WO2012017118A1 - Vectores no virales para terapía génica - Google Patents

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WO2012017118A1
WO2012017118A1 PCT/ES2011/070562 ES2011070562W WO2012017118A1 WO 2012017118 A1 WO2012017118 A1 WO 2012017118A1 ES 2011070562 W ES2011070562 W ES 2011070562W WO 2012017118 A1 WO2012017118 A1 WO 2012017118A1
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carbon
dendrimer
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PCT/ES2011/070562
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Valentín CEÑA CALLEJO
Mª del Prado SÁNCHEZ VERDÚ
Sonia Merino Guijarro
Joaquín Calixto GARCÍA MARTÍNEZ
Julían RODRÍGUEZ LÓPEZ
Ester VÁZQUEZ FERNÁNDEZ-PACHECO
Maria Antonia Herrero Chamorro
Ana Campo Rodrigo
Noelia Rubio Carrero
Francisco PÉREZ MARTÍNEZ
Francisco Javier Guerra Navarro
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Universidad Castilla La Mancha (50%)
Nanodrugs, S. L. (50%)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • C01B32/15—Nano-sized carbon materials
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Definitions

  • the present invention relates to new non-viral vectors, comprising carbon nanochromes that comprise dendrons and / or 5 dendrimers on their surface, which in turn are linked to at least one biologically active molecule, for use in gene therapy and its use. for the preparation of a medicine.
  • the method of synthesis of said non-viral vectors is described. 0 STATE OF THE PREVIOUS TECHNIQUE
  • non-viral vectors in gene therapy is especially relevant, since the FDA has suspended, sine die, clinical trials using viruses (adenovirus, adeno-associated, etc.) because they generate immune reactions5 that have caused the death of some patients who They participated in these trials.
  • Viral vectors have several disadvantages, such as, insecurity in their management, toxicity, provocation of an immune response that decreases their effectiveness or lack of cellular specificity. Along with this, these systems are quickly eliminated from the circulation, limiting the process of transfection to first-pass organs (lungs, liver and spleen).
  • Non-viral vectors have a number of advantages over viral analogs: a) ease of preparation (even multigram scale) and modification, b) greater flexibility with respect to the size of the genetic material to be transfected, c) they are generally safe in vivo and d) they do not cause a specific immune response and therefore can be administered repeatedly.
  • the present invention relates to new non-viral vectors for use in gene therapy that solve all the problems that arise in the other routes of action in gene therapy.
  • a first aspect of the present invention relates to new non-viral vectors, wherein said non-viral vector comprises:
  • dendrons and / or dendrimers are linked with at least one biologically active molecule.
  • carbon nanochromes are understood to be: nanomaterials consisting of graphene tubes wound in a single layer with a diameter between 2-5 nm and a length between 40-50 nm. These tubes end in a conical structure with an angle of 20 °. This angle is due to the presence of pentagonal carbon rings. Carbon nanochromes usually aggregate with each other constituting what is known for their anglicisms such as dahlias, buds and seeds. According to another preferred embodiment, the carbon nanochromes have a radius of less than 10 nm, preferably less than 6 nm. The nanochromes are only monolayer, there are currently no bi- or multilayers.
  • the carbon nanochromes have a length of less than 50 nm, the diameter of the nanochord dalias (association of nanochromes) being equal to or less than 150 nm.
  • the carbon nanochromes are cut at the tips and / or in their outer layer, where cut nanochromes are understood to be those whose length is shorter than the initial one since they are treated by using strong acidic medium and heating originating carboxylic groups and an indiscriminate cutting of the nanochromes.
  • the cut results in that the nanochromes are preferably functionalized at the tips (that is, the ends) of the nanochromes but also at the outer layer thereof.
  • the carbon nanochromes and dendrimers are chemically linked by covalent bonds.
  • dendrimer is understood as a three-dimensional macromolecule of arborescent construction.
  • the dendrimers are part of the polymers, but their difference is that the distribution of the molecules that constitute the linear polymers is probabilistic, while in the case of dendrimers, there is a precise chemical structure, where the chemical bonds between Atoms can be described accurately.
  • Dendrimeric macromolecules have a generational growth form, GO, G1, G2.
  • dendron is understood as a macromolecule with dendritic structure and whose subsequent couplings to other dendrons or nuclei will constitute the dendrimer in its entirety.
  • the covalent bond has been formed by amino, carboxyl and / or ester groups present on the surface of the carbon nanochromes, preferably by an amide bond.
  • the amide bonding is carried out by amino groups present in the dendrons and / or dendrimers and carboxyl groups present on the surface of the carbon nanochromes.
  • dendrons and / or dendrimers comprise from 0 to 8 generations, preferably from 2 to 6 generations.
  • the dendrimer is of generation 0 (G0) it is called dendron.
  • the invention is understood by generation at the stages of growth of a dendrimer.
  • the dendrons and / or dendrimers have a molecular weight between 300 and 100,000 g / mol, preferably between 1,000 and 10,000 g / mol.
  • the dendrons and / or dendrimers have a diameter between 5 to 140 A, preferably have a diameter between 10 and 70 A.
  • dendrons and / or dendrimers comprise between 2 and 1,024 surface groups, preferably between 4 and 260 surface groups.
  • the surface group is understood as: amino groups, carboxylic acid groups, ester groups, hydroxyl groups, alkyl groups, quaternized amino groups or other structures such as amino acids or polyethylene glycol.
  • the surface groups of dendrons and / or dendrimers are amino groups, preferably tertiary and / or primary amines, and more preferably these tertiary and / or primary amines are protonated at a pH below 6.
  • the charge / mass ratio of dendrons and / or dendrimers at pH less than 5 is between 0.1 to 10 mmol of positive charges per gram of dendrimer.
  • the dendrons and / or dendrimers are soluble in water at pH below 6 both before and after the dendrimer's binding to the carbon nanochromne.
  • the dendrons and / or dendrimers in their neutral forms are soluble in methanol both before and after the union of the dendrimer to the carbon nanochromne.
  • n is an integer from 1 to 4.
  • dendrons and / or dendrimers are selected from:
  • PAMAM type dendrimer is understood to be those dendrimers that have a high degree of molecular uniformity, narrow molecular weight distribution, size and specific shape characteristics, and a highly functionalized terminal surface.
  • the manufacturing process is through a series of repetitive steps from a central initiator core. Each step represents a subsequent growth to the new "generation" of polymer with a larger molecular diameter, twice the number of surface groups, and approximately twice the molecular weight of the preceding generation. This is common to any dendrimer, not just those of PAMAM.
  • PAMAM dendrimers are commercial polyamidoamine dendrimers (by Dendritech, Inc.) and are synthesized by a series of repetitive steps being these aminolysis and addition reactions of Michael, 1, 4.
  • the fourth or sixth generation PAMAM type dendrimers contain gold particles.
  • the gold nanoparticles are not bound to the dendrimer but are encapsulated within it by a steric effect, that is, the "cage" dendrimer to the gold nanoparticles.
  • the presence of the gold nanoparticles results in the dendrimer adopting a more rigid conformation.
  • the presence of gold can favor the application of these compounds in resonance imaging or hyperthermia treatments.
  • the PAMAM type dendrimers comprise on their surface quaternary amino groups.
  • PAMAM-type dendrimers have a group linked through their quaternary amino groups: -CH 2 -CH (OH) -CH 2 -N + (CH 3 ) 3 .
  • the fourth or sixth generation PAMAM type dendrimers are selected from:
  • R is— CH 2 -CH (OH) -CH 2 -N + (CH 3 ) 3.
  • the biologically active molecule is an oligonucleotide chain and / or an amino acid chain and / or a pharmaceutically active molecule.
  • oligonucleotide is understood as a linear sequence of nucleotides linked by phospho-diester bonds, usually not greater than 50 nucleotides.
  • amino acid chain is understood as the binding of a certain number of amino acids for the formation of a protein with or without enzymatic activity.
  • a pharmaceutically active molecule is understood as any pharmaceutically acceptable salt drug for prevention and / or treatment of any of the diseases to which the non-viral vector described in the present invention is directed.
  • the dendrons and / or dendrimers are linked with at least one chain of oligonucleotides and / or amino acids and / or pharmaceutically active molecule by electrostatic interactions and / or covalent bonds, preferably amide and / or ester.
  • the electrostatic interaction and / or covalent bonding takes place between one of the final terminal positions of the oligonucleotide and / or amino acid chains and / or the pharmaceutically active molecule and the surface of the carbon nanochromes.
  • electrostatic interaction is understood as the attraction or repulsion of electric charges, in particular the amino groups of the dendrimers and the carboxyl groups of the oligonucleotide and / or amino acid chains and / or of the pharmaceutically active molecules. .
  • the dendrons and / or dendrimers are bound to DNA, RNA, silencing RNA, micro RNA, antagomir, antibodies, proteins or any combination thereof.
  • antagomir a new class of chemically modified oligonucleotides that are used to silence endogenous micro RNA.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of non-viral vectors as described above for the preparation of a drug in gene therapy.
  • gene therapy is understood as the introduction of any type of genetic material (DNA, RNA, RNAi, siRNA) into the interior of a cell with the aim of replenishing the function of a defective gene or of eliminating a protein selectively in order to interfere with an activated signaling pathway during the genesis of a disease.
  • a preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of diseases of the nervous system, neurodegenerative diseases and strokes.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of an infection.
  • the infection is bacterial or viral.
  • the infection is caused by the human immunodeficiency syndrome (AIDS) virus.
  • AIDS human immunodeficiency syndrome
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of cancer.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a chronic disease, preferably diabetes and rheumatoid arthritis.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of compounds used for performing diagnostic tests by medical imaging, in various pathologies.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a contrast medium or probe Image comprising said non-viral vector and a radiological marking compound, which can be used for observation and diagnosis by radiological techniques commonly used in the clinic.
  • marking compounds are gadolinium or iodine, although it may be anyone known to a person skilled in the art.
  • Another aspect of the present invention relates to a non-viral vector as defined above.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the non-viral vector as defined above and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition further comprises at least one other active ingredient.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the pharmaceutical composition for the manufacture of a medicament.
  • a preferred embodiment refers to the use of the composition described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of diseases of the nervous system, neurodegenerative diseases and strokes.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the composition described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of an infection.
  • the infection is bacterial or viral.
  • the infection is caused by the human immunodeficiency syndrome (AIDS) virus.
  • AIDS human immunodeficiency syndrome
  • Another preferred embodiment relates to the use of the composition described above for the preparation of a medicament as an anticancer.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the composition described above for the preparation of a medicament for a chronic disease, preferably diabetes and rheumatoid arthritis.
  • Another aspect of the present invention relates to a silencing RNA transfection kit comprising any of the non-viral vectors as defined above.
  • a preferred embodiment relates to the use of the silencing RNA transfection kit in primary cultures of nerve cells, glia, tumor cells and primary cells.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for the synthesis of non-viral vectors as defined above, which comprises the following steps:
  • the nanochromes are previously cut.
  • the nanochromes are dispersed in at least one solution of DMF (N, N-Dimethylformamide).
  • the dendrimer solution is added to an aqueous solution of HAuCI 4 and subsequently reduced by NaBH 4 .
  • the carbon nanochromes have been previously functionalized by a dipolar cycloaddition of azomethine ilides, by radical reaction of aniline derivatives or by direct oxidation of the nanochromes to obtain on their surface carboxyl groups and anchor on them amino groups, and / or ester.
  • pharmaceutically acceptable salts, solvates, prodrugs refers to any pharmaceutically acceptable salt, ester, solvate, or any other compound that, when administered to a receptor, is capable of providing (directly or indirectly) a compound as described in This document.
  • pharmaceutically acceptable salts are also within the scope of the invention since these may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable salts.
  • the preparation of salts, prodrugs and derivatives can be carried out by methods known in the art.
  • salts of compounds provided herein are synthesized by conventional chemical methods from an original compound containing a basic or acidic moiety.
  • such salts are prepared, for example, by reacting the free acid or base forms of the compounds with a stoichiometric amount of the appropriate base or acid in water or in an organic solvent or in a mixture of the two.
  • non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred.
  • acid addition salts include mineral acid addition salts such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, iodhydrate, sulfate, nitrate, phosphate and organic acid addition salts such as, for example, acetate, maleate, fumarate, citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and p-toluenesulfonate.
  • base addition salts include inorganic salts such as, for example, sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, aluminum and lithium salts, and salts of organic bases. such as, for example, ethylenediamine, ethanolamine, N, N-dialkylene ethanolamine, glucamine and basic amino acid salts.
  • Particularly preferred derivatives or prodrugs are those that increase the bioavailability of the compounds of this invention when such compounds are administered to a patient (for example, by making a compound administered orally more easily absorbed by the blood), or which potentiates the release of the original compound in a biological compartment (for example, the brain or lymphatic system) in relation to the original species.
  • prodrug or “prodrug” is used in its broadest sense and encompasses those derivatives that become live in the compounds of the invention. Such derivatives will be apparent to those skilled in the art, and include, depending on the functional groups present in the molecule and without limitation, the following derivatives of the compounds present esters, amino acid esters, phosphate esters, metal salt sulphonate esters , carbamates, and amides.
  • the compounds of the present invention may be in crystalline form as free compounds or as solvates and it is intended that both forms are within the scope of the present invention. Solvation methods are generally known within the art. Suitable solvates are pharmaceutically acceptable solvates. In a particular embodiment, the solvate is a hydrate.
  • the compounds described in the present invention, their pharmaceutically acceptable salts, prodrugs and / or solvates as well as the pharmaceutical compositions containing them can be used together with other additional drugs to provide a combination therapy.
  • Such additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or not administration to that of the pharmaceutical composition comprising the compounds of the present invention or a prodrug, solvate, derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of developing the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, due to the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • said therapeutic composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention can be administered by any appropriate route of administration.
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1. Analysis of electrophoretic delay of siRNA by coupling to CNH31.
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of CNH31 1mg / ml incubated with 25 ⁇ of siRNA 1, 6 ⁇ and brought to a final volume of 50 ⁇ with H 2 0 free of RNAsas.
  • 100nM of siRNA corresponds a CNH31 concentration of: (1) 0 Mg / ml (siRNA only), (2) 5 Mg / ml, (3) 10 Mg / ml, (4) 20 Mg / ml, (5) 40 ⁇ g / ml and (6) 60 ⁇ g / ml.
  • Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • FIG. 2. Analysis of electrophoretic delay of siRNA by coupling to CNH40.
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of CNH40 1mg / ml incubated with 25 ⁇ of siRNA 1, 6 ⁇ and taken to a final volume of 50 ⁇ with H 2 0 free of RNAsas.
  • 100nM of siRNA corresponds a CNH40 concentration of: (1) 0 ⁇ g / ml (siRNA only), (2) 10 ⁇ g / ml, (3) 20 Mg / ml, (4) 40 ⁇ g / ml, (5) 60 ⁇ g / ml, (6) 80 ⁇ g / ml and (7) 100 ⁇ g / ml.
  • FIG. 3. Analysis of electrophoretic retardation of siRNA by coupling to CNH41.
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of CNH41 1 mg / ml incubated with 25 ⁇ of siRNA 1, 6 ⁇ and brought to a final volume of 50 ⁇ with H 2 0 free of RNAsas.
  • siRNA For 100nM of siRNA corresponds a CNH41 concentration of: (1) 0 g / ml (siRNA only), (2) 10 Mg / ml, (3) 20 Mg / ml, (4) 40 Mg / ml, (5) 60 Mg / ml, (6) 80 Mg / ml and (7) 100 Mg / ml. Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • FIG. 4- Analysis of electrophoretic delay of siRNA by coupling to CNH43.
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of 1 mg / ml CNH43 incubated with 25 ⁇ of 1.6MM siRNA and brought to a final volume of 50 ⁇ with H 2 0 RNAse free.
  • siRNA corresponds a CNH43 concentration of: (1) 0 ig / m ⁇ (siRNA only), (2) 10 ⁇ ig / m ⁇ , (3) 20 Mg / ml, (4) 40 ⁇ ig / m ⁇ , (5) 60 ⁇ ig / m ⁇ , (6) 80 ⁇ ig / m ⁇ and (7) 100 ⁇ ig / m ⁇ .
  • Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • FIG. 5. Study of the toxicity of CNH31 in cortical neurons.
  • the cells were treated with different concentrations of CNH31 (1 to 30 Mg / ml) for 48 hours.
  • FIG. 6. Quantification of the transfection of the CNH31-siRNA fluorescent complex in cortical neurons (A) and the toxicity produced by the complex (percentage of cells marked with propidium iodide) in this same cell type (B) through cytometry study flow.
  • the complexes were formed with different concentrations of CNH31 and 100nM of fluorescent siRNA. The treatments lasted 48 hours. Data are expressed as mean (% control) ⁇ SEM, of a minimum of 3 different experiments. * p ⁇ 0.05, compared to the control.
  • FIG. 7. Study of the effect of the CNH31-siRNA complex against COFILINA or SCRAMBLE (Control) on the gene expression of COFILINA in cortical neurons by means of real-time PCR.
  • the quantification of COFILINA mRNA and ⁇ -actin (endogenous control) was performed in cells transfected for 48 hours with CNH31. Data are expressed as mean (% control) ⁇ SEM, of a minimum of 3 different experiments. * p ⁇ 0.05, compared to the control.
  • f-CNHs 5 are introduced into 10 ml of methanol and sonicated for 5 minutes.
  • the mixture is irradiated for 60 minutes at 70 ° C and a power of 10 W.
  • the reaction crude is filtered using a Millipore membrane system (PTFE, 0.2 ⁇ ).
  • the black solid that is collected after filtration is washed using cycles in which sonication and filtration are combined with methanol, acetone and dichloromethane until the filtrate is transparent and finally dried and 18 mg of f-CNHs 6 are obtained.
  • Thermogravimetric analysis shows a value of 19% loss of organic matter, which would be equivalent to one functional group every 99 carbon atoms of f-CNHs 6.
  • the metal dendrimer-ion complex is stirred for 1 min. After this time, it is rapidly reduced by a freshly prepared aqueous solution of 1M NaBH4 (0.04 ml) dissolved in a 0.3M sodium hydroxide solution. The vial is closed. The reduction occurs immediately and is accompanied by a color change from yellow to pink. It is stirred for 1 h before being used. High resolution studies of electron microscopy reveal that the nanoparticles have a diameter of 2.0 ⁇ 0.3 nm.
  • the metal dendrimer-ion complex is stirred for 1 min. After this time, it is rapidly reduced by a freshly prepared aqueous solution of 1 M NaBH4 (0.01 1 ml) dissolved in a 0.3 M solution of sodium hydroxide. The vial is closed. The reduction occurs immediately and is accompanied by a color change from yellow to pink. It is stirred for 1 h before being used. High resolution studies of electron microscopy reveal that nanoparticles have a diameter of 1.3 ⁇ 0.3 nm. f-CNHs 17 (MAHC31) - f-CNHs (18).
  • siRNA short interference RNA
  • cortical neurons Primary cultures of rat cortical neurons The primary culture of cortical neurons was performed according to the methodology previously described (V. Bruno, et al., Eur. J. Neurosci., 13: 1469-1478 (2001). Frontolateral cortical lobes were dissected in fetuses of 17 days of female rats of the Spragle-Dawley strain and mechanically dissociated in HBSS (Hank's Buffered Salt Solution) The cortical lobes were crushed by pipetting about ten times with a Pasteur pipette After centrifuging 5 minutes at 800 * g, the cells were resuspended in Neurobasal culture medium supplemented with B27, 2mM glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.The cells were seeded in culture plates pretreated with poly-lysine and used no earlier than 7 days after the culture, which is the time they need to finish differentiating and that glutamate
  • the nanochromus-siRNA complexes were formed by mixing equal amounts of the solution containing the chosen nanochromate and the one containing the siRNA (Chonco L, et al., Org Biomol Chem. 2007 Jun 21; 5 (12): 1886- 93.; Posadas I, .et al., Pharm Res. 2009 May; 26 (5): 1181-91), and incubating the mixture under stirring for 30 minutes at room temperature. Both molecules were dissolved in DEPC (Diethyl pyrocarbonate) water (free of RNAsas).
  • DEPC Diethyl pyrocarbonate
  • the agarose gel delay was used to determine the appropriate concentration to obtain the highest possible binding effectiveness between both molecules ⁇ Hansen RK J Neurochem. 2007; 103 (4): 1396-407 Peng LA Brain Res Dev Brain Res. 1991; 63 (1-2): 1-12).
  • the mixture of different concentrations of nanochromne and 250ng of siRNA was tested. The mixture was run for 15 minutes at 60V on a 1.2% agarose gel with 0.017% ethidium bromide. The gels were photographed and the bands were quantified with an appropriate image analysis system (Quantity One). The results are You can see in Figures 1 to 4 for CNH31, CNH40, CNH41 and CNH43, respectively.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the cells were seeded in 24-well plates and exposed to solutions with different concentrations of nanochromus to perform concentration-dependent toxicity curves for 24, 48 or 74 hours. Toxic effects were evaluated by measuring the rupture of the cell membrane and the consequent release of LDH to the supernatant through the CytoTox96® kit (Promega). The cells were mechanically detached, washed with PBS (Phosphate buffered saline) and centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. The absorbance of the lysate and the cell supernatant was measured using a microplate spectrophotometer at a wavelength of 490 nm.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the toxicity of the treatments with the nanochroman-siRNA complexes was studied by flow cytometry. To do this, after the treatments, the cells were incubated with 0.5 mg / ml propidium iodide for at least 1 hour at 37 ° C in the dark. The cells were then trypsinized and analyzed in a flow cytometer (FACSCalibur, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
  • the conditioned media were collected and the cells were trypsinized and washed with PBS. Total cells - live and dead - present in the resulting suspension by joining the cell trypsinized and the conditioned medium were analyzed in a flow cytometer (FACSCalibur, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
  • the translocation of the nanocuerno-siRNA complex was also studied by confocal microscopy.
  • the cells were seeded on coverslips and treated in the same way as the previous samples.
  • Cells treated with fluorescent siRNA, alone or forming nanochondro-siRNA complexes were visualized and photographed in a confocal microscope (Nikon Eclipse TE200) using the appropriate wavelength for the fluorophore excitation with which the siRNA is labeled (Gras R, Almonacid L, Ortega P, Serramia MJ, Gómez R, de la Mata FJ, Lopez-Fernandez LA, Mu ⁇ oz-Fernandez MA.
  • the beta-actin gene was used as a reference gene for all real-time PCR experiments.
  • the reaction was performed using standard procedures for the StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). In each experiment, the mean cycle threshold [cycle threshold (CT)] of the triplicates of each of the genes studied and the gene used as a reference was calculated, thus being able to compare the gene expression after the different treatments.
  • CT cycle threshold

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, que comprenden al menos un nanocuerno de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrimeros que a su vez están unidos con al menos una molécula biológicamente activa, para su uso en terapia génica y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos vectores no virales.

Description

CARBON NANOHORNS COMPRISING DENDRIMERS ON THEIR SURFACE AS NO -VIRAL VECTORS
FOR GENE THERAPY
La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, que comprenden nanocuernos de carbono que comprenden en su superficie dendrones y/o 5 dendrímeros que a su vez están unidos con al menos una molécula biológicamente activa, para su uso en terapia génica y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos vectores no virales. 0 ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR
El uso de vectores no virales en terapia génica es especialmente relevante, ya que la FDA ha suspendido, sine die, los ensayos clínicos usando virus (adenovirus, adenoasociados, etc) debido a que generan reacciones inmunes5 que han causado la muerte de algunos pacientes que participaban en dichos ensayos. Los vectores víricos poseen varios inconvenientes, tales como, inseguridad en su manejo, toxicidad, provocación de una respuesta inmune que disminuye su efectividad o falta de especificidad celular. Junto a ello, estos sistemas son rápidamente eliminados de la circulación, limitando el proceso de0 transfección a órganos de primer paso (pulmones, hígado y bazo).
También hay que tener en cuenta que procesos de recombinación pueden originar un virus replicante aunque el peligro es remoto. No obstante, los problemas que plantean los virus como vectores en terapia génica son serios y5 los ensayos clínicos de terapia génica en, por ejemplo, Estados Unidos, han sido interrumpidos recientemente por la FDA debido a la muerte de varios pacientes por fallo multiorgánico. Este tipo de graves problemas ha llevado a la búsqueda y desarrollo de alternativas al uso de los virus como vectores de material génico.
0
Los vectores no virales poseen una serie de ventajas con respecto a los análogos víricos: a) facilidad en la preparación (incluso a escala multigramo) y modificación, b) mayor flexibilidad con respecto al tamaño del material genético a transfectar, c) son generalmente seguros in vivo y d) no provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser administrados repetidamente.
La introducción de nanocuernos acoplados a dendrímeros polares como vehículos para la transfeccion génica se basa en tres factores distintos: (i) la escasez de estudios donde se desarrolla el uso de nanocuernos como vehículos para transferencia génica; (ii) los dendrímeros de PAMAM (Poly(amido amine)), especialmente los de generaciones altas, han demostrado ser tóxicos debido fundamentalmente a procesos de hemolisis y el anclaje a los nanocuernos disminuye su toxicidad y (iii) los nanocuernos son inertes químicamente lo que les confiere una alta estabilidad. Dentro de los vectores no virales, los dendrímeros representan una de estas alternativas, ya que presentan un tamaño nanométrico, una estructura globular, una baja polidispersidad y una alta densidad funcional en la superficie con un pequeño volumen molecular. DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales para su uso en terapia génica que solventan todos los problemas que se plantean en las otras vías de actuación en terapia génica. Estas ventajas son las siguientes:
- a) Facilidad en la preparación y reproducibilidad del método sintético (incluso a escala multigramo).
- b) La ausencia de nanopartículas metálicas en la producción de los nanocuernos de carbono. Esto hace a los nanocuernos materiales más biocompatibles.
- c) Posibilidad de modificación de la superficie del nanocuerno pudiendo optimizar sus propiedades de acuerdo a la metodología sintética. - d) Son generalmente seguros in vivo y poco tóxicos.
- e) No provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser administrados repetidamente. Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, donde dicho vector no viral comprende:
i) al menos un nanocuerno de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros; y
ii) donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa.
En la presente invención, se entiende por nanocuernos de carbono a: nanomateriales consistentes en tubos de grafeno enrollados en una sola capa con un diámetro de entre 2-5 nm y una longitud entre 40-50 nm. Estos tubos terminan en una estructura cónica con un ángulo de 20°. Dicho ángulo se debe a la presencia de anillos de carbono pentagonales. Los nanocuernos de carbono usualmente se agregan entre sí constituyendo lo que se conoce por sus anglicismos como dalias, buds y seeds. Según otra realización preferida, los nanocuernos de carbono tienen un radio inferior a 10 nm, preferiblemente inferior a 6 nm. Los nanocuernos son solo monocapa, no existiendo en la actualidad bi- o multicapas.
Según otra realización preferida, los nanocuernos de carbono tienen una longitud inferior a 50 nm, siendo el diámetro de las dalias de nanocuernos (asociación de nanocuernos) igual o menor de 150 nm.
Según otra realización preferida, los nanocuernos de carbono están cortados en las puntas y/o en su capa exterior, donde se entiende por nanocuernos cortados a aquellos cuya longitud es menor de la inicial ya que se tratan mediante el uso de medio ácido fuerte y calefacción originando grupos carboxílicos y un corte indiscriminado de los nanocuernos. El corte da lugar a que los nanocuernos se funcionalicen preferentemente en las puntas (es decir, los extremos) de los nanocuernos pero también en la capa exterior de los mismos. Según otra realización preferida, las nanocuernos de carbono y los dendrímeros están enlazados químicamente mediante enlaces covalentes.
En la presente invención se entiende por dendrímero a una macromolécula tridimensional de construcción arborescente. Los dendrímeros forman parte de los polímeros, pero su diferencia radica en que la distribución de las moléculas que constituyen a los polímeros lineales es probabilística, en tanto que en el caso de los dendrímeros, se tiene una estructura química precisa, donde los enlaces químicos entre los átomos pueden ser descritos con exactitud. Las macromoléculas dendriméricas presentan una forma de crecimiento generacional, GO, G1 , G2.
En la presente invención se entiende por dendrón una macromolécula con estructura dendrítica y cuyos posteriores acoplamientos a otros dendrones o núcleos constituirán el dendrímero en su totalidad.
Según otra realización preferida, el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster presentes en la superficie de los nanocuernos de carbono, preferiblemente mediante un enlace de tipo amida. Según otra realización preferida, el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la superficie de los nanocuernos de carbono.
Según otra realización preferida los dendrones y/o dendrímeros comprenden desde 0 a 8 generaciones, preferiblemente de 2 a 6 generaciones. Cuando el dendrímero es de generación 0 (G0) se denomina dendrón. En la presente invención se entiende por generación a las etapas del crecimiento de un dendrímero.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros tienen un peso molecular comprendido entre 300 y 100.000 g/mol, preferiblemente entre 1 .000 y 10.000 g/mol.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros tienen un diámetro comprendido entre 5 a 140 A, preferiblemente tienen un diámetro comprendido entre 10 y 70 A.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros comprenden entre 2 y 1 .024 grupos de superficie, preferiblemente entre 4 y 260 grupos de superficie.
En la presente invención se entiende por grupo de superficie a: grupos amino, grupos ácido carboxílico, grupos éster, grupos hidroxilo, grupos alquílicos, grupos amino cuaternizados u otras estructuras como pudieran ser aminoácidos o polietilenglicol.
Según otra realización preferida, los grupos de superficie de los dendrones y/o dendrímeros son grupos amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están protonadas a un pH inferior a 6.
Según otra realización preferida, la relación carga/masa de los dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0, 1 a 10 mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero. Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros son solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de carbono. Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros en sus formas neutras son solubles en metanol tanto antes como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de carbono.
Figure imgf000007_0001
ii)
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000007_0003
donde n es un número entero desde 1 a 4.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros se seleccionan entre:
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación.
En la presente invención se entiende por dendrímero tipo PAMAM a aquellos dendrímeros que tienen un alto grado de uniformidad molecular, estrecha distribución del peso molecular, tamaño y características específicas de la forma, y una superficie terminal altamente funcionalizada. El proceso de fabricación es mediante una serie de pasos repetitivos a partir de un núcleo iniciador central. Cada paso representa un crecimiento posterior a la nueva "generación" de polímero con un diámetro molecular más grande, el doble del número grupos de superficie, y aproximadamente el doble del peso molecular de la generación precedente. Esto es común a cualquier dendrímero, no sólo a los de PAMAM. Los dendrímeros de PAMAM son dendrímeros de poliamidoamina comerciales (por Dendritech, Inc.) y que se sintetizan mediante una serie de pasos repetitivos siendo estos aminolisis y reacciones de adición de Michael, 1 ,4.
Según otra realización preferida, los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación contienen partículas de oro. Las nanopartículas de oro no están unidas al dendrímero sino que se encuentran encapsuladas dentro del mismo mediante un efecto estérico, es decir, el dendrímero "enjaula" a la nanopartículas de oro. La presencia de la nanopartículas de oro da lugar a que el dendrímero adopte una conformación más rígida. Además la presencia de oro puede favorecer la aplicación de estos compuestos en resonancia de imagen o en tratamientos de hipertermia.
Según otra realización preferida los dendrímeros tipo PAMAM comprenden en su superficie grupos amino cuaternarios.
Según otra realización preferida, los dendrímeros tipos PAMAM tienen unidos a través de sus grupos amino cuaternarios un grupo: -CH2-CH(OH)-CH2- N+(CH3)3. Según otra realización preferida, los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación se seleccionan entre:
Figure imgf000010_0001
donde R es— CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
Según otra realización preferida, la molécula biológicamente activa es una cadena de oligonucleótidos y/o una cadena de aminoácidos y/o una molécula farmacéuticamente activa.
En la presente invención se entiende por oligonucleótido a secuencia lineal de nucleótidos unidos por enlaces fosfo-diéster, habitualmente no mayor de 50 nucleótidos.
En la presente invención se entiende por cadena de aminoácidos a la unión de un número determinado de aminoácidos para la formación de una proteína con o sin actividad enzimática.
En la presente invención se entiende por molécula farmacéuticamente activa a cualquier fármaco en forma de sal farmacéuticamente aceptable para la prevención y/o tratamiento de cualquiera de las enfermedades a las que va dirigido el vector no viral descrito en la presente invención.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o molécula farmacéuticamente activa mediante interacciones electrostáticas y/o enlaces covalentes, preferiblemente amida y/o éster.
Según otra realización preferida la interacción electrostática y/o la unión covalente tiene lugar entre una de las posiciones terminales finales de las cadenas de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o de la molécula farmacéuticamente activa y la superficie de los nanocuernos de carbono.
En la presente invención se entiende por interacción electrostática a la atracción o repulsión de cargas eléctricas, en concreto de los grupos amino de los dendrímeros y de los grupos carboxilo de las cadenas de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o de las moléculas farmacéuticamente activas.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros están unidos a ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro ARN, antagomir, anticuerpos, proteínas o cualquier combinación de los mismos.
En la presente invención se entiende por antagomir a una nueva clase de oligonucleótidos modificados químicamente que se utilizan para silenciar micro ARN endógeno.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los vectores no virales tal cual han sido descritos anteriormente para la elaboración de un medicamento en terapia génica.
En la presente invención se entiende por terapia génica la introducción de cualquier tipo de material genético (DNA, RNA, RNAi, siRNA) en el interior de una célula con el objetivo de reponer la función de un gen defectuoso o de eliminar una proteína de forma selectiva para poder interferir con una vía de señalización activada durante la génesis de una enfermedad. Una realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares. Otra realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
Según una realización preferida la infección es bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano (SIDA).
Otra realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer.
Otra realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
Otra realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de compuestos utilizados para la realización de pruebas diagnósticas mediante imagen médica, en diversas patologías.
Otra realización preferida se refiere al uso de de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medio de contraste o sonda de imagen que comprenda dicho vector no viral y un compuesto de mareaje radiológico, que puede ser utilizado para la observación y diagnóstico mediante las técnicas radiológicas habitualmente utilizadas en clínica. Ejemplos no limitantes de dichos compuestos de mareaje son gadolinio o yodo, aunque puede ser cualquiera conocido por un experto en la materia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector no viral tal y como se ha definido anteriormente. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el vector no viral como se definió anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Según una realización preferida, la composición farmacéutica además comprende al menos otro principio activo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento. Una realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares. Otra realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
Según una realización preferida la infección es bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano (SIDA). Otra realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento como anticancerígeno.
Otra realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento para una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit de transfeccion de ARN de silenciamiento que comprende cualquiera de los vectores no virales tal cual han sido definidos anteriormente.
Una realización preferida, se refiere al uso del kit de transfeccion de ARN de silenciamiento en cultivos primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células primarias.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de los vectores no virales tal cual se definieron anteriormente, que comprende las siguientes etapas:
a. mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y
b. añadir la mezcla anterior a una disolución de nanocuernos previamente dispersados. Según una realización preferida los nanocuernos están previamente cortados.
Según otra realización preferida los nanocuernos se dispersan en al menos una disolución de DMF (N,N-Dimetilformamida). Según otra realización preferida, la disolución del dendrímero es añadida a una disolución acuosa de HAuCI4 y posteriormente se reduce mediante NaBH4. Según otra realización preferida, los nanocuernos de carbono han sido previamente funcionalizados mediante una cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante reacción radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación directa de los nanocuernos para obtener en su superficie grupos carboxilo y anclar sobre ellos grupos amino, y/o éster.
El término "sales, solvatos, prodroga farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal, éster, solvato farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, cuando se administra a un receptor es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciará que las sales farmacéuticamente no aceptables también están dentro del alcance de la invención ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, prodrogas y derivados puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de compuestos previstos en el presente documento, se sintetizan mediante métodos químicos convencionales a partir de un compuesto original que contiene un resto básico ó acido. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de los compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales de adición de acido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y sales de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N,N- dialquilenetanolamina, glucamina y sales de aminoácidos básicos.
Los derivados o prodrogas particularmente favoritos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba mas fácilmente por la sangre), o que potencia la liberación del compuesto original en un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con relación a la especie original.
El termino "prodroga" o "profármaco" se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten en vivo en los compuestos de la invención. Tales derivados serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los compuestos presentes esteres, esteres de aminoácido, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, y amidas. Los compuestos de la presente invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro de la técnica. Los solvatos adecuados son solvatos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, el solvato es un hidrato.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación.
Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende los compuestos de la presente invención o un profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1.- Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a CNH31. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de CNH31 1mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de CNH31 de: (1 ) 0 Mg/ml (siRNA sólo), (2) 5 Mg/ml, (3) 10 Mg/ml, (4) 20 Mg/ml, (5) 40 μg/ml y (6) 60 μg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 2.- Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a CNH40. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de CNH40 1mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de CNH40 de: (1 ) 0 μg/ml (siRNA sólo), (2) 10 μg/ml, (3) 20 Mg/ml, (4) 40 μg/ml, (5) 60 μg/ml, (6) 80 μg/ml y (7) 100 μg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B). FIG. 3.- Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a CNH41. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de CNH41 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de CNH41 de: (1 ) 0 g/ml (siRNA sólo), (2) 10 Mg/ml, (3) 20 Mg/ml, (4) 40 Mg/ml, (5) 60 Mg/ml, (6) 80 Mg/ml y (7) 100 Mg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 4- Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a CNH43. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de CNH43 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6MM y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de CNH43 de: (1 ) 0 ig/m\ (siRNA sólo), (2) 10 \ig/m\, (3) 20 Mg/ml, (4) 40 \ig/m\, (5) 60 \ig/m\, (6) 80 \ig/m\ y (7) 100 \ig/m\. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 5.- Estudio de la toxicidad de CNH31 en neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes concentraciones de CNH31 (1 a 30 Mg/ml) durante 48 horas. La viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH (lactato deshidrogenasa) liberada al medio de cultivo. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM (desviación estándar de la media), n=12. * p <0,05, comparados con el control.
FIG. 6.- Cuantificación de la transfección del complejo CNH31 -siRNA fluorescente en neuronas corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentraciones de CNH31 y 100nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el control.
FIG. 7.- Estudio del efecto del complejo CNH31 -siRNA contra COFILINA o SCRAMBLE (Control) en sobre la expresión génica de COFILINA en neuronas corticales mediante real-time PCR. La cuantificación del RNAm de COFILINA y β-actina (control endógeno) se realizó en células transfectadas durante 48 horas con CNH31 . Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el control.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención. Sin embargo, estos ejemplos no son limitativos. Tienen carácter informativo y en ningún caso limitante de las metodologías empleadas, las cuales pueden ser alteradas con el fin de alcanzar unos resultados similares.
En esta memoria descriptiva los símbolos y convenciones usadas en estos procedimientos, esquemas y ejemplos son consistentes con los usados en el Sistema Internacional y la bibliografía científica contemporánea, por ejemplo, el Journal of Medicinal Chemistry. Salvo que se indique otra cosa, todos los materiales de partida se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional. Específicamente, se pueden usar las siguientes abreviaturas en los ejemplos y a lo largo de toda la memoria descriptiva: g (gramos); mg (miligramos); Kg (kilogramos); mi (mililitros); μΙ (microlitros); mmol (milimoles); P.f. (punto de fusión); Hz (hertzio); MHz (megahertzio); δ (desplazamiento químico); ppm (partes por millón); s (singlete); d (doblete); t (triplete); q (cuartete); c (quintuplete); m (multiplete); J (constante de acoplamiento); RMN (resonancia magnética nuclear); EM (espectrometría de masas); ES (electrospray); m/z (Relación masa/carga); Anal. (Análisis Elemental); Rto (Rendimiento); TEA (trietilamina); CH2CI2 (diclorometano); CDCI3 (cloroformo deuterado); CD3OD (metanol deuterado) DMSO (dimetilsulfóxido); i.p. (administración parenteral). Todas las temperaturas se expresan en °C (grados Celsius).
Ejemplo 1 - Síntesis de los complejos nanocuernos-dendrímeros.
Esquema de modificación de nanocuernos.
Tour y colaboradores (Price, B.K.; Tour, J.M. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 1289-1294. b) Pagona, G.; Karousis, N.; Tagmatarchis, N. Carbón, 2008, 46, 604) han descrito una ruta sintética para la funcionalización de nanotubos de carbono, en presencia de una anilina sustituida y un agente oxidante. Esta metodología se ha aplicado también a nanocuernos según el siguiente esquema general:
Figure imgf000021_0001
La funcionalidad en este caso, como se desprende del esquema anterior, depende de la modificación de la anilina empleada en dicha reacción. f-CNHs 4.
Siguiendo el esquema general anterior y el método descrito en la bibliografía (J. Mal Chem., 2009, 19, 4407-4413) se obtienen 18 mg de f-CNHs 4 utilizando la anilina (3a).
Figure imgf000021_0002
La desprotección de f-CNHs 4 se llevó a cabo mediante el siguiente esquema:
Figure imgf000021_0003
En un matraz de fondo redondo se sonicaron 15 mg del derivado f-CNHs 4 en 15 mi de metanol durante 10 minutos. Se burbujea la mezcla con ácido clorhídrico gas en la suspensión durante 3 minutos. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 14 horas. El crudo de reacción se filtra en una membrana Millipore (PTFE (politetrafluoroetileno), 0,2 μηπ) y se lava con ciclos de sonicación y filtración usando diclorometano (100 mi) y metanol (100 mi). Por último, los nanocuernos funcionalizados se secan a vacío, obteniendo así 14 mg del derivado f-CNHs 5. El análisis termogravimétrico muestra un valor de 13% de pérdida de materia orgánica, el cual equivaldría a un grupo funcional cada 60 átomos de carbono de nanocuernos de carbono. f-CNHs 6.
En un matraz microondas se introducen 20 mg de f-CNHs 5 en 10 mi de metanol y se sonican durante 5 minutos. A la mezcla se le añade 1 mi de N- etildiisopropilamina y se sónica durante 5 minutos y finalmente se añaden 2 mi de acrilato de metilo y se acopla el refrigerante. La mezcla se irradia durante 60 minutos a 70°C y una potencia de 10 W. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 18 mg de f-CNHs 6. El análisis termogravimétrico muestra un valor de 19 % de pérdida de materia orgánica, el cual equivaldría a un grupo funcional cada 99 átomos de carbono de f-CNHs 6.
Figure imgf000022_0001
f-CNHs 8.
20 mg de f-CNHs (6) se dispersan en 5 mL de DMF y se adiciona gota a gota una disolución del dendrón (7) en metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante un día. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente. Se dispersa de nuevo en metanol y se borbotea ácido clorhídrico gas durante 3 minutos y de nuevo se repite el proceso de filtración y sonicación y finalmente se secan y se obtienen 20 mg de f-CNHs 8.
Figure imgf000023_0001
f-CNHs 10.
20 mg de f-CNHs 6 se dispersan en 5 mi de DMF y se adiciona gota a gota una disolución del derivado 9 (IR8) en metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante un día. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 20 mg de f-CNHs 10.
Figure imgf000024_0001
f-CNHs 13- f-CNHs 14.
20 mg de f-CNHs 6 se dispersan en 5 mi de DMF y se adiciona gota a gota una disolución acuosa 1 ,6 μΜ del dendrímero (1 1 ó 12) (2 x 25 mi, pH 7,5). La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante un día. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 20 mg de f-CNHs 13 ó 14.
Figure imgf000024_0002
Síntesis del dendrímero G6-NH2(Au200) (11). 50,0 mi (2x25 mi) de una disolución 1 ,6 μΜ G6-NH2(Au200) se prepara de acuerdo al procedimiento descrito en la literatura (Kim, Y. G.; Oh, S. K; Crooks, R. M., Preparation and Characterization of 1-2 nm Dendrimer-Encapsulated Gold Nanoparticles Having Very Narrow Size Distributions. Chem. Mater. 2004, 16, 167-172) Brevemente, 0,8 mi de una disolución acuosa recién preparada de 10,0 mM HAuCI4 se añade a una disolución acuosa 1 ,6 μΜ (concentración final) de PAMAM G6- NH2 (24, 16 mi). El complejo dendrímero-ión metálico se agita durante 1 min. Tras este tiempo, se reduce rápidamente mediante una disolución acuosa recién preparada de NaBH4 1 M (0,04 mi) disuelto en una disolución de hidróxido sódico 0,3 M. El vial se cierra. La reducción ocurre inmediatamente y va acompañada de un cambio de color de amarillo a rosado. Se agita durante 1 h antes de ser utilizado. Estudios de alta resolución de microscopía electrónica revelan que las nanopartículas tienen un diámetro de 2,0 ± 0,3 nm.
Síntesis del dendrímero G4-NH2(Au55) (12). 50,0 mi (2x25 mi) de una disolución 1 ,6 μΜ G4-NH2 (Au55) se prepara de acuerdo al procedimiento descrito en la literatura (Kim, Y. G.; Oh, S. K; Crooks, R. M., Preparation and Characterization of 1-2 nm Dendrimer-Encapsulated Gold Nanoparticles Having Very Narrow Size Distributions. Chem. Mater. 2004, 16, 167-172). Brevemente, 0,22 mi de una disolución acuosa recién preparada de 10,0 mM HAuCI4 se añade a una disolución acuosa 1 ,6 μΜ (concentración final) de PAMAM G4- NH2 (24,77 mi). El complejo dendrímero-ión metálico se agita durante 1 min. Tras este tiempo, se reduce rápidamente mediante una disolución acuosa recién preparada de NaBH4 1 M (0,01 1 mi) disuelto en una disolución de hidróxido sódico 0,3 M. El vial se cierra. La reducción ocurre inmediatamente y va acompañada de un cambio de color de amarillo a rosado. Se agita durante 1 h antes de ser utilizado. Estudios de alta resolución de microscopía electrónica revelan que las nanopartículas tienen un diámetro de 1 ,3 ± 0,3 nm. f-CNHs 17(MAHC31)- f-CNHs (18).
20 mg de f-CNHs 6 se dispersan en 5 mi de DMF y se adiciona gota a gota 2 equivalentes de grupo amina (con respecto al numero de equivalentes de grupo funcional) de una disolución en metanol del dendrímero comercial PAMAM de cuarta o de sexta generación (15 ó 16, respectivamente). La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante un día. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 20 mg de f-CNHs 17 ó 18.
Figure imgf000026_0001
Ejemplo 2
Se ha investigado la capacidad de un nanocuerno de carbono unido a diferentes dendrímeros con aminas nitrogenadas en su periferia de interaccionar y formar complejos con un RNA de interferencia corto (siRNA), y de vehiculizarlo al interior celular sin producir ningún tipo de citotoxicidad.
Materiales y Métodos
Cultivos celulares
Cultivos primarios de neuronas corticales de rata El cultivo primario de neuronas corticales se realizó de acuerdo a la metodología descrita previamente (V. Bruno, et al., Eur. J. Neurosci., 13:1469- 1478 (2001). Los lóbulos corticales frontolaterales se disecaron en fetos de 17 días de ratas hembra de la cepa Spragle-Dawley y se disociaron mecánicamente en HBSS (Hank's Buffered Salt Solution). Los lóbulos corticales se trituraron pipeteando unas diez veces con una pipeta Pasteur. Después de centrifugar 5 minutos a 800*g, las células se resuspendieron en medio de cultivo Neurobasal suplementado con B27, 2mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Las células se sembraron en placas de cultivo pretratadas con poli-lisina y se utilizaron no antes de 7 días tras el cultivo, que es el tiempo que necesitan para terminar de diferenciarse y que aparezcan receptores de glutamato.
Formación de los complejos nanocuerno-siRNA
Los complejos nanocuerno-siRNA se formaron mezclando cantidades iguales de volumen de la solución que contenía el nanocuerno elegido y de la que contenía el siRNA (Chonco L, et al., Org Biomol Chem. 2007 Jun 21;5(12):1886-93.;Posadas I, .et al., Pharm Res. 2009 May;26(5):1181-91), e incubando la mezcla en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ambas moléculas se disolvieron en agua DEPC (Dietil pirocarbonato) (libre de RNAsas).
Experimentos de retardo en gel del complejo nanocuerno-siRNA
El retardo en gel de agarosa se utilizó para averiguar la concentración adecuada para obtener la mayor efectividad de unión posible entre ambas moléculas {Hansen RK J Neurochem. 2007;103(4): 1396-407 Peng LA Brain Res Dev Brain Res. 1991;63(1-2):1-12). Se testó la mezcla de distintas concentraciones de nanocuerno y de 250ng de siRNA. La mezcla se corrió durante 15 minutos a 60V en un gel de agarosa al 1 ,2% con 0,017% de bromuro de etidio. Los geles se fotografiaron y las bandas se cuantificaron con un sistema de análisis de imagen apropiado (Quantity One). Los resultados se pueden observar en las figuras 1 a 4 para CNH31 , CNH40, CNH41 y CNH43, respectivamente.
Estudios de Citotoxicidad
Las Ppruebas para evaluar la toxicidad del nanocuerno se realizaron en distintos tipos celulares, determinando la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) (Posadas I, López-Hernández B, Clemente MI, Jiménez JL, Ortega P, de la Mata J, Gómez R, Muñoz-Fernández MA, Ceña V Highiy efficient transfection of rat cortical neurons using carbosilane dendrimers unveils a neuroprotective role for HIF-1alpha in early chemical hypoxia- mediated neurotoxicity Pharm Res. 2009 May;26(5):1181-91). Para ello, las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios y se expusieron a soluciones con diferentes concentraciones de nanocuerno para realizar curvas de toxicidad concentración-dependiente durante 24, 48 o 74 horas. Los efectos tóxicos se evaluaron midiendo la ruptura de la membrana celular y la consiguiente liberación de la LDH al sobrenadante a través del kit CytoTox96® (Promega). Las células se despegaron mecánicamente, se lavaron con PBS (Phosphate buffered saline) y fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos. La absorbancia del lisado y del sobrenadante celular se midió utilizando un espectofotómetro de microplacas a una longitud de onda de 490 nm.
La toxicidad de los tratamientos con los complejos nanocuerno-siRNA, utilizando distintas concentraciones de nanocuerno (1 -8 μΜ) en combinación con 100 nM de siRNA, se estudió por citometría de flujo. Para ello, después de los tratamientos, las células se incubaron con yoduro de propidio 0,5 mg/ml al menos durante 1 hora a 37°C en oscuridad. Seguidamente, las células se tripsinizaron y se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton- Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A partir de la evaluación de 10.000 células por condición experimental, se calculó el porcentaje de células con la membrana citoplasmática dañada (yoduro de propidio positivas) (Weber N, Ortega P, Clemente MI, Shcharbin D, Bryszewska M, de la Mata FJ, Gómez R, Muñoz-Fernández MA Characterization of carbosilane dendrimers as effective carriers of siRNA to HlV-infected lymphocytes. J Control Reléase. 2008 Nov 24;132(1):55-64. Perumal OP, Inapagolla R, Kannan S, Kannan RM The effect of surface functionality on cellular trafficking of dendrimers. Biomaterials. 2008 Aug-Sep;29(24-25):3469-76). Los resultados de la citotoxicidad para neuronas corticales se pueden observar en la figura 5.
Estudio del porcentaje de translocación del complejo nanocuerno-siRNA al interior celular
Después de 24-72 horas con las células en presencia de los complejos nanocuerno-siRNA, utilizando 100nM de siRNA fluorescente para realizarlos, se recogieron los medios condicionados y las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS. Las células totales - vivas y muertas - presentes en la suspensión resultante al juntar el tripsinizado celular y el medio condicionado se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A partir de la evaluación de 10.000 células por condición experimental se calculó el porcentaje de células transfectadas con siRNA fluorescente (Weber N, Ortega P, Clemente MI, Shcharbin D, Bryszewska M, de la Mata FJ, Gómez R, Muñoz-Fernández MA Characterization of carbosilane dendrimers as effective carriers of siRNA to HlV-infected lymphocytes, J Control Reléase. 2008 Nov 24; 132(1): 55-64. Perumal OP, Inapagolla R, Kannan S, Kannan RM The effect of surface functionality on cellular trafficking of dendrimers. Biomaterials. 2008 Aug- Sep;29(24-25):3469-76).
La translocación del complejo nanocuerno-siRNA también se estudió por microscopía confocal. Para esto, las células se sembraron en cubreobjetos y se trataron del mismo modo que las muestras anteriores. Las células tratadas con siRNA fluorescente, sólo o formando complejos nanocuerno-siRNA, se visualizaron y fotografiaron en un microscopio confocal (Nikon Eclipse TE200) utilizando la longitud de onda adecuada para la excitación del fluoróforo con el que el siRNA esta marcado (Gras R, Almonacid L, Ortega P, Serramia MJ, Gómez R, de la Mata FJ, Lopez-Fernandez LA, Muñoz-Fernandez MA. Changes in gene expression pattern of human primary macrophages induced by carbosilane dendrimer 2G-NN16. Pharm Res. 2009 Mar;26(3):577-86) Los resultados sirvieron para determinar el porcentaje de células positivas para la transfección intracelular de siRNA. En la figura 6 se muestran los resultados para el complejo CNH31-SÍRNA.
Estudio del silenciamiento génico por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (real-time PCR)
El ARN total celular se aisló mediante un método estándar con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo (TriPure Isolation Reagent, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). El ARN se transformó en cDNA y éste se utilizó para realizar la real-time PCR. Utilizamos la real-time PCR para estudiar el silenciamiento de distintos genes por medio de 100 nM de siRNA vehiculizado con distintas concentraciones de IR8. El gen beta-actina se utilizó como gen de referencia para todos los experimentos de real-time PCR. La reacción se realizó utilizando procedimientos estándar para la StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). En cada experimento, se calculó la media del ciclo umbral [cycle threshold (CT)] de los triplicados de cada uno de los genes estudiados y del gen utilizado como referencia, pudiendo así comparar la expresión génica tras los diferentes tratamientos. Los resultados se muestran en la figura 7.

Claims

REIVINDICACIONES - Uso de un vector no viral, donde el vector no viral comprende:
i) al menos un nanocuerno de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros; y
ii) donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa;
para la elaboración de un medicamento para terapia génica.
2.- El uso según la reivindicación anterior, donde el nanocuerno de carbono tiene un radio inferior a 10 nm, preferiblemente inferior a 6 nm.
3. - El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono tiene una longitud inferior a 50 nm siendo el diámetro de las dalias de nanocuernos igual o menor de 150 nm.
4. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono está cortado en las puntas y/o en su capa exterior.
5.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono y los dendrones y/o dendrímeros están enlazados químicamente mediante enlaces covalentes.
6. - El uso según la reivindicación anterior, donde el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster presentes en la superficie del nanocuerno de carbono.
7. - El uso según la cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono y los dendrones y/o dendrímeros están enlazados mediante un enlace de tipo amida.
8.- El uso según la reivindicación anterior, donde el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la superficie del nanocuerno de carbono.
9.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden desde 0 a 8 generaciones.
10. - El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden de 2 a 6 generaciones.
1 1 . - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un peso molecular comprendido entre 300 y 100.000 g/mol, preferiblemente entre 1 .000 y 10.000 g/mol.
12.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre 5 y 140 A.
13. - El uso según la reivindicación anterior, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre 10 y 70 A.
14. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero comprende entre 2 y 1 .024 grupos de superficie.
15. - El uso según la reivindicación anterior, donde el dendrón y/o dendrímero comprende de 4 a 260 grupos de superficie.
16. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, donde los grupos de superficie son grupos amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están protonadas a un pH inferior a 6.
17.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la relación carga/masa de los dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0, 1 a 10 mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero.
18.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros son solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de carbono
19. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde los dendrones y/o dendrímeros en sus formas neutras son solubles en metanol tanto antes como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de carbono
20. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el núcleo de los dendrones o dendrímeros se selecciona entre:
i)
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000034_0001
iv)
Figure imgf000034_0002
donde n es un número entero desde 1 a 4.
21 .- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde los dendrones y/o dendrímeros se seleccionan entre:
Figure imgf000035_0001
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación.
22. - El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación contienen partículas de oro.
23. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde los dendrímeros tipo PAMAM comprenden en su superficie grupos amino cuaternarios.
24. - El uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros tipo PAMAM tienen unido a través de sus grupos amino cuaternarios un grupo: -CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
25.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, donde el dendrímero PAMAM de cuarta o sexta generación se selecciona entre:
Figure imgf000036_0001
donde R es— CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
26. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula biológicamente activa es una cadena de oligonucleótidos y/o una cadena de aminoácidos y/o una molécula farmacéuticamente activa.
27. - El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o a la cadena farmacéuticamente activa mediante interacciones electrostáticas y/o enlaces covalentes, preferiblemente amida y/o éster.
28.- El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la interacción electrostática y/o la unión covalente tiene lugar entre una de las posiciones terminales finales de las cadenas de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o de la sustancia farmacéuticamente activa y la superficie de los nanocuernos de carbono.
29.- El uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros están unidos a ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro ARN, antagomir, anticuerpos, proteínas o cualquier combinación de los mismos.
30. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares.
31 . - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
32. - El uso según la reivindicación anterior donde la infección es bacteriana o viral.
33.- El uso según la reivindicación anterior donde la infección es causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano (SIDA).
34.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer.
35.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
36.- El uso de los vectores descritos en las reivindicaciones 1 a 29 para la preparación de un medio de contraste o sonda de imagen que comprende el vector no viral y una molécula de mareaje radiológico.
37. Vector no viral como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.
38. - Composición farmacéutica que comprende el vector no viral como se define en la reivindicación 37 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
39.- Composición farmacéutica según la reivindicación anterior, que además comprende al menos otro principio activo.
40. - Uso de la composición según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, para la elaboración de un medicamento.
41 . - Kit de transfección de ARN de silenciamiento que comprende el vector no viral según se define en la reivindicación 37.
42. - Uso del kit de transfección de ARN de silenciamiento según la reivindicación anterior en cultivos primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células primarias.
43. - Procedimiento para la síntesis del vector no viral según se define en la reivindicación 37, que comprende las siguientes etapas:
a. mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y b. añadir la mezcla anterior a una disolución de nanocuernos previamente dispersados.
44. - El procedimiento según la reivindicación anterior, donde los nanocuernos están previamente cortados.
45. - El procedimiento según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde los nanocuernos se dispersan en al menos una disolución de DMF.
46.- El procedimiento según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde a la disolución del dendrón y/o dendrímero es añadida una disolución acuosa de HAuCI4 y posteriormente se reduce mediante NaBH4.
47. El procedimiento según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, donde los nanocuernos de carbono han sido previamente funcionalizados mediante una cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante reacción radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación directa de los nanocuernos para obtener en su superficie grupos carboxilo y anclar sobre ellos grupos amino, y/o éster.
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