KR102110883B1 - 정신 질환 진단용 kmt2c 다형성 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 KMT2C(lysine (K)-specific methyltransferase 2 C) 유전자 내 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 이용한 정신질환 진단용 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

정신 질환 진단용 KMT2C 다형성 마커{KMT2C SNP MARKER FOR DIAGNOSIS OF MENTAL DISORDER}

본 발명은 정신 질환 진단을 위한 KMT2C　 (lysine (K)-specific methyltransferase 2 C) 유전자 단일염기 다형성에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 rs4639425의 SNP를 이용하여 정신 질환을 진단하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

정신질환 중 하나인 기분장애에는 양극성 장애와 우울장애가 있다.

양극성 장애(bipolar disorder, BD)는 만성적이고 반복적인 정신질환으로 극단적인 들뜸(즉, 조증)에서 심한 우울증에 이르기까지 기분 변화가 나타나는 특징이 있고 흔히 정신병적 특징을 동반한다.　　전 세계 사람들의 1 % 이상이 국적이나 민족성에 관계없이 BD의 영향을 받는다.　BD는 사회 기능, 삶의 질, 자살에 대한 해로운 영향으로 인해, 특히 사회적, 경제적으로 큰 부담을 안겨준다.　가족, 쌍둥이 및 입양 연구의 유전 역학 조사는 BD의 발생에 유전적 기여가 상당히 있음을 보여준다.　　BD는 가장 유전적인 정신 질환 중 하나이며 일란성 쌍둥이의 일치율은 약 40-70 %로 주요 우울 장애 (major depressive disorder, MDD)보다 높다.

종래의 유전자 연관 연구들은 BD에 대한 유전자 후보로 다양한 SNVs(common single nucleotide variants)를 제안하였고, 그리고 GWAS (genome-wide association studies)는　CACNA1C,　ODZ4　및　NCAN과 같은 SNVs의 중요성을 확인했다.　BD의 취약성은 복잡한 유전 상속 패턴을 가진 다른 정신 질환과 마찬가지로 공통된 변이에 의해 설명될 수 있지만, BD에 대한 유전적 위험은 작은 침투 효과를 가진 일반적인 SNV의 수집에 의해 완전히 설명 될 수 없다.　더욱이 GWAS는 표본 크기가 크다는 것에도 불구하고 일반적인 합의를 이끌어 낼 수 없었다.　 최근 인구 유전 이론은 대안적인 저인자유전 유사 멘델 모델(oligogenic quasi-Mendelian model)을 제안했는데, 이는　적당한 효과를 가진 희귀 변종의 클러스터가 공동으로 유전적 복잡성과 질병 발병을 일으킬 수 있다는 것이며, 복제 수 변이(copy number variants)를 포함한 희귀 SNVs 또는 구조적 게놈 변이는 BD에 대한 추가적 유전 감수성을 설명 할 수 있다.　인간 게놈 데이터 활용 증가, 시퀀싱의 감소 비용, 고급 시퀀싱 기술은 WES (whole-exome sequencing) 또는 WGS (whole-genome sequencing)를 통해 정신 질환의 원인이 되는 보통 또는 고침투력을 가진 희귀 유전 변이를 탐색할 수 있게 해 준다.　

최근에, 신경 영상 기술의 발달로 정신 영상 장애에서, 유전자 후보와, 뇌 구조, 기능 및 연결성의 변이와 같은, 중간 신경 표현형(and intermediate neural phenotype) 사이의 연관성을 분석 할 수 있는 유전 연구와 함께 이미징이 가능하게 되었다. 신경이미지-유전 접근법의 결합으로 정신질환이　있는 환자의 감정, 인지 및 행동에 대한 유전적 영향의 신경 메커니즘을 밝혀 낼 수 있다.　

유전자 관련 연구로부터 유전적 위험 변이의 효과는, BD 환자에서 신경 회로의 구조적 또는 기능적 변화의 내적표현형(endophenotypes)에 대한 보다 강력하고 분명한 증거가 될 수 있고 제안되었다.　 BD 소인을 찾기 위해서 WES 또는 WGS를 통해 희귀 변이의 중요한 역할을 나타내는 증거가 많이 드러났지만, WES로 확인된 SNVs 및 뇌 MRI 데이터 사이의 연관성을 조사한 연구는 없다.

이에 본 발명자들은 BD　환자와 건강한 대조군 대상으로　WES로 확인된 SNVs 및 뇌 MRI 데이터 사이의 연관성을 조사하여 KMT2C 다형성 마커가 정신질환을 진단하는 마커로 이용될 수 있음을 최초로 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

미국공개특허 US 2015-0292016

본 발명의 목적은 정신질환 진단용 마커 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 정신질환 진단용 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 정신질환 진단용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 정신질환 진단에 관한 정보를 제공하기 위한 것이다.

먼저, 본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"유전적 다형성(genetic polymorphism)"은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다.

"다형성"이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 ("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#")이다.

"단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(A 또는 G)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

"유전자형(genotype)"이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다.

"대립 인자" 또는 '대립 유전자'란 같은 염색체 위치(same chromosomal locus) 를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태(alternative forms) 중 하나를 뜻한다.

"대립유전자 빈도"는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)을 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립유전자 빈도를, 계통 또는 집단으로부터의 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 정신질환, 바람직하게는 양극성 장애(BD)의 존재를 확인하는 것을 포함한다. 정신질환은 대부분 유전성이어서 이를 정확하게 진단할 수 있는 지표가 매우 중요한데, 본 발명의 KMT2C　 (lysine (K)-specific methyltransferase 2 C) SNP가 이러한 지표 기능을 하므로 정신질환 진단 인자로 이용할 수 있다. 즉, 이러한 유전자들의 다형성 특성 측정은 정신질환의 발병을 확인하는 유용한 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 다음의 정신질환 진단용 마커 조성물을 제공한다:

서열번호 1(rs4639425)로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 정신질환 진단용 마커 조성물.

상기 정신질환은 양극성 장애, 조현병, 우울증, 조증, 또는 불안 장애일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 다형성 부위는 KMT2C(lysine (K)-specific methyltransferase 2 C, 진뱅크번호: NC_000007.13) 유전자에 존재하는 염기에 해당하며, 상기 다형성 부위를 포함하고 있는 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다. 본 발명에서는 상기 다형성 부위를 “rs4639425C>T”로 표시한다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 10 내지 50개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일 염기다형이 일어나는 부위를 말한다.

본 발명의 상기 KMT2C 는 6 개의 라이신 (K) 특이적 메틸 전이 효소 2 (lysine (K)-specific methyltransferase 2, KMT2) 패밀리 중 하나를 암호화하는데, 이는 유전자 활성화와 관련된 염색질 개질에 관여하는 히스톤 H3 라이신 4 (H3K4) 메틸화를 조절하는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 KMT2C 유전자의 다형성과 정신질환 진단에 관한 연구는 보고된 바 없다.

본 발명의 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기의 유전자형이 적어도 하나의 T 대립유전자를 가진 TT일 경우 TC 또는 CC에 비하여 양극성 장애를 일으킬 수 있는 뇌의 백질 경로의 구조적 이상이 높게 발병하는 것으로 나타났다. 즉, KMT2C rs4639425C>T 다형성의 경우, TT 유전자형일 경우에는 정신질환의 발병에 영향을 미치는 뇌의 구조적 이상의 가능성이 높다는 것을 알 수 있었다.

다른 측면에서 본 발명은, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 정신질환 진단용 마커 조성물을 제공한다.

상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열을 가진다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 10 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 20 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적 (allele-specific) 이다.

대립형질 특이적 (allele-specific) 이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 정신질환을 진단하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 마커 조성물을 포함하는 정신질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 정신질환 진단용 마커인, KMT2C rs4639425C>T 다형성 부위(SNP)를 확인함으로써 정신질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 정신질환 진단용 KMT2C rs4639425C>T 의 SNP를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq- 폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 정신질환 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 마커 조성물을 포함하는 정신질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 진단 대상으로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 정신질환 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 SNP을 확인하는 단계는, 상기 SNP의 유전자형이 TT인 것을 확인하는 것일 수 있다.

상기 정신질환은 양극성 장애, 조현병, 우울증, 조증, 또는 불안 장애일 수 있다.

상기에서 진단 대상은 정신질환이 의심되는 환자를 의미한다. 바람직하게, 상기 환자는 양극성 장애, 조현병, 우울증, 조증, 또는 불안 장애가 의심되는 환자를 포함한다.

진단 대상의 핵산은 이들 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등의 시료로부터 수득할 수 있으며, 그 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다. 상기 환자의 핵산은 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 방법과 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

본 발명의 SNP 의 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 이 기술분야에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계 처리할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-테스트(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형회귀선분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regressionanalysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비(odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 정신질환 진단 기술은 정신질환 발병 여부를 정확하게 진단할 수 있으므로 조기 진단 및 치료가 가능하다.

도 1은 53명의 양극성 장애(BD)　게놈에서　확인된　생식선 돌연변이 조성물을 나타낸 것이다: A는　생식선 돌연변이 수,　B는 염기쌍 치환의 유형.
도 2는 BD 게놈에서 확인 된 생식선 돌연변이이다. 본 발명에서 확인된 BD 관련 유전자를 각 표본에 표시하였다. 표본의 5 % 이상에서 돌연변이가 있는 유전자는 오른쪽 플롯 (총 56 개의 유전자)에 표시하였다. BD 게놈에서 각 돌연변이의 분수를 왼쪽 플롯에 표시하였다.　
도 3은 BD 게놈에서 확인된 유전자 복제수 변이(copy number alterations)이다. 7 개의 BD 게놈 (y 축, Log2 비율)에서 확인 된 8p23.1 영역의 초점 증폭을 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 방법

1-1: 환자 샘플

고려대학교 안암병원 외래 정신과에서 2015 년 1 월부터 2017 년까지　총 53 명의 BD 환자를 대상으로 하였다.　19 세 이상의 BD 환자를 대상으로 하였으며, 진단(즉, 양극성 I 또는 II 장애)은　Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 제 4 판 (DSM-IV) 엑시스 I 장애(SCID-I)의 구조화된 임상 면접을 사용하여　공인 정신과 의사　(함병주 및 원은수)에　의해 결정되었다.　본 연구에서는 현재의 정상 또는 우울 상태의 환자들만을 대상으로 하였다(BD I, n = 24, BD II, n = 29, 정상 상태, n = 33, 우울 상태, n = 20).　환자들에 대한 배제 기준은 다음과 같다: i) 다른 주요 정신병의 합병증;　ii) 현재의 정신병적 특징 (즉, 망상 또는 환각);　iii) 즉각적인 입원 치료가 필요한 자살 위험이 높은 환자;　iv) 심각하거나 불안정한 의학적 병력의 병력;　v) 일차 신경병 (예: 파킨슨병, 뇌 혈관 질환, 간질);　vi) MRI 스캔에 대한 금기 사항.　질병의 지속 기간은 인생 차트 방법론을 사용하여 정신과 의사에 의해 평가되었다.　대조군의 경우, 광고를 사용하여 19 세 이상의 건강한 대조군(healthy control, HC) 참가자 82 명이 지역 사회에서 모집되었다.　보드 정신과 의사　(함병주 및 원은수)가　건강한 사람들을 대상으로　전체 정신과적 평가를 실시한　결과, 현재 또는 과거의 정신병적 장애가 없는 것으로 확인되었다.　BD 그룹에 대한　동일한　제외 기준도 HC에 적용되었다.　우리는　MRI 스캔을 할 때, 17 항목 해밀턴 우울증 평가 척도 (17-item Hamilton Depression Rating Scale, HDRS)를 사용하여 모든 주제의 우울 증상의 심각도를　평가했다.　본 연구시 모든 환자는 연구 등록을 하고 정신약리학적 치료를 하였고, 향정신성 약물에 대한 자세한 정보는　표 1에 상세하게 기재하였다. 본 연구 프로토콜은 고려대학교 안암　병원의　임상 시험 심사위원회에 의해 승인되었다.　헬싱키 선언에 따라, 모든 참가자들에게 연구에 참여하기 전에 서면 동의를 받았다.

1-2: 　전장 엑솜 시퀀싱(Whole-exome sequencing)과　생식선 돌연변이(germline　mutations)

Agilent SureSelect Human All Exome V5 kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 를 이용하여 제조업체의　지시에 따라　말초　혈액으로부터　얻은 게놈 DNA로 WES를 수행하였다.　시퀀싱은 HiSeq2000, HiSeq2500, 또는 HiSeq4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) 를 사용하고 101bp의 페어드 엔드 리드(paired-end 101 bp reads)를 가지고 수행하였다.　페어드 엔드 로데이터((FASTQ format)는 Burrows-Wheeler aligner software (BWA, v0.7.12)를 사용하여 휴먼 레퍼런스 게놈(hg19)에 정렬되었다. 로컬 재정렬 및 스코어 재보정을 포함하여 베이직 프로세싱과 중복 마킹(marking duplicates)에 Genome Analysis toolkit (GATK, v3.8), Picard (http://picard.sourceforge.net; v1.130), 및 Samtools (v1.6)를 사용하였다. 생식선 변이 호출은 GATK HaplotypeCaller를 사용하였다. ANNOVAR (Annotate Variation)는 코딩 영역의 각 변이에 대한 기능적 주석달기(functional annotation )를 위해 이용하였다. 　PolyPhen-2　는　단백질 기능　과 구조　에 대한 아미노산 치환의 가능한 효과　를　예측하는　데 사용되었다.　ngCGH 모듈과 NEXUS 소프트웨어 v9.0 (Biodiscovery Inc., El Segundo, CA, USA)의 RankSegmentation 통계 알고리즘을 사용하여 53 명의 BD 환자 각각에 대한 CAN(Copy number alterations)을 정의했다.　

1-3:　단일 변이 연관 검사

BD와 관련된 단일 변형을 감지하기 위해, PLINK　을　사용하여 P 값과 오즈 비율을 산정하였다(Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MA, Bender D, et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. American journal of human genetics. 2007; 81:559-75.). 본 발명자들은 다음 기준을 사용하여 변이를 필터링했다: Hardy-Weinberg의 정확한 테스트　평형: P 값 <0.001;　95 % 미만의 표본 CR(call rate);　95 % 미만의 SNP (single-nucleotide polymorphism) CR(call rate).

1-4:　MRI 데이터 수집 및 영상 처리

샘플에서 BD (21 명의 여성)와 74 명의 HC (45 명의 여성)를 갖는 47 명의 환자는 3.0-Tesla TrioTM 전신 이미징 시스템(Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Germany)으로 T1 가중 및 DTI(diffusion tensor imaging) 스캔을 모두 받았다.　T1 가중 영상 및 DTI의 세부 매개 변수는 보충 자료 및 방법에 설명되어 있다.　전체 뇌에서 각 피질 영역의 두께를 계산하기 위해 T1 이미지 데이터는　자동화된 절차로 수행되었다: T1 이미지에서 계산된 피질 표면 재구성의 3 차원 모델 - FreeSurfer 5.3(Laboratory for Computational Neuroimaging, Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Charlestown, MA, USA; http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu)로 실행됨.　피질 표면 재건의 상세한 과정은 이전 연구에 설명되어　있다 (Han KM, Won E, Sim Y, Kang J, Han C, Kim YK, et al. Influence of FKBP5 polymorphism and DNA methylation on structural changes of the brain in major depressive disorder. Scientific reports. 2017; 7:42621.; Han KM, Choi S, Jung J, Na KS, Yoon HK, Lee MS, et al. Cortical thickness, cortical and subcortical volume, and white matter integrity in patients with their first episode of major depression. Journal of affective disorders. 2014; 155:42-8.)　FreeSurfer는 Destrieux atlas (Destrieux C, Fischl B, Dale A, Halgren E. Automatic parcellation of human cortical gyri and sulci using standard anatomical nomenclature. NeuroImage. 2010; 53:1-15.) 에 따라 각 반구를 74개의 cortical gyri와 sulci 꾸러미로 나누고, 각 피질 부위의 두께를 자돌 계산하였다. 우리는 각 반구에서 추출된 38개의 cortical gyri의 회색질(gray-matter) 두께값을 우리의 분석에 사용하였다.　

백질 신경로의 보존도(integrity of white matter tracts)를 조사하기 위해 자동화된 백질 신경로의 확률적 재건축, Yendiki 등에 의해 개발된, FreeSurfer 패키지로 구현되는 TRACULA (Tracts Constrained by UnderLying Anatomy) (Yendiki A, Panneck P, Srinivasan P, Stevens A, Zollei L, Augustinack J, et al. Automated probabilistic reconstruction of white-matter pathways in health and disease using an atlas of the underlying anatomy. Frontiers in neuroinformatics. 2011; 5:23.)를 사용하였다.　TRACULA는　양측 대뇌 반구의 18 가지 주요 백색질 경로의 미세 구조적 연결성을 계산했으며, 대상의 DTI 데이터를 사용하여 자동화된 전 지역 확률적 신경다발추적(tractography) 프로세스에 의해 재구성되었다.　TRACULA 분석의 세부 프로세스와 프로토콜은 이전 연구에서 설명하였다(Won E, Han KM, Kang J, Kim A, Yoon HK, Chang HS, et al. Vesicular monoamine transporter 1 gene polymorphism and white matter integrity in major depressive disorder. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 2017; 77:138-45.).　　주요 백색질 통로는 다음과 같다: the forceps major and forceps minor of the corpus callosum, the anterior thalamic radiation (ATR), cingulum-angular bundle (CAB), cingulum-cingulate gyrus bundle (CCG), corticospinal tract (CST), inferior longitudinal fasciculus (ILF), superior longitudinal fasciculus-parietal bundle (SLFp), superior longitudinal fasciculus-temporal bundle (SLFt), and uncinate fasciculus (UF). TRACULA는 백질 보존도의 4개 파라미터를 만든다: fractional anisotropy (FA), radial diffusivity (RD), mean diffusivity (MD), and axial diffusivity (AD).　이전의 연구들은 미세 구조 백색질의 보존도를 측정하고 축삭 섬유의 크기와 수를 반영하는 것으로 FA를 제안하였다(Won E, Han KM, Kang J, Kim A, Yoon HK, Chang HS, et al. Vesicular monoamine transporter 1 gene polymorphism and white matter integrity in major depressive disorder. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 2017; 77:138-45.).　MD는 세포성, 부종 및 괴사에 민감한 것으로 제안되었다.　RD탈수초화(demyelination)에　민감한 것으로　제시되며,　AD는 백질 조직의 미세 구조 및 연결에 관련된 축삭 병리학(axonal pathologies)에 민감한 곳으로 제시되었다(Won E, Han KM, Kang J, Kim A, Yoon HK, Chang HS, et al. Vesicular monoamine transporter 1 gene polymorphism and white matter integrity in major depressive disorder. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 2017; 77:138-45.).　 모든 4개의 상호 보완적 백질 통합 파라미터를 이용하여 분석을 수행하였다.

1-5:　이미징 - 유전자형 연관 분석을 위한 통계적 방법

본 발명자들은 영상 마커(대뇌 피질의 두께와 백질 신경로 보존도)와 BD 및 HC 그룹의 SNP 간의 상관 관계를 조사했다.　SNP는 환자 - 대조군 연관 검사 (P-value <0.001)에서 선택하였다.　 SNPs의 유전자형과 진단에 의한 유전자형의 영상 마커에서의 상호작용을, 다음 변수를 이용하여, 공분산의 양방향 분석(ANCOVA)을 사용하여 조사하였다: 76 개의 피질 영역의 회색질 두께와 종속변수로서 주요 백질 경로의 4 개의 DTI 파라미터(FA, MD, RD, AD); 독립변수로서 유전자형과 진단(BD 대 HC); 방해 공변량인 연령과 성별. 분석시, 지배적인 모델 (즉, 비위험 대립유전자　동형 접합체 대 위험 대립 유전자 캐리어)을 유전자형 효과에 적용하였다.　피질의 두께와 백질 보존도에 대한 진단 효과는 연령과 성별을 공변량으로 일방향 ANCOVA를 사용하여 분석되었다.　유형 I의 오류를 피하기 위해, 분석시 Bonferroni 수정이 다중 비교에 적용되었다.　인구 통계학적 및 임상적 특성에 대해 두 그룹 간의 연령 및 HDRS 점수의 차이를 독립적 인 t-테스트로 분석하였다.　성별 및 교육 수준의 분포 차이는 카이 제곱 검정을 사용하여 조사되었다.　모든 통계 분석은 IBM SPSS Statistics for Windows 버전 24.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행되었다.

　

실시예 2.　결과

2-1:　인구통계학 및 임상 특성

연령, 성별, 교육 수준, HDRS 점수, 질병 지속 기간 및 향정신성 약물의 종류에 관한 데이터를　표 1　에　나타냈다.　HDRS 점수 (t = -7.187, P 값 <0.001)를 제외하고 연령, 성별, 또는 교육 수준 (모든 P 값> 0.1)에 대해 그룹간에 유의 한 차이는 관찰되지 않았다.

[표 1] 양극성 장애 및 건강한 대조군의 인구학적 임상 특징

2-2:　생식선 돌연변이의 카탈로그

총 53 개의 BD 게놈이 이번 연구에서 분석되었다.　평균 적용 범위　시퀀싱 깊이(sequencing depth)의 평균 커버리지는 BD 샘플에서 84.8X　(65.0-　113.7X)이었다.　엑솜 시퀀싱용 SureSelect V5를 사용하여 샘플 당 평균 ~20,071 변이를 얻었다.　총 520,671 비-침묵 (9,607-10,014 per sample; median of 9,816) 및 543,109 침묵 (10,036-10,423 per sample; median of 10,258) 돌연변이가 BD　게놈에서　확인되었다　(도 1A).　　점 돌연변이의 서열 특성의 관점에서, C> T 치환이 가장 일반적인 형태이었다(39.0　%; 도　1B).

2-3:　양극성 장애 관련 유전자

53 개의 BD 샘플 중에서 11 개 (21 %)　는　KMT2C　에서　총 12 개의　비동의 돌연변이(non-synonymous mutation) 와 1 개의　넌센스　돌연변이(nonsense mutation)를 포함하였다.　　KMT2C에 더해서,　다른　재발성 비　-　침묵 돌연변이　(= 2.6 건)가　AHNAK(10 건),　CDH23(10　건),　DCHS1(9 건),　FRAS1(7 건),　MACF1(10 건), 및　RYR3(5 건)을 포함해서 55 개　유전자에서 발견되었다(도　2).　PolyPhen -2- 분석은 돌연변이의 대부분은(255 중 107건, 42 %) 단백질의 기능에　유해한 영향을 미칠 것으로 예측하였다.

2-4: 유전자 복제수 변이(Copy number alterations, CNA)

본 발명자들은 BD와 HC 게놈 사이의 WES 데이터의 리드 깊이(read depth) 차이를 기반으로 CNA를 분석했다.　WES　데이터의　전체, 총　1,198 개의　CNA(795 개의　획득과　403 개의　손실)을 분석하여 53　명의 BD 게놈을 확인하였다.　　BD 게놈에서,　우리는 27개의 반복적으로 변형되는CNA를 발견하였는데,　8p23.1상의 획득과 15q11.1 - q11.2 상의 손실(각각 53% 및 34%)이 제일 반복적인 CNA이었다. (표 2).　7 개 BD 게놈은 8p23.1 로커스에서 높은 복제 획득을 보여주었다(100 %　획득[로그 비율:0.6])(도 3).　

본 발명에서　우리　는 BD 게놈에서 반복적으로 변형된 CNA로서　16p11.2의　손실　(15 %) 및 4q26의 획득 (15 %) 영역을 발견했다. 또한 1q31.3, 2p11.1, 7q35, 8p23.1, 9p13.1 - p11.2, 9q21.32, 10p12.33, 10q11.23, 15q11.1 - q11.2, 15q11.2, 16q22.1, 17q12, 17q21.31, 19p13.2, 19p13.11 - p12, and 21p11.2 - p11.1에서의 획득과, 16q22.1, 17q12, 17q21.31, 19p13.2, 19p13.11-p12 및 21p11.2-p11.1에서의 손실 및 7q22.1, 7q34, 7q35, 8p23.1, 9p13.1 - p11.2, 9q12 - q13, 14q11.2, 15q11.1 - q11.2, 15q11.2, 및 16p11.2에서의 손실을 발견하였다(표　2).

[표 2] BD 게놈에서 반복적으로 변형된 영역

2-5: 영상- 유전자형 연관성 분석

BD와 HC에서 영상 마커와 SNP 간의 연관성을 조사했다.　비동의성 SNP는　케이스 제어 단일-변이 연관성 테스트(case-control single-variant association test)의 결과로부터 선택되었고(P-value <0.001), BD 게놈에서 가장 자주 나타나는 돌연변이 유전자는 KMT2C　이었다. 이 분석에 포함된 SNP은 다음과 같다: 케이스 제어 연관성 테스트(12 SNPs): 　ADCY3의　rs11676272,　ASPDH의　rs7248272,　CLN3의　rs77595156,　HNF4G의　rs1805098,　LIMCH1의 rs2289342 및 rs11734372,　LMO7의　rs2241913,　NREP의　rs11559,　OR51G1 의 rs1378739 및 rs10836954,　PRTN3에서　rs351111, TDRD7에서　rs2045732;　KMT2C　(4 SNP): rs4639425, rs74483926, rs201834857 및 rs138627563.　 대뇌 피질의 두께 분석을 위해 다음과 같은 통계적 역치를 사용하여 Bonferroni 보정을 적용했다: P < 4.11 x 10^-5 (= 0.05 / [76 cortical regions*16 SNPs]); 백질 신경로 분석: P < 4.34 x 10^-5 (= 0.05 / [4 DTI parameters*18 white matter tracts *16 SNPs]).

KMT2C에서　SNP의 rs4639425는　Bonferroni 보정　(표　3　참조)　후의 백질 신경로 보존도를 반영하여 DTI 파라미터에서 상당한 유전형 효과를　보였다.　특히, T 대립형질 동형 접합체는 모든 피험자의 합동 샘플 중에서 C 대립형질 캐리어와 비교하여 CAB, CCG, UF, CST, ILF, SLFP, SLFT 및 ATR을 포함한 여러 가지 백질 신경로에서 오른쪽 CST에서 FA를 감소 시켰고, MD 및 RD를 증가시켰다.

[표 3] 양극성 질환 (BD) 환자와 건강한 대조군 (HC)의 백질 보존도의 중요한 연관성

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 53 명의 BD환자의 게놈에서 돌연변이를 보인 122 개의 BD 관련 유전자를 확인했다.　그 중　KMT2C　는 가장 빈도가 높은 11 개의 BD 게놈 (즉, BD 환자의 21 %)에서 12　개의 비동의성 돌연변이 및 1개의 넌센스 돌연변이를 포함하였고, KMT2C의　SNP rs4639425　는 케이스-제어 신경이미지 분석에서 넓게 분포된 백질 영역 보존도의 미세구조 변화와 관련이 있었다.

본 발명에서는 KMT2C의　한 SNP가　백질 영역의 DTI 파라미터와 유의한 관련이　있음을 알아냈다.　특히,　KMT2C　rs4639425　의 T 대립 유전자 동형 접합체는 RD와 cingulum (즉, CCG 및 CAB), UF, CST, SLFP 및 SLFT에서의 MD, 그리고 오른쪽 CST에서 FA와 관련하여 백질(WM) 보존도의 광범위한 손상과 관련이 있었다　KMT2C의　SNP가　백색 보존도의 미세구조 변화를 조절하면서 BD의 발생과 관련이 있다고 생각한다. 즉, 본 발명은　KMT2C의 rs4639425　가 BD 및 HC 그룹의 광범위한 백색질 영역에서의 미세 구조 변화와 유의미한 관련이　있음을 발견했다.　

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> KMT2C SNP MARKER FOR DIAGNOSIS OF MENTAL DISORDER <130> DHP18-522 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaaataatgg ctgaaacaca taatcaacat tacactgaag ttctatctga agacagaaaa 60 agttgccatc cacaccaaag ctacacatat accttctgat tttatagaat tgttccaata 120 tcttttctgt caatatcatt aaaatcaccc tacctgtttg gaccgaggtc taccaggaga 180 aaattttctc ttagtaatag ctggtttacc catgccaatt tttggagtga ctgagatgta 240 agttgttggc atgatgtttc cagcagagga actaagagct gaagggtaat tatgcagcat 300 gtcatgcgaa ggcaagtctg aagaaggtgt tggggaggaa gacacatctg ccttgcttat 360 gtctgctgat gatgaaaatg atgactctgt ctcagatgat aactttatag atttgcctcc 420 ttggtatgaa acatctttca cacaaccctc aattgtagga gtcatttcag agtccatcaa 480 tccagtagaa agttcagaat yttctttctg ttccttttct ccttgtagcc tttctataac 540 caactgttcc tcaggacata atgaaatact ttcctcatgt ggggacacta aggtttctag 600 tggaagagtg acagattcca tgactaattt tggaggcctt gattcttctc tggataccac 660 tgtttcaggt tcctctaaca actgcagttg ttcttgctgc acagtgatct ggtgtgtaac 720 gacttcaatg ttttctgtca cttccatttt atcttcaatt tgatcttcgc cacaaatatg 780 cttcacttca gaagacattt tcaggtcttc actatcaact tcattagaaa tctgtttttc 840 caattcagta ttcactgtat gttgggatga tactacaaaa ttcagaacat ttgttatggc 900 aatgtacaaa caaattttaa attttctaac tatagatata taaaacattt ggctacacta 960 gaacttaaat cagaaggtat tcatcaaagc agacaattat t 1001

Claims (10)

1. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 양극성 장애 진단용 마커 조성물.
   
2. 삭제
3. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 양극성 장애 진단용 마커 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인, 양극성 장애 진단용 마커 조성물.
   
5. 삭제
6. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 양극성 장애 진단용 키트.
   
7. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 양극성 장애 진단용 마이크로어레이.
   
8. 진단 대상으로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 양극성 장애 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
   
9. 삭제
10. 제8항에 있어서,
    상기 SNP을 확인하는 단계는, 상기 SNP의 유전자형이 TT인 것을 확인하는 것인, 양극성 장애 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
    
    

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