KR20140032334A - 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료, 예방 및 진단을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료, 예방 및 진단을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료, 예방 및 진단을 위한 방법 및 조성물{METHOD AND COMPOSITION FOR TREATING, PREVENTING AND DIAGNOSING CANCER CONTAINING CANCER STEM CELLS OR DERIVED THEREFROM}
본 발명은, RPN2 유전자를 표적으로 한 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료, 예방 및 진단을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
증거의 축적에 의해, 종양은 똑같지 않고 종종 불균일한 세포형으로 구성되어 있으며, 그 중의 세포의 서브셋이 종양의 저해, 약제 내성 및 전이를 담당한다는 것이 시사되어 있다. 이러한 세포는 암 줄기세포(또는 종양 개시 세포)라 부르고 있다. 이 암 줄기 세포를 표적으로 하면, 암의 발생, 전이, 재발을 치료 및 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, 암 줄기세포 표현형의 분자적 기반의 대부분은 불분명하기 때문에, 암 줄기세포를 규정하는 마커는 명확하지 않고, 또한, 암 줄기세포를 표적으로 한 치료 또는 예방의 방법은 확립되어 있지 않다.
본 발명자들은, 이전에 올리고당 전이 효소(OST) 복합체의 구성 성분인 리보포린 II(RPN2)가 유방암 세포에 있어서의 약제 내성을 조절하고 있으며, RPN2의 사일런싱이 약제 내성 종양을 극복하기 위한 유망한 시도임을 실증하였다(특허문헌 1). 그러나, RPN2의 발현 억제에 의한 암 세포의 증식 억제 등의 메커니즘은 명확하지 않았다.
국제 특허 공개 제2007/144985호
본 발명의 목적은, 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료, 예방 및 진단을 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것에 있다.
본원에 있어서, 본 발명자들은 RPN2가 유방암 세포의 암 줄기세포 분획에서 높게 발현되고 있으며, RPN2의 녹다운이 시험관 내에서 암 줄기세포의 콜로니 형성 및 침윤능을 저해한다는 것을 밝힌다. 추가 분석에 의해, RPN2의 녹다운이 생체 내에서 종양 형성을 저하시키고 전이능을 억제하는 것이 나타났다. 망라적 프로테오믹스 분석에 의해, RPN2 녹다운이 TGF-β/Smad 경로를 조절하는 것이 알려져 있는 14-3-3ζ의 발현을 변화시킨다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명자들은, RPN2가 암 줄기세포 표현형의 유지를 위해 중요하고, RPN2가 암 줄기세포 치료를 위한 유망한 표적일 수 있다는 유전적 및 생물학적 증거를 제공한다.
본 발명은:
[1] RPN2 조해제를 포함하는 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물;
[2] 암 줄기세포가 변이형 p53유전자를 갖는 [1]의 의약 조성물;
[3] RPN2 조해제가 RPN2 유전자에 대한 siRNA인 [1] 또는 [2]의 의약 조성물;
[4] RPN2의 발현의 유무 또는 레벨을 결정하는 것을 포함하는 암 줄기세포의 검출 방법;
[5] 변이형 p53 유전자를 검출하는 것을 더 포함하는 [4]의 방법
에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, RPN2 유전자를 표적으로 한 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료, 예방 및 진단을 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
도 1의 (A)는 CD44+CD24- 암 줄기세포의 불균등 분열을 도시하는 도면, (B)는 RT-PCR에 의한 RPN2의 발현 해석을 도시하는 도면이다.
도 2는 CD44+CD24- 암 줄기세포수에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면이다.
도 3의 (A)는 콜로니 형성능에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면, (B)는 형성 콜로니수에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면이다.
도 4는 종양 형성능에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면이다.
도 5는 종양 전이에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면이다.
도 6은 치사성에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면이다.
도 7의 (A)는 변이형 p53의 발현에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면, (B)는 E-카드헤린의 발현에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면이다.
도 8은 14-3-3ζ의 발현에 대한 RPN2 녹다운의 효과를 도시하는 도면이다.
도 9는 MM231-LN 세포를 동물에 이식하여 형성된 종양의 면역 조직 염색의 결과를 도시하는 도면이다.
도 10은 인간 유방암 환자의 유방암 조직에 있어서의 RPN2 및 변이형 p53의 발현을 도시하는 도면이다.
도 11은 TUNEL 분석(assay)에 의해 평가한 종양 아포토시스(apoptosis)를 도시하는 도면이다. 유방암의 종양 아포토시스가 고도로 유도된 것이 투여 3일 후의 RPN2-siRNA/A6K의 종양 내 송달에 의해 증명되었다.
도 12는 개 유방암에 있어서의 RPN2의 녹다운 분석을 도시하는 도면이다. RPN2-siRNA/A6K에 의해, RPN2 mRNA의 대조(생리 식염수)에 비해 약 50％의 저해를 보였다(n=3, p<0.001).
본 발명은, RPN2 조해제를 포함하는, 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명에 의해, 대상에 본 발명의 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다.
본 명세서에 있어서 사용하는 용어 「암 줄기세포」는, 다분화능 및 자기 복제능(이들을 본 명세서에 있어서 자기 복제 분화능이라고도 함)을 갖는 암 세포를 말한다. 암 세포에는, 유방암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 혈구계암 세포 등, 임의의 암이 포함된다. 암 줄기세포는, 자기 복제 분화능 뿐만 아니라 항암제에 대한 내성(약제 내성), 주변 조직에 침윤 및/또는 체내의 이격된 부위로 전이되는 능력(침윤 전이능)을 가질 수 있다. 암 줄기세포를 표적으로 하면, 암의 발생, 전이, 재발을 치료 및 예방할 수 있다고 생각된다. 본 발명은, 이러한 암 줄기세포를 표적으로 한 암의 치료 및 예방에 유용하다.
하나의 실시 형태에 있어서, 암 줄기세포는 증가한 리보포린 II(RPN2)의 발현 레벨을 갖는다. 「RPN2」는 조면 소포에 존재하고, 신생 폴리펩티드쇄에 N 결합형 당쇄를 부가하는 기능을 갖는 올리고당 전이 효소(OST) 복합체의 구성 성분(서브 유닛) 중 하나이다. 인간 RPN2는 631 아미노산을 포함하여 이루어지는 염기성의 막 단백질이다. RPN2의 기원에 한정은 없지만, 예를 들어 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 영장류, 더욱 바람직하게는 인간이다. 「RPN2 유전자」는, RPN2를 코드하는 유전자이다. 배열 번호 1에 인간 RPN2 유전자의 염기 배열을 나타낸다.
본 발명자들은, RPN2의 발현을 CD44+/CD24-의 유방암의 암 줄기세포 분획에 있어서 숏 헤어핀 RNA(shRNA)에 의해 녹다운하면, 시험관 내에서 암 줄기세포의 콜로니 형성 및 침윤능이 저해되고, 면역 부전 동물에서의(즉 생체 내에서의) 종양 형성능이나 침윤 전이능이 소멸된다는 것을 알아내었다. 상기한 바와 같이 암 줄기세포는, 자기 복제 분화능, 약제 내성, 침윤 전이능을 가질 수 있기 때문에, 이들 모두에 관여하는 RPN2는 암 줄기세포의 마커가 되고, 또한 RPN2를 표적으로 하면 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암을 치료 및 예방할 수 있다고 생각된다.
다른 실시 형태에 있어서, 암 줄기세포는 변이형 p53 유전자를 갖는다. 「p53」은 암 억제 유전자 산물이며, 많은 인간 암에 있어서 p53 유전자에 있어서의 변이가 발견되어 있다(문헌 [Adorno, M. et al., Cell, 137:87-98(2009); Wang, S. P. et al., Nat. Cell Biol., 11:694-704(2009); Muller, P. A. et al., Cell, 139:1327-1341(2009); Morton, J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:246-251(2010)]). p53 유전자에 있어서의 변이에 한정은 없지만, 바람직하게는 변이는 프레임 시프트를 발생하지 않는 치환점 변이(미스센스 변이) 또는 결실 변이(코돈 결실 변이)이다.
본 발명자들은, 변이형 p53을 갖는 세포주에 있어서 RPN2의 발현을 녹다운하면 변이형 p53 단백질 레벨이 저하되고, E-카드헤린의 발현 저하가 억제된다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, RPN2가 높게 발현하고 있는 암 세포에서는 14-3-3ζ의 발현이 저하되어 있으며, RPN2의 녹다운에 의해 그의 발현이 증가한다는 것을 발견하였다. 14-3-3ζ은 mdm2를 통해 변이형 p53을 분해하도록 작용한다는 것이 알려져 있다.
암 세포는, 상피 간엽 전환(EMT)이라 칭하는 현상을 나타낸다는 것이 알려져 있다. EMT시에 세포 접착에 관여하는 E-카드헤린의 발현이 저하되고, 그 결과 암 세포가 침윤 또는 전이된다고 생각된다. 상기한 결과는, 암 세포에 있어서 RPN2가 14-3-3ζ의 발현을 저하시키고, 그 결과 변이형 p53이 안정화되어 EMT를 일으키고, 암 세포의 침윤 또는 전이가 초래되는 것을 나타내고 있다.
변이형 p53은 암 세포의 자기 복제 분화능 및 침윤 전이능에 관여한다는 것이 시사되어 있으며, p53에 관한 많은 연구가 존재한다. 그러나, p53을 표적으로 한 암의 치료 또는 예방의 성공예는 현재까지 보고되어 있지 않다. RPN2는, 자기복제 분화능 및 침윤 전이능 뿐만 아니라 약제 내성에 관여한다는 것이 나타나 있기 때문에, RPN2를 저해하면 암 세포의 약제 내성을 없앨 뿐만 아니라, 변이형 p53의 작용을 그의 상류에서 저해하여 암 세포의 자기 복제 분화능 및 침윤 전이능을 저해할 수 있다고 생각된다. RPN2의 발현 뿐만 아니라 변이형 p53의 존재를 검출하면, RPN2의 저해가 유효한 변이형 p53을 갖는 암 세포를 보다 정확하게 동정할 수 있다. 또한, RPN2를 저해함으로써, 변이형 p53을 표적으로 하는 것보다도 유효하게 변이형 p53에 관련된 암을 치료 및 예방할 수 있다.
본 명세서에 있어서 사용하는 용어 「RPN2 조해제」는, RPN2 유전자의 발현, RPN2 유전자 산물의 작용을 저해하는 임의의 물질을 말한다. RPN2는 태반 이외의 정상 조직에서는 대부분 발현되지 않는다는 것이 알려져 있다. 따라서, RPN2 조해제는, 임산부 이외의 대상에 있어서의 암 세포 이외의 세포에는 실질적으로 작용하지 않아, 부작용이 없는 특이적인 암 치료약으로서 유용하다. 대상 한정은 없지만, 예를 들어 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 영장류, 더욱 바람직하게는 인간이다.
RPN2 조해제로서, 예를 들어 RPN2 유전자의 전사를 저해하는 물질, RPN2 전사 산물에 결합하거나 또는 그것을 분해하는 물질, RPN2 단백질에 결합하는 물질 등을 사용할 수 있다. RPN2 단백질에 결합하는 물질의 예로서는, 항RPN2 항체 또는 그 프래그먼트(Fab, F(ab')2 등), 올리고당 전이 효소(OST) 복합체에 있어서 RPN2와 결합하는 다른 구성 성분 등을 들 수 있다. RPN2 전사 산물에 결합하거나 또는 그것을 분해하는 물질의 예로서는, RPN2 유전자에 대한 안티센스 RNA, 리보자임, 저분자 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 등을 들 수 있다.
RPN2 유전자에 대하여 RNA 간섭(RNAi)을 일으키는 siRNA, miRNA 등이 RPN2 조해제로서 적절하게 사용된다. RNA 간섭은, 이중쇄(ds) RNA 분자에 의해 배열 특이적으로 유전자 발현이 억제되는 현상을 말한다. 예를 들어 siRNA에 의한 표적mRNA의 절단, siRNA에 의한 표적 DNA 영역의 헤테로크로마틴화를 통한 유전자 사일런싱, miRNA에 의한 번역 억제, 전사 억제, mRNA의 분해 등에 의해 RNA 간섭이 초래된다. siRNA는, 대상 유전자인 RPN2 유전자의 배열에 기초하여 배열 설계를 할 수 있으며, 인공 합성 가능하기 때문에, 본 발명에 있어서 적절하게 사용된다.
이러한 siRNA를 당 기술 분야에 있어서 공지된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, DNA 화학 합성에서도 사용되는 포스포라미디트법에 의해, 3' 말단으로부터 5' 말단을 향해 일염기씩 순서대로 축합 반응시킴으로써 화학 합성할 수 있다. 바람직하게는, 합성 과정에서 RNase에 의한 분해를 방지하기 위해, 개개의 리보뉴클레오티드의 2' 말단의 수산기를 보호한다. 이러한 보호기로서는, 2'-O-t-부틸디메틸실릴(2'-tBDMS)기, 2'-O-트리이소프로필실릴옥시메틸(2'-TOM)기, 5'-실릴-2'-아세톡시에톡시(2'-ACE)기 등을 들 수 있다.
RPN2 유전자에 대한 siRNA는, RPN2 유전자의 소정의 배열에 대응하는 배열, 즉 표적이 되는 mRNA의 일부의 배열에 대응하는 배열을 갖는다. 예를 들어, 배열 번호 1에 나타내는 RPN2 유전자 배열 중 1194번째부터 1212번째까지의 배열에 대하여, 센스쇄가 되는 배열 번호 2의 RNA 및 안티센스쇄가 되는 배열 번호 3의 RNA로 이루어지는 dsRNA(배열 A)를 siRNA로서 사용할 수 있다. 이 dsRNA에 있어서, 각 쇄의 3' 말단에는 2 염기의 오버행이 존재하기 때문에, 이중쇄 부분은 19 염기 길이가 된다. 배열 번호 4 내지 25에, 특허문헌 1에 개시된 RPN2 유전자에 대한 siRNA(배열 B 내지 L)의 센스쇄 및 안티센스쇄의 배열을 나타낸다. 이들 쌍(dsRNA)을 본 발명에 있어서 RPN2 조해제로서 사용할 수 있다.
또한, miRNA는 단백질을 코드하지 않는 저분자 RNA이며, 게놈 위에 몇백 종류 존재한다는 것이 알려져 있다. miRNA는, 몇백부터 몇천 염기의 뉴클레오티드로서 전사된 후에 프로세싱을 받고, 최종적으로는 19 내지 24 염기의 2량체 뉴클레오티드가 되어, 이 miRNA와 상보적인 염기 배열을 갖는 mRNA의 번역 억제나, mRNA의 분해, 전사의 제어 등에 의해 유전자 발현을 억제한다. RPN2도 복수의 miRNA에 의해 발현이 제어된다는 것이 알려져 있기 때문에, 이러한 miRNA를 인공적으로 합성하고, 본 발명에 있어서 RPN2 조해제로서 사용함으로써 RPN2 유전자 발현을 억제하는 것이 가능해진다. RPN2 유전자의 발현을 억제할 가능성이 있는 기지된 miRNA의 배열은 공개 데이터 베이스(TargetScan Release 3.1 등)에 의해 검색할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여는, 전신 투여, 국소 투여 중 어느 것이든 좋다. 투여 경로는, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내, 비강 내 등의 임의의 경로일 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 부형제, 희석제, 안정화제 등, 제제의 분야에서 사용되는 임의의 성분을 더 포함하여도 좋다. 예를 들어, RPN2 조해제가 항체 등의 단백질인 경우, 의약 조성물은 단백질 제제의 분야에 있어서 일반적으로 사용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 RPN2 조해제가 siRNA 등의 핵산인 경우, 핵산을 도입하기 위한 임의의 물질(예를 들어, 리포솜)을 포함하여도 좋다. 국제 공개 제2010/024262호에 기재된 펩티드 계면 활성제를 포함하는 트랜스펙션제는 낮은 독성, 높은 환부까지의 도달 효율 및 표적 유전자의 억제 효율을 나타내고, 전신 투여 가능하기 때문에, 본 발명을 위해 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 RPN2 조해제의 사용량은, 투여 방법, 종양의 종류, 크기, 환자의 상태, 병용하는 약제 등에 따라 변동되며, 당업자에 의해 적절히 결정된다. 예를 들어, RPN2 조해제로서 siRNA를 사용하는 경우, 국소 투여에서는 1nmol/kg 이상 10nmol/kg 이하, 전신 투여에서는 2nmol/kg 이상 50nmol/kg 이하가 바람직하다.
본 발명은, RPN2의 발현의 유무 또는 레벨을 결정하는 것을 포함하는 암 줄기세포의 검출 방법을 제공한다.
RPN2는 세포질 내에 존재하기 때문에, 검출시에는 대상으로부터 얻어진 세포 또는 조직으로부터 RNA, 단백질 등을 포함하는 추출물을 제조하고, 그 중의 전사 산물(RPN2 mRNA), 번역 산물(RPN2 단백질)을 검출한다. RPN2 mRNA의 검출에는, 노던 블로팅, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 등의 당 기술 분야에 있어서 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. RPN2 단백질의 검출에는, 당 기술 분야에 있어서 공지된 임의의 방법, 예를 들어 항RPN2 항체를 사용한 면역학적 방법(웨스턴 블로팅, ELISA 등)을 사용할 수 있다. RPN2는 태반 이외의 정상 조직에서는 거의 발현되지 않는 것이 알려져 있기 때문에, RPN2의 발현의 존재 또는 고레벨의 발현은 RPN2의 암에 대한 관여의 지표가 된다. 이러한 암의 치료 및 예방에는, RPN2 조해제를 포함하는 본 발명의 의약 조성물을 사용한 처치가 유효하다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 검출 방법은 변이형 p53 유전자를 검출하는 것을 더 포함한다. 변이형 p53 유전자의 검출을, 당 기술 분야에 있어서 공지된 하이브리다이제이션, 전기 영동, 핵산 증폭, 배열 결정 등을 이용한 임의의 핵산 검출ㆍ분석 방법을 사용하여 행할 수 있다. 상기한 바와 같이 RPN2를 발현하는 암 세포에 있어서 변이형 p53이 존재하는 경우, RPN2를 저해함으로써 변이형 p53에 관련된 암을 유효하게 치료 및 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 검출 방법은, 유효한 치료 및 예방 방법을 결정하기 위한 진단 방법으로서 유용하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
인간 유방암 세포인 MCF7-ADR을 2개 세포 분획 CD44+CD24- 및 CD44+CD24+로 나누어서 7일간 배양하였다. CD44+CD24-의 분획만이 암 줄기세포로서의 성질인 불 균등 분열을 갖고 있었다(도 1의 A).
RT-PCR에 의해 리보포린 II(RPN2)의 발현을 해석하였다. 그 결과, CD44+CD24-(암 줄기세포)에 있어서의 발현은, CD44+CD24+(비암 줄기세포)에 있어서의 발현에 비해 약 20배 이상 항진되어 있었다(도 1의 B).
실시예 2
shRPN2 벡터를 사용하여, RPN2의 발현이 항상적으로 녹다운된 인간 유방암 세포를 제작하였다. 사용한 세포는, MCF7, MCF7-ADR, MDA-MB-231LN(MM231-LN)의 인간 유방암 세포주 3종류였다. MCF7은, MCF7-ADR(약제 내성주)의 친주(親株)이며, 비악성인 유방암 세포에서 호르몬 리셉터 양성이며, 약제에 감수성이 있다. MM231-LN은, 호르몬 리셉터 음성이며 고전이성의 악성도가 높은 세포주이다.
얻어진 각각의 세포에 대하여, 10nM 도세탁셀 존재하에 96시간 인큐베이트한 후, CD44+CD24- 암 줄기세포의 수를 측정하였다. 그 결과, shRPN2 벡터를 도입한 MCF7-ADR 세포 및 MM231-LN 세포에서는, 컨트롤 벡터(shNC)를 도입한 세포에 비해 CD44+CD24- 암 줄기세포의 수가 현저하게 감소되어 있었다(도 2).
실시예 3
암 줄기세포의 특징 중 하나로서, 평면 배양(샬레)에서의 콜로니 형성능이 있다. MM231-LN 세포는, 도 3의 A 위(MM231-LN-shNC)에 도시한 바와 같이 다수의 콜로니를 형성하지만, shRPN2 벡터를 도입한 경우, 콜로니 형성능은 현저하게 억제되었다(도 3의 A 아래, MM231-LN-shRPN2). 도 3의 B는, 형성된 콜로니수를 나타낸다.
실시예 4
암 줄기세포의 다른 특징은, 적은 세포수를 동물에 이식하여도 충분한 종양을 형성하는 것에 있다. 여기에서는 2종의 인간 유방암 세포(MCF7-ADR 및 MM231-LN)에 대하여 RPN2를 녹다운한 경우(shRPN2)와 그렇지 않은 경우(shNC)를 비교하였다. shRPN2 벡터를 도입한 세포를 마우스(NOD-Scid 마우스, 자성, 6주령) 배면부의 우측에, shNC 벡터를 도입한 세포를 좌측에 이식하였다. 이식한 세포수는, MCF7-ADR의 경우 1×104개/부위, MM231-LN의 경우 1×102개/부위였다.
그 결과, 마우스의 이미징의 도면(도 4 중 (MCF7-ADR-luc) 및 우측(MM231-LN-luc))에 도시한 바와 같이, shRPN2 벡터를 도입한 세포는 어느 쪽도 종양 형성능을 상실하였다. 표 1에 그 결과를 정리한다.
Figure pct00001
실시예 5
MM231-LN 세포는 악성도가 높은 고전이성주이며, 이 세포를 마우스의 유선에 이식하면 겨드랑이 밑이나 흉부 림프절에 전이되어, 100％ 치사가 된다. 이 계에 있어서, shRPN2 벡터를 도입한 경우와 shNC 벡터를 도입한 경우를 비교하였다. 그 결과, shRPN2의 군에서는 림프절 전이가 현저하게 억제되었다(도 5). 표 2에 그 결과를 정리한다.
Figure pct00002
실시예 6
실시예 5에 기재된 마우스를 더욱 장기간 관찰한 결과, shNC군에서는 이식 세포수 1×102개, 1×103개 모두 전체예가 치사가 되었지만, shRPN2군에서는 1×102개, 1×103개의 이식에서 전체예가 생존하였다(도 6). 도 6에 있어서, 종축은 무전이 생존율(％)을, 횡축은 시간(일)을 나타낸다.
실시예 7
shRPN2 벡터의 도입에 의해 RPN2를 녹다운한 MCF7-ADR 및 MM231-LN의 2종류의 세포에 대하여, 웨스턴법에 의한 단백질 해석에 의해 변이형 p53의 발현을 조사하였다. 그 결과, 어떠한 세포에서도 변이형 p53의 발현이 현저하게 저하된다는 것을 알아내었다(도 7의 A).
또한, shRPN2에 의한 RPN2 녹다운은 E-카드헤린의 발현을 유도한다는 것이 명확해졌다(도 7의 B). 도 7의 B 좌측은 shNC에 관한 결과를, 도 7 가운데는 shRPN2에 관한 결과를, 도 7의 B 우측은 E-카드헤린 양성 세포율(％)을 나타낸다.
E-카드헤린의 발현은, 암 세포가 상피 간엽 전환(EMT)을 나타내면 상실된다. E-카드헤린이 감소한 세포는 보다 전이되기 쉬워지는 성질을 갖는다고 알려져 있다. RPN2 고발현의 세포에 있어서의 RPN2의 발현을 shRPN2에 의해 녹다운하면, E-카드헤린의 발현이 상승한 사실은 RPN2가 EMT를 유도하고 있는 것을 뒷받침한다.
실시예 8
변이형 p53의 발현이 RPN2에 의해 제어되는 메커니즘을 조사하기 위해, shRPN2 벡터의 세포로의 도입에 의해 발현이 변화되어 있는 단백질을 프로테옴의 방법으로 해석하였다. 그 결과, 14-3-3ζ의 관여가 밝혀졌다(도 8). 14-3-3ζ은 mdm2를 통해 변이형 p53을 분해하도록 작용한다. RPN2가 항진하고 있는 세포에서는 14-3-3ζ의 발현이 저하되어 있기 때문에, 변이형 p53의 안정화가 일어나고, E-카드헤린을 감소시키는 등, 전이에 관계된 EMT의 방향으로 세포를 운명지은 것으로 생각된다.
실시예 9
MM231-LN 세포를 동물에 이식하고, 형성된 종양을 핵을 특이적으로 염색하는 DAPI(청색), 항RPN2 항체(녹색), 항변이형 p53 항체(적색)를 사용하는 3색의 면역 조직 염색에 의해 조사하였다(도 9 좌측). RPN2 양성 세포와 변이형 p53 양성 세포는 일치하고 있었다. 또한, RPN2의 발현을 ABC법으로 염색하여 조사하였다(도 9 가운데). 도 9 가운데에서 짙게 염색되어 있는 RPN2 고발현 암 세포에 있어서, E-카드헤린의 발현이 감소되어 있었다(도 9 우측).
실시예 10
2개의 인간 유방암 환자의 유방암 조직을, 핵을 특이적으로 염색하는 DAPI(청색), 항RPN2 항체(녹색), 항변이형 p53 항체(적색)를 사용하는 3색의 형광 면역 염색에 의해 조사하였다. 조직은 원발소이며, 어느 쪽도 림프절 전이 양성이다. 어느 경우에도 RPN2 양성 세포와 변이형 p53 양성 세포는 일치하고 있었으며, 이것은 실시예 9에 있어서의 시험관 내의 결과를 뒷받침하는 것이다(도 10).
실시예 11
개의 자연 발증 유방암에 있어서의 RPN2 유전자에 대한 siRNA 투여에 의한 유방암 세포의 아포토시스 및 유방암 종양의 축소
개의 자연 발증 암 조직(유선암을 포함함)의 PCR 해석에 의해, 개의 유방암 조직에 있어서도 RPN2가 고발현하고 있는 경향이 보였다. 개 RPN2에 대한 siRNA를 설계하고, 핵산 이송 담체 수용액(핵산 이송 담체로서, 펩티드 계면 활성제를 포함하는 이송 담체(A6K: 특허 공개 2010-222338)를 최종 농도 0.5％로 사용함)와 혼합하고, siRNA-담체 복합체(최종 농도 1mg/mL)를 제조하였다.
개(골든 레트리버, 체중 약 40kg)의 자연 발증 유방암 종양에 상기한 siRNA-담체 복합체를 2일 간격으로 2번 국소적으로 투여하고, 최후의 투여로부터 3일째에 외과적으로 종양 조직을 절제하였다. 대조로서, 생리 식염수만, 담체(A6K)만을 투여하였다.
종양의 외관 크기는, siRNA-담체 복합체 투여 전에 긴 직경 36.3mm, 짧은 직경 17.1mm였던 것이 최후의 투여로부터 3일째에는 긴 직경 24.9mm, 짧은 직경 15.6mm가 되고, 종양 체적(GTV)으로서 43％의 축소가 보였다.
외과적 절제한 종양 조직의 절편 관찰 및 TUNEL 분석에 의해, siRNA-담체 복합체 투여에 의한 종양 세포의 아포토시스가 보이고, 투여 후의 조직에는 종양에 특징적인 구조가 보이지 않았다(도 11 우측). 한편, A6K만 투여에서는 종양 조직에 큰 변화는 보이지 않았다(도 11 좌측).
siRNA-담체 복합체 투여에 의해, RPN2의 mRNA가 약 50％ 녹다운되었다(도 12).
본 발명에 의해, RPN2 유전자를 표적으로 한 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료, 예방 및 진단을 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> National Cancer Center Research Institute 3-D Matrix, Ltd. <120> Method and composition for treatment, prevention and diagnosis of cancer comprising or derived from cancer stem cells <130> FP-3367 <160> 25 <210> 1 <211> 2509 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttccagcgtt gcgagacggt cggttccaag tgggcctggg cgcgggggag aggcgggtct 60 gtcctcggga actgcaaggc cctgtgagcg ggaggactgg gatcccggcc gcggctgctg 120 gaagcgtcga agctcagcgg gccgcggaca tgacctgtgc ttagaactca tcctggcccg 180 cagagcctgc cgcgagtccc tggcgtcccc tgtggcgggc tcttggagcc actttcccga 240 gcggaagtca gcccgcggct cggactccgg cgggacctgc tcggaggaat ggcgccgccg 300 ggttcaagca ctgtcttcct gttggccctg acaatcatag ccagcacctg ggctctgacg 360 cccactcact acctcaccaa gcatgacgtg gagagactaa aagcctcgct ggatcgccct 420 ttcacaaatt tggaatctgc cttctactcc atcgtgggac tcagcagcct tggtgctcag 480 gtgccagatg caaagaaagc atgtacctac atcagatcta accttgatcc cagcaatgtg 540 gattccctct tctacgctgc ccaggccagc caggccctct caggatgtga gatctctatt 600 tcaaatgaga 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Sequence <220> <223> Sense strand for sequence G <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for deoxythymidine (dT) <400> 14 ggugccagau gcaaagaaan n 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand for sequence G <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n stands for deoxythymidine (dT) <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n stands for deoxyguanosine (dG) <400> 15 uuucuuugca ucuggcaccn n 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand for sequence H <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for deoxythymidine (dT) <400> 16 ggccacuguu aaacuagaan n 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand for sequence H <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n stands for deoxythymidine (dT) <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n stands for deoxyguanosine (dG) <400> 17 uucuaguuua acaguggccn n 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA 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Claims (5)

  1. RPN2 조해제를 포함하는, 암 줄기세포를 포함하거나 또는 그것에서 유래하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 암 줄기세포가 변이형 p53 유전자를 갖는 의약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, RPN2 조해제가 RPN2 유전자에 대한 siRNA인 의약 조성물.
  4. RPN2의 발현의 유무 또는 레벨을 결정하는 것을 포함하는 암 줄기세포의 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 변이형 p53 유전자를 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
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