WO2012032891A1 - 生体物質検出用素子を用いた計測装置及び計測方法 - Google Patents

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佑介 後藤
悠 石毛
釜堀　政男
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株式会社日立製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N15/0656—Investigating concentration of particle suspensions using electric, e.g. electrostatic methods or magnetic methods
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a measuring apparatus and a measuring method capable of measuring a biological material with high accuracy and high sensitivity by performing electrical and optical measurements.
  • Immunological techniques represented by antigen-antibody reactions are widely known as methods for detecting biological substances such as viruses and bacteria.
  • detection kits based on immunochromatography and fine particle aggregation have become widespread for the purpose of simple inspection of whether or not a virus or bacteria are involved (for example, Patent Document 1).
  • These kits are composed of a sample introduction part, a part holding a labeling antibody, and a test part for antigen detection.
  • the labeling substance fine metal particles that develop color by aggregation are used.
  • coloration occurs in the test part due to the aggregation of the labeling substance, and the presence or absence of the detection target in the sample is determined from the presence or absence of the coloration. It is suitable for simple inspection because it is easy to operate and takes only a few minutes to several tens of minutes.
  • Immunoassays are widely used as a more sensitive method for detecting biological substances using antigen-antibody reactions. Immunoassays are roughly classified into two types: detection using a labeling antibody that can be detected by an optical method, and environmental changes caused by the binding between a normal immobilized antibody and a detection target without using a labeling substance. It can be divided into methods.
  • the former includes an Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) method (for example, Non-Patent Document 1), a Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay (LOCI) method (for example, Patent Document 2), and the like.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • LOCI Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay
  • the latter includes latex agglutination (for example, Patent Document 3), surface plasmon resonance (SPR) (for example, Patent Document 4), crystal oscillator microbalance method (QCM) (for example, Patent Document 5), capacitance measurement ( For example, Non-Patent Document 2), impedance measurement (for example, Patent Document 6), interface potential measurement (for example, Non-Patent Document 3), and the like are included.
  • SPR surface plasmon resonance
  • QCM crystal oscillator microbalance method
  • Patent Document 5 for example, Patent Document 5
  • capacitance measurement For example, Non-Patent Document 2
  • impedance measurement for example, Patent Document 6
  • interface potential measurement for example, Non-Patent Document 3
  • an object to be detected and a labeling antibody are injected onto a substrate on which an antibody is immobilized, and after the reaction for a certain period of time, washing is performed to remove the free labeling antibody. Thereafter, the labeled enzyme remaining on the substrate surface is reacted with the substrate, the amount of the reaction product is optically measured, and the concentration of the detection target is obtained.
  • microparticles A and B each having different antibodies that recognize different parts of the detection target are used. When the detection object and the fine particles A and B are mixed, the fine particles A and B are bonded via the detection object.
  • the antibody immobilized on the microparticles A and B is modified with a labeling substance that emits light only when it is present in the vicinity, so that the detection target is not removed without removing the microparticles that are not bound to the detection target.
  • the concentration can be determined.
  • the optical characteristics when an object to be detected is injected into a dispersion of latex particles to which an antibody is immobilized, the optical characteristics (latest wavelength, transmission wavelength) when latex particles grow into an aggregated cluster starting from the object to be detected. Measure changes in light intensity and scattered light intensity.
  • SPR, QCM, capacitance measurement, impedance measurement, and interface potential measurement all detect a change in a physical quantity on the surface when an object to be detected is bound to an antibody immobilized on the sensor surface.
  • SPR detects changes in plasma resonance angle due to changes in dielectric constant
  • QCM detects changes in resonance frequency due to changes in mass
  • capacitance, impedance, and interface potential measurements detect changes in capacitance, impedance, and interface potential, respectively. Yes.
  • Non-Patent Document 4 For the purpose of detecting one biomolecule, a technique called single molecule imaging combining a fluorescent label and a microscope has been rapidly developed in recent years (for example, Non-Patent Document 4).
  • single-molecule imaging in order to perform high-sensitivity measurement, background signals are reduced and single molecules are detected by using evanescent light whose penetration depth is about half the wavelength of light.
  • viruses, bacteria, and cells could not be quantified in single units.
  • a change in optical properties occurs only when a plurality of fine particles are aggregated. Therefore, in principle, it was difficult to measure a single biological substance.
  • the concentration of the detection target is obtained from the correlation between the concentration of the detection target determined experimentally and the signal signal value.
  • a measuring apparatus and a measuring method for measuring and quantifying a biological substance in units of one are provided.
  • a substrate having a probe for capturing a measurement target, a solution contact means for contacting a reference solution containing a reagent that emits light by an oxidation-reduction reaction on the array, a counter electrode provided to contact the reference solution,
  • the voltage control means for controlling the voltage between the working electrode and the counter electrode, the photodetector for detecting the light from the array, and the sample contact with the solution contact means,
  • a calculation unit that measures the presence or absence of a measurement target captured by a probe based on measurement of light intensity detected by a photodetector.
  • a step of introducing a reference solution onto the above-described array, a step of introducing a sample solution onto the array, and a step of controlling the electrical connection of each of the plurality of working electrodes were connected.
  • the sample solution is introduced for the step of controlling the voltage application between the working electrode and the counter electrode in contact with the reference solution, the step of detecting light from the array by a photodetector, and the array into which the reference solution is introduced And a step of measuring the presence or absence of the measurement target captured by the probe based on the measurement of the light intensity when not introduced.
  • the number of captured measurement objects is counted, and the number of measurement objects in the sample is measured and quantified.
  • a method for determining whether the change in light intensity after the introduction of the sample solution exceeded the threshold or a reference solution was introduced.
  • a method of determining whether or not the difference in light intensity between when the sample solution is introduced and when the sample solution is not introduced exceeds a threshold value can be used.
  • the voltage application start time to the working electrode may be synchronized with the measurement start time at the light receiving element.
  • the conceptual diagram which shows an example of the measurement cell of FIG. The conceptual diagram which shows an example of the measurement cell of FIG.
  • FIG. 1 Figure showing the luminescence intensity of a working electrode in chronological order Sectional drawing which shows an example of the working electrode used for an element.
  • Sectional drawing which shows an example of the working electrode used for an element.
  • Sectional drawing which shows an example of the working electrode used for an element.
  • Sectional drawing which shows an example of the working electrode used for an element.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of an element and a measuring device using the element.
  • This measuring apparatus includes a measuring unit 101 and a control unit 110.
  • a reference solution 104 is placed in a container 103 formed on the element 102.
  • the reference solution 104 contains a reagent that causes a redox reaction.
  • a reagent that causes this redox reaction a reagent that emits light by electrical energy is used.
  • a counter electrode 105 and a reference electrode 106 are arranged in the reference solution 104. Each working electrode of the element is connected to the input terminal of the multiplexer 107. Details of the element will be described later.
  • the counter electrode 105 and the output terminal of the multiplexer 107 are connected to a potentiostat 108.
  • the potentiostat 108 and the light receiving element 109 are connected to the control unit 110.
  • the role of the multiplexer 107 is to connect at least one of the plurality of working electrodes on the element 102 to the potentiostat 108.
  • the role of the potentiostat 108 is to impress a potential difference between at least one of the plurality of working electrodes on the element 102 and the counter electrode 105, and to detect photons generated on the working electrode with the light receiving element 109.
  • the control unit 110 for example, a personal computer (PC) as shown in FIG. 1 can be used.
  • the PC includes a data processing device 111 and a data display device 115.
  • the data processing device 111 includes, for example, an arithmetic device 112, a temporary storage device 113, and a nonvolatile storage device 114.
  • FIG. 2 is an example of a flowchart of the measurement method. This will be described in conjunction with FIG. First, the reference solution 104 is injected into the container 103. Subsequently, light emission on each working electrode is measured by the potentiostat 108 and the light receiving element 109 while switching the connection between the input terminal and the output terminal by the multiplexer 107, and the respective light emission intensities are recorded. Thereby, the emission intensity is measured for all working electrodes on the element 102.
  • the sample solution refers to, for example, a biological sample such as a subject's blood, saliva, urine, or a solution obtained by adjusting them. It waits for a fixed time until the detection target in the sample solution is bound to the probe immobilized on the working electrode of the element 102. Subsequently, while switching the connection between the input terminal and the output terminal by the multiplexer 107, the light emission intensity is measured by the potentiostat 108 and the light receiving element 109, and each light emission intensity is recorded. Compared with the emission intensity measured before the sample solution injection, if the change in emission intensity is greater than the threshold, the counter is incremented.
  • the presence or absence of binding of the detection target for each working electrode on the element 102 is determined, and the number of detection targets coupled on all the working electrodes on the element 102 is counted. Finally, the counter value, that is, the number of detection targets coupled on all the working electrodes on the element 102 is output.
  • a means for transferring electrical energy from the working electrode to a reagent that causes a redox reaction may be used as a means for generating photons on the working electrode.
  • An example of such means is electrochemiluminescence.
  • the reagent necessary for electrochemiluminescence include tri (bipyridyl) ruthenium or a derivative thereof.
  • the working electrode material necessary for electrochemiluminescence include gold, platinum, glassy carbon, and boron-doped diamond.
  • ⁇ лектри ⁇ ество Other means for generating photons include light emission using singlet oxygen. Since singlet oxygen has a very strong oxidizing power, for example, an olefin compound has a feature that it emits light when oxidized, a light emitting system can be constructed by combining singlet oxygen and such a substance.
  • An electrode necessary for generating singlet oxygen includes a semiconductor electrode such as titanium oxide.
  • the time for applying the voltage to each working electrode and the time for measuring the photons by the light receiving element may be synchronized. For example, after applying a voltage to one working electrode, start the measurement with the light receiving element from the time when the current value becomes a steady state. There is a method to repeat the operation. By measuring in this way, light emission at each working electrode can be reliably measured in units of one electrode, and when a detection target is captured on the electrode surface, a stable change in light emission intensity can be measured. it can.
  • the measurement accuracy can be improved as compared with the conventional method of measuring the amount of the detection target with one working electrode.
  • Factors that change the emission intensity include disturbances such as non-specific adsorption of contaminants and temperature changes in addition to the binding of the detection target.
  • these disturbances reduce the measurement accuracy, but when the detection target on the working electrode is counted using a threshold, the disturbance is less than the threshold. Does not affect the count value. Therefore, by counting the detection target on the working electrode using the threshold value, the influence of disturbance can be suppressed and the measurement accuracy can be improved.
  • the probe provided on the working electrode may be any substance that has the ability to selectively capture the detection target.
  • examples of such substances include antibodies, virus recognition sites, receptors and the like having biological affinity.
  • Another example is a positively or negatively charged substance that can bind to an object to be detected by electrostatic interaction.
  • Another example includes an active ester group, a thiol group, and an amine group, which are functional groups that form a coordinate bond or a covalent bond with a specific functional group.
  • FIG. 3 is another conceptual diagram of the measuring device.
  • this measurement apparatus includes a measurement unit 301 and a control unit 311.
  • the reference solution in the reference solution container 302 passes through the flow path 304 by the pump 303 and reaches the waste liquid container 308 through the measurement cell 307.
  • a valve 306 is provided on the flow path 304, and the sample solution is injected into the measurement solution in the flow path by the syringe 305.
  • FIG. 3B is a detailed view of the measurement cell 307, and the flow path 312 is in contact with the element 313.
  • Each working electrode on the element 313 is connected to the input terminal of the multiplexer 314.
  • the counter electrode 315 and the reference electrode 316 are also mounted on the element 313 and are in contact with the flow path 312.
  • the output terminal of the multiplexer 314, the counter electrode 315, and the reference electrode 316 are connected to the potentiostat 309.
  • the role of the multiplexer 314 is to connect one of the plurality of working electrodes on the element 313 to the potentiostat 309.
  • the role of the potentiostat 309 is to impress a potential difference between one of the plurality of working electrodes on the element 313 and the counter electrode 315, and to detect photons generated at the working electrode by the light receiving element 310.
  • FIG. 4 is an example of a flowchart of a measuring method using the measuring device according to the present invention. This will be described in conjunction with FIG. First, the reference solution in the reference solution container 302 is caused to flow through the channel 304 using the pump 303. Subsequently, while switching the connection between the input terminal and the output terminal by the multiplexer 314, the light emission is measured by the potentiostat 309 and the light receiving element 310, and the respective light emission intensities are recorded. Thereby, the emission intensity is measured for all working electrodes on the element 313.
  • the sample solution is injected into the flow path 304 and reacted in the measurement cell 307. Subsequently, while switching the connection between the input terminal and the output terminal by the multiplexer 314, the light emission is measured by the potentiostat 309 and the light receiving element 310, and the respective light emission intensities are recorded. Compared with the emission intensity measured before the sample solution injection, if the change in emission intensity is greater than the threshold, the counter is incremented. As a result, the presence or absence of binding of the detection target for each working electrode on the element 313 is determined, and the number of detection targets coupled on all the working electrodes on the element 313 is counted. Finally, the value of the counter, that is, the number of detection targets coupled on all the working electrodes on the element 313 is output.
  • the change in emission intensity of the same working electrode was examined.
  • the working electrode group for reference and the working electrode group for detection were prepared on the same or different elements, and the working electrode group for reference and the detecting electrode group were detected. You may investigate the difference in the luminescence intensity of the working electrode group.
  • a comparison may be made by using a plurality of the same number of working electrodes arranged at the same interval, and a working electrode for reference is identified and the identified working electrode for reference is identified. The emission of each of the detection working electrode groups may be compared.
  • FIG. 5 is an overhead view showing another configuration example of the measurement cell 307 in FIG.
  • a flow path 501 on the solution introduction side is connected to a flow path switchable valve 502, and the valve 502 is connected to a reference flow path 503 and a detection flow path 504.
  • An element 507 facing a plurality of working electrodes is in contact with the reference channel and the detection channel, and a valve 505 that can switch the channel again is provided at the end of each channel. 506 is connected.
  • the reference solution can flow in both the reference channel 503 and the detection channel 504, and the measurement sample can flow only in the detection channel 504. Further, as shown in FIG.
  • the arrangement of the working electrode may be the same between the element 507 facing the reference channel 503 and the element 507 facing the detection channel 504, or FIG. ),
  • the working electrode of the reference channel 503 may be reduced to take a representative value.
  • the element 507 may be provided separately.
  • FIG. 6 is an example of a flowchart of a measuring method using the measuring device according to the present invention. This will be described in conjunction with FIG. 3 and FIG. First, the reference solution is caused to flow through the flow path 501 in the measurement cell 307. Here, the reference solution is allowed to flow through the reference channel 503 and the detection channel 504 to the channel 506. Subsequently, the switching valve 502 is switched to the detection channel side, the sample solution is caused to flow into the detection channel 504 using the syringe 305 and the pump 303, and the reaction is performed in the detection channel 504.
  • the light emission is measured by the potentiostat 309 and the light receiving element 310, and the respective light emission intensities are recorded. Thereby, the emission intensity is measured for all working electrodes on the element 507.
  • the emission intensity of the working electrode in the reference channel and the emission intensity in the detection channel are compared, and if the difference in emission intensity is greater than the threshold, the counter is incremented. As a result, the presence or absence of binding of the detection target for each working electrode in the detection flow path on the element 507 is determined, and the detection target combined on all the working electrodes in the detection flow path of the element 507 is determined. Count the number.
  • the value of the counter that is, the number of detection targets coupled on all the working electrodes on the element 507 is output.
  • the reference solution is filled in the flow path here, but if a biological sample such as blood, saliva, urine or the like diluted with the reference solution is used as the sample solution, the detection flow path is used. It is possible to omit the step of filling the reference solution with the above.
  • the reference channel 503 and the detection channel 504 are branched from the channel 501, but as shown in FIGS. 5E, 5F, 5G, and 5H.
  • the flow path may be divided from the beginning. In this case, the measurement of light emission in the reference channel and the measurement of light emission in the detection channel can be performed in parallel, and the measurement time can be shortened.
  • the amount of the reference solution and the sample solution to be put in the container or the flow path be a predetermined fixed amount. By doing in this way, it is possible to compare the detection target concentrations among a plurality of sample solutions and to obtain the absolute value of the detection target concentration. If the detection target concentration of the sample solution is high, it may be bound to almost all of the working electrodes. In that case, since the concentration cannot be estimated correctly, it becomes possible to correctly measure by reducing or diluting the amount of the sample solution. Note that the change in the value of the current flowing through the electrode may be examined instead of the change in the emission intensity.
  • the element In order to quickly replace a used element with a new element after measuring a sample solution, it is desirable that the element can be replaced as a single chip. At this time, in order to improve the convenience of circuit wiring, it is conceivable to combine an element and a multiplexer into one chip. In this way, if the element is a single chip, not only can the replacement be speeded up, but for example, if various types of probes are prepared on the working electrode, multiple items can be obtained by simply replacing the chip. It becomes possible to measure.
  • the light-receiving element and the plurality of working electrodes on the element are made to correspond one-to-one with the multiplexer, and light emission is measured one by one.
  • a plurality of light-receiving elements such as a CCD and a photodiode array
  • a plurality of light emission may be simultaneously measured using a device having For example, when a photomultiplier tube is used as the light receiving element, since only one light receiving element is used and processing is performed sequentially for each working electrode, the total processing time is (number of working electrodes) ⁇ (working electrode). Total processing time per electrode).
  • the total processing time is (Number of working electrodes corresponding to one light receiving element) ⁇ (total processing time per time). Therefore, since the number of working electrodes and the processing time are in a trade-off relationship, the light receiving element may be selected so that the total processing time is shortened depending on the case.
  • the time during which the substance on the working electrode has been captured can be obtained by arranging the emission intensities of one working electrode in chronological order as shown in FIG. Since the probe provided on the working electrode specifically binds to the detection target, the time during which the detection target is captured is longer than when the contaminants are captured by adsorption. Therefore, the determination accuracy can be improved by determining whether the captured substance is a detection target or a foreign substance from the substance capture time.
  • a probe that binds to the detection target is selected as a probe that is immobilized on the working electrode or another probe that is immobilized on a bead or liposome.
  • a probe that binds to the detection target is selected as a probe that is immobilized on the working electrode or another probe that is immobilized on a bead or liposome.
  • FIG. 7 to 10 are views showing an example of the element according to the present invention.
  • FIG. 7 is an overhead view of a part of the element.
  • a plurality of working electrodes 702 are provided on the substrate 701, and wirings 703 are connected to the individual working electrodes 702.
  • FIG. 8 shows a cross-sectional view of the working electrode of FIG.
  • the substrate 801 is provided with a working electrode 802, and a wiring 803 is connected to the working electrode 802.
  • FIG. 9 shows a conceptual diagram when the working electrode of FIG. 8 is equipped with a probe.
  • a working electrode 902 is provided on the substrate 901, a wiring 903 is connected to the working electrode 902, and a probe 904 is provided on the working electrode 902.
  • the probe 904 is preferably a substance capable of selectively capturing a detection target, such as an antibody, a receptor, a virus recognition site, a positively or negatively charged substance, or the like. Immobilization of the probe 904 on the working electrode 902 may be physical adsorption or chemical bonding.
  • the same type of probe may be mounted on the plurality of electrodes, but depending on the measurement conditions, different types of probes may be fixed on the electrode by determining the range to be fixed or mixed. Good.
  • the substrate 901 is modified with a substance that suppresses nonspecific adsorption, such as polyethylene glycol, in order to suppress erroneous detection due to nonspecific adsorption of impurities.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram when a detection target is coupled to a working electrode provided with the probe of FIG.
  • a working electrode 1002 is provided on the substrate 1001, a wiring 1003 is connected to the working electrode 1002, a probe 1004 is provided on the working electrode 1002, and one detection object 1005 is coupled to the probe 1004.
  • An insulator such as SiO 2 or Si 3 N 4 is used for the substrate. Although it is desirable to use gold, platinum, silver, copper or carbon for the working electrode, titanium, aluminum, chromium or the like can also be used depending on the required durability.
  • a conductor is used for the wiring.
  • the working electrode and the wiring may be connected by, for example, forming the working electrode after forming the wiring by using a semiconductor manufacturing process.
  • the diameter of the wiring does not have to be smaller than the diameter of the working electrode as shown in FIG. 7, for example, the working electrode and the wiring have the same diameter (FIG. 11A), or the wiring is thicker than the diameter of the working electrode. (FIG. 11B), and the effect of the present invention can be obtained by coupling the portion exposed on the substrate surface with the detection target.
  • the size of the working electrode may be any size that can be paired with the detection target. And by making the diameter of a working electrode into about 2 times or less of the diameter of a detection target, it can prevent that two or more detection targets couple
  • Detected objects are viruses, bacteria, cells, etc.
  • Table 1 shows the approximate sizes of viruses, bacteria, and cells.
  • the size of the working electrode is about 5 to 200 nm for viruses, about 150 nm to 16 ⁇ m for bacteria, and about 5 to 20 ⁇ m for cells according to the detection target.
  • FIG. 13 to 22 are conceptual diagrams showing another example of the working electrode provided in the element.
  • the substrate 1301 has a portion dug down by one step, and a working electrode 1302 is provided on the bottom of the dug down portion.
  • a wiring 1303 is connected to the working electrode 1303, and a wall 1304 exists around the working electrode 1302.
  • FIG. 14 shows a state in which the probe is immobilized on the working electrode in FIG. 13, and
  • FIG. 15 shows a state in which the detection target is bound to the probe in FIG.
  • FIG. 16 shows a shape in which the wall of FIG. 13 protrudes to a part of the working electrode.
  • the portion where the working electrode is exposed can be regarded as an effective working electrode.
  • FIG. 17 shows an example of a shape in which the wall exists only in the vicinity of the working electrode.
  • FIG. 18 shows an example in which the working electrode has a concave shape.
  • FIG. 19 shows a shape in which the probe is fixed to the concave working electrode of FIG. 18, and
  • FIG. 20 shows a state in which the detection target is bound to the probe of FIG.
  • the opening diameter of the wall is not more than twice that of the detection object.
  • FIG. 21 and FIG. 22 are other forms of FIG. 13 and FIG. Even if the wall is tapered as shown in FIG. 21, the effect of diffusion inhibition by the wall obtained in FIG. 13 can be obtained. Further, even if the working electrode is rounded and recessed as shown in FIG. 22, the effect of the concave electrode obtained in FIG. 18 can be obtained.
  • FIG. 23 shows the result of numerical analysis using the finite element method for the relationship between the size of the working electrode and the rate of change of the emission intensity when the state of FIG. 9 changes to the state of FIG.
  • the working electrode is a disk having a diameter of 0.2, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100 ⁇ m
  • the detection target is a sphere having the same diameter as the working electrode, and the working electrode and the detection target are in contact. .
  • Electrochemiluminescence is used for the light-emitting system, and typical conditions for electrochemiluminescence include tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (Ru (bpy) 3 2+ ) 5 mM (diffusion coefficient 590 ⁇ m 2 / s), Employing tripropylamine 100 mM, applied voltage 1.2 V (reaction rate of electrode reaction 10,000 ⁇ m / s), calculating the emission intensity in the steady state, and determining the amount of change in emission intensity depending on the presence or absence of the detection target on the working electrode surface It was. As shown in FIG. 23, the emission intensity decreased due to the presence of the detection target on the surface of the working electrode, and the rate of decrease was substantially constant regardless of the diameter of the working electrode.
  • FIG. 24 shows the difference in the amount of change in emission intensity depending on the presence or absence of a detection target on the surface of the working electrode when the height of the wall around the working electrode as shown in FIG. 13 is changed.
  • the same light emitting system as that shown in FIG. 23 was used.
  • the working electrode was a disk having a diameter of 0.2, 1, 2, 10, 20 ⁇ m
  • the detection target was a sphere having the same diameter as the working electrode, and the working electrode and the detection target were in contact.
  • the detection target on the surface of the working electrode when the wall opening diameter is the same as that of the working electrode and the height of the wall is changed to 1/4, 1/2, 3/4 with respect to the radius of the detection target The amount of change in the emission intensity due to the presence or absence of was determined numerically by the finite element method in the same manner as in FIG. From FIG. 24, the decreasing rate of the emission intensity increased as the wall height increased. This is presumably because the increase in the wall height hinders the supply of reagents that cause redox to the working electrode surface.
  • FIG. 25 shows the difference in the amount of change in emission intensity depending on the presence or absence of the detection target on the surface of the working electrode when the ratio of the detection target diameter to the working electrode diameter changes.
  • the same light emitting system as that shown in FIG. 23 was used.
  • the working electrode is a disk having a diameter of 0.2, 1, 2, 10, 20 ⁇ m
  • the detection target is a sphere
  • the diameter is changed to 1, 2, 5 times the diameter of the working electrode.
  • the amount of change in the light emission intensity depending on the presence or absence of the detection target on the surface was obtained numerically by the finite element method in the same manner as in FIG. From FIG. 25, the decrease rate of the emission intensity increased as the size of the detection target with respect to the working electrode increased.
  • the determination threshold can be set higher, and therefore the selectivity can be further improved in combination with the effect of improving the selectivity by the excluded volume effect.
  • an upper limit and a lower limit of the emission intensity reduction rate calculated from the information on the working electrode obtained in advance and the size of the detection target are determined, and within that range.
  • FIG. 26 shows a typical reaction path in electrochemiluminescence.
  • A represents an electrochemiluminescence reagent
  • C represents a catalyst in an electrochemiluminescence reaction
  • P represents a photon.
  • Electrochemiluminescence occurs when the electrochemiluminescent reagent is excited by receiving electrical energy from the working electrode and releases the energy as photons in the process of returning to the ground state.
  • the reaction rate of receiving an electron from an electrode is the slowest in a series of electrochemical reactions, so that the electrochemical reaction is electrode reaction rate limiting ((1) in FIG. 26 is electrode reaction). .
  • the electrochemiluminescence intensity depends on the time change of the concentration of the electrochemiluminescent reagent in the electrode reaction, that is, the current value, and is proportional to the current value in the steady state. Therefore, investigating the behavior of the electrochemiluminescence intensity is equivalent to examining the behavior of the current value in the electrode reaction.
  • an electrochemical reaction via a catalyst has been exemplified, but the same argument applies to an electrochemiluminescence reaction not via a catalyst (for example, a reaction via an anion and cation anion).
  • the concentration of the electrochemiluminescent reagent is C
  • the rate of the electrode reaction is k
  • the diffusion coefficient of the electrochemiluminescent reagent is D
  • the electrode reaction in the steady state is expressed by the following equation (1).
  • This dimensionless number ⁇ is qualitatively understood as follows. (D / k) has a dimension of length and represents how much the supply rate of the electrochemiluminescence reagent is with respect to the rate at which the electrochemical reagent is consumed in the electrode reaction. Therefore, if the ratio is normalized by taking the ratio of d to (D / k), it can be evaluated from the dimensionless number ⁇ whether the electrode reaction is electrode reaction rate limited or diffusion supply limited under certain conditions. it can.
  • FIG. 27 is a diagram showing the change rate of the light emission intensity when the state is changed from the state of FIG. 9 to the state of FIG. 10 by using a dimensionless number ⁇ .
  • the dimensionless number ⁇ is sufficiently large, the diffusion rate is sufficiently high, so that the electrochemiluminescent reagent is sufficiently spread on the electrode surface, and the current value does not change depending on the presence or absence of the detection target on the electrode surface.
  • the dimensionless number ⁇ is sufficiently small, the reaction rate is sufficiently fast, so if there is a detection target on the electrode surface, the electrochemiluminescent reagent is consumed before reaching the gap between the working electrode and the detection target. The current value decreases.
  • this reduction rate is an excluded volume effect depending on the detection target, it takes a constant value in a region where the dimensionless number is sufficiently small.
  • the reason why the reduction rate is almost constant regardless of the diameter of the electrode is that the value of the dimensionless number ⁇ is in the range of 0.001 to 0.5 in the diffusion supply rate limiting region. From the above discussion, it is considered that one of the reasons why the emission intensity decreased due to the presence of the detection target on the electrode surface is due to the diffusion inhibition of the reagent that causes the redox reaction by the detection target.
  • the larger the reduction rate threshold the better.
  • the diffusion inhibition effect due to the presence of the detection target is amplified by the walls as shown in FIG. It can be set, and the detection accuracy can be improved.
  • the absolute value of the emission intensity can be increased by bringing the counter electrode closer to the working electrode.
  • the counter electrode is arranged in parallel directly above the working electrode and the distance between the counter electrode and the working electrode is reduced, the current value increases and the emission intensity also increases.
  • an electrode material transparent to light emission is preferable, and for example, an indium tin oxide (ITO) electrode is desirable.
  • ITO indium tin oxide
  • the wall and the concave electrode also have an effect of improving the selectivity with respect to the detection target.
  • a substance larger than the detection target is adsorbed non-specifically on the electrode surface, the emission intensity changes in the same manner as the detection target, which may cause erroneous detection.
  • a substance larger than the opening diameter of the wall or the concave electrode cannot approach the electrode surface, and the selectivity to the detection target can be improved.
  • the number of working electrodes is larger in order to increase the coupling probability. Also, the larger the number of working electrodes, the better in order to detect a detection object in a high concentration range.
  • it is necessary to increase the integration of the working electrodes that is, to reduce the distance between the working electrodes as shown in FIG.
  • this working electrode interval is less than the resolution of the optical microscope, the adjacent working electrodes are distinguished in the method of detecting each light by detecting each working electrode on the element at the same time and the conventional optical microscope. It becomes impossible to do. Therefore, there is a trade-off relationship between high integration of the working electrode, high detection efficiency, and detection upper limit of the detection target.
  • the technique of detecting each working electrode by emitting light one by one using a multiplexer is a technique for solving this trade-off.
  • a voltage to each working electrode one by one and synchronizing the applied time with the time for measuring with the light receiving element, one emission of each working electrode can be observed, and the working electrode spacing is light. It is possible to distinguish between adjacent working electrodes even if the wavelength is equal to or shorter than the wavelength.
  • this method By combining this method with the electrode spacing below the resolution of the optical microscope, it becomes possible to improve the detection efficiency and detect the detection target in the high concentration range.
  • the combination of this technique and the electrode spacing below the resolution of the optical microscope has the effect that position information below the resolution of the optical microscope can be obtained. Since the position resolution of an optical microscope is about half the wavelength of light (0.3 to 0.5 ⁇ m), using an element with an electrode interval less than this wavelength and this method, position information less than the wavelength of the emitted light can be obtained. be able to. For example, if a flat cell is to be detected using an electrode array having a working electrode of about 100 nm and an electrode interval of about 100 nm, the surface shape of the cell can be determined with a position resolution of about 100 nm. It can be acquired.
  • a group of working electrodes having about 10,000 working electrodes with a diameter of 100 nm to which antibodies against influenza A virus are immobilized and about 100 nm with a working electrode having a diameter of 100 nm to which antibodies against influenza B virus are immobilized, for example, for each antibody. If a sample of a patient suspected of having influenza virus is measured using an element separately provided, it is possible to simultaneously determine the disease and type of the virus. The same effect can be obtained not only for viruses but also for bacteria and cells.
  • FIG. 29 shows the change rate of the emission intensity depending on the size of the working electrode and the presence or absence of the detection target coupled on the working electrode.
  • Gold electrode with a diameter of 10, 25, 100 ⁇ m as working electrode, Tris (2,2′-bipyridyl) ruthenium (Ru (bpy) 3 2+ ) 5 mM, Tripropylamine 100 mM phosphate buffer solution as electrochemiluminescence reagent was used. Electrochemiluminescence was caused under the condition of an applied voltage of 1.2 V using a platinum electrode as a counter electrode and a saturated potassium silver chloride silver chloride electrode as a reference electrode. As a model for detection, polystyrene beads of almost the same size as the working electrode were used.
  • the measurement with the light receiving element was started after 5 seconds had elapsed from the voltage application, and the voltage application and measurement were terminated after 2 seconds had elapsed since the start of light reception.
  • the measured value (black circle) of the change rate of the emission intensity was in good agreement with the calculated value (white circle) by the finite element method. Therefore, it can be seen that the numerical analysis by the finite element method can reproduce the actual measurement well.
  • Electrochemiluminescence was caused under the condition of an applied voltage of 1.2 V using a platinum electrode as a counter electrode and a saturated potassium silver chloride silver chloride electrode as a reference electrode.
  • the same operation is applied to all working electrodes at the same time, starting the measurement with the light receiving element after 1 second from the voltage application to each working electrode and terminating the voltage application and measurement after 2 seconds from the start of light reception.
  • the method of going and measuring was used.
  • the threshold is set to 15%, and as a result of applying a voltage to all working electrodes simultaneously, it is not possible to obtain position information as to which working electrode emits light, and to determine whether beads are captured. I could't.
  • the threshold value is set to 15% in the procedure of FIG. 2 and applying one voltage to each working electrode, it was possible to distinguish the light emission from each working electrode.

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Abstract

　バックグラウンド信号や個体差のバラツキを除去し，高精度・高感度に測定対象であるウイルス、細菌、細胞等の数を測定する。　基板と、基板の表面に設けられた複数の作用電極と、複数の電極のそれぞれと接続され基板の表面と反対側に設けられた配線と、作用電極上に測定対象を捕捉するプローブとを有するアレイを用い、酸化還元反応により発光する試薬を含む参照溶液を当該アレイ上に接触させ、対向電極と配線のそれぞれの接続を制御して、作用電極と対向電極との間に電圧を印加し、測定試料の導入による光強度の変化や差に基づいて、プローブに捕捉された測定対象の有無を測定する。

Description

生体物質検出用素子を用いた計測装置及び計測方法
　本発明は，電気的及び光学的な計測を行い，生体物質を高精度および高感度に計測することのできる計測装置，および計測方法に関する。
　ウイルス・細菌等の生体物質を検出する方法として抗原抗体反応に代表される免疫学的手法が広く知られている。例えば，近年ウイルスや細菌に罹患しているかどうかの簡易検査を目的として，イムノクロマトグラフィーと微粒子凝集を基礎原理とした検出キットが広まっている（例えば，特許文献１）。これらのキットは，検体導入部，標識用抗体を保持する部，抗原検出用のテスト部から構成される。標識物質としては，凝集により発色する金属微粒子が用いられる。検体を導入すると検体と共に標識用抗体が展開され，検体内に検出対象物が存在するとテスト部において検出対象物を介して標識用抗体が結合する。この時，標識物質の凝集によってテスト部で発色が起こり，発色の有無から検体内の検出対象物の有無の判定を行う。操作が簡便かつ，実施時間が数分～数十分と短時間であり，目視による判定が可能であることから簡易検査として適している。
　抗原抗体反応を利用した，より高感度な生体物質の検出手法としてはイムノアッセイが広く普及している。イムノアッセイは，大別して光学的な手法により検出が可能な標識用抗体を用いる手法と，標識物質を用いずに通常の固定化抗体と検出対象物の結合がもたらす環境変化を利用して検出を行う手法に分けることができる。前者にはEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）法（例えば，非特許文献１），Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay（ＬＯＣＩ）法（例えば，特許文献２）等が含まれる。一方，後者にはラテックス凝集法（例えば，特許文献３），表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば，特許文献４），水晶発振子マイクロバランス法（ＱＣＭ）（例えば，特許文献５），キャパシタンス測定（例えば，非特許文献２），インピーダンス測定（例えば，特許文献６），界面電位測定（例えば，非特許文献３）等が含まれる。
　ＥＬＩＳＡ法では，抗体を固定化した基板に検出対象物と標識用抗体を注入，一定時間反応後に洗浄を行って遊離している標識用抗体を除去する。その後，基板表面に残留した標識酵素と基質を反応させ，反応生成物量を光学的に測定し，検出対象物濃度を求める。ＬＯＣＩ法では，検出対象物の異なる部位を認識する別々の抗体を各々に固定化した微粒子Ａ，Ｂを用いる。検出対象物と微粒子Ａ，Ｂを混合すると，検出対象物を介して微粒子Ａ，Ｂが結合する。微粒子Ａ，Ｂに固定化された抗体にはごく近傍に存在する場合にのみ発光を生じる標識物質が修飾されているため，検出対象物と結合していない微粒子を除去することなく，検出対象物濃度を求めることができる。
　ラテックス凝集法では，抗体が固定化されたラテックス微粒子の分散液中に検出対象物を注入すると，検出対象物を起点としてラテックス微粒子が凝集クラスターに成長した時の光学的特性（吸光極大波長，透過光強度，散乱光強度）の変化を測定する。ＳＰＲ・ＱＣＭ・キャパシタンス測定・インピーダンス測定・界面電位測定は，どれもセンサ表面に固定化された抗体に検出対象物が結合した時の表面のある物理量の変化を検出している。ＳＰＲは誘電率の変化によるプラズマ共鳴角の変化を，ＱＣＭは質量の変化による共鳴振動数の変化を，キャパシタンス測定・インピーダンス測定・界面電位測定はそれぞれキャパシタンス・インピーダンス・界面電位の変化を検出している。
　また，生体分子を１個検出することを目的として，蛍光標識と顕微鏡を組み合わせた１分子イメージングという技術が近年急速に発達している（例えば，非特許文献４）。１分子イメージングでは高感度測定を行うために，染み出し深さが光の波長の半分程度であるエバネッセント光を用いて，バックグラウンド信号を低減し，１分子を検出している。
　別の生体分子の１個検出を目指した手法として，微小電極を複数配置した電極及び電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ），電荷結合素子（ＣＣＤ）を組み合わせて生体物質を１個検出する手法が報告されている（例えば，特許文献７）。この手法では電極表面に固定化された抗体に検出対象物が結合したことによる電荷の変化を検出し，この時の電荷の変化量がある閾値を超えたときに生体物質が１個有ると判定を行うことで生体物質の検出を行っている。
特開平1-32169 EP0515194A US4250394 US4997278 US6006589 US7192752 US7022287
Immunochemistry, 1971, 8, 871-874. Anal. Chem., 1997, 69, 3651-3657. Analyst, 2002, 127, 1137-151. Nature, 1996, 380, 451-453.
　従来技術ではウイルス・細菌・細胞を１個単位で定量することはできなかった。
微粒子凝集を用いたイムノクロマトグラフィーやラテックス凝集法では複数の微粒子が凝集した時に初めて光学的特性の変化が発生する。したがって，原理的に生体物質の１個単位測定は困難であった。
　従来のイムノアッセイではバックグラウンド信号の影響により１個単位で検出することは困難であった。例えば，標識用抗体を用いたＥＬＩＳＡ法では洗浄工程により除去しきれなかった標識用抗体がバックグラウンド信号を発生させる。これはＬＯＣＩ法についても同様である。一方，生体物質の結合によるセンサ表面の物理量変化を検出する手法（ＳＰＲ，ＱＣＭ，キャパシタンス測定，インピーダンス測定，界面電位測定）にとっては，検出対象物以外の物質（夾雑物）の非特異的吸着がバックグラウンド信号源となる。これらの手法は予め実験的に定めた検出対象物の濃度とシグナル信号値との相関関係から検出対象物の濃度を求めているが，検出対象物の濃度が微小になるとシグナル信号値に対するバックグラウンド信号値の比が無視できなくなるほど大きくなるため，１個単位での検出が困難であった。複数の微小電極と電荷変化を組み合わせた手法においても，電荷変化をもたらす異物の吸着がバックグラウンド信号となることから，同様の課題があると言える。
　１分子イメージングでは生体物質１個単位での検出は可能であるが，光の波長以下の位置分解能を持たず光の波長以下の集積化が困難である。また、照明領域が非常に小さいため，基板全域を走査するには長時間を必要とする。以上の理由から、１分子イメージングでは数千～数万の生体物質の定量は困難である。また、得られる情報にはサイズ情報が含まれていないため、サイズ選択性をもたすことができない。
　本発明では，生体物質を１個単位で計測し，定量する計測装置および計測方法を提供する。
　本発明の代表的な形態としては、基板と、基板の表面に設けられた複数の作用電極と、複数の電極のそれぞれと接続され基板の表面と反対側に設けられた配線と、作用電極上に測定対象を捕捉するプローブとを有するアレイと、酸化還元反応により発光する試薬を含む参照溶液を当該アレイ上に接触させる溶液接触手段と、参照溶液に接触するように設けられた対向電極と、配線のそれぞれの接続を制御して、作用電極と対向電極との間の電圧を制御する電圧制御手段と、アレイからの光を検出する光検出器と、溶液接触手段により試料溶液を接触させ、光検出器により検出される光強度の測定に基づいて、プローブに捕捉された測定対象の有無を測定する計算部と、を有する計測装置である。
　また、計測方法としては、上記したアレイ上に参照溶液を導入する工程と、アレイ上に試料溶液を導入する工程と、複数の作用電極のそれぞれの電気的接続を制御する工程と、接続された作用電極と参照溶液と接触した対向電極との間の電圧印加を制御する工程と、アレイからの光を光検出器により検出する工程と、参照溶液を導入したアレイについて、試料溶液を導入した場合と導入しない場合における光強度の測定に基づいて、プローブに捕捉された測定対象の有無を測定する工程とを有する。
　そして、複数の作用電極それぞれについて、捕捉された測定対象の数をカウントして、試料中の測定対象の数を測定して定量する。
　捕捉された測定対象の有無の検出としては、参照溶液を導入したアレイについて、試料溶液を導入してからの光強度の変化が閾値を超えるかどうかの判定をする方法や、参照溶液を導入したアレイについて、試料溶液を導入した場合と導入しない場合の光強度の差が閾値を超えるかどうかを判定をする方法を用いることができる。
　また、作用電極への電圧印加の開始時間と受光素子での計測開始時間を同期させて計測するようにしてもよい。
　上記構成により、発光強度の測定により検出対象物の１個単位の有無を判定することができる。そして、従来問題となっていたバックグラウンド信号が測定値に与える影響を抑制することができる。また，検出対象物の有無を判定することで従来同様に問題となっていた検出対象の個体差に起因する信号変化のバラツキの影響も抑制することができる。さらに，検出対象が有ると判定した電極の数を総和することで，検体中の検出対象の量を求めることが可能となる。これにより，標識物質を使用することなく検出対象を定量することができる。加えて、作用電極への電圧印加の開始時間と受光素子での計測開始時間を同期させて計測することにより、隣接する複数の作用電極間の間隔が光学顕微鏡の位置分解能以下であっても個々の作用電極を区別することができる。
　以上より，前記のように各作用電極についてバックグラウンド信号や個体差のバラツキを除去できるため，従来よりも高精度・高感度な測定が可能となる。
計測装置の一例を示す概念図。 計測方法のフローチャートの一例。 計測装置の一例を示す概念図。 計測方法のフローチャートの一例。 図３の測定セルの一例を示す概念図。 図３の測定セルの一例を示す概念図。 図３の測定セルの一例を示す概念図。 図３の測定セルの一例を示す概念図。 計測方法のフローチャートの一例。 素子の一例を示す俯瞰図 素子の一例を示す断面図 作用電極にプローブを固定化した場合の概念図。 作用電極に検出対象が結合した場合の概念図。 素子の一例を示す断面図。 ある作用電極の発光強度を時系列順に並べた図 素子に用いる作用電極の一例を示す断面図。 素子に用いる作用電極の一例において，作用電極にプローブを固定化した場合の概念図。 素子に用いる作用電極の一例において，作用電極に検出対象が結合した場合の概念図。 素子に用いる作用電極の一例を示す断面図。 素子に用いる作用電極の一例を示す断面図。 素子に用いる作用電極の一例を示す断面図。 素子に用いる作用電極の一例において，作用電極にプローブを固定化した場合の概念図。 素子に用いる作用電極の一例において，作用電極に検出対象が結合した場合の概念図。 素子に用いる作用電極の一例を示す断面図。 素子に用いる作用電極の一例を示す断面図。 作用電極の直径と検出対象の結合による発光強度減少率の関係を示す図。 作用電極の周囲の壁の高さを変化させた時の，作用電極の直径と検出対象の結合による発光強度減少率の関係を示す図。 作用電極の直径と検出対象の直径の比を変化させた時の，作用電極の直径と検出対象の結合による発光強度減少率の関係を示す図。 典型的な電気化学発光の反応経路を示す図。 典型的な電気化学発光における無次元数πと検出対象の結合による発光強度減少率の関係を示す図。 隣接する作用電極間隔が光の波長分解能以下であるような素子の一例を示す概念図。 実験と計算でそれぞれ求めた作用電極の直径と検出対象の結合による発光強度減少率の関係を示す図。 実験で用いた１６個の作用電極を有する素子の俯瞰図。
　以下，図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
　図１は，素子とそれを用いた計測装置の概念図である。本計測装置は，計測部１０１と制御部１１０から構成される。素子１０２上に形成された容器１０３中には参照用溶液１０４が入れられる。参照用溶液１０４は酸化還元反応を起こす試薬を含んでいる。この酸化還元反応を起こす試薬は、電気的エネルギーにより発光するような試薬を用いる。参照用溶液１０４中には対向電極１０５と参照電極１０６が配置されている。素子の各作用電極はそれぞれマルチプレクサ１０７の入力端子に接続されている。素子についての詳細は後述する。対向電極１０５とマルチプレクサ１０７の出力端子はポテンショスタット１０８に接続されている。ポテンショスタット１０８と受光素子１０９は制御部１１０と接続されている。マルチプレクサ１０７の役割は，素子１０２上の複数の作用電極のうち少なくとも１つをポテンショスタット１０８と接続することである。ポテンショスタット１０８の役割は，素子１０２上の複数の作用電極のうち少なくとも１つと対向電極１０５の間に電位差を印圧し，作用電極上に発生した光子を受光素子１０９で検出することである。制御部１１０としては，例えば図１に示したようなパーソナルコンピュータ（ＰＣ）を用いることができる。ＰＣは，データ処理装置１１１，データ表示装置１１５を有し，データ処理装置１１１は，例えば演算装置１１２，一時記憶装置１１３，不揮発性記憶装置１１４を有している。
　図２は，計測方法のフローチャートの一例である。図１と併せて説明する。まず，容器１０３に参照用溶液１０４を注入する。続いて，マルチプレクサ１０７により入力端子と出力端子の接続を切り替えながら，ポテンショスタット１０８と受光素子１０９で各作用電極上の発光を測定し，それぞれの発光強度を記録する。これにより，素子１０２上の全ての作用電極について発光強度を測定する。
　次に，容器１０３に試料溶液を注入する。試料溶液は、例えば被検者の血液・唾液・尿等の生体試料やそれらを調整して得られた溶液などをいう。試料溶液中の検出対象が素子１０２の作用電極上に固定化されたプローブに結合するまで，一定時間待機する。続いて，マルチプレクサ１０７により入力端子と出力端子の接続を切り替えながら，ポテンショスタット１０８と受光素子１０９で発光強度を測定し，それぞれの発光強度を記録する。試料溶液注入前に測定した発光強度と比較し，発光強度の変化が閾値よりも大きければカウンターをインクリメントする。これにより，素子１０２上の作用電極一つ一つについて検出対象の結合の有無を判定し，素子１０２上の全ての作用電極上に結合した検出対象の数を数える。最後に，カウンターの値，すなわち素子１０２上の全ての作用電極上に結合した検出対象の数を出力する。
　作用電極上に光子を発生させる手段としては，酸化還元反応を起こす試薬に作用電極から電気的エネルギーを受け渡す手段を用いればよい。そのような手段の一例としては，電気化学発光が挙げられる。電気化学発光に必要な試薬としては，例えばトリ（ビピリジル）ルテニウムまたはその誘導体等がある。電気化学発光に必要な作用電極の材料としては例えば金，白金，グラッシーカーボン，ホウ素をドープしたダイヤモンド等がある。
　他の光子を発生させる手段としては、一重項酸素を用いた発光が挙げられる。一重項酸素は酸化力が非常に強く、例えばオレフィン化合物は酸化すると発光するという特徴を持っているため、一重項酸素とそのような物質を組み合わせれば発光系を構築することができる。一重項酸素を発生させるのに必要な電極としては半導体電極、例えば酸化チタン等がある。
　作用電極上に発生した光子を計測させる手順としては、各作用電極に電圧を印加する時間と受光素子で光子を計測する時間を同期させればよい。例えば、１つの作用電極に電圧を印加後、電流値が定常状態になった時刻から受光素子で計測を開始し、一定時間経過後、電圧印加と計測を終了し、また次の作用電極に同様の操作を繰り返していく手法がある。このように計測することで、各作用電極での発光を電極１個単位で確実に計測でき、かつ電極表面に検出対象物が捕捉されている場合、安定した発光強度の変化を計測することができる。
　閾値を用いて作用電極上の検出対象をカウントすることで，一つの作用電極で検出対象の量を測定する従来の方法と比べて，測定精度を向上させることができる。発光強度を変化させる要因として，検出対象の結合以外に，夾雑物の非特異的吸着，温度の変化などの外乱がある。一つの電極で検出対象の量を測定する従来の方法では，これら外乱が測定精度を低下させるが，閾値を用いて作用電極上の検出対象をカウントする場合，外乱が閾値よりも小さいときは外乱はカウント値に影響を及ぼさない。従って，閾値を用いて作用電極上の検出対象をカウントすることで，外乱の影響を抑制し，測定精度を向上させることができる。
　作用電極上に備えられたプローブとしては，検出対象を選択的に捕捉する能力を有した物質であればよい。そのような物質の一例としては，例えば生物学的親和性を有する，抗体・ウイルス認識部位・レセプター等が挙げられる。別の一例としては，静電気相互作用により検出対象と結合できる正または負に帯電した物質が挙げられる。別の一例としては、特定の官能基と配位結合や共有結合を作る官能基である、活性エステル基やチオール基、アミン基などが挙げられる。
　図３は，計測装置の別の概念図である。図３（Ａ）に示すように、本測定装置は，測定部３０１と制御部３１１からなる。測定部３０１では，参照用溶液容器３０２内の参照用溶液がポンプ３０３によって流路３０４内を通り，測定セル３０７を経て廃液容器３０８に達する。流路３０４上にはバルブ３０６があり，シリンジ３０５によって試料溶液が流路中の測定溶液に注入される。
　図３(Ｂ)は測定セル３０７の詳細図であり，素子３１３に流路３１２が接している。素子３１３上の各作用電極はマルチプレクサ３１４の入力端子に接続されている。また，この例では，素子３１３上に対向電極３１５と参照電極３１６も載っており，同じく流路３１２に接している。マルチプレクサ３１４の出力端子と対向電極３１５及び参照電極３１６はポテンショスタット３０９に接続されている。マルチプレクサ３１４の役割は，素子３１３上の複数の作用電極のうち一つをポテンショスタット３０９と接続することである。ポテンショスタット３０９の役割は，素子３１３上の複数の作用電極のうち一つと対向電極３１５の間に電位差を印圧し，作用電極に発生した光子を受光素子３１０で検出することである。
　図４は，本発明による計測装置を用いた計測方法のフローチャートの一例である。図３と併せて説明する。まず，流路３０４にポンプ３０３を用いて参照用溶液容器３０２内の参照用溶液を流す。続いて，マルチプレクサ３１４により入力端子と出力端子の接続を切り替えながら，ポテンショスタット３０９と受光素子３１０で発光を測定し，それぞれの発光強度を記録する。これにより，素子３１３上の全ての作用電極について発光強度を測定する。
　次に，流路３０４に試料溶液を注入し，測定セル３０７内で反応させる。続いて，マルチプレクサ３１４により入力端子と出力端子の接続を切り替えながら，ポテンショスタット３０９と受光素子３１０で発光を測定し，それぞれの発光強度を記録する。試料溶液注入前に測定した発光強度と比較し，発光強度の変化が閾値よりも大きければカウンターをインクリメントする。これにより，素子３１３上の作用電極一つ一つについて検出対象の結合の有無を判定し，素子３１３上の全ての作用電極上に結合した検出対象の数を数える。最後に，カウンターの値，すなわち素子３１３上の全ての作用電極上に結合した検出対象の数を出力する。
　以上の例では，同一作用電極の発光強度変化を調べたが，参照用の作用電極群と検出用の作用電極群を同一又は別の素子上に用意して，参照用の作用電極群と検出用の作用電極群の発光強度の差を調べてもよい。比較においては、それぞれ同じ数の作用電極が同じ間隔で複数並んでいるものを用いて比較をしてもよいし、参照用とする作用電極を特定して、その特定された参照用作用電極と、検出用の作用電極群それぞれとの発光を比較するようにしてもよい。
　図５は，図３における測定セル３０７の別の構成例を示した俯瞰図である。溶液導入側の流路５０１が流路の切り替え可能な弁５０２に接続され，弁５０２は参照用流路５０３と検出用流路５０４に接続されている。参照用流路と検出用流路には複数の作用電極が面した素子５０７が接しており，各流路の先には再び流路の切り替え可能な弁５０５があり，溶液排出側の流路５０６に接続されている。これらの弁５０２，５０５により、参照用溶液は参照用流路５０３と検出用流路５０４両方に流れるようにし、測定試料については、検出用流路５０４のみに流れるようにすることができる。また、図５（Ａ）のように、参照用流路５０３に面した素子５０７と検出用流路５０４に面した素子５０７で作用電極の配置を同じようにしてもよいし、図５（Ｂ）のように、参照用流路５０３の作用電極は少なくして代表的な値をとるようにしてもよい。さらに、図５（Ｃ）（Ｄ）のように、素子５０７を別々に設けるようにしてもよい。
　図６は，本発明による計測装置を用いた計測方法のフローチャートの一例である。図３及び図５と併せて説明する。まず、測定セル３０７内の流路５０１に参照用溶液を流す。ここで参照用溶液は、参照用流路５０３と検出用流路５０４を通って流路５０６に抜けるように流される。続いて切り替え弁５０２を検出用流路側に切り替えて検出用流路５０４にシリンジ３０５とポンプ３０３を用いて試料溶液を流し、検出用流路５０４内で反応させる。マルチプレクサ３１４により入力端子と出力端子の接続を切り替えながら，ポテンショスタット３０９と受光素子３１０で発光を測定し，それぞれの発光強度を記録する。これにより，素子５０７上の全ての作用電極について発光強度を測定する。参照用流路内の作用電極の発光強度と検出用流路内の発光強度を比較し，発光強度の差が閾値よりも大きければカウンターをインクリメントする。これにより，素子５０７上の検出用流路内の作用電極一つ一つについて検出対象の結合の有無を判定し，素子５０７の検出用流路内の全ての作用電極上に結合した検出対象の数を数える。最後に，カウンターの値，すなわち素子５０７上の全ての作用電極上に結合した検出対象の数を出力する。尚、ここでは参照用溶液を先に流路内に充填しているが、血液・唾液・尿等の生体試料そのものを参照用溶液で希釈したものを試料溶液として採用すれば、検出用流路に参照用溶液を充填させる工程を省くことができる。また、ここでは参照用流路５０３と検出用流路５０４とが流路５０１とから分岐するようにしているが、図５（Ｅ）（Ｆ）、図５（Ｇ）（Ｈ）のように、はじめから流路を分けておいてもよい。この場合、参照用流路での発光の計測と検出用流路での発光の計測とを並列して行うことができ、測定時間の短縮をすることができる。
　図２，図４，図６の測定フローにおいて，容器又は流路に入れる参照用溶液，試料溶液の量は予め決めた一定量にしておくことが望ましい。このようにすることで，複数の試料溶液間で検出対象濃度を比較したり，検出対象濃度の絶対値を求めたりすることができる。試料溶液の検出対象濃度が高いと，作用電極のほぼ全てに結合してしまうことがある。その場合，濃度を正しく見積もることができないため，試料溶液量を減らしたり，希釈したりすることで正しく計測することができるようになる。尚，発光強度の変化の変わりに電極に流れる電流値の変化を調べてもよい。
　試料溶液の計測後，使用した素子を迅速に新規な素子へと交換するためには，素子を１つのチップとしチップ単位で交換できるのが望ましい。この際，回路の配線の利便性を高めるために素子とマルチプレクサを組み合わせて１つのチップとすることも考えられる。このように素子を１つのチップとすれば，交換の迅速化が図れるだけでなく，例えば様々な種類のプローブが作用電極に備えられた素子を準備すれば，チップを交換するだけで多項目を計測することが可能となる。
　以上の例では，マルチプレクサにより受光素子と素子上の複数の作用電極をその都度１対１対応させて発光の計測を１つ１つ行ったが，ＣＣＤやフォトダイオードアレイのような複数の受光素子を有するものを用いて，複数の発光を同時に計測してもよい。例えば，受光素子として光電子増倍管を用いた場合，受光素子が１個のみであり各作用電極１個に対して逐次的に処理を行うため，全処理時間は（作用電極数）×（作用電極１個当たりの全処理時間）となる。例えば，受光素子としてＣＣＤやフォトダイオードアレイを用いた場合，受光素子が複数備わっているため，各受光素子に対応させた複数の作用電極を同時に光子を発生させて計測すれば、全処理時間は（受光素子１個当たりに対応した作用電極数）×（１回当たりの全処理時間）となる。したがって，作用電極数と処理時間がトレードオフの関係となっているため，場合に応じて全処理時間が短くなるように受光素子を選べばよい。
　また，発光強度変化又は発光強度の差の閾値を用いて作用電極上の検出対象の有無を判定する例を述べたが，時系列の変化を用いても検出対象を高精度に検出することができる。例えば，図１２のようにある１つの作用電極の発光強度を時系列順に並べることで，作用電極上にある物質が捕捉されていた時間を求めることができる。作用電極上に備えられたプローブは検出対象と特異的に結合するため，夾雑物が吸着によって捕捉されてしまった場合よりも，検出対象が捕捉されている時間は長い。したがって，物質の捕捉時間から，捕捉されていた物質が検出対象か夾雑物かを判定することで，判定の精度を向上させることができる。
　ビーズやリポソームを標識として用いれば，本手法はタンパク質などを検出にも有効である。作用電極上に固定化するプローブ、ビーズやリポソームに固定化する別のプローブとして，検出対象に結合するようなものを選択する。このようにすれば，検出対象を介して作用電極上にビーズやリポソームが固定化されるため，作用電極よりも小さな物質も検出することができる。検出対象を１個単位でカウントすることはできないが，標識の非特異的吸着が抑えられる点や溶液中に遊離している標識が信号として検出されにくいため，いわゆるホモジニアスアッセイが可能となる。
　以下，素子について説明を行う。図７～図１０は本発明による素子の一例を示した図である。図７は前記素子の一部分の俯瞰図である。基板７０１上に複数の作用電極７０２が備えられていて，個々の作用電極７０２には配線７０３が接続されている。作用電極は図１のように基板に埋め込まれていると，検出対象物が結合するのに障害が少なくてよい。図８は図７の作用電極の断面図を示している。基板８０１には作用電極８０２が備えられていて，作用電極８０２には配線８０３が接続されている。
　図９は，図８の作用電極にプローブが備えられた場合の概念図を示している。基板９０１には作用電極９０２が備えられていて，作用電極９０２には配線９０３が接続され，作用電極９０２上にはプローブ９０４が備えられている。プローブ９０４は，検出対象を選択的に捕捉できる能力を有する物質，例えば抗体やレセプター，ウイルス認識部位，正または負に帯電した物質等が望ましい。プローブ９０４の作用電極９０２上への固定化は，物理的吸着でも化学的結合でもよい。また，同一種類のプローブをこの複数の電極上に載せるようにしてもよいが，測定条件によっては異なる種類のプローブを，固定化する範囲を決めて，もしくは混在させて電極上に固定化してもよい。基板９０１の部分には夾雑物の非特異的吸着による検出の誤判定を抑制するために，非特異的吸着を抑制する物質，例えばポリエチレングリコール等が修飾されていることが望ましい。
　図１０は図９のプローブが備えられた作用電極上に検出対象が結合した場合の概念図を示している。基板１００１には作用電極１００２が備えられていて，作用電極１００２には配線１００３が接続され，作用電極１００２上にはプローブ１００４が備えら，プローブ１００４に検出対象１００５が１個結合している。上記基板にはＳｉＯ２，Ｓｉ３Ｎ４などの絶縁物を用いる。作用電極には金，白金，銀，銅やカーボンを用いることが望ましいが，求められる耐久性に応じて，チタン，アルミニウム，クロムなどを用いることもできる。配線には導電体を用いる。作用電極と配線の接続は，例えば半導体製造プロセスを用いて，配線の形成後に作用電極を形成するなどすればよい。尚，配線の径は図７のように作用電極の径より小さい必要はなく，例えば，作用電極と配線が同じ径であったり（図１１（Ａ）），作用電極の径よりも配線が太かったりしてもよく（図１１（Ｂ）），基板表面に露出している部分の検出対象との結合により，本発明の効果は得られる。作用電極の大きさとしては，検出対象と対となる大きさであればよい。そして、作用電極の直径を検出対象の直径のおよそ２倍以下とすることで，作用電極に２つ以上の検出対象が結合するのを防ぐことができる。一方，作用電極の直径を検出対象の直径の２分の１以上とすることで，検出対象よりも小さな物質が非特異的に作用電極に結合した際に生じる発光変化を小さくし，検出対象に対する選択性を向上させた。
　検出対象はウイルス・細菌・細胞などである。ウイルス・細菌・細胞のおおよその大きさを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これより，作用電極の大きさとしては，検出対象に合わせて，ウイルスの場合には５～２００ｎｍ程度，細菌の場合には１５０ｎｍ～１６μｍ程度，細胞の場合には５～２０μｍ程度となる。
　図１３～２２は，素子に備わっている作用電極の別の例を示す概念図である。基板１３０１には１段掘り下げられた部位があり，掘り下げられた部位の底面部に作用電極１３０２が備えられている。作用電極１３０３には配線１３０３が接続されていて，作用電極１３０２の周囲に壁１３０４が存在している。図１４は図１３の作用電極にプローブが固定化された状態を，図１５は図１４のプローブに検出対象物が結合している状態を示している。図１６は図１３の壁が作用電極の一部にせり出した形状を示している。このように壁が作用電極の一部を覆っている場合，本実施例においては作用電極が露出した部分が実効的な作用電極であるとみなせる。したがって，作用電極全体の大きさを小さくすることなく，壁の開口部の大きさで作用電極の実効的な大きさを制御することができるようになるため，製造工程の一部を共通化することが可能となる。また，作用電極の大きさを小さくすることが困難な場合にも有効である。図１７は，壁が作用電極近傍にのみ存在している形状の例を示している。図１８は，作用電極が凹型の形状である例を示している。図１９は図１８の凹型作用電極にプローブが固定化された形状を，図２０は図１９のプローブに検出対象物が結合している状態を示している。ここで，検出対象物が１つだけ結合できることを保証するためには，壁の開口径は検出対象物の２倍以下であるとことが望ましい。
　図２１，図２２は図１３，図１８の別の形態である。図２１のように壁がテーパー状であっても図１３で得られた壁による拡散阻害の効果は得られる。また，図２２のように作用電極が丸く凹んでいても，図１８で得られた凹型電極の効果は得られる。
　以下，それぞれの構成をとった場合の効果について説明する。
　図２３は図９の状態から図１０の状態へ変化したときの，作用電極の大きさと発光強度の変化率の関係を，有限要素法を用いて数値解析的に求めた結果を示している。作用電極を直径０．２，１，２，５，１０，２５，５０，１００μmの円板とし，検出対象を作用電極と同じ直径の球体とし，作用電極と検出対象は接触状態にあるとした。発光系には電気化学発光を用いて，電気化学発光の典型的な条件として，トリス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム（Ru(bpy)3 2+）5mM（拡散係数590μm2/s），トリプロピルアミン100mM，印加電圧1.2V（電極反応の反応速度10000μm/s）を採用し，定常状態時における発光強度を計算し，作用電極表面上における検出対象の有無による発光強度の変化量を求めた。図２３に示すように，作用電極表面上に検出対象が有る事によって発光強度は減少し，その減少率は作用電極の直径によらずほぼ一定値であった。
　図２４は，図１３のような作用電極の周囲の壁の高さを変えていった場合の，作用電極表面上における検出対象の有無による発光強度の変化量の違いを示している。発光系には図２３と同じものを採用した。作用電極を直径０．２，１，２，１０，２０μmの円板とし，検出対象を作用電極と同じ直径の球体とし，作用電極と検出対象は接触状態にあるとした。壁の開口径は作用電極と同じとし，壁の高さを検出対象の半径に対して，１／４，１／２，３／４と変化させていった時の作用電極表面上における検出対象の有無による発光強度の変化量を，図２３の時と同様に有限要素法により数値解析的に求めた。図２４より，壁の高さが増加するほど発光強度の減少率は増加していった。これは壁の高さが増加することにより，作用電極表面への酸化還元を起こす試薬の供給が阻害されるためと考えられる。このように，各作用電極の周囲に壁を設けることによって，作用電極近傍における検出対象の有無による発光強度の変化量を増大させることができる。
　図２５は作用電極の直径に対して検出対象の直径の比が変化していった時の，作用電極表面上における検出対象の有無による発光強度の変化量の違いを示している。発光系には図２３と同じものを採用した。作用電極を直径０．２，１，２，１０，２０μmの円板とし，検出対象を球体とし，その直径を作用電極の直径の１，２，５倍と変化させていった時の作用電極表面上における検出対象の有無による発光強度の変化量を，図２３の時と同様に有限要素法により数値解析的に求めた。図２５より作用電極に対する検出対象の大きさが大きいほど，発光強度の減少率は大きくなった。これは検出対象の大きさが増加したことにより，作用電極表面への酸化還元反応を起こす試薬の供給が阻害されるためと考えられる。したがって，作用電極の直径を検出対象の直径よりも小さくすれば，判定の閾値を高く設定することができるため，排除体積効果による選択性向上の効果と合わせて選択性をより向上させることができる。また，検出の有無を判定する際に単純な閾値でなく，予め得ている作用電極と検出対象の大きさの情報から計算される発光強度の減少率の上限と下限を定め，その範囲内に実測値が入れば検出対象を有りと判定する方法もある。このように判定範囲を定めることにより，稀に非特異的に作用電極に吸着してしまった検出対象物より大きな異物による誤判定を抑制することができる。
　以下，図２３～２５で示した現象を説明する。ここでは発光系として電気化学発光に着目するが，他の酸化還元反応を介した発光系でも同様の議論が通用する。図２６に電気化学発光における典型的な反応経路を示す。Ａは電気化学発光試薬を，Ｃは電気化学発光反応における触媒を，Ｐは光子を表す。電気化学発光は電気化学発光試薬が作用電極から電気エネルギーを受け取って励起され，基底状態に戻る過程でエネルギーを光子として放出することで発生する。一般に電気化学反応の一連の反応の中で，電極から電子を受け取る反応（電極反応）の速度が最も遅いため，電気化学反応は電極反応律速となる（図２６においては(1)が電極反応）。
　また，図２６の反応経路からもわかる通り，電気化学発光強度は電極反応における電気化学発光試薬の濃度の時間変化，すなわち電流値に依存し，定常状態においては電流値に比例する。したがって，電気化学発光強度の挙動を調べることは電極反応における電流値の挙動を調べることと同値である。ここでは触媒を介した電気化学反応を例示したが，触媒を介さない電気化学発光反応（例えば，アニオンとカチオンによるアニヒレーションを経由する反応）においても同様の議論が通用する。電気化学発光試薬の濃度をＣ，電極反応の速度をｋ，電気化学発光試薬の拡散係数をＤとすると，定常状態における電極反応は数１で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　いま系の挙動を支配する独立変数はＣ(mol/m3)，ｋ(m/s)，Ｄ(m2/s)に加え，電極半径d (m)の４つであるから，バッキンガムのπ定理より電極反応の挙動の指標となる無次元数πはπ＝（Ｄ／ｋ）／ｄと導出できる。この無次元数πは定性的には次のように理解される。（Ｄ／ｋ）は長さの次元を持ち，電極反応で電気化学試薬が消費される速度に対する電気化学発光試薬の供給速度がどれほど大きいかを表す。したがって（Ｄ／ｋ）に対してｄで比を取って規格化すれば，ある条件下において電極反応が電極反応速度律速であるか拡散供給律速であるかを無次元数πから評価することができる。
　図２７に，図９の状態から図１０の状態へ変化したときの発光強度の変化率を無次元数πを用いて表した図を示す。無次元数πが十分大きい時は拡散速度が十分速いため，電極表面に電気化学発光試薬が十分行渡り電極表面上の検出対象の有無によって電流値は変化しない。一方，無次元数πが十分小さい時は反応速度が十分速いため，電極表面に検出対象が有ると電気化学発光試薬が作用電極と検出対象の間の隙間に到達する前に消費されるため，電流値は減少する。この減少率は検出対象による排除体積効果なので無次元数が十分小さい領域では一定値をとる。図２３，図２５において，減少率が電極の直径に依らずほぼ一定であったのは無次元数πの値が拡散供給律速領域の０．００１～０．５の範囲にあったためである。以上の議論から，電極表面上の検出対象の存在によって発光強度が減少した理由の一つとしては，検出対象による酸化還元反応を起こす試薬の拡散阻害によるものであると考えられる。
　検出対象の有無の判定精度を考えた時，減少率の閾値としては大きいほど望ましい。図１３～１７に示した壁を設けた電極の場合，図２４で示したように壁により検出対象が有ることによる拡散阻害の効果が増幅されるため，減少率の閾値を平板電極よりも高く設定することができ，検出の判定精度を向上させることができる。
　発光強度の測定を考えた時，発光強度の絶対値は大きいほど測定が容易となるため，発光強度の絶対値は大きい方が望ましい。図１８～２０に示した凹型電極の場合，図１３～１７の壁による減少率の増幅効果に加えて，電極面積が平板電極よりも大きくなるため発光強度の絶対値も大きくなり，測定をより容易にすることができる。
　また、対向電極を作用電極に近づけることでも発光強度の絶対値を大きくすることができる。例えば，対向電極を作用電極の真上に平行に配置し，対向電極と作用電極の間隔を小さくしていけば，電流値が増大し発光強度も増大する。対向電極で光量を損失させないためには，発光に対して透明な電極材料がよく、例えば酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極等が望ましい。壁や凹型電極には検出対象に対する選択性を向上させる効果もある。平板電極では，検出対象よりも大きい物質が電極表面に非特異的に吸着した場合，検出対象と同様の発光強度の変化をもたらし，検出の誤判定を引き起こす可能性がある。しかし，壁を設けた電極や凹型電極では，壁や凹型電極の開口径よりも大きい物質が電極表面に接近することができず，検出対象に対する選択性を向上することができる。
　検出対象物を高効率で検出するためには，結合確率を増加させるために作用電極数は多いほど望ましい。また，高濃度域の検出対象物を検出するためにも作用電極数は多いほど良い。素子全体の大きさを一定にしつつ作用電極数を増大するためには，作用電極の高集積化すなわち図２８のような各作用電極の間隔の微小化をする必要がある。しかし，この作用電極間隔が光学顕微鏡の分解能以下の大きさになると，素子上の各作用電極を同時に発光させて受光素子で検出する手法や従来の光学顕微鏡では，隣接した各作用電極を区別することができなくなってしまう。したがって，作用電極の高集積化と検出の高効率化及び検出対象物の検出上限にはトレードオフの関係がある。
　マルチプレクサを用いて各作用電極を１個ずつ発光させて検出する手法は，このトレードオフを解決する手法である。このように、例えば各作用電極に１個ずつ電圧を印加し，印加した時間と受光素子で計測を行う時間を同期させることにより，各作用電極の発光を１個観察でき，作用電極間隔が光の波長以下であっても隣接した各作用電極を区別することが可能となる。この手法と光学顕微鏡の分解能以下の電極間隔を組み合わせることにより，検出の高効率化及び高濃度域の検出対象物の検出が可能となる。
　また，この手法と光学顕微鏡の分解能以下の電極間隔の組み合わせには，光学顕微鏡の位置分解能以下の位置情報を取得できるという効果もある。光学顕微鏡の位置分解能は光の波長の半分程度（0.3～0.5μm）であるため，この波長以下の電極間隔を有する素子とこの手法を用いれば，発光した光の波長以下の位置情報を取得することができる。例えば，100nm程度の大きさの作用電極と100nm程度の大きさの電極間隔を有する電極アレイを用いて，扁平な細胞を検出対象とすれば，100nm程度の位置分解能を持って細胞の表面形状を取得することが可能となる。
　１つの素子上に異種抗体を２種類以上固定化した素子を用いて検出対象の検出を行うことで，同時に複数種の検出対象を検出することが可能となる。例えば，Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体を固定化した直径100nmの作用電極とＢ型インフルエンザウイルスに対する抗体を固定化した直径100nmの作用電極をそれぞれ10000個程度有する作用電極群をそれぞれの抗体毎に例えば領域を分けて設けた素子を用いて，インフルエンザウイルスの罹患が疑われる患者の検体を測定すれば，ウイルスの罹患と型の判定を同時に行うことができる。尚，検出対象はウイルスのみに限らず細菌・細胞でも同様の効果が得られる。
　図２９は作用電極の大きさと作用電極上に結合された検出対象の有無による発光強度の変化率を示している。作用電極として１０，２５，１００μmの直径を持つ金電極を，電気化学発光試薬としてトリス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム（Ru(bpy)3 2+）5mM，トリプロピルアミン100mMリン酸バッファー溶液を用いた。対向電極として白金電極を，参照電極として飽和塩化カリウム銀塩化銀電極を用いて，印加電圧1.2Vの条件で電気化学発光を起こした。検出対象のモデルとしては，作用電極とほぼ同じサイズのポリスチレンビーズを用いた。電圧印加後5秒経過してから受光素子による計測を開始し，受光開始後2秒経過してから電圧印加と計測を終了した。その結果，図２９に示したように発光強度の変化率の実測値（黒丸）は有限要素法による計算値（白丸）と良く一致した。したがって，有限要素法による数値解析が実際の測定を良く再現できていることがわかる。
　１６個の直径300nmの金電極が電極間隔300nmで図３０のように配置されている素子を用いて，300nmのビーズを検出対象として実験を行った。各作用電極には便宜的に１～１６の番号をつけた。金電極表面にはビオチンを化学結合により固定し，ビーズ表面にはストレプトアビジンを化学結合により固定した。このビーズを500個程度含んだ1 μLの検体を素子の上に滴下し，10分間反応させてビーズを金電極の表面に捕捉させた。その後，リン酸バッファー溶液により洗浄を行い，リン酸バッファー中で光学顕微鏡による蛍光観察を，電気化学発光試薬を含む溶液中で電気化学発光を計測した。電気化学発光試薬としてトリス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム（Ru(bpy)3 2+）5mM，トリプロピルアミン100mMリン酸バッファー溶液を用いた。対向電極として白金電極を，参照電極として飽和塩化カリウム銀塩化銀電極を用いて，印加電圧1.2Vの条件で電気化学発光を起こした。
　各作用電極に電圧印加後1秒経過してから受光素子による計測を開始し，受光開始後2秒経過してから電圧印加と計測を終了する手法と、同様の操作を全ての作用電極に同時に行って計測する手法を用いた。ここでは、閾値を15％と定め、全作用電極に電圧を同時に印加させた結果，どの作用電極での発光かどうかの位置情報を得ることができず、ビーズが捕捉されているかどうか判断することはできなかった。一方，図２の手順で閾値を15％と定め、各作用電極に１個ずつ電圧を印加していった結果、個々の作用電極からの発光を区別することができた。
　個々の作用電極の発光強度の変化からビーズの有無を検出した結果，ビーズが捕捉されていると区別できるのは５個であった（電極番号で言えば，１，７，１２，１３，１４を検出）。したがって，隣接する作用電極が光学顕微鏡の位置分解能以下の範囲に入っているために従来法では個々の作用電極が区別できないような条件下でも，各作用電極に電圧を印加する時間と受光素子で計測を開始する時間を同期させて計測することで個々の作用電極を区別することができた。
１０１，３０１　測定部
１０２，３１３，５０７　素子
１０３　容器
１０４　溶液
１０５，３１５　対向電極
１０６，３１６　参照電極
１０７，３１４　マルチプレクサ
１０８，３０９　ポテンショスタット
１０９，３１０　受光素子
１１０，３１１　制御部
１１１　データ処理装置
１１２　演算装置
１１３　一時記憶装置
１１４　不揮発性記憶装置
１１５　データ表示装置
３０２　参照用溶液容器
３０３　ポンプ
３０４，３１２　流路
３０５　シリンジ
３０６　バルブ
３０７　測定セル
３０８　廃液容器
５０１　導入側流路
５０２　切り替え弁
５０３　参照用流路
５０４　検出用流路
５０５　切り替え弁
５０６　排出側流路
７０１，８０１，９０１，１００１，１１０１，１３０１，１４０１，１５０１，１６０１，１７０１，１８０１，１９０１，２００１，２１０１，２２０１，２８０１　基板
７０２，８０２，９０２，１００２，１１０２，１３０２，１４０２，１５０２，１６０２，１７０２，１８０２，１９０２，２００２，２１０２，２２０２，２８０２　作用電極
７０３，８０３，９０３，１００３，１１０３，１３０３，１４０３，１５０３，１６０３，１７０３，１８０３，１９０３，２００３，２１０３，２２０３，２８０３　配線
９０４，１００４，１４０５，１５０５，１９０４，２００４　固定化プローブ
１００５，１５０６，２００５　検出対象
１３０４，１４０４，１５０４，１６０４，１７０４，２１０４　壁

Claims (18)

  1. 　基板と、前記基板の表面に設けられた複数の作用電極と、前記複数の電極のそれぞれと接続され前記基板の表面と反対側に設けられた配線と、前記作用電極上に測定対象を捕捉するプローブとを有するアレイと、
    　酸化還元反応により発光する試薬を含む参照溶液を前記アレイ上に接触させる溶液接触手段と、
    　前記参照溶液に接触するように設けられた対向電極と、
    　前記配線のそれぞれの接続を制御して、前記作用電極と前記対向電極との間の電圧を制御する電圧制御手段と、
    　前記アレイからの光を検出する光検出器と、
    　前記溶液接触手段により試料溶液を接触させ、前記光検出器により検出される光強度の測定に基づいて、前記プローブに捕捉された前記測定対象の有無を測定する計算部と、を有することを特徴とする計測装置。
  2. 　前記計算部は、測定された前記測定対象の数をカウントすることを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  3. 　前記計算部は、前記測定対象の捕捉の有無を判定するための光強度変化の閾値を記憶していることを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  4. 　前記電圧制御手段は、前記複数の作用電極のうち１つを選択して電圧を印加することを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  5. 　前記溶液接触手段は、前記アレイを底面に保持し、前記参照溶液を保持する容器であることを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  6. 　前記溶液接触手段は、前記参照溶液を流す流路であることを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  7. 　前記流路は、前記流路は前記測定対象を流す第１の流路と、前記測定対象を流さない第２の流路とを備え、前記計算部は、前記第１の流路に接触しているアレイからの光と、前記第２の流路に接触しているアレイからの光との強度差により、測定対象の計測をすることを特徴とする請求項６記載の計測装置。
  8. 　前記作用電極が底面となるように前記基板上に側壁を有することを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  9. 　前記複数の作用電極の間隔は、光の波長分解能よりも小さいことを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  10. 　前記電圧制御手段は一定時間電圧を印加し、前記計算部は光強度が変化した時間を測定して、前記測定対象の捕捉の有無を判定することを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  11. 　前記作用電極の大きさは、前記測定対象と対となる大きさであることを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  12. 　前記作用電極の大きさは、前記測定対象の大きさの半分以上２倍以下であることを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  13. 　前記測定対象は、細胞、細菌、ウイルス、ビーズ、リポソーム、たんぱく質のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の計測装置。
  14. 　基板と、前記基板の表面に設けられた複数の作用電極と、前記複数の電極のそれぞれと接続され前記基板の表面と反対側に設けられた配線と、前記作用電極上に測定対象を捕捉するプローブとを有するアレイ上に、酸化還元反応により発光する試薬を含む参照溶液を導入する工程と、
    　前記アレイ上に、試料溶液を導入する工程と、
    　前記複数の作用電極のそれぞれの電気的接続を制御する工程と、
    　接続された前記作用電極と、前記参照溶液と接触した対向電極との間の電圧印加を制御する工程と、
    　前記前記アレイからの光を光検出器により検出する工程と、
    　前記参照溶液を導入したアレイについて、前記試料溶液を導入した場合と導入しない場合における光強度の測定に基づいて、前記プローブに捕捉された前記測定対象の有無を測定する工程と、を有することを特徴とする計測方法。
  15. 前記複数の作用電極それぞれについて、前記測定対象の捕捉の有無を測定し、捕捉された測定対象の数をカウントする工程とを有することを特徴とする請求項１４記載の計測方法。
  16. 　前記参照溶液を導入した前記アレイについて、前記試料溶液を導入してからの光強度の変化が閾値を超えるかどうかの判定をして、前記プローブに捕捉された前記測定対象の有無を測定することを特徴とする請求項１４記載の計測方法。
  17. 　前記参照溶液を導入した前記アレイについて、前記試料溶液を導入した場合と導入しない場合の光強度の差に基づいて、前記プローブに捕捉された前記測定対象の有無を測定することを特徴とする請求項１４記載の計測方法。
  18. 　前記電圧印加の工程と、前記光検出器により検出する工程とのタイミングを同期させて計測することを特徴とする請求項１４記載の計測方法。
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