CN107942078A - 一种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法，采用实时荧光定量RT‑PCR和免疫印迹Western blot技术分别检测肝癌及肝良性肿瘤患者、正常人肝组织中的肝癌新标志物，明确其在基因及蛋白水平的表达量及其定位，分析其与肝癌患者临床病理的关系；构建带有荧光标签的肝癌新蛋白标志物编码基因的真核细胞表达载体，并转染肝癌细胞株表达；采用激光共聚焦等测定转染前后的细胞特征；本发明寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、疾病的早期诊断及预后判断具有重要意义。

Description

一种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法

技术领域

本发明涉及基因转录组学和蛋白质组学领域，尤其是一种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法。

背景技术

20世纪原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手，在城市仅次于肺癌，在农村则仅次于胃癌^[1]。目前广西每年有3.5万人左右死于恶性肿瘤，其中，死于肝癌的有1.2万人左右，可见，肝癌是广西第一位癌症杀手。在广西范围内，肝癌危害情况很不均衡。肝癌死亡率较高的县、市，主要集中于桂西南地区，以南宁周边的扶绥、隆安、武鸣三县最为高发，这个局部地区的肝癌发生密度，达到50～60/10万，其中的个别行政村，肝癌发生密度竟高达140～160/10万，这样的肝癌发生率在世界上也是罕见的。肝癌不仅发病率高而且死亡率也高，可谓“癌中之王”，广西肝癌的死亡率已经上升到27.31/10万，占全部恶性肿瘤死亡率的34.12％。由于原发性肝癌早期一般无任何症状，一旦出现临床表现，病情大多已进入中、晚期，而且恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强，因此，寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、药物靶标的设计、疾病的早期诊断及高危人群的筛查成为广西地区肝癌研究的当务之急。

目前，肝癌的发现和诊断是通过血清AFP检测结合影像学检查。其中临床较为公认的肝癌诊断标准为：血清AFP浓度>400μｇ/L，持续4周，影像学发现肝脏有实质性占位且能排除肝炎活动、生殖胚胎性肿瘤等疾病。但仅依靠血清AFP浓度来诊断肝癌，灵敏度为39%~64%之间，特异度为76%~91%，阳性预测值只在9%～32%，这就使得很多肝癌患者漏检，或假阳性和假阴性，直接影响肝癌患者的早期诊断和治疗。

随着生物技术的迅猛发展及人类基因组计划(HGP)全基因组测序的完成，人类进入了后基因组时代，其中蛋白质组学的研究越来越受到人们的关注。用蛋白质组学技术来检测、分析和确定标志蛋白和靶蛋白，阐明肿瘤蛋白表达水平的变化与肿瘤发生发展不同阶段的相互关系及其规律，是目前解决肿瘤早期诊断难题的最有利的途径；同时，也是肿瘤及其药物筛选研究中最新并且最强有力的手段。

质谱技术是蛋白组学技术中筛选、鉴定特异性肿瘤标志物的核心，常用的是表面增强激光解析/离子化飞行时间质谱技术（surface-enhanced laserdesorption/inionation-time of flightmass spectrometry，SELDI-TOF-MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of FlightMass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）。本课题组曾利用SELDI-TOF-MS结合液质联用HPLC/MALDI-TOF-MS技术对乙肝相关的肝癌、慢性良性肝病、正常人的血清样品进行分析，得到人类乙肝相关肝癌的特异性血清标志物NAP2（71）和NAP2（73）。利用与SELDI有着相似的检测原理但重复性较好的CLINPROT系统，在肝癌与正常人两组血清样品中筛选到两个差异明显的蛋白质多肽，一个鉴定为来自纤维蛋白原（Fibrinogen）的一个分泌片段，纤维蛋白肽A（Fibrinopeptide A），这与Eduard等的结果完全一致；另一个多肽鉴定为激肽原（Kininogen）。而近两年来新发展的iTRAQ（isobaric tags for relative and absolutequantification，iTRAQ）标记结合MALDI-TOF MS/MSF技术，建立在iTRAQ同位素标记试剂的基础上，包括一个带电荷的报告基团，另外还有一个肽段反应基团和一个平衡基团，其中平衡基团平衡分子量，保证与每一种报告基因结合后iTRAQ试剂总的相对分子量都是145，肽段反应基团可以同肽段的N末端和赖氨酸测量E氨基基团发生反应，这样可以标记生物样品中产生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息，为疾病标志物的发现与鉴定提供了定量信息，使得课题组在肝癌新标志物的筛选方面更为如虎添翼。

自2005年起，本课题组经上述质谱技术筛选肝癌特异性标志物，取得的一系列研究成果，这些功能蛋白质和潜在疾病蛋白质标志物的发现和鉴定得益于差异蛋白质组学研究的发展，但如何进一步探测这些蛋白质的表达丰度，以阐明其功能和在疾病研究中的意义，已变得越来越重要。目前，标志物发现- 验证- 临床确证的研究模式已得到研究者们的广泛认可。即在发现阶段从疾病生物样本中寻找与正常样本有差异的蛋白质；到验证阶段对筛选出来的标记物定量，评估其准确性、特异性、范围等，并把被验证的标志物与临床特征、结果相联系；将验证阶段找出的最有可能成为生物标志物的候选分子，进入下一步临床确证。这种研究模式使体液中生物标志物的发现和验证更为有效、科学和合理。

在上述的研究模式中，目标蛋白的定量技术是标志物从发现通向验证的桥梁。质谱的高灵敏度在标志物的发现阶段能帮助人们发掘到生物标本中低丰度的蛋白质、多肽信息，但在定量验证阶段，由于复杂组分共流出物的干扰和宽达9 个数量级以上的动态范围，极大地影响了质谱对生物体液中低丰度蛋白质、多肽的定量检测。尽管研究者们尝试采用多种方法，包括尽可能充分的色谱分离，去除高丰度蛋白质等，但其结果的精密度和准确度仍远不能满足分析的要求，直到质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术的出现。M R M 技术在定量蛋白质组学应用上展现了其方法的优点。

M R M 技术是基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式。具体地说，即是根据多肽母离子质量数和碎片离子质量数，选择母离子- 子离子对，允许符合设定的母离子进入碰撞室，碰撞完成后，只记录设定子离子信号。通过母离子和子离子的两次选择，去除干扰离子，降低化学背景，提高灵敏度。在进行MRM分析时，现代质谱仪可通过MRM扫描模式对大批量的样本监测，查看是否有此排列的母-子离子对出现。如若信号出现，证明此分子在样本中存在，仪器将自动切换至MS/MS扫描模式，确定此母离子的碎片离子信息，并再次鉴定并确认该分子的结构。如若在MRM扫描工作中，未发现预期的母/子离子对，就说明该分子在此样本中不存在。由于MRM扫描模式高效快速，且具有极高灵敏度，因此非常适合于高通量验证与确认生物标志物。此外，MRM 技术高通量的特点，也为多种蛋白质的同时定量提供了条件。M R M 技术通过与同位素稀释法或m T R A Q 技术结合，对已知量加入的内标肽段和样本中的真实肽段分别进行标记，选择不同母-子离子对获得不同的色谱检出信号，比较两者信号，从而产生绝对定量结果^[15]。目前，由MRM定量验证的血清标志物是避免假阳性标志物的最好的方法。

因此，本研究拟对课题组先期用SELDI-TOF-MS蛋白芯片、iTRAQ同位素标记技术筛选的肝癌特异性蛋白标志物，采用实时荧光定量RT-PCR和免疫印记Western blot技术明确肝癌新蛋白标志物的表达及定位，并对研究目标进行进一步的挑选；采用真核转染、SiRNA干扰技术观察肝癌新标志物对肝癌细胞株生物学特性的影响，同时采用裸鼠荷瘤模型体内试验观察其在肝癌浸润转移中的作用；通过生物信息学分析，解析这些关键蛋白在系统信号网络中的作用；最后以MRM技术进行大样本的绝对定量验证，评估这些肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌价值以及分析与临床相关性，提出它们在肝癌的预防、早期诊断和预后判断等临床应用方面的可行性，本研究将为最终筛选出肝癌关键蛋白/多肽奠定坚实的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法。

这种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法，

由以下步骤组成：

①采用实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹Western blot技术分别检测肝癌及肝良性肿瘤患者、正常人肝组织中的肝癌新标志物，明确其在基因及蛋白水平的表达量及其定位，分析其与肝癌患者临床病理的关系；

②构建带有荧光标签的肝癌新蛋白标志物编码基因的真核细胞表达载体，并转染肝癌细胞株表达；采用激光共聚焦等测定转染前后的细胞特征；

③采用SiRNA干扰技术抑制肝癌细胞株中肝癌新蛋白标志物的基因表达，采用流式细胞仪、透射电镜等观察沉默前后肝癌细胞系的标志物表达、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡变化等情况；

④分别将标志物基因转染前后的肝癌细胞株行动物致瘤实验，采用活体小动物成像等技术研究肝癌新蛋白标志物对肿瘤生长、浸润、转移的影响；

⑤通过生物信息学分析构建肝癌血清关键蛋白多肽调控网络，解析最终所筛选出的肝癌关键蛋白多肽的功能；

⑥通过大样本MRM绝对定量验证，计算肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及与肝癌临床不同病理类型、不同病程、原发与转移、疗效等相关分析，提出它们在肝癌的预防、早期诊断、病程预测和预后判断等临床应用方面的可行性。

发明有益效果：

本发明寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、疾病的早期诊断及预后判断具有重要意义。通过生物信息学分析，解析这些关键蛋白在系统信号网络中的作用；再以MRM绝对定量验证，评估这些肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌价值以及分析与临床相关性，提出它们在肝癌的预防、早期诊断和预后判断等临床应用方面的可行性。

具体实施方式

实施例：

这种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法，

由以下步骤组成：

①采用实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹Western blot技术分别检测肝癌及肝良性肿瘤患者、正常人肝组织中的肝癌新标志物，明确其在基因及蛋白水平的表达量及其定位，分析其与肝癌患者临床病理的关系；

②构建带有荧光标签的肝癌新蛋白标志物编码基因的真核细胞表达载体，并转染肝癌细胞株表达；采用激光共聚焦等测定转染前后的细胞特征；

③采用SiRNA干扰技术抑制肝癌细胞株中肝癌新蛋白标志物的基因表达，采用流式细胞仪、透射电镜等观察沉默前后肝癌细胞系的标志物表达、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡变化等情况；

④分别将标志物基因转染前后的肝癌细胞株行动物致瘤实验，采用活体小动物成像等技术研究肝癌新蛋白标志物对肿瘤生长、浸润、转移的影响；

⑤通过生物信息学分析构建肝癌血清关键蛋白多肽调控网络，解析最终所筛选出的肝癌关键蛋白多肽的功能；

⑥通过大样本MRM绝对定量验证，计算肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及与肝癌临床不同病理类型、不同病程、原发与转移、疗效等相关分析，提出它们在肝癌的预防、早期诊断、病程预测和预后判断等临床应用方面的可行性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种发现的蛋白标志物对肝癌的影响分析方法，其特征在于：由以下步骤组成：

①采用实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹Western blot技术分别检测肝癌及肝良性肿瘤患者、正常人肝组织中的肝癌新标志物，明确其在基因及蛋白水平的表达量及其定位，分析其与肝癌患者临床病理的关系；

②构建带有荧光标签的肝癌新蛋白标志物编码基因的真核细胞表达载体，并转染肝癌细胞株表达；采用激光共聚焦等测定转染前后的细胞特征；

③采用SiRNA干扰技术抑制肝癌细胞株中肝癌新蛋白标志物的基因表达，采用流式细胞仪、透射电镜等观察沉默前后肝癌细胞系的标志物表达、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡变化等情况；

④分别将标志物基因转染前后的肝癌细胞株行动物致瘤实验，采用活体小动物成像等技术研究肝癌新蛋白标志物对肿瘤生长、浸润、转移的影响；

⑤通过生物信息学分析构建肝癌血清关键蛋白多肽调控网络，解析最终所筛选出的肝癌关键蛋白多肽的功能；

⑥通过大样本MRM绝对定量验证，计算肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及与肝癌临床不同病理类型、不同病程、原发与转移、疗效等相关分析，提出它们在肝癌的预防、早期诊断、病程预测和预后判断等临床应用方面的可行性。