WO2012017867A1 - 精神疾患の検査方法、精神疾患用の検査キット、ならびに精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法 - Google Patents

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WO2012017867A1 PCT/JP2011/067004 JP2011067004W WO2012017867A1 WO 2012017867 A1 WO2012017867 A1 WO 2012017867A1 JP 2011067004 W JP2011067004 W JP 2011067004W WO 2012017867 A1 WO2012017867 A1 WO 2012017867A1
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mental
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繁 森信
学 淵上
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国立大学法人広島大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a test method for mental illness based on the methylation state of CpG island, a test kit for mental illness, and a method for evaluating a therapeutic and / or prophylactic agent for mental illness.
  • Patent Document 1 discloses a new diagnosis method for mental illness based on biological characteristics based on expression patterns (expression levels) of a large number of genes, and a new substance capable of preventing or treating mental illness. A method of searching is described.
  • Patent Document 2 describes a method for determining whether or not a patient has a psychotic disorder using quantitative values of specific various proteins, nucleic acids, or fragments thereof collected from a sample of a subject. One of these various proteins, nucleic acids or fragments thereof also describes the expression level associated with the BDNF gene.
  • Patent Document 3 describes that it is possible to predict a manic-depressive disease and determine the susceptibility to it from SNP analysis of various genes, and one of the genes includes the BDNF gene. It is.
  • Patent Document 4 describes a method for determining the pathological condition of colorectal cancer based on the methylation state of the CpG island upstream of the BDNF gene.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, a method for testing mental illness, a test kit for mental illness based on an objective judgment criterion based on a biological index in a technique targeting one gene, Another object of the present invention is to provide a method for evaluating a psychiatric disease therapeutic agent and / or preventive agent.
  • BDNF BrainDerived Neurotrophic Factor
  • the method for examining a psychiatric disorder includes a detection step of detecting a methylation state in a CpG island upstream of exon I of a BDNF gene of a sample collected from a subject; Comparing the methylation status of a sample collected from the subject with the methylation status in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of a sample collected from an individual with mental illness and a non-psychotic illness; A test process for testing whether or not the patient has a mental illness, It is characterized by including.
  • the mental illness is depression and / or schizophrenia.
  • the testing step comprises determining the methylation status of a sample collected from the subject by methylation in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of a sample collected from an individual with mental illness and a non-psychotic illness. It is a step of examining whether or not the subject has a mental illness using as an index a tree diagram obtained by clustering analysis of the state and divided into a mental illness group and a non-psychiatric illness group.
  • the testing step is characterized in that the methylation status of the sample collected from the subject is determined in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of the sample collected from a mentally ill individual and a nonpsychotic individual.
  • the sample is a biological sample collected from an animal.
  • the sample is peripheral blood collected from a human.
  • the CpG island includes the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the test kit for psychiatric disorders comprises SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 3, for detection of methylation status in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of a sample collected from a subject. It includes at least one primer set of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • the method for evaluating a therapeutic agent and / or a preventive agent for psychiatric disorders according to the third aspect of the present invention is a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of a sample collected from a subject in the absence and presence of the test compound.
  • a detection step of detecting a methylation state in The methyl of a sample collected from the subject in the absence of the test compound, using as an index the methylation state in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of the sample collected from an individual with mental illness and a non-psychotic illness For evaluating whether or not the test compound is a therapeutic and / or prophylactic agent for mental illness by comparing the methylation state and the methylation state of a sample collected from the subject in the presence of the test compound Process, It is characterized by including.
  • the mental illness is depression and / or schizophrenia.
  • the methylation status of the sample collected from the subject in the absence and presence of the test compound is determined from the BDNF of the sample collected from the individual with mental illness and the individual with non-psychotic illness. Obtained from clustering analysis of methylation state in CpG island upstream of exon I of gene, and using as an index a tree diagram that is divided into a psychiatric disorder group and a non-psychiatric disorder group, the test compound is a therapeutic and / or prophylactic agent for mental illness It is the process of evaluating whether it becomes.
  • the methylation status of the sample collected from the subject in the absence and presence of the test compound is determined based on the BDNF of the sample collected from a mentally ill individual and a nonpsychotic individual.
  • the CpG island includes the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the objective is based on a biological index by a technique targeting one gene. It is possible to test whether or not the subject has a mental illness according to the criteria.
  • a test compound is determined according to an objective judgment criterion based on a biological index in a technique targeting one gene. Can be evaluated as an agent for treating and / or preventing psychiatric disorders.
  • BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor
  • Embodiment 1 of the present invention relates to a test method for mental illness. Specifically, a detection step of detecting a methylation state in a CpG island upstream of exon I of a BDNF gene of a sample collected from a subject, and the methylation state of the sample, an individual with mental illness, and a non-psychotic illness A test step of testing whether or not the subject has a mental illness by comparing the methylation status in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of a sample collected from an individual is included.
  • mental disease means a disease caused by functional or organic disorders of the brain or heart. Examples include depression, schizophrenia, bipolar mood disorder, emotional disorder, or developmental disorder (such as autism, Asperger's syndrome or attention deficit hyperactivity disorder). Of these, most preferably, it means depression and / or schizophrenia. “Non-mental illness” means a state or condition that does not fall under any of these mental illnesses or symptoms. When an individual is a human, an individual having a non-psychiatric disorder mainly means a healthy person.
  • the “subject” means an organism to be examined, particularly an animal (for example, human, mouse, rat, hamster, guinea pig, monkey, cow, pig, horse, rabbit, sheep, goat, cat or dog, etc. Mammals).
  • An “individual” means an organism, particularly an animal, that corresponds to these “subjects” and that is not a test subject.
  • the “sample” refers to any target sample that can be collected from a subject (individual) and can detect methylation in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene, and can be generally used by those skilled in the art. Means. For example, a biological sample (tissue, cell, liquid component, etc.) having DNA in vivo or in vitro. Most preferably, the sample collected from the subject (individual) is peripheral blood collected from a human.
  • sample In order to collect a sample from a subject (individual), it is possible to collect the sample by any method suitable for the above-described “subject (individual)” and “sample”. For example, when collecting human peripheral blood, about 5 ml of peripheral blood may be collected from a vein with a syringe or the like.
  • CpG island means that the content of cytosine (C) and guanine (G), which is used in a general sense by those skilled in the art, is close to 40% of the promoters of mammalian genes (of human genes). It means a region of DNA occupying about 70% of the promoter).
  • C cytosine
  • G guanine
  • any condition can be used as long as it is generally used by those skilled in the art.
  • the conditions of% GC> 50, length> 200 bp and Obs / Exp CpG> 0.6 which are the criteria of the CpG island of UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu/), can be mentioned.
  • the “CpG island upstream of exon I of the BDNF gene” most preferably has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the human chromosome 11 at positions 2743473 to 27474564 of genomic DNA. Means an area. Preferably, it means a region corresponding to a CpG island in the vicinity of the human region. For an organism having a BDNF gene other than human, it means a place corresponding to a similar region in the organism.
  • the “methylation state of CpG island (in CpG island)” means a CpG unit (including one CpG site or a group of continuous CpG sites) in the region of the CpG island. This means the situation and pattern of methylation.
  • a mass array method in particular, MassARRAY (registered trademark) system (SEQUENOM), which is a quantitative DNA methylation analysis combining a base-specific cleavage reaction and MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry)).
  • SEQUENOM MassARRAY (registered trademark) system
  • MALDI-TOF MS Microx Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry
  • Embodiment 1 first, the methylation state in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of the sample collected from the subject is detected.
  • a means for detecting the methylation state in the CpG island any means known in the art can be used.
  • the aforementioned mass array method Methylation-specific PCR (polymerase chain reaction) method, Methylight (Methylation-specific real-time PCR) method, bisulfite sequencing method, methylation chip method, or COBRA (Combined Bisulfite) Restriction (Analysis) method.
  • the methylation status in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of the sample of the subject detected by these means, and in the CpG island of the sample collected from individuals with mental illness and non-psychotic illness The methylation status is compared to test whether the subject is mentally ill.
  • a subject has a mental illness by collecting data on methylation statuses of a plurality of psychiatric patients and healthy subjects in advance and comparing the data with the average data. . Furthermore, for example, it may be compared with the average data of patients for each of a plurality of types of mental illnesses, and it may be examined which disease is applicable. Preferably, the subject (subject) is examined by comparing with average data of healthy subjects, depressed patients and / or schizophrenic patients. Or even if it is not average data, it can also be examined by using multivariate analysis.
  • the methylation status of the sample and the results of clustering analysis of the methylation status in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of samples collected from individuals with mental illness and non-psychotic illness are used as indicators. Test whether the body is mentally ill. For example, as a specific method, first, data on methylation states of samples of a plurality of healthy subjects, depressed patients and / or schizophrenic patients is collected in advance. Next, based on each CpG unit and methylation status, clustering analysis using statistical software or the like (preferably hierarchical clustering of the complete linkage method) is performed, and three (normal subjects, depressed patients and / or integrations) are performed. Confirm that a dendrogram (dendrogram) is created. Using this, a test is performed by determining to which methylation state of the target sample (one or more) belongs, processing, or performing a clustering analysis again with these.
  • statistical software or the like preferably hierarchical clustering of the complete linkage method
  • the methylation status of a sample collected from a subject is measured by CpG_1, CpG_14, CpG_19, 20 in CpG islands upstream of exon I of the BDNF gene of samples collected from individuals with mental illness and non-psychotic illness.
  • whether or not the subject is a mental illness is determined based on an objective judgment criterion based on a biological index using a technique targeting one gene. Can be inspected. In other words, since it is possible to test whether or not the subject is a mental illness without relying on subjective judgments by clinicians or the like, the test can be performed more accurately.
  • the present invention is also suitable for collecting data on methylation status of healthy subjects, depressed patients and / or schizophrenic patients.
  • the second embodiment of the present invention relates to a test kit for mental illness used in the method for testing psychiatric disease according to the first embodiment. Specifically, it comprises at least one primer set for detecting methylation in a CpG island upstream of exon I of a BDNF gene of a sample collected from a subject. That is, the test kit for mental illness according to the second embodiment of the present invention is a test method using the methylation state detection means including the PCR step among the methylation state detection means described in the first embodiment. Used in.
  • the test kit for mental illness is a test kit for depression and / or a test kit for schizophrenia.
  • the primer set for detection of methylation is a region in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene (preferably, a region of genomic DNA from the 2743473th position to the 2774454th position of human chromosome 11 (SEQ ID NO: 1)).
  • a set of forward and reverse primers used to detect methylation status is preferably has an appropriate number of bases that enables specific binding to the template, for example, about several tens of bp and 10 to 30 bp.
  • a forward and reverse primer set using 200 to 600 bp as a target region which is used in PCR when a methylation state is detected by a mass array method, can be mentioned.
  • the base sequence of the primer set can be easily designed by those skilled in the art by using known methylation detection primer design software. See the Examples for an example of the base sequence of the primer set.
  • Such a primer set should just contain at least 1 and may contain four primer sets as described in an Example.
  • forward and reverse primers of the base sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 forward and reverse primers of the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, forward and reverse primers of the base sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7,
  • the base sequence of the primer can function as the primer of each set, it may be a sequence containing the base sequences of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 9.
  • reagents may be included in accordance with the methylation state detection means.
  • a solution for dissolving the sample and / or a bisulfite-containing reagent may be included.
  • the test kit for mental illness As described above, according to the test kit for mental illness according to the second embodiment, it is possible to more easily perform the test for mental illness with the means for detecting the methylation state including the PCR process. Similarly to the mental illness testing method according to Embodiment 1, it is possible to test whether or not the subject has a mental illness based on an objective judgment criterion based on a biological index. In other words, since it is possible to test whether or not the subject is a mental illness without relying on subjective judgments by clinicians or the like, the test can be performed more accurately.
  • Embodiment 3 of the present invention relates to a method for evaluating a psychiatric disorder therapeutic agent and / or preventive agent. Specifically, a detection step of detecting a methylation state in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of a sample collected from a subject in the absence and presence of the test compound, and an individual and non-psychiatric disorder Compare the methylation status of the sample in the absence of the test compound with the methylation status of the sample in the presence of the test compound, using as an index the methylation status in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of the sample collected from the individual with mental illness And an evaluation step of evaluating whether or not the test compound is a psychiatric disorder therapeutic agent and / or preventive agent.
  • test compound refers to any substance that can be an object of evaluation (including screening for a psychiatric disease therapeutic agent and / or prophylactic agent) as to whether or not it becomes a psychiatric disease therapeutic agent and / or prophylactic agent.
  • a low molecular compound, a nucleic acid, or a polypeptide can be used.
  • the low molecular weight compound, nucleic acid, polypeptide or the like may be extracted and purified from a natural product, or may be artificially synthesized.
  • purified thing but an unpurified thing can also be used as a test compound.
  • a novel substance but a well-known substance or its improvement may be sufficient. For example, it is possible to evaluate an existing therapeutic agent or prophylactic agent or a derivative thereof.
  • the methylation state in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of the sample collected from the subject is detected.
  • Sample collection, methylation state detection means, and the like are the same as those in the first embodiment.
  • the methylation state in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene in the peripheral blood of an animal having a mental illness is first detected in advance by means such as a mass array method. Thereafter, the test compound is orally or intravenously administered to the animal, and the methylation state of the peripheral blood in the CpG island is similarly detected by means such as a mass array method.
  • the methylation status of the sample in the absence and presence of the test compound thus detected is compared. . From the result, it is evaluated whether or not the test compound is a psychiatric disorder therapeutic agent and / or preventive agent.
  • a test compound becomes a therapeutic agent and / or preventive agent of a mental illness.
  • the therapeutic agent and / or preventive agent for mental illness is a therapeutic agent for depression, a prophylactic agent for depression, a therapeutic agent for schizophrenia, and / or a preventive agent for schizophrenia.
  • the methylation status of the sample in the absence and presence of the test compound and the methylation status in the CpG island upstream of exon I of the BDNF gene of a sample taken from a mentally ill and nonpsychotic individual Whether or not the test compound is a psychiatric disorder therapeutic agent and / or prophylactic agent is evaluated using the result of the clustering analysis as an index. For example, as a specific method, first, data on methylation states of samples of a plurality of healthy subjects, depressed patients and / or schizophrenic patients is collected in advance.
  • clustering analysis using statistical software or the like preferably hierarchical clustering of the complete linkage method
  • three normal subjects, depressed patients and / or integrations
  • Confirm that a dendrogram (dendrogram) is created.
  • the evaluation is performed by determining to which the methylation state of the sample before and after administration of the test compound belongs, processing, or performing clustering analysis again with these.
  • the methylation status of a sample collected from a subject in the presence and absence of a test compound is expressed as CpG upstream of exon I of the BDNF gene of a sample collected from a mentally ill individual and a nonpsychotic individual.
  • test compound is a therapeutic and / or prophylactic agent for psychiatric disorders by comparing it with the methylation status of all of these CpG units.
  • the test is performed according to an objective judgment criterion based on a biological index using a technique targeting one gene. It can be evaluated whether a compound is a psychiatric disorder therapeutic agent and / or a preventive agent.
  • a psychiatric disorder therapeutic agent and / or a preventive agent since it is possible to evaluate a psychiatric treatment and / or prevention agent without the subjective judgment of a clinician or the like, it is possible to perform a more accurate evaluation, which may greatly contribute to the development of a new drug. high.
  • Example In this example, an example relating to detection of methylation status in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene using human peripheral blood and analysis by hierarchical clustering will be described in detail.
  • FIG. 1 is a diagram showing the statistics of a subject according to an example. As shown in FIG. 1, first, it divided into the group of three test subjects, and implemented. As controls, healthy subjects who were recruited through advertisements and had no mental or physical illness at present or in the past and who did not have a depression patient as a first-degree relative were subjects. For patients with depression (Major depression) and patients with schizophrenia (Schizophrenia), patients who were diagnosed by psychiatrists using DSM-IV criteria based on interviews and medical records .
  • CpGI the region from 27743473 to 27474564 of human chromosome 11 was selected (hereinafter, this region is referred to as CpGI).
  • the base sequence of CpGI is shown in SEQ ID NO: 1 as described above.
  • a 5 ml sample of peripheral blood was collected from the three groups of subjects described above and stored at -80 degrees in a vacuum tube containing sodium heparin. Using these samples, DNeasy Blood & Tissue Kit (manufactured by Qiagen, Hilden, Germany) was used to isolate genomic DNA according to the instruction manual. Furthermore, 1 ⁇ g of the separated genomic DNA was converted to unuracilized cytosine (C) into uracil (U) with sodium bisulfite using EZ DNA DNA methylation kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) ( Bisulfite treatment).
  • FIG. 2 is a diagram showing an amplification region by PCR in a CpG island upstream of exon I of the BDNF gene according to the example. That is, FIG. 2 shows CpGI having 1092 bp and having 81 CpG sites (CpGs), an amplification region in each PCR, and a CpG site contained in the region.
  • the PCR primer (primer for methylated DNA) was designed using EpiDesigner software (http://www.epidesigner.com/).
  • the reference of the CpG island of EpiDesigner is% GC> 50 and Obs / Exp CpG> 0.6.
  • the base sequence of forward primer 1 is shown in SEQ ID NO: 2
  • the base sequence of reverse primer 1 is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence of forward primer 2 is shown in SEQ ID NO: 4
  • the base sequence of reverse primer 2 is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the base sequence of forward primer 3 is shown in SEQ ID NO: 6
  • the base sequence of reverse primer 3 is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the base sequence of forward primer 4 is shown in SEQ ID NO: 8
  • the base sequence of reverse primer 4 is shown in SEQ ID NO: 9.
  • the amplified product was subjected to in vitro transcription and RNase degradation using MassCLEAVE T-only kit according to the instruction manual.
  • Samples 20 to 20 nl after the decomposition reaction were dispensed into pretreated silicon matrix chips (SpectroCHIP (manufactured by SEQUENOM)) using MassARRAYARnanodispenser (manufactured by SEQUENOM). Thereafter, methylated CpG sites were analyzed using MassARRAY® Compact® System® MALDI-TOF (manufactured by SEQUENOM).
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a result of EpiTYPER analysis of a CpG site in a CpG island upstream of exon I, and a PCR amplification region.
  • Amplicon1 to amplicon4 are four regions amplified by the above-described PCR process.
  • the 81 CpG sites (CpG count) detected by the CpGI EpiTYPER analysis shown in Fig. 3 are named CpG_1 to CpG_81 in the order of Base Pairs on Input Sequence.
  • CpG_1 to CpG_81 were indicated as CpG units by quantification of the analysis results of the obtained sequences.
  • This CpG unit is either one containing one CpG site or one that is a set of continuous CpG sites. By such a method, in CpGI, 81 CpG sites were divided into 53 CpG units.
  • this 53CpG unit first, CpG units that could be analyzed in 25% or more of all samples (excluding low quality data and unchanged data) were extracted. Furthermore, regarding the extracted CpG unit, a sample that could be analyzed at 80% or more was extracted. Regarding CpG units / samples extracted in this way, CpG units that could be analyzed in 50% or more of all samples were adopted, and samples that could be analyzed in 50% or more of CpG units were adopted. This QC (quality control) step is in accordance with the SEQUENOM standard protocol.
  • CpGI CpG units out of 53 CpG units were analyzed (68%).
  • N 18 for healthy subjects
  • N 20 for depressed patients
  • N 20 for schizophrenic patients.
  • FIG. 4 is a diagram showing methylation data in the CpG unit upstream of exon I of the BDNF gene according to the example. That is, the analysis result of the methylation rate (0 to 100%) of each CpG unit in EpiTYPER software v1.0 (manufactured by SEQUENOM) is shown.
  • FIG. 5 is a diagram showing a hierarchical clustering result of methylation in the CpG unit upstream of exon I of the BDNF gene according to the example. That is, the result of analyzing the analysis data by EpiTYPER in FIG. 4 by hierarchical clustering is shown. The clustering analysis was performed using the statistical analysis software R, calculating the Euclidean distance between samples, and using hclust in the R package. The analysis results are shown by hierarchical clustering by the fully connected method.
  • 58 samples were classified into the original three groups based on the analysis data of the methylation rate of 36 CpG units in CpGI. Specifically, when the tree diagram of the hierarchical clustering shown in FIG. 5 is cut at a height (Height) of 1.0 to 1.5, the group of healthy subjects and the group of patients can be distinguished, When cut at a height of 0.5 to 1.0, it was confirmed that a healthy person, a depressed patient, and a schizophrenic patient can be completely distinguished.
  • CpGIV The base sequence of CpGIV is shown in SEQ ID NO: 10.
  • exon IV since there was no region satisfying the CpG island standard of UCSC genome browser described above, a region in which proximal promoter activity was found near the upstream of exon IV was selected (Martinowich K, Hattori D , Wu H, et al., Science 302, 890-893, 2003 and Yasuda S, Liang MH, Marinova Z, Yahyavi A, Chuang DM, Mol Psychiatry 14, 51-59, 2009).
  • FIG. 6 is a diagram showing an amplification region by PCR in a CpG island upstream of exon IV of the BDNF gene according to the comparative example. That is, FIG. 6 shows CpGIV having 1137 bp and having 28 CpG sites (CpGs), the amplified region in each PCR, and the CpG site contained in the region.
  • the PCR primer (primer for methylated DNA) was designed using EpiDesigner software as in the above-described example.
  • the base sequence of forward primer 5 is shown in SEQ ID NO: 11
  • the base sequence of reverse primer 5 is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the base sequence of forward primer 6 is shown in SEQ ID NO: 13
  • the base sequence of reverse primer 6 is shown in SEQ ID NO: 14.
  • FIG. 7 is a diagram showing data on methylation of CpG units in a CpG island upstream of exon IV of the BDNF gene according to the comparative example. That is, the analysis result of the methylation rate of each CpG unit in EpiTYPER software v1.0 is shown.
  • FIG. 8 is a diagram showing a hierarchical clustering result of CpG unit methylation in the CpG island upstream of exon IV of the BDNF gene according to the comparative example. That is, the result of analyzing the analysis data by EpiTYPER in FIG. 7 by hierarchical clustering is shown. The clustering analysis was performed using the statistical analysis software R, calculating the Euclidean distance between samples, and using hclust in the R package. The analysis results are shown by hierarchical clustering by the fully connected method.
  • the present example suggests that an inspection method using the result of methylation state in the detected CpGI region as an index is possible without using the result of final hierarchical clustering as an index. For example, if data of the methylation state pattern of DNA (such as methylation rate of each CpG unit) in the CpGI region of healthy subjects, depression patients and / or schizophrenia patients is prepared in advance, the data It is suggested that the disease can be examined by comparing the pattern detected from the peripheral blood of the subject with the pattern.
  • FIG. 9 is a diagram showing data of one-way analysis of variance of CpG units in healthy persons, depressed patients, and schizophrenic patients.
  • FIG. 9 shows the average value (Mean ⁇ of ratio) of the methylation rate in each CpG unit for each group, the difference between the calculated average values (Mean difference between group), and the average value.
  • Absolute value Absolute value of mean differce
  • p-value p value of one way test
  • small p-value significant difference
  • CpG_8, 9 (listed in ascending order of p-value) contributed to the classification of hierarchical clustering. That is, even if the methylation status of CpG units in all regions of CpGI is not used as an index, healthy individuals, depressed patients, and schizophrenia patients can be selected using only one or more of these CpG units as an index. It can be predicted that classification and inspection can be performed.
  • BDNF gene is originally involved in various brain functions and mental disorders. Therefore, it is suggested that not only depression and schizophrenia, but also a region-specific methylation state of CpGI is involved not only in various mental disorders.
  • the mental illness of the subject can be determined based on an objective judgment criterion based on a biological index in a technique targeting one gene. This makes it possible to perform a more accurate examination of mental illness. Furthermore, it has the potential to standardize the diagnosis and treatment of mental illness that is currently performed mainly by the subjective judgment of clinicians. Moreover, according to the method for evaluating a psychiatric disease therapeutic agent and / or preventive agent of the present invention, a psychiatric disease therapeutic agent and / or prophylactic agent can be evaluated according to an objective judgment criterion based on a biological index, It has the potential to greatly contribute to the development of new drugs.

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Abstract

　一つの遺伝子を対象とした手法での生物学的指標に基づいた客観的判断基準による、精神疾患の検査方法、精神疾患用の検査キット、ならびに精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法を提供する。本発明の精神疾患の検査方法は、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程、ならびに、当該試料のメチル化状態と、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態とを比較して、被験体が精神疾患か否かを検査する検査工程を含む。好ましくは、精神疾患は、うつ病および／または統合失調症である。

Description

精神疾患の検査方法、精神疾患用の検査キット、ならびに精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法
　本発明は、ＣｐＧアイランドのメチル化状態に基づく精神疾患の検査方法、精神疾患用の検査キット、ならびに精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法に関する。
　ＷＨＯ（World Health Organization）の疫学調査において、精神疾患は高い有病率を呈する。特に、うつ病および統合失調症は、有病率が高く、かつ日常生活上において中程度から重症の障害をもたらす疾患群である。
　現在、このような精神疾患の診断において、公的な統計学的診断基準はＡＰＡ（アメリカ精神医学会）によるthe fourth edition of the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（ＤＳＭ－ＩＶ）に依っている。この基準は、主観的な症状の陳述、観察、罹病期間、症状変化の時間経過、および臨床医の印象等から判断することが多い。
　このような主観的な診断では客観性に欠けるため、精神疾患は多様性に富み、正確な疫学調査や治療法の標準化、ならびに新薬の開発等が進みにくい。そこで、精神疾患の生物学的指標の必要性が久しく提唱されている。例えば、特許文献１には、多数の遺伝子の発現パターン（発現レベル）に基づく、生物学的な特徴に立脚した新たな精神疾患の診断方法、ならびに精神疾患を予防または治療し得る新たな物質を探索する方法が記載されている。また、特許文献２には、被験者の試料から採取される、特定の種々のタンパク質、核酸またはその断片の定量値を以て精神病性障害に罹患しているか否かを判断する方法が記載されている。これら種々のタンパク質、核酸またはその断片のうちの一つには、ＢＤＮＦ遺伝子に係る発現量についても記載されている。その他にも、特許文献３には、種々の遺伝子のＳＮＰｓ解析から、躁うつ疾患の予測およびかかり易さの判定が可能であると記載されており、当該遺伝子の一つにもＢＤＮＦ遺伝子が含まれている。
　一方、このような精神疾患の分野以外で、癌や生活習慣病等の多要因が関与して発症する疾患群に対して、エピジェネティクス（後天的な修飾により遺伝子発現が制御されることに起因する、遺伝学または分子生物学の分野）の観点からの発病マーカーや治療効果の判定が近年注目されてきている。例えば、特許文献４には、ＢＤＮＦ遺伝子の上流のＣｐＧアイランドのメチル化状態によって、大腸癌の病態を判断する方法が記載されている。
特開２００９－１１２２６６号公報 特開２００１－２４５６６１号公報 国際公開第２０１０／０３９５２６号 米国特許出願公開第２００９／００５３７０６号明細書
　前述したように、精神疾患の診断・治療において、臨床医の主観の判断によると、治療法の標準化、ならびに新薬の開発等が進みにくい。そこで、特許文献１ないし特許文献３に記載されている、ＢＤＮＦ遺伝子を含む多数の遺伝子等の発現レベルまたはＳＮＰｓ解析に基づいた精神疾患の判定方法での診断、治療では、客観的な判断が可能となる。
　しかし、当該多数の遺伝子または多数の遺伝子のＳＮＰｓ解析のうち、一部の遺伝子のみで発現レベルの変動が確認された場合、または、一部の遺伝子のＳＮＰｓ解析において該当する場合、完全な客観的判断のみで診断することができず、臨床医の主観の判断にも依らざるを得ない。さらに、これら多数の遺伝子の発現量の定量または多数のＳＮＰｓ解析での判断は、大きな労力を要する。そこで、精神疾患に対し、より容易な、例えば網羅的な遺伝子発現や多数のＳＮＰｓ解析と比較し、一つの遺伝子を対象とした手法において判定可能である新たな客観的判断基準の発見が望まれる。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、一つの遺伝子を対象とした手法での生物学的指標に基づいた客観的判断基準による、精神疾患の検査方法、精神疾患用の検査キット、ならびに精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成する為、本発明者らはＢＤＮＦ（Brain Derived Neurotrophic Factor）遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化（エピジェネティクス）に着目した。ＢＤＮＦは、神経栄養因子群の一つで、主に中枢神経で発見されている。また、記憶・学習、神経発達、神経新生等の脳機能に深く関与し、さらには、ストレスによる海馬の神経可塑性、うつ病の原因に深く関与していることもわかっている。
　ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドのメチル化は、身体的ならびに病理学的コンディションでのＢＤＮＦ遺伝子の制御に関連していることが提唱されている（Chen WG, Chang Q, Lin Y, et al., Science ３０２, ８８５－８８９, ２００３、およびYasuda S, Liang MH, Marinova Z, Yahyavi A, Chuang DM,　Mol Psychiatry １４, ５１－５９, ２００９参照）。さらに、近位プロモーター活性の観点から、エクソンＩも転写において重要であると考えられている（Sengupta PK, Smith BD, Biochim Biophys Acta １４４３, ７５－８９, １９９８およびDelgado MD, Leon J, Clin Transl Oncol ８, ７８０－７８７, ２００６参照）。
　しかし、ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩまたはエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドのメチル化と、うつ病や統合失調症等の精神疾患との関連性については、未だ明確には解明されていない。
　そこで、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ヒト（homo sapiens）のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩおよびエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドのメチル化について、当該エクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化のみが、階層的クラスタリングによって、健常者、うつ病患者および統合失調症患者の三つに分類できることが解明された。
　本発明の第１の態様に係る精神疾患の検査方法は、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程と、
　前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態と比較して、前記被験体が精神疾患か否かを検査する検査工程と、
　を含むことを特徴とする。
　好ましくは、前記精神疾患は、うつ病および／または統合失調症であることを特徴とする。
　より好ましくは、前記検査工程は、前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態のクラスタリング解析から得られ、精神疾患群と非精神疾患群とに分かれる樹形図を指標として、前記被験体が精神疾患か否かを検査する工程であることを特徴とする。
　また、好ましくは、前記検査工程は、前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおける、ＣｐＧ＿１、ＣｐＧ＿１４、ＣｐＧ＿１９，２０，２１、ＣｐＧ＿２２、ＣｐＧ＿２３、ＣｐＧ＿２４、ＣｐＧ＿２９，３０，３１、ＣｐＧ＿３、ＣｐＧ＿３２、ＣｐＧ＿３６、ＣｐＧ＿４、ＣｐＧ＿４８、ＣｐＧ＿６、ＣｐＧ＿７、ＣｐＧ＿７１、ＣｐＧ＿７６またはＣｐＧ＿８，９ユニットの少なくとも一つのＣｐＧユニットのメチル化状態と比較して、前記被験体が精神疾患か否かを検査する工程であることを特徴とする。
　さらに好ましくは、前記試料は、動物から採取した生体試料であることを特徴とする。
　好ましくは、前記試料は、ヒトから採取した末梢血であることを特徴とする。
　最も好ましくは、前記ＣｐＧアイランドは、配列番号１に記載の塩基配列を含むことを特徴とする。
　本発明の第２の態様に係る精神疾患用の検査キットは、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態検出用の、配列番号２および配列番号３、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、または、配列番号８および配列番号９のうち少なくとも一つのプライマーセットを含むことを特徴とする。
　本発明の第３の態様に係る精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法は、被験化合物の非存在下および存在下において、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程と、
　精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標として、前記被験化合物の非存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態と前記被験化合物の存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態とを比較して、前記被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する評価工程と、
　を含むことを特徴とする。
　好ましくは、前記精神疾患は、うつ病および／または統合失調症であることを特徴とする。
　より好ましくは、前記評価工程は、前記被験化合物の非存在下および存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態のクラスタリング解析から得られ、精神疾患群と非精神疾患群とに分かれる樹形図を指標として、前記被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する工程であることを特徴とする。
　さらに好ましくは、前記評価工程は、前記被験化合物の非存在下および存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおける、ＣｐＧ＿１、ＣｐＧ＿１４、ＣｐＧ＿１９，２０，２１、ＣｐＧ＿２２、ＣｐＧ＿２３、ＣｐＧ＿２４、ＣｐＧ＿２９，３０，３１、ＣｐＧ＿３、ＣｐＧ＿３２、ＣｐＧ＿３６、ＣｐＧ＿４、ＣｐＧ＿４８、ＣｐＧ＿６、ＣｐＧ＿７、ＣｐＧ＿７１、ＣｐＧ＿７６またはＣｐＧ＿８，９ユニットの少なくとも一つのＣｐＧユニットのメチル化状態と比較して、前記被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する工程であることを特徴とする。
　最も好ましくは、前記ＣｐＧアイランドは、配列番号１に記載の塩基配列を含むことを特徴とする。
　本発明の第１の態様に係る精神疾患の検査方法および第２の態様に係る精神疾患用の検査キットによれば、一つの遺伝子を対象とした手法での生物学的指標に基づいた客観的判断基準によって、被験体が精神疾患か否かを検査することができる。本発明の第３の態様に係る精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法によれば、一つの遺伝子を対象とした手法での生物学的指標に基づいた客観的判断基準によって、被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価することができる。
実施例に係る被験者の統計を示す図である。 実施例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるＰＣＲでの増幅領域を示す図である。 エクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧサイトのEpiTYPER解析の結果の一例、およびＰＣＲ増幅領域を示す図である。 実施例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧユニットのメチル化のデータを示す図である。 実施例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧユニットのメチル化の階層的クラスタリング結果を示す図である。 比較例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドにおけるＰＣＲでの増幅領域を示す図である。 比較例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧユニットのメチル化のデータを示す図である。 比較例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧユニットのメチル化の階層的クラスタリング結果を示す図である。 健常者、うつ病患者および統合失調症患者におけるＣｐＧユニットの一元配置分散分析のデータを示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本明細書において「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。なお、ヒト（homo sapiens）の「ＢＤＮＦ（Brain Derived Neurotrophic Factor）」のゲノム配列は、GenBankにおいて、アクセッション番号ＮＧ＿０１１７９４に登録されている。
　（精神疾患の検査方法）
　本発明の実施の形態１は精神疾患の検査方法に関する。具体的には、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程、ならびに、当該試料のメチル化状態と、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を比較して、被験体が精神疾患か否かを検査する検査工程を含む。
　本明細書において「精神疾患」とは、脳または心の機能的、器質的障害によって引き起こされる疾患を意味する。例えば、うつ病、統合失調症、双極性気分障害、感情障害、または、発達障害（自閉症、アスペルガー症候群もしくは注意欠陥多動性障害等）等を挙げることができる。このうち、最も好ましくは、うつ病および／または統合失調症を意味する。「非精神疾患」とは、これら精神疾患のいずれの疾患、症状にも該当していない状態、状況を意味する。個体がヒトである場合、非精神疾患の個体とは、主に健常者を意味する。
　本明細書において「被験体」とは、検査対象となる生物、特に動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコまたはイヌ等の哺乳動物）を意味する。「個体」とは、これら「被験体」と対応する、検査対象でない生物、特に動物を意味する。また、「試料」とは、被験体（個体）から採取でき、かつＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出することができ、当業者が一般的に利用しうる任意の対象試料を意味する。例えば、in vivoまたはin vitroでのＤＮＡを有する生体試料（組織、細胞または液体成分等）が挙げられる。最も好ましくは、被験体（個体）から採取した試料とはヒトから採取した末梢血である。
　被験体（個体）から試料を採取するには、上述した「被験体（個体）」および「試料」に適宜合った任意の方法において採取することが可能である。例えば、ヒトの末梢血を採取する場合には、注射器等により静脈から５ｍｌ程度の末梢血を採取すればよい。
　本明細書において「ＣｐＧアイランド」とは、当業者が一般的な意味で使用する、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の含量が多く、哺乳類の遺伝子のプロモーターの４０％近く（ヒトの遺伝子のプロモーターの約７０％）を占めるＤＮＡの領域を意味する。このようなＣｐＧアイランドの条件については、当業者が一般的に使用する条件であればどのような条件でも構わない。例えば、ＵＣＳＣ genome browser（http://genome.ucsc.edu/）のＣｐＧアイランドの基準である、％ＧＣ＞５０、length＞２００ｂｐかつＯｂｓ／Ｅｘｐ ＣｐＧ＞０．６の条件を挙げることができる。
　そこで、本明細書において「ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランド」とは、最も好ましくは、配列番号１に示す塩基配列を有する、ヒトの第１１番染色体の２７７４３４７３番目から２７７４４５６４番目のゲノムＤＮＡの領域を意味する。好ましくは、ヒトの当該領域付近のＣｐＧアイランドに該当する領域のことを意味する。ヒト以外のＢＤＮＦ遺伝子を有する生物については、当該生物において同様の領域に該当する場所を意味する。
　さらに、本明細書において「ＣｐＧアイランドの（ＣｐＧアイランドにおける）メチル化状態」とは、当該ＣｐＧアイランドの領域内におけるＣｐＧユニット（一つのＣｐＧサイトを含むもの、もしくは、連続しているＣｐＧサイトの集合であるもの）のメチル化の状況、パターンを意味する。
　例えば、塩基特異的切断反応と、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry）とを組み合わせた定量的ＤＮＡメチル化解析であるマスアレイ法（特に、MassARRAY（登録商標）system（SEQUENOM社製、特表２００２－５０７８８３号公報参照））によって検出され、当該ＣｐＧアイランド内の個々のＣｐＧユニットのメチル化比率を定量し作成される、メチル化プロファイルを意味する。
　実施の形態１では、まず、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する。ＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態の検出手段としては、当該技術分野において公知である任意の手段を用いることができる。例えば、前述したマスアレイ法、Methylation-specific ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、Methylight（Methylation-specific real-time ＰＣＲ）法、バイサルファイトシーケンス（Bisulfite sequencing）法、メチレーションチップ法、または、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法等を挙げることができる。
　次に、これらの手段により検出された当該被験体の試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態と、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料の当該ＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態とを比較し、被験体が精神疾患か否かを検査する。
　具体的には、例えば、予め複数の精神疾患患者および健常者のメチル化状態のデータを収集しておき、当該平均データと比較することによって被験体が精神疾患か否かを検査することができる。さらには、例えば、複数種の精神疾患毎の患者の平均データと比較し、いずれの疾患に該当するか検査してもよい。好ましくは、健常者、うつ病患者および／または統合失調症患者の平均データと比較することにより、被験体（対象者）がいずれに該当するかを検査する。または、平均データでなくとも、多変量解析を用いることにより、いずれに該当するか検査することも可能である。
　最も好ましくは、当該試料のメチル化状態と、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態のクラスタリング解析の結果を指標として、被験体が精神疾患か否かを検査する。例えば、具体的な方法としては、まず、予め複数の健常者、うつ病患者および／または統合失調症患者のサンプルのメチル化状態のデータを収集しておく。次に、それぞれのＣｐＧユニットおよびメチル化状態に基づいて、統計ソフト等を用いたクラスタリング（好ましくは完全連結法の階層的クラスタリング）解析を行い、三つ（健常者、うつ病患者および／または統合失調症患者）に分類したデンドログラム（樹形図）が作成されることを確認する。これを用い、対象試料（一つまたは複数）のメチル化状態がいずれに属するのか判断、処理またはこれらと共に再度クラスタリング解析を行うことによって検査を行う。
　また、一部のＣｐＧユニットのみに限定しても、ある程度の検査は可能である（実施例参照）。具体的には、被験体から採取した試料のメチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおける、ＣｐＧ＿１、ＣｐＧ＿１４、ＣｐＧ＿１９，２０，２１、ＣｐＧ＿２２、ＣｐＧ＿２３、ＣｐＧ＿２４、ＣｐＧ＿２９，３０，３１、ＣｐＧ＿３、ＣｐＧ＿３２、ＣｐＧ＿３６、ＣｐＧ＿４、ＣｐＧ＿４８、ＣｐＧ＿６、ＣｐＧ＿７、ＣｐＧ＿７１、ＣｐＧ＿７６またはＣｐＧ＿８，９ユニットの少なくとも一つ、好ましくはより多く、最も好ましくはこれらのＣｐＧユニット全てのメチル化状態と比較し、被験体が精神疾患か否かを検査する。
　このように本実施の形態１に係る精神疾患の検査方法によれば、一つの遺伝子を対象とした手法での生物学的指標に基づいた客観的判断基準によって、被験体が精神疾患か否かを検査することができる。すなわち、臨床医等の主観的な判断によらずに精神疾患か否かを検査できるため、より正確に検査を行うことが可能となる。
　特に、試料をヒト（他の実験動物等でもよい）の末梢血として検査、すなわち診断を行う場合には、生きているヒトに対し苦痛を伴わずに精神疾患の診断を行うことができるため、さらに有利な効果を奏する。前述したような、健常者、うつ病患者および／または統合失調症患者等のメチル化状態のデータ収集の際においても好適である。
　（精神疾患用の検査キット）
　本発明の実施の形態２は、実施の形態１に係る精神疾患の検査方法において使用する、精神疾患用の検査キットに関する。具体的には、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化検出用の少なくとも一つのプライマーセットを含むことを特徴とする。すなわち、本発明の実施の形態２に係る精神疾患用の検査キットは、実施の形態１で述べたメチル化状態の検出手段のうち、ＰＣＲの工程を含むメチル化状態の検出手段での検査方法において使用する。好ましくは、当該精神疾患用の検査キットは、うつ病用の検査キットおよび／または統合失調症用の検査キットである。
　メチル化検出用のプライマーセットは、当該ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランド内の領域（好ましくは、ヒトの第１１番染色体の２７７４３４７３番目から２７７４４５６４番目のゲノムＤＮＡの領域（配列番号１））のメチル化状態を検出するために用いるフォワードおよびリバースプライマーのセットのことである。プライマーは、鋳型との特異的な結合が可能となるような適当な塩基数、例えば、数十ｂｐ、１０～３０ｂｐ程度を有することが好ましい。例えば、マスアレイ法によってメチル化状態を検出する場合のＰＣＲの際に使用する、２００～６００ｂｐ毎をターゲット領域としたフォワードおよびリバースプライマーのセットが挙げられる。
　なお、当該プライマーセットの塩基配列については、当業者であれば公知のメチル化検出用プライマー設計ソフトを使用することで容易に設計可能である。当該プライマーセットの塩基配列の一例については実施例を参照されたい。このようなプライマーセットは、少なくとも一つ含んでいればよく、実施例で述べるように四つのプライマーセットを含んでいても構わない。例えば、配列番号２および配列番号３の塩基配列のフォワードおよびリバースプライマー、配列番号４および配列番号５の塩基配列のフォワードおよびリバースプライマー、配列番号６および配列番号７の塩基配列のフォワードおよびリバースプライマー、または、配列番号８および配列番号９の塩基配列のフォワードおよびリバースプライマーのうち少なくとも一つのプライマーセットを挙げることができる。プライマーの塩基配列についても、それぞれのセットのプライマーとして機能することができれば、配列番号２ないし配列番号９の塩基配列を含有している配列であればよい。
　その他、各メチル化状態の検出手段に合わせた、各種試薬、酵素、緩衝液、反応器材および／または説明書等が含まれても構わない。例えば、マスアレイ法の場合、試料を溶解するための溶解液および／または重亜硫酸塩含有試薬等を含んでも構わない。
　このように本実施の形態２に係る精神疾患用の検査キットによれば、ＰＣＲの工程を含むメチル化状態の検出手段での精神疾患の検査を、より簡便に行うことができる。また、実施の形態１に係る精神疾患の検査方法と同様に、生物学的指標に基づいた客観的判断基準によって、被験体が精神疾患か否かを検査することができる。すなわち、臨床医等の主観的な判断によらずに精神疾患か否かを検査できるため、より正確に検査を行うことが可能となる。
　（精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法）
　本発明の実施の形態３は、精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法に関する。具体的には、被験化合物の非存在下および存在下において、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程、ならびに、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標として、被験化合物非存在下の試料のメチル化状態と被験化合物存在下の試料のメチル化状態を比較し、被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する評価工程を含む。
　本明細書において「被験化合物」とは、精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かの評価（精神疾患治療剤および／または予防剤のスクリーニングも含む）の対象となりうる、あらゆる物質を意味する。例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、未精製のものでも被験化合物として使用することができる。また、新規な物質に限らず、公知の物質またはその改良物であってもよい。例えば、既存の治療薬もしくは予防薬またはその誘導体につき、評価をすることも可能である。
　まず、被験化合物の非存在下および存在下において、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する。試料の採取、およびメチル化状態の検出手段等については、前述した実施の形態１と同様である。
　具体的には、例えば、まず精神疾患である動物の末梢血のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を、マスアレイ法等の手段にて予め検出しておく。その後、当該動物に被験化合物を経口投与または静脈内投与等を行い、同様に末梢血の当該ＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態をマスアレイ法等の手段にて検出する。
　次に、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した当該ＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標とし、このように検出した被験化合物の非存在下および存在下における試料のメチル化状態を比較する。その結果から、被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する。
　具体的には、例えば、予め複数の精神疾患患者および健常者のメチル化状態のデータを収集しておき、当該平均データ等を指標とし、被験化合物の投与前後の試料のメチル化状態を比較する。これにより、被験化合物が精神疾患の治療剤および／または予防剤となるか否かを評価することができる。好ましくは、精神疾患治療剤および／または予防剤は、うつ病治療剤、うつ病予防剤、統合失調症治療剤および／または統合失調症予防剤である。なお、平均データでなくとも、多変量解析により評価を行うことも可能である。
　最も好ましくは、被験化合物の非存在下および存在下における当該試料のメチル化状態と、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態とのクラスタリング解析の結果を指標として、被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する。例えば、具体的な方法としては、まず、予め複数の健常者、うつ病患者および／または統合失調症患者のサンプルのメチル化状態のデータを収集しておく。次に、それぞれのＣｐＧユニットおよびメチル化状態に基づいて、統計ソフト等を用いたクラスタリング（好ましくは完全連結法の階層的クラスタリング）解析を行い、三つ（健常者、うつ病患者および／または統合失調症患者）に分類したデンドログラム（樹形図）が作成されることを確認する。これを用い、被験化合物の投与前後の試料のメチル化状態がいずれに属するのか判断、処理またはこれらと共に再度クラスタリング解析を行うことによって評価する。
　また、実施の形態１と同様に、一部のＣｐＧユニットのみに限定しても、ある程度の評価は可能である（実施例参照）。具体的には、被験化合物の存在下および非存在下における被験体から採取した試料のメチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおける、ＣｐＧ＿１、ＣｐＧ＿１４、ＣｐＧ＿１９，２０，２１、ＣｐＧ＿２２、ＣｐＧ＿２３、ＣｐＧ＿２４、ＣｐＧ＿２９，３０，３１、ＣｐＧ＿３、ＣｐＧ＿３２、ＣｐＧ＿３６、ＣｐＧ＿４、ＣｐＧ＿４８、ＣｐＧ＿６、ＣｐＧ＿７、ＣｐＧ＿７１、ＣｐＧ＿７６またはＣｐＧ＿８，９ユニットの少なくとも一つ、好ましくはより多く、最も好ましくはこれらのＣｐＧユニット全てのメチル化状態と比較し、被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤か否かを評価することができる。
　このように本実施の形態３に係る精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法によれば、一つの遺伝子を対象とした手法での生物学的指標に基づいた客観的判断基準によって、被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価することができる。すなわち、臨床医等の主観的な判断によらずに精神疾患治療剤および／または予防剤の評価ができるため、より正確な評価を行うことが可能となり、新薬の開発に大いに貢献する可能性が高い。
　以下、実施例および比較例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例および比較例は本発明を限定するものではない。
　（実施例）
　本実施例では、ヒトの末梢血を用いたＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩの上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態の検出、ならびに階層的クラスタリングによる解析に係る実施例について詳細に説明する。
　まず、本実施例に係る被験者について詳細に説明する。
　図１は、実施例に係る被験者の統計を示す図である。図１に示すように、まず、三つの被験者のグループに分けて実施した。コントロール（Control）としては、広告で募り、現在または過去に精神的・身体的に病気を有しておらず、かつ第一度近親者にもうつ病患者を持たない健常者を被験者とした。うつ病患者（Major depression）および統合失調症患者（Schizophrenia）については、いずれも問診および医学的な記録情報に基づき、ＤＳＭ－ＩＶの基準を用いて精神科医に診断された患者を被験者とした。
　うつ病患者に関しては、系統立てた臨床的問診、精神疾患研究医によるMini-International Neuropsychiatric Interview（Otsubo T, Tanaka K, Koda R, et al., Psychiatry Clin Neurosci ５９, ５１７－５２６, ２００５およびSheehan DV, Lecrubier Y, Sheehan KH, et al., J Clin Psychiatry ５９ Suppl ２０, ２２－３３ quiz ４－５７, １９９８参照）の日本語版も用い、診断を行った。性別（Gender、男性（Ｍ）／女性（Ｆ））、および年齢（Age）は、図１に示す通りである。それぞれのグループの人数（Ｎ）についての詳細は後述する。
　次に、ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドについて詳細に説明する。
　具体的には、本実施例におけるＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドとして、ヒトの第１１番染色体の２７７４３４７３番目から２７７４４５６４番目の領域を選んだ（以下、この領域をＣｐＧＩという）。ＣｐＧＩの塩基配列は、前述の通り配列番号１に示す。なお、ＣｐＧＩは、ＵＣＳＣ genome browser（http://genome.ucsc.edu/）のＣｐＧアイランドの基準である、％ＧＣ＞５０、length＞２００ｂｐかつＯｂｓ／Ｅｘｐ ＣｐＧ＞０．６の条件を満たすものである（％ＧＣ＝６０．５、length＝１０９２ｂｐ、Ｏｂｓ／Ｅｘｐ ＣｐＧ＝０．８３）。
　以下、実施例に係るMassARRAY（登録商標）SystemによるＤＮＡメチル化検出、解析について詳細に説明する。
　前述した三つのグループの被験者から末梢血のサンプル５ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウムを含む真空チューブにおいて、－８０度で保管しておいた。これらのサンプルを、DNeasy Blood&Tissue Kit（Qiagen社製、ドイツ、ヒルデン）を用い、使用説明書通りにゲノムＤＮＡを分離した。さらに、分離したゲノムＤＮＡ１μｇを、ＥＺ ＤＮＡ methylation kit（Zymo Research社製、米国カリフォルニア州オレンジ）を使用し、亜硫酸水素ナトリウムによって、非メチル化のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に転換させた（バイサルファイト処理）。
　次に、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡ１μｇを使用し、ターゲット領域であるＣｐＧＩに対し、使用説明書に従って、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ配列を取り込ませたＰＣＲを行った。図２は、実施例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるＰＣＲでの増幅領域を示す図である。すなわち、図２には、１０９２ｂｐであり、８１ＣｐＧサイト（ＣｐＧｓ）を有するＣｐＧＩと、それぞれのＰＣＲでの増幅領域およびその領域に含まれるＣｐＧサイトとが示されている。なお、ＰＣＲのプライマー（メチル化ＤＮＡ用プライマー）については、EpiDesigner software（http://www.epidesigner.com/）を用いて設計した。なお、EpiDesignerのＣｐＧアイランドの基準は、％ＧＣ＞５０かつＯｂｓ／Ｅｘｐ ＣｐＧ＞０．６である。
　図２に示すPrimer１の増幅領域における、フォワードプライマー１の塩基配列を配列番号２に、リバースプライマー１の塩基配列を配列番号３に示す。Primer２の増幅領域における、フォワードプライマー２の塩基配列を配列番号４に、リバースプライマー２の塩基配列を配列番号５に示す。Primer３の増幅領域における、フォワードプライマー３の塩基配列を配列番号６に、リバースプライマー３の塩基配列を配列番号７に示す。Primer４の増幅領域における、フォワードプライマー４の塩基配列を配列番号８に、リバースプライマー４の塩基配列を配列番号９に示す。
　これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った後、増幅された産物に対して、使用説明書に従い、in vitroでの転写およびMassCLEAVE Ｔ-only kitを用いたＲＮase分解を行った。分解反応後のサンプル１０～２０ｎｌを、MassARRAY nanodispenser（SEQUENOM社製）を使用して、前処理されたシリコンマトリックスチップ（SpectroCHIP（SEQUENOM社製））に分注した。その後、MassARRAY Compact System ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（SEQUENOM社製）を使用して、メチル化ＣｐＧサイトを分析した。メチル化ＣｐＧサイト解析におけるスペクトルのメチル化率は、EpiTYPER software ｖ１．０（SEQUENOM社製）で算出した。図３は、エクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧサイトのEpiTYPER解析の結果の一例、およびＰＣＲ増幅領域を示す図である。amplicon1ないしamplicon4は、前述したＰＣＲによる工程によって増幅される４つの領域である。図３に示すＣｐＧＩのEpiTYPER解析で検出された８１箇所のＣｐＧサイト（ＣｐＧ count）について、Base Pairs on Input Sequenceの少ない順に、ＣｐＧ＿１ないしＣｐＧ＿８１として名称を付けた。
　バイサルファイト処理されたそれぞれのサンプルから、独立して三回分析を行った。これらの得られた配列のそれぞれの分析結果の定量によって、それぞれのＣｐＧ＿１ないしＣｐＧ＿８１を、ＣｐＧユニットとして示した。このＣｐＧユニットは、一つのＣｐＧサイトを含むもの、または、連続しているＣｐＧサイトの集合であるもののいずれかである。このような方法によって、ＣｐＧＩでは、８１箇所のＣｐＧサイトが５３箇所のＣｐＧユニットに分けられた。
　この５３ＣｐＧユニットにおいて、まず、全サンプル中２５％以上で解析可能（質の低いデータおよび変化しないデータを除いたもの）であったＣｐＧユニットを抽出した。さらに、抽出したＣｐＧユニットに関して、８０％以上で解析可能であったサンプルを抽出した。このように抽出したＣｐＧユニット／サンプルに関して、全サンプル中５０％以上で解析可能であったＣｐＧユニットを採用し、ＣｐＧユニットに関し５０％以上で解析可能であったサンプルを採用した。なお、このＱＣ（quality control）stepは、SEQUENOMの標準プロトコルにそったものである。
　この結果、本実施例（ＣｐＧＩ）では５３ＣｐＧユニットのうち３６ＣｐＧユニットが解析された（６８％）。また、図１に示すように、サンプル数は健常者がＮ＝１８、うつ病患者がＮ＝２０、統合失調症患者がＮ＝２０で解析された。
　図４は、実施例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧユニットにおけるメチル化のデータを示す図である。すなわち、EpiTYPER software ｖ１．０（SEQUENOM社製）での、各ＣｐＧユニットのメチル化率（０～１００％）の解析結果を示している。図５は、実施例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧユニットにおけるメチル化の階層的クラスタリング結果を示す図である。すなわち、図４のEpiTYPERによる解析データを階層的クラスタリングで分析した結果を示す。クラスタリング解析は、統計解析ソフトウェアＲを用いて、試料間のユークリッド距離を算出し、Ｒのパッケージ内のhclustを用いて行った。分析結果は、完全連結法による階層的クラスタリングによって示されている。
　図５に示すように、５８サンプルは、ＣｐＧＩ内の３６ＣｐＧユニットのメチル化率の解析データに基づいて、元々の三つのグループに分類された。具体的には、図５に示す階層的クラスタリングの樹形図の高さ（Height）１．０～１．５でカットした場合、健常者のグループと患者のグループとを区別することができ、高さ０．５～１．０でカットした場合、健常者とうつ病患者と統合失調症患者とを完全に区別することができることが確認された。
　（比較例）
　本比較例では、ヒトの末梢血を用いたＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態の検出、ならびに階層的クラスタリングによる解析に係る比較例について詳細に説明する。なお、本比較例に係る被験者については、前述した実施例と同様であり、図１と同様である。
　まず、ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドについて詳細に説明する。
　具体的には、本比較例におけるＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドとして、ヒトの第１１番染色体の２７７２２８４４番目から２７７２３９８０番目の領域を選んだ（以下、この領域をＣｐＧＩＶという）。ＣｐＧＩＶの塩基配列を、配列番号１０に示す。なお、エクソンＩＶについては、前述したＵＣＳＣ genome browserのＣｐＧアイランドの基準を満たす領域が存在しなかったため、エクソンＩＶの上流付近の近位プロモーター活性が認められた領域を選択した（Martinowich K, Hattori D, Wu H, et al., Science ３０２, ８９０－８９３, ２００３およびYasuda S, Liang MH, Marinova Z, Yahyavi A, Chuang DM, Mol Psychiatry １４, ５１－５９, ２００９参照）。
　以下、比較例に係るMassARRAY（登録商標）SystemによるＤＮＡメチル化検出、解析について詳細に説明する。
　前述した実施例と同様に、被験者からの末梢血のゲノムＤＮＡ分離、バイサルファイト処理、それに続くＰＣＲを行った。図６は、比較例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドにおけるＰＣＲでの増幅領域を示す図である。すなわち、図６には、１１３７ｂｐであり、２８ＣｐＧサイト（ＣｐＧｓ）を有するＣｐＧＩＶと、それぞれのＰＣＲでの増幅領域およびその領域に含まれるＣｐＧサイトとが示されている。なお、ＰＣＲのプライマー（メチル化ＤＮＡ用プライマー）については、前述した実施例と同様、EpiDesigner softwareを用いて設計した。
　図６に示すPrimer５の増幅領域における、フォワードプライマー５の塩基配列を配列番号１１に、リバースプライマー５の塩基配列を配列番号１２に示す。Primer６の増幅領域における、フォワードプライマー６の塩基配列を配列番号１３に、リバースプライマー６の塩基配列を配列番号１４に示す。
　その後、前述した実施例と同様に、ＰＣＲ後の増幅産物に対してin vitroでの転写、ＲＮase分解を行った。その後も同様に、分解反応後のサンプル１０～２０ｎｌを、前処理されたシリコンマトリックスチップに分注し、MassARRAY Compact System ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用してメチル化ＣｐＧサイトを分析した。メチル化ＣｐＧサイト解析におけるスペクトルのメチル化率は、EpiTYPER software ｖ１．０で算出した。独立した三回の分析、およびＣｐＧユニットへの分割についても同様である。なお、比較例であるＣｐＧＩＶでは、２８ＣｐＧサイトが２４ＣｐＧユニットにわけられた。
　この２４ＣｐＧユニットにおいて、前述した実施例と同様に、SEQUENOMの標準プロトコルにそったＱＣ stepを行った。その結果、ＣｐＧＩＶでは、２４ＣｐＧユニットのうち１９ＣｐＧユニットが解析された（７９％）。
　図７は、比較例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧユニットのメチル化のデータを示す図である。すなわち、EpiTYPER software ｖ１．０での、各ＣｐＧユニットのメチル化率の解析結果を示している。図８は、比較例に係るＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドにおけるＣｐＧユニットのメチル化の階層的クラスタリング結果を示す図である。すなわち、図７のEpiTYPERによる解析データを、階層的クラスタリングで分析した結果を示す。クラスタリング解析は、統計解析ソフトウェアＲを用いて、試料間のユークリッド距離を算出し、Ｒのパッケージ内のhclustを用いて行った。分析結果は、完全連結法による階層的クラスタリングによって示されている。
　図８に示すように、図５の実施例とは異なり、５８サンプルは、１９ＣｐＧユニットのメチル化率の解析データに基づいた元の三つのグループには分類されなかった。
　以上のＣｐＧＩに係る実施例およびＣｐＧＩＶに係る比較例から、ＣｐＧＩの領域特異的に、メチル化状態を検出し階層的クラスタリングで分析（分類）することにより、健常者、うつ病患者および統合失調症患者の対象三群を完全に分類できることが実証された。
　なお、本実施例から、最終的な階層的クラスタリングによる結果を指標としなくとも、検出したＣｐＧＩの領域におけるメチル化状態の結果を指標とする検査方法も可能であることが示唆される。例えば、予め健常者、うつ病患者および／または統合失調症患者等のＣｐＧＩの領域におけるＤＮＡのメチル化状態のパターン（各ＣｐＧユニットのメチル化率等）のデータを作成しておけば、当該データと被験者の末梢血から検出したパターンとを比較することによって疾患を検査することが可能であることが示唆される。
　さらに、図４に示すＣｐＧＩの実施例の結果から、特定のＣｐＧユニットが階層的クラスタリングの分類に寄与していることが予測される。本発明者らは、このようなＣｐＧユニットを抽出するため、まず、三つのサンプルのグループ毎に各ＣｐＧユニットのメチル化の平均値を算出した。次に、各グループ間の平均値の差を算出し、この平均値の差を用いて一元配置分散分析（One-way test）にて統計学的に非常に有意な差（ｐ＜０．００１）が検出されたＣｐＧユニットを抽出した。図９は、健常者、うつ病患者および統合失調症患者におけるＣｐＧユニットの一元配置分散分析のデータを示す図である。図９において、Ｃは健常者を示し、Ｄはうつ病患者を示し、Ｓは統合失調症患者を示す。また、図９には、それぞれのグループにおける、グループ毎の各ＣｐＧユニットにおけるメチル化率の平均値（Mean of ratio）、算出されたグループ間の平均値の差（Mean difference between group）、平均値の差の絶対値（Absolute value of mean differce）、および、一元配置分散分析を行った際の（ｐ値の小さい（差が有意な）順における）ｐ値（p value of one way test）、が記載されている。なお、当該データには主として有意差が有るもののみを記載した。
　この結果、図４および図９において、ＣｐＧ＿１、ＣｐＧ＿１４、ＣｐＧ＿１９，２０，２１、ＣｐＧ＿２２、ＣｐＧ＿２３、ＣｐＧ＿２４、ＣｐＧ＿２９，３０，３１、ＣｐＧ＿３、ＣｐＧ＿３２、ＣｐＧ＿３６、ＣｐＧ＿４、ＣｐＧ＿４８、ＣｐＧ＿６、ＣｐＧ＿７、ＣｐＧ＿７１、ＣｐＧ＿７６およびＣｐＧ＿８，９（ｐ値の小さい順に列挙）が、階層的クラスタリングの分類に寄与していることが予測された。すなわち、ＣｐＧＩ全ての領域のＣｐＧユニットにおけるメチル化状態を指標としなくとも、これらのＣｐＧユニットのうち、一つまたは複数個におけるメチル化のみを指標として健常者、うつ病患者および統合失調症患者を分類・検査できることが予測されうる。
　また、ＢＤＮＦ遺伝子は元来様々な脳機能、精神疾患に関与していることが知られている。そのため、うつ病および統合失調症のみだけでなく、多様な精神疾患に対しても同様にＣｐＧＩの領域特異的なメチル化状態が関与していることも示唆される。
　本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
　本出願は、２０１０年８月４日に出願された日本国特許出願２０１０－１７５７４８号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１０－１７５７４８号の、明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩおよびエクソンＩＶ上流のＣｐＧアイランドのメチル化について、当該エクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態のみが、階層的クラスタリングによって、健常者、うつ病患者および統合失調症患者のそれぞれに分類できることが解明された。これは、エピジェネティクスによる精神疾患発症・難治化の機序解明につながるものであり、当該エクソンＩ上流のＣｐＧアイランド領域、さらには領域内の特定ＣｐＧサイトのメチル化状態における、精神疾患の生物学的指標を大きく示唆するものである。
　そこで、本発明の精神疾患の検査方法および精神疾患用の検査キットによれば、一つの遺伝子を対象とした手法での生物学的指標に基づいた客観的判断基準によって、被験体の精神疾患を検査することができ、より正確な精神疾患の検査を行うことが可能となる。さらには、現在は主に臨床医の主観の判断によって行われている精神疾患の診断・治療を標準化できる可能性を有する。また、本発明の精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法によれば、生物学的指標に基づいた客観的判断基準によって、精神疾患治療剤および／または予防剤を評価することができ、新薬等を開発する上で大きく貢献する可能性を有する。

Claims (13)

  1. 　被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程と、
    　前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態と比較して、前記被験体が精神疾患か否かを検査する検査工程と、
    　を含むことを特徴とする精神疾患の検査方法。
  2. 　前記精神疾患は、うつ病および／または統合失調症であることを特徴とする請求項１に記載の精神疾患の検査方法。
  3. 　前記検査工程は、前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態のクラスタリング解析から得られ、精神疾患群と非精神疾患群とに分かれる樹形図を指標として、前記被験体が精神疾患か否かを検査する工程であることを特徴とする請求項１または２に記載の精神疾患の検査方法。
  4. 　前記検査工程は、前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおける、ＣｐＧ＿１、ＣｐＧ＿１４、ＣｐＧ＿１９，２０，２１、ＣｐＧ＿２２、ＣｐＧ＿２３、ＣｐＧ＿２４、ＣｐＧ＿２９，３０，３１、ＣｐＧ＿３、ＣｐＧ＿３２、ＣｐＧ＿３６、ＣｐＧ＿４、ＣｐＧ＿４８、ＣｐＧ＿６、ＣｐＧ＿７、ＣｐＧ＿７１、ＣｐＧ＿７６またはＣｐＧ＿８，９ユニットの少なくとも一つのＣｐＧユニットのメチル化状態と比較して、前記被験体が精神疾患か否かを検査する工程であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の精神疾患の検査方法。
  5. 　前記試料は、動物から採取した生体試料であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の精神疾患の検査方法。
  6. 　前記試料は、ヒトから採取した末梢血であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の精神疾患の検査方法。
  7. 　前記ＣｐＧアイランドは、配列番号１に記載の塩基配列を含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の精神疾患の検査方法。
  8. 　被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態検出用の、配列番号２および配列番号３、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、または、配列番号８および配列番号９のうち少なくとも一つのプライマーセットを含むことを特徴とする精神疾患用の検査キット。
  9. 　被験化合物の非存在下および存在下において、被験体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程と、
    　精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標として、前記被験化合物の非存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態と前記被験化合物の存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態とを比較して、前記被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する評価工程と、
    　を含むことを特徴とする精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法。
  10. 　前記精神疾患は、うつ病および／または統合失調症であることを特徴とする請求項９に記載の精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法。
  11. 　前記評価工程は、前記被験化合物の非存在下および存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態のクラスタリング解析から得られ、精神疾患群と非精神疾患群とに分かれる樹形図を指標として、前記被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する工程であることを特徴とする請求項９または１０に記載の精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法。
  12. 　前記評価工程は、前記被験化合物の非存在下および存在下における前記被験体から採取した試料の前記メチル化状態を、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＢＤＮＦ遺伝子のエクソンＩ上流のＣｐＧアイランドにおける、ＣｐＧ＿１、ＣｐＧ＿１４、ＣｐＧ＿１９，２０，２１、ＣｐＧ＿２２、ＣｐＧ＿２３、ＣｐＧ＿２４、ＣｐＧ＿２９，３０，３１、ＣｐＧ＿３、ＣｐＧ＿３２、ＣｐＧ＿３６、ＣｐＧ＿４、ＣｐＧ＿４８、ＣｐＧ＿６、ＣｐＧ＿７、ＣｐＧ＿７１、ＣｐＧ＿７６またはＣｐＧ＿８，９ユニットの少なくとも一つのＣｐＧユニットのメチル化状態と比較して、前記被験化合物が精神疾患治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する工程であることを特徴とする請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法。
  13. 　前記ＣｐＧアイランドは、配列番号１に記載の塩基配列を含むことを特徴とする請求項９ないし１２のいずれか１項に記載の精神疾患治療剤および／または予防剤の評価方法。
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