JP2013542410A - 細胞の磁気的な流れ測定方法および装置 - Google Patents

細胞の磁気的な流れ測定方法および装置 Download PDF

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Abstract

【課題】磁気的なフローサイトメトリーにおけるバックグラウンド信号を削減し、偽の正信号を回避する。
【解決手段】本発明の方法により、一義的な個別細胞検出と、流れの中にある細胞の細胞測定が保証される。そのために１対の磁気抵抗素子によって特徴的な測定信号パターンが生成され、ここから測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、測定偏倚の振幅、測定偏倚の向き、測定偏倚の向きの順序のような情報を読み取ることが可能である。さらに、これに基づいて流速ならびに細胞直径を求めることができる。これに加えて、測定偏倚の振幅に基づいて信号対雑音比が求められる。
【選択図】図６

Description

本発明はフローサイトメトリーに関する。
細胞測定や細胞検出の分野では、磁気的にマーキングされた検体が磁気センサを通って流れる流れ測定が知られている。しかしその場合、正信号は個々の細胞に一義的に由来していないかもしれない。たとえば、磁気的なマーカーの交差選択によって誤ってマーキングされた細胞が、正信号を惹起することがある。さらに、未結合のマーカーが正信号を引き起こすこともある。また、細胞凝集塊も正信号のみを生じさせ、そのようなものとして認識可能ではない。
本発明の課題は、磁気的なフローサイトメトリーにおけるバックグラウンド信号を削減し、偽の正信号を回避することにある。
この課題は、請求項１に記載の方法および請求項９に記載の装置によって解決される。本方法の発展例や本装置の好ましい実施態様は、従属請求項の対象となっている。
本発明による方法は、細胞の磁気的な流れ測定に使われる。本方法は次の各ステップを含んでいる。
まず、センサ装置の使用開始が行われる。このとき少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子が、ホイートストンブリッジに対角線配置または並列配置で配列される。ここで対角線配置とは、ホイートストンブリッジの対角線上で互いに向かい合う抵抗器が磁気抵抗素子であることを意味しており、並列配置とは、ホイートストンブリッジの相並んで位置する抵抗器が磁気抵抗素子であることを意味している。磁気抵抗素子は流れ方向に相互間隔をおいて配置される。特にこの間隔は、検出されるべき細胞のタイプに合わせられる。さらに、細胞の磁気的なマーキングが行われる。使用開始と細胞のマーキングの後、センサ装置を通る細胞の流れが生成される。細胞の流れは、最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子を通るように案内される。このとき個別細胞検出が行われる。センサ装置を通って流れていく磁気的にマーキングされた個々の細胞の磁界によって、少なくとも３つの測定偏倚（Ｍｅｓｓａｕｓｓｃｈｌｇ）からなる特徴的なパターンをもつ測定信号が生成される。特徴的な測定信号パターンは、測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、測定偏倚の振幅、測定偏倚の向き（方向）、測定偏倚の向き（方向）の順序などの情報を提供する。個別細胞検出に引き続いて測定信号の評価が行われ、この評価では、測定信号が特徴的な測定偏倚の順序に基づいて個別細胞検出として識別される。
このことは、フロー中の検体の校正不要な濃度測定を可能にする。さらにこの方法は、バックグラウンド信号の削減のほかに、偽の正信号が回避されるという利点を有している。
同時に流速測定を行うことができる。細胞サイズの推定も可能である。そのために本発明の１つの好ましい実施形態では、本方法において測定信号の評価が行われ、この評価では、それぞれの磁気抵抗素子の既知の間隔に基づいて、細胞の流速が算出される。細胞の流速を知ることは、さらに別の利点をもたらす。流速に基づいて、細胞サイズの定性的な推定が可能である。細胞よりもはるかに小さい粒子、たとえば未結合の磁気マーカーなどは、検出されるべき細胞よりもはるかに低速で運動する。比較的大きい粒子や細胞凝集塊は、検出されるべき細胞よりもはるかに高い流速で運動する。つまり流速を計算することによって、個別細胞検出の品質がいっそう高くなる。
本発明の別の好ましい実施形態では、本方法において測定信号の評価が行われ、この評価では、測定偏倚の間隔に基づいて細胞直径が算出される。この計算は、たとえば算出された流速と測定された測定偏倚の間隔に基づいて行われる。細胞直径は、個別細胞検出を示唆するさらに別のパラメータであり、または偽の正信号を表す指標である。
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、本方法において測定信号の評価が行われ、この評価では、測定偏倚の振幅に基づいて信号対雑音比が求められる。特に測定信号パターンは、振幅のそれぞれ異なる複数の測定偏倚を有することがある。たとえば振幅の上側限界値および／または下側限界値が規定されていてよい。このとき測定偏倚の振幅は、従来の測定のようにただ測定結果の識別に利用されるのではなく、特徴的な測定信号のパターンに由来する複数の情報のうちの１つとして利用される。
特に、測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、測定偏倚の振幅のような、測定信号パターンに由来するすべての測定値ないし情報について、限界値を規定することができる。特に、正の測定信号の対応する測定値が位置していなければならない限界インターバルを規定することができる。このような種類の限界値、上側限界値および／または下側限界値、または限界値インターバルは、流速や細胞直径や信号対雑音比のような算出される量についても規定することができる。
本発明の好ましい実施形態では、本方法において、超常磁性マーカーによって細胞の磁気的なマーキングが行われる。磁気抵抗素子はたとえばＧＭＲ（巨大磁気抵抗）センサ、ＴＭＲ（トンネル磁気抵抗）センサ、またはＡＭＲ（異方性磁気抵抗）センサである。
本方法において、センサ装置を使用開始するときに第１の磁気抵抗素子および第２の磁気抵抗素子は流れ方向に最大で細胞直径の間隔をおいて配置されるのが好ましい。このことは、４つの測定偏倚を含む１つの測定信号パターンが生成されるという利点がある。別案として、この間隔は細胞直径の１．５倍であってもよい。細胞直径の最大２倍の間隔が好都合である。磁気抵抗素子の間隔のこのような適合化は、特徴的な細胞直径をもつ細胞のタイプに準拠している。さまざまに異なる細胞のタイプを検出するために、または直径が未知の細胞を検出するために、それぞれ間隔の異なる複数のセンサ装置を備えるセンサ区間を作成可能である。
本発明の好都合な実施形態では、本方法においてセンサ装置を使用するために、４つの磁気抵抗素子がホイートストンブリッジに第１の対および第２の対をなすように並列配置で配列され、細胞の流れが最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子、次に第３の磁気抵抗素子、次に第４の磁気抵抗素子を通って案内可能であるように直列に配置される。細胞の流れは最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子、次に第３の磁気抵抗素子、次に第４の磁気抵抗素子を通る。評価のときには、第１の対の磁気抵抗素子と第２の対の磁気抵抗素子との間の既知の対間隔に基づいて流速が算出されるのが好ましい。この実施形態は、２つの対の磁気抵抗素子から、個々の細胞についての１つの特徴的な測定信号パターンが生成されるという利点がある。
たとえば全血のような複合媒体の中で細胞検出が行われるのが好ましい。検体すなわち細胞は変動のある直径を有している。典型的な場合、７から１２μｍの直径の白血球が計測される。それに応じて算出される細胞直径の限界インターバルは、たとえば（７から１２μｍ）に設定される。このことは、たとえば細胞直径が明らかに異なる別の細胞タイプに及ぶ交差選択性を回避できるという利点がある。このような種類の交差選択性は、磁気的なマーカーのみによって排除することはできない。
そのうえ細胞のマーカー密度も変動する。このことは、たとえば異なる測定偏倚の振幅として現れる。それに応じて、たとえば測定偏倚の振幅について限界インターバルが選択される。測定偏倚の振幅の上限および下限を規定することで、バックグラウンドが抑制されるとともに、凝集物による高すぎる信号を無視できるという利点がある。バックグラウンド信号に関与するのは、たとえば抗体を含む未結合の超常磁性粒子である。たとえば未結合マーカーを介して互いに結合する細胞の凝集物のほか、超常磁性粒子の凝集物も抗体を介して生じることがある。しかしこのような凝集物は、測定偏倚の振幅についての上限を規定することによって排除される。
流れ通路内の磁気抵抗素子に対する、ないしは通路壁に対する、細胞の間隔の変動は流速の変化として現れる。層流での流速は、細胞が通路表面と付着ないし相互作用したときに変化する。磁気的にマーキングされた細胞は、外部磁界の中で磁気抵抗素子に蓄積されて、細胞の漂遊磁界がアライメントされるのが好ましい。特に細胞は、層流の中で通路壁に沿って転動するように、通路壁に蓄積される。外部磁界は、細胞の検出されるべき漂遊磁界に対して垂直に延びているのが好ましい。
個々の磁気抵抗素子が個々の磁気的にマーキングされた細胞によって通過されると、この磁気抵抗素子は、磁気抵抗素子すなわちセンサ素子に対して相対的な細胞の位置ないしその磁界に依存して抵抗変化を受ける。この測定信号は正の測定偏倚と負の測定偏倚を有している。細胞の漂遊磁界は磁気双極子であり、この細胞の漂遊磁界の方向に依存して、最初に正の測定偏倚が生じ、引き続き負の測定偏倚が生じ、またはこの逆が生じる。
対角線配置の１対の磁気抵抗素子が通過されると、正確に同一な２つの測定信号が順次形成される。この信号は、磁気抵抗素子の間隔によって変調することができる。素子間隔を短くすると、測定信号の重ね合わせが生じる。
並列配置の１対の磁気抵抗素子が、磁気的にマーキングされた単一の細胞によって通過されると、２つの個別信号が生じ、２番目の信号は１番目の信号の鏡像である。並列配置における信号も、それぞれの磁気抵抗素子の間隔によって変調可能である。間隔を適切に選択することによって、個別信号の２倍の振幅をもつ信号偏位が生じるように、各信号を重ね合わせることができる。
本発明による方法の主要な利点は、検体の変動する細胞直径に関わりなく、および細胞上のマーカー密度に関わりなく、特徴的な測定信号パターンが生成され、そのようにして、個別細胞検出を行うことができるという点にある。特に個々の細胞の測定信号パターンが、４ビットの情報内容を供給する。このことは本発明の方法のさらに別の利点をもたらし、すなわち、マーキングされた細胞の校正不要の濃度決定を行えるように、偽の正信号やバックグラウンド信号を低減させることを、信号推移ないし信号パターンが可能にするという利点につながる。このような校正不要の濃度決定は、純粋な振幅評価によっては不可能である。信号パターンを用いた評価の選択肢は次の事項に及ぶ。
１．たとえば未結合の粒子のようなバックグラウンドに関わりのない、正の測定偏倚および負の測定偏倚の交互の順序による個々の細胞の特徴的な指紋。
２．インビトロ流速測定（ガラス管内での流速測定）。それにより、細胞凝集や凝集したマーカーの偽の正信号を排除することができる。
３．上側閾および下側閾値に基づいて振幅の評価。
４．測定信号パターン内部における個々の測定偏倚の間隔を通じての細胞サイズの推定。
本発明による装置は、細胞の磁気的な流れ測定に利用される。本装置は、少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子を備える少なくとも１つのホイートストンブリッジを含むセンサ装置を含んでいる。磁気抵抗素子は対角線配置または並列配置で配列されている。磁気抵抗素子は流れ通路に沿って相互間隔をおきながら、細胞の流れが最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子を通るように案内可能であるように配置されている。流れ方向における磁気抵抗素子の間隔は、検出されるべき細胞タイプに合わせられている（つまり適合化されている）のが好ましい。このとき磁気抵抗素子は、磁気的にマーキングされた個々の細胞の磁界を検出可能であるように構成されている。センサ装置は、少なくとも３つの測定偏倚を含む特徴的な測定信号パターンを示す測定信号を検出可能であるように構成されている。測定信号パターンは、測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、測定偏倚の振幅、測定偏倚の向き（方向）、測定偏倚の向き（方向）の順序の情報を含んでいる。さらに、測定偏倚の向きの順序に基づいて測定信号を個別細胞検出として識別するために構成された評価電子装置が含まれている。本発明による装置は個別細胞検出を保証するという利点をもたらし、それに対して、偽の正信号は付加的な情報によって測定信号パターンから回避される。
本発明の１つの好ましい実施形態では、磁気抵抗素子の間隔は最大で細胞直径である。たとえばこの間隔は最大で５０μｍである。好ましくはこの間隔は最大で２５μｍである。このような間隔は、４つの測定偏倚を含む１つの測定信号パターンが対角線配置で生成され、３つの測定偏倚を含む測定信号パターンが並列配置で生成されるという利点がある。
本発明の１つの好ましい実施形態では、本装置は、磁気抵抗素子の既知の間隔に基づいて流速を測定信号パターンから算出するために構成された評価電子装置を含んでいる。
本発明の別の好ましい実施形態では、本装置は、測定偏倚の間隔に基づいて細胞直径を算出するために構成された評価電子装置を含んでいる。評価電子装置は、細胞直径の算出と流速の算出の役目を同じように果たすのが好ましい。
本発明の１つの好都合な実施形態では、本装置は、測定偏倚の振幅に基づいて信号対雑音比を求めるために構成された評価電子装置を含んでいる。特に、流速と細胞直径も算出する同一の評価電子装置によって、信号対雑音比が求められる。
磁気抵抗素子は並列配置で配列されており、細胞の流れが最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子、次に第３の磁気抵抗素子、次に第４の磁気抵抗素子を通るように案内可能であるように直列に配置されるのが好ましい。そのためにセンサ装置には、それぞれ２つの磁気抵抗素子からなる第１の対および第２の対を備える少なくとも１つのホイートストンブリッジが含まれている。第１の対の磁気抵抗素子と第２の対の磁気抵抗素子との間の間隔は、３つの細胞直径よりも大きいのが好ましい。本装置のこのような実施形態は、並列配置で流速が検出されるとともに、２対の磁気抵抗素子が２つの特徴的な測定信号パターンを生成するという利点がある。
特に、それぞれ１つのセンサ装置を備える複数の本装置の連続配置を行うことができる。この場合、たとえば複数のセンサ対をそれぞれ異なる間隔で連続配置することができる。このことは、たとえば異なる細胞サイズを検出して区別するという利点がある。
たとえば本装置はフローチャンバを含んでおり、これを通って細胞が案内され、このフローチャンバは磁気抵抗センサ上に延びているのが好都合である。磁気抵抗素子はＧＭＲ（巨大磁気抵抗）センサ、ＴＭＲ（トンネル磁気抵抗）センサ、またはＡＭＲ（異方性磁気抵抗）センサであってよい。このような種類の磁気抵抗センサは、磁気抵抗としてホイートストンブリッジに配列されているのが好ましい。このようなホイートストン測定ブリッジにより、細胞によって発生される漂遊磁界を検出することができ、それによって抵抗変化が引き起こされる。
フローチャンバは、その中で検体の層流を具体化できるように構成されているのが好ましい。特に、フローチャンバ表面と細胞との付着ないし相互作用が強すぎてはならない。フローチャンバの内面の性質は、通路壁に沿った細胞の転動を可能にするのが好ましい。
ホイートストン測定ブリッジは次のようなレイアウトで具体化されるのが好ましい。磁気抵抗素子は帯状であり、たとえば２×３０μｍのセンサ面を有するのが好ましい。素子サイズは、細胞状の検体の寸法の範囲内にあるのが好都合である。検出されるべき細胞は、たとえば１から２０μｍの間の直径を有している。帯状の磁気抵抗素子は、細胞の流れ方向に対して直角に位置しているのが好都合である。ホイートストンブリッジの４つの抵抗器へのリード線の抵抗は、信号のオフセットや温度の影響を最低限に抑えるために、できるだけ均衡がとれているのが好都合である。たとえばホイートストンブリッジの４つすべての抵抗器は磁気抵抗素子である。特に磁気抵抗素子はＧＭＲ（巨大磁気抵抗）素子である。
センサ装置は、ホイートストンブリッジの対角線抵抗器、すなわちホイートストンブリッジの対角線上で向かい合って位置している抵抗器が、空間的に互いに分離された対をなすように配置されるように構成されているのが好都合である。これらの対の１つは、たとえば磁気抵抗性の抵抗器からなっている。そして測定プロセスでは細胞の流れが、磁気抵抗素子からなる対角線上の抵抗器対を横切る。磁気抵抗素子はたとえばＧＭＲ素子である。すなわちこの構成では、ハーフブリッジだけが利用される。
測定信号パターンは、特にそれぞれの測定偏倚の間隔は、１対の対角線抵抗器の磁気抵抗素子の間隔に依存して決まる。磁気抵抗素子の間隔が大きいときには４つの測定偏倚が記録される。流れ方向に沿った２つの磁気抵抗素子の間の間隔を短くすると、４つの測定偏倚が互いに近づいていき、振幅および向きの異なる４つの測定偏倚を含む測定信号パターンを形成する。細胞直径を表す特徴的な間隔を超えると、個々の磁気抵抗素子の個別信号が重ね合わされる。さらにこの特徴的な間隔は、細胞の漂遊磁界の広がりに依存して決まる。対角線配置におけるそれぞれの磁気抵抗素子の間の間隔を十分に短くすれば、中央の測定偏倚の解消が生じる。このような信号の重ね合わせは、２つの細胞直径よりも小さい間隔以降に生じる。たとえば１０μｍの細胞直径では、それぞれの磁気抵抗素子のほぼ２０から３０μｍの間隔以降に、センサ応答の重なり合いが生じる。
ホイートストンブリッジの並列のレイアウトでも、各抵抗器は空間的に分離された各対をなすように配置される。このとき各対は、測定ブリッジの並列の抵抗器である。測定ブリッジにおける並列の磁気抵抗素子では、第２の信号が、すなわち第２の磁気抵抗素子が通過されたときに生じる信号が、第１の信号の鏡像となる。並列レイアウトでも対角線レイアウトと同様に、流れ方向で磁気抵抗素子を接近させると、センサ応答の重ね合わせが生じる。並列抵抗器では、重ね合わされた２つのハーフ信号が加算され、その結果理論的には２倍の振幅高さをもつピークが生じる。
並列レイアウトによる流速決定のために、ホイートストンブリッジの２対の抵抗器が用いられるのが好ましい。そのために、２対の並列の抵抗器が直列につながれる。各対の抵抗器の間隔は、検出されるべき細胞の３つの細胞直径よりも大きいのが好都合である。
２つの対角線抵抗器による特徴的な測定信号の順序によって、細胞の流速の検出が可能となる。流速は、データレートが既知でありかつ磁気抵抗素子の間隔が既知であるときに、算出することができる。
測定信号パターンは、測定偏倚のピーク値に、磁気抵抗素子に対して相対的に正確な細胞位置を割り当てることを可能にする。測定偏倚の２つのピーク値の間で細胞が進む距離が、２つの磁気抵抗素子の間隔に一致している。
並列配置による流速計算のために、２対の磁気抵抗素子が利用されるのが好ましい。このとき細胞が進む距離は、測定偏倚のピーク値の間における各対の抵抗器の間隔に一致している。
添付の図面の図１から図１８を参照しながら、一例を挙げる形で本発明について説明する。各図面は模式的なものであり、縮尺に忠実な図を表すものではない。
個別抵抗器装置の測定信号である。 １つの個別抵抗器を通る検出されるべき細胞の運動の時間的な推移である。 ホイートストンブリッジである。 対角線配置のホイートストンブリッジである。 各抵抗器の間隔に依存する対角線配置での測定信号である。 個別抵抗器の２つの測定信号の重ね合わせを可能にする各抵抗器の間隔を有する対角線配置での測定信号である。 ２つの抵抗器を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。 ホイートストンブリッジと、各抵抗器を通る細胞の流れの推移である。 並列配置のホイートストンブリッジである。 各抵抗器の間隔に依存する並列配置での測定信号である。 個別抵抗器の２つの測定信号の重ね合わせを可能にする各抵抗器の間隔を有する並列配置での測定信号である。 並列配置の２つの抵抗器を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。 流速測定のための対角線配置での測定信号である。 各抵抗器を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。 ホイートストンブリッジと、各抵抗器を通る細胞の流れの推移である。 流速測定のための並列配置のホイートストンブリッジである。 流速測定をするための並列配置の２対の抵抗器の２つの測定信号である。 流速測定用の測定装置を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。
図１に示す時間ｔに伴う測定信号推移は、最初に正の測定偏倚を示しており、次に、同じ振幅Ａの負の測定偏倚を示している。このような信号は、単一の細胞１０が単一の測定抵抗器を通って運動するときに生じる。時間的な流れの推移２０が図２に示されている。図２は、１つの細胞１０を３つの時点ｔ１，ｔ２およびｔ３で示している。細胞１０は、時間インターバルｔ１からｔ３で測定抵抗器を通過する。さらに細胞１０の漂遊磁界が図示されている。ここでは測定抵抗器によって面内磁界だけが記録され、すなわち、速度矢印ｖによって図示された運動方向と平行な磁界が記録される。運動方向に対して垂直でかつ抵抗器が位置する平面に対して垂直な磁界は、センサによって検出されない。運動方向に対して垂直なこの方向において、抵抗器に細胞１０を蓄積させるように外部磁界が用いられる。
図３はホイートストン測定ブリッジを示している。ここでＵｃｃは印加される電圧、Ｕｂは測定電圧、Ｒ１からＲ４は測定ブリッジの抵抗器を示しており、そのうち少なくとも２つは、たとえば向かい合う対角線素子Ｒ１およびＲ４は、磁気抵抗性の抵抗器である。さらに、細胞１０とその流れ方向２０が示されている。
図４は、対角線素子Ｒ１，Ｒ４を介して細胞１０の流動を行うことができるように、ホイートストン測定ブリッジが特にどのように配置されるべきかを示している。ここでは測定は対角線対４０を用いて行われ、それに対してＲ２とＲ３はたとえば磁気抵抗素子でなくてもよい。磁気抵抗素子Ｒ１，Ｒ４の間隔Δｘは測定信号に影響を及ぼす。間隔Δｘによる測定信号への影響は、図５に示されている。図５は、３つの異なる間隔Δｘ１，Δｘ２およびΔｘ３について、時間に伴う測定推移を示している。このときΔｘ２＜Δｘ１であり、Δｘ３＜Δｘ２である。間隔Δｘが短くなると、２つの磁気抵抗素子Ｒ１，Ｒ４の同一に生起される測定信号の重なり合いが生じる。間隔Δｘ３については、対角線配置４０での個別細胞検出について４つの連続する測定偏倚を含む特徴的な測定信号は、最初は正の測定偏倚であり、次に負、そしてまた正、次に負の測定偏倚である。これらの測定偏倚は異なる振幅Ａを有している。
校正不要の個別細胞検出のために、すなわち、複合媒体中での細胞濃度の定量化のために、このような間隔依存性が利用される。検出されるべき細胞１０のそれぞれの細胞サイズにこの間隔Δｘが合わせられる、つまりこの間隔Δｘの適合化が行われる。細胞サイズは１μｍから２０μｍの間を変動する可能性がある。このような種類の個別細胞検出について関心の対象となるのは、ほぼ３μｍの細胞サイズおよび８から１２μｍの範囲内の細胞サイズである。たとえばＣＤ４＋−細胞は、ほぼ７μｍの直径を有している。細胞タイプの内部でも細胞直径の変動がある。すなわち、小さな変動も一緒に検出されなければならない。それに応じて、測定振幅Ａについてある程度のインターバルが選択される。図６は、個別細胞検出についての特徴的な測定推移を示しており、いわゆる個別細胞１０の指紋を示している。ここでは特徴的な時間ｔ６１，ｔ６２，ｔ６４およびｔ６５での測定偏倚のピーク値に、図７に図示された正確な位置が抵抗器（Ｒ１，Ｒ４）に対して相対的に割り当てられている。個別細胞１０は、１対の磁気抵抗素子Ｒ１，Ｒ４の傍を通るように運動する。図示しているこのハーフブリッジ装置は、対角線配置４０に配列されている。２つの磁気抵抗素子Ｒ１，Ｒ４により、同じく細胞１０の漂遊磁界の面内磁界だけが記録される。時点ｔ６１で細胞１０は第１のセンサ素子Ｒ１に到達し、時点ｔ６２で細胞１０はちょうど第１のセンサ素子Ｒ１を通過し、その漂遊磁界はすでに第２のセンサ素子Ｒ４に到達しており、それによって時点ｔ６２での第２の測定偏倚は、時点ｔ６１での第１の測定偏倚よりも小さい振幅Ａを有している。時点ｔ６３で、細胞１０が正確に素子Ｒ１，Ｒ４の間の中央にあるときに、測定信号のゼロ通過が行われる。時点ｔ６４で、第２のセンサ素子Ｒ４の通過が始まる。時点ｔ６５で、細胞１０は第２のセンサ素子の通過を終える。時点ｔ６５では、再び完全な振幅高さＡをもつ測定偏倚が記録される。
図８は、ホイートストンブリッジを古典的な回路図で示している。矢印２０は、検出されるべき細胞１０の流れ方向を示している。流れ方向２０は、ここでは図３とは異なり、並列素子Ｒ１，Ｒ２またはＲ３，Ｒ４を通るように選択されている。並列素子とは、通過される抵抗器対Ｒ１，Ｒ２またはＲ３，Ｒ４が並置されており、対角線上で対向していないことを意味している。図９は、ホイートストンブリッジ９０の好ましい配置構造を示しており、それにより各抵抗器は定められた相互間隔Δｘで、流れ方向２０に沿って配置される。抵抗器Ｒ１−Ｒ４は帯状であり、流れ方向２０に対して直角に配置されている。図９にさらに見られるとおり、細胞１０は１つの抵抗器対または２つの抵抗器対を、分離された通路の中で通過する。図１６には、並列接続１６０によって、４つすべての磁気抵抗素子Ｒ１−Ｒ４を通る流れ２０をどのように記録できるかが示されており、その場合、これらの抵抗器が流れ通路２０に沿って直列に配置される。
図１０は、間隔Δｘに依存する、２つの測定抵抗器Ｒ３，Ｒ４の並列配置９０の測定信号を示している。間隔Δｘが短くなると、測定信号が接近していく。間隔Δｘ１については、それぞれの測定信号はまだ互いに離れており、重なり合っていない。ここでは対角線配置４０とは異なり、並列配置９０では測定偏倚の順序が鏡像になっている様子が示されている。第１の抵抗器Ｒ３を通過すると、最初に正の測定偏倚、次に負の測定偏倚が生じる。第２の測定抵抗器Ｒ４を通過すると、最初に負の測定偏倚、次に正の測定偏倚が生じる。測定抵抗器Ｒ３，Ｒ４をさらに接近させると測定信号の重なり合いが生じ、間隔Δｘ４では３つの測定偏倚しか記録されないように測定信号が重ね合わされ、第２の中央の測定偏倚は２倍の振幅高さＡを有している。２倍の振幅高さＡは、改善された信号対雑音比のために利用することができる。
図１１は、並列配置を通じての測定信号推移を示している。このケースでも、測定偏倚のピークは正確な時点ｔ１１−ｔ１３に割り当てられ、ないしは抵抗器に対して相対的な位置に割り当てられる。これらは測定抵抗器Ｒ３，Ｒ４を通る細胞１０の時間的な推移として、図１２に図示されている。時点ｔ１１で、細胞１０は第１の測定抵抗器Ｒ３を通過し始める。細胞１０は速度ｖでそれぞれの測定抵抗器を通るように運動する。細胞１０の漂遊磁界の面内磁界が記録される。振幅Ａが最高になる時点ｔ１２では、細胞１０はちょうど並列配置９０の２つの磁気抵抗素子Ｒ３，Ｒ４の間にある。時点ｔ３で、細胞１０は第２のセンサＲ４の通過を終える。並列配置９０の２つのセンサＲ３，Ｒ４は間隔Δｘをおいている。
図１３は、振幅の異なる４つの測定偏倚を含む測定信号推移を引き起こす、磁気抵抗素子Ｒ１，Ｒ４の間隔Δｘを有する対角線配置４０における測定信号の時間的推移を同じく示している。測定偏倚ｔ３１からｔ３４のピーク値の時点がやはり図１４に示されており、測定抵抗器Ｒ１，Ｒ４を通る細胞１０の位置と関連づけられている。両方の最大値の間の、すなわち時点ｔ３１およびｔ３３での測定偏倚のピーク値の間の時間インターバルΔｔで細胞１０が進む距離Δｘは、両方のセンサ素子Ｒ１，Ｒ４の間隔Δｘにちょうど一致している。測定点Ｎの数と、既知のデータレートＮ／ｓｅｃとを通じて、速度ｖは次のように求めることができる。
Figure 2013542410
並列配置１６０によるこのような流速の計算のために、ホイートストンブリッジの４つすべての抵抗器Ｒ１−Ｒ４が磁気抵抗素子として利用されて直列に配置されるのが好ましく、それにより、最初に第１の対Ｒ１，Ｒ２が通過され、そして素子間隔Δｘよりも広い間隔Δｘで第２の対Ｒ３，Ｒ４が通過される。図１５は、測定抵抗器Ｒ１−Ｒ４を通る細胞１０の推移を示している。図１７は、並列配置１６０の連続する２つの対Ｒ１，Ｒ２およびＲ３，Ｒ４の測定信号を示している。図１８は、これに対応する細胞１０によるセンサ装置の通過を示している。時点ｔ７１で、細胞１０は第１のセンサ素子Ｒ１を速度ｖで通過する。時点ｔ７２で細胞１０は、最初の２つの素子Ｒ１，Ｒ４の間の中央部に達する。この位置は、第１の測定信号ｔ７２の最高のピーク値に相当している。時点ｔ７３で細胞１０は第２のセンサＲ２を終える。時点ｔ７４で細胞１０は第２の対の素子の間の中央部に達しており、すなわち、第２の測定信号の最高のピーク値に再び達している。時点ｔ７２およびｔ７４でのこれら両最大値の時間間隔ΔＴは、符号ΔＴで表されている。そしてこの時間差ΔＴを、流速ｖを求めるために同じく利用することができる。
Figure 2013542410
時間インターバルΔＴ／Δｔと、それぞれの素子の既知の間隔Δｘもしくは既知の各対の間隔ΔＸからこのようにして求めた流速ｖに基づいて、いかなるケースでも細胞直径を求めることができ、それは、流速ｖ[μｍ／ｓ]が時間インターバルΔｔ[ｓｅｃ]またはΔＴ[ｓｅｃ]と乗算されることによって行われる。
１０ 細胞
２０ 流れ、流れ方向
４０ 対角線配置
９０ 並列配置
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４ 磁気抵抗素子
本発明はフローサイトメトリーに関する。本発明は特に細胞の磁気的な流れ測定方法および細胞の磁気的な流れ測定装置に関する。
細胞測定や細胞検出の分野では、磁気的にマーキングされた検体が磁気センサを通って流れる流れ測定が知られている。しかしその場合、正信号は個々の細胞に一義的に由来していないかもしれない。たとえば、磁気的なマーカーの交差選択によって誤ってマーキングされた細胞が、正信号を惹起することがある。さらに、未結合のマーカーが正信号を引き起こすこともある。また、細胞凝集塊も正信号のみを生じさせ、そのようなものとして認識可能ではない。
本発明の課題は、磁気的なフローサイトメトリーにおけるバックグラウンド信号を削減し、偽の正信号を回避することにある。
この課題は、本発明によれば、細胞の磁気的な流れ測定を行なう方法において、
センサ装置の使用開始が行われ、使用開始のために少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子がホイートストンブリッジに対角線配置または並列配置で配列されて、流れ方向に相互に間隔をおいて配置され、少なくとも前記第１の磁気抵抗素子と少なくとも前記第２の磁気抵抗素子との間隔は検出されるべき細胞タイプに合わせられており、
細胞の磁気的なマーキングが行われ、
前記センサ装置を通る細胞の流れが生成され、細胞の流れは最初に前記第１の磁気抵抗素子、次に前記第２の磁気抵抗素子を通るように案内され、
個別細胞検出が行われ、前記センサ装置を通って流れていく磁気的にマーキングされた個々の細胞によって少なくとも３つの測定偏倚からなる特徴的なパターンをもつ測定信号が生成され、
測定信号の評価が行われ、該評価では測定偏倚の向きの順序に基づいて測定信号が個別細胞検出として識別される細胞の磁気的な流れ測定方法によって解決される（請求項１）。
細胞の磁気的な流れ測定方法に関する本発明の有利な実施態様は次の通りである。
・測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、または測定偏倚の振幅のような特徴的な測定信号パターンに由来する少なくとも１つの別の情報が評価される（請求項２）。
・前記評価では前記磁気抵抗素子の既知の間隔に基づいて流速が算出される（請求項３）。
・前記評価では測定偏倚の間隔に基づいて細胞直径が算出される（請求項４）。
・前記評価では測定偏倚の振幅に基づいて信号対雑音比が求められる（請求項５）。
・細胞の磁気的なマーキングのために超常磁性マーカーが使用される（請求項６）。
・特徴的な細胞直径をもつ予め定められたタイプの細胞の磁気的な流れ測定をするために、前記第１の磁気抵抗素子および第２の磁気抵抗素子が流れ方向に細胞直径の最大２倍である相互の間隔をおいて配置される（請求項７）。
・前記センサ装置の使用開始のために４つの前記磁気抵抗素子は第１の対および第２の対をなすようにホイートストンブリッジに並列配置で配列され、細胞の流れが最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子、次に第３の磁気抵抗素子、次に第４の磁気抵抗素子を通るように案内可能であるように直列に配置され、
細胞の流れは上記の順序で４つの前記磁気抵抗素子を通るように案内され、
前記評価では前記磁気抵抗素子の前記第１の対と第２の対との間の既知の間隔に基づいて流速が算出される（請求項８）。
前述の課題は、本発明によれば、細胞の磁気的な流れ測定を行なう装置において、
少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子を有する少なくとも１つのホイートストンブリッジを含むセンサ装置を備え、前記磁気抵抗素子は対角線配置または並列配置で配列されるとともに、流れ通路に沿って相互に間隔をおきながら配置されており、少なくとも前記第１の磁気抵抗素子と少なくとも前記第２の磁気抵抗素子との間隔は検出されるべき細胞タイプに合わせられており、細胞の流れは最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子を通るように案内可能であり、前記センサ装置は測定信号を検出するように構成されており、前記磁気抵抗素子の前記間隔は、前記測定信号が少なくとも３つの測定偏倚を含む１つの特徴的な測定信号パターンを示す値であり、
さらに、測定偏倚の向き（方向）の順序に基づいて測定信号を個別細胞検出として識別する評価電子装置を備えている細胞の磁気的な流れ測定装置によっても解決される（請求項９）。
細胞の磁気的な流れ測定装置に関する本発明の有利な実施態様は次の通りである。
・前記磁気抵抗素子の前記間隔は最大で５０μｍである（請求項１０）。
・前記評価電子装置は前記測定信号パターンから前記磁気抵抗素子の既知の前記間隔に基づいて流速を算出する（請求項１１）。
・前記評価電子装置は測定偏倚の間隔に基づいて細胞直径を算出する（請求項１２）。
・前記評価電子装置は測定偏倚の振幅に基づいて信号対雑音比を求める（請求項１３）。
・前記センサ装置はホイートストンブリッジの４つの磁気抵抗素子を含んでおり、これらの４つの磁気抵抗素子は、磁気抵抗素子からなる第１の対および第２の対をなすように並列配置で配列され、細胞の流れが最初に第１の前記磁気抵抗素子、次に第２の前記磁気抵抗素子、次に第３の前記磁気抵抗素子、次に第４の前記磁気抵抗素子を通るように案内可能であるように直列に配置され、前記評価電子装置は、前記磁気抵抗素子の前記第１の対と第２の対との間の既知の対間隔に基づいて流速を算出する（請求項１４）。
・前記磁気抵抗素子の前記第１の対と第２の対との間の対間隔は、１つの対内の個々の磁気抵抗素子間の間隔よりも大きい（請求項１５）。
本発明による方法は、細胞の磁気的な流れ測定に使われる。本方法は次の各ステップを含んでいる。
まず、センサ装置の使用開始が行われる。このとき少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子が、ホイートストンブリッジに対角線配置または並列配置で配列される。ここで対角線配置とは、ホイートストンブリッジの対角線上で互いに向かい合う抵抗器が磁気抵抗素子であることを意味しており、並列配置とは、ホイートストンブリッジの相並んで位置する抵抗器が磁気抵抗素子であることを意味している。磁気抵抗素子は流れ方向に相互間隔をおいて配置される。特にこの間隔は、検出されるべき細胞のタイプに合わせられる。さらに、細胞の磁気的なマーキングが行われる。使用開始と細胞のマーキングの後、センサ装置を通る細胞の流れが生成される。細胞の流れは、最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子を通るように案内される。このとき個別細胞検出が行われる。センサ装置を通って流れていく磁気的にマーキングされた個々の細胞の磁界によって、少なくとも３つの測定偏倚（Ｍｅｓｓａｕｓｓｃｈｌｇ）からなる特徴的なパターンをもつ測定信号が生成される。特徴的な測定信号パターンは、測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、測定偏倚の振幅、測定偏倚の向き（方向）、測定偏倚の向き（方向）の順序などの情報を提供する。個別細胞検出に引き続いて測定信号の評価が行われ、この評価では、測定信号が特徴的な測定偏倚の順序に基づいて個別細胞検出として識別される。
このことは、フロー中の検体の校正不要な濃度測定を可能にする。さらにこの方法は、バックグラウンド信号の削減のほかに、偽の正信号が回避されるという利点を有している。
同時に流速測定を行うことができる。細胞サイズの推定も可能である。そのために本発明の１つの好ましい実施形態では、本方法において測定信号の評価が行われ、この評価では、それぞれの磁気抵抗素子の既知の間隔に基づいて、細胞の流速が算出される。細胞の流速を知ることは、さらに別の利点をもたらす。流速に基づいて、細胞サイズの定性的な推定が可能である。細胞よりもはるかに小さい粒子、たとえば未結合の磁気マーカーなどは、検出されるべき細胞よりもはるかに低速で運動する。比較的大きい粒子や細胞凝集塊は、検出されるべき細胞よりもはるかに高い流速で運動する。つまり流速を計算することによって、個別細胞検出の品質がいっそう高くなる。
本発明の別の好ましい実施形態では、本方法において測定信号の評価が行われ、この評価では、測定偏倚の間隔に基づいて細胞直径が算出される。この計算は、たとえば算出された流速と測定された測定偏倚の間隔に基づいて行われる。細胞直径は、個別細胞検出を示唆するさらに別のパラメータであり、または偽の正信号を表す指標である。
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、本方法において測定信号の評価が行われ、この評価では、測定偏倚の振幅に基づいて信号対雑音比が求められる。特に測定信号パターンは、振幅のそれぞれ異なる複数の測定偏倚を有することがある。たとえば振幅の上側限界値および／または下側限界値が規定されていてよい。このとき測定偏倚の振幅は、従来の測定のようにただ測定結果の識別に利用されるのではなく、特徴的な測定信号のパターンに由来する複数の情報のうちの１つとして利用される。
特に、測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、測定偏倚の振幅のような、測定信号パターンに由来するすべての測定値ないし情報について、限界値を規定することができる。特に、正の測定信号の対応する測定値が位置していなければならない限界インターバルを規定することができる。このような種類の限界値、上側限界値および／または下側限界値、または限界値インターバルは、流速や細胞直径や信号対雑音比のような算出される量についても規定することができる。
本発明の好ましい実施形態では、本方法において、超常磁性マーカーによって細胞の磁気的なマーキングが行われる。磁気抵抗素子はたとえばＧＭＲ（巨大磁気抵抗）センサ、ＴＭＲ（トンネル磁気抵抗）センサ、またはＡＭＲ（異方性磁気抵抗）センサである。
本方法において、センサ装置を使用開始するときに第１の磁気抵抗素子および第２の磁気抵抗素子は流れ方向に最大で細胞直径の間隔をおいて配置されるのが好ましい。このことは、４つの測定偏倚を含む１つの測定信号パターンが生成されるという利点がある。別案として、この間隔は細胞直径の１．５倍であってもよい。細胞直径の最大２倍の間隔が好都合である。磁気抵抗素子の間隔のこのような適合化は、特徴的な細胞直径をもつ細胞のタイプに準拠している。さまざまに異なる細胞のタイプを検出するために、または直径が未知の細胞を検出するために、それぞれ間隔の異なる複数のセンサ装置を備えるセンサ区間を作成可能である。
本発明の好都合な実施形態では、本方法においてセンサ装置を使用するために、４つの磁気抵抗素子がホイートストンブリッジに第１の対および第２の対をなすように並列配置で配列され、細胞の流れが最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子、次に第３の磁気抵抗素子、次に第４の磁気抵抗素子を通って案内可能であるように直列に配置される。細胞の流れは最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子、次に第３の磁気抵抗素子、次に第４の磁気抵抗素子を通る。評価のときには、第１の対の磁気抵抗素子と第２の対の磁気抵抗素子との間の既知の対間隔に基づいて流速が算出されるのが好ましい。この実施形態は、２つの対の磁気抵抗素子から、個々の細胞についての１つの特徴的な測定信号パターンが生成されるという利点がある。
たとえば全血のような複合媒体の中で細胞検出が行われるのが好ましい。検体すなわち細胞は変動のある直径を有している。典型的な場合、７から１２μｍの直径の白血球が計測される。それに応じて算出される細胞直径の限界インターバルは、たとえば（７から１２μｍ）に設定される。このことは、たとえば細胞直径が明らかに異なる別の細胞タイプに及ぶ交差選択性を回避できるという利点がある。このような種類の交差選択性は、磁気的なマーカーのみによって排除することはできない。
そのうえ細胞のマーカー密度も変動する。このことは、たとえば異なる測定偏倚の振幅として現れる。それに応じて、たとえば測定偏倚の振幅について限界インターバルが選択される。測定偏倚の振幅の上限および下限を規定することで、バックグラウンドが抑制されるとともに、凝集物による高すぎる信号を無視できるという利点がある。バックグラウンド信号に関与するのは、たとえば抗体を含む未結合の超常磁性粒子である。たとえば未結合マーカーを介して互いに結合する細胞の凝集物のほか、超常磁性粒子の凝集物も抗体を介して生じることがある。しかしこのような凝集物は、測定偏倚の振幅についての上限を規定することによって排除される。
流れ通路内の磁気抵抗素子に対する、ないしは通路壁に対する、細胞の間隔の変動は流速の変化として現れる。層流での流速は、細胞が通路表面と付着ないし相互作用したときに変化する。磁気的にマーキングされた細胞は、外部磁界の中で磁気抵抗素子に蓄積されて、細胞の漂遊磁界がアライメントされるのが好ましい。特に細胞は、層流の中で通路壁に沿って転動するように、通路壁に蓄積される。外部磁界は、細胞の検出されるべき漂遊磁界に対して垂直に延びているのが好ましい。
個々の磁気抵抗素子が個々の磁気的にマーキングされた細胞によって通過されると、この磁気抵抗素子は、磁気抵抗素子すなわちセンサ素子に対して相対的な細胞の位置ないしその磁界に依存して抵抗変化を受ける。この測定信号は正の測定偏倚と負の測定偏倚を有している。細胞の漂遊磁界は磁気双極子であり、この細胞の漂遊磁界の方向に依存して、最初に正の測定偏倚が生じ、引き続き負の測定偏倚が生じ、またはこの逆が生じる。
対角線配置の１対の磁気抵抗素子が通過されると、正確に同一な２つの測定信号が順次形成される。この信号は、磁気抵抗素子の間隔によって変調することができる。素子間隔を短くすると、測定信号の重ね合わせが生じる。
並列配置の１対の磁気抵抗素子が、磁気的にマーキングされた単一の細胞によって通過されると、２つの個別信号が生じ、２番目の信号は１番目の信号の鏡像である。並列配置における信号も、それぞれの磁気抵抗素子の間隔によって変調可能である。間隔を適切に選択することによって、個別信号の２倍の振幅をもつ信号偏位が生じるように、各信号を重ね合わせることができる。
本発明による方法の主要な利点は、検体の変動する細胞直径に関わりなく、および細胞上のマーカー密度に関わりなく、特徴的な測定信号パターンが生成され、そのようにして、個別細胞検出を行うことができるという点にある。特に個々の細胞の測定信号パターンが、４ビットの情報内容を供給する。このことは本発明の方法のさらに別の利点をもたらし、すなわち、マーキングされた細胞の校正不要の濃度決定を行えるように、偽の正信号やバックグラウンド信号を低減させることを、信号推移ないし信号パターンが可能にするという利点につながる。このような校正不要の濃度決定は、純粋な振幅評価によっては不可能である。信号パターンを用いた評価の選択肢は次の事項に及ぶ。
１．たとえば未結合の粒子のようなバックグラウンドに関わりのない、正の測定偏倚および負の測定偏倚の交互の順序による個々の細胞の特徴的な指紋。
２．インビトロ流速測定（ガラス管内での流速測定）。それにより、細胞凝集や凝集したマーカーの偽の正信号を排除することができる。
３．上側閾および下側閾値に基づいて振幅の評価。
４．測定信号パターン内部における個々の測定偏倚の間隔を通じての細胞サイズの推定。
本発明による装置は、細胞の磁気的な流れ測定に利用される。本装置は、少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子を備える少なくとも１つのホイートストンブリッジを含むセンサ装置を含んでいる。磁気抵抗素子は対角線配置または並列配置で配列されている。磁気抵抗素子は流れ通路に沿って相互間隔をおきながら、細胞の流れが最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子を通るように案内可能であるように配置されている。流れ方向における磁気抵抗素子の間隔は、検出されるべき細胞タイプに合わせられている（つまり適合化されている）のが好ましい。このとき磁気抵抗素子は、磁気的にマーキングされた個々の細胞の磁界を検出可能であるように構成されている。センサ装置は、少なくとも３つの測定偏倚を含む特徴的な測定信号パターンを示す測定信号を検出可能であるように構成されている。測定信号パターンは、測定偏倚の数、測定偏倚の間隔、測定偏倚の振幅、測定偏倚の向き（方向）、測定偏倚の向き（方向）の順序の情報を含んでいる。さらに、測定偏倚の向きの順序に基づいて測定信号を個別細胞検出として識別するために構成された評価電子装置が含まれている。本発明による装置は個別細胞検出を保証するという利点をもたらし、それに対して、偽の正信号は付加的な情報によって測定信号パターンから回避される。
本発明の１つの好ましい実施形態では、磁気抵抗素子の間隔は最大で細胞直径である。たとえばこの間隔は最大で５０μｍである。好ましくはこの間隔は最大で２５μｍである。このような間隔は、４つの測定偏倚を含む１つの測定信号パターンが対角線配置で生成され、３つの測定偏倚を含む測定信号パターンが並列配置で生成されるという利点がある。
本発明の１つの好ましい実施形態では、本装置は、磁気抵抗素子の既知の間隔に基づいて流速を測定信号パターンから算出するために構成された評価電子装置を含んでいる。
本発明の別の好ましい実施形態では、本装置は、測定偏倚の間隔に基づいて細胞直径を算出するために構成された評価電子装置を含んでいる。評価電子装置は、細胞直径の算出と流速の算出の役目を同じように果たすのが好ましい。
本発明の１つの好都合な実施形態では、本装置は、測定偏倚の振幅に基づいて信号対雑音比を求めるために構成された評価電子装置を含んでいる。特に、流速と細胞直径も算出する同一の評価電子装置によって、信号対雑音比が求められる。
磁気抵抗素子は並列配置で配列されており、細胞の流れが最初に第１の磁気抵抗素子、次に第２の磁気抵抗素子、次に第３の磁気抵抗素子、次に第４の磁気抵抗素子を通るように案内可能であるように直列に配置されるのが好ましい。そのためにセンサ装置には、それぞれ２つの磁気抵抗素子からなる第１の対および第２の対を備える少なくとも１つのホイートストンブリッジが含まれている。第１の対の磁気抵抗素子と第２の対の磁気抵抗素子との間の間隔は、３つの細胞直径よりも大きいのが好ましい。本装置のこのような実施形態は、並列配置で流速が検出されるとともに、２対の磁気抵抗素子が２つの特徴的な測定信号パターンを生成するという利点がある。
特に、それぞれ１つのセンサ装置を備える複数の本装置の連続配置を行うことができる。この場合、たとえば複数のセンサ対をそれぞれ異なる間隔で連続配置することができる。このことは、たとえば異なる細胞サイズを検出して区別するという利点がある。
たとえば本装置はフローチャンバを含んでおり、これを通って細胞が案内され、このフローチャンバは磁気抵抗センサ上に延びているのが好都合である。磁気抵抗素子はＧＭＲ（巨大磁気抵抗）センサ、ＴＭＲ（トンネル磁気抵抗）センサ、またはＡＭＲ（異方性磁気抵抗）センサであってよい。このような種類の磁気抵抗センサは、磁気抵抗としてホイートストンブリッジに配列されているのが好ましい。このようなホイートストン測定ブリッジにより、細胞によって発生される漂遊磁界を検出することができ、それによって抵抗変化が引き起こされる。
フローチャンバは、その中で検体の層流を具体化できるように構成されているのが好ましい。特に、フローチャンバ表面と細胞との付着ないし相互作用が強すぎてはならない。フローチャンバの内面の性質は、通路壁に沿った細胞の転動を可能にするのが好ましい。
ホイートストン測定ブリッジは次のようなレイアウトで具体化されるのが好ましい。磁気抵抗素子は帯状であり、たとえば２×３０μｍのセンサ面を有するのが好ましい。素子サイズは、細胞状の検体の寸法の範囲内にあるのが好都合である。検出されるべき細胞は、たとえば１から２０μｍの間の直径を有している。帯状の磁気抵抗素子は、細胞の流れ方向に対して直角に位置しているのが好都合である。ホイートストンブリッジの４つの抵抗器へのリード線の抵抗は、信号のオフセットや温度の影響を最低限に抑えるために、できるだけ均衡がとれているのが好都合である。たとえばホイートストンブリッジの４つすべての抵抗器は磁気抵抗素子である。特に磁気抵抗素子はＧＭＲ（巨大磁気抵抗）素子である。
センサ装置は、ホイートストンブリッジの対角線抵抗器、すなわちホイートストンブリッジの対角線上で向かい合って位置している抵抗器が、空間的に互いに分離された対をなすように配置されるように構成されているのが好都合である。これらの対の１つは、たとえば磁気抵抗性の抵抗器からなっている。そして測定プロセスでは細胞の流れが、磁気抵抗素子からなる対角線上の抵抗器対を横切る。磁気抵抗素子はたとえばＧＭＲ素子である。すなわちこの構成では、ハーフブリッジだけが利用される。
測定信号パターンは、特にそれぞれの測定偏倚の間隔は、１対の対角線抵抗器の磁気抵抗素子の間隔に依存して決まる。磁気抵抗素子の間隔が大きいときには４つの測定偏倚が記録される。流れ方向に沿った２つの磁気抵抗素子の間の間隔を短くすると、４つの測定偏倚が互いに近づいていき、振幅および向きの異なる４つの測定偏倚を含む測定信号パターンを形成する。細胞直径を表す特徴的な間隔を超えると、個々の磁気抵抗素子の個別信号が重ね合わされる。さらにこの特徴的な間隔は、細胞の漂遊磁界の広がりに依存して決まる。対角線配置におけるそれぞれの磁気抵抗素子の間の間隔を十分に短くすれば、中央の測定偏倚の解消が生じる。このような信号の重ね合わせは、２つの細胞直径よりも小さい間隔以降に生じる。たとえば１０μｍの細胞直径では、それぞれの磁気抵抗素子のほぼ２０から３０μｍの間隔以降に、センサ応答の重なり合いが生じる。
ホイートストンブリッジの並列のレイアウトでも、各抵抗器は空間的に分離された各対をなすように配置される。このとき各対は、測定ブリッジの並列の抵抗器である。測定ブリッジにおける並列の磁気抵抗素子では、第２の信号が、すなわち第２の磁気抵抗素子が通過されたときに生じる信号が、第１の信号の鏡像となる。並列レイアウトでも対角線レイアウトと同様に、流れ方向で磁気抵抗素子を接近させると、センサ応答の重ね合わせが生じる。並列抵抗器では、重ね合わされた２つのハーフ信号が加算され、その結果理論的には２倍の振幅高さをもつピークが生じる。
並列レイアウトによる流速決定のために、ホイートストンブリッジの２対の抵抗器が用いられるのが好ましい。そのために、２対の並列の抵抗器が直列につながれる。各対の抵抗器の間隔は、検出されるべき細胞の３つの細胞直径よりも大きいのが好都合である。
２つの対角線抵抗器による特徴的な測定信号の順序によって、細胞の流速の検出が可能となる。流速は、データレートが既知でありかつ磁気抵抗素子の間隔が既知であるときに、算出することができる。
測定信号パターンは、測定偏倚のピーク値に、磁気抵抗素子に対して相対的に正確な細胞位置を割り当てることを可能にする。測定偏倚の２つのピーク値の間で細胞が進む距離が、２つの磁気抵抗素子の間隔に一致している。
並列配置による流速計算のために、２対の磁気抵抗素子が利用されるのが好ましい。このとき細胞が進む距離は、測定偏倚のピーク値の間における各対の抵抗器の間隔に一致している。
添付の図面の図１から図１８を参照しながら、一例を挙げる形で本発明について説明する。各図面は模式的なものであり、縮尺に忠実な図を表すものではない。
個別抵抗器装置の測定信号である。 １つの個別抵抗器を通る検出されるべき細胞の運動の時間的な推移である。 ホイートストンブリッジである。 対角線配置のホイートストンブリッジである。 各抵抗器の間隔に依存する対角線配置での測定信号である。 個別抵抗器の２つの測定信号の重ね合わせを可能にする各抵抗器の間隔を有する対角線配置での測定信号である。 ２つの抵抗器を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。 ホイートストンブリッジと、各抵抗器を通る細胞の流れの推移である。 並列配置のホイートストンブリッジである。 各抵抗器の間隔に依存する並列配置での測定信号である。 個別抵抗器の２つの測定信号の重ね合わせを可能にする各抵抗器の間隔を有する並列配置での測定信号である。 並列配置の２つの抵抗器を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。 流速測定のための対角線配置での測定信号である。 各抵抗器を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。 ホイートストンブリッジと、各抵抗器を通る細胞の流れの推移である。 流速測定のための並列配置のホイートストンブリッジである。 流速測定をするための並列配置の２対の抵抗器の２つの測定信号である。 流速測定用の測定装置を通る検出されるべき細胞の時間的な推移である。
図１に示す時間ｔに伴う測定信号推移は、最初に正の測定偏倚を示しており、次に、同じ振幅Ａの負の測定偏倚を示している。このような信号は、単一の細胞１０が単一の測定抵抗器を通って運動するときに生じる。時間的な流れの推移２０が図２に示されている。図２は、１つの細胞１０を３つの時点ｔ1，ｔ2およびｔ3で示している。細胞１０は、時間インターバルｔ1からｔ3で測定抵抗器を通過する。さらに細胞１０の漂遊磁界が図示されている。ここでは測定抵抗器によって面内磁界だけが記録され、すなわち、速度矢印ｖによって図示された運動方向と平行な磁界が記録される。運動方向に対して垂直でかつ抵抗器が位置する平面に対して垂直な磁界は、センサによって検出されない。運動方向に対して垂直なこの方向において、抵抗器に細胞１０を蓄積させるように外部磁界が用いられる。
図３はホイートストン測定ブリッジを示している。ここでＵccは印加される電圧、Ｕbは測定電圧、Ｒ1からＲ4は測定ブリッジの抵抗器を示しており、そのうち少なくとも２つは、たとえば向かい合う対角線素子Ｒ1およびＲ4は、磁気抵抗性の抵抗器である。さらに、細胞１０とその流れ方向２０が示されている。
図４は、対角線素子Ｒ1，Ｒ4を介して細胞１０の流動を行うことができるように、ホイートストン測定ブリッジが特にどのように配置されるべきかを示している。ここでは測定は対角線対４０を用いて行われ、それに対してＲ2とＲ3はたとえば磁気抵抗素子でなくてもよい。磁気抵抗素子Ｒ1，Ｒ4の間隔Δｘは測定信号に影響を及ぼす。間隔Δｘによる測定信号への影響は、図５に示されている。図５は、３つの異なる間隔Δｘ１，Δｘ２およびΔｘ３について、時間に伴う測定推移を示している。このときΔｘ２＜Δｘ１であり、Δｘ３＜Δｘ２である。間隔Δｘが短くなると、２つの磁気抵抗素子Ｒ1，Ｒ4の同一に生起される測定信号の重なり合いが生じる。間隔Δｘ３については、対角線配置４０での個別細胞検出について４つの連続する測定偏倚を含む特徴的な測定信号は、最初は正の測定偏倚であり、次に負、そしてまた正、次に負の測定偏倚である。これらの測定偏倚は異なる振幅Ａを有している。
校正不要の個別細胞検出のために、すなわち、複合媒体中での細胞濃度の定量化のために、このような間隔依存性が利用される。検出されるべき細胞１０のそれぞれの細胞サイズにこの間隔Δｘが合わせられる、つまりこの間隔Δｘの適合化が行われる。細胞サイズは１μｍから２０μｍの間を変動する可能性がある。このような種類の個別細胞検出について関心の対象となるのは、ほぼ３μｍの細胞サイズおよび８から１２μｍの範囲内の細胞サイズである。たとえばＣＤ４＋−細胞は、ほぼ７μｍの直径を有している。細胞タイプの内部でも細胞直径の変動がある。すなわち、小さな変動も一緒に検出されなければならない。それに応じて、測定振幅Ａについてある程度のインターバルが選択される。図６は、個別細胞検出についての特徴的な測定推移を示しており、いわゆる個別細胞１０の指紋を示している。ここでは特徴的な時間ｔ61，ｔ62，ｔ64およびｔ65での測定偏倚のピーク値に、図７に図示された正確な位置が抵抗器（Ｒ1，Ｒ4）に対して相対的に割り当てられている。個別細胞１０は、１対の磁気抵抗素子Ｒ1，Ｒ4の傍を通るように運動する。図示しているこのハーフブリッジ装置は、対角線配置４０に配列されている。２つの磁気抵抗素子Ｒ1，Ｒ4により、同じく細胞１０の漂遊磁界の面内磁界だけが記録される。時点ｔ61で細胞１０は第１のセンサ素子Ｒ1に到達し、時点ｔ62で細胞１０はちょうど第１のセンサ素子Ｒ1を通過し、その漂遊磁界はすでに第２のセンサ素子Ｒ4に到達しており、それによって時点ｔ62での第２の測定偏倚は、時点ｔ61での第１の測定偏倚よりも小さい振幅Ａを有している。時点ｔ63で、細胞１０が正確に素子Ｒ1，Ｒ4の間の中央にあるときに、測定信号のゼロ通過が行われる。時点ｔ64で、第２のセンサ素子Ｒ4の通過が始まる。時点ｔ65で、細胞１０は第２のセンサ素子の通過を終える。時点ｔ65では、再び完全な振幅高さＡをもつ測定偏倚が記録される。
図８は、ホイートストンブリッジを古典的な回路図で示している。矢印２０は、検出されるべき細胞１０の流れ方向を示している。流れ方向２０は、ここでは図３とは異なり、並列素子Ｒ1，Ｒ2またはＲ3，Ｒ4を通るように選択されている。並列素子とは、通過される抵抗器対Ｒ1，Ｒ2またはＲ3，Ｒ4が並置されており、対角線上で対向していないことを意味している。図９は、ホイートストンブリッジ９０の好ましい配置構造を示しており、それにより各抵抗器は定められた相互間隔Δｘで、流れ方向２０に沿って配置される。抵抗器Ｒ1−Ｒ4は帯状であり、流れ方向２０に対して直角に配置されている。図９にさらに見られるとおり、細胞１０は１つの抵抗器対または２つの抵抗器対を、分離された通路の中で通過する。図１６には、並列接続１６０によって、４つすべての磁気抵抗素子Ｒ1−Ｒ4を通る流れ２０をどのように記録できるかが示されており、その場合、これらの抵抗器が流れ通路２０に沿って直列に配置される。
図１０は、間隔Δｘに依存する、２つの測定抵抗器Ｒ3，Ｒ4の並列配置９０の測定信号を示している。間隔Δｘが短くなると、測定信号が接近していく。間隔Δｘ1については、それぞれの測定信号はまだ互いに離れており、重なり合っていない。ここでは対角線配置４０とは異なり、並列配置９０では測定偏倚の順序が鏡像になっている様子が示されている。第１の抵抗器Ｒ3を通過すると、最初に正の測定偏倚、次に負の測定偏倚が生じる。第２の測定抵抗器Ｒ4を通過すると、最初に負の測定偏倚、次に正の測定偏倚が生じる。測定抵抗器Ｒ3，Ｒ4をさらに接近させると測定信号の重なり合いが生じ、間隔Δｘ4では３つの測定偏倚しか記録されないように測定信号が重ね合わされ、第２の中央の測定偏倚は２倍の振幅高さＡを有している。２倍の振幅高さＡは、改善された信号対雑音比のために利用することができる。
図１１は、並列配置を通じての測定信号推移を示している。このケースでも、測定偏倚のピークは正確な時点ｔ11−ｔ13に割り当てられ、ないしは抵抗器に対して相対的な位置に割り当てられる。これらは測定抵抗器Ｒ3，Ｒ4を通る細胞１０の時間的な推移として、図１２に図示されている。時点ｔ11で、細胞１０は第１の測定抵抗器Ｒ3を通過し始める。細胞１０は速度ｖでそれぞれの測定抵抗器を通るように運動する。細胞１０の漂遊磁界の面内磁界が記録される。振幅Ａが最高になる時点ｔ12では、細胞１０はちょうど並列配置９０の２つの磁気抵抗素子Ｒ3，Ｒ4の間にある。時点ｔ3で、細胞１０は第２のセンサＲ4の通過を終える。並列配置９０の２つのセンサＲ3，Ｒ4は間隔Δｘをおいている。
図１３は、振幅の異なる４つの測定偏倚を含む測定信号推移を引き起こす、磁気抵抗素子Ｒ1，Ｒ4の間隔Δｘを有する対角線配置４０における測定信号の時間的推移を同じく示している。測定偏倚ｔ31からｔ34のピーク値の時点がやはり図１４に示されており、測定抵抗器Ｒ1，Ｒ4を通る細胞１０の位置と関連づけられている。両方の最大値の間の、すなわち時点ｔ31およびｔ33での測定偏倚のピーク値の間の時間インターバルΔｔで細胞１０が進む距離Δｘは、両方のセンサ素子Ｒ1，Ｒ4の間隔Δｘにちょうど一致している。測定点Ｎの数と、既知のデータレートＮ／ｓｅｃとを通じて、速度ｖは次のように求めることができる。
Figure 2013542410
並列配置１６０によるこのような流速の計算のために、ホイートストンブリッジの４つすべての抵抗器Ｒ1−Ｒ4が磁気抵抗素子として利用されて直列に配置されるのが好ましく、それにより、最初に第１の対Ｒ1，Ｒ2が通過され、そして素子間隔Δｘよりも広い間隔Δｘで第２の対Ｒ3，Ｒ4が通過される。図１５は、測定抵抗器Ｒ1−Ｒ4を通る細胞１０の推移を示している。図１７は、並列配置１６０の連続する２つの対Ｒ1，Ｒ2およびＲ3，Ｒ4の測定信号を示している。図１８は、これに対応する細胞１０によるセンサ装置の通過を示している。時点ｔ71で、細胞１０は第１のセンサ素子Ｒ1を速度ｖで通過する。時点ｔ72で細胞１０は、最初の２つの素子Ｒ1，Ｒ4の間の中央部に達する。この位置は、第１の測定信号ｔ72の最高のピーク値に相当している。時点ｔ73で細胞１０は第２のセンサＲ2を終える。時点ｔ74で細胞１０は第２の対の素子の間の中央部に達しており、すなわち、第２の測定信号の最高のピーク値に再び達している。時点ｔ72およびｔ74でのこれら両最大値の時間間隔ΔＴは、符号ΔＴで表されている。そしてこの時間差ΔＴを、流速ｖを求めるために同じく利用することができる。
Figure 2013542410
時間インターバルΔＴ／Δｔと、それぞれの素子の既知の間隔Δｘもしくは既知の各対の間隔ΔＸからこのようにして求めた流速ｖに基づいて、いかなるケースでも細胞直径を求めることができ、それは、流速ｖ[μｍ／ｓ]が時間インターバルΔｔ[ｓｅｃ]またはΔＴ[ｓｅｃ]と乗算されることによって行われる。
１０ 細胞
２０ 流れ、流れ方向
４０ 対角線配置
９０ 並列配置
Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4 磁気抵抗素子

Claims (15)

  1. 細胞（１０）の磁気的な流れ測定を行なう方法において、前記方法は次の各ステップを含んでおり、すなわち、
    センサ装置の使用開始が行われ、使用開始のために少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子（Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）がホイートストンブリッジに対角線配置（４０）または並列配置（９０）で配列されて、流れ方向（２０）に相互に間隔（Δｘ）をおいて配置され、
    細胞（１０）の磁気的なマーキングが行われ、
    前記センサ装置を通る細胞の流れが生成され、細胞（１０）の流れ（２０）は最初に前記第１の磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）、次に前記第２の磁気抵抗素子（Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）を通るように案内され、
    個別細胞検出が行われ、前記センサ装置を通って流れていく磁気的にマーキングされた個々の細胞（１０）によって少なくとも３つの測定偏倚からなる特徴的なパターンをもつ測定信号が生成され、
    測定信号の評価が行われ、該評価では測定偏倚の向きの順序に基づいて測定信号が個別細胞検出として識別される細胞の磁気的な流れ測定方法。
  2. 測定偏倚の数、測定偏倚の間隔（Δｔ）、または測定偏倚の振幅（Ａ）のような特徴的な測定信号パターンに由来する少なくとも１つの別の情報が評価される請求項１に記載の方法。
  3. 前記評価では前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）の既知の間隔（Δｘ）に基づいて流速が算出される請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記評価では測定偏倚の間隔（Δｔ）に基づいて細胞直径が算出される請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記評価では測定偏倚の振幅（Ａ）に基づいて信号対雑音比が求められる請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 細胞の磁気的なマーキングのために超常磁性マーカーが使用される請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 特徴的な細胞直径をもつ予め定められたタイプの細胞（１０）の磁気的な流れ測定をするために、前記第１の磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）および第２の磁気抵抗素子（Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）が流れ方向（２０）に細胞直径の最大２倍である相互の間隔（Δｘ）をおいて配置される請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記センサ装置の使用開始のために４つの前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）は第１の対（Ｒ１，Ｒ２）および第２の対（Ｒ３，Ｒ４）をなすようにホイートストンブリッジに並列配置（１６０）で配列され、細胞（１０）の流れ（２０）が最初に第１の磁気抵抗素子（Ｒ１）、次に第２の磁気抵抗素子（Ｒ２）、次に第３の磁気抵抗素子（Ｒ３）、次に第４の磁気抵抗素子（Ｒ４）を通るように案内可能であるように直列に配置され、
    細胞（１０）の流れ（２０）は上記の順序で４つの前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）を通るように案内され、
    前記評価では前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）の前記第１の対（Ｒ１，Ｒ２）と第２の対（Ｒ３，Ｒ４）との間の既知の間隔（ΔＸ）に基づいて流速が算出される請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 細胞（１０）の磁気的な流れ測定を行なう装置において、
    少なくとも１つの第１の磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）および少なくとも１つの第２の磁気抵抗素子（Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）を有する少なくとも１つのホイートストンブリッジを含むセンサ装置を備え、前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）は対角線配置（４０）または並列配置（９０）で配列されるとともに、流れ通路に沿って相互に間隔（Δｘ）をおきながら配置されており、細胞（１０）の流れ（２０）は最初に第１の磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）、次に第２の磁気抵抗素子（Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）を通るように案内可能であり、前記センサ装置は測定信号を検出するように構成されており、前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）の前記間隔（Δｘ）は、前記測定信号が少なくとも３つの測定偏倚を含む１つの特徴的な測定信号パターンを示す値であり、
    さらに、測定偏倚の向きの順序に基づいて測定信号を個別細胞検出として識別するために構成された評価電子装置を備えている細胞の磁気的な流れ測定装置。
  10. 前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）の前記間隔（Δｘ）は最大で５０μｍである請求項９に記載の装置。
  11. 前記評価電子装置は前記測定信号パターンから前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）の既知の前記間隔（Δｘ）に基づいて流速を算出するために構成されている請求項９または１０に記載の装置。
  12. 前記評価電子装置は測定偏倚の間隔（Δｔ）に基づいて細胞直径を算出するために構成されている請求項９から１１のいずれか１項に記載の装置。
  13. 前記評価電子装置は測定偏倚の振幅（Ａ）に基づいて信号対雑音比を求めるために構成されている請求項９から１２のいずれか１項に記載の装置。
  14. 前記センサ装置はホイートストンブリッジの４つの磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）を含んでおり、これらの４つの磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）は、磁気抵抗素子からなる第１の対（Ｒ１，Ｒ２）および第２の対（Ｒ３，Ｒ４）をなすように並列配置（１６０）で配列され、細胞（１０）の流れ（２０）が最初に第１の前記磁気抵抗素子（Ｒ１）、次に第２の前記磁気抵抗素子（Ｒ２）、次に第３の前記磁気抵抗素子（Ｒ３）、次に第４の前記磁気抵抗素子（Ｒ４）を通るように案内可能であるように直列に配置され、前記評価電子装置は、前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）の前記第１の対（Ｒ１，Ｒ２）と第２の対（Ｒ３，Ｒ４）との間の既知の対間隔（ΔＸ）に基づいて流速を算出するために構成されている請求項９から１３のいずれか１項に記載の装置。
  15. 前記磁気抵抗素子（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）の前記第１の対（Ｒ１，Ｒ２）と第２の対（Ｒ３，Ｒ４）との間の対間隔（ΔＸ）は、１つの対内の個々の磁気抵抗素子間の間隔（Δｘ）よりも大きい請求項１４に記載の装置。
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