WO2012023345A1 - がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物 - Google Patents

がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to methods and compositions for the treatment, prevention and diagnosis of cancer containing or derived from cancer stem cells targeting the RPN2 gene.
  • cancer stem cells or tumor initiating cells. Targeting this cancer stem cell is expected to be able to treat and prevent the occurrence, metastasis and recurrence of cancer.
  • the markers that define cancer stem cells are not clear, and treatment or prevention methods targeting cancer stem cells have been established. Absent.
  • RPN2 ribophorin II
  • OST oligosaccharide transferase
  • An object of the present invention is to provide methods and compositions for the treatment, prevention and diagnosis of cancer containing or derived from cancer stem cells.
  • the inventors show that RPN2 is highly expressed in the cancer stem cell fraction of breast cancer cells, and that knockdown of RPN2 inhibits colony formation and invasive ability of cancer stem cells in vitro. Further analysis showed that knockdown of RPN2 reduced tumor formation and suppressed metastatic potential in vivo. Extensive proteomic analysis revealed that RPN2 knockdown alters the expression of 14-3-3 ⁇ , which is known to regulate the TGF- ⁇ / Smad pathway. Thus, the inventors provide genetic and biological evidence that RPN2 is important for maintenance of cancer stem cell phenotype and that RPN2 may be a promising target for cancer stem cell therapy. provide.
  • the present invention is: [1] A pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising an RPN2 inhibitor, comprising or derived from cancer stem cells; [2] The pharmaceutical composition of [1], wherein the cancer stem cell has a mutant p53 gene; [3] The pharmaceutical composition of [1] or [2], wherein the RPN2 inhibitor is siRNA against the RPN2 gene; [4] A method for detecting cancer stem cells, comprising determining the presence or level of RPN2 expression; [5] The method according to [4], further comprising detecting a mutant p53 gene.
  • the present invention provides methods and compositions for the treatment, prevention and diagnosis of cancer containing or derived from cancer stem cells targeting the RPN2 gene.
  • (A) shows CD44 + CD24 ⁇ cancer stem cell unequal division.
  • (B) RPN2 expression analysis by RT-PCR. It is a figure which shows the effect of RPN2 knockdown with respect to the number of CD44 + CD24 ⁇ cancer stem cells.
  • (A) It is a figure which shows the effect of RPN2 knockdown with respect to colony formation ability.
  • (B) It is a figure which shows the effect of RPN2 knockdown with respect to the number of formation colonies. It is a figure which shows the effect of RPN2 knockdown with respect to tumorigenicity. It is a figure which shows the effect of RPN2 knockdown with respect to tumor metastasis. It is a figure which shows the effect of RPN2 knockdown with respect to lethality.
  • FIG. 6 shows the effect of RPN2 knockdown on the expression of 14-3-3 ⁇ . It is a figure which shows the result of the immunohistochemical staining of the tumor formed by transplanting MM231-LN cell to an animal. It is a figure which shows the expression of RPN2 and the mutant
  • FIG. 5 shows tumor apoptosis assessed by TUNEL assay.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising an RPN2 inhibitor, containing or derived from cancer stem cells.
  • the present invention also provides a method for the treatment or prevention of cancer comprising or derived from cancer stem cells, comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
  • cancer stem cell refers to a cancer cell having pluripotency and self-renewal ability (also referred to herein as self-replication differentiation ability).
  • the cancer cells include any cancer such as breast cancer cells, stomach cancer cells, colon cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, blood cell cancer cells and the like.
  • cancer stem cells may have resistance to anticancer drugs (drug resistance), ability to invade surrounding tissues and / or metastasize to distant sites in the body (invasion metastasis ability). .
  • drug resistance drug resistance
  • the present invention is useful for cancer treatment and prevention targeting such cancer stem cells.
  • the cancer stem cells have an increased expression level of ribophorin II (RPN2).
  • RPN2 is one of the components (subunits) of an oligosaccharide transferase (OST) complex that exists in rough vesicles and has a function of adding an N-linked sugar chain to a nascent polypeptide chain.
  • Human RPN2 is a basic membrane protein consisting of 631 amino acids. The origin of RPN2 is not limited, but is, for example, an animal, preferably a mammal, more preferably a primate, and still more preferably a human.
  • RPN2 gene is a gene encoding RPN2. SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the human RPN2 gene.
  • the cancer stem cell has a mutant p53 gene.
  • “P53” is a tumor suppressor gene product, and mutations in the p53 gene have been found in many human cancers (Adorno, M. et al., Cell, 137: 87-98 (2009); Wang , SP et al., Nat. Cell Biol., 11: 694-704 (2009); Muller, PA et al., Cell, 139: 1327-1341 (2009); Morton, JP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 246-251 (2010)).
  • the mutation in the p53 gene is not limited, but preferably the mutation is a substitution point mutation (missense mutation) or a deletion mutation (codon deletion mutation) that does not cause a frame shift.
  • the present inventors have found that knocking down RPN2 expression in a cell line having mutant p53 reduces the mutant p53 protein level and suppresses the decrease in E-cadherin expression. Furthermore, the present inventors have found that the expression of 14-3-3 ⁇ is decreased in cancer cells in which RPN2 is highly expressed, and that the expression is increased by knocking down RPN2. 14-3-3 ⁇ is known to act to degrade mutant p53 via mdm2.
  • Cancer cells are known to exhibit a phenomenon called epithelial-mesenchymal transition (EMT). It is thought that the expression of E-cadherin involved in cell adhesion during EMT decreases, and as a result, cancer cells infiltrate or metastasize.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • mutant p53 is involved in the ability of cancer cells to self-replicate and to infiltrate and metastasize, and there are many studies on p53.
  • no successful cancer treatment or prevention targeting p53 has been reported to date.
  • RPN2 has been shown to be involved in drug resistance in addition to self-renewal differentiation ability and invasion and metastasis ability, inhibiting RPN2 not only eliminates drug resistance of cancer cells, but also mutant p53 It is thought that it can inhibit the self-renewal differentiation ability and invasive metastasis ability of cancer cells by inhibiting the action upstream.
  • mutant p53 By detecting the presence of mutant p53 in addition to RPN2 expression, cancer cells having mutant p53 effective in inhibiting RPN2 can be identified more accurately. Further, by inhibiting RPN2, cancer associated with mutant p53 can be treated and prevented more effectively than targeting mutant p53.
  • the term “RPN2 inhibitor” refers to any substance that inhibits RPN2 gene expression and RPN2 gene product action. It is known that RPN2 is hardly expressed in normal tissues other than placenta. Accordingly, the RPN2 inhibitor is useful as a specific cancer therapeutic agent that does not substantially act on cells other than cancer cells in subjects other than pregnant women and has no side effects. Although there is no subject limitation, for example, it is an animal, preferably a mammal, more preferably a primate, and still more preferably a human.
  • RPN2 inhibitor for example, a substance that inhibits transcription of the RPN2 gene, a substance that binds to or degrades the RPN2 transcript, a substance that binds to the RPN2 protein, and the like can be used.
  • substances that bind to RPN2 protein include anti-RPN2 antibodies or fragments thereof (Fab, F (ab ′) 2, etc.), other components that bind to RPN2 in oligosaccharide transferase (OST) complexes, and the like. It is done.
  • substances that bind to or degrade the RPN2 transcript include antisense RNA, ribozyme, small interfering RNA (siRNA), microRNA (miRNA) and the like for the RPN2 gene.
  • RNA interference refers to a phenomenon in which gene expression is suppressed in a sequence-specific manner by double-stranded (ds) RNA molecules.
  • ds double-stranded
  • siRNA interference is caused by cleavage of target mRNA by siRNA, gene silencing via heterochromatinization of the target DNA region by siRNA, translational suppression by miRNA, transcriptional repression, degradation of mRNA, and the like. Since siRNA can be designed based on the sequence of the RPN2 gene, which is the target gene, and can be artificially synthesized, it is preferably used in the present invention.
  • Such siRNA can be obtained by any method known in the art. For example, it can be chemically synthesized by performing a condensation reaction one base at a time from the 3 ′ end to the 5 ′ end by the phosphoramidite method also used in DNA chemical synthesis.
  • the hydroxyl group at the 2 ′ end of each ribonucleotide is protected in order to prevent degradation by RNase during the synthesis process.
  • protecting groups include 2'-Ot-butyldimethylsilyl (2'-tBDMS) group, 2'-O-triisopropylsilyloxymethyl (2'-TOM) group, 5'-silyl-2 Examples include a '-acetoxyethoxy (2'-ACE) group.
  • the siRNA for the RPN2 gene has a sequence corresponding to a predetermined sequence of the RPN2 gene, that is, a sequence corresponding to a partial sequence of the target mRNA.
  • a dsRNA consisting of RNA of SEQ ID NO: 2 serving as a sense strand and RNA of SEQ ID NO: 3 serving as an antisense strand with respect to the sequence from 1194th to 1212th in the RPN2 gene sequence shown in SEQ ID NO: 1 (sequence A) can be used as siRNA.
  • this dsRNA there is a 2-base overhang at the 3 ′ end of each strand, so the double-stranded portion is 19 bases long.
  • SEQ ID NOs: 4 to 25 show the sequences of the sense strand and the antisense strand of siRNA (sequences B to L) for the RPN2 gene disclosed in Patent Document 1. These pairs (dsRNA) can be used as RPN2 inhibitors in the present invention.
  • miRNA is a low molecular weight RNA that does not encode a protein, and it is known that there are several hundred types on the genome. miRNA is transcribed as nucleotides of hundreds to thousands of bases and then processed, and finally becomes dimer nucleotides of 19 to 24 bases. Translation of mRNA having a base sequence complementary to this miRNA is suppressed. Inhibits gene expression by mRNA degradation, transcriptional control, etc. Since it is known that the expression of RPN2 is also controlled by a plurality of miRNAs, it is possible to artificially synthesize such miRNAs and use them as RPN2 inhibitors in the present invention to suppress RPN2 gene expression. It becomes possible. Known miRNA sequences that may suppress RPN2 gene expression can be searched from public databases (such as TargetScanetRelease 3.1).
  • the administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be either systemic administration or local administration.
  • the route of administration can be any route such as intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intranasal, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain optional components used in the field of pharmaceutical preparation, such as excipients, diluents, and stabilizers.
  • the RPN2 inhibitor is a protein such as an antibody
  • the pharmaceutical composition may further comprise components commonly used in the field of protein formulation.
  • the RPN2 inhibitor is a nucleic acid such as siRNA
  • an arbitrary substance for example, a liposome for introducing the nucleic acid may be included. Since the transfection agent containing the peptide surfactant described in WO2010 / 024262 exhibits low toxicity, high reachability to the affected area, and suppression efficiency of the target gene and can be administered systemically, Therefore, it can be used suitably.
  • the amount of RPN2 inhibitor used in the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the administration method, tumor type, size, patient condition, concomitant drugs, etc., and is appropriately determined by those skilled in the art.
  • siRNA when used as an RPN2 inhibitor, it is preferably 1 nmol / kg or more and 10 nmol / kg or less for local administration, and 2 nmol / kg or more and 50 nmol / kg or less for systemic administration.
  • the present invention provides a method for detecting cancer stem cells, comprising determining the presence or level or expression level of RPN2.
  • RPN2 Since RPN2 is present in the cytoplasm, for detection, an extract containing RNA, protein, etc. is prepared from cells or tissues obtained from the subject, and the transcription product (RPN2 mRNA) and translation product (RPN2 protein) therein are prepared. To detect.
  • RPN2 mRNA any method known in the art such as Northern blotting or reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) can be used.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • detection of RPN2 protein any method known in the art, for example, an immunological method using an anti-RPN2 antibody (Western blotting, ELISA, etc.) can be used.
  • RPN2 Since it is known that RPN2 is hardly expressed in normal tissues other than placenta, the presence or high level expression of RPN2 is an indicator of RPN2's involvement in cancer. For the treatment and prevention of such cancer, treatment using the pharmaceutical composition of the present invention containing an RPN2 inhibitor is effective.
  • the detection method of the present invention further includes detecting a mutant p53 gene.
  • Detection of the mutant p53 gene can be performed using any nucleic acid detection / analysis method utilizing hybridization, electrophoresis, nucleic acid amplification, sequencing and the like known in the art.
  • the detection method of the present invention is useful as a diagnostic method for determining effective treatment and prevention methods.
  • Example 1 MCF7-ADR a human breast cancer cell, was divided into two cell fractions CD44 + CD24 ⁇ and CD44 + CD24 + and cultured for 7 days. Only the CD44 + CD24 ⁇ fraction had unequal division, a property of cancer stem cells (FIG. 1A).
  • ribophorin II (RPN2) was analyzed by RT-PCR.
  • RPN2 ribophorin II
  • CD44 + CD24 ⁇ cancer stem cells
  • CD44 + CD24 + non-cancer stem cells
  • Example 2 The shRPN2 vector was used to produce human breast cancer cells in which the expression of RPN2 was constitutively knocked down.
  • the cells used were three types of human breast cancer cell lines: MCF7, MCF7-ADR, and MDA-MB-231LN (MM231-LN).
  • MCF7 is a parent strain of MCF7-ADR (drug resistant strain), is a non-malignant breast cancer cell, is hormone receptor positive, and is sensitive to drugs.
  • MM231-LN is a hormone receptor negative and highly metastatic cell line with high malignancy.
  • Example 3 One of the characteristics of cancer stem cells is the ability to form colonies in planar culture. As shown in FIG. 3A (MM231-LN-shNC), MM231-LN cells form a large number of colonies, but when the shRPN2 vector was introduced, the colony forming ability was remarkably suppressed (bottom of FIG. 3A). MM231-LN-shRPN2). FIG. 3B shows the number of colonies formed.
  • Example 4 Another feature of cancer stem cells is that even if a small number of cells are transplanted into an animal, they form a fine tumor.
  • MCF7-ADR and MM231-LN two types of human breast cancer cells
  • shRPN2 RPN2 was knocked down
  • shNC shNC
  • Cells into which shRPN2 vector was introduced were transplanted on the right side of the back of mice (NOD-Scid mice, female, 6 weeks old), and cells into which shNC vector was introduced on the left side.
  • Number of transplanted cells when 1 ⁇ 10 4 cells / site of MCF7-ADR, was when 1 ⁇ 10 2 cells / sites of MM231-LN.
  • Example 5 MM231-LN cell is a highly metastatic strain with high malignancy. When this cell is transplanted into the mammary gland of a mouse, it metastasizes to the armpit and thoracic lymph nodes and is 100% lethal. In this system, the case where the shRPN2 vector was introduced was compared with the case where the shNC vector was introduced. As a result, lymph node metastasis was remarkably suppressed in the shRPN2 group (FIG. 5). Table 2 summarizes the results.
  • Example 6 As a result of observing the mice described in Example 5 for a longer period of time, in the shNC group, all of the transplanted cells 1 ⁇ 10 2 cells and 1 ⁇ 10 3 cells were lethal, but in the shRPN2 group, 1 ⁇ 10 All cases survived with 2 x 1 x 3 transplants (Figure 6).
  • the vertical axis represents the metastasis-free survival rate (%), and the horizontal axis represents time (day).
  • Example 7 Two types of cells, MCF7-ADR and MM231-LN, in which RPN2 was knocked down by introduction of shRPN2 vector, were examined for expression of mutant p53 by protein analysis by Western method. As a result, it was found that the expression of mutant p53 was remarkably reduced in any cell (FIG. 7A).
  • FIG. 7B shows the results for shNC
  • FIG. 7 shows the results for shRPN2
  • FIG. 7B right shows the E-cadherin positive cell rate (%).
  • E-cadherin expression is lost when cancer cells exhibit epithelial-mesenchymal transition (EMT). Cells with reduced E-cadherin are said to have the property of facilitating metastasis.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • Example 8 In order to investigate the mechanism by which the expression of mutant p53 is controlled by RPN2, proteins whose expression was changed by introduction of shRPN2 vector into cells were analyzed by the proteome technique. As a result, the involvement of 14-3-3 ⁇ was clarified (FIG. 8). 14-3-3 ⁇ acts to degrade mutant p53 via mdm2. In cells in which RPN2 is increased, the expression of 14-3-3 ⁇ is reduced, so that the mutant p53 is stabilized, and E-cadherin is decreased. It is thought that it was destined.
  • Example 9 MM231-LN cells are transplanted into animals, and the formed tumor is immunized in three colors using DAPI (blue), anti-RPN2 antibody (green), and anti-mutated p53 antibody (red) that specifically stain the nucleus. This was examined by tissue staining (FIG. 9 left). RPN2-positive cells and mutant p53-positive cells were consistent. Furthermore, the expression of RPN2 was examined by staining with the ABC method (in FIG. 9). The expression of E-cadherin was decreased in RPN2 high-expressing cancer cells that were heavily stained in FIG. 9 (right side of FIG. 9).
  • Example 10 The breast cancer tissues of two human breast cancer patients were examined by three-color fluorescent immunostaining using DAPI (blue), anti-RPN2 antibody (green), and anti-mutated p53 antibody (red) that specifically stain the nucleus.
  • the tissue is the primary focus and both are positive for lymph node metastasis.
  • the RPN2-positive cells and the mutant p53-positive cells are in agreement, which confirms the in vitro results in Example 9 (FIG. 10).
  • Example 11 Apoptosis of breast cancer cells and reduction of breast cancer tumors by administration of siRNA against RPN2 gene in spontaneous breast cancer of dogs.
  • PCR analysis of spontaneous cancer tissues of dogs (including breast cancer) revealed that RPN2 was highly expressed in canine breast cancer tissues.
  • SiRNA for canine RPN2 was designed and a nucleic acid transfer carrier aqueous solution (a transfer carrier containing a peptide surfactant (A 6 K: Patent Publication 2010-222338) as a nucleic acid transfer carrier) was used at a final concentration of 0.5%. )
  • a siRNA-carrier complex final concentration 1 mg / mL).
  • the above siRNA-carrier complex is locally administered every 2 days to a spontaneous breast cancer tumor of a dog (Golden Retriever, body weight of about 40 kg), and the tumor tissue is surgically treated on the third day from the last administration. Resected. As controls, physiological saline alone and carrier (A 6 K) alone were administered. The appearance size of the tumor was 36.3 mm long and 17.1 mm short before administration of the siRNA-carrier complex, but became 34.9 mm long and 15.6 mm short on the third day after the last administration. There was a 43% reduction in tumor volume (GTV).
  • the present invention provides methods and compositions for the treatment, prevention and diagnosis of cancer containing or derived from cancer stem cells targeting the RPN2 gene.

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Abstract

　がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物を提供する。

Description

がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物
　本発明は、ＲＰＮ２遺伝子を標的としたがん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物に関する。
　証拠の蓄積により、腫瘍は一様ではなく、しばしば不均一な細胞型から構成されており、その中の細胞のサブセットが腫瘍の阻害、薬剤耐性および転移を担うことが示唆されている。そのような細胞はがん幹細胞（または腫瘍開始細胞）と呼ばれている。このがん幹細胞を標的とすれば、がんの発生、転移、再発を治療および予防できることが期待される。しかし、がん幹細胞表現型の分子的基盤の大部分は不明であるので、がん幹細胞を規定するマーカーは明らかではなく、また、がん幹細胞を標的とした治療または予防の方法は確立されていない。
　本発明者らは、以前に、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の構成成分であるリボホリンＩＩ（ＲＰＮ２）が乳がん細胞における薬剤耐性を調節しており、そしてＲＰＮ２のサイレンシングが薬剤耐性腫瘍を克服するための有望なアプローチであることを実証した（特許文献１）。しかし、ＲＰＮ２の発現抑制によるがん細胞の増殖抑制等のメカニズムは明らかではなかった。
国際特開第２００７／１４４９８５号
　本発明の目的は、がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物を提供することにある。
　本願において、本発明者らは、ＲＰＮ２が乳がん細胞のがん幹細胞画分において高発現されており、そしてＲＰＮ２のノックダウンがインビトロでがん幹細胞のコロニー形成および浸潤能を阻害することを示す。更なる分析により、ＲＰＮ２のノックダウンがインビボで腫瘍形成を低下させそして転移能を抑制することが示された。網羅的プロテオミクス分析により、ＲＰＮ２ノックダウンが、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ経路を調節することが知られている１４－３－３ζの発現を変化させることが明らかになった。従って、本発明者らは、ＲＰＮ２ががん幹細胞表現型の維持のために重要であり、そしてＲＰＮ２ががん幹細胞治療に向けた有望な標的であり得ることの遺伝的および生物学的証拠を提供する。
　本発明は：
［１］ＲＰＮ２阻害剤を含む、がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療または予防のための医薬組成物；
［２］がん幹細胞が変異型ｐ５３遺伝子を有する、［１］の医薬組成物；
［３］ＲＰＮ２阻害剤がＲＰＮ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡである、［１］または［２］の医薬組成物；
［４］ＲＰＮ２の発現の有無またはレベルを決定することを含む、がん幹細胞の検出方法；
［５］変異型ｐ５３遺伝子を検出することをさらに含む、［４］の方法
に関する。
　本発明により、ＲＰＮ２遺伝子を標的としたがん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物が提供される。
（Ａ）ＣＤ４４＋ＣＤ２４－がん幹細胞の不均等分裂を示す図である。（Ｂ）ＲＴ－ＰＣＲによるＲＰＮ２の発現解析を示す図である。 ＣＤ４４＋ＣＤ２４－がん幹細胞数に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。 （Ａ）コロニー形成能に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。（Ｂ）形成コロニー数に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である 腫瘍形成能に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。 腫瘍転移に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。 致死性に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。 （Ａ）変異型ｐ５３の発現に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。（Ｂ）Ｅ－カドヘリンの発現に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。 １４－３－３ζの発現に対するＲＰＮ２ノックダウンの効果を示す図である。 ＭＭ２３１－ＬＮ細胞を動物に移植して形成された腫瘍の免疫組織染色の結果を示す図である。 ヒト乳がん患者の乳がん組織におけるＲＰＮ２および変異型ｐ５３の発現を示す図である。 ＴＵＮＥＬアッセイによって評価した腫瘍アポトーシスを示す図である。乳癌の腫瘍アポトーシスが高度に誘導されたことが、投与３日後のＲＰＮ２－ｓｉＲＮＡ／Ａ６Ｋの腫瘍内送達によって証明された。 イヌ乳癌におけるＲＰＮ２のノックダウン分析を示す図である。ＲＰＮ２－ｓｉＲＮＡ／Ａ６Ｋによって、ＲＰＮ２　ｍＲＮＡの対照（生理食塩水）と比べて約５０％の阻害が、認められた（ｎ＝３，ｐ＜０．００１）。
　本発明は、ＲＰＮ２阻害剤を含む、がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療または予防のための医薬組成物を提供する。また、本発明により、対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む、がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療または予防のための方法が提供される。
　本明細書において使用する用語「がん幹細胞」は、多分化能および自己複製能（これらを本明細書において自己複製分化能ともいう）を有するがん細胞を指す。がん細胞には、乳がん細胞、胃がん細胞、大腸がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、血球系がん細胞等、任意のがんが含まれる。がん幹細胞は、自己複製分化能に加えて、抗がん剤に対する耐性（薬剤耐性）、周辺組織へ浸潤するおよび／または体内の離れた部位へ転移する能力（浸潤転移能）を有し得る。がん幹細胞を標的とすれば、がんの発生、転移、再発を治療および予防できると考えられる。本発明は、このようながん幹細胞を標的としたがんの治療および予防に有用である。
　１つの実施態様において、がん幹細胞は、増加したリボホリンＩＩ（ＲＰＮ２）の発現レベルを有する。「ＲＰＮ２」は、粗面小胞に存在し、新生ポリペプチド鎖にＮ結合型糖鎖を付加する機能を有するオリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の構成成分（サブユニット）の一つである。ヒトＲＰＮ２は６３１アミノ酸からなる塩基性の膜タンパク質である。ＲＰＮ２の起源に限定はないが、例えば動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒトである。「ＲＰＮ２遺伝子」は、ＲＰＮ２をコードする遺伝子である。配列番号１にヒトＲＰＮ２遺伝子の塩基配列を示す。
　本発明者らは、ＲＰＮ２の発現をＣＤ４４＋／ＣＤ２４－の乳がんのがん幹細胞画分においてショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によりノックダウンすると、インビトロでがん幹細胞のコロニー形成および浸潤能が阻害され、そして免疫不全動物での（すなわちインビボでの）腫瘍形成能や浸潤転移能が消滅することを見出した。上記のように、がん幹細胞は、自己複製分化能、薬剤耐性、浸潤転移能を有し得るので、これらの全てに関与するＲＰＮ２はがん幹細胞のマーカーとなり、また、ＲＰＮ２を標的とすればがん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんを治療および予防できると考えられる。
　別の実施態様において、がん幹細胞は変異型ｐ５３遺伝子を有する。「ｐ５３」は、がん抑制遺伝子産物であり、多くのヒトがんにおいてｐ５３遺伝子における変異が見出されている（Adorno, M. et al., Cell, 137:87-98 (2009)；Wang, S.P. et al., Nat. Cell Biol., 11:694-704 (2009)；Muller, P.A. et al., Cell, 139:1327-1341 (2009)；Morton, J.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:246-251 (2010)）。ｐ５３遺伝子における変異に限定はないが、好ましくは、変異はフレームシフトを生じない置換点変異（ミスセンス変異）または欠失変異（コドン欠失変異）である。
　本発明者らは、変異型ｐ５３を有する細胞株においてＲＰＮ２の発現をノックダウンすると、変異型ｐ５３タンパク質レベルが低下し、Ｅ－カドヘリンの発現低下が抑制されることを見出した。さらに、本発明者らは、ＲＰＮ２が高発現しているがん細胞では１４－３－３ζの発現が低下しており、ＲＰＮ２のノックダウンによってその発現が増加することを見出した。１４－３－３ζはｍｄｍ２を介して変異型ｐ５３を分解するように作用することが知られている。
　がん細胞は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）と称する現象を示すことが知られている。ＥＭＴに際して細胞接着に関与するＥ－カドヘリンの発現が低下し、その結果、がん細胞が浸潤または転移すると考えられている。上記の結果は、がん細胞においてＲＰＮ２が１４－３－３ζの発現を低下させ、その結果、変異型ｐ５３が安定化されて、ＥＭＴを引き起こし、がん細胞の浸潤または転移がもたらされることを示している。
　変異型ｐ５３はがん細胞の自己複製分化能および浸潤転移能に関与することが示唆されており、ｐ５３に関する多くの研究が存在する。しかし、ｐ５３を標的としたがんの治療または予防の成功例は現在までに報告されていない。ＲＰＮ２は、自己複製分化能および浸潤転移能に加えて、薬剤耐性に関与することが示されているので、ＲＰＮ２を阻害すれば、がん細胞の薬剤耐性をなくすだけでなく、変異型ｐ５３の作用をその上流で阻害してがん細胞の自己複製分化能および浸潤転移能を阻害できると考えられる。ＲＰＮ２の発現に加えて、変異型ｐ５３の存在を検出すれば、ＲＰＮ２の阻害が有効な変異型ｐ５３を有するがん細胞をより正確に同定することができる。また、ＲＰＮ２を阻害することによって、変異型ｐ５３を標的とするよりも有効に変異型ｐ５３に関連するがんを治療および予防することができる。
　本明細書において使用する用語「ＲＰＮ２阻害剤」は、ＲＰＮ２遺伝子の発現、ＲＰＮ２遺伝子産物の作用を阻害する任意の物質を指す。ＲＰＮ２は胎盤以外の正常組織ではほとんど発現されていないことが知られている。従って、ＲＰＮ２阻害剤は、妊婦以外の対象におけるがん細胞以外の細胞には実質的に作用せず、副作用のない特異的ながん治療薬として有用である。対象限定はないが、例えば動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒトである。
　ＲＰＮ２阻害剤として、例えば、ＲＰＮ２遺伝子の転写を阻害する物質、ＲＰＮ２転写産物に結合するかまたはそれを分解する物質、ＲＰＮ２タンパク質に結合する物質等を使用することができる。ＲＰＮ２タンパク質に結合する物質の例としては、抗ＲＰＮ２抗体またはそのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等）、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体においてＲＰＮ２と結合する他の構成成分等が挙げられる。ＲＰＮ２転写産物に結合するかまたはそれを分解する物質の例としては、ＲＰＮ２遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等が挙げられる。
　ＲＰＮ２遺伝子に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こすｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等がＲＰＮ２阻害剤として好適に使用される。ＲＮＡ干渉は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子によって配列特異的に遺伝子発現が抑制される現象を指す。例えばｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの切断、ｓｉＲＮＡによる標的ＤＮＡ領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシング、ｍｉＲＮＡによる翻訳抑制、転写抑制、ｍＲＮＡの分解等によってＲＮＡ干渉がもたらされる。ｓｉＲＮＡは、対象遺伝子であるＲＰＮ２遺伝子の配列に基づいて配列設計をすることができ、人工合成可能であるので、本発明において好適に使用される。
　このようなｓｉＲＮＡを当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡ化学合成でも使用されるホスホアミダイト法により、３'末端から５'末端に向かって一塩基ずつ順番に縮合反応させることにより化学合成することができる。好ましくは、合成過程でＲＮａｓｅによる分解を防ぐために、個々のリボヌクレオチドの２'末端の水酸基を保護する。このような保護基としては、２’－Ｏ－ｔ－ブチルジメチルシリル（２’－ｔＢＤＭＳ）基、２’－Ｏ－トリイソプロピルシリルオキシメチル（２’－ＴＯＭ）基、５’－シリル－２’－アセトキシエトキシ（２’－ＡＣＥ）基などが挙げられる。
　ＲＰＮ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、ＲＰＮ２遺伝子の所定の配列に対応する配列、すなわち標的となるｍＲＮＡの一部の配列に対応する配列を有する。例えば、配列番号１に示すＲＰＮ２遺伝子配列の中の１１９４番目から１２１２番目までの配列に対して、センス鎖となる配列番号２のＲＮＡおよびアンチセンス鎖となる配列番号３のＲＮＡからなるｄｓＲＮＡ（配列Ａ）をｓｉＲＮＡとして使用することができる。このｄｓＲＮＡにおいて、各鎖の３'末端には、２塩基のオーバーハングが存在するため、二重鎖部分は１９塩基長となる。配列番号４～２５に、特許文献１に開示されるＲＰＮ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（配列Ｂ～Ｌ）のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を示す。これらの対（ｄｓＲＮＡ）を本発明においてＲＰＮ２阻害剤として使用することができる。
　また、ｍｉＲＮＡは、タンパク質をコードしない低分子ＲＮＡであり、ゲノム上に数百種類存在することが知られている。ｍｉＲＮＡは、数百から数千塩基のヌクレオチドとして転写された後にプロセシングを受け、最終的には１９～２４塩基の２量体ヌクレオチドとなり、このｍｉＲＮＡと相補的な塩基配列を持つｍＲＮＡの翻訳抑制や、ｍＲＮＡの分解、転写の制御等により遺伝子発現を抑制する。ＲＰＮ２も複数のｍｉＲＮＡによって発現が制御されることが知られていることから、このようなｍｉＲＮＡを人工的に合成し、本発明においてＲＰＮ２阻害剤として使用することによりＲＰＮ２遺伝子発現を抑制することが可能となる。ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する可能性のある既知のｍｉＲＮＡの配列は公開データベース（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ Ｒｅｌｅａｓｅ３．１など）により検索することができる。
　本発明の医薬組成物の投与は、全身投与、局所投与のいずれでもよい。投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、鼻腔内などの任意の経路であり得る。本発明の医薬組成物は、賦形剤、希釈剤、安定化剤等、製剤の分野で使用される任意の成分をさらに含んでもよい。例えば、ＲＰＮ２阻害剤が抗体等のタンパク質である場合、医薬組成物は、タンパク質製剤の分野において一般に使用される成分をさらに含み得る。また、例えば、ＲＰＮ２阻害剤がｓｉＲＮＡ等の核酸である場合、核酸を導入するための任意の物質（例えば、リポソーム）を含めてもよい。国際公開第２０１０／０２４２６２号に記載されるペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤は、低い毒性、高い患部までの到達効率および標的遺伝子の抑制効率を示し、全身投与可能であるので、本発明のために好適に使用することができる。
　本発明の医薬組成物に含まれるＲＰＮ２阻害剤の使用量は、投与方法、腫瘍の種類、大きさ、患者の状態、併用する薬剤等によって変動し、当業者によって適宜決定される。例えば、ＲＰＮ２阻害剤としてｓｉＲＮＡを使用する場合、局所投与では１ｎｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、全身投与では２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上５０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。
　本発明は、ＲＰＮ２の発現の有無またはレベルを決定することを含む、がん幹細胞の検出方法を提供する。
　ＲＰＮ２は細胞質内に存在するので、検出に際しては対象から得られた細胞または組織からＲＮＡ、タンパク質等を含む抽出物を調製し、その中の転写産物（ＲＰＮ２　ｍＲＮＡ）、翻訳産物（ＲＰＮ２タンパク質）を検出する。ＲＰＮ２　ｍＲＮＡの検出には、ノーザンブロッティング、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）などの当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。ＲＰＮ２タンパク質の検出には、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、抗ＲＰＮ２抗体を使用した免疫学的方法（ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等）を使用することができる。ＲＰＮ２は胎盤以外の正常組織ではほとんど発現されていないことが知られているので、ＲＰＮ２の発現の存在または高レベルの発現は、ＲＰＮ２のがんへの関与の指標となる。そのようながんの治療および予防には、ＲＰＮ２阻害剤を含む本発明の医薬組成物を用いた処置が有効である。
　１つの実施態様において、本発明の検出方法は、変異型ｐ５３遺伝子を検出することをさらに含む。変異型ｐ５３遺伝子の検出を、当技術分野において公知のハイブリダイゼーション、電気泳動、核酸増幅、配列決定などを利用した任意の核酸検出・分析方法を使用して行なうことができる。上記のように、ＲＰＮ２を発現するがん細胞において変異型ｐ５３が存在する場合、ＲＰＮ２を阻害することによって、変異型ｐ５３に関連するがんを有効に治療および予防することができる。従って、本発明の検出方法は、有効な治療および予防方法の決定するための診断方法として有用である。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　ヒト乳がん細胞であるＭＣＦ７－ＡＤＲを２つ細胞分画ＣＤ４４＋ＣＤ２４－およびＣＤ４４＋ＣＤ２４＋に分けて７日間培養した。ＣＤ４４＋ＣＤ２４－の分画のみが、がん幹細胞としての性質である不均等分裂を有していた（図１Ａ）。
　ＲＴ－ＰＣＲによりリボホリンＩＩ（ＲＰＮ２）の発現を解析した。その結果、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－（がん幹細胞）における発現は、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋（非がん幹細胞）における発現に比べて約２０倍以上亢進していた（図１Ｂ）。
実施例２
　ｓｈＲＰＮ２ベクターを使用して、ＲＰＮ２の発現が恒常的にノックダウンされたヒト乳がん細胞を作製した。用いた細胞は、ＭＣＦ７、ＭＣＦ７－ＡＤＲ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＬＮ（ＭＭ２３１－ＬＮ）のヒト乳がん細胞株３種類であった。ＭＣＦ７は、ＭＣＦ７－ＡＤＲ（薬剤耐性株）の親株であり、非悪性の乳がん細胞で、ホルモンレセプター陽性であり、薬剤に感受性がある。ＭＭ２３１－ＬＮは、ホルモンレセプター陰性で高転移性の悪性度の高い細胞株である。
　得られたそれぞれの細胞について、１０ｎＭドセタキセル存在下で９６時間インキュベートした後、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－がん幹細胞の数を測定した。その結果、ｓｈＲＰＮ２ベクターを導入したＭＣＦ７－ＡＤＲ細胞およびＭＭ２３１－ＬＮ細胞では、コントロールベクター（ｓｈＮＣ）を導入した細胞に比較して、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－がん幹細胞の数が顕著に減少していた（図２）。
実施例３
　がん幹細胞の特徴に１つとして、平面培養（シャーレ）でのコロニー形成能がある。ＭＭ２３１－ＬＮ細胞は、図３Ａ上（ＭＭ２３１－ＬＮ－ｓｈＮＣ）に示すように、多数のコロニーを形成するが、ｓｈＲＰＮ２ベクターを導入した場合、コロニー形成能は顕著に抑制された（図３Ａ下、ＭＭ２３１－ＬＮ－ｓｈＲＰＮ２）。図３Ｂは、形成されたコロニー数を示す。
実施例４
　がん幹細胞の別の特徴は、少ない細胞数を動物に移植しても、立派な腫瘍を形成することである。ここでは２種のヒト乳がん細胞（ＭＣＦ７－ＡＤＲおよびＭＭ２３１－ＬＮ）について、ＲＰＮ２をノックダウンした場合（ｓｈＲＰＮ２）とそうでない場合（ｓｈＮＣ）を比較した。ｓｈＲＰＮ２ベクターを導入した細胞をマウス（ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウス、雌性、６週齢）背部の右側に、ｓｈＮＣベクターを導入した細胞を左側に移植した。移植した細胞数は、ＭＣＦ７－ＡＤＲの場合１×１０４個／部位、ＭＭ２３１－ＬＮの場合１×１０２個／部位であった。
　その結果、マウスのイメージングの図（図４中（ＭＣＦ７－ＡＤＲ－ｌｕｃ）および右（ＭＭ２３１－ＬＮ－ｌｕｃ））に示すように、ｓｈＲＰＮ２ベクターを導入した細胞は、どちらとも腫瘍形成能を失った。表１にその結果をまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例５
　ＭＭ２３１－ＬＮ細胞は悪性度が高い高転移性株である、この細胞を、マウスの乳腺に移植すると、腋下や胸部リンパ節に転移し、１００％致死となる。この系において、ｓｈＲＰＮ２ベクターを導入した場合とｓｈＮＣベクターを導入した場合を比較した。その結果、ｓｈＲＰＮ２の群ではリンパ節転移が顕著に抑制された（図５）。表２にその結果をまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例６
　実施例５に記載のマウスをさらに長期間観察した結果、ｓｈＮＣ群では、移植細胞数１×１０２個、１×１０３個ともに全例が致死となったが、ｓｈＲＰＮ２群では、１×１０２個、１×１０３個の移植で全例が生存した（図６）。図６において、縦軸は無転移生存率（％）を、横軸は時間（日）を示す。
実施例７
　ｓｈＲＰＮ２ベクターの導入によってＲＰＮ２をノックダウンしたＭＣＦ７－ＡＤＲおよびＭＭ２３１－ＬＮの２種類の細胞について、ウエスタン法によるタンパク質解析によって変異型ｐ５３の発現を調べた。その結果、いずれの細胞でも変異型ｐ５３の発現が顕著に低下する事を見出した（図７Ａ）。
　さらに、ｓｈＲＰＮ２によるＲＰＮ２ノックダウンはＥ－カドヘリンの発現を誘導する事が明らかとなった（図７Ｂ）。図７Ｂ左はｓｈＮＣについての結果を、図７中はｓｈＲＰＮ２についての結果を、図７Ｂ右はＥ－カドヘリン陽性細胞率（％）を示す。
　Ｅ－カドヘリンの発現は、がん細胞が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を示すと失われる。Ｅ－カドヘリンが減少した細胞はより転移しやすくなる性質を持つとされている。ＲＰＮ２高発現の細胞におけるＲＰＮ２の発現をｓｈＲＰＮ２によりノックダウンすると、Ｅ－カドヘリンの発現が上昇した事実は、ＲＰＮ２がＥＭＴを誘導している事を裏付ける。
実施例８
　変異型ｐ５３の発現がＲＰＮ２によって制御されるメカニズムを調べるために、ｓｈＲＰＮ２ベクターの細胞への導入によって発現が変化しているタンパク質をプロテオームの手法で解析した。その結果、１４－３－３ζの関与が明らかになった（図８）。１４－３－３ζはｍｄｍ２を介して変異型ｐ５３を分解するように作用する。ＲＰＮ２が亢進している細胞では、１４－３－３ζの発現が低下しているため、変異型ｐ５３の安定化がおこり、Ｅ－カドヘリンを減少させるなど、転移に関係するＥＭＴの方向に細胞を運命づけたものと考えられる。
実施例９
　ＭＭ２３１－ＬＮ細胞を動物に移植し、形成された腫瘍を、核を特異的に染色するＤＡＰＩ（青）、抗ＲＰＮ２抗体（緑）、抗変異型ｐ５３抗体（赤）を使用する３色の免疫組織染色によって調べた（図９左）。ＲＰＮ２陽性細胞と変異型ｐ５３陽性細胞は一致していた。さらに、ＲＰＮ２の発現をＡＢＣ法にて染色して調べた（図９中）。図９中において濃く染色されているＲＰＮ２高発現がん細胞において、Ｅ－カドヘリンの発現が減少していた（図９右）。
実施例１０
　２つのヒト乳がん患者の乳がん組織を、核を特異的に染色するＤＡＰＩ（青）、抗ＲＰＮ２抗体（緑）、抗変異型ｐ５３抗体（赤）を使用する３色の蛍光免疫染色によって調べた。組織は原発巣であり、どちらもリンパ節転移陽性である。いずれの場合も、ＲＰＮ２陽性細胞と変異型ｐ５３陽性細胞は一致しており、これは、実施例９におけるインビトロの結果を裏付けるものである（図１０）。
実施例１１
　イヌの自然発症乳癌における、ＲＰＮ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与による乳癌細胞のアポトーシス及び乳癌腫瘍の縮小
　イヌの自然発症癌組織（乳腺癌を含む）のＰＣＲ解析により、犬の乳癌組織においてもＲＰＮ２が高発現している傾向が見られた。イヌＲＰＮ２に対するｓｉＲＮＡを設計し、核酸移送担体水溶液（核酸移送担体として、ペプチド界面活性剤を含む移送担体（Ａ６Ｋ：特許公開２０１０－２２２３３８）を、最終濃度０．５％にて用いた。）と混合し、ｓｉＲＮＡ－担体複合体（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
　イヌ（ゴールデンレトリバー、体重約４０ｋｇ）の自然発症乳癌腫瘍に、上記のｓｉＲＮＡ－担体複合体を２日おきに２度局所的に投与し、最後の投与から３日目に外科的に腫瘍組織を切除した。対照として、生理食塩水のみ、担体（Ａ６Ｋ）のみを投与した。
　腫瘍の外観サイズは、ｓｉＲＮＡ－担体複合体投与前に長径３６．３ｍｍ、短径１７．１ｍｍであったものが、最後の投与から３日目には長径２４．９ｍｍ、短径１５．６ｍｍとなり、腫瘍体積（ＧＴＶ）として４３％の縮小がみられた。
　外科的切除した腫瘍組織の切片観察およびＴＵＮＥＬアッセイにより、ｓｉＲＮＡ－担体複合体投与による腫瘍細胞のアポトーシスが認められ、投与後の組織には、腫瘍に特徴的な構造が見られなかった（図１１右）。一方、Ａ６Ｋのみ投与では、腫瘍組織に大きな変化は見られなかった（図１１左）。
　ｓｉＲＮＡ－担体複合体投与により、ＲＰＮ２のｍＲＮＡが約５０％ノックダウンされた（図１２）。
　本発明により、ＲＰＮ２遺伝子を標的としたがん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療、予防および診断のための方法および組成物が提供される。

Claims (5)

  1. 　ＲＰＮ２阻害剤を含む、がん幹細胞を含むまたはそれに由来するがんの治療または予防のための医薬組成物。
  2. 　がん幹細胞が変異型ｐ５３遺伝子を有する、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　ＲＰＮ２阻害剤がＲＰＮ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡである、請求項１または２記載の医薬組成物。
  4. 　ＲＰＮ２の発現の有無またはレベルを決定することを含む、がん幹細胞の検出方法。
  5. 　変異型ｐ５３遺伝子を検出することをさらに含む、請求項４記載の方法。
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