used. The reaction was performed according to the attached instruction manual. RT samples were stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • Quantification of mRNA expression by Real-time RT-PCR was performed using a POWER SYBR-green PCR Master Mix (ABI) and a PCR product automatic detection / quantification system PRISM7500 (ABI).
  • amplification conditions were 95 ° C., 15 seconds denaturation reaction, 60 ° C., 1 minute annealing and extension reaction.
  • the expression level of DnaJC6 mRNA gene was corrected by the expression level of control gene RPLP0 mRNA.
  • Primers used for RT-PCR were Primer express ver. Designed using 2.0 (ABI). The primers used are shown in Table 1 below.
  • the primary antibodies were rabbit anti-DnaJC6 antibody prepared by standard methods at 1 ⁇ g / ml in 5% skim milk, and goat anti-beta-Actin (I-19) antibody (SantaCruz) in 0.2 ⁇ g in 5% skim milk. / Ml.
  • Secondary antibodies were anti-rabbit IgG-HRP (Amersham) or anti-goat IgG-HRP (SantaCruz), respectively, and used at a dilution of 1/2000 in 5% skim milk.
  • ECL color development was performed using LumiGLO Reagent and Peroxide (Cell Signaling) according to the instruction manual.
  • Example 2 Evaluation of Barberation of Test Substance Using Human Isolated Hair Follicle A human scalp sample was disinfected by immersing in a 0.1% Hibiten solution for 1 minute and then washed with PBS. Thereafter, hair follicles were isolated using a forceps and a scalpel in a William E medium (Invitrogen) under a stereomicroscope.
  • the isolated hair follicles were added to William E medium in 2 mM L-Glutamine (Invitrogen), 10 ⁇ g / ml Insulin (Invitrogen), 40 ng / ml Hydrocortisone (SIGMA), 1% Antibiotics-antimitogenics (Invitrogen) Medium (24 well plate, 300 ⁇ l) was cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the oren extract and the beech rose extract prepared in Example 1 were adjusted to a concentration of 1 mg / ml with 50% ethanol and added to the medium so that the concentration was 0.1 vol% (final concentration 1 ⁇ g / ml).
  • Example 2 Production Example Using the extract obtained in Example 1 as an active ingredient, lotions, creams, aerosols, packs, foundations, lotions, and gels having the compositions shown below were prepared by conventional methods.
  • Aerosol The following component A was uniformly mixed and placed in a container, and the liquid petroleum gas (propellant) of B was filled into the container by a conventional method to produce an aerosol.
  • Composition Composition: Mass%)
  • a Funabara grass extract 1.0 (dry solids)
  • Cetanol 1.2
  • Propylene glycol 4.0
  • Ethanol 8.0
  • Purified water balance B Liquefied petroleum gas (propellant) 4.0
  • composition Composition: Mass%) Beech grass extract 3.0 (dry solids) Polyvinyl alcohol 20.0 Glycerin 5.0 Ethanol 16.0 Fragrance Trace amount Pigment Trace amount Purified water Remaining
  • composition Composition: Mass%) Beech extract (1.0% dry solids) Spherical silica beads 20.0 Silica coated sericite 45.0 Ultrafine titanium oxide 10.0 Yellow iron oxide 3.0 Talc 5.0 Mica 5.0 Bengala 1.0 Gunjo 1.0 Paraben 0.2 Liquid paraffin 4.8 Squalane 4.0
  • composition Composition: Mass%) Beech extract (5.0% dry solids) Glycerin 15.0 Dipropylene glycol 5.0 Purified water balance
  • composition Composition: Mass%) Polyacrylic acid 0.5 Potassium hydroxide 0.15 Gurucam 10.0 Glycerin 10.0 Glycine betaine 3.0 Beech extract (2.0 dry solids) Succinic acid 1.5 Purified water balance

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Abstract

　本発明は、毛成長制御方法、毛成長制御剤の評価又は選択方法、及び毛成長抑制剤を提供する。本発明は、毛成長制御剤の評価又は選択方法であって、ＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞に試験物質を投与する工程；当該細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現を測定する工程；及び、当該発現に基づいて当該試験物質の毛成長制御効果を評価する工程、を包含する方法を提供する。また本発明は、フナバラソウ又はその抽出物を有効成分として含有する毛成長抑制剤を提供する。

Description

毛成長制御方法、毛成長制御剤の評価又は選択方法、及び毛成長抑制剤
　本発明は、毛成長制御方法、毛成長制御剤の評価又は選択方法、及び毛成長抑制剤に関する。
　頭髪や体毛は、生物学的には頭部、胸部、手足等の重要な器官を防護するものである。しかしながら、近年、特に手足等における体毛は、美的外観上無い方が好ましいとする傾向が高まっている。
　体毛を除去する方法としては、シェーバー、抜毛器等を用いる機械的除去方法、脱毛剤や除毛剤を用いた化学的作用による除去方法が挙げられる。しかしながら、これらの体毛除去方法は、皮膚に対して物理的又は化学的刺激を伴う場合があり、また抑毛作用という点では未だ不十分であるため、一定期間経過後には再び体毛除去処理を行わなければならない。体毛除去処理の軽減化が望まれている。
　従来、育毛剤又は抑毛剤を評価又は選択する場合、生体の皮膚に塗布するか（特許文献１～３）、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でヒトやマウス若しくはラット、又はブタの毛包の器官培養物に候補物質を投与した後、毛の伸長や毛包の成長の度合いを測定し、その測定結果に基づいて候補物質の育毛又は抑毛作用を評価していた（特許文献４～７、非特許文献１～３）。効率や評価の正確性を考えるとｉｎ　ｖｉｔｒｏでの試験がより好ましい。しかしｉｎ　ｖｉｔｒｏでの毛包の器官培養は、試料となる毛包の入手が困難である場合があること、培養に手間がかかること、毛の伸長や毛包成長が観察されるまでに数日間を要するため評価に時間がかかるなどの問題があった。より効率的に育毛剤又は抑毛剤を評価又は選択するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏスクリーニング系の開発が求められている。
　特許文献７には、ヒト毛嚢に、熱ショックタンパク質ＨＳＰ－２７、ＨＳＰ－７０及びＨＳＰ－９０が存在すること、毛嚢へのＨＳＰ－２７抗体の投与により毛髪繊維発育の有意な低減が観察されたこと、ＨＳＰ－９０特異的阻害物質ゲルダナマイシン、又はＨＳＰ合成阻害物質であるＫＮＫ４３７の投与により、ヒト毛嚢成育が容量依存的に低減したことが記載されている。しかし、熱ショックタンパク質は種類が多く、その機能も多岐にわたるため、上記の熱ショックタンパク質が毛成長に関与する分子メカニズムは明らかでなく、また他の熱ショックタンパク質が毛成長に関与し得るかどうかを予測することはできなかった。
　フナバラソウ（Ｃｙｎａｎｃｈｕｍ　ａｔｒａｔｕｍ）は、ガガイモ科カモメヅル属の多年草で、その根は白薇湯などの漢方方剤に用いられている。フナバラソウは、清熱涼血、解熱、利尿作用等の薬効を有することが知られており、またその薬効成分として、強心配糖体作用を有するＣｙｎａｎｃｈｏｌが知られている。
　特許文献８には、白薇を含む津液作用を有する生薬のエキス及びその活性成分と血管新生活性作用を有する生薬のエキス及びその活性成分とを含有する育毛用の皮膚外用剤が開示されている。特許文献９には、ガガイモ科に属する植物の抽出物を含む組成物を体毛成長の阻害、抑制または遅延を含むヒト皮膚の化粧処置のために使用することが記載されている。しかし、フナバラソウがそれ単独で毛成長に対してどのような影響を及ぼすのかは明らかではなかった。
国際公開第０３／０８６３３１号パンフレット 特開２００５－２０６５３６号公報 特開２００６－００８６５７号公報 国際公開第２０１０／０１６６０６号パンフレット 特開平１１－４９６４７号公報 特開２００２－６２２８９号公報 特許第４１８９０２４号 特開２００３－２２１３１３号公報 特表２００７－５１７８２４号公報
Ｊｉｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ，２０：７５６－７６２，１９９３． 宇塚　誠及び▲奏▼沢　千加，日皮誌，１０４（８）：９７９－９８７，１９９４． Ｐｈｉｌｐｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，９７：４６３－４７１，１９９０．
　すなわち、一態様において、本発明は、毛髪組織におけるＤｎａＪＣ６の活性化レベルを制御する工程を含む、毛成長制御方法を提供する。
　別の態様において、本発明は、下記工程（Ａ）～（Ｃ）：
　　（Ａ）試験物質の存在下及び非存在下でＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量を測定する工程；
　　（Ｂ）試験物質存在下での当該細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量と、試験物質非存在下での当該細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量とを比較する工程；及び
　　（Ｃ）試験物質の存在下と非存在下との間でＤｎａＪＣ６の発現量が有意に異なっていた場合に、当該試験物質を毛成長制御剤として選択する工程、
を含む毛成長制御剤の評価又は選択方法を提供する。
　本発明のまた別の態様は、毛成長抑制に使用するためのフナバラソウ又はその抽出物である。あるいは、毛成長抑制のための医薬若しくは化粧品の製造における、フナバラソウ又はその抽出物の使用である。
　さらに別の態様において、本発明は、フナバラソウ又はその抽出物を毛成長抑制が所望される皮膚組織に適用することを含む毛成長抑制方法を提供する。
　また別の態様において、本発明は、フナバラソウ又はその抽出物を有効成分として含有する毛成長抑制剤を提供する。
オウレン抽出物及びフナバラソウ抽出物がヒトＤｎａＪＣ６プロモーター活性に与える影響。ｎ＝３、ｍｅａｎ±ＳＤ。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊＊：Ｐ＜０．００１（ｎｏｎ－ｐａｉｒｅｄ　ｔ－ｔｅｓｔ、ｖｓ　Ｖｅｈｉｃｌｅ）。 オウレン抽出物及びフナバラソウ抽出物がヒトＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡ発現に与える影響。ｎ＝３、ｍｅａｎ±ＳＤ。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１（ｎｏｎ－ｐａｉｒｅｄ　ｔ－ｔｅｓｔ、ｖｓ　Ｖｅｈｉｃｌｅ）。 オウレン抽出物及びフナバラソウ抽出物がヒトＤｎａＪＣ６タンパク質発現に与える影響。 オウレン抽出物が毛成長に与える影響。Ａ：毛成長の経時観察結果（ｎ＝５又は６、ｍｅａｎ±ＳＤ。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１（ｎｏｎ－ｐａｉｒｅｄ　ｔ－ｔｅｓｔ、ｖｓ　Ｖｅｈｉｃｌｅ）。Ｂ：１０日後の培養毛包画像。 フナバラソウ抽出物が毛成長に与える影響。Ａ：毛成長の経時観察結果（ｎ＝１０～１４、ｍｅａｎ±ＳＤ。＊＊＊：Ｐ＜０．００１（ｎｏｎ－ｐａｉｒｅｄ　ｔ－ｔｅｓｔ、ｖｓ　Ｖｅｈｉｃｌｅ）。Ｂ：９日後の培養毛包画像。
　本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
　本明細書において、「毛成長制御」とは、毛または毛包の伸長を促進または抑制する作用、あるいは毛径を増加または減少させる作用を意味する。すなわち、本明細書における「毛成長制御」とは、毛成長の促進及び抑制を含む概念である。
　本明細書において、「ＤｎａＪＣ６」とは、ＮＣＢＩのデータベース（ＯＭＩＭ）［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｏｍｉｍ］にＭＩＭ　ＩＤ　＊６０８３７５として登録されているタンパク質を指す。ＤｎａＪＣ６は、熱ショック蛋白質に分類されるタンパク質である。熱ショック蛋白質には多くのファミリーが存在し、例えば、ＨＳＰ１１０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ１０のファミリーに大別される。このうち、ＤｎａＪＣ６は、ＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０ファミリーに属する分子シャペロンである。
　本明細書において、「ＤｎａＪＣ６遺伝子」、「ＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡ」、及び「ＤｎａＪＣ６プロモーター」とは、それぞれ、ＤｎａＪＣ６をコードする遺伝子、そのｍＲＮＡ、及びＤｎａＪＣ６をコードする遺伝子を制御するプロモーターをいう。
　本発明は、遺伝子の発現の制御による毛成長制御方法、遺伝子の発現を指標とした毛成長制御剤の評価又は選択方法、及び毛成長抑制剤に関する。
　本発明者らは、ＤｎａＪＣ６の発現を制御することで毛成長を制御することができること、ＤｎａＪＣ６の発現を指標とすることで毛成長を制御する物質を効率的に評価又は選択できること、および毛成長を抑制する物質を探索した結果、フナバラソウ又はその抽出物が毛成長を抑制する作用を有することを見出した。
　本発明によれば、動物の身体の所望の部位において毛成長を制御することができる。また本発明によれば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、簡便、迅速に且つ効率よく毛成長制御剤を評価又は選択することができる。また本発明によれば、植物由来の、生体に対して安全で且つ効果の高い素材を用いて、毛成長抑制を実現することができる。
　一態様において、本発明は、毛包組織におけるＤｎａＪＣ６の活性化レベルを制御する工程を含む毛成長制御方法を提供する。
　上記組織としては、動物の生体の組織、及び動物の生体由来の組織が挙げられる。動物としては、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物、より好ましくはヒトが挙げられる。また好ましくは、動物としては、毛成長制御を必要とする動物、例えば、発毛又は育毛を所望する又は所望しない動物、除毛又は脱毛を所望する動物、脱毛を所望しない動物等が挙げられる。生体由来の組織としては、動物から採取された組織及びそれらの培養物が挙げられる。
　上記活性化レベルの制御は、例えば、上記組織におけるＤｎａＪＣ６タンパク質の存在量、ＤｎａＪＣ６タンパク質の活性化、ＤｎａＪＣ６タンパク質の発現、ＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの発現、又はＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの活性化を制御することによって行うことができる。これらは、単独で制御されてもよく、組み合わせて制御されてもよい。
　一実施形態において、上記制御する工程は、ＤｎａＪＣ６の活性化レベルを低下させることによって毛成長を抑制する工程であり得る。
　ＤｎａＪＣ６の活性化レベルを低下させる手段としては、例えば、ＤｎａＪＣ６タンパク質に特異的な抗体を用いたＤｎａＪＣ６タンパク質の不活性化、ＤｎａＪＣ６遺伝子のプロモーターの活性を阻害することによるＤｎａＪＣ６遺伝子からｍＲＮＡへの転写の抑制、ＲＮＡｉ等の手段によるＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の抑制等が挙げられる。
　好ましい実施形態において、上記活性化レベルは、ＤｎａＪＣ６遺伝子のプロモーターの活性として好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上低下する。あるいは、ＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡの発現量として好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上低下する。ＤｎａＪＣ６の活性化レベルの低下によって、上記組織の毛成長は抑制される。
　別の実施形態において、上記制御する工程は、ＤｎａＪＣ６の活性化レベルを増強させることによって毛成長を促進する工程であり得る。
　ＤｎａＪＣ６の活性化レベルを増強させる手段としては、例えば、上記組織の細胞へのＤｎａＪＣ６遺伝子の導入、上記組織の細胞へのＤｎａＪＣ６遺伝子を含む発現ベクターの導入、ＤｎａＪＣ６遺伝子のプロモーターの活性を増加させることによるＤｎａＪＣ６遺伝子からｍＲＮＡへの転写の促進、ＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡの分解の抑制、ＤｎａＪＣ６タンパク質の分解の抑制等が挙げられる。
　好ましい実施形態において、上記活性化レベルは、ＤｎａＪＣ６遺伝子のプロモーターの活性として好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上増強する。あるいは、ＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡの発現量として好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上増強する。ＤｎａＪＣ６の活性化レベルの増強によって、上記組織の毛成長は促進される。
　本発明の別の一態様においては、下記工程（Ａ）～（Ｃ）を含む毛成長制御剤の評価又は選択方法が提供される：
　（Ａ）試験物質の存在下及び非存在下でＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量を測定する工程；
　（Ｂ）試験物質存在下での当該細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量と、試験物質非存在下での当該細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量とを比較する工程；及び
　（Ｃ）試験物質の存在下と非存在下との間でＤｎａＪＣ６の発現量が有意に異なっていた場合に、当該試験物質を毛成長制御剤として選択する工程。
　上記「ＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞」としては、生来的にＤｎａＪＣ６遺伝子を有し、これを発現する能力のある細胞、及び外来的にＤｎａＪＣ６遺伝子を発現可能に導入された細胞が挙げられる。当該細胞は、生体から採取された細胞、または生体から採取された組織や器官に含まれる細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。好ましくは、当該細胞は、哺乳動物に由来する。生来的にＤｎａＪＣ６遺伝子を有し、これを発現する能力のある細胞としては、生体のあらゆる組織に由来する細胞が挙げられるが、好ましくは、哺乳動物から採取された皮膚由来の細胞、例えば、哺乳動物皮膚切片中に存在する細胞、毛髪組織由来の細胞、表皮組織由来の細胞、真皮組織由来の細胞（線維芽細胞等）、及び脳由来の細胞等、ならびにこれらの細胞に由来する細胞培養物、器官培養物等の高次培養物が挙げられる。外来的にＤｎａＪＣ６遺伝子を発現可能にした細胞は、ＤｎａＪＣ６遺伝子を組み込んだ発現ベクターを任意の哺乳動物細胞に導入し、当該細胞を形質転換させることによって得ることができる。ＤｎａＪＣ６遺伝子を組み込んだ発現ベクターの作製方法及び発現ベクターの哺乳動物細胞への導入方法は、当業者に周知である。
　上記試験物質としては、毛成長制御剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されず、例えば、動植物、海洋生物、微生物等及びその抽出物；それらに由来する天然成分；合成化合物；ならびにそれらの混合物及び組成物等が挙げられる。
　上記工程（Ａ）においては、試験物質の存在下及び非存在下で、ＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量が測定される。例えば、ＤｎａＪＣ６の発現量は、細胞への試験物質投与前後で、又は試験物質添加群と試験物質非添加群において、若しくは又は試験物質添加群と対照物質添加群とにおいて、それぞれ測定される。
　ＤｎａＪＣ６の発現量の測定は、ＤｎａＪＣ６タンパク質の発現、又はＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの発現、ＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの活性化の量等を指標として測定することができる。これらの指標は、単独で測定されてもよく、組み合わせて測定されてもよい。測定は、指標とするパラメータ（例えば、タンパク質発現、遺伝子又はｍＲＮＡ発現、プロモーターの活性化等）の測定方法として当該分野で公知の方法に従って行えばよい。
　例えば、ＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの発現量の測定方法としては、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法、ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ法、ＤＮＡアレイ解析等が挙げられる。
　また例えば、ＤｎａＪＣ６のタンパク質の発現量の測定方法としては、アガロースゲル電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、クロマトグラフィー法、免疫学的測定法（例えば、ＤｎａＪＣ６タンパク質に特異的な抗体を利用する免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降等）、比色定量法、蛍光・光学的測定法、質量分析、電子顕微鏡観察等、及びこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。上記のうち、ＤｎａＪＣ６タンパク質に特異的な抗体を利用するＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が好ましい。
　上記工程（Ｂ）においては、上記（Ａ）で測定された値が、試験物質の存在下の場合と非存在下の場合との間で比較される。例えば、試験物質投与前後で、又は試験物質添加群と試験物質非添加群若しくは対照物質添加群とを比較することによって行われる。例えば、（Ａ）で測定されたＤｎａＪＣ６タンパク質の発現、又はＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの発現、ＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの活性化の量等が、試験物質投与前後で、試験物質添加群と試験物質非添加群との間で、又は試験物質添加群と対照物質添加群との間で、比較される。好ましくは、比較は、統計学的に行われる。
　上記工程（Ｃ）においては、上記（Ｂ）で得られた比較結果に基づいて、試験物質の毛成長制御効果を評価する。ＤｎａＪＣ６の発現に影響を与えた物質を毛成長制御剤として選択することができる。例えば、試験物質の存在下と非存在下との間で上記細胞のＤｎａＪＣ６の発現量が有意に異なっていた場合、当該試験物質を毛成長制御剤として選択することができる。
　一実施形態において、ＤｎａＪＣ６の発現量を減少させる試験物質は毛成長抑制剤として選択される。好ましい例として、試験物質非存在下の場合と比べて、試験物質存在下でのＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡの発現量が好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上減少した場合、当該物質は毛成長抑制剤として選択される。発現量の減少は統計学的に有意であることが好ましい。
　別の実施形態において、ＤｎａＪＣ６の発現量を増加させる試験物質は毛成長促進剤として選択される。好ましい例として、試験物質非存在下の場合と比べて、試験物質存在下でのＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡの発現量が好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上増加した場合、当該物質は毛成長促進剤として選択される。発現量の減少は統計学的に有意であることが好ましい。
　ＤｎａＪＣ６遺伝子プロモーターの活性化を指標にＤｎａＪＣ６の発現を測定する場合、下記（ａ）～（ｄ）の工程を含む方法が好ましい例として挙げられる：
　（ａ）ＤｎａＪＣ６をコードする遺伝子のプロモーターにより制御されるレポーター遺伝子を、ＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞に導入する工程；
　（ｂ）試験物質の存在下及び非存在下で、当該細胞におけるレポーター遺伝子発現産物の量を測定する工程；
　（ｃ）試験物質存在下での当該細胞におけるレポーター遺伝子発現産物の量と、試験物質非存在下での当該細胞におけるレポーター遺伝子発現産物の量とを比較する工程；及び
　（ｄ）試験物質の存在下と非存在下との間で当該レポーター遺伝子発現産物の量が有意に異なっていた場合に、当該試験物質を毛成長制御剤として選択する工程。
　測定に用いるプロモーターとしては、ヒトＤｎａＪＣ６プロモーターが好ましい。ヒトＤｎａＪＣ６プロモーターとしては、配列番号１で示される塩基配列を有するプロモーター、及び配列番号１で示される塩基配列に対して１個～数個（好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個）の塩基が置換、欠失、挿入、付加されており、且つ配列番号１で示される塩基配列を有するプロモーターと同様の転写因子に制御されて下流の遺伝子の発現を制御するものが挙げられる。
　上記（ａ）においては、ＤｎａＪＣ６をコードする遺伝子のプロモーターにより制御されるレポーター遺伝子が、ＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞に導入される。好ましくは、当該プロモーターの下流にレポーター遺伝子を作動可能に連結する。好ましい実施形態において、上記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、及び緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される。
　上記（ｂ）～（ｄ）は、測定対象がレポーター遺伝子発現産物の量であることを除いて、上記（Ａ）～（Ｃ）と同様である。すなわち、上記（ｄ）では、試験物質の存在下と非存在下との間で上記細胞のレポーター遺伝子発現産物の量が有意に異なっていた場合、当該試験物質を毛成長制御剤として選択することができる。
　一実施形態において、上記レポーター遺伝子発現産物の量を減少させる試験物質は毛成長抑制剤として選択され得、該レポーター遺伝子発現産物の量を増加させる試験物質は毛成長促進剤として選択され得る。好ましくは、試験物質存在下でのレポーター遺伝子発現産物の量の減少が、試験物質非存在下の場合と比べて好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上の場合、当該物質は毛成長抑制剤として選択される。また好ましくは、試験物質存在下でのレポーター遺伝子発現産物の量の増加が、試験物質非存在下の場合と比べて好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上の場合、当該物質は毛成長促進剤として選択される。発現量の減少は統計学的に有意であることが好ましい。
　斯くして得られた毛成長制御剤は、発毛、育毛、除毛、脱毛、発毛抑制等のために使用でき、あるいは発毛剤、育毛剤、除毛剤、脱毛剤、発毛抑制剤等の有効成分となり得る。またあるいは、当該毛成長制御剤を、発毛、育毛、除毛、脱毛、発毛抑制等の毛成長の促進又は抑制を必要とする被験体に投与することにより、その被験体において毛成長を促進又は抑制し、発毛、育毛、除毛、脱毛、発毛抑制等を実現することができる。またあるいは、当該毛成長制御剤は、発毛、育毛、除毛、脱毛、発毛抑制等のための組成物、医薬、医薬部外品、化粧料又は飲食品として、あるいはそれらの製造のために使用することができる。
　後記実施例に示すように、本発明者らは、フナバラソウ抽出物がヒト器官培養毛の伸長を有意に抑制する作用を有することを見出した。従って、フナバラソウ又はその抽出物は、毛成長抑制剤として有用である。また、フナバラソウ又はその抽出物は、当該毛成長抑制作用を介して、発毛若しくは育毛の抑制、又は除毛、脱毛等の効果を発揮することができる。すなわち、フナバラソウ又はその抽出物は、毛成長抑制のため、発毛若しくは育毛の抑制のため、又は除毛、脱毛等のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
　従って、一態様として、本発明は、フナバラソウ又はその抽出物を有効成分として含有する毛成長抑制剤を提供する。一実施形態として、本発明の毛成長抑制剤は、本質的にフナバラソウ又はその抽出物から構成される。当該毛成長抑制剤は、発毛又は育毛の抑制のため、あるいは除毛又は脱毛のために使用することができる。
　本明細書において、「フナバラソウ」とは、ガガイモ科カモメヅル属の多年草Ｃｙｎａｎｃｈｕｍ　ａｔｒａｔｕｍを指し、「フナバラソウ抽出物」とは、フナバラソウから得られた抽出物を意味する。抽出物は、フナバラソウの任意の部位、例えば全草若しくは根、又はそれらの組み合わせからの抽出物であればよいが、根からの抽出物が好ましい。上記部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、又は粉砕、切断若しくは乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。
　上記抽出物としては、市販されているものを利用してもよく、又は常法により得られる各種溶剤抽出物、又はその希釈液、その濃縮液、その乾燥末、ペースト若しくはその活性炭処理したものであってもよい。一例として、本発明におけるフナバラソウ抽出物は、フナバラソウを室温（例えば、４～５０℃）若しくは加温（室温～溶媒沸点）下にて抽出するか、又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得ることができる。
　抽出のための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類及びその水溶液が挙げられ、アルコール類としてはエタノールが好ましい。より好ましい溶剤は、水及びエタノール水溶液である。
　アルコール水溶液におけるアルコール類と水との配合割合（容量比）としては、０．００１～１００：９９．９９９～０が好ましく、５～９５：９５～５がより好ましく、２０～８０：８０～２０がさらに好ましく、３０～７０：７０～３０がさらにより好ましく、４０～６０：６０～４０がなお好ましい。エタノール水溶液の場合、エタノール類濃度が４０～６０容量％であることが好ましい。溶剤の使用量としては、フナバラソウ根（乾燥質量換算）１ｇに対して１～１００ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間～２ヶ月間が好ましく、１０分間～４週間がより好ましい。このときの抽出温度は、０℃～溶媒沸点、より好ましくは１０～６０℃、さらに好ましくは１５～４０℃である。
　抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。例えば、浸漬の好適な一例として、１５～４０℃で、１時間～４週間の浸漬が挙げられる。また、抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１０～１００℃（好ましくは２０～１００℃）下、１０００～５０００ｒｐｍで１～３０分間の攪拌が挙げられる。抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
　フナバラソウ又はその抽出物は、毛成長抑制のため、発毛又は育毛の抑制のため、あるいは除毛又は脱毛のための組成物、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品若しくはその原料、又は飼料若しくはその原料として使用することができ、あるいはそれらの製造のために使用することができる。当該組成物、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品若しくはその原料、又は飼料若しくはその原料は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。
　あるいは、フナバラソウ又はその抽出物は、毛成長抑制のため、発毛又は育毛の抑制のため、あるいは除毛又は脱毛のための組成物、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料に素材として配合され得る。
　上記医薬又は医薬部外品は、フナバラソウ又はその抽出物を有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与形態は、経口投与でも外用剤等の非経口投与でもよい。例えば、経口投与形態としては、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシロール、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与形態としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。
　上記医薬や医薬部外品は、フナバラソウ又はその抽出物を単独で含有していてもよく、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、希釈剤、分散剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該医薬や医薬部外品は、フナバラソウ又はその抽出物の毛成長抑制作用が失われない限り、他の有効成分や薬理成分を含有していてもよい。
　上記医薬又は医薬部外品は、フナバラソウ又はその抽出物から、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や薬理成分を組みあわせて、常法により製造することができる。当該医薬又は医薬部外品におけるフナバラソウ又はその抽出物の含有量は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．００１～９９．９９９質量％であり、０．０１～２０質量％とするのが好ましい。
　上記化粧料は、フナバラソウ又はその抽出物を有効成分として含有する。上記化粧料は、フナバラソウ又はその抽出物を単独で含有していてもよく、又は化粧料として許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。
　斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、希釈剤、分散剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該化粧料は、フナバラソウ又はその抽出物の毛成長抑制作用が失われない限り、他の有効成分や化粧成分、例えば、保湿剤、美白剤、紫外線保護剤、細胞賦活剤、洗浄剤、角質溶解剤、メークアップ成分（例えば、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、チーク、口紅、アイメーク、アイブロウ、マスカラ、その他）等を含有していてもよい。
　化粧料の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、フォーム、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧料に使用され得る任意の形態が挙げられる。好ましくは、除毛又は脱毛用のローション、乳液、クリーム、フォーム、ジェル等の形態であり得る。
　上記化粧料は、フナバラソウ又はその抽出物から、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や化粧成分を組みあわせて、常法により製造することができる。当該化粧料におけるフナバラソウ又はその抽出物の含有量は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．０００１～９９．９９９質量％であり、０．００１～１０質量％とするのが好ましい。
　上記飲食品若しくは飼料、又はそれらの原料は、フナバラソウ又はその抽出物を有効成分として含有する、毛成長抑制、発毛又は育毛の抑制、あるいは除毛又は脱毛等の機能を企図し、且つ必要に応じてその機能を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、ペットフード等、又はそれらの原料であり得る。上記飲食品の種類は特に限定されない。飲料としては、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等、あらゆる飲料が挙げられる。食品の形態は、固形、半固形、液状等の任意の形態であってもよく、また錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。例えば、食品としては、パン類、麺類、パスタ、ゼリー状食品、各種スナック類、ケーキ類、菓子類、アイスクリーム類、スープ類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、その他加工食品、調味料、サプリメント等が挙げられる。上記飼料の種類も特に限定されず、任意の動物のための飼料であってよく、その形態も上記食品の場合と同様に任意の形態であり得る。
　上記飲食品若しくは飼料、又はそれらの原料は、フナバラソウ又はその抽出物を単独で含有していてもよく、又は他の食材や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等の添加剤を組み合わせて含有していてもよい。当該飲食品若しくは飼料中のフナバラソウ又はその抽出物の含有量は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．０００１～９９．９９９質量％であり、０．００１～１０質量％とするのが好ましい。
　本発明のなお別の実施形態においては、フナバラソウ又はその抽出物を投与することを特徴とする毛成長抑制方法を提供する。当該方法において、フナバラソウ又はその抽出物は、毛成長抑制のため、発毛又は育毛の抑制のため、あるいは除毛又は脱毛等のため、それらを必要とする対象に有効量で投与される。あるいは、フナバラソウ又はその抽出物は、毛成長抑制のため、発毛又は育毛の抑制のため、あるいは除毛又は脱毛等のため、それらを必要とする対象に有効量で摂取される。
　投与又は摂取する対象としては、動物、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物、より好ましくはヒトが挙げられる。あるいは、投与又は摂取する対象は、動物由来の組織、器官、細胞、又はそれらの分画物であり得る。当該組織、器官、細胞、又はそれらの分画物は、好ましくは、毛成長能力を有する天然由来又は生物学的若しくは生物工学的に改変された組織、器官、細胞、又はそれらの分画物である。また好ましくは、当該組織、器官、細胞、又はそれらの分画物は皮膚由来である。
　好ましくは、フナバラソウ又はその抽出物は、上記に挙げた対象の皮膚組織における毛成長抑制が所望される領域に適用される。
　好ましい投与量及び摂取量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与の用量、経路、間隔、及び摂取の量や間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、ヒトの皮膚に塗布する場合、投与量は、フナバラソウ抽出物（抽出物の乾燥物換算）として、成人１人当たり、０．０１～１０００ｍｇ／日とすることが好ましく、０．１～１００ｍｇ／日がより好ましい。
　以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１　ＤｎａＪＣ６発現に基づく試験物質の評価
（１）手順
（Ａ）オウレン抽出液の調製
　オウレン根（新和物産）４０ｇに５０％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で１３日間浸漬した。これをろ過し、オウレン抽出液を得た。このオウレン抽出液を濃縮したところ、その固形分は５．４６ｇであった。抽出液の固形分濃度は１．７３ｗｔ％であった。
（Ｂ）フナバラソウ抽出液の調製
　フナバラソウ根（新和物産）４０ｇに５０％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で２７日間浸漬した。これをろ過し、フナバラソウ抽出液を得た。このフナバラソウ抽出液を濃縮したところ、その固形分は４．３９ｇであった。抽出液の固形分濃度は１．３３ｗｔ％であった。
（Ｃ）培養物の調製
　ＤｎａＪＣ６発現が認められるヒト培養細胞（２９３Ａ、ＡＴＣＣまたはＭｅＷｏ、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）を、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ、１０％ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＦＢＳ）中３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。試験物質を５０％エタノールにて１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、０．１ｖｏｌ％（最終濃度１μｇ／ｍｌ）となるように培地に添加した。対照群には、同量の５０％エタノール溶液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を培地に添加した。
（Ｄ）ヒトＤｎａＪＣ６プロモーター活性の測定
　ヒトＤｎａＪＣ６プロモーター（配列番号１：９７９ｂｐ［転写開始点から－７７１～＋２０８］）の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたｈＤｎａＪＣ６ｏｐＰ／ｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］プラスミド、及びトランスフェクション効率の補正を目的としてＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたプラスミド（ｐＲＬ－ＣＭＶ、Ｐｒｏｍｅｇａ）をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２９３Ａ細胞にトランスフェクションした。その８時間後に培地を交換し、試験物質を添加した。更に２４時間後にそれぞれのルシフェラーゼ活性を測定した。
　ルシフェラーゼアッセイはＤｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。培地を除去後、ＰＢＳにより２倍希釈したＤｕａｌ－Ｇｌｏ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｒｅａｇｅｎｔを加え、攪拌した後、約２０分後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。その後、等量のＤｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ　ｒｅａｇｅｎｔを加え、攪拌した後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。尚、双方ともルシフェラーゼ活性の測定時間は２秒とした。
　全てのＤｎａＪＣ６プロモーター活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、ＤｎａＪＣ６プロモーター活性阻害率を以下の式にて求め、ＤｎａＪＣ６プロモーター活性を試験物質が何％阻害したかを算出した。
 
　ＤｎａＪＣ６プロモーター活性阻害率（％）
＝｛（溶媒対照添加群－試験物質添加群）／溶媒対照添加群｝×１００
 
（Ｅ）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ
　試験物質を添加後、２４時間培養したＭｅＷｏ細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製は付属の使用説明書に従って実施した。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡは濃度を揃えた後６５℃、５分間の熱処理を行い、急冷後に使用した。逆転写反応には、一定量のｔｏｔａｌ　ＲＮＡとＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を用い、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、反応は付属の使用説明書に従って実施した。ＲＴサンプルは、使用まで－２０℃で保存した。
　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現の定量は、ＰＯＷＥＲ　ＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＡＢＩ）を用い、ＰＣＲプロダクト自動検出／定量システムＰＲＩＳＭ７５００（ＡＢＩ）を用いて実施した。
　５０μｌの反応液にて、増幅条件は、９５℃、１５秒の変性反応、６０℃、１分のアニーリング及び伸長反応にて行った。ＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡ遺伝子発現量は、コントロール遺伝子ＲＰＬＰ０　ｍＲＮＡ発現量により補正した。ＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーはＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ｖｅｒ．２．０（ＡＢＩ）を利用して設計した。用いたプライマーを以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（Ｆ）ウェスタンブロッティング
　試験物質を添加後、２４時間培養したＭｅＷｏ細胞を回収後、１％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ）を含むＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１２５ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＮＰ４０、ｐＨ＝７．６）により可溶化し、Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒと混合後、１００℃、５分間熱処理した後にウェスタンブロッティングに用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は標準的な方法で行い、４－２０％　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌを用いた。ブロッティングはウェット法によりＨｙｂｏｎｄ　Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）メンブレンに転写した。メンブレンに転写後、５％スキムミルクでブロッキングを行った。一次抗体は、標準的な方法にて作製したｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＤｎａＪＣ６抗体を５％スキムミルク中１μｇ／ｍｌで、ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ（Ｉ－１９）抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を５％スキムミルク中０．２μｇ／ｍｌで使用した。二次抗体は、それぞれａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用い、５％スキムミルク中１／２０００希釈で使用した。ＥＣＬ発色はＬｕｍｉＧＬＯ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用い、使用説明書に従って行った。
（２）結果
　結果を図１、２及び３に示す。対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に対してオウレン及びフナバラソウエキスを添加した群では、それぞれＤｎａＪＣ６プロモーター活性及びＤｎａＪＣ６　ｍＲＮＡ発現が有意に抑制され、ＤｎａＪＣ６タンパク質発現量も抑制された。
実施例２　ヒト単離毛包を用いた試験物質の抑毛評価
　ヒト頭皮サンプルは０．１％ヒビテン液に１分間浸漬して消毒後、ＰＢＳにて洗浄した。その後、Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、実体顕微鏡下にてピンセットとメスを用いて毛包を単離した。単離した毛包は、Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｅ培地に２ｍＭ　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４０ｎｇ／ｍｌ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＳＩＧＭＡ）、１％　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ－ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）となるように添加した培地中（２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ、３００μｌ）にて３７℃、５％　ＣＯ２条件下で培養した。実施例１で調製したオウレン抽出液とフナバラソウ抽出液を５０％エタノールにて１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、０．１ｖｏｌ％（最終濃度１μｇ／ｍｌ）となるように培地に添加した。対照として、同量の５０％エタノール溶液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を培地に添加した。
　器官培養毛は、経時的に顕微鏡下で写真を撮影、同条件で撮影されたスケールを元に画像解析にて毛包の長さを算出した。画像解析はＮｅｗＱｕｂｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０．３、Ｎｅｘｕｓ）により実施し、初期値からの増加量を毛伸長量とした。
　結果を図４及び５に示す。対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）では、培養時間に従って毛包の伸長（毛成長）が観察された一方、ＤｎａＪＣ６発現抑制作用を有するオウレン又はフナバラソウ添加群では、毛包の伸長が有意に抑制された。
製造実施例
　実施例１で得られた抽出物を有効成分として、下記に示す組成のローション、クリーム、エアゾール、パック剤、ファンデーション、化粧水、ジェルを常法により各々調製した。
製造実施例１．発毛抑制ローション
　下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製した。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製した。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、ローションを得た。
 
　　（組成）　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
　Ａ　ポリオキシエチレン硬化ひまし油　　　　　　０．８
　　　エタノール　　　　　　　　　　　　　　　３０．０
　Ｂ　フナバラソウ抽出物　　　　　　　　　　　　１．０（乾燥固形分）
　　　ドデシル硫酸ナトリウム　　　　　　　　　　０．１２
　　　ドデシルメチルアミンオキシド　　　　　　　０．１８
　　　イソプロピルアルコール　　　　　　　　　１５．０
　　　ベンジルアルコール　　　　　　　　　　　１５．０
　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　２．０
　　　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部
 
製造実施例２．発毛抑制クリーム
　下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製した。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製した。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、乳化後、冷却して、クリームを得た。
 
　　（組成）　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
　Ａ　流動パラフィン　　　　　　　　　　　　　１０．０
　　　スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　７．０
　　　ホホバ油　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０
　　　固形パラフィン　　　　　　　　　　　　　　３．０
　　　ポリオキシエチレンセチルエーテル　　　　　２．０
　　　ソルビタンセスキオレエート　　　　　　　　１．０
　　　水酸化カリウム　　　　　　　　　　　　　　０．１
　Ｂ　フナバラソウ抽出物　　　　　　　　　　　　１．０（乾燥固形分）
　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　３．０
　　　エチルパラベン　　　　　　　　　　　　　　０．１
　　　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部
 
製造実施例３．エアゾール
　下記Ａの成分を均一に混合して容器に入れ、Ｂの液化石油ガス（噴射剤）を常法により容器に充填してエアゾールを製造した。
 
　　（組成）　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
　Ａ　フナバラソウ抽出物　　　　　　　　　　　　１．０（乾燥固形分）
　　　セタノール　　　　　　　　　　　　　　　　１．２
　　　プロピレングリコール　　　　　　　　　　　４．０
　　　エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　８．０
　　　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部
　Ｂ　液化石油ガス（噴射剤）　　　　　　　　　　４．０
 
製造実施例４．発毛抑制パック剤
　下記の組成のパック剤を常法により調製した。
 
（組成）　　　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
　フナバラソウ抽出物　　　　　　　　　　　　　　３．０（乾燥固形分）
　ポリビニルアルコール　　　　　　　　　　　　２０．０
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０
　エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　１６．０
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微量
　色素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微量
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部
 
製造実施例５．ファンデーション
　下記の組成のファンデーションを常法により調製した。
 
（組成）　　　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
　フナバラソウ抽出物　　　　　　　　　　　　　　１．０（乾燥固形分）
　球状シリカビーズ　　　　　　　　　　　　　　２０．０
　シリカ被覆セリサイト　　　　　　　　　　　　４５．０
　超微粒子酸化チタン　　　　　　　　　　　　　１０．０
　黄酸化鉄　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０
　タルク　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０
　マイカ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０
　ベンガラ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０
　グンジョウ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０
　パラベン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２
　流動パラフィン　　　　　　　　　　　　　　　　４．８
　スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０
 
製造実施例６．発毛抑制化粧水
　下記の組成の化粧水を常法により調製した。
 
（組成）　　　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
　フナバラソウ抽出物　　　　　　　　　　　　　　５．０（乾燥固形分）
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０
　ジプロピレングリコール　　　　　　　　　　　　５．０
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部
 
製造実施例７．発毛抑制ジェル
　下記の組成のジェルを常法により調製した。
 
（組成）　　　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
　ポリアクリル酸　　　　　　　　　　　　　　　　０．５
　水酸化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５
　グルカム　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
　グリシンベタイン　　　　　　　　　　　　　　　３．０
　フナバラソウ抽出物　　　　　　　　　　　　　　２．０（乾燥固形分）
　コハク酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部

Claims (21)

  1. 　毛包組織におけるＤｎａＪＣ６の活性化レベルを制御する工程を含む、毛成長制御方法。
  2. 　前記制御する工程が、ＤｎａＪＣ６の活性化レベルを低下させることによって毛成長を抑制する工程である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記制御する工程が、ＤｎａＪＣ６の活性化レベルを増強させることによって毛成長を促進する工程である、請求項１記載の方法。
  4. 　前記制御する工程が、ＤｎａＪＣ６タンパク質の存在量、ＤｎａＪＣ６タンパク質の活性化、ＤｎａＪＣ６タンパク質の発現、ＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの発現、又はＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの活性化を制御する工程である、請求項１記載の方法。
  5. 　前記組織がヒト毛包組織である、請求項１記載の方法。
  6. 　下記工程（Ａ）～（Ｃ）：
    　　（Ａ）試験物質の存在下及び非存在下でＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量を測定する工程；
    　　（Ｂ）試験物質存在下での当該細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量と、試験物質非存在下での当該細胞におけるＤｎａＪＣ６の発現量とを比較する工程；及び
    　　（Ｃ）試験物質の存在下と非存在下との間でＤｎａＪＣ６の発現量が有意に異なっていた場合に、当該試験物質を毛成長制御剤として選択する工程、
    を含む毛成長制御剤の評価又は選択方法。
  7. 　前記（Ｃ）において、ＤｎａＪＣ６の発現量を減少させる前記試験物質は毛成長抑制剤として選択され、ＤｎａＪＣ６の発現量を増加させる前記試験物質は毛成長促進剤として選択される、請求項６記載の方法。
  8. 　前記ＤｎａＪＣ６の発現量が、ＤｎａＪＣ６タンパク質の発現、ＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの発現、又はＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの活性化の量である、請求項６又は７記載の方法。
  9. 　ＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの発現量の測定が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、又はＮｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法、又はＲＮａｓｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ法、又はＤＮＡアレイ解析により行われる、請求項８記載の方法。
  10. 　ＤｎａＪＣ６のタンパク質の発現量の測定が、ＤｎａＪＣ６タンパク質に特異的な抗体を利用するＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法により行われる、請求項８記載の方法。
  11. 　前記ＤｎａＪＣ６の発現量がＤｎａＪＣ６タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターにより制御されるレポーター遺伝子の発現産物の量であり、前記（Ａ）において、前記ＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞に当該レポーター遺伝子を予め導入する工程を含む請求項６記載の方法。
  12. 　前記レポーター遺伝子発現産物の量を減少させる前記試験物質は毛成長抑制剤として選択され、該レポーター遺伝子発現産物の量を増加させる前記試験物質は毛成長促進剤として選択される、請求項１１記載の方法。
  13. 　前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、及び緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
  14. 　前記ＤｎａＪＣ６を発現可能な細胞が、哺乳動物皮膚由来の切片、培養細胞又は高次皮膚培養物中に存在する細胞である請求項６又は１１に記載の方法。
  15. 　毛成長の抑制に使用するためのフナバラソウ又はその抽出物。
  16. 　抽出物が水抽出物又はエタノール水溶液抽出物である請求項１５記載の抽出物。
  17. 　毛成長抑制のための医薬若しくは化粧品の製造におけるフナバラソウ又はその抽出物の使用。
  18. 　抽出物が水抽出物又はエタノール水溶液抽出物である請求項１７記載の使用。
  19. 　エタノール水溶液が４０～６０容量％エタノール水溶液である請求項１７記載の使用。
  20. 　フナバラソウ又はその抽出物を毛成長抑制が所望される皮膚組織に適用することを含む毛成長抑制方法。
  21. 　抽出物が水抽出物又はエタノール水溶液抽出物である請求項２０記載の方法。
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