WO2012031918A1 - Magnetische durchflusszytometrie zur einzelzelldetektion - Google Patents

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WO2012031918A1
WO2012031918A1 PCT/EP2011/064776 EP2011064776W WO2012031918A1 WO 2012031918 A1 WO2012031918 A1 WO 2012031918A1 EP 2011064776 W EP2011064776 W EP 2011064776W WO 2012031918 A1 WO2012031918 A1 WO 2012031918A1
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magnetoresistive
measurement
distance
flow
cells
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PCT/EP2011/064776
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English (en)
French (fr)
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Oliver Hayden
Michael Johannes Helou
Sandro Francesco Tedde
Original Assignee
Siemens Aktiengesellschaft
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1031—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/72—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating magnetic variables

Definitions

  • the present invention relates to flow cytometry.
  • flow measurements are known in which magnetically labeled analytes flow through magnetic sensors.
  • positive signals can not be clearly attributed to a single cell.
  • cross-selection of the magnetic markers can also cause falsely labeled cells to give a positive signal.
  • unbound markers can also cause a positive signal.
  • Cell agglomerates in turn lead to only a positive signal and are not as such ⁇ he recognizable.
  • the inventive method is used for magnetic flow measurement of cells.
  • the process comprises the following steps:
  • a commissioning of a sensor arrangement takes place.
  • at least a first and a second magnetoresistive component is connected in a Wheatstone bridge in Diago ⁇ nalanaku or parallel arrangement.
  • diagonal arrangement is meant here that the diagonally ge ⁇ genübericide resistances of the Wheatstone bridge are magnetoresistive elements, parallel design, it is meant that adjacent resistors in the Wheatstone bridge are magnetoresistive elements.
  • the magnetoresistive components are spaced apart in the flow direction arranged. In particular, the distance is adapted to the type of cell to be detected.
  • a measurement signal is generated with a characteristic pattern of at least three Meßausditen.
  • the charac ⁇ -specific measurement signal pattern provides the information measuring rash number, measuring distances rash, rash measuring amplitudes measured deflection direction and measuring direction rash sequence.
  • an evaluation of the measurement signal takes place, in which a measurement signal is identified as a single cell detection on the basis of the characteristic measurement stop sequence.
  • This method further has the advantage that, besides the reduction of the legitimacysig ⁇ Nals false positive signals are avoided.
  • a flow velocity measurement can take place.
  • an evaluation of the measurement signal is carried out in the method, in which the flow velocity of the cells is calculated on the basis of the known distance of the magnetoresistive components. Knowing the flow rate of the cells has another advantage. Based on the flow rate qualitative conclusions about the cell size are mög ⁇ Lich. Much smaller particles than the cell, eg unbound magnetic markers, move much more slowly than the cells to be detected. Larger particles or cell ⁇ agglomerate move at a much higher speed than the fürtikge ⁇ to be detected cells. Through the Calculating the flow rate so the quality of single cell detection is still increased.
  • an evaluation of the measurement signal is pre ⁇ taken in the method, in which the cell diameter is calculated on the basis of the Meßaustsch- distance. This calculation can be done beispielswei ⁇ se from the calculated flow rate and the measured measurement rash distance.
  • the Zell bemes ⁇ ser is another parameter that indicates a single cell detection or is an indication of a false positive signal.
  • an evaluation of the measurement signal provided ⁇ taken, in which the signal ⁇ noise ratio is determined based on the measured deflection amplitude is in the process.
  • the measurement ⁇ signal pattern may comprise a plurality of measuring deflections with different amplitudes. For example, an upper and / or a lower limit for the amplitude can be set.
  • the measurement amplitude used here not as in previous measurements solely for the identification of a measurement event, but as one of several information from the characteristic measurement signal pattern.
  • boundary intervals can be set in which the corresponding measured value must be a positive signal measurement ⁇ .
  • limits, upper and / or un ⁇ tere limits or threshold intervals can be set for the calculated variables such as flow rate or cell ⁇ diameter or signal to noise ratio.
  • a magnetic marking of the cells is carried out by means of superparamagnetic markers.
  • the magnetoresistive Examples of components include GMR sensors, TMR sensors or AMR sensors.
  • the first and the second magnetoresistive component are preferably arranged at a distance in the flow direction of at most one cell diameter.
  • the distance may be one and a half cell diameter.
  • a distance of a maximum of twice the cell diameter is directed to a cell type with a characteristic cell diameter.
  • the sensor arrangement, four magnetoresistive components to a first and a second pair are connected in a Wheatstone bridge in parallel arrangement and are arranged in series so that a flow of cell h ⁇ len initially via the first, can then be guided via the second, then via the third and then via the fourth magnetoresistive component.
  • the flow of the cells is first conducted via the first, then via the second, then via the third and then via the fourth magnetoresistive component.
  • the flow rate is preferably calculated on the basis of the known pair distance between the first and second pair of magnetoresistive components.
  • cell detection is performed in complex media, such as whole blood.
  • the analyte ie the cells have varying diameters. typically, measure white blood cells 7 to 12 ⁇ in diameter. Accordingly, the limit interval for the calculated cell ⁇ diameter, for example, set (to 7 to 12 ⁇ ).
  • This has the advantage that cross-selectivity, for example to other cell types with significantly different cell diameters, can be avoided.
  • Such cross-selectivity can be al ⁇ Leinig not excluded by the magnetic marker.
  • the marker density varies on a cell. This manifests itself, for example, in different measurement amplitudes. Accordingly, for example, the limit interval for the measurement amplitude is selected.
  • the background is expediently suppressed, and too high signals are ignored by aggregates. For example, unbound superparamagnetic particles with antibody contribute to the background signal.
  • ⁇ gaten of cells for example, bind over unbound markers each other, it can also lead to aggregates of superparamagnetic particles on the antibody. However, these are excluded, for example, by setting an upper limit for the measurement amplitude.
  • the flow velocity in a laminar flow changes as the cells interact with the channel surface.
  • the magnetically marked cells are preferably enriched in an external field on the magnetoresistive components and the stray field of the cells is aligned.
  • the cells are enriched in the channel wall ⁇ that they roll in a laminar flow at the channel ⁇ wall.
  • the external field preferably extends perpendicularly to the stray field of the cells to be detected.
  • the magnetoresistive component When a single magnetoresistive component is swept by a single magnetically marked cell, the magnetoresistive component experiences a change in resistance as a function of the position of the cell or its magnetic field relative to the magnetoresistive component, that is to say the sensor element.
  • Measurement signal has a positive and a negative measurement deflection. Depending on the direction of the stray field of the cell, which is a magnetic dipole, is first of po sitive ⁇ and then the negative measuring rash or vice versa.
  • the essential advantage of the method according to the invention is that, independently of a varying cell diameter of the analyte and independent of the marker density, a characteristic measurement signal pattern is generated on a cell and an individual cell detection can thus be carried out.
  • the measurement signal pattern of a single cell delivers an information content of four bits.
  • false-positive signals can be excluded from cell aggregates or aggregated markers
  • the device according to the invention serves for magnetic
  • the device comprises a sensor arrangement comprising at least one Wheatstone bridge with at least one first and one second magnetoresistive component.
  • the magnetoresistive components are connected in a diagonal arrangement or in a parallel arrangement.
  • the magnetoresistive components are arranged at a distance from one another along a flow channel such that a flow of the cells can first be guided via the first and then via the second magnetoresistive component.
  • the distance of the magnetoresistive components in the flow direction is preferably adapted to the cell type to be detected. Since ⁇ at the magnetoresistive components are designed so that a magnetic field of a single magnetically marked cell can be detected.
  • the sensor arrangement is designed so that a measuring signal is detected which is a charac ⁇ ULTRASONIC measurement signal pattern with at least three measurement rashes.
  • the measurement signal pattern contains information measuring rash number, measuring distances rash, Messaustschamplitu ⁇ , measuring deflection direction and measuring direction rash sequence. Furthermore includes an evaluation that out ⁇ staltet is based on the measured deflection towards the sequence Identify measurement signal as single cell detection.
  • the ER-making proper device poses to ensure a single cell detection ⁇ while false positive Signa ⁇ le be avoided by additional information from a measurement signal pattern the advantage.
  • the distance of the magnetoresistive components is at most a cell diameter.
  • the distance is a maximum of 50 ⁇ .
  • the distance is a maximum of 25 ⁇ .
  • the device comprises evaluation electronics which are designed to calculate the flow rate from the measurement signal pattern on the basis of the known distance of the magnetoresistive components.
  • the device comprises evaluation electronics which are designed to calculate the cell diameter on the basis of the measurement deflection distance.
  • the evaluation electronics likewise serve to calculate the cell diameter and the flow rate.
  • the device comprises evaluation electronics, which are designed to determine the signal-to-noise ratio on the basis of the measurement amplitude.
  • the signal to noise ratio is the same evaluation ⁇ electronics, the calculated flow rate and cell through ⁇ knife, determined.
  • the magnetoresistive elements are connected in a ⁇ Pa rallelanowski extract and arranged in series so that a flow of the cells initially via the first, then through the second, then subse- via the third and chd on the fourth magnetoresistive component is feasible.
  • at least one Wheatstone bridge with a first and a second pair of two magnetoresistive components is included in the sensor arrangement.
  • the distance between the first and the second pair of magnetoresistive components is more than three cell diameters.
  • the device has the advantage that in a parallel arrangement, the flow rate is ⁇ telt ermit and two pairs of magnetoresistive components also generate two characteristic measured signal pattern to advantage.
  • the device comprises a flow chamber through which the cells are passed, and which expediently passes over a magnetoresistive sensor.
  • a magnetoresistive device may be a GMR, TMR or AMR sensor.
  • Such magnetoresistive sensors are advantageous ⁇ , as magnetoresistors in a Wheatstone bridge connected. With such a Wheatstone measuring bridge, the stray field generated by a cell can be detected, thereby causing a change in resistance.
  • the flow chamber is designed so that a laminar flow of the analyte can be realized therein.
  • adhesion or interaction of the cells with the flow chamber surface must not be too strong.
  • the nature of the inner surface of the flow channel allows the cells to roll on the channel wall.
  • the Wheatstone bridge is realized in the following layout :
  • the magnetoresistive components are preferred wise strip-shaped, eg with a sensor surface of 2 x 30 um.
  • the component size is in the range of the dimension of a cellular analyte.
  • the cells to be detected have, for example, diameters between 1 and 20 ⁇ m.
  • the strip-shaped magnetoresistive components are transverse to the flow direction of the cells.
  • the resistances of the supply lines to the four resistors of a Wheatstone bridge are aligned ⁇ consider possible to nimize to mi- in the signal and influence of temperature offsets. For example, all four resistors are the
  • the magnetoresistive components are GMR elements.
  • the sensor arrangement is configured such that the diagonal resistances of the Wheatstone bridge, ie the diagonally opposite resistances of the Wheatstone bridge, are arranged in spatially separated pairs.
  • One of the pairs for example, consists of magnetoresistive resistors.
  • the magnetoresistive components are, for example, GMR elements. In this configuration, therefore, only the hal ⁇ be bridge is exploited.
  • the measurement signal pattern depends on the distance between the magnetoresistive components of a pair of diagonal resistors. If the magnetoresistive components are far apart, four measurement deflections are registered. In shortening the distance between the two magnetoresistive elements along the flow direction, the four measuring deflections migrate to one another and form a measuring ⁇ signal pattern with four measuring deflections different amplitude and direction. From a distance characteristic of the cell diameter, the individual signals of the individual magnetoresistive components overlap. The characteristic distance is furthermore dependent on the extent of the stray field of the cell. With sufficient shortening of the abatement Standes between the magnetoresistive components in a diagonal arrangement, it comes to extinguishing the average measurement rashes. This signal overlap occurs from a distance less than 2 cell diameter. With a cell diameter of, for example, 10 ⁇ , the magnetoresistive components overlap at a distance of approximately 20 to 30 ⁇ from the sensor responses.
  • the resistors are arranged in spatially separated pairs.
  • the pairs are parallel resistances of the measuring bridge.
  • the second signal ie the signal that is produced during scanning of the second magnetoresistive component, a reflection of the first signal.
  • a superimposition of the sensor responses also takes place in the parallel layout when the magnetoresistive components approach in the direction of flow.
  • the two superimposed signal halves add up, which theoretically results in a peak with twice the amplitude height.
  • both parallel resistor pairs are connected in series.
  • the distance of the opponent ⁇ stand couple is expediently more than three cell ⁇ diameter of the cell to be sensed.
  • the characteristic measuring signal sequence By means of the characteristic measuring signal sequence with two diagonal resistances, it is possible to determine the flow velocity of the cell.
  • the fürtikgeschwin ⁇ speed can be calculated for a known data rate and a known distance of the magnetoresistive elements.
  • the measurement signal pattern allows to assign relative to the magnetic gates ⁇ sistiven components the peak values of the measuring cell rashes exact positions. The way the cell travels between the two peaks of the sets corresponds to the distance between the two magnetoresistive components.
  • the distance traveled by the cell h ⁇ le corresponds to the distance of the pairs of resistors between the peak values of the measured deflections.
  • FIG. 1 shows a measurement signal of a single resistance arrangement.
  • Figure 2 shows the time course of the movement of a cell to be detected via a single resistor.
  • Figure 3 shows a Wheatstone bridge
  • FIG. 4 shows a Wheatstone bridge in diagonal arrangement.
  • FIG. 5 shows the measurement signal in a diagonal arrangement in FIG
  • Figure 6 shows the measurement signal in a diagonal arrangement with a spacing of the resistors, which he laubt a superposition of the two measurement signals of the individual resistances ⁇ .
  • Figure 7 shows the time course of a detected
  • FIG. 8 shows a Wheatstone bridge and the cell flow progression via the resistors.
  • FIG. 9 shows a Wheatstone bridge in parallel arrangement.
  • FIG. 10 shows the measurement signal in a parallel arrangement in FIG
  • FIG. 11 shows the measurement signal in a parallel arrangement with a spacing of the resistors, which he laubt a superposition of the two measurement signals of the individual resistances ⁇ .
  • FIG. 12 shows the time profile of a cell to be detected via two resistors in parallel arrangement.
  • FIG. 13 shows the measurement signal in a diagonal arrangement for a flow velocity measurement.
  • Figure 14 shows the time course of a detected
  • FIG. 15 shows a Wheatstone bridge and the Zellpoundver ⁇ run on the resistors.
  • Figure 16 shows a Wheatstone bridge in parallel arrangement for a flow rate measurement.
  • FIG. 17 shows two measurement signals of two resistor pairs in a parallel arrangement for flow rate measurement.
  • Figure 18 shows the time course of a detected
  • the measurement signal curve shown in FIG. 1 with the time t first shows a positive measurement deflection and then a negative measurement deflection of the same amplitude A.
  • the temporal flow profile 20 is illustrated in FIG. 2 shows a cell 10 at three time points ti, t2 and T3. The cell 10 sweeps over the measuring resistor in the time interval ti to t 3 .
  • the stray field of the cell 10 is displayed.
  • the inplane field is registered by the measuring resistor, ie the field parallel to the direction of movement, which is indicated by the velocity arrow v.
  • the field perpendicular to the direction of movement and perpendicular to the plane in which the resistor is located is not detected by the sensor.
  • ⁇ ser direction perpendicular to the moving direction of the external field is directed to the enrichment of the cells 10 to the resistors.
  • FIG. 3 shows a Wheatstone measuring bridge.
  • U cc denotes the applied voltage
  • U b the measuring voltage
  • Ri to R 4 the resistances of the measuring bridge, of which at least two, for example, example, the opposing diagonal elements Ri and R4 are magnetoresistive resistors.
  • cells 10 and their flow direction 20 are displayed.
  • Figure 4 shows how the Wheatstone bridge preferably is at an ⁇ that a flow of the cells 10 on the diagonal elements of Ri, R4 can be carried out.
  • the measurement at hand ⁇ a diagonal pair 40 is carried out, whereas R2 and R3, for example as ⁇ need not be magnetoresistive elements.
  • the distance ⁇ of the magnetoresistive components Ri, R4 influences the measurement signal.
  • FIG. 5 shows the course of the measurement over time for three different distances ⁇ , ⁇ 2 and ⁇ 3. Where ⁇ 2 ⁇ and ⁇ 3 ⁇ 2.
  • the otherwise identically generated measuring signals of the two magnetoresistive components Ri, R 4 are superimposed.
  • a cha ⁇ rakter Vietnameses measurement signal for a single cell detection in the diagonal arrangement 40 with four successive strokes Messaus- is initially positive, then negative, then again a positive and then a negative measurement shown a rash.
  • the measurement rashes have also ⁇ Kunststoffliche amplitudes A.
  • this distance dependence is used for a calibration-free single cell detection, ie a quantification of a cell concentration in a complex medium.
  • This distance ⁇ is used for a calibration-free single cell detection.
  • the cell size can vary between 1 ⁇ and 20 ⁇ .
  • CD4 + cells have a diameter of about 7 ⁇ . Even within a cell type, the cell diameter varies. A small variation has to be recorded. Accordingly, a GeWiS ⁇ ses interval for measuring the amplitude A is selected.
  • FIG. 6 shows a characteristic curve for measuring a Einzelzellde ⁇ tetation, a so-called fingerprint of an individual cell 10th
  • the peak values of the measured deflections at the characte ristic ⁇ times tei, tei, tei and t65 an accurate position relative to the resistance (Ri, R 4) to you, which is illustrated in FIG. 7
  • a single cell 10 moves past the pair of magnetoresistive devices Ri, R4.
  • This half-bridge arrangement shown is connected in diagonal arrangement 40.
  • FIG. 8 again shows a Wheatstone bridge in the classic circuit diagram.
  • the arrows 20 indicate the flow direction of the cells 10 to be detected.
  • the flow direction 20 is now selected in contrast to Figure 3 via the parallel elements Ri and R 2 or R3 and R4.
  • Parallel elements means that the swept resistance pairs R 1 / R 2 or R3 / R4 are located next to one another and not diagonally opposite each other.
  • Figure 9 shows an advantageous arrangement of the Wheatstone bridge 90, so that the resistors are arranged at a defined distance ⁇ to each other along the flow direction 20.
  • the resistors R 1 -R 4 are strip-shaped and arranged transversely to the flow direction 20.
  • the cells 10 can sweep a pair of resistors or both pairs of resistors in separate channels.
  • FIG. 16 shows how, with a parallel connection 160, a flux 20 is implemented via all four magnetoresistive components R 1 -R 4 can be, which are arranged in a row along the Flusska ⁇ nals 20.
  • FIG. 10 shows the measuring signal of a parallel arrangement 90 of two measuring resistors R3, R4 as a function of the distance ⁇ .
  • the Messsigna ⁇ le approximate.
  • the measurement signals are still from ⁇ each other and do not overlap. It is shown that, in contrast to the diagonal arrangement 40 in the parallel arrangement 90, the measurement deflection sequence is mirrored.
  • the first resistor R3 emphasize is initially a po ⁇ sitiver measuring rash and then a negative impact from ⁇ .
  • the second measuring resistor R4 he ⁇ initially followed by a negative and then a positive measurement deflection.
  • FIG. 11 shows a measurement signal profile via a parallel arrangement. Also in this case, the peak values of the measured deflections exact time points tn-ti 3, or positions re ⁇ tively to the resistors assigned. These are shown in the time course of the cell 10 via the measuring resistors R3, R4 in Figure 12. At the time tu, the cell 10 starts to sweep the first measuring resistor R3. The cell 10 moves at a speed v over the measurement reflection ⁇ stands. Is registered, the in-plane field of the stray field of the cell 10. At the time ti2 with the highest amplitude A be ⁇ there is the cell 10 exactly between the two components magnetore- sistiven R3, R4 in a parallel arrangement 90.
  • FIG. 13 shows the time course of a Messsig ⁇ Nals in diagonal arrangement 40 with a spacing ⁇ the magnetically toresistiven components Ri, R 4, which causes a measurement waveform with four measuring deflections of different amplitude.
  • the time points of the peak values of the measurement deflections t3i to t34 are again illustrated in FIG. 14 and brought in conjunction with the position of the cell 10 over the measuring resistors Ri, R4.
  • the path ⁇ the cell 10 in the time interval At between the two maxima, ie the peak values of the measuring deflections travels at the time t33 and t3i, corresponds exactly to the distance ⁇ of the two sensor elements Ri, R 4. about
  • FIG. 15 illustrates the course of the cells 10 via the measuring resistors R 1 -R 4.
  • Figure 17 shows the measurement signal of the two consecutive pairs of Ri, R2 and R3, R4 160 in Parallelanord ⁇ voltage
  • Figure 18 shows the corresponding sweep the sensor assembly of a cell 10. At time t 7 i sweeps the cell 10, the first sensor element Ri at a speed of v.
  • cell 10 reaches the middle between the first two components R 1 / R 2 .
  • the ⁇ se position corresponds to the highest peak value of the first measurement signal t 72 ⁇
  • the cell 10 terminates the second sensor R 2 .
  • the cell 10 has reached the ⁇ With te between the components of the second pair, so again the highest peak value of the second measurement signal.
  • the time interval ⁇ of these two maxima at the times t 72 and t 74 is marked ⁇ . This time difference Reference ⁇ can now be used again to determine the flow rate v.
  • the cell diameter can be determined in the flow rate ⁇ / s] with the time interval et [sec] or ⁇ T [sec] is multiplied.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Durchflusszytometrie. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine eindeutige Einzelzelldetektion und eine Zellmessung von Zellen im Fluss gewährleistet. Dazu wird mit einem Paar magnetoresistiver Bauteile ein charakteristisches Messsignalmuster erzeugt, dem die Informationen Messausschlaganzahl, Messausschlagabstände, Messausschlagamplituden, Messausschlagrichtung und Messausschlagrichtungsabfolge entnehmbar sind. Daraus können wiederum die Durchflussgeschwindigkeit sowie der Zelldurchmesser ermittelt werden. Darüber hinaus wird anhand der Messausschlagamplitude das Signalrauschverhältnis ermittelt.

Description

Beschreibung
Magnetische Durchflusszytometrie zur Einzelzelldetektion
Die vorliegende Erfindung betrifft die Durchflusszytometrie . Im Bereich der Zellmessung und Zelldetektion sind Durchflussmessungen bekannt, bei denen magnetisch markierte Analyte über Magnetsensoren fließen. Positive Signale können dabei jedoch nicht eindeutig auf eine einzelne Zelle zurückgeführt werden. So können durch Querselektion der magnetischen Marker auch fälschlicherweise markierte Zellen ein positives Signal hervorrufen. Weiterhin können auch ungebundene Marker ein positives Signal verursachen. Zellagglomerate wiederum führen zu nur einem positiven Signal und sind nicht als solche er¬ kennbar .
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Hintergrund¬ signal bei magnetischer Durchflusszytometrie zu verringern und falschpositive Signale zu vermeiden.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 und durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 9. Weiterbildungen des Verfahrens und vorteilhafte Ausgestaltun¬ gen der Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen. Dabei umfasst das Verfahren folgende Schritte :
Zunächst findet eine Inbetriebnahme einer Sensoranordnung statt. Dabei wird mindestens ein erstes und ein zweites magnetoresistives Bauteil in eine Wheatstone-Brücke in Diago¬ nalanordnung oder Parallelanordnung verschaltet. Mit Diagonalanordnung ist dabei gemeint, dass die sich diagonal ge¬ genüberliegenden Widerstände der Wheatstone-Brücke magnetore- sistive Bauteile sind, mit Parallelanordnung ist gemeint, dass nebeneinander liegende Widerstände in der Wheatstone- Brücke magnetoresistive Bauteile sind. Die magnetoresistiven Bauteile werden in einem Abstand voneinander in Flussrichtung angeordnet. Insbesondere wird der Abstand auf den zu detek- tierenden Zelltyp angepasst. Des Weiteren erfolgt eine magne¬ tische Markierung der Zellen. Nach der Inbetriebnahme und Markierung der Zellen wird ein Fluss der Zellen über die Sen- soranordnung erzeugt. Dabei wird der Fluss der Zellen zu¬ nächst über das erste und anschließend über das zweite magne- toresistive Bauteil geführt. Dabei erfolgt eine Einzelzeller¬ fassung. Durch das magnetische Feld einer einzelnen magnetisch markierten Zelle, die über die Sensoranordnung fließt, wird ein Messsignal mit einem charakteristischen Muster aus mindestens drei Messausschlägen erzeugt. Das charakteristi¬ sche Messsignalmuster stellt die Informationen Messausschlaganzahl, Messausschlagabstände, Messausschlagamplituden, Messausschlagrichtung und Messausschlagrichtungsabfolge bereit. Anschließend an die Einzelzellerfassung erfolgt eine Auswertung des Messsignals, in der ein Messsignal als Einzelzellde- tektion anhand der charakteristischen Messanschlagabfolge identifiziert wird. Dies ermöglicht eine kalibrationsfreie Konzentrationsbestim¬ mung des Analyten im Durchfluss. Dieses Verfahren hat weiter den Vorteil, dass neben der Verminderung des Hintergrundsig¬ nals falschpositive Signale vermieden werden. Gleichzeitig kann eine Durchflussgeschwindigkeitsmessung erfolgen. Auch Rückschlüsse auf die Zellgröße sind möglich. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird dazu in dem Verfahren eine Auswertung des Messsignals vorgenommen, in der die Durchflussgeschwindigkeit der Zellen anhand des be- kannten Abstandes der magnetoresistiven Bauteile berechnet wird. Die Durchflussgeschwindigkeit der Zellen zu kennen birgt einen weiteren Vorteil. Anhand der Durchflussgeschwindigkeit sind qualitative Rückschlüsse auf die Zellgröße mög¬ lich. Sehr viel kleinere Partikel als die Zelle, z.B. unge- bundene magnetische Marker, bewegen sich sehr viel langsamer als die zu detektierenden Zellen. Größere Partikel oder Zell¬ agglomerate bewegen sich mit sehr viel höherer Durchflussge¬ schwindigkeit als die zu detektierenden Zellen. Durch die Be- rechnung der Durchflussgeschwindigkeit wird also die Güte der Einzelzelldetektion noch erhöht.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in dem Verfahren eine Auswertung des Messsignals vorge¬ nommen, in der der Zelldurchmesser anhand des Messausschlag- abstandes berechnet wird. Diese Berechnung kann beispielswei¬ se anhand der berechneten Durchflussgeschwindigkeit und dem gemessenen Messausschlagabstandes erfolgen. Der Zelldurchmes¬ ser ist ein weiterer Parameter, der auf eine Einzelzelldetektion hinweist oder ein Indiz für ein falschpositives Signal ist .
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in dem Verfahren eine Auswertung des Messsignals vorge¬ nommen, in der anhand der Messausschlagamplitude das Signal¬ rauschverhältnis ermittelt wird. Insbesondere kann das Mess¬ signalmuster mehrere Messausschläge mit unterschiedlichen Amplituden aufweisen. Beispielsweise kann ein oberer und/oder ein unterer Grenzwert für die Amplitude festgelegt sein. Die Messausschlagamplitude dient hier, nicht wie in bisherigen Messungen alleinig zur Identifikation eines Messereignisses, sondern als eine von mehreren Informationen aus dem charakteristischen Messsignalmuster.
Insbesondere können für alle Messwerte bzw. Informationen aus dem Messsignalmuster wie Messausschlaganzahl, Messausschlag- abstand und Messausschlagamplitude Grenzwerte festgelegt wer¬ den. Insbesondere können Grenzintervalle festgelegt werden, in denen der entsprechende Messwert für ein positives Mess¬ signal liegen muss. Derartige Grenzwerte, obere und/oder un¬ tere Grenzwerte oder Grenzwertintervalle, können auch für die berechneten Größen wie Durchflussgeschwindigkeit oder Zell¬ durchmesser oder Signalrauschverhältnis festgelegt werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in dem Verfahren eine magnetische Markierung der Zellen mittels superparamagnetischer Marker vorgenommen. Die magnetoresisti- ven Bauteile sind beispielsweise GMR-Sensoren, TMR-Sensoren oder AMR-Sensoren .
Vorzugsweise wird in dem Verfahren bei der Inbetriebnahme der Sensoranordnung das erste und das zweite magnetoresistive Bauteil in einem Abstand in Flussrichtung von maximal einem Zelldurchmesser angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass ein Messsignalmuster mit vier Messausschlägen erzeugt wird. Alternativ kann der Abstand auch eineinhalb Zelldurchmesser betragen. Zweckdienlich ist ein Abstand von maximal doppeltem Zelldurchmesser. Eine derartige Anpassung des Abstandes der magnetoresistiven Bauteile ist auf einen Zelltyp mit charakteristischem Zelldurchmesser ausgerichtet. Zur Erfassung unterschiedlicher Zelltypen oder Zellen unbekannten Durchmes- sers ist eine Sensor-Strecke mit mehreren Sensoranordnung un¬ terschiedlichen Abstands ausführbar.
In einer zweckdienlichen Ausgestaltung der Erfindung werden in dem Verfahren zur Inbetriebnahme der Sensoranordnung vier magnetoresistive Bauteile zu einem ersten und einem zweiten Paar in einer Wheatstone-Brücke in Parallelanordnung verschaltet und so in Reihe angeordnet, dass ein Fluss der Zel¬ len zunächst über das erste, anschließend über das zweite, anschließend über das dritte und anschließend über das vierte magnetoresistive Bauteil führbar ist. Der Fluss der Zellen wird zunächst über das erste, anschließend über das zweite, anschließend über das dritte und anschließend über das vierte magnetoresistive Bauteil geführt. Vorzugsweise wird in der Auswertung die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Paar-Abstandes zwischen dem ersten und zweiten Paar magneto- resistiver Bauteile berechnet. Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass von beiden Paaren magnetoresistiver Bauteile ein charakteristisches Messsignalmuster für eine einzelne Zelle erzeugt wird.
Vorzugsweise wird eine Zelldetektion in komplexen Medien, wie beispielsweise Vollblut vorgenommen. Der Analyt, d.h. die Zellen weisen variierende Durchmesser auf. Typischerweise messen weiße Blutzellen 7 bis 12 μπι im Durchmesser. Dementsprechend wird das Grenzintervall für den berechneten Zell¬ durchmesser beispielsweise (auf 7 bis 12 μπι) gesetzt. Dies hat den Vorteil, dass eine Querselektivität, z.B. auf andere Zelltypen mit deutlich unterschiedlichem Zelldurchmesser vermieden werden kann. Eine derartige Querselektivität kann al¬ leinig durch die magnetischen Marker nicht ausgeschlossen werden .
Zu dem variiert die Markerdichte auf einer Zelle. Dies äußert sich etwa in unterschiedlichen Messausschlagamplituden. Dementsprechend wird beispielsweise das Grenzintervall für die Messausschlagamplitude gewählt. Mit der Festsetzung einer Ober- und einer Untergrenze für die Messausschlagamplitude wird zweckdienlicherweise der Hintergrund unterdrückt sowie zu hohe Signale durch Aggregate unberücksichtigt gelassen. Zu dem Hintergrundsignal tragen beispielsweise ungebundene su- perparamagnetische Partikel mit Antikörper bei. Neben Aggre¬ gaten von Zellen, die z.B. über ungebundene Marker aneinander binden, kann es auch zu Aggregaten von superparamagnetischen Partikeln über die Antikörper kommen. Diese werden jedoch z.B. durch die Festsetzung einer Obergrenze für die Messausschlagamplitude ausgeschlossen.
Eine Variation des Abstands der Zelle zu den magnetoresisti- ven Bauteilen im Durchflusskanal bzw. zur Kanalwand, äußert sich in einer veränderten Durchflussgeschwindigkeit. Die Durchflussgeschwindigkeit in einer laminaren Strömung ändert sich, wenn es zur Haftung bzw. Wechselwirkung der Zellen mit der Kanaloberfläche kommt. Vorzugsweise werden die magnetisch markierten Zellen in einem externen Feld an den magnetore- sistiven Bauteilen angereichert und das Streufeld der Zellen ausgerichtet. Insbesondere werden die Zellen so an der Kanal¬ wand angereichert, dass sie im laminaren Fluss an der Kanal¬ wand abrollen. Vorzugsweise verläuft das externe Feld senk¬ recht zu dem zu detektierenden Streufeld der Zellen. Bei Überstreichen eines einzelnen magnetoresistiven Bauteils von einer einzelnen magnetisch markierten Zelle erfährt das magnetoresistive Bauteil eine Widerstandsänderung abhängig von der Position der Zelle bzw. deren Magnetfeld relativ zum magnetoresistiven Bauteil, also dem Sensorelement. Dieses
Messsignal weist einen positiven und einen negativen Messausschlag auf. Abhängig von der Richtung des Streufeldes der Zelle, das ein magnetischer Dipol ist, erfolgt zuerst der po¬ sitive und anschließend der negative Messausschlag oder umge- kehrt.
Bei Überstreichen eines Paares von magnetoresistiven Bauteilen in Diagonalanordnung bilden sich zwei exakt identische Messsignale nacheinander aus. Das Signal kann durch den Ab- stand der magnetoresistiven Bauteile moduliert werden. Bei Verringerung des Bauteilabstandes erfolgt eine Überlagerung der Messsignale.
Bei Überstreichen einer einzelnen magnetisch markierten Zelle eines Paares magnetoresistiver Bauteile in Parallelanordnung kommt es zu zwei Einzelsignalen, wobei das zweite Signal eine Spiegelung des ersten Signals ist. Auch das Signal in Paral¬ lelanordnung ist durch den Abstand der magnetoresistiven Bauteile modulierbar. Mittels geeigneter Abstandswahl kann das Signal so überlagert werden, dass ein Signalausschlag mit doppelter Amplitude wie das Einzelsignal auftritt.
Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass unabhängig von einem variierenden Zell- durchmesser des Analyten und unabhängig von der Markerdichte auf einer Zelle ein charakteristisches Messsignalmuster erzeugt und so eine Einzelzelldetektion vorgenommen werden kann. Insbesondere liefert das Messsignalmuster einer einzel¬ nen Zelle einen Informationsgehalt von vier Bit. Dies führt zu einem weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich dass der Signalverlauf bzw. das Signalmuster es erlaubt, falschpositive Signale und Hintergrundsignale so zu reduzieren, dass eine kalibrationsfreie Konzentrationsbestim- mung der markierten Zellen vorgenommen werden kann. Eine derartige kalibrationsfreie Konzentrationsbestimmung ist mit reiner Amplitudenauswertung nicht möglich. Die Auswertemöglichkeiten mit Hilfe des Signalmusters erstrecken sich auf
1. einen charakteristischen Fingerabdruck für eine einzelne Zelle mittels der alternierenden Abfolge von positiven und negativen Messausschlägen unabhängig von dem Hintergrund, z.B. nicht gebundener Partikel,
2. eine Invitrodurchflussgeschwindigkeitsmessung, wodurch
falschpositive Signale von Zellaggregaten oder aggregierten Markern ausgeschlossen werden können,
3. die Auswertung der Amplitude anhand von oberen und unteren Schwellwerten sowie
4. Rückschlüsse auf die Zellgröße über den Abstand der ein¬ zelnen Messausschläge innerhalb eines Messsignalmusters.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient zur magnetischen
Durchflussmessung von Zellen. Die Vorrichtung umfasst eine Sensoranordnung, die mindestens eine Wheatstone-Brücke mit mindestens einem ersten und einem zweiten magnetoresistiven Bauteil umfasst. Die magnetoresistiven Bauteile sind in einer Diagonalanordnung oder in einer Parallelanordnung verschaltet. Die magnetoresistiven Bauteile sind in einem Abstand voneinander entlang eines Flusskanals so angeordnet, dass ein Fluss der Zellen zunächst über das erste und anschließend über das zweite magnetoresistive Bauteil führbar ist. Der Ab¬ stand der magnetoresistiven Bauteile in Flussrichtung ist vorzugsweise auf den zu detektierenden Zelltyp angepasst. Da¬ bei sind die magnetoresistiven Bauteile so ausgestaltet, dass ein magnetisches Feld einer einzelnen magnetisch markierten Zelle erfassbar ist. Die Sensoranordnung ist so ausgestaltet, dass ein Messsignal erfassbar ist, welches ein charakteristi¬ sches Messsignalmuster mit mindestens drei Messausschlägen zeigt. Das Messsignalmuster enthält die Informationen Messausschlaganzahl, Messausschlagabstände, Messausschlagamplitu¬ den, Messausschlagrichtung und Messausschlagrichtungsabfolge . Des Weiteren ist eine Auswerteelektronik umfasst, die ausge¬ staltet ist anhand der Messausschlagsrichtungsabfolge das Messsignal als Einzelzelldetektion zu identifizieren. Die er- findungsgemäße Vorrichtung birgt den Vorteil, eine Einzel¬ zelldetektion zu gewährleisten, während falschpositive Signa¬ le durch zusätzliche Informationen aus einem Messsignalmuster vermieden werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Abstand der magnetoresistiven Bauteile maximal ein Zelldurchmesser. Beispielsweise beträgt der Abstand maximal 50 μπι. Vorzugweise beträgt der Abstand maximal 25 μπι. Dieser Abstand hat den Vorteil, dass ein Messsignalmuster mit vier Messaus¬ schlägen in der Diagonalanordnung erzeugt wird und mit drei Messausschlägen in der Parallelanordnung erzeugt wird. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Auswerteelektronik, die ausgestaltet ist aus dem Messsignalmuster die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Abstandes der magnetoresistiven Bauteile zu berechnen .
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Auswerteelektronik, die ausgestaltet ist den Zelldurchmesser anhand des Messausschlagab- standes zu berechnen. Vorzugsweise dient die Auswerteelektro- nik gleichermaßen der Berechnung des Zelldurchmessers und der Durchflussgeschwindigkeit .
In einer zweckdienlichen Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Auswerteelektronik, die ausgestaltet ist anhand der Messausschlagamplitude das Signalrauschverhältnis zu ermitteln. Insbesondere wird mit der gleichen Auswerte¬ elektronik, die auch Durchflussgeschwindigkeit und Zelldurch¬ messer berechnet, das Signalrauschverhältnis ermittelt. Vorzugsweise sind die magnetoresistiven Bauteile in einer Pa¬ rallelanordnung verschaltet und so in Reihe angeordnet, dass ein Fluss der Zellen zunächst über das erste, anschließend über das zweite, anschließend über das dritte und anschlie- ßend über das vierte magnetoresistive Bauteil führbar ist. Dazu sind in der Sensoranordnung mindestens eine Wheatstone- Brücke mit einem ersten und einem zweiten Paar aus je zwei magnetoresistiven Bauteilen umfasst. Vorzugsweise beträgt der Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Paar magnetore- sistiver Bauteile mehr als drei Zelldurchmesser. Eine derartige Aus führungs form der Vorrichtung hat den Vorteil, dass in einer Parallelanordnung die Durchflussgeschwindigkeit ermit¬ telt wird und zwei Paare von magnetoresistiven Bauteilen auch zwei charakteristische Messsignalmuster erzeugen.
Insbesondere kann auch eine Aneinanderreihung mehrerer Vorrichtungen mit je einer Sensoranordnung erfolgen. Dabei können beispielsweise mehrere Sensorpaare mit je unterschiedli- chem Abstand aneinandergereiht werden. Dies hätte den Vor¬ teil, z.B. unterschiedliche Zellgrößen zu erfassen und zu un¬ terscheiden .
Beispielsweise umfasst die Vorrichtung eine Durchflusskammer, durch die die Zellen geführt werden, und die zweckdienlicherweise über einen magnetoresistiven Sensor verläuft. Ein magnetoresistives Bauteil kann ein GMR-, TMR- oder AMR-Sensor sein. Derartige magnetoresistive Sensoren sind vorteilhafter¬ weise als Magnetowiderstände in einer Wheatstone-Messbrücke verschaltet. Mit einer derartigen Wheatstone-Messbrücke kann das von einer Zelle generierte Streufeld detektiert werden, indem dadurch eine Widerstandsänderung hervorgerufen wird.
Vorzugsweise ist die Durchflusskammer so ausgestaltet, dass eine laminare Strömung des Analyten darin realisiert werden kann. Insbesondere dürfen Haftung bzw. Wechselwirkung der Zellen mit der Durchflusskammeroberfläche nicht zu stark sein. Vorzugsweise erlaubt die Beschaffenheit der Innenfläche des Durchflusskanals ein Abrollen der Zellen an der Kanal- wand.
Vorzugsweise ist die Wheatstone-Messbrücke in folgendem Lay¬ out realisiert: Die magnetoresistiven Bauteile sind Vorzugs- weise streifenförmig, z.B. mit einer Sensorfläche von 2 x 30 um. Zweckdienlicherweise liegt die Bauteilgröße im Bereich der Dimension eines zellulären Analyten. Die zu detektieren- den Zellen haben beispielsweise Durchmesser zwischen 1 und 20 μπι. Zweckdienlicherweise liegen die streifenförmigen magnetoresistiven Bauteile quer zur Flussrichtung der Zellen. Zweckdienlicherweise sind die Widerstände der Zuleitungen zu den vier Widerständen einer Wheatstone-Brücke möglichst abge¬ glichen, um Offsets im Signal und Temperatureinflüsse zu mi- nimieren. Beispielsweise sind alle vier Widerstände der
Wheatstone-Brücke magnetoresistive Bauteile. Insbesondere handelt es sich bei den magnetoresistiven Bauteilen um GMR- Elemente . Zweckdienlicherweise ist die Sensoranordnung so ausgestaltet, dass die Diagonalwiderstände der Wheatstone-Brücke, d.h. die sich diagonal gegenüberliegenden Widerstände der Wheatstone- Brücke, zu räumlich voneinander getrennten Paaren angeordnet. Eines der Paare beispielsweise besteht aus magnetoresistiven Widerständen. Bei einem Messvorgang überquert dann der Zell- fluss das diagonale Widerstandspaar aus magnetoresistiven Bauteilen. Die magnetoresistiven Bauteile sind beispielsweise GMR-Elemente . Bei dieser Konfiguration wird also nur die hal¬ be Brücke ausgenutzt.
Das Messsignalmuster, vor allem der Abstand der Messausschläge, ist abhängig vom Abstand der magnetoresistiven Bauteile eines Paares von Diagonalwiderständen. Bei großem Abstand der magnetoresistiven Bauteile werden vier Messausschläge regist- riert. Bei Verkürzung des Abstandes zwischen den beiden magnetoresistiven Bauteilen entlang der Flussrichtung wandern die vier Messausschläge aufeinander zu und bilden ein Mess¬ signalmuster mit vier Messausschlägen unterschiedlicher Amplitude und Richtung. Ab einem für den Zelldurchmesser charak- teristischen Abstand überlagern sich die Einzelsignale der einzelnen magnetoresistiven Bauteile. Der charakteristische Abstand ist des Weiteren abhängig von der Ausdehnung des Streufeldes der Zelle. Bei ausreichender Verkürzung des Ab- Standes zwischen den magnetoresistiven Bauteilen in Diagonalanordnung kommt es zu einer Auslöschung der mittleren Messausschläge. Diese Signalüberlappung tritt ab einem Abstand kleiner als 2 Zelldurchmesser auf. Bei einem Zelldurchmesser von beispielsweise 10 μπι kommt es ab einem Abstand von etwa 20 bis 30 μπι der magnetoresistiven Bauteile zu einer Überlagerung der Sensorantworten.
Auch im parallelen Layout der Wheatstone-Brücke sind die Wi- derstände zu räumlich getrennten Paaren angeordnet. Dabei sind die Paare parallele Widerstände der Messbrücke. Bei pa¬ rallelen magnetoresistiven Bauteilen in der Messbrücke ist das zweite Signal, d.h. das Signal, das bei Überstreichen des zweiten magnetoresistiven Bauteils entsteht, eine Spiegelung des ersten Signals. Analog zum Diagonallayout erfolgt auch im Parallellayout bei Annäherung der magnetoresistiven Bauteile in Flussrichtung eine Überlagerung der Sensorantworten. Bei Parallelwiderständen addieren sich die beiden überlagerten Signalhälften auf, woraus theoretisch ein Peak mit doppelter Amplitudenhöhe resultiert.
Zur Durchflussgeschwindigkeitsbestimmung mit einem Parallellayout werden vorzugsweise zwei Widerstandspaare der
Wheatstone-Brücke verwendet. Dazu werden beide parallele Wi- derstandspaare in Reihe geschaltet. Der Abstand der Wider¬ standspaare beträgt zweckdienlicherweise mehr als drei Zell¬ durchmesser der zu detektierenden Zelle.
Mittels der charakteristischen Messsignalabfolge mit zwei Di- agonalwiderständen wird die Ermittlung der Durchflussgeschwindigkeit der Zelle ermöglicht. Die Durchflussgeschwin¬ digkeit kann bei bekannter Datenrate und bekanntem Abstand der magnetoresistiven Bauteile berechnet werden. Das Messsignalmuster erlaubt es den Scheitelwerten der Messausschläge genaue Zellpositionen relativ zu den magnetore¬ sistiven Bauteilen zuzuordnen. Der Weg, den die Zelle zwischen den beiden Scheitelwerten der Messausschläge zurück- legt, entspricht dem Abstand der beiden magnetoresistiven Bauteile .
Für eine Durchflussgeschwindigkeitsberechnung mit Parallelan- Ordnung werden vorzugsweise zwei Paare magnetoresistiver Bauteile genutzt. Hier entspricht der zurückgelegte Weg der Zel¬ le dem Abstand der Widerstandspaare zwischen den Scheitelwerten der Messausschläge.
Die Erfindung wird in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren 1 bis 18 der angehängten Zeichnung beschrieben. Die Figuren sind schematisch und stellen keine maßstabsgetreuen Abbildungen dar. Figur 1 zeigt ein Messsignal einer Einzelwiderstandsanord¬ nung .
Figur 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Bewegung einer zu detektierenden Zelle über einen Einzelwiderstand.
Figur 3 zeigt eine Wheatstone-Brücke .
Figur 4 zeigt eine Wheatstone-Brücke in Diagonalanordnung.
Figur 5 zeigt das Messsignal in einer Diagonalanordnung in
Abhängigkeit des Abstandes der Widerstände.
Figur 6 zeigt das Messsignal in einer Diagonalanordnung mit einem Abstand der Widerstände, der eine Überlagerung der beiden Messsignale der Einzelwiderstände er¬ laubt .
Figur 7 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden
Zelle über zwei Widerstände.
Figur 8 zeigt eine Wheatstone-Brücke und den Zellflussver- lauf über die Widerstände.
Figur 9 zeigt eine Wheatstone-Brücke in Parallelanordnung.
Figur 10 zeigt das Messsignal in einer Parallelanordnung in
Abhängigkeit des Abstandes der Widerstände.
Figur 11 zeigt das Messsignal in einer Parallelanordnung mit einem Abstand der Widerstände, der eine Überlagerung der beiden Messsignale der Einzelwiderstände er¬ laubt . Figur 12 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden Zelle über zwei Widerstände in Parallelanordnung.
Figur 13 zeigt das Messsignal in einer Diagonalanordnung für eine Durchflussgeschwindigkeitsmessung .
Figur 14 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden
Zelle über die Widerstände.
Figur 15 zeigt eine Wheatstone-Brücke und den Zellflussver¬ lauf über die Widerstände.
Figur 16 zeigt eine Wheatstone-Brücke in Parallelanordnung für eine Durchflussgeschwindigkeitsmessung .
Figur 17 zeigt zwei Messsignale von zwei Widerstandspaaren in einer Parallelanordnung zur Durchflussgeschwindigkeitsmessung .
Figur 18 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden
Zelle über die Messanordnung zur Durchflussgeschwindigkeitsmessung .
Der in Figur 1 gezeigte Messsignalverlauf mit der Zeit t zeigt zunächst einen positiven Messausschlag und anschließend einen negativen Messausschlag gleicher Amplitude A. Dieses
Signal entsteht, wenn sich eine einzelne Zelle 10 über einen einzelnen Messwiderstand bewegt. Der zeitliche Flussverlauf 20 ist in Figur 2 verdeutlicht. Die Figur 2 zeigt eine Zelle 10 zu drei Zeitpunkten ti, t2 und t3. Die Zelle 10 über- streicht in dem Zeitintervall ti bis t3 den Messwiderstand.
Des Weiteren ist das Streufeld der Zelle 10 angezeigt. Dabei wird von dem Messwiderstand nur das Inplane-Feld registriert, d.h. das Feld parallel zur Bewegungsrichtung, die durch den Geschwindigkeitspfeil v angezeigt ist. Das Feld senkrecht zur Bewegungsrichtung und senkrecht zur Ebene in der der Widerstand liegt, wird nicht von dem Sensor erfasst. In eben die¬ ser Richtung senkrecht zur Bewegungsrichtung ist das externe Feld zur Anreicherung der Zellen 10 an den Widerständen ausgerichtet .
Figur 3 zeigt eine Wheatstone-Messbrücke . Dabei bezeichnet Ucc die angelegte Spannung, Ub die Messspannung, Ri bis R4 die Widerstände der Messbrücke, wovon zumindest zwei, beispiels- weise die sich gegenüberliegenden Diagonalelemente Ri und R4 magnetoresistive Widerstände sind. Des Weiteren sind Zellen 10 und deren Flussrichtung 20 angezeigt. Figur 4 zeigt, wie die Wheatstone-Messbrücke vorzugweise an¬ zuordnen ist, dass ein Fluss der Zellen 10 über die Diagonalelemente Ri, R4 erfolgen kann. Dabei erfolgt die Messung an¬ hand eines Diagonalpaares 40, wohingegen R2 und R3 beispiel¬ weise keine magnetoresistiven Bauteile sein müssen. Der Ab- stand Δχ der magnetoresistiven Bauteile Ri, R4 beeinflusst das Messsignal. Die Beeinflussung des Messsignals durch den Abstand Δχ ist in Figur 5 verdeutlicht. Figur 5 zeigt den Messverlauf mit der Zeit für drei unterschiedliche Abstände Δχΐ, Δχ2 und Δχ3. Dabei ist Δχ2 < Δχΐ und Δχ3 < Δχ2. Bei Verringerung des Abstandes Δχ kommt es zur Überlagerung der ansonsten identisch generierten Messsignale der zwei magnetoresistiven Bauteile Ri, R4. Für den Abstand Δχ3 ist ein cha¬ rakteristisches Messsignal für eine Einzelzelldetektion in Diagonalanordnung 40 mit vier aufeinanderfolgenden Messaus- Schlägen zunächst ein positiver, dann ein negativer, dann wiederum ein positiver und anschließend ein negativer Messausschlag gezeigt. Die Messausschläge weisen auch unter¬ schiedliche Amplituden A auf. Für eine kalibrationsfreie Einzelzelldetektion, also eine Quantifizierung einer Zellkonzentration in einem komplexen Medium wird sich diese Abstandsabhängigkeit zunutze gemacht. Es erfolgt eine Adaption dieses Abstands Δχ an die jeweilige Zellgröße der zu detektierenden Zelle 10. Die Zellgröße kann zwischen 1 μπι und 20 μπι variieren. Für eine derartige Einzelzelldetektion interessant sind Zellgrößen um 3 μπι und Zellgrößen im Bereich von 8 bis 12 μπι. CD4+-Zellen z.B. haben einen Durchmesser von um die 7 μπι. Auch innerhalb eines Zelltyps schwankt der Zelldurchmesser. Eine geringe Variation muss also miterfasst werden. Dementsprechend wird ein gewis¬ ses Intervall für die Messamplitude A gewählt. Figur 6 zeigt einen charakteristischen Messverlauf für eine Einzelzellde¬ tektion, einen sogenannten Fingerprint einer Einzelzelle 10. Dabei ist den Scheitelwerten der Messausschläge zu charakte¬ ristischen Zeiten tei, tei, tei und t65 eine genaue Position relativ zum Widerstand (Ri, R4) zuzuordnen, die in Figur 7 verdeutlicht wird. Eine Einzelzelle 10 bewegt sich an dem Paar von magnetoresistiven Bauteilen Ri, R4 vorbei. Diese gezeigte Halbbrückenanordnung ist in Diagonalanordnung 40 verschaltet. Es wird von den zwei magnetoresistiven Bauteilen Ri, R4 wiederum nur das Inplane-Feld des Streufeldes der Zel¬ le 10 registriert. Zum Zeitpunkt tei erreicht die Zelle 10 das erste Sensorelement Ri, zum Zeitpunkt te2 hat die Zelle 10 gerade das erste Sensorelement Ri überstrichen und erreicht mit ihrem Streufeld bereits das zweite Sensorelement R4, wo¬ durch der zweite Messausschlag zum Zeitpunkt te2 eine gerin¬ gere Amplitude A als der erste Messausschlag zum Zeitpunkt tei aufweist. Zum Zeitpunkt t63 erfolgt ein Nulldurchgang des Messsignals, wenn sich die Zelle 10 exakt in der Mitte zwi¬ schen den Bauelementen R1/R4 befindet. Zum Zeitpunkt t64 be¬ ginnt das Überstreichen des zweiten Sensorelements R4. Zum Zeitpunkt t65 beendet die Zelle 10 das Überstreichen des zweiten Sensorelements. Zum Zeitpunkt t65 wird wieder ein Messausschlag mit voller Amplitudenhöhe A registriert.
Figur 8 zeigt wieder eine Wheatstone-Brücke im klassischen Schaltbild. Die Pfeile 20 zeigen die Flussrichtung der zu de- tektierenden Zellen 10 an. Die Flussrichtung 20 ist nun im Gegensatz zur Figur 3 über die Parallelelemente Ri und R2 oder R3 und R4 gewählt. Parallelelemente heißt, dass sich die überstrichenen Widerstandspaare R1/R2 oder R3/R4 nebeneinander und nicht diagonal gegenüber befinden. Figur 9 zeigt eine vorteilhafte Anordnung der Wheatstone-Brücke 90, so dass die Widerstände in einem definierten Abstand Δχ zueinander entlang der Flussrichtung 20 angeordnet sind. Die Widerstände R1-R4 sind streifenförmig und quer zur Flussrichtung 20 angeordnet. Wie weiterhin in Figur 9 zu sehen ist, können die Zellen 10 ein Widerstandspaar oder auch beide Widerstandspaare in getrennten Kanälen überstreichen. In Figur 16 ist gezeigt, wie mit einer Parallelverschaltung 160 auch ein Fluss 20 über alle vier magnetoresistiven Bauteile R1-R4 realisiert werden kann, wobei diese in einer Reihe entlang des Flusska¬ nals 20 angeordnet sind.
Figur 10 zeigt das Messsignal einer Parallelanordnung 90 von zwei Messwiderständen R3, R4 in Abhängigkeit vom Abstand Δχ . Bei Verringerung des Abstandes Δχ nähern sich die Messsigna¬ le an. Für einen Abstand Δχι liegen die Messsignale noch aus¬ einander und überlagern sich nicht. Dabei ist gezeigt, dass im Gegensatz zur Diagonalanordnung 40 in der Parallelanord- nung 90 die Messausschlagabfolge gespiegelt ist. Bei Über¬ streichen des ersten Widerstandes R3 erfolgt zunächst ein po¬ sitiver Messausschlag und anschließend ein negativer Aus¬ schlag. Bei Überstreichen des zweiten Messwiderstandes R4 er¬ folgt zunächst ein negativer und anschließend ein positiver Messausschlag. Bei weiterem Annähern der Messwiderstände R3, R4 erfolgt eine Überlagerung der Messsignale, bei einem Ab¬ stand ΔΧ4 sind die Messsignale so überlagert, dass nur noch drei Messausschläge registriert werden, wobei der zweite, mittlere Messausschlag die doppelte Amplitudenhöhe A auf- weist. Die doppelte Amplitudenhöhe A kann für ein verbesser¬ tes Signalrauschverhältnis genutzt werden.
Figur 11 zeigt einen Messsignalverlauf über eine Parallelanordnung. Auch in diesem Fall sind den Scheitelwerten der Messausschläge exakte Zeitpunkte tn-ti3, bzw. Positionen re¬ lativ zu den Widerständen zuzuordnen. Diese sind in dem zeitlichen Verlauf der Zelle 10 über die Messwiderstände R3, R4 in Figur 12 gezeigt. Zum Zeitpunkt tu beginnt die Zelle 10 den ersten Messwiderstand R3 zu überstreichen. Die Zelle 10 bewegt sich mit einer Geschwindigkeit v über die Messwider¬ stände. Registriert wird das Inplane-Feld des Streufeldes der Zelle 10. Zum Zeitpunkt ti2 mit der höchsten Amplitude A be¬ findet sich die Zelle 10 exakt zwischen den zwei magnetore- sistiven Bauteilen R3, R4 in Parallelanordnung 90. Zum Zeit- punkt t3 beendet die Zelle 10 das Überstreichen des zweiten Sensors R4. Die zwei Sensoren R3, R4 in Parallelanordnung 90 befinden sich in einem Abstand Δχ . Figur 13 zeigt wiederum den zeitlichen Verlauf eines Messsig¬ nals in Diagonalanordnung 40 mit einem Abstand Δχ der magne- toresistiven Bauteile Ri, R4, der einen Messsignalverlauf mit vier Messausschlägen unterschiedlicher Amplitude hervorruft. Die Zeitpunkte der Scheitelwerte der Messausschläge t3i bis t34 sind wiederum in Figur 14 verdeutlicht und in Verbindung mit der Position der Zelle 10 über den Messwiderständen Ri, R4 gebracht. Der Weg Δχ, den die Zelle 10 Im Zeitintervall At zwischen den beiden Maxima, also den Scheitelwerten der Mess- ausschlage zum Zeitpunkt t3i und t33 zurücklegt, entspricht genau dem Abstand Δχ der beiden Sensorelemente Ri, R4. Über
N
die Anzahl der Messpunkte N, und eine bekannte Datenrate , sec kann so die Geschwindigkeit v ermittelt werden:
N
Datenrate •Ax| ra]
sec
V [^]
sec Datenpunkte im Intervall At[N]
Für eine derartige Berechnung der Durchflussgeschwindigkeit mit Parallelanordnung 160werden vorzugsweise alle vier Widerstände R1-R4 der Wheatstone-Brücke als magnetoresistive Bau¬ teile verwendet und in Reihe angeordnet, so dass zunächst das erste Paar Ri, R2 und in einem größeren Abstand Δχ als der Bauteilabstand Δχ das zweite Paar R3, R4 überstrichen wird. Figur 15 verdeutlicht den Verlauf der Zellen 10 über die Messwiderstände R1-R4. Figur 17 zeigt das Messsignal der zwei aufeinanderfolgenden Paare Ri, R2 und R3, R4 in Parallelanord¬ nung 160. Figur 18 zeigt das dazu gehörige Überstreichen der Sensoranordnung von einer Zelle 10. Zum Zeitpunkt t7i überstreicht die Zelle 10 das erste Sensorelement Ri mit einer Geschwindigkeit v. Zum Zeitpunkt t72 erreicht die Zelle 10 die Mitte zwischen den ersten beiden Bauelementen R1/R2. Die¬ se Position entspricht dem höchsten Scheitelwert des ersten Messsignals t72 · Zum Zeitpunkt t73 beendet die Zelle 10 den zweiten Sensor R2. Zum Zeitpunkt t74 hat die Zelle 10 die Mit¬ te zwischen den Bauelementen des zweiten Paares erreicht, also wieder dem höchsten Scheitelwert des zweiten Messsignals. Der zeitliche Abstand ΔΤ dieser beiden Maxima zu den Zeit- punkten t72 und t74 wird mit ΔΤ gekennzeichnet. Diese Zeitdif- ferenz ΔΤ kann nun wiederum genutzt werden, um die Durchflussgeschwindigkeit v zu ermitteln.
Figure imgf000020_0001
sec Datenpunkte im IntervallΔΤΝ Anhand der so ermittelten Durchflussgeschwindigkeiten v aus dem Zeitintervall Δτ/At und dem bekannten Abstand Δχ der Bauelemente oder dem bekannten Paarabstand ΔΧ kann in allen Fällen auch der Zelldurchmesser ermittelt werden, in dem die Durchflussgeschwindigkeit νΐμιιι/s] mit dem Zeitintervall Ät[sec] oder ÄT[sec] multipliziert wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen (10), wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: - Inbetriebnahme einer Sensoranordnung, wobei zur Inbetriebnahme mindestens ein erstes (Rl, R2, R3) und ein zweites magnetoresistives Bauteil (R2, R3, R4 ) in einer Wheatstone-Brücke in Diagonalanordnung (40) oder Parallelanordnung (90) verschaltet und in einem Abstand (Δχ) voneinander in Flussrichtung (20) angeordnet werden,
- magnetische Markierung der Zellen (10),
- Flusserzeugung der Zellen über die Sensoranordnung, wobei der Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (Rl, R2, R3) und anschließend über das zweite magnetoresistive Bauteil (R2, R3, R4 ) geführt wird,
- Einzelzellerfassung, wobei durch das magnetische Feld einer einzelnen magnetisch markierten Zelle (10), die über die Sensoranordnung fließt, ein Messsignal mit ei¬ nem charakteristischen Muster aus mindestens drei Mess- ausschlagen erzeugt wird
- Auswertung des Messsignals, in der anhand der Messaus- schlagrichtungsabfolge das Messsignal als Einzelzellde- tektion identifiziert wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens eine weitere Information aus dem charakteristischen Messsignalmuster wie Messausschlaganzahl, Messausschlagabstände (At) oder Messausschlagamplituden (A) ausgewertet wird. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in der Auswertung die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Abstan- des (Ax) der magnetoresistiven Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) berechnet wird. 4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in der Auswertung der Zelldurchmesser anhand des Messaus- schlagabstandes (At) berechnet wird.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in der Auswertung anhand der Messausschlagamplitude (A) das Signal-Rausch-Verhältnis ermittelt wird. 6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem zur magnetischen Markierung der Zellen superparamagneti- scher Marker verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen (10) eines vorgegebnen Typs mit charakteristischem Zelldurchmesser, wobei das erste (Rl, R2, R3) und das zweite magnetoresistive Bauteil (R2, R3, R4 ) in einem Abstand (Δχ) voneinander in Flussrichtung (20) angeordnet werden, der maximal den doppelten Zelldurchmesser beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei
zur Inbetriebnahme der Sensoranordnung vier magnetoresistive Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) zu einem ersten (Rl, R2 ) und einem zweiten Paar (R3, R4 ) in einer Wheatstone- Brücke in Parallelanordnung (160) verschaltet werden und so in Reihe angeordnet werden, dass ein Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (Rl), anschließend über das zweite (R2), anschließend über das dritte (R3) und anschließend über das vierte magnetoresistive Bau¬ teil (R4) führbar ist und wobei
- der Fluss (20) der Zellen (10) in eben dieser Reihenfolge über die vier magnetoresistiven Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) geführt wird und wobei
- in der Auswertung die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Paar-Abstandes (ΔΧ) zwischen dem ersten (Rl, R2 ) und zweiten Paar (R3, R4 ) magnetoresistiver Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) berechnet wird.
. Vorrichtung zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen (10) mit einer Sensoranordnung, die mindestens eine
Wheatstone-Brücke mit mindestens einem ersten (Rl, R2, R3) und einem zweiten magnetoresistiven Bauteil (R2, R3, R4 ) umfasst, wobei die magnetoresistiven Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) in einer Diagonalanordnung (40) oder einer Parallelanordnung (90) verschaltet sind und in einem Abstand (Δχ) voneinander entlang eines Flusskanal angeordnet sind, dass ein Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste
(Rl, R2, R3) und anschließend über das zweite magnetore¬ sistive Bauteil (R2, R3, R4 ) führbar ist, wobei die Sen¬ soranordnung ausgestaltet ist, ein Messsignal zu erfassen und der Abstand (Δχ) der magnetoresistiven Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) einen Wert beträgt, der bewirkt dass das Mess¬ signal ein charakteristisches Messsignalmuster mit mindes¬ tens drei Messausschlägen zeigt und mit einer Auswerte¬ elektronik, die ausgestaltet ist, anhand der Messaus- schlagrichtungsabfolge das Messsignal als Einzelzelldetek- tion zu identifizieren.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei der Abstand (Δχ) der magnetoresistiven Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) maximal 50 μπι beträgt .
11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Auswerteelektronik ausgestaltet ist, aus dem Messsignalmuster die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Abstandes (Δχ) der magnetoresistiven Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) zu berechnen.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Auswerteelektronik ausgestaltet ist, den Zelldurchmesser anhand des Messausschlagabstandes (At) zu berechnen.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Auswerteelektronik ausgestaltet ist, anhand der Messaus¬ schlagamplitude (A) das Signal-Rausch-Verhältnis zu ermit¬ teln .
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Sensoranordnung vier magnetoresistive Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) einer Wheatstone-Brücke umfasst, die zu einem ers- ten (Rl, R2 ) und einem zweiten Paar (R3, R4 ) aus magneto¬ resistiven Bauteilen in Parallelanordnung (160) verschaltet sind und so in Reihe angeordnet sind, dass ein Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (Rl), an¬ schließend über das zweite (R2), anschließend über das dritte (R3) und anschließend über das vierte magnetore- sistive Bauteil (R4) führbar ist und wobei die Auswerte¬ elektronik ausgestaltet ist, die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Paar-Abstandes (ΔΧ) zwischen dem ersten (Rl, R2 ) und zweiten Paar (R3, R4 ) magnetoresisti- ver Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) zu berechnen.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei der Paar-Abstand
(ΔΧ) zwischen dem ersten (Rl, R2 ) und zweiten Paar (R3, R4 ) magnetoresistiver Bauteile (Rl, R2, R3, R4 ) größer als der Abstand (Δχ) zwischen den einzelnen magnetoresistiven Bauteilen innerhalb eines Paares ist.
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