ES2374245A1 - Vectores no virales para terapia génica. - Google Patents
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Abstract
Vectores no virales para terapia génica.La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, que comprenden al menos un nanocuerno de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrimeros que a su vez están unidos con al menos una molécula biológicamente activa, para su uso en terapia génica y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos vectores no virales.
Description
Vectores no virales para terapia génica.
El uso de vectores no virales en terapia génica
es especialmente relevante, ya que la FDA ha suspendido, sine
die, los ensayos clínicos usando virus (adenovirus,
adenoasociados, etc) debido a que generan reacciones inmunes que han
causado la muerte de algunos pacientes que participaban en dichos
ensayos. Los vectores víricos poseen varios inconvenientes, tales
como, inseguridad en su manejo, toxicidad, provocación de una
respuesta inmune que disminuye su efectividad o falta de
especificidad celular. Junto a ello, estos sistemas son rápidamente
eliminados de la circulación, limitando el proceso de transfección a
órganos de primer paso (pulmones, hígado y bazo).
También hay que tener en cuenta que procesos de
recombinación pueden originar un virus replicante aunque el peligro
es remoto. No obstante, los problemas que plantean los virus como
vectores en terapia génica son serios y los ensayos clínicos de
terapia génica en, por ejemplo, Estados Unidos, han sido
interrumpidos recientemente por la FDA debido a la muerte de varios
pacientes por fallo multiorgánico. Este tipo de graves problemas ha
llevado a la búsqueda y desarrollo de alternativas al uso de los
virus como vectores de material génico.
Los vectores no virales poseen una serie de
ventajas con respecto a los análogos víricos: a) facilidad en la
preparación (incluso a escala multigramo) y modificación, b) mayor
flexibilidad con respecto al tamaño del material genético a
transfectar, c) son generalmente seguros in vivo y d) no
provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser
administrados repetidamente.
La introducción de nanocuernos acoplados a
dendrímeros polares como vehículos para la transfección génica se
basa en tres factores distintos: (i) la escasez de estudios donde se
desarrolla el uso de nanocuernos como vehículos para transferencia
génica; (ii) los dendrímeros de PAMAM (Poly(amido
amine)), especialmente los de generaciones altas, han demostrado
ser tóxicos debido fundamentalmente a procesos de hemolisis y el
anclaje a los nanocuernos disminuye su toxicidad y (iii) los
nanocuernos son inertes químicamente lo que les confiere una alta
estabilidad.
Dentro de los vectores no virales, los
dendrímeros representan una de estas alternativas, ya que presentan
un tamaño nanométrico, una estructura globular, una baja
polidispersidad y una alta densidad funcional en la superficie con
un pequeño volumen molecular.
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La presente invención se refiere a nuevos
vectores no virales para su uso en terapia génica que solventan
todos los problemas que se plantean en las otras vías de actuación
en terapia génica. Estas ventajas son las siguientes:
- a)
- Facilidad en la preparación y reproducibilidad del método sintético (incluso a escala multigramo).
- b)
- La ausencia de nanopartículas metálicas en la producción de los nanocuernos de carbono. Esto hace a los nanocuernos materiales más biocompatibles.
- c)
- Posibilidad de modificación de la superficie del nanocuerno pudiendo optimizar sus propiedades de acuerdo a la metodología sintética.
- d)
- Son generalmente seguros in vivo y poco tóxicos.
- e)
- No provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser administrados repetidamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente
invención se refiere a nuevos vectores no virales, donde dicho
vector no viral comprende:
- i)
- al menos un nanocuerno de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros; y
- ii)
- donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa.
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En la presente invención, se entiende por
nanocuernos de carbono a: nanomateriales consistentes en tubos de
grafeno enrollados en una sola capa con un diámetro de entre
2-5 nm y una longitud entre 40-50
nm. Estos tubos terminan en una estructura cónica con un ángulo de
20º. Dicho ángulo se debe a la presencia de anillos de carbono
pentagonales. Los nanocuernos de carbono usualmente se agregan entre
sí constituyendo lo que se conoce por sus anglicismos como
dalias, buds y seeds.
\newpage
Según otra realización preferida, los
nanocuernos de carbono tienen un radio inferior a 10 nm,
preferiblemente inferior a 6 nm. Los nanocuernos son solo monocapa,
no existiendo en la actualidad bi- o multicapas.
Según otra realización preferida, los
nanocuernos de carbono tienen una longitud inferior a 50 nm, siendo
el diámetro de las dalias de nanocuernos (asociación de nanocuernos)
igual o menor de 150 nm.
Según otra realización preferida, los
nanocuernos de carbono están cortados en las puntas y/o en su capa
exterior, donde se entiende por nanocuernos cortados a aquellos cuya
longitud es menor de la inicial ya que se tratan mediante el uso de
medio ácido fuerte y calefacción originando grupos carboxílicos y un
corte indiscriminado de los nanocuernos. El corte da lugar a que los
nanocuernos se funcionalicen preferentemente en las puntas (es
decir, los extremos) de los nanocuernos pero también en la capa
exterior de los mismos.
Según otra realización preferida, las
nanocuernos de carbono y los dendrímeros están enlazados
químicamente mediante enlaces covalentes.
En la presente invención se entiende por
dendrímero a una macromolécula tridimensional de construcción
arborescente. Los dendrímeros forman parte de los polímeros, pero su
diferencia radica en que la distribución de las moléculas que
constituyen a los polímeros lineales es probabilística, en tanto que
en el caso de los dendrímeros, se tiene una estructura química
precisa, donde los enlaces químicos entre los átomos pueden ser
descritos con exactitud. Las macromoléculas dendriméricas presentan
una forma de crecimiento generacional, G0, G1, G2.
En la presente invención se entiende por dendrón
una macromolécula con estructura dendrítica y cuyos posteriores
acoplamientos a otros dendrones o núcleos constituirán el dendrímero
en su totalidad.
Según otra realización preferida, el enlace
covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster
presentes en la superficie de los nanocuernos de carbono,
preferiblemente mediante un enlace de tipo amida.
Según otra realización preferida, el enlace
amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los
dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la
superficie de los nanocuernos de carbono.
Según otra realización preferida los dendrones
y/o dendrímeros comprenden desde 0 a 8 generaciones, preferiblemente
de 2 a 6 generaciones. Cuando el dendrímero es de generación 0 (G0)
se denomina dendrón. En la presente invención se entiende por
generación a las etapas del crecimiento de un dendrímero.
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros tienen un peso molecular comprendido entre 300 y
100.000 g/mol, preferiblemente entre 1.000 y 10.000 g/mol.
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros tienen un diámetro comprendido entre 5 a 140
\ring{A}, preferiblemente tienen un diámetro comprendido entre 10
y 70 \ring{A}.
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros comprenden entre 2 y 1.024 grupos de superficie,
preferiblemente entre 4 y 260 grupos de superficie.
En la presente invención se entiende por grupo
de superficie a: grupos amino, grupos ácido carboxílico, grupos
éster, grupos hidroxilo, grupos alquílicos, grupos amino
cuaternizados u otras estructuras como pudieran ser aminoácidos o
polietilenglicol.
Según otra realización preferida, los grupos de
superficie de los dendrones y/o dendrímeros son grupos amino,
preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más
preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están
protonadas a un pH inferior a 6.
Según otra realización preferida, la relación
carga/masa de los dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de
entre 0,1 a 10 mmoles de cargas positivas por gramo de
dendrímero.
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros son solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes
como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de
carbono.
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros en sus formas neutras son solubles en metanol tanto
antes como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de
carbono.
\newpage
Según otra realización preferida, el núcleo de
los dendrones o dendrímeros se selecciona entre
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde n es un número entero desde 1
a
4.
\newpage
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros se seleccionan entre:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de
cuarta o sexta
generación.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención se entiende por
dendrímero tipo PAMAM a aquellos dendrímeros que tienen un alto
grado de uniformidad molecular, estrecha distribución del peso
molecular, tamaño y características específicas de la forma, y una
superficie terminal altamente funcionalizada. El proceso de
fabricación es mediante una serie de pasos repetitivos a partir de
un núcleo iniciador central. Cada paso representa un crecimiento
posterior a la nueva "generación" de polímero con un diámetro
molecular más grande, el doble del número grupos de superficie, y
aproximadamente el doble del peso molecular de la generación
precedente. Esto es común a cualquier dendrímero, no sólo a los de
PAMAM. Los dendrímeros de PAMAM son dendrímeros de poliamidoamina
comerciales (por Dendritech, Inc.) y que se sintetizan mediante una
serie de pasos repetitivos siendo estos aminolisis y reacciones de
adición de Michael, 1,4.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación contienen
partículas de oro. Las nanopartículas de oro no están unidas al
dendrímero sino que se encuentran encapsuladas dentro del mismo
mediante un efecto estérico, es decir, el dendrímero "enjaula"
a la nanopartículas de oro. La presencia de la nanopartículas de oro
da lugar a que el dendrímero adopte una conformación más rígida.
Además la presencia de oro puede favorecer la aplicación de estos
compuestos en resonancia de imagen o en tratamientos de
hipertermia.
Según otra realización preferida los dendrímeros
tipo PAMAM comprenden en su superficie grupos amino
cuaternarios.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tipos PAMAM tienen unidos a través de sus grupos amino
cuaternarios un grupo:
-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación se seleccionan
entre:
donde R es
- - -CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otra realización preferida, la molécula
biológicamente activa es una cadena de oligonucleótidos y/o una
cadena de aminoácidos y/o una molécula farmacéuticamente activa.
En la presente invención se entiende por
oligonucleótido a secuencia lineal de nucleótidos unidos por enlaces
fosfo-diéster, habitualmente no mayor de 50
nucleótidos.
En la presente invención se entiende por cadena
de aminoácidos a la unión de un número determinado de aminoácidos
para la formación de una proteína con o sin actividad
enzimática.
En la presente invención se entiende por
molécula farmacéuticamente activa a cualquier fármaco en forma de
sal farmacéuticamente aceptable para la prevención y/o tratamiento
de cualquiera de las enfermedades a las que va dirigido el vector no
viral descrito en la presente invención.
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros están unidos con al menos una cadena de
oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o molécula farmacéuticamente
activa mediante interacciones electrostáticas y/o enlaces
covalentes, preferiblemente amida y/o éster.
Según otra realización preferida la interacción
electrostática y/o la unión covalente tiene lugar entre una de las
posiciones terminales finales de las cadenas de oligonucleótidos y/o
de aminoácidos y/o de la molécula farmacéuticamente activa y la
superficie de los nanocuernos de carbono.
En la presente invención se entiende por
interacción electrostática a la atracción o repulsión de cargas
eléctricas, en concreto de los grupos amino de los dendrímeros y de
los grupos carboxilo de las cadenas de oligonucleótidos y/o de
aminoácidos y/o de las moléculas farmacéuticamente activas.
Según otra realización preferida, los dendrones
y/o dendrímeros están unidos a ADN, ARN, ARN de silenciamiento,
micro ARN, antagomir, anticuerpos, proteínas o cualquier combinación
de los mismos.
En la presente invención se entiende por
antagomir a una nueva clase de oligonucleótidos modificados
químicamente que se utilizan para silenciar micro ARN endógeno.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de los vectores no virales tal cual han sido descritos
anteriormente para la elaboración de un medicamento en terapia
génica.
En la presente invención se entiende por terapia
génica la introducción de cualquier tipo de material genético (DNA,
RNA, RNAi, siRNA) en el interior de una célula con el objetivo de
reponer la función de un gen defectuoso o de eliminar una proteína
de forma selectiva para poder interferir con una vía de señalización
activada durante la génesis de una enfermedad.
Una realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades
del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los
accidentes cerebrovasculares.
Otra realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para el tratamiento o prevención de una
infección.
Según una realización preferida la infección es
bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es
causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano
(SIDA).
Otra realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer.
Otra realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad
crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
Otra realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de compuestos utilizados para la realización de pruebas diagnósticas
mediante imagen médica, en diversas patologías.
Otra realización preferida se refiere al uso de
de los vectores no virales descritos anteriormente para la
preparación de un medio de contraste o sonda de imagen que comprenda
dicho vector no viral y un compuesto de mareaje radiológico, que
puede ser utilizado para la observación y diagnóstico mediante las
técnicas radiológicas habitualmente utilizadas en clínica. Ejemplos
no limitantes de dichos compuestos de mareaje son gadolinio o yodo,
aunque puede ser cualquiera conocido por un experto en la
materia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un vector no viral tal y como se ha definido anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende el vector no viral como
se definió anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según una realización preferida, la composición
farmacéutica además comprende al menos otro principio activo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de la composición farmacéutica para la elaboración de un
medicamento.
Una realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades del
sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes
cerebrovasculares.
Otra realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
Según una realización preferida la infección es
bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es
causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano
(SIDA).
Otra realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento como anticancerígeno.
Otra realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento para una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes
y la artritis reumatoide.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un kit de transfección de ARN de silenciamiento que comprende
cualquiera de los vectores no virales tal cual han sido definidos
anteriormente.
Una realización preferida, se refiere al uso del
kit de transfección de ARN de silenciamiento en cultivos primarios
de células nerviosas, glía, células tumorales y células
primarias.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para la síntesis de los vectores no virales tal
cual se definieron anteriormente, que comprende las siguientes
etapas:
- a.
- mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y
- b.
- añadir la mezcla anterior a una disolución de nanocuernos previamente dispersados.
\vskip1.000000\baselineskip
Según una realización preferida los nanocuernos
están previamente cortados.
Según otra realización preferida los nanocuernos
se dispersan en al menos una disolución de DMF
(N,N-Dimetilformamida).
Según otra realización preferida, la disolución
del dendrímero es añadida a una disolución acuosa de HAuCl_{4} y
posteriormente se reduce mediante NaBH_{4}.
Según otra realización preferida, los
nanocuernos de carbono han sido previamente funcionalizados mediante
una cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante reacción
radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación directa de
los nanocuernos para obtener en su superficie grupos carboxilo y
anclar sobre ellos grupos amino, y/o
éster.
éster.
El término "sales, solvatos, prodroga
farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal, éster,
solvato farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que,
cuando se administra a un receptor es capaz de proporcionar
(directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el
presente documento. Sin embargo, se apreciará que las sales
farmacéuticamente no aceptables también están dentro del alcance de
la invención ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de
sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales,
prodrogas y derivados puede llevarse a cabo mediante métodos
conocidos en la técnica.
Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables
de compuestos previstos en el presente documento, se sintetizan
mediante métodos químicos convencionales a partir de un compuesto
original que contiene un resto básico ó acido. Generalmente, tales
sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de
ácido o base libre de los compuestos con una cantidad
estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un
disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se
prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol,
isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adición de ácidos
incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo,
clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y
sales de adición de acido orgánico tales como, por ejemplo, acetato,
maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato,
mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato.
Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas
tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio,
magnesio, aluminio y litio, y sales de bases orgánicas tales como,
por ejemplo, etilendiamina, etanolamina,
N,N-dialquilenetanolamina, glucamina y sales de
aminoácidos básicos.
Los derivados o prodrogas particularmente
favoritos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los
compuestos de esta invención cuando se administran tales compuestos
a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado
por vía oral se absorba mas fácilmente por la sangre), o que
potencia la liberación del compuesto original en un compartimento
biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con
relación a la especie original.
El termino "prodroga" o "profármaco"
se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se
convierten en vivo en los compuestos de la invención. Tales
derivados serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, e
incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la
molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los
compuestos presentes esteres, esteres de aminoácido, esteres de
fosfato, esteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, y
amidas.
Los compuestos de la presente invención pueden
estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y
se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente
invención. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro
de la técnica. Los solvatos adecuados son solvatos farmacéuticamente
aceptables. En una realización particular, el solvato es un
hidrato.
Los compuestos descritos en la presente
invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o
solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen
pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para
proporcionar una terapia de combinación.
Dichos fármacos adicionales pueden formar parte
de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser
proporcionados en forma de una composición separada para su
administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica
que comprende los compuestos de la presente invención o un
profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable
de los mismos.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones
terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción
terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas,
calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá
determinada, entre otras causas, por las características propias de
los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la
severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de
administración.
En otra realización particular, dicha
composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o
suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La
composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser
administrada por cualquier vía de administración apropiada.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a CNH31. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de CNH31 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de CNH31 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 5 \mug/ml, (3) 10 \mug/ml, (4) 20 \mug/ml, (5) 40
\mug/ml y (6) 60 \mug/ml. El análisis densitométrico de los
resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
Fig. 2.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a CNH40. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de CNH40 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de CNH40 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 10 \mug/ml, (3) 20 \mug/ml, (4) 40 \mug/ml, (5) 60
\mug/ml, (6) 80 \mug/ml y (7) 100 \mug/ml. El análisis
densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel
se muestran en (B).
Fig. 3.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a CNH41. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de CNH41 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de CNH41 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 10 \mug/ml, (3) 20 \mug/ml, (4) 40 \mug/ml, (5) 60
\mug/ml, (6) 80 \mug/ml y (7) 100 \mug/ml. El análisis
densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel
se muestran en (B).
Fig. 4.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a CNH43. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de CNH43 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de CNH43 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 10 \mug/ml, (3) 20 \mug/ml, (4) 40 \mug/ml, (5) 60
\mug/ml, (6) 80 \mug/ml y (7) 100 \mug/ml. El análisis
densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel
se muestran en (B).
Fig. 5.- Estudio de la toxicidad de CNH31 en
neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes
concentraciones de CNH31 (1 a 30 \mug/ml) durante 48 horas. La
viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH
(lactato deshidrogenasa) liberada al medio de cultivo. Los datos se
expresan como media (% control) \pm SEM (desviación estándar de la
media), n=12. * p <0,05, comparados con el control.
Fig. 6.- Cuantificación de la transfección
del complejo CNH31-siRNA fluorescente en neuronas
corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo
(porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este
mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo.
Los complejos se formaron con distintas concentraciones de CNH31 y
100 nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los
datos se expresan como media (% control) \pm SEM, de un mínimo de
3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el
control.
Fig. 7.- Estudio del efecto del complejo
CNH31-siRNA contra COFILINA o SCRAMBLE (Control)
en sobre la expresión génica de COFILINA en neuronas corticales
mediante real-time PCR. La cuantificación del
RNAm de COFILINA y \beta-actina (control endógeno)
se realizó en células transfectadas durante 48 horas con CNH31. Los
datos se expresan como media (% control) \pm SEM, de un mínimo de
3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención. Sin embargo, estos ejemplos no son limitativos. Tienen
carácter informativo y en ningún caso limitante de las metodologías
empleadas, las cuales pueden ser alteradas con el fin de alcanzar
unos resultados similares.
En esta memoria descriptiva los símbolos y
convenciones usadas en estos procedimientos, esquemas y ejemplos son
consistentes con los usados en el Sistema Internacional y la
bibliografía científica contemporánea, por ejemplo, el Journal of
Medicinal Chemistry. Salvo que se indique otra cosa, todos los
materiales de partida se obtuvieron de proveedores comerciales y se
usaron sin purificación adicional. Específicamente, se pueden usar
las siguientes abreviaturas en los ejemplos y a lo largo de toda la
memoria descriptiva: g (gramos); mg (miligramos); Kg (kilogramos);
ml (mililitros); \mul (microlitros); mmol (milimoles); P.f. (punto
de fusión); Hz (hertzio); MHz (megahertzio); \delta
(desplazamiento químico); ppm (partes por millón); s (singlete); d
(doblete); t (triplete); q (cuartete); c (quintuplete); m
(multiplete); J (constante de acoplamiento); RMN (resonancia
magnética nuclear); EM (espectrometría de masas); ES (electrospray);
m/z (Relación masa/carga); Anal. (Análisis Elemental); Rto
(Rendimiento); TEA (trietilamina); CH_{2}Cl_{2} (diclorometano);
CDCl_{3} (cloroformo deuterado); CD_{3}OD (metanol deuterado)
DMSO (dimetilsulfóxido); i.p. (administración parenteral).
Todas las temperaturas se expresan en ºC (grados Celsius).
\vskip1.000000\baselineskip
Tour y colaboradores (Price, B.K.; Tour, J.M.
J. Am. Chem. Soc. 2006, 128,
1289-1294. b) Pagona, G.; Karousis, N.;
Tagmatarchis, N. Carbon, 2008, 46, 604) han
descrito una ruta sintética para la funcionalización de nanotubos de
carbono, en presencia de una anilina sustituida y un agente
oxidante. Esta metodología se ha aplicado también a nanocuernos
según el siguiente esquema general:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La funcionalidad en este caso, como se desprende
del esquema anterior, depende de la modificación de la anilina
empleada en dicha reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el esquema general anterior y el
método descrito en la bibliografía (J. Mat. Chem., 2009, 19,
4407-4413) se obtienen 18 mg de
f-CNHs 4 utilizando la anilina (3a).
La desprotección de f-CNHs 4 se
llevó a cabo mediante el siguiente esquema:
En un matraz de fondo redondo se sonicaron 15 mg
del derivado f-CNHs 4 en 15 ml de metanol durante 10
minutos. Se burbujea la mezcla con ácido clorhídrico gas en la
suspensión durante 3 minutos. La mezcla se agita a temperatura
ambiente durante 14 horas. El crudo de reacción se filtra en una
membrana Millipore (PTFE (politetrafluoroetileno), 0,2 \mum) y se
lava con ciclos de sonicación y filtración usando diclorometano (100
ml) y metanol (100 ml). Por último, los nanocuernos funcionalizados
se secan a vacío, obteniendo así 14 mg del derivado
f-CNHs 5. El análisis termogravimétrico muestra un
valor de 13% de pérdida de materia orgánica, el cual equivaldría a
un grupo funcional cada 60 átomos de carbono de nanocuernos de
carbono.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz microondas se introducen 20 mg de
f-CNHs 5 en 10 ml de metanol y se sonican durante 5
minutos. A la mezcla se le añade 1 ml de
N-etildiisopropilamina y se sónica durante 5
minutos y finalmente se añaden 2 ml de acrilato de metilo y se
acopla el refrigerante. La mezcla se irradia durante 60 minutos a
70ºC y una potencia de 10 W. Tras enfriar la mezcla a temperatura
ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema
Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El sólido negro que se
recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se
combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano
hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se
obtienen 18 mg de f-CNHs 6. El análisis
termogravimétrico muestra un valor de 19% de pérdida de materia
orgánica, el cual equivaldría a un grupo funcional cada 99 átomos de
carbono de f-CNHs 6.
20 mg de f-CNHs (6) se dispersan
en 5 mL de DMF y se adiciona gota a gota una disolución del dendrón
(7) en metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40ºC durante un
día. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de
reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE,
0,2 \mum). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se
lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración
con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea
transparente. Se dispersa de nuevo en metanol y se borbotea ácido
clorhídrico gas durante 3 minutos y de nuevo se repite el proceso de
filtración y sonicación y finalmente se secan y se obtienen 20 mg de
f-CNHs 8.
20 mg de f-CNHs 6 se dispersan
en 5 ml de DMF y se adiciona gota a gota una disolución del derivado
9 (IR8) en metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40ºC durante
un día. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de
reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE,
0,2 \mum). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se
lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración
con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea
transparente y finalmente se secan y se obtienen 20 mg de
f-CNHs 10.
20 mg de f-CNHs 6 se dispersan
en 5 ml de DMF y se adiciona gota a gota una disolución acuosa 1,6
\muM del dendrímero (11 ó 12) (2 x 25 ml, pH 7,5). La mezcla de
reacción se calienta a 40ºC durante un día. Tras enfriar la mezcla a
temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un
sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El sólido negro
que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los
que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y
diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se
secan y se obtienen 20 mg de f-CNHs 13 ó 14.
Síntesis del dendrímero
G6-NH2(Au200) (11). 50,0 ml (2x25 ml) de
una disolución 1,6 \muM G6-NH2(Au200) se
prepara de acuerdo al procedimiento descrito en la literatura
(Kim, Y. G.; Oh, S. K; Crooks, R. M., Preparation and
Characterization of 1-2 nm
Dendrimer-Encapsulated Gold Nanoparticles Having
Very Narrow Size Distributions. Chem. Mater. 2004, 16,
167-172). Brevemente, 0,8 ml de una disolución
acuosa recién preparada de 10,0 mM HAuCl4 se añade a una disolución
acuosa 1,6 \muM (concentración final) de PAMAM
G6-NH2 (24,16 ml). El complejo
dendrímero-ión metálico se agita durante 1 min. Tras
este tiempo, se reduce rápidamente mediante una disolución acuosa
recién preparada de NaBH4 1M (0,04 ml) disuelto en una disolución de
hidróxido sódico 0,3 M. El vial se cierra. La reducción ocurre
inmediatamente y va acompañada de un cambio de color de amarillo a
rosado. Se agita durante 1 h antes de ser utilizado.
Estudios de alta resolución de microscopía
electrónica revelan que las nanopartículas tienen un diámetro
de
2,0 \pm 0,3 nm.
2,0 \pm 0,3 nm.
Síntesis del dendrímero
G4-NH2(Au55) (12). 50,0 ml (2x25 ml) de
una disolución 1,6 \muM G4-NH2 (Au55) se prepara
de acuerdo al procedimiento descrito en la literatura (Kim, Y.
G.; Oh, S. K; Crooks, R. M., Preparation and Characterization of
1-2 nm Dendrimer-Encapsulated Gold
Nanoparticles Having Very Narrow Size Distributions. Chem.
Mater. 2004, 16, 167-172).
Brevemente, 0,22 ml de una disolución acuosa recién preparada de
10,0 mM HAuCl4 se añade a una disolución acuosa 1,6 \muM
(concentración final) de PAMAM G4-NH2 (24,77 ml).
El complejo dendrímero-ión metálico se agita durante
1 min. Tras este tiempo, se reduce rápidamente mediante una
disolución acuosa recién preparada de NaBH4 1M (0,011 ml) disuelto
en una disolución de hidróxido sódico 0,3 M. El vial se cierra. La
reducción ocurre inmediatamente y va acompañada de un cambio de
color de amarillo a rosado. Se agita durante 1 h antes de ser
utilizado.
Estudios de alta resolución de microscopía
electrónica revelan que las nanopartículas tienen un diámetro
de
1,3 \pm 0,3 nm.
1,3 \pm 0,3 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
20 mg de f-CNHs 6 se dispersan
en 5 ml de DMF y se adiciona gota a gota 2 equivalentes de grupo
amina (con respecto al número de equivalentes de grupo funcional) de
una disolución en metanol del dendrímero comercial PAMAM de cuarta o
de sexta generación (15 ó 16, respectivamente). La mezcla de
reacción se calienta a 40ºC durante un día. Tras enfriar la mezcla a
temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un
sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El sólido negro
que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los
que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y
diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se
secan y se obtienen 20 mg de f-CNHs 17 ó 18.
Se ha investigado la capacidad de un nanocuerno
de carbono unido a diferentes dendrímeros con aminas nitrogenadas en
su periferia de interaccionar y formar complejos con un RNA de
interferencia corto (siRNA), y de vehiculizarlo al interior celular
sin producir ningún tipo de citotoxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo primario de neuronas corticales se
realizó de acuerdo a la metodología descrita previamente (V.
Bruno, et al., Eur. J. Neurosci., 13:1469-1478
(2001). Los lóbulos corticales frontolaterales se disecaron en
fetos de 17 días de ratas hembra de la cepa
Spragle-Dawley y se disociaron mecánicamente
en HBSS (Hank's Buffered Salt Solution). Los lóbulos
corticales se trituraron pipeteando unas diez veces con una pipeta
Pasteur. Después de centrifugar 5 minutos a 800 \timesg, las
células se resuspendieron en medio de cultivo Neurobasal
suplementado con B27, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y
100 \mug/ml de estreptomicina. Las células se sembraron en placas
de cultivo pretratadas con poli-lisina y se
utilizaron no antes de 7 días tras el cultivo, que es el tiempo que
necesitan para terminar de diferenciarse y que aparezcan receptores
de glutamato.
\vskip1.000000\baselineskip
Los complejos nanocuerno-siRNA
se formaron mezclando cantidades iguales de volumen de la solución
que contenía el nanocuerno elegido y de la que contenía el siRNA
(Chonco L, et al., Org Biomol Chem. 2007 Jun 21;
5(12):1886-93. Posadas I, et al., Pharm Res.
2009 May; 26(5):1181-91), e incubando la
mezcla en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ambas
moléculas se disolvieron en agua DEPC (Dietil pirocarbonato) (libre
de RNAsas).
\vskip1.000000\baselineskip
El retardo en gel de agarosa se utilizó para
averiguar la concentración adecuada para obtener la mayor
efectividad de unión posible entre ambas moléculas (Hansen RK J
Neurochem. 2007;103(4):1396-407 Peng LA Brain
Res Dev Brain Res. 1991;
63(1-2):1-12). Se testó
la mezcla de distintas concentraciones de nanocuerno y de 250 ng de
siRNA. La mezcla se corrió durante 15 minutos a 60V en un gel de
agarosa al 1,2% con 0,017% de bromuro de etidio. Los geles se
fotografiaron y las bandas se cuantificaron con un sistema de
análisis de imagen apropiado (Quantity One). Los resultados
se pueden observar en las figuras 1 a 4 para CNH31, CNH40, CNH41 y
CNH43, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las pruebas para evaluar la toxicidad del
nanocuerno se realizaron en distintos tipos celulares, determinando
la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) (Posadas
I, López-Hernández B, Clemente MI, Jiménez JL,
Ortega P, de la Mata J, Gómez R, Muñoz-Fernández MA,
Ceña V Highly efficient transfection of rat cortical neurons using
carbosilane dendrimers unveils a neuroprotective role for
HIF-1alpha in early chemical
hypoxia-mediated neurotoxicity Pharm Res. 2009 May;
26(5):1181-91). Para ello, las células
fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se expusieron a
soluciones con diferentes concentraciones de nanocuerno para
realizar curvas de toxicidad
concentración-dependiente durante 24, 48 o 74 horas.
Los efectos tóxicos se evaluaron midiendo la ruptura de la membrana
celular y la consiguiente liberación de la LDH al sobrenadante a
través del kit CytoTox96® (Promega). Las células se despegaron
mecánicamente, se lavaron con PBS (Phosphate buffered saline)
y fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos. La
absorbancia del lisado y del sobrenadante celular se midió
utilizando un espectofotómetro de microplacas a una longitud de onda
de 490 nm.
La toxicidad de los tratamientos con los
complejos nanocuerno-siRNA, utilizando distintas
concentraciones de nanocuerno (1-8 \muM) en
combinación con 100 nM de siRNA, se estudió por citometría de flujo.
Para ello, después de los tratamientos, las células se incubaron con
yoduro de propidio 0,5 mg/ml al menos durante 1 hora a 37ºC en
oscuridad. Seguidamente, las células se tripsinizaron y se
analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur,
Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A
partir de la evaluación de 10.000 células por condición
experimental, se calculó el porcentaje de células con la membrana
citoplasmática dañada (yoduro de propidio positivas) (Weber N,
Ortega P, Clemente MI, Shcharbin D, Bryszewska M, de la Mata FJ,
Gómez R, Muñoz-Fernández MA Characterization of
carbosilane dendrimers as effective carriers of siRNA to
HIV-infected lymphocytes. J Control Release. 2008
Nov 24; 132(1):55-64. Perumal OP, Inapagolla
R, Kannan S, Kannan RM The effect of surface functionality on
cellular trafficking of dendrimers. Biomaterials. 2008
Aug-Sep;
29(24-25):3469-76). Los
resultados de la citotoxicidad para neuronas corticales se pueden
observar en la figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de 24-72 horas con las
células en presencia de los complejos
nanocuerno-siRNA, utilizando 100 nM de siRNA
fluorescente para realizarlos, se recogieron los medios
condicionados y las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS.
Las células totales -vivas y muertas- presentes en la suspensión
resultante al juntar el tripsinizado celular y el medio condicionado
se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur,
Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A
partir de la evaluación de 10.000 células por condición experimental
se calculó el porcentaje de células transfectadas con siRNA
fluorescente (Weber N, Ortega P, Clemente MI, Shcharbin D,
Bryszewska M, de la Mata FJ, Gómez R,
Muñoz-Fernández MA Characterization of carbosilane
dendrimers as effective carriers of siRNA to
HIV-infected lymphocytes, J Control Release. 2008
Nov 24; 132(1):55-64. Perumal OP, Inapagolla
R, Kannan S, Kannan RM The effect of surface functionality on
cellular trafficking of dendrimers. Biomaterials. 2008
Aug-Sep;
29(24-25):3469-76).
La translocación del complejo
nanocuerno-siRNA también se estudió por microscopía
confocal. Para esto, las células se sembraron en cubreobjetos y se
trataron del mismo modo que las muestras anteriores. Las células
tratadas con siRNA fluorescente, sólo o formando complejos
nanocuerno-siRNA, se visualizaron y fotografiaron en
un microscopio confocal (Nikon Eclipse TE200) utilizando la
longitud de onda adecuada para la excitación del fluoróforo con el
que el siRNA esta marcado (Gras R, Almonacid L, Ortega P,
Serramia MJ, Gómez R, de la Mata FJ, López-Fernández
LA, Muñoz-Fernández MA. Changes in gene expression
pattern of human primary macrophages induced by carbosilane
dendrimer 2G-NN16. Pharm Res. 2009 Mar;
26(3):577-86).
Los resultados sirvieron para determinar el
porcentaje de células positivas para la transfección intracelular de
siRNA. En la figura 6 se muestran los resultados para el complejo
CNH31-siRNA.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN total celular se aisló mediante un método
estándar con tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo
(TriPure Isolation Reagent, Roche Applied Sciences, Indianapolis,
IN). El ARN se transformó en cDNA y éste se utilizó para
realizar la real-time PCR. Utilizamos la
real-time PCR para estudiar el silenciamiento
de distintos genes por medio de 100 nM de siRNA vehiculizado con
distintas concentraciones de IR8. El gen beta-actina
se utilizó como gen de referencia para todos los experimentos de
real-time PCR. La reacción se realizó
utilizando procedimientos estándar para la StepOnePlus
Real-Time PCR System (Applied
Biosystems). En cada experimento, se calculó la media del ciclo
umbral [cycle threshold (C_{T})] de los triplicados de cada
uno de los genes estudiados y del gen utilizado como referencia,
pudiendo así comparar la expresión génica tras los diferentes
tratamientos. Los resultados se muestran en la figura 7.
Claims (47)
1. Uso de un vector no viral, donde el vector no
viral comprende:
- i)
- al menos un nanocuerno de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros; y
- ii)
- donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa;
para la elaboración de un medicamento para
terapia génica.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El uso según la reivindicación anterior,
donde el nanocuerno de carbono tiene un radio inferior a 10 nm,
preferiblemente inferior a 6 nm.
3. El uso según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono tiene
una longitud inferior a 50 nm siendo el diámetro de las dalias de
nanocuernos igual o menor de 150 nm.
4. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono está
cortado en las puntas y/o en su capa exterior.
5. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono y los
dendrones y/o dendrímeros están enlazados químicamente mediante
enlaces covalentes.
6. El uso según la reivindicación anterior,
donde el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino,
carboxilo y/o éster presentes en la superficie del nanocuerno de
carbono.
7. El uso según la cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono y los
dendrones y/o dendrímeros están enlazados mediante un enlace de tipo
amida.
8. El uso según la reivindicación anterior,
donde el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino
presentes en los dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo
presentes en la superficie del nanocuerno de carbono.
9. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros
comprenden desde 0 a 8 generaciones.
10. El uso según la reivindicación anterior,
donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden de 2 a 6
generaciones.
11. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene
un peso molecular comprendido entre 300 y 100.000 g/mol,
preferiblemente entre 1.000 y 10.000 g/mol.
12. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene
un diámetro comprendido entre 5 y 140 \ring{A}.
13. El uso según la reivindicación anterior,
donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre
10 y 70 \ring{A}.
14. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero
comprende entre 2 y 1.024 grupos de superficie.
15. El uso según la reivindicación anterior,
donde el dendrón y/o dendrímero comprende de 4 a 260 grupos de
superficie.
16. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15, donde los grupos de superficie son grupos
amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más
preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están
protonadas a un pH inferior a 6.
17. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la relación carga/masa de los
dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0,1 a 10
mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero.
18. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros son
solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes como después de la
unión del dendrímero al nanocuerno de carbono.
19. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, donde los dendrones y/o dendrímeros en sus
formas neutras son solubles en metanol tanto antes como después de
la unión del dendrímero al nanocuerno de carbono.
20. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el núcleo de los dendrones o
dendrímeros se selecciona entre:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde n es un número entero desde 1
a
4.
\newpage
21. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, donde los dendrones y/o dendrímeros se
seleccionan entre:
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de
cuarta o sexta
generación.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El uso según la reivindicación anterior,
donde los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación
contienen partículas de oro.
23. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, donde los dendrímeros tipo PAMAM
comprenden en su superficie grupos amino cuaternarios.
24. El uso según cualquiera de las tres
reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros tipo PAMAM tienen
unido a través de sus grupos amino cuaternarios un grupo:
-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}.
25. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, donde el dendrímero PAMAM de cuarta o
sexta generación se selecciona entre:
donde R es
- - -CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
26. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la molécula biológicamente activa
es una cadena de oligonucleótidos y/o una cadena de aminoácidos y/o
una molécula farmacéuticamente activa.
27. El uso según la reivindicación anterior,
donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una
cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o a la cadena
farmacéuticamente activa mediante interacciones electrostáticas y/o
enlaces covalentes, preferiblemente amida y/o éster.
28. El uso según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde la interacción electrostática y/o
la unión covalente tiene lugar entre una de las posiciones
terminales finales de las cadenas de oligonucleótidos y/o de
aminoácidos y/o de la sustancia farmacéuticamente activa y la
superficie de los nanocuernos de carbono.
29. El uso según cualquiera de las tres
reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros están unidos a
ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro ARN, antagomir, anticuerpos,
proteínas o cualquier combinación de los mismos.
30. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para la preparación de un medicamento
para el tratamiento o prevención de enfermedades del sistema
nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes
cerebrovasculares.
31. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para
el tratamiento o prevención de una infección.
32. El uso según la reivindicación anterior
donde la infección es bacteriana o viral.
33. El uso según la reivindicación anterior
donde la infección es causada por el virus del síndrome de
inmunodeficiencia humano (SIDA).
34. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para
el tratamiento o prevención del cáncer.
35. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para
el tratamiento o prevención de una enfermedad crónica,
preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
36. El uso de los vectores descritos en las
reivindicaciones 1 a 29 para la preparación de un medio de contraste
o sonda de imagen que comprende el vector no viral y una molécula de
mareaje radiológico.
37. Vector no viral como se define en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 29.
38. Composición farmacéutica que comprende el
vector no viral como se define en la reivindicación 37 y al menos un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
39. Composición farmacéutica según la
reivindicación anterior, que además comprende al menos otro
principio activo.
40. Uso de la composición según cualquiera de
las dos reivindicaciones anteriores, para la elaboración de un
medicamento.
41. Kit de transfección de ARN de silenciamiento
que comprende el vector no viral según se define en la
reivindicación 37.
42. Uso del kit de transfección de ARN de
silenciamiento según la reivindicación anterior en cultivos
primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células
primarias.
43. Procedimiento para la síntesis del vector no
viral según se define en la reivindicación 37, que comprende las
siguientes etapas:
- a.
- mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y
- b.
- añadir la mezcla anterior a una disolución de nanocuernos previamente dispersados.
\vskip1.000000\baselineskip
44. El procedimiento según la reivindicación
anterior, donde los nanocuernos están previamente cortados.
45. El procedimiento según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde los nanocuernos se dispersan en
al menos una disolución de DMF.
46. El procedimiento según cualquiera de las
tres reivindicaciones anteriores, donde a la disolución del dendrón
y/o dendrímero es añadida una disolución acuosa de HAuCl_{4} y
posteriormente se reduce mediante NaBH_{4}.
47. El procedimiento según cualquiera de las
cuatro reivindicaciones anteriores, donde los nanocuernos de carbono
han sido previamente funcionalizados mediante una cicloadición
dipolar de iluros de azometino, mediante reacción radicálica de
derivados de anilina o mediante oxidación directa de los nanocuernos
para obtener en su superficie grupos carboxilo y anclar sobre ellos
grupos amino, y/o éster.
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| JP2023540098A (ja) | 2020-09-03 | 2023-09-21 | チェン アーヴィン エス．ワイ． | 可溶性アルカリホスファターゼ構築物及び可溶性アルカリホスファターゼ構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター |
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2010
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Non-Patent Citations (6)
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Also Published As
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