WO2012021042A2 - 대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법 및 이를 이용한 대장암 진단 방법 - Google Patents

대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법 및 이를 이용한 대장암 진단 방법 Download PDF

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Definitions

  • the mass values of the CRC diagnostic low mass ions are 86.1, 104.1, 105.1, 137.0, 169.0, 181.1, 316.2, 342.2, 344.3, 368.3, 370.3, 468.3, 482.3, 495.3, 510.3, 518.3, 519.3, 525.3 and 1465.6 m / It is preferably at least one selected from the group consisting of z.
  • step (B) comprises: (B1) normalizing the imported peak intensities; And (B2) scaling the normalized peak intensities. More preferably, said scaling is Pareto scaling.
  • FIG. 9 illustrates a distribution of discrimination scores of training set cases selected through a first loop of two loops for constructing a preliminary discrimination equation.

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Abstract

본 발명은 MALDI-TOF 질량분석기 등을 이용하여 생물학적 시료로부터 추출한 저질량 이온에 대해 생물통계학적 분석을 하여 대장암 진단을 위한 저질량 이온을 결정하고, 이를 이용하여 대장암 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 방법을 제시한다. 본 발명에 의해 분석 비용이 매우 낮으며, 분석 시간이 짧고, 대규모 분석이 가능하며, 판별 성능이 우수하고 강건한 진단 방법을 제공할 수 있다.

Description

대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법 및 이를 이용한 대장암 진단 방법
본 발명은 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 질량분석기 등을 이용하여 생물학적 시료로부터 추출한 저질량 이온(low mass ion)에 대해 생물통계학적 분석을 하여 대장암 진단을 위한 저질량 이온을 결정하고, 이를 이용하여 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
암은 세포가 무한히 증식해 정상적인 세포의 기능을 방해하는 질병으로, 폐암, 위암, 유방암(breast cancer, 이하 "BRC"), 대장암(colorectal cancer, 이하 "CRC") 등이 대표적이나, 실질적으로는 어느 조직에서나 발생할 수 있다. 초창기 암 진단은 암 세포의 성장에 따른 생체 조직의 외적 변화에 근거하였으나, 근래에 들어 혈액, 당쇄, DNA 등 생물의 조직 또는 세포에 존재하는 미량의 생체 분자를 이용한 진단 및 검출이 시도되고 있다. 그러나 가장 보편적으로 사용되는 암 진단 방법은 생체조직 검사를 통해 얻어진 조직 샘플을 이용하거나, 영상을 이용한 진단이다.
그 중 생체조직 검사는 환자에게 큰 고통을 야기하며, 고비용이 들뿐만 아니라, 진단까지 긴 시간이 소요되는 단점이 있다. 또한 환자가 실제 암에 걸린 경우, 생체조직 검사 과정 중 암의 전이가 유발될 수 있는 위험이 있으며, 생체조직 검사를 통해 조직 샘플을 얻을 수 없는 부위의 경우, 외과적인 수술을 통해 의심되는 조직의 적출이 이루어지기 전에는 질병의 진단이 불가능한 단점이 있다.
영상을 이용한 진단에서는 엑스레이 영상, 질병 표적 물질이 부착된 조영제를 사용하여 획득한 핵자기 공명 영상 등을 기반으로 암을 판정한다. 그러나, 이러한 영상 진단은 임상의 또는 판독의의 숙련도에 따라 오진의 가능성이 있으며, 영상을 얻는 기기의 정밀도에 크게 의존하는 단점이 있다. 더 나아가, 가장 정밀한 기기조차도 수 mm 이하의 종양은 검출이 불가능하여, 발병 초기 단계에서는 검출이 어려운 단점이 있다. 또한, 영상을 얻기 위해 환자 또는 질병 보유 가능자가 유전자의 돌연변이를 유발할 수 있는 고에너지의 전자기파에 노출되므로, 또 다른 질병을 야기할 수 있을 뿐만 아니라, 영상을 통한 진단 횟수에 제한이 있는 단점이 있다.
소화기 계통의 경우 통상적으로 내시경을 이용한 육안 영상 관찰을 통해 질병의 유무를 판단하나, 그 과정이 환자에게 무척 고통스러우며, 육안 영상 관찰을 통해 이상이 발견된 경우라 할지라도, 악성/양성 종양, 용종 등의 정확한 질병 판별을 위해서는 생체조직 검사가 필수적으로 수행되어야 한다.
특히 CRC는 세계적으로 발병률이 3위 이내인 흔한 암이며, 치료의 가능성이 암의 진행 단계(stage)에 크게 좌우되는 암이다. 즉, 조기 진단을 통해 초기 단계에서 발견되는 경우 매우 높은 완치율을 가진다. 따라서, 무엇보다 정확한 조기 진단이 중요한 질병이나, 암이 진행됨에 따라 동반되는 이상 징후가 미미하여 대부분 출혈에 의한 분변의 색깔 변화로 병을 인지하는 것이 보통이며, 환자 또는 질병 보유 가능자가 검사를 받는다 하더라도 대장 내시경을 통한 관찰이 통상적이며, 정확한 질병 판별을 위해서는 생체조직 검사가 필수적으로 수행되어야 한다. 요약하면, CRC의 경우 조기 진단이 중요하며, 대장 내시경 및 생체조직 검사는 많은 시간, 비용, 불편, 고통 등을 수반하므로, 불필요한 대장 내시경 및 생체조직 검사의 대상자 수를 획기적으로 줄일 수 있는 진단 방법이 필요하다.
따라서, 새로운 분자적 접근을 적용하여 초기 단계에서 CRC를 스크리닝할 수 있다면 환자들에게 매우 유용할 것이다. 제노믹스(genomics), 프로테오믹스(proteomics) 및 분자적 병리학은 임상적으로 잠재적인 가치를 지닌 여러 바이오 마커(biomarker) 후보들을 제공해 왔다. 암의 병기(stage) 및 환자별 맞춤 치료에 이들을 적극적으로 활용하는 것을 통해 치료 효과를 향상시킬 수 있을 것으로 사료되나, 임상 치료에 적용하기 위해서는 앞으로도 많은 연구가 선행되어야 한다.
최근의 CRC 스크리닝 검사는 대장 내시경을 사용하여 이상(gross abnormality) 여부를 판단하거나 분변에서 혈액을 탐지(fecal occult blood test, 이하 "FOBT")하는 것을 통해 수행된다. 대장 내시경은 CRC 스크리닝 검사에서 표준적인 방법으로 활용되어왔으나, 침습적이며, 수용 가능한 환자가 제한되어 있다. 따라서 최근에 많은 노력이 분변 검사에 집중되어 왔는데, 이는 비침습적이며, 장세척이 요구되지 않으며, 표본의 운반이 가능하기 때문이다. 분변 마커(marker)는 종양으로부터 새어 나오는 것, 분비되는 것, 또는 종양으로부터 박리되는 것으로 분류될 수 있다. 예를 들어 전통적인 FOBT에서 헤모글로빈은 CRC를 진단하기 위한 대규모 스크리닝 프로그램에서 새어 나오는 종류의 마커로 인식되어 왔으나, 이것을 포함하여 현재까지 알려진 마커들의 판별 능력은 만족스럽지 못하다.
한편, MALDI-TOF 질량분석기를 이용하면 혈액 내 질량 이온의 스펙트럼을 추출할 수 있다. 기존 단백질체 연구들에 이용된 질량 분석은 주로 800 내지 2500 m/z 질량값 범위를 분석 대상으로 하였는데, 그 범위가 단백질이 트립신으로 잘려졌을 경우 펩타이드의 질량값 영역이기 때문이다. 또한, MALDI-TOF 질량분석기를 이용하면 저질량 이온의 질량 스펙트럼도 추출할 수 있다. 그러나 약 800 m/z 이하의 저질량 대역은 분석 대상이 아닌 매트릭스(matrix)의 피크(peak)들이 혼재하는 영역이기 때문에 그동안 이 영역에 대한 연구가 활발하지는 않았다.
추출된 저질량 이온의 질량 스펙트럼은 종래의 소프트웨어 중 하나인 MarkerViewTM(version 1.2, 이하 버전 생략)에 의해 분석될 수 있다. 본 발명자들은 CRC 환자 및 비환자의 혈청으로부터 추출된 저질량 이온의 질량 스펙트럼을 MarkerViewTM를 이용하여 분석해 보았는데, 도 1을 참조하여 그 방법을 상세히 설명한다.
CRC 환자 133명과 비환자 153명으로 구성된 기본 집합으로부터 수집한 혈청을 시료로 하여 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 추출한 T2D 파일 형식의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 MarkerViewTM로 임포트하였다(11). 임포트 조건으로 표 1의 조건들을 사용하였다.
표 1
Mass tolerance 100 ppm
Minimum required response 10.0
Maximum number of peaks 10000
다음, 임포트한 피크 강도(intensity)들을 정규화(normalization)하였다(12). MarkerViewTM에는 다수의 정규화 방법이 존재하는데, "Normalization Using Total Area Sums" 방법을 사용하여 정규화를 수행하였다. 이 방법에서는 각 시료별 강도의 소계를 구하고, 시료별 소계들의 평균을 구한 후, 각 시료별 강도의 소계가 이 평균과 일치하도록 각 피크 강도에 시료별 배율 인자(scaling factor)를 곱한다. 즉, 이와 같이 정규화한 후에는 각 시료별 강도의 소계가 동일해진다.
다음, 정규화한 피크 강도들을 파레토 스케일링(Pareto scaling)하였다(13). 즉, 정규화한 각 피크 강도에서 질량값별 평균값을 뺀 후 표준편차의 제곱근으로 나누어 피크 강도들을 파레토 스케일링하였다.
다음, 파레토 스케일링한 피크 강도들에 대해 주성분 분석 기반 선형 판별 분석(principal component analysis-based linear discriminant analysis, PCA-DA)을 수행하여 판별 점수(discriminant score, DS)를 계산하였다(14). 즉, 두 단계로 주성분 분석을 수행하여 각 피크별 가중치(weighting factor)인 인자적재값(factor loading)을 구하고, 파레토 스케일링된 강도에 이 인자적재값을 곱한 후 더하여 각 시료별 판별 점수를 계산하였다. 표 1의 임포트 조건에서 피크의 최대 개수를 10000개로 하였고, 충분히 많은 시료들을 함께 임포트하였으므로, 본 계산에서 인자적재값은 10000개가 계산되었으며, 따라서 10000개의 항을 더하여 한 개의 판별 점수가 계산되었다.
다음, 계산된 판별 점수가 양수인지 여부를 판단하여(15), 양수인 경우 양성으로(16), 음수인 경우 음성으로 판정하였다(17). 즉, CRC에 적용되어 양수인 경우 환자로, 음수인 경우 비환자로 판정하였다.
도 2는 이미 임상적으로 판정된 CRC 환자 133명과 비환자 153명으로 구성된 기본 집합에 대해 도 1의 방법으로 계산한 판별 점수의 분포를 나타낸다. 판별 점수에 따른 판정 결과는 혼동 행렬(confusion matrix)로 요약하여 표현할 수 있는데, 본 명세서에서 기재되는 혼동 행렬의 양식은 표 2의 우하단 3행 3렬로 규정한다.
표 2
임상적 확인 결과
환자 비환자
PCA-DA예측 결과 환자 진양성 (TP) 위양성 (FP) 양성예측도 (PPV)
비환자 위음성 (FN) 진음성 (TN) 음성예측도 (NPV)
민감도 특이도
즉, 혼동 행렬은 기본적으로 진양성(true positive, TP), 위양성(false positive, FP), 위음성(false negative, FN), 진음성(true negative, TN) 사례들의 개수로 구성되나, 분석의 편의를 위해 이에 추가하여 민감도(sensitivity), 특이도(specificity), 양성예측도(positive predictive value, PPV), 음성예측도(negative predictive value, NPV)를 함께 표기하고자 한다. 도 2에 나타낸 판별 점수에 따른 판정 결과를 혼동 행렬을 이용하여 정리하면 표 3과 같다.
표 3
131 2 98.5%
2 151 98.7%
98.5 % 98.7%
도 2 및 표 3을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 종래 기술인 MarkerViewTM의 주성분 분석 기반 선형 판별 분석 방법을 통하여 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도 모두 98% 이상인 매우 우수한 판별 결과를 얻을 수 있었다.
그러나 이를 임상에서 사용할 수 있으려면 식의 강건성(robustness)이 반드시 먼저 검증되어야 한다. 즉, 이미 한 번 측정했고 판별식을 구성했던 기본 집합에 대하여 추가적으로 수회 반복 측정한 질량 스펙트럼들에 대해서도 여전히 좋은 판별 결과를 나타내어야 하며, 판별식을 구성할 때 고려하지 않았던 새로운 CRC 환자 및 비환자 집합에 대해서도 동일한 판별식으로 좋은 판별 결과를 얻을 수 있어야 한다. 질량 스펙트럼을 반복 측정하는 과정에는 혈청을 얼리고 녹이는 과정이 포함되거나, 혈청을 새로 메탄올/클로로포름과 혼합하여 추출하는 과정이 포함되기도 한다. 이와 같은 과정들은 질량 스펙트럼에 대한 통계 분석에 있어서 외란들(disturbances)로 볼 수 있는데, 이러한 외란들에 둔감한 판별식을 구성해야만 임상에 적용될 수 있다.
요컨대, 도 1, 2 및 표 1, 2, 3을 참조하여 설명한 종래의 주성분 분석 기반 선형 판별 분석 방법은 특정 시료들로 구성된 집합에 개별적으로 적용되는 경우에는, 즉 개별 훈련 집합에 대한 판별에서는 매우 우수한 판별 결과를 나타내기도 하나, 검증 집합에서의 판별 결과는 만족스럽지 않았다(표7). 훈련 집합에 대해서는 매우 우수한 판별 결과를 보임에도 불구하고 판별식이 강건성을 갖지 못한 이유는 판별식을 구성하고 있는 10000개의 피크들 중 상당한 개수의 피크들이 환자 및 비환자 판별을 위해서는 최소한 불필요하며, 때로는 훈련 집합의 판별에서는 문제를 일으키지 않았으나 검증 집합의 판별에서는 잠재적으로 판별 결과를 혼동시킬 수 있는 피크들을 포함하고 있기 때문으로 추정된다. 따라서 이와 같이 최소한 불필요하며, 또는 잠재적으로 판별 결과에 혼동을 줄 수 있는 피크들을 적극적으로 제거하는 과정을 통해 우수하며 강건한 판별 결과를 얻기 위해 필수 불가결한 피크들만을 찾아내는 작업이 필요할 것으로 사료된다.
본 발명에서는, CRC 환자 및 비환자 시료에 대해 강건한 판별 결과를 주는 판별식을 제안하고자 한다. 즉, 판별식을 도출하였던 CRC 환자 및 비환자 집합에 대해 추가로 수회 반복 측정한 질량 스펙트럼과 새로운 CRC 환자 및 비환자 집합에 대해 수회 반복 측정한 질량 스펙트럼 모두에 대해 80% 이상의 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도를 나타내는 판별식을 제안하고, 이를 구성하는 저질량 이온들을 결정하는 방법을 제안하고자 한다.
또한, 이렇게 결정된 저질량 이온들 및 그 판별식으로써 CRC를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제안하고자 한다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 CRC 진단용 저질량 이온을 결정하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, (a) 다수의 케이스들의 생물학적 시료로부터 측정한 저질량 이온의 피크 강도들을 정렬하여 획득하는 단계; (b) 상기 획득된 피크 강도들에 대해 생물통계학적 분석을 수행하는 단계; (c) 상기 생물통계학적 분석 결과로부터 상기 다수의 케이스들 중 소정의 케이스들을 훈련 집합으로 선택하는 단계; 및 (d) 상기 소정의 훈련 집합 케이스들에 대해 생물통계학적 분석을 다시 수행하여 최종적으로 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, CRC 진단용 저질량 이온 결정 방법을 제공한다.
또한, 상기 (d) 단계는, (d1) 상기 피크들 중, 상기 피크 강도와 상기 피크별 인자적재값의 곱의 절댓값이 T1보다 큰 피크들을 케이스별로 일차적으로 선택하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. CRC를 대상으로 한 경우 상기 T1은 0.1인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 (d) 단계는, (d2) 상기 케이스별로 일차적으로 선택한 피크들 중, 상기 훈련 집합 케이스들의 T2 퍼센트 이상의 케이스들에서 공통으로 나타나는 피크들을 이차적으로 선택하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 T2는 50인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 (d) 단계는, (d1) 상기 피크들 중, 상기 피크 강도와 상기 피크별 인자적재값의 곱의 절댓값이 T1보다 큰 피크들을 케이스별로 일차적으로 선택하는 단계; 및 (d2) 상기 케이스별로 일차적으로 선택한 피크들 중, 상기 훈련 집합 케이스들의 T2 퍼센트 이상의 케이스들에서 공통으로 나타나는 피크들을 이차적으로 선택하는 단계를 포함하며, 상기 (d2) 단계 이후, 상기 (d2) 단계에서 선택한 피크들만으로 판별 점수를 계산하고, 상기 계산된 판별 점수에 따라 민감도 및 특이도를 계산하고, 그리고 상기 계산된 민감도가 N3보다 작거나 또는 상기 계산된 특이도가 N4보다 작은 경우 상기 T1 및 상기 T2를 변경하여 상기 (d1) 및 상기 (d2) 단계를 반복하는 것이 바람직하다. 상기 N3 및 상기 N4는 0.9인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 (d) 단계는, (d3) 상기 (d2) 단계에서 선택한 피크들 중 소정의 피크들을 선택하여 검증 집합 케이스들에 대한 판별 점수를 계산하고, 상기 계산된 판별 점수에 따라 민감도 및 특이도를 계산하고, 그리고 상기 계산된 민감도가 N5보다 작거나 또는 상기 계산된 특이도가 N6보다 작은 경우 상기 소정의 피크들과 동일하지 않은 새로운 소정의 피크들을 다시 선택하여 검증 집합의 케이스들에 대한 판별 성능을 개선하는 과정을 반복하여 상기 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값을 최종적으로 선택하는 단계를 더 포함하는 것이 보다 바람직하다. 상기 N5 및 상기 N6는 0.8인 것이 보다 바람직하다.
상기 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값은, 86.1, 104.1, 105.1, 137.0, 169.0, 181.1, 316.2, 342.2, 344.3, 368.3, 370.3, 468.3, 482.3, 495.3, 510.3, 518.3, 519.3, 525.3 및 1465.6 m/z로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 CRC 진단용 저질량 이온들은 19개이며, 그리고 상기 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값은, 86.1, 104.1, 105.1, 137.0, 169.0, 181.1, 316.2, 342.2, 344.3, 368.3, 370.3, 468.3, 482.3, 495.3, 510.3, 518.3, 519.3, 525.3 및 1465.6 m/z인 것이 보다 바람직하다.
여기에서, 상기 CRC 진단용 저질량 이온들은 피브리노겐(fibrinogen) 또는 피브리노겐 알파 체인(alpha chain)인 저질량 이온들을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 CRC 질병 진단용 저질량 이온들은 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate, PEP)인 저질량 이온들을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (c) 단계는, (c1) 상기 계산된 판별 점수에 따라 민감도 및 특이도를 계산하는 단계; (c2) 상기 민감도가 N1보다 작거나 또는 상기 특이도가 N2보다 작은 경우 위양성 또는 위음성 케이스들을 상기 다수의 케이스들에서 제외하여 상기 (a) 내지 상기 (b) 단계를 반복하는 단계; 및 (c3) 상기 민감도가 N1보다 크거나 같으며 그리고 상기 특이도가 N2보다 크거나 같은 경우 상기 케이스들을 상기 소정의 훈련 집합 케이스들로 선택하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 N1 및 상기 N2는 1인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 (a) 단계는, (a1) 상기 다수의 케이스들의 생물학적 시료로부터 획득한 저질량 이온 질량 스펙트럼을 정렬하여 임포트하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (b) 단계는, (b1) 상기 임포트한 피크 강도들을 정규화하는 단계; (b2) 상기 정규화한 피크 강도들을 스케일링(scaling)하는 단계; 및 (b3) 상기 스케일링한 피크 강도들에 대해 생물통계학적 분석을 수행하여 상기 판별 점수를 계산하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 스케일링은 파레토 스케일링인 것이 보다 바람직하다. 상기 생물통계학적 분석은 주성분 분석 기반 선형 판별 분석인 것이 보다 바람직하다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 전술한 CRC 진단용 저질량 이온들을 선정하는 방법에 따라 결정된 상기 CRC 진단용 저질량 이온들을 사용하는 것을 특징으로 하는 CRC 진단을 위한 정보를 생성하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, (A) 판별 대상 시료의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 상기 훈련 집합에 정렬하여 획득하는 단계; (B) 상기 획득한 피크 강도들을 정규화하고 스케일링하는 단계; (C) 상기 정규화하고 스케일링한 CRC 진단용 저질량 이온들의 피크 강도와 피크별 인자적재값을 통해 판별 점수를 계산하는 단계; 및 (D) 상기 계산된 판별 점수에 따라 CRC 여부를 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, CRC 진단을 위한 정보를 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 (A) 단계는, (A1) 판별 대상 시료의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 훈련 집합에 정렬하여 임포트하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (B) 단계는, (B1) 상기 임포트한 피크 강도들을 정규화하는 단계; 및 (B2) 상기 정규화한 피크 강도들을 스케일링하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 스케일링은 파레토 스케일링인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 (C) 단계는, (C1) 상기 판별 대상 시료에 대해 상기 정규화하고 스케일링한 CRC 진단용 저질량 이온들의 피크 강도와 훈련 집합에 대한 주성분 분석 기반 선형 판별 분석에 의해 획득한 피크별 인자적재값으로부터 상기 판별 점수를 계산하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (D) 단계는, (D1) 상기 판별 점수가 S보다 큰 경우 양성으로 판정하고, S보다 작은 경우 음성으로 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. CRC를 대상으로 한 경우 상기 S는 0 또는 5.5인 것이 바람직하다.
또한, 상기 (D) 단계는, (D1') 상기 판별 점수가 S1 이상인 경우 양성 판정, S2 이하인 경우 음성 판정, 그리고 S2 초과 내지 S1 미만인 경우 보류 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. CRC를 대상으로 한 경우 상기 S1은 10, 그리고 상기 S2는 -10인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 (D) 단계는, (D2') 상기 보류 판정된 대상을 층화 분석(stratified analysis)하여 재판정하는 단계를 더 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명은 전술한 CRC 진단용 저질량 이온 결정 방법을 수행하거나 CRC 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는 연산 장치를 제공한다.
또한, 전술한 CRC 진단용 저질량 이온 결정 방법은 CRC 환자 및 비환자 집합을 예를 들어 CRC 초기 환자 및 말기 환자 집합으로 변경하는 경우 CRC 진행 예측용 저질량 이온 결정 방법으로 쉽게 전환될 수 있으므로, 본 발명은 CRC 진행 예측용 저질량 이온들을 사용하는 것을 특징으로 하는, 환자 개개인의 CRC 진행을 예측하기 위한 정보를 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 전술한 CRC 진단용 저질량 이온 결정 방법은 CRC 환자 및 비환자 집합을 예를 들어 치료 반응 환자 및 무반응 환자 집합으로 변경하는 경우 치료 반응성 예측용 저질량 이온 결정 방법으로 쉽게 전환될 수 있으므로, 본 발명은 치료 반응성 예측용 저질량 이온들을 사용하는 것을 특징으로 하는, 환자 개개인의 특정 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 CRC 진단용 저질량 이온 결정 방법 및 이를 이용한 CRC 진단 방법은, 분석 비용이 매우 낮으며, 분석 시간이 짧고, 대규모 분석이 가능하다는 장점이 있다. 예를 들어, 혈액의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 측정하고, 그 중 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값에 대응하는 피크 강도들을 추출하여 간단한 계산을 거치면 바로 CRC 여부를 판정할 수 있다.
또한, 판별 성능이 우수하고 강건하며, CRC를 대상으로 한 경우 훈련 집합뿐 아니라 검증 집합의 판별에서도 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성 예측도가 모두 80% 이상임을 확인하였다.
또한, CRC 진단용 저질량 이온 결정 방법은 CRC 환자 및 비환자 집합을 예를 들어 CRC 초기 환자 및 말기 환자 집합으로, 또는 치료 반응 환자 및 무반응 환자 집합으로 변경하는 것을 통해 환자 개개인의 CRC의 진행 정도를 모니터링하거나, 환자 개개인의 특정 치료에 대한 효과를 예측하는 방법으로 쉽게 전환될 수 있다.
또한, CRC를 대상으로 한 경우 분변을 분석 시료로 하는 FOBT와 비교하면, 혈액을 분석 시료로 사용할 수 있으므로 다른 검사와 더불어 분석할 수 있어, 종래의 기술에 비하여 편리하고 신속한 CRC 진단이 가능하다. CRC 진단용 저질량 이온들을 사용하는 경우 판정을 가르는 판별 점수인 절단값(cut-off value) S를 0에서 5.5로 조정하는 것을 통해 기존 FOBT의 판별 성능에 필적하는 성능을 나타냄을 확인하였다.
도 1 내지 2는 배경 기술을 설명하기 위한 도면이다.
도 1은, 종래 기술에 따라 저질량 이온 질량 스펙트럼을 사용하여 CRC를 판정하는 과정을 설명하는 순서도이다.
도 2는, 종래 기술에 따라 CRC 환자 133명과 비환자 153명으로 구성된 기본 집합을 판정한 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 3f 내지 23은 본 발명을 설명하기 위한 도면이다.
도 3a 내지 3f은, 기본 집합의 CRC 환자들에 대한 정보를 나타낸다.
도 4a 내지 4c는, 기본 집합의 CRC 비환자들에 대한 정보를 나타낸다.
도 5a 내지 5f는, 검증 집합 B의 CRC 환자들에 대한 정보를 나타낸다.
도 6a 내지 6b은, 검증 집합 B의 CRC 비환자들에 대한 정보를 나타낸다.
도 7은, 검증 집합 B의 CRC 환자 중 직장암 환자들에 대한 정보를 나타낸다.
도 8는, 본 발명에 따른 예비 판별식을 구성하는 과정을 설명하는 순서도이다.
도 9은, 예비 판별식을 구성하기 위한 두 개의 루프 중 첫 번째 루프를 통하여 선정한 훈련 집합 케이스들의 판별 점수의 분포를 나타낸다.
도 10은, 예비 판별식에 따라 훈련 집합을 판정한 결과를 나타낸다.
도 11는, 검증 시료에 판별식을 적용하는 과정을 설명하는 순서도이다.
도 12은, 예비 판별식에 따라 기본 집합을 판정한 결과를 나타낸다.
도 13는, 본 발명에 따른 최종 판별식을 구성하는 과정을 설명하는 순서도이다.
도 14a 내지 14c는, 본 발명에 따른 방법에 의하여 결정된 CRC 진단용 저질량 이온들의 피크 강도를 나타낸다.
도 15은, 검증 집합 A의 5회 반복 측정한 질량 스펙트럼들에 대해 본 발명의 최종 판별식에 따라 판별 점수를 계산한 후 반복 측정한 집합별로 각각 판정한 결과를 나타낸다.
도 16은, 검증 집합 A의 5회 반복 측정한 질량 스펙트럼들에 대해 본 발명의 최종 판별식에 따라 판별 점수를 계산한 후 평균 판별 점수(mean DS)를 구하여 판정한 결과를 나타낸다.
도 17은, 본 발명의 최종 판별식에 따라 평균 판별 점수를 계산하여 5회 반복 측정한 검증 집합 B를 판정한 결과를 나타낸다.
도 18a 내지 18b은, 본 발명에 따른 방법에 의하여 결정된 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값 중 169.0 m/z을 동정한 결과를 나타낸다.
도 19a 내지 19c은, 본 발명에 따른 방법에 의하여 결정된 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값 중 1465.6 m/z을 동정한 결과를 나타낸다.
도 20는, 최종 판별식에 의해 계산된 평균 판별 점수와 병리학적 파라미터의 관계를 나타낸다.
도 21a 내지 21b은, 절단값(S)을 5.5로 하여 본 발명의 최종 판별식에 따라 검증 집합 A와 B를 판정한 결과를 나타낸다.
1. 용어의 정의
본 발명에서, "생물학적 시료"는 전혈, 혈청, 혈장, 요, 분변, 객담, 타액, 조직, 세포, 세포 추출물, 체외 세포 배양물 등과 같은 시료들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아래에 기술되는 실시 예에서는 CRC 환자 또는 비환자의 혈청을 생물학적 시료로 사용하였다.
본 발명에서, "강도"는 MALDI-TOF 질량분석기로부터 얻어지는 값을 말하며, 피크에 해당하는 질량 이온의 양과 상관 관계를 가진다.
본 발명에서, "정규화"는 데이터의 범위를 일치시키거나 분포를 유사하게 만들어 주는 것을 말하며, 평균값, 중간값 등을 이용하여 정규화할 수 있으나 이에 제한되지 않고, 경우에 따라 다양한 공지의 방법들이 적용될 수 있다. 본 실시 예에서는 각 시료별 강도의 소계를 구하고, 시료별 소계들의 평균을 구한 후, 각 시료별 강도의 소계가 이 평균과 일치하도록 각 피크 강도에 시료별 배율 인자를 곱하는 방식으로 정규화하였다. 즉, 이와 같이 정규화한 후에는 각 시료별 강도의 소계가 동일해진다.
본 발명에서, "파레토 스케일링"은 정규화한 각 피크 강도에서 질량값별 평균값을 뺀 후 표준편차의 제곱근으로 나누는 것을 말한다. 보다 일반적인 스케일링 방법인 오토스케일링(autoscaling)에서는 표준편차로 나누는 것을 통해 데이터의 크기 정보를 완전히 상쇄시키는 것에 비해, 파레토 스케일링에서는 데이터의 크기 정보를 부분적으로 유지하는 것을 통해 노이즈(noise)의 증폭을 피할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에서, "가중치"는 가중치를 곱한 후의 데이터의 수치적 크기가 통계적 관점에서의 중요성에 비례하도록 조정하는 인자를 말하는데, 아래에 기술되는 실시 예에서 주성분 분석 기반 선형 판별 분석 결과 획득한 피크별 인자적재값을 가중치의 일례라 할 수 있다.
본 발명에서, "저질량 이온"은 MALDI-TOF 질량분석기 등을 이용하여 획득한 질량값이 1500 m/z보다 작은 이온을 의미한다.
본 발명에서, MALDI-TOF 질량분석기에 의해 측정된 질량값은 "±0.1 m/z"의 오차 범위를 포함한다. 다양한 실험 환경에 따라 질량값 측정치에 다소의 오차가 발생할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 청구범위에 기재된 86.1 m/z의 질량값은 실제로 86.0 m/z 내지 86.2 m/z의 범위를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 실험 환경에 따라 오차 범위는 "±0.5 m/z"일 수 있다.
본 발명에서, MALDI-TOF 질량분석기에 의해 측정된 질량값은 MALDI-TOF 질량분석기의 포지티브 모드(positive mode)에서 획득된 질량값임에 유의한다.
본 발명에서, 가중치 벡터(vector)의 부호는 판별 점수가 양수인 경우 양성으로 판정되고 음수인 경우 음성으로 판정되도록 조정한다. 주성분 분석에서의 인자적재값 벡터는 수학적으로 고유 벡터(eigenvector)에 해당하는데, 이 벡터의 부호는 임의로 정할 수 있다. 즉, 계산된 피크별 인자적재값에 전체적으로 -1을 곱하여 부호를 변경한다고 하여도 수학적으로는 동일한 고유치 문제(eigenvalue problem)에 대한 동등한 해라고 할 수 있으나, 판별 점수가 음수인 경우를 양성으로 양수인 경우를 음성으로 판별하게 된다. 본 발명에서는 판별 점수가 양수인 경우 양성으로 판정되고 음수인 경우 음성으로 판정되도록 고유 벡터의 부호를 조정하였으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지 않음에 유의한다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 기술되는 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위가 실시 예에 한정되는 것은 아님을 밝혀둔다.
2. 실시 예
(1) 시료 준비 - 혈청 수집 대상
133명의 CRC 환자 및 153명의 CRC 비환자로부터 혈청을 수집하였다. 배경 기술에서 설명한 대상과 동일하다. 이 286명의 혈청으로부터 한 번 측정한 질량 스펙트럼들을 “기본 집합”으로 하여 후술하는 바와 같이 그 부분 집합으로 훈련 집합을 구성하였으며, 이 훈련 집합에 대한 생물통계학적 분석을 통해 예비 판별식을 획득하였다. 또한 이 286명의 혈청에 대해 추가로 5회 반복 측정한 질량 스펙트럼들을 "검증 집합 A"로 하여 판별식 후보들의 강건성을 판단하였다. 본 집합의 CRC 환자들에 대한 정보가 도 3a 내지 3f에 나타나며, 본 집합의 CRC 비환자들에 대한 정보가 도 4a 내지 4c에 나타난다.
또한, 기본 집합과 독립된 새로운 144명의 CRC 환자 및 100명의 CRC 비환자로부터 혈청을 수집하였다. 이하에서 이를 "검증 집합 B"라 지칭한다. 본 집합의 CRC 환자들에 대한 정보가 도 5a 내지 5f에 나타나며, 본 집합의 CRC 비환자들에 대한 정보가 도 6a 내지 6b에 나타난다.
검증 집합 B의 CRC 환자들 중에서, 44명은 국소적으로 발전된 직장암(locally advanced rectal cancer, LARC) 환자들로서, 이들의 혈청은 CRT(chemoradiotherapy) 시작 전에 수집되었다. 이 환자들은 7일 동안 50.4 GY / 28 FX의 방사선 치료와 테가풀(tegafur) / 우라실(uracil) 400mg/m2/day와 류코보린(leucovorin) 90mg/day의 약물 치료를 함께 받았다. 도 7은 종양 회귀 등급(tumor regression grade)을 보여주고 있는데, 이 정보들로부터 치료 반응 환자와 무반응 환자 집합을 구성하면, 본 발명은 환자 개개인의 특정 치료 반응성을 예측하기 위한 저질량 이온들을 결정하고, 이 치료 반응성 예측용 저질량 이온들을 이용하여 환자 개개인의 특정 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법으로 전환될 수 있다.
검증 집합 A, B의 총 253명의 CRC 비환자들은 한국 국립암센터의 건강 검진 프로그램에 참여한 지원자들이다. 진단 및 질병의 단계와 범위의 판정을 위하여, 모든 CRC 환자들은 생체조직 검사와 대장 내시경 검사, 복부와 골반의 CT(computed tomography) 스캔과 같은 검사를 수행하였다. FDGPET(F-18 deoxyfluoroglucose positron emission tomography)는 필요할 때 수행하였다.
(2) 시료 준비 - 혈청 준비 및 질량 스펙트럼 측정
4배 부피의 메탄올/클로로포름(2:1, V/V)을 25㎕의 혈청과 함께 격렬하게 섞은 후에 10분 동안 실온에서 배양하였다. 혼합물은 4℃에서 10분 동안 6000 ×g로 원심 분리하였다. 수득한 상청액을 1시간 동안 농축기(concentrator)에서 완전히 건조시켰으며, 30분 동안 교반기(vortexer)에서 30㎕의 50% 아세토니트릴 (acetonitrile)/0.1% 트라이플루오린화 아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)으로 용해시켰다.
메탄올/클로로포름 추출물을 50% 아세토니트릴 /0.1% TFA 내에서 알파-시아노-4-하이드록시 시남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 용액과 혼합하였으며(1:12, v/v), 1㎕의 혼합물을 MALDI-target에 위치시켰다. 환자 및 비환자 혈청 추출물의 질량 스펙트럼을 Proteomics Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 한 개의 시료에 대해 질량 스펙트럼 데이터는 20번 반복 측정된 스펙트럼의 평균으로 추출된다. 모든 개별 시료의 질량값 구간은 최대 질량값이 약 2500 m/z이 되도록 조정하였다. 실험적 오류를 최소화하기 위하여, 초점 질량(focus mass), 레이저 강도(laser intensity), 타깃 플레이트(target plate), 데이터 수집 시각(data acquisition time)을 포함하는 다양한 요소를 점검하였다. 바람직한 초점 질량 및 레이저 강도로 500 m/z 및 5000이 각각 고정되어 사용되었다. 검증 집합의 시료들은 고정된 초점 질량 및 레이저 강도와 함께, 다른 타깃 및 다른 데이터 수집 시각 하에서 5번 반복 측정하였다.
이러한 과정을 통해, MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 혈청 시료로부터 저질량 이온 질량 스펙트럼을 추출하였다.
(3) 예비 판별식의 구성
배경 기술에서 설명한 종래 기술에서는 주성분 분석 기반 선형 판별 분석에서 고려한 모든 피크들을 사용하여 판별 점수를 계산한 후 그 판별 점수에 따라 CRC 환자 여부를 판정하였으나, 본 발명에서는 강건한 판별 성능을 나타내는 판별식을 도출하기 위해 우선 판별 점수에 큰 기여를 하는 피크들만 사용하는 예비 판별식을 구성하였다. "예비 판별식"이란 본 발명에 따라 최종적으로 구하고자 하는 판별식을 도출하는 중간 단계로서의 판별식을 지칭하며, 이를 구성하는 저질량 이온들은 최종 판별식을 구성할 CRC 진단용 저질량 이온들의 "예비 후보군"이 된다.
도 8를 참조하여 예비 판별식을 구성하는 방법에 대하여 설명한다. 예비 판별식을 구성하는 과정은 크게 두 개의 루프, 즉 111 내지 117 단계의 첫 번째 루프와 118 내지 122 단계의 두 번째 루프로 이루어진다.
먼저, 첫 번째 루프를 통해, 민감도와 특이도의 값이 소정의 값을 갖는 훈련 집합을 선택하였다. 본 실시 예에서 소정의 값은 100%였다.
도 8의 111 내지 114 단계들은 배경 기술에서 설명한 바와 동일하다. 즉, 기본 집합 내 다수의 케이스들의 저질량 이온 질량 스펙트럼들을 정렬하여 임포트하였고(111), 임포트한 피크 강도들을 정규화하였고(112), 정규화한 피크 강도들을 파레토 스케일링하였고(113), 파레토 스케일링한 피크 강도들에 대해 생물통계학적 분석을 수행하여 판별 점수를 계산하였다(114). 다양한 생물통계학적 분석 방법 중 어느 하나를 선택하여 판별 점수를 계산할 수 있으나, 본 실시 예에서는 주성분 분석 기반 선형 판별 분석을 수행하였다. 판별 점수를 통하여 민감도 및 특이도를 계산하였으며(115), 그 결과는 전술한 도 2 및 표 3과 같다.
도 2 및 표 3에 나타낸 판별 결과가 매우 우수하기는 하나 민감도와 특이도가 모두 100%는 아니다. 따라서, 민감도의 문턱값 N1과 특이도의 문턱값 N2를 설정하여(116), 민감도 또는 특이도가 각각의 문턱값보다 작은 경우 위양성 또는 위음성 케이스들을 제외하였다(117). 본 실시 예에서는 민감도의 문턱값 N1과 특이도의 문턱값 N2를 모두 1로 설정함으로써 민감도와 특이도가 모두 100%인 훈련 집합을 찾았다. 표 3에 나타난 위양성인 두 케이스와 위음성인 두 케이스를 모두 배제하고, 배제한 집합에 대하여 다시 111 내지 115 단계를 수행하였다. 배제한 집합에 대하여 111 내지 115 단계를 다시 수행하여도 바로 민감도 및 특이도가 100%가 되지는 않았으며, 111 내지 117 단계를 수회 반복함으로써 비로소 민감도와 특이도가 모두 100%인 훈련 집합을 찾을 수 있었다. 도 9 및 표 4는 그 결과를 나타낸다.
표 4
125 0 100%
0 144 100%
100% 100%
다음, 두 번째 루프를 통해, 10000개의 피크들 중 판별 점수에 큰 영향을 미치는 소정의 피크들을 선정하였다. 본 실시 예에서 선정된 소정의 피크들의 개수는 278개였다.
표 1과 함께 전술한 바와 같이 임포트 조건에서 피크의 최대 개수를 10000개로 하였고 충분히 많은 시료들을 함께 임포트하였으므로, MarkerViewTM의 주성분 분석 기반 선형 판별 분석 방법을 통해 구성한 판별식은 10000개의 항으로 이루어져 있다. 그러나, CRC 환자 및 비환자를 구분함에 있어 10000개의 항이 모두 동등한 중요성을 가지지는 않을 것이므로, 두 번째 루프의 절차에 따라 10000개의 피크들 중 판별 점수에 큰 영향을 미치는 피크들을 두 단계에 걸쳐 선정하였다. 이 단계는 10000개의 피크들 중 CRC 환자 및 비환자를 구분함에 있어 불필요한 피크들을 제거하는 과정이라 할 수 있다.
10000개 항의 값들 중에서 피크 강도와 피크별 인자적재값의 곱의 절댓값이 문턱값 T1보다 큰 피크들을 케이스별로 일차적으로 선택하였다(118). 본 실시 예에서 문턱값 T1은 0.1이었다.
다음, 케이스별로 일차적으로 선택한 피크들 중에서 훈련 집합 케이스들 중 문턱값 T2 퍼센트 이상의 케이스들에서 공통으로 나타나는 피크들을 이차적으로 선택하였다(119). 본 실시 예에서 문턱값 T2는 50이었다. 즉, 훈련 집합인 269개 케이스들 중 최소 135개 이상의 케이스들에서 공통으로 등장하는 피크들로만 예비 판별식을 구성하였다.
상기와 같은 과정을 통하여 선택한 피크들만으로 다시 판별 점수를 계산하고 이에 따라 민감도 및 특이도를 계산하였다(120). 다시, 민감도의 문턱값 N3와 특이도의 문턱값 N4를 설정하여(121), 민감도 또는 특이도가 각각의 문턱값보다 작은 경우 118 단계에서 사용된 문턱값 T1 또는 119 단계에서 사용된 문턱값 T2를 변경하여(122) 118 내지 121 단계를 반복하였다. 본 실시 예에서는 민감도의 문턱값 N3와 특이도의 문턱값 N4가 각각 0.9였다.
이와 같은 단계들을 거쳐 선택한 피크들로 CRC 진단용 저질량 이온의 예비 후보군을 구성하였는데(123), 본 실시 예에서는 10000개의 피크들 중 278개의 피크들이 선택되었다. 도 10 및 표 5는 전술한 훈련 집합에 대하여 예비 판별식으로 판정한 결과를 나타낸다. 전체 피크의 3%도 되지 않는 피크들만으로 계산한 결과임에도 불구하고, 전체 피크를 사용한 경우인 표4의 판별 성능에 필적할 만한 우수한 판별 결과를 보임을 확인할 수 있으며, 이로부터 CRC 환자 및 비환자를 구분함에 있어 10000개의 피크가 모두 필요한 것이 아니라는 것을 확인할 수 있다.
표 5
124 3 97.6%
1 141 99.3%
99.2% 98.0%
(4) 예비 판별식의 적용
구성한 판별식을 판별 대상 시료에 적용하는 과정을 설명하면 다음과 같다. 우선 MarkerViewTM에는 이와 유사한 목적으로 사용할 수 있는 기능이 있다. 즉, 함께 임포트한 시료 데이터 중에서 일부 시료들만을 대상으로 하여 주성분 분석 기반 선형 판별 분석을 적용할 수 있으며, 이렇게 구성한 판별식으로 나머지 시료들을 판별할 수 있다. 이 기능을 이용하면 훈련 집합과 판별 대상 시료를 함께 임포트한 후 훈련 집합만을 선택해서 주성분 분석 기반 선형 판별 분석을 수행하여 판별 대상 시료가 어떻게 판정되는지 알 수 있다.
그러나, MarkerViewTM의 임포트 과정에서 피크들을 정렬하는 기능(peak alignment)이 수행되는데, 훈련 집합에 맞추어 판별 대상 시료의 피크들을 정렬하는 기능이 없기 때문에, 훈련 집합만을 임포트하였을 때의 피크 표(peak table, m/z 열과 시료별 강도 열로 이루어진 행렬)와, 훈련 집합과 판별 대상 시료를 함께 임포트하였을 때 생성되는 피크 표의 훈련 집합 부분은 동일하지 않다. 강도 행렬 부분도 다르며, 동일한 강도 행에 대응하는 m/z 값도 항상 동일하게 나타나지는 않는다. 따라서, 훈련 집합에서 만든 판별식을 판별 대상 시료에 적용하여 판별 점수를 계산하기 위해서는 훈련 집합과 판별 대상 시료를 함께 입력했을 때 생성되는 피크 표를 훈련 집합만을 입력하였을 때의 피크 표에 재정렬(realignment)하는 작업이 선행되어야 한다.
여러 개의 판별 대상 시료들을 훈련 집합과 함께 임포트하는 경우 정렬이 어긋나는 정도가 더욱 심해진다. 이에 따라 본 실시 예에서는 모든 판별 대상 시료들에 대해서 훈련 집합에 한 개의 판별 대상 시료를 추가하여 임포트한 후, 재정렬, 정규화, 파레토 스케일링을 수행하였다. 도 11를 참조하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, MarkerViewTM에는 판별 대상 시료를 훈련 집합에 정렬하여 임포트하는 기능이 없으므로, 전술한 바와 같이 판별 대상 시료의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 훈련 집합과 함께 임포트한 후 만들어지는 피크 표를 훈련 집합만을 임포트하였을 때 만들어지는 피크 표에 재정렬하는 프로그램을 만들어 훈련 집합에 정렬된 판별 대상 시료의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 추출하였다. 그러나 재정렬 없이 처음부터 판별 대상 시료를 훈련 집합에 정렬하여 임포트하는 것이 보다 바람직하고 이것 역시 프로그램을 만들어 구현 가능하다(211). 다음, 임포트한 피크 강도들을 정규화하고(212), 정규화한 피크 강도들을 파레토 스케일링하였다(213). 다음, 파레토 스케일링한 저질량 이온들의 피크 강도와 훈련 집합에 대한 주성분 분석 기반 선형 판별 분석에 의해 획득된 피크별 인자적재값으로부터 판별 점수를 계산하였다(214). 이렇게 계산된 판별 점수가 절단값(S)보다 큰지 여부를 판단하여(215), 절단값(S)보다 큰 경우 양성으로 판정하고(216), 절단값(S)보다 작은 경우 음성으로 판정하였다(217). 본 실시 예에서 절단값(S)은 0이었다.
표 4에서 제외되었던, 즉 기본 집합에서 훈련 집합을 구성할 때 제외되었던 8명의 CRC 환자 시료, 9명의 CRC 비환자 시료에 대해서도 상기의 과정을 통해 예비 판별식을 이용하여 판별 점수를 계산하여 기본 집합 전체를 판정하였다. 그 결과를 도 12 및 표 6에 나타내었다.
표 6
125 12 91.2%
8 141 94.6%
94.0% 92.2%
판별식을 구성할 때 이미 제외된 케이스들이었기 때문에 위양성 또는 위음성인 경우들로 판별될 것으로 예상되었는데, 진양성으로 판별된 하나의 경우를 제외하고는 예상대로 판별되었다.
(5) 판별식의 개선
예비 판별식을 구성하는 과정에서는 임포트한 10000개의 피크들 중 판별 점수에 큰 기여를 하는 피크들을 추출하였다. 그러나 피크들 중에는 훈련 집합에서는 문제를 발생시키지 않았으나, 동일한 CRC 환자 및 비환자의 혈청에 대해 다시 측정한 질량 스펙트럼에 대한 판별 또는 새로운 CRC 환자 및 비환자 집합에 대한 판별에 있어서는 잠재적으로 판별 성능을 저하시킬 수 있는 피크들 역시 포함되어 있을 것이므로 이것도 적극적으로 제거하는 단계가 필요한데, 판별식의 개선 과정에서는 이 단계를 거쳐 최종적으로 CRC 진단용 저질량 이온들을 결정한다.
판별식의 강건성을 검증하기 위해 먼저 기본 집합을 추가적으로 5회 반복 측정 실험하였으며, 새로운 CRC 환자 및 비환자 집합에 대해서도 5회 반복 측정 실험을 수행하였다. 이 각각을 검증 집합 A, B로 지칭한다. 질량 스펙트럼의 측정 과정에는 상기 설명한 혈청을 얼리고 녹이는 과정 및 혈청을 새로 메탄올/클로로포름과 혼합하여 추출하는 과정이 개입되는 것 외에, 레이저 빔을 이용한 기화(vaporization), 탈착(desorption), 이온화(ionization) 과정 등도 반복 실험시 동일하게 진행된다고는 할 수 없으며, 또한 아직 밝혀지지 않은 다양한 원인들로부터의 외란들도 개입할 여지가 많다. 따라서 개별 시료에 대한 판별 점수에 어느 정도의 편차가 발생하는 것은 배제할 수 없을 것이므로 본 실시 예에서는 5회 반복 측정한 시료에 대해 평균 판별 점수를 계산하여 판정을 실시하였다.
표 7은 종래 기술인 MarkerViewTM의 주성분 분석 기반 선형 판별 분석 결과인 10000개 항의 판별식으로 검증 집합 A와 B를 판별한 결과를 나타내며, 표 8은 278개 항을 가지는 예비 판별식으로 검증 집합 A와 B를 판별한 결과를 나타낸다.
표 7
검증 집합 A 검증 집합 B
119 65 64.7% 138 47 74.6%
14 88 86.3% 6 53 89.8%
89.5% 57.5% 95.8% 53.0%
표 8
검증 집합 A 검증 집합 B
124 60 67.4% 138 41 77.1%
9 93 91.2% 6 59 90.8%
93.2% 60.8% 95.8% 59.0%
10000개 피크로 구성된 판별식은 훈련 집합에서 완벽한 판별 성능(표4)을 보였음에도 불구하고, 검증 집합 A와 B에서 특히 특이도가 낮아서 양성예측도 역시 낮게 나타나는 것을 표 7에서 확인할 수 있었다. 278개 피크로 구성된 예비 판별식도 훈련 집합에서는 매우 우수한 판별 성능(표5)을 보였음에도 불구하고 검증 집합들에서의 판별 결과(표8)는 만족스럽지 않았다.
이에 예비 판별식을 강건한 판별식으로 개선하고자 다음의 단계를 수행하였다. 도 13를 참조하여 설명하면, 111 내지 122 단계는 도 8에서 설명한 바와 같으며 이에 따라 예비 판별식을 구성하는 저질량 이온들의 예비 후보군이 선정된다. 다음, 예비 후보군으로부터 소정의 피크들을 선택하고(124), 선택한 소정의 피크들만으로 검증 집합 케이스들에 대한 판별 점수를 계산하고 이에 따라 민감도 및 특이도를 계산하였다(125). 민감도의 문턱값 N5와 특이도의 문턱값 N6를 설정하여(126), 민감도 또는 특이도가 각각의 문턱값보다 작은 경우 124 단계와 다르게 소정의 피크들을 다시 선택하여(127) 125 내지 126 단계를 반복하였다. 본 실시 예에서는 민감도의 문턱값 N5와 특이도의 문턱값 N6가 각각 0.8이었다. 이와 같은 단계를 거쳐 결과를 개선하는 과정을 반복함으로써 CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값을 최종적으로 선택하였다(128).
본 실시 예에서는 전술한 바와 같이 278개의 피크들이 예비 후보군으로 선택되었으며, 상기 예비 후보군 내에서 임의로 소정의 피크들을 선택하여 판별 성능을 살펴보고 목표 판별 성능을 만족하지 못하면 소정의 피크들 중 일부 또는 전체 피크들을 삭제하거나 새로 추가하는 방식으로 다시 소정의 피크들을 선택하여 판별 성능을 검토하는 것으로 판별식을 개선하였다. 보다 구체적으로, 검증 집합 A와 B의 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도가 모두 80% 이상이 되는 판별식을 최종 판별식으로 선정하였다. 최종 판별식은 19개의 저질량 이온들로 구성되는데 이를 "CRC 진단용 저질량 이온들"로 지칭하고, 이를 이용하여 최종적으로 구한 본 발명에 따른 판별식을 "최종 판별식"으로 지칭한다. CRC 진단용 저질량 이온들의 질량값은 표 9와 같으며, 도 14a 내지 14c는 CRC 진단용 저질량 이온들의 피크 강도를 CRC 환자 및 비환자의 경우에 대해 비교하여 예시하고 있다. 137.0, 169.0 및 1465.6 m/z의 경우 CRC 환자들 혈청에서의 피크 강도가 상대적으로 높았고, 이를 제외한 나머지 16개 저질량 이온들의 경우 CRC 비환자들 혈청에서의 피크 강도가 상대적으로 높았다.
표 9
86.1 104.1 105.1 137.0 169.0 181.1 316.2 342.2 344.3 368.3
370.3 468.3 482.3 498.5 510.3 518.3 519.3 525.3 1465.6 -
(6) 최종 판별식의 적용 및 분석
판별 대상 시료에 대하여, 19개의 CRC 진단용 저질량 이온들을 이용한 최종 판별식을 도 11의 방법에 따라 적용하면 그 판정 결과를 획득할 수 있다. 검증 집합 A, B를 최종 판별식으로 판정한 결과를 도 15, 17, 18 및 표 10에 나타내었다.
도 15은 검증 집합 A의 5회 반복 측정한 질량 스펙트럼들에 대해 최종 판별식에 따라 판별 점수를 계산한 후 반복 측정한 집합별로 각각 판정한 결과를 나타내고, 도 16은 5회 판별 점수의 평균 판별 점수로 판정한 결과를 나타낸다. 도 17은 검증 집합 B에 대해 평균 판별 점수로 판정한 결과를 나타낸다.
표 10
검증 집합 A 검증 집합 B
125 29 81.2% 130 14 90.3%
8 124 93.9% 14 86 86.0%
94.0% 81.0% 90.3% 86.0%
검증 집합 A, B의 경우 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도가 모두 80% 이상임을 확인할 수 있다.
도 18a 내지 18b에는 19개 CRC 진단용 저질량 이온들 중 169.0 m/z을 동정한 결과를 나타내었다. 도20은 CRC에서 포스포에놀파이루베이트인 169.0 m/z의 MS/MS 패턴을 나타낸다. 이를 통하여 CRC 진단용 저질량 이온들 중에는 포스포에놀파이루베이트인 저질량 이온이 포함됨을 알 수 있다.
도 19a 내지 19c은 19개 CRC 진단용 저질량 이온들 중 1465.6 m/z을 동정한 결과를 나타낸다. (A)는 CRC 환자의 혈청 추출물에서의 피크 강도가 비환자 혈청에서의 피크 강도에 비해 상대적으로 높게 나타남을 나타내고, (B)는 CRC에서 1465.6 m/z의 MS/MS 패턴을 나타내고, (C)는 피브리노겐 알파체인으로서 1465.6 m/z을 동정한 결과를 나타낸다. 이를 통하여 CRC 진단용 저질량 이온들 중에는 피브리노겐 또는 피브리노겐 알파 체인인 저질량 이온이 포함됨을 알 수 있다.
도 20는 평균 판별 점수와 암의 병기와의 관계를 나타낸다. 병이 진행됨에 따라 전반적으로 판별 점수가 상승하는 경향을 관찰할 수 있다.
도 21a 내지 21b은 ROC(receiver operating characteristic) 곡선을 보여주고 있으며, 도 11의 215 단계에서 절단값(S)을 5.5로 설정하였을 때, 즉 민감도를 희생하고 특이도를 높인 경우의 판별 성능을 나타낸다. 종래의 FOBT 분석에 필적할 만한 민감도 및 특이도를 나타냄을 알 수 있으며, 이는 본 발명의 우수한 판별 성능을 증명한다.
또한, 도 11의 215 단계에서 절단값(S)을 제 1 절단값(S1) 및 제 2 절단값(S2)으로 설정할 수 있다. 즉, 215 단계에서 판별 점수가 제 1 절단값(S1) 이상인 경우 양성 판정, 제 2 절단값(S2) 이하인 경우 음성 판정, 그리고 제 2 절단값(S2) 초과 내지 제 1 절단값(S1) 미만인 경우 보류 판정을 할 수 있다. 예를 들어, CRC를 대상으로 한 경우 제 1 절단값(S1)은 10으로 설정하고 제 2 절단값(S2)은 -10으로 설정할 수 있다. 이 경우, 보류 판정된 시료들을 이차적으로 더욱 잘 구별할 수 있도록 이들만을 대상으로 한 층화 분석이 본 실시 예와 유사한 과정을 거쳐 이루어질 수 있어서 보다 좋은 판별 결과를 얻을 수 있다.

Claims (33)

  1. (a) 다수의 케이스들의 생물학적 시료로부터 측정한 저질량 이온(low mass ion)의 피크 강도(intensity)들을 정렬하여 획득하는 단계;
    (b) 상기 획득된 피크 강도들에 대해 생물통계학적 분석을 수행하는 단계;
    (c) 상기 생물통계학적 분석 결과로부터 상기 다수의 케이스들 중 소정의 케이스들을 훈련 집합으로 선택하는 단계; 및
    (d) 상기 소정의 훈련 집합 케이스들에 대해 생물통계학적 분석을 다시 수행하여 최종적으로 대장암 진단용 저질량 이온들의 질량값을 선택하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    (d1) 상기 피크들 중, 상기 피크 강도와 상기 피크별 인자적재값(factor loading)의 곱의 절댓값이 T1보다 큰 피크들을 케이스별로 일차적으로 선택하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 T1은 0.1인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    (d2) 상기 케이스별로 일차적으로 선택한 피크들 중, 상기 훈련 집합 케이스들의 T2 퍼센트 이상의 케이스들에서 공통으로 나타나는 피크들을 이차적으로 선택하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 T2는 50인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    (d1) 상기 피크들 중, 상기 피크 강도와 상기 피크별 인자적재값의 곱의 절댓값이 T1보다 큰 피크들을 케이스별로 일차적으로 선택하는 단계; 및
    (d2) 상기 케이스별로 일차적으로 선택한 피크들 중, 상기 훈련 집합 케이스들의 T2 퍼센트 이상의 케이스들에서 공통으로 나타나는 피크들을 이차적으로 선택하는 단계
    를 포함하며,
    상기 (d2) 단계 이후, 상기 (d2) 단계에서 선택한 피크들만으로 판별 점수를 계산하고, 상기 계산된 판별 점수에 따라 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 계산하고, 그리고 상기 계산된 민감도가 N3보다 작거나 또는 상기 계산된 특이도가 N4보다 작은 경우 상기 T1 및 상기 T2를 변경하여 상기 (d1) 및 상기 (d2) 단계를 반복하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 N3 및 상기 N4는 0.9인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    (d3) 상기 (d2) 단계에서 선택한 피크들 중 소정의 피크들을 선택하여 검증 집합 케이스들에 대한 판별 점수를 계산하고, 상기 계산된 판별 점수에 따라 민감도 및 특이도를 계산하고, 그리고 상기 계산된 민감도가 N5보다 작거나 또는 상기 계산된 특이도가 N6보다 작은 경우 상기 소정의 피크들과 동일하지 않은 새로운 소정의 피크들을 다시 선택하여 검증 집합 케이스들에 대한 판별 성능을 개선하는 과정을 반복하여 상기 대장암 진단용 저질량 이온들의 질량값을 최종적으로 선택하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 N5 및 상기 N6는 0.8인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 대장암 진단용 저질량 이온들의 질량값은, 86.1, 104.1, 105.1, 137.0, 169.0, 181.1, 316.2, 342.2, 344.3, 368.3, 370.3, 468.3, 482.3, 495.3, 510.3, 518.3, 519.3, 525.3 및 1465.6 m/z로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 대장암 진단용 저질량 이온들은 19개이며, 그리고
    상기 대장암 진단용 저질량 이온들의 질량값은, 86.1, 104.1, 105.1, 137.0, 169.0, 181.1, 316.2, 342.2, 344.3, 368.3, 370.3, 468.3, 482.3, 495.3, 510.3, 518.3, 519.3, 525.3 및 1465.6 m/z인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 대장암 진단용 저질량 이온들은 피브리노겐(fibrinogen) 또는 피브리노겐 알파 체인(alpha chain)인 저질량 이온들을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 대장암 진단용 저질량 이온들은 포스포에놀파이루베이트(PEP; Phosphoenolpyruvate)인 저질량 이온들을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는,
    (c1) 상기 계산된 판별 점수에 따라 민감도 및 특이도를 계산하는 단계;
    (c2) 상기 민감도가 N1보다 작거나 또는 상기 특이도가 N2보다 작은 경우 위양성 또는 위음성 케이스들을 상기 다수의 케이스들에서 제외하여 상기 (a) 내지 상기 (b) 단계를 반복하는 단계; 및
    (c3) 상기 민감도가 N1보다 크거나 같으며 그리고 상기 특이도가 N2보다 크거나 같은 경우 상기 케이스들을 상기 소정의 훈련 집합 케이스들로 선택하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는,
    (a1) 상기 다수의 케이스들의 생물학적 시료로부터 획득한 저질량 이온 질량 스펙트럼을 정렬하여 임포트하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계는,
    (b1) 상기 임포트한 피크 강도들을 정규화(normalization)하는 단계;
    (b2) 상기 정규화한 피크 강도들을 스케일링(scaling)하는 단계; 및
    (b3) 상기 스케일링한 피크 강도들에 대해 생물통계학적 분석을 수행하여 상기 판별 점수를 계산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 스케일링은 파레토 스케일링(Pareto scaling)인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 생물통계학적 분석은 주성분 분석 기반 선형 판별 분석(principal component analysis-based linear discriminant analysis, PCA-DA)인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따라 결정된 상기 대장암 진단용 저질량 이온들을 사용하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    (A) 판별 대상 시료의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 상기 훈련 집합에 정렬하여 획득하는 단계;
    (B) 상기 획득한 피크 강도들을 정규화하고 스케일링하는 단계;
    (C) 상기 정규화하고 스케일링한 대장암 진단용 저질량 이온들의 피크 강도와 피크별 인자적재값을 통해 판별 점수를 계산하는 단계; 및
    (D) 상기 계산된 판별 점수에 따라 대장암 여부를 판정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 (A) 단계는,
    (A1) 판별 대상 시료의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 상기 훈련 집합에 정렬하여 임포트하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    상기 (B) 단계는,
    (B1) 상기 임포트한 피크 강도들을 정규화하는 단계; 및
    (B2) 상기 정규화한 피크 강도들을 스케일링하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 스케일링은 파레토 스케일링인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  24. 제 20 항에 있어서,
    상기 (C) 단계는,
    (C1) 상기 판별 대상 시료에 대해 상기 정규화하고 스케일링한 대장암 진단용 저질량 이온들의 피크 강도와 훈련 집합에 대한 주성분 분석 기반 선형 판별 분석에 의해 획득한 피크별 인자적재값으로부터 상기 판별 점수를 계산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  25. 제 20 항에 있어서,
    상기 (D) 단계는,
    (D1) 상기 판별 점수가 S 이상인 경우 양성으로 판정하고, S 미만인 경우 음성으로 판정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 S는 0 또는 5.5인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  27. 제 20 항에 있어서,
    상기 (D) 단계는,
    (D1') 상기 판별 점수가 S1 이상인 경우 양성 판정, S2 이하인 경우 음성 판정, 그리고 S2 초과 내지 S1 미만인 경우 보류 판정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 S1은 10, 그리고 상기 S2는 -10인 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서,
    상기 (D) 단계는,
    (D2') 상기 보류 판정된 대상을 층화 분석(stratified analysis)하여 재판정하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는,
    연산 장치.
  31. 제 19 항에 따른 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는,
    연산 장치.
  32. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따라 결정된 소정의 대장암 진행 예측용 저질량 이온들을 사용하는 것을 특징으로 하는,
    환자 개개인의 대장암 진행을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따라 결정된 소정의 치료 반응성 예측용 저질량 이온들을 사용하는 것을 특징으로 하는,
    환자 개개인의 특정 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
PCT/KR2011/005974 2010-08-12 2011-08-12 대장암 진단용 저질량 이온 결정 방법 및 이를 이용한 대장암 진단 방법 WO2012021042A2 (ko)

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