WO2012014492A1 - 免疫誘導剤 - Google Patents

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immunity
cells
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錦雁 程
丸山　宏二
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Shizuoka Prefecture
Olympus Corp
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Shizuoka Prefecture
Olympus Corp
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an immunity-inducing agent containing ⁇ -tricalcium phosphate (hereinafter also referred to as “ ⁇ -TCP”) having a porosity of 50% or less, more specifically, by being implanted or injected into a living body. And an immunity-inducing agent that induces lymphocytes and dendritic cells (hereinafter also referred to as “DC cells”) in the vicinity thereof.
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • DC cells dendritic cells
  • ⁇ -TCP calcium phosphate compounds
  • ⁇ -TCP has a high-purity ⁇ -TCP crystal layer consisting of continuous macropores and micropores with a porosity of about 75% and 100 to 400 ⁇ m, and a compressive strength of 2 to 3 MPa that is easy to process at the surgical site.
  • Quality artificial bone filling agents and the like are commercially available (for example, see Non-Patent Document 1), and such a ⁇ -TCP porous body has ideal properties as an artificial bone filling material in that it is replaced by its own bone.
  • Patent Document 1 it has been explained that such properties are due to absorption by two mechanisms of in vivo chemical dissolution and cell phagocytosis (see, for example, Patent Document 1).
  • the present inventors have used a cancer cell suppression sheet obtained by coating a surface of a flexible sheet member with a ⁇ -TCP porous powder having a particle size of 25 to 75 ⁇ m and having a porosity of 75% or more. It has been confirmed that malignant tumors can be suppressed by bringing ⁇ -TCP into direct contact with activating macrophage activity (see, for example, Patent Document 2).
  • ⁇ -TCP porous powder having a particle size of 25 to 75 ⁇ m and having a porosity of 75% or more. It has been confirmed that malignant tumors can be suppressed by bringing ⁇ -TCP into direct contact with activating macrophage activity (see, for example, Patent Document 2).
  • the accumulation action of lymphocytes and dendritic cells by ⁇ -TCP porous body powder has not been confirmed, and an invasive treatment such as introduction of a sheet is necessary. Such a delicate treatment was difficult.
  • An object of the present invention is to provide an immunity-inducing agent that can be transplanted or injected into a living body by a simple operation and can activate immune action without side effects in the living body.
  • the present inventors examined the immunity-inducing action by changing the porosity of ⁇ -TCP.
  • ⁇ -TCP having a porosity of 50% or less was transplanted / injected into a living body, the vicinity of ⁇ -TCP
  • lymphocytes and dendritic cells such as B cells, T cells and natural killer cells (hereinafter also referred to as “NK cells”) involved in immunity are accumulated and induced in these areas.
  • NK cells natural killer cells
  • the present invention is (1) an immunity-inducing agent containing ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) having a porosity of 50% or less, or (2) for implantation or injection into a living body.
  • a method for inducing an immune reaction in which ⁇ -TCP having a porosity of 50% or less is transplanted or injected into a living body, or ⁇ -TCP having a porosity of 50% or less is used.
  • a method of activating immune action to be transplanted or injected into the living body a method of forming lymph node-like tissue in which ⁇ -TCP having a porosity of 50% or less is transplanted or injected into the living body, and a porosity of 50% or less ⁇ -TCP is used as an immune inducer for transplantation or injection into a living body, and ⁇ -TCP having a porosity of 50% or less is used as a lymph for transplantation or injection into a living body.
  • ⁇ -TCP having a porosity of 50% or less for the preparation of an immunoinducing agent for transplantation or injection for implantation in vivo or transplantation in vivo
  • ⁇ -TCP for the preparation of lymph node-like tissue forming agents for injection or injection
  • beta-TCP is 50% or less.
  • an immunoinducing agent containing ⁇ -TCP having a porosity of 50% or less can be transplanted or injected into a living body, particularly in the vicinity of a lesion such as cancer (non-lesion).
  • a lesion such as cancer
  • ⁇ -TCP which is biocompatible, is transplanted or injected, and lymphocytes and dendritic cells originally present in the patient's body are induced, so reactions other than immune activation occur in the body. Can prevent you from getting up.
  • ⁇ -TCP particles or granules having a particle size of 0.05 ⁇ m or more and less than 25 ⁇ m and having a porosity of 50% or less are injected or transplanted
  • ⁇ -TCP particles or granules having a porosity of 25 ⁇ m or more and 50% or less are used. More lymphocytes and dendritic cells can be induced than when injected or transplanted.
  • a ⁇ -TCP tablet having a porosity of 50% or less is transplanted or injected, a long-term immune induction effect can be expected.
  • ⁇ -TCP particles (granule) or ⁇ -TCP columnar bodies having a porosity of 50% or less they can be easily administered multiple times or locally with a syringe or the like.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of a ⁇ -TCP tablet that is an embodiment of an immunity-inducing agent of the present invention.
  • 2 is an SEM photograph of a fractured section of a ⁇ -TCP tablet having a porosity of 18%.
  • 3 is a HE-stained photograph of skin tissue transplanted with a ⁇ -TCP tablet having a porosity of 18%.
  • FIG. 4 is an enlarged photograph of a region a in FIG. 3.
  • Fig. 4 is an enlarged photograph of a region b in Fig. 3. It is a HE staining photograph of untreated normal skin tissue.
  • 3 is a HE-stained photograph of skin tissue transplanted with a ⁇ -TCP porous body having a porosity of 60%.
  • 3 is a HE-stained photograph of a skin tissue transplanted with a ⁇ -TCP porous body having a porosity of 75%. It is the HE dyeing
  • FIG. 6 is a particle size distribution diagram of a fraction of ⁇ -TCP powder having a particle size of 0.05 to 25 ⁇ m.
  • the immunity-inducing agent of the present invention is not particularly limited as long as it is an immunity-inducing agent containing ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) having a porosity of 50% or less. Inducing a reaction, that is, inducing an action of the immune system against a foreign substance (antigen).
  • ⁇ -TCP is a single crystal form of a composition represented by Ca 3 (PO 4 ) 2 and is a compound that is stable at room temperature and has biocompatibility.
  • the ⁇ -TCP is preferably a sintered body.
  • ⁇ -TCP stone having a porosity of 0% ( ⁇ -TCP sintered body having the same composition as that of the sintered body to be measured and having no crystalline pores)
  • a method can be mentioned.
  • the immunity-inducing agent of the present invention includes ⁇ -TCP particles having a porosity of 50% or less, ⁇ -TCP granules (a conjugate of a plurality of particles) having a porosity of 50% or less, and a porosity of 50%.
  • ⁇ -TCP tablets, ⁇ -TCP columnar bodies having a porosity of 50% or less, and the like can be exemplified. Even if these are composed only of ⁇ -TCP, ⁇ -TCP is an active ingredient. , Other components may be included.
  • the porosity of ⁇ -TCP of 50% or less is preferably 40% or less, more preferably 30% or less, and particularly preferably 20% or less.
  • the ⁇ -TCP particles and ⁇ -TCP granules are in the form of powder, suspension (sol) or viscous material (gel) in the vicinity of a lesion such as cancer in a living body (non-cancerous part, etc.). Be administered.
  • the porosity P of such ⁇ -TCP particles and ⁇ -TCP granules can be measured using, for example, AccuPick 1330 series (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the molar ratio of calcium hydrogen phosphate and calcium carbonate powder is 1: 1 to 3, preferably 1: 1.5 to 2.5.
  • the mechanochemical method is prepared by adding pure water to the calcium hydrogen phosphate-calcium carbonate mixture to prepare a slurry, and subjecting the prepared slurry to a wet milling process for about 24 hours by a ball mill.
  • the slurry obtained by the above-mentioned reaction was dried at 70 to 90 ° C., preferably 75 to 85 ° C., and the solid obtained by pulverizing the solid material was added to 700-TCP powder.
  • ⁇ -TCP calcined powder By pre-calcining at ⁇ 800 ° C for several hours, ⁇ -TCP calcined powder can be prepared, and the obtained ⁇ -TCP calcined powder can be sieved to obtain a fraction of each particle size. , Porosity for each fraction By measuring, a fraction having a porosity of 50% or less can be obtained. Specifically, first, the sieve passes through a 105 ⁇ m sieve, and the sieve passes through the 75 ⁇ m sieve to leave the remaining ⁇ -TCP as a fraction (A), and then the sieve passes through a 75 ⁇ m sieve.
  • fraction (B) ⁇ -TCP remaining through a sieve having a sieve size of 25 ⁇ m
  • fraction (C) ⁇ -TCP that has passed through a 25 ⁇ m sieve
  • Suitable examples of the particle diameter of the ⁇ -TCP particles and ⁇ -TCP granules are 0.05 or more and less than 500 ⁇ m, preferably less than 100 ⁇ m, more preferably less than 50 ⁇ m, still more preferably less than 25 ⁇ m, and more preferably less than 15 ⁇ m. can do. These particle sizes can be evaluated by the size of ⁇ -TCP particles and granules confirmed by fractionation using the above-mentioned sieve or by comparison with markers by SEM photographs.
  • the dose of ⁇ -TCP particles or ⁇ -TCP granules to be transplanted or injected is not limited as long as the immunity-inducing effect is exhibited, but should be appropriately selected according to the disease type, lesion size, patient weight, etc.
  • 0.01 mg to 100 g, more preferably 0.1 mg to 10 g, and still more preferably 1 mg to 1 g can be exemplified.
  • the frequency of transplantation and / or infusion can be exemplified once every 1 to 6 weeks.
  • Examples of the shape of the ⁇ -TCP tablet and ⁇ -TCP columnar body include a columnar body such as a disk, a cylindrical body, a substantially cylindrical body, an elliptical columnar body, and a triangular to heptagonal columnar body.
  • the ⁇ -TCP The size of the tablet or columnar body can be appropriately determined in consideration of the type of lesion, the administration site, the size of the lesion, the weight of the patient, and the like.
  • the diameter of the ⁇ -TCP tablet can be 1.0 to 10.0 mm, preferably 3.0 to 7.0 mm, more preferably 4.0 to 6.0 mm, and the height is 0 0.5 to 4.0 mm, preferably 1.0 to 3.0 mm, and more preferably 1.5 to 2.5 mm.
  • the diameter of the ⁇ -TCP columnar body can be 0.1 to 2.0 mm, preferably 0.3 to 1.0 mm, more preferably 0.4 to 0.6 mm. 1.0 to 6.0 mm, preferably 2.0 to 5.0 mm, more preferably 3.0 to 4.0 mm.
  • the ⁇ -TCP calcined powder is prepared as described above, and the obtained ⁇ -TCP calcined powder is molded into tablets or columns by compression molding (tabletting).
  • the sintered ⁇ -TCP calcined tablet or columnar body is sintered at 450 to 650 ° C., preferably 600 ° C. for 2.5 to 3.5 hours, preferably 3 hours, and then 850 to 950 ° C., preferably 900 ° C.
  • the ⁇ -TCP calcined powder is sintered to obtain a powder as a sintered body of ⁇ -TCP, which is then compression-molded (tablet). TCP tablets and columns may be produced.
  • the ⁇ -TCP columnar body may be produced by punching a ⁇ -TCP tablet into a columnar shape.
  • the living body in the present invention is not particularly limited as long as it is a site other than bones and teeth, and examples include subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intrathoracic, and intracerebral, preferably subcutaneous. Can do.
  • lymphocytes and dendritic cells such as T cells, B cells, and NK cells are accumulated in the vicinity of the transplanted and / or injected immunity-inducing agent.
  • Lymph node-like tissue can be constructed.
  • the lymph node-like tissue means a cell cluster in which lymphocytes and dendritic cells are accumulated.
  • the immunity-inducing agent that induces lymphocytes and dendritic cells is located in the vicinity of the lesion site but is a non-lesion site, a remote site away from the lesion site, or after excision of the lesion site. Specifically, it is 1 mm or more and 100 cm or less, preferably 50 cm or less, more preferably 5 cm or less, further preferably 3 cm or less, for example 1.5 cm to 2.0 cm from the lesion site or the excision site of the lesion. An area at a distance can be mentioned. Lymphocytes and dendritic cells induced in the vicinity of immunity inducers are lymphocytes and dendritic cells originally present in the patient's body, preventing reactions other than immune activation from occurring in the body. .
  • the lesion in the present invention is not particularly limited as long as it is a lesion other than a bone or a tooth, and examples thereof include cancer, allergic immunity, and infectious diseases.
  • cancer can be preferably mentioned.
  • Tissue, lung, skin, mammary gland, soft tissue, bladder, stomach, liver, gallbladder, pancreas, head, neck, kidney, adrenal gland, prostate, large intestine, small intestine, esophagus, female organ (eg ovary, uterus) or thyroid gland Can be particularly preferably exemplified.
  • Examples of the method of transplanting the immunity-inducing agent of the present invention include a method of placing the tablet at an incision site by surgical treatment, and a method of distributing the particles and granules at the incision site by surgical treatment.
  • a method for injecting an immunity-inducing agent a method of directly injecting into the living body through a minimal opening using a syringe filled with the above-mentioned particles or granule suspension, or the above-mentioned columnar article was attached to an injection needle The method of extruding and injecting directly into the living body through a minimal opening using a syringe can be mentioned.
  • the immunity-inducing agent of the present invention includes, as long as it does not diminish or inhibit the effects of the present invention, pharmaceutically acceptable ordinary carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents other than ⁇ -TCP, Various formulation ingredients such as pH buffering agents, disintegrants, solubilizers, solubilizers, isotonic agents, etc. can also be included, these components can be mixed with the above particles or granules and injected, It can also be prepared by mixing in advance and compression molding (tablet).
  • ⁇ -TCP tablets Calcium hydrogen phosphate and calcium carbonate powder are weighed and mixed at a molar ratio of 1: 2, and a slurry is prepared by adding pure water to the calcium hydrogen phosphate-calcium carbonate mixture at an appropriate ratio. The prepared slurry is subjected to wet milling for about 1 day with a ball mill, the milled slurry is dried at 80 ° C. for several hours, and the resulting solid is pulverized to obtain ⁇ -TCP A powder was obtained. The obtained ⁇ -TCP powder was calcined at 750 ° C. for several hours to prepare a ⁇ -TCP calcined powder.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of a ⁇ -TCP tablet.
  • FIG. 2 is a photograph of a ⁇ -TCP tablet having a porosity of 18%, which was observed with a scanning electron microscope (SEM) in its fractured section.
  • SEM scanning electron microscope
  • ⁇ -TCP tablets with a porosity of 18% were used to transplant the immune cell-inducing effect of the immunity-inducing agent of the present application subcutaneously into two 7-week-old mice. It was evaluated by doing. Specifically, the mouse is anesthetized, the back skin is incised about 10 mm, a ⁇ -TCP tablet with a porosity of 18% is implanted subcutaneously, the mouse is bred for 2 weeks, and the skin tissue including the tablet implantation site is collected. did. The collected skin tissue was fixed with formalin and then embedded in paraffin to prepare a thin section for a pathological specimen, stained with HE (hematoxin / eosin), and observed with an optical microscope.
  • HE hematoxin / eosin
  • FIG. 3 to 5 show photographs when a ⁇ -TCP tablet having a porosity of 18% is transplanted.
  • 4 and 5 are enlarged photographs of the edge portion a or the central portion b of the transplant site in FIG.
  • FIG. 6 shows an HE-stained image of a thin section prepared from skin tissue not transplanted with ⁇ -TCP tablets as a negative control.
  • FIG. 7 shows the result of implanting a ⁇ -TCP tablet with a porosity of 60%
  • FIG. 8 shows the ⁇ -TCP tablet with a porosity of 75%
  • FIG. 9 shows the result of implanting a plastic piece.
  • the number of lymphocytes and macrophages induced in the graft was compared in an HE-stained image obtained by photographing the skin tissue transplanted with each graft. The result is shown in FIG.
  • FIG. 11 shows the results of the same analysis performed on ⁇ -TCP tablets with porosity 3, 8, 18, 42, 50, 60, and 75% prepared in Example 1 above.
  • induction of lymphocytes was observed at a porosity of 50% or less, but in the ⁇ -TCP tablets having a porosity of 60% and 75%, almost no induction of lymphocytes was confirmed.
  • ⁇ -TCP tablets with a porosity of 50% or less effectively induce lymphocytes and have an immune induction effect that activates immune functions by the induced lymphocytes.
  • Example 1 The types and distribution of lymphocytes induced by the ⁇ -TCP tablets prepared in Example 1 were examined by immunostaining.
  • a ⁇ -TCP tablet with a porosity of 18% was transplanted subcutaneously into a mouse in the same procedure as in Example 2 above, and the mouse was bred for 2 weeks after transplantation, the transplant site was collected, a thin section was prepared, and a thin section was prepared.
  • immunostaining of each cell was performed on a thin section of a lymph node collected from a mouse transplanted with an immunity-inducing agent.
  • FIGS. 12 to 19 show the results of observation of the vicinity of the transplantation site where ⁇ -TCP having a porosity of 18% was transplanted and the lymph tissue of the spleen of the mouse not transplanted with an optical microscope.
  • T cells 12 and 13 show T cells stained in the vicinity of the transplant site and splenic lymph tissue, respectively. In both cases, it can be seen that the density of T cells is higher in the central part than in the edge part.
  • FIGS. 14 and 15 show B cells stained in the vicinity of the transplant site and splenic lymph tissue, respectively. Similarly, in both cases, it can be seen that B cells are densely packed at the edge (see arrows in FIGS. 14 and 15).
  • NK cells 16 and 17 are NK cells stained in the vicinity of the transplant site and spleen lymph tissue, respectively. Cells indicated by arrows are NK cells. Similarly, in both cases, a small number of NK cells were dispersed and confirmed.
  • FIGS. 18 and 19 are obtained by staining dendritic cells in the vicinity of the transplant site and splenic lymph tissue, respectively.
  • the cell indicated by the arrow is a DC cell.
  • a small number of DC cells were dispersed and confirmed in both cases.
  • the ⁇ -TCP tablet produced in Example 1 above induces various types of lymphocytes such as T cells, B cells, NK cells, and also induces dendritic cells. It was confirmed that it had the same distribution and density as normal lymph nodes after transplantation in the body and constructed a cell cluster structure similar to normal lymph nodes.
  • the tablet containing ⁇ -TCP of the present invention is an excellent immunity-inducing agent capable of inducing immune functions by inducing lymph node-like tissues similar to natural lymph nodes. To do.
  • ⁇ -TCP particles or granules The ⁇ -TCP calcined powder obtained in Example 1 is sieved, the sieve passes through a sieve of 105 ⁇ m, and the sieve passes through a sieve of 75 ⁇ m. The remaining ⁇ -TCP has a particle size of 75 ⁇ m or more and less than 105 ⁇ m.
  • A ⁇ -TCP passed through a sieve of 75 ⁇ m, and the particle size of ⁇ -TCP remaining on the sieve passed through a sieve of 25 ⁇ m was set to 25 ⁇ m or more and less than 75 ⁇ m (B), and ⁇ -TCP passed through a 25 ⁇ m sieve.
  • 3 fractions (A) to (C) were obtained with a particle size of 0.05 ⁇ m or more and less than 25 ⁇ m (C).
  • A represents a ⁇ -TCP powder having a porosity of 60 to 70%, B a porosity of 40 to 50%, and C a porosity of 0 to 30%. It was confirmed that macrophages were distributed around A. On the other hand, the distribution of lymphocytes was confirmed around B, and it was confirmed that lymphocytes were localized at a high density around C. Thus, it became clear that lymphocytes were more effectively induced particularly in C.
  • the SEM image was shown about the particle
  • FIG. 23 shows the particle size distribution of the powder of (C) fraction.
  • Anti-tumor effect by ⁇ -TCP tablet Antitumor effects in mice were examined using disk-shaped ⁇ -TCP tablets (diameter 5 mm, height 2 mm) with a porosity of 0.1 to 12%. As a control, a plastic carrier material of the same size and free of heterologous proteins that could be immunogenic was used.
  • Tumor volume (major axis ⁇ minor axis 2 ) / 2 (mm 3 )
  • a ⁇ -TCP tablet and a plastic carrier material as a control were each implanted subcutaneously at a site 15 to 20 mm away from the forming tumor. About one month later, the tumor size was measured, and the effect of ⁇ -TCP on tumor growth was observed. As a result, the tumor volume of the control was 1400 mm 3 , whereas in the ⁇ -TCP tablet administration group, the tumor volume was reduced to 1200 mm 3 .

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Abstract

　簡便な操作で生体内に移植又は注入することができ、生体内で副作用なく免疫作用を活性化させることができる免疫誘導剤を提供することを課題とする。　解決手段として、気孔率が５０％以下であるβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）を含む免疫誘導剤を生体内、特にがん等の病変部の近傍（非病変部）に移植又は注入する。β－ＴＣＰの近傍には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のリンパ球や樹状細胞を誘導し、リンパ球が高密度で局在するリンパ節様組織を形成することができる。免疫誘導剤の剤型としては、粒径０．０５以上２５μｍ未満の粒子又は顆粒や、錠剤又は柱状体を挙げることができる。

Description

免疫誘導剤
　本発明は、気孔率５０％以下のβ－リン酸三カルシウム（β－Tricalciumphosphate：以下「β－ＴＣＰ」ともいう）を含む免疫誘導剤、より詳しくは、生体内に移植又は注入されることにより、リンパ球及び樹状細胞（以下「ＤＣ細胞」ともいう）をその近傍に誘導する免疫誘導剤に関する。
　β－ＴＣＰ等のリン酸カルシウム系化合物は、その優れた生体親和性により様々な製品が実用化されている。例えば、気孔率約７５％で１００～４００μｍの連続するマクロ気孔とミクロ気孔からなる高純度のβ－ＴＣＰの結晶層を有し、手術現場で加工し易い強度である２～３ＭＰａの圧縮強度の品質の人工骨補填剤等が市販されており（例えば、非特許文献１参照）、かかるβ－ＴＣＰ多孔体は、自分の骨に置き換わるという点で人工骨補填材料として理想的な性質を兼ね備えているが、かかる性質は、生体内における化学的な溶解と、細胞による貪食の２つのメカニズムによる吸収作用による旨の説明がなされている（例えば、特許文献１参照）。
　本発明者らは、柔軟性のあるシート部材の表面に７５％以上の気孔率を有する粒径２５～７５μｍのβ－ＴＣＰ多孔体粉末をコーティングしてなる癌細胞抑制シートを用いて、がんに直接β－ＴＣＰを接触させ、マクロファージの活動を活発化させることにより悪性腫瘍を抑制できることを確認している（例えば、特許文献２参照）。この発明では、β－ＴＣＰ多孔体粉末によるリンパ球及び樹状細胞の集積作用については確認されておらず、シートの導入という侵襲的処置が必要であり、複数回投与や濃度を変えての投与等の細やかな処置が困難であった。また、β－ＴＣＰ多孔体粉末の場合、その粒径が２５μｍより小さいとき、初期的には粒径２５～７５μｍの場合と同様の細胞抑制効果が認められたが時間の経過とともに抑制効果が低下するという問題があった。
特開２００１－２５９０１６号公報 特開２０１０－１２６４３４号公報
セラミックス４３（2008）Ｎｏ．１１、９６７～９８８頁
　本発明の課題は、簡便な操作で生体内に移植又は注入することができ、生体内で副作用なく免疫作用を活性化させることができる免疫誘導剤を提供することにある。
　本発明者らは、β－ＴＣＰの気孔率を変化させて、その免疫誘導作用について検討したところ、気孔率が５０％以下のβ－ＴＣＰを生体内に移植・注入した場合、β－ＴＣＰ近傍の領域に免疫作用に関わるＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（以下「ＮＫ細胞」ともいう）等のリンパ球や樹状細胞が集積・誘導されることを見いだした。また、β－ＴＣＰが移植された部位の近傍の非病変部に、天然のリンパ節と類似した細胞構造が構築されることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、（１）気孔率が５０％以下であるβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）を含む免疫誘導剤や、（２）生体内への移植用又は注入用であることを特徴とする上記（１）記載の免疫誘導剤や、（３）近傍にリンパ球及び樹状細胞を誘導することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の免疫誘導剤や、（４）リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞から選ばれる１又は２以上であることを特徴とする上記（１）～（３）いずれか記載の免疫誘導剤や、（５）剤型が、粒径０．０５以上２５μｍ未満の粒子又は顆粒であることを特徴とする上記（１）～（４）いずれか記載の免疫誘導剤や、（６）剤型が、錠剤又は柱状体であることを特徴とする上記（１）～（４）いずれか記載の免疫誘導剤や、（７）上記（１）～（６）いずれか記載の免疫誘導剤により形成されたリンパ節様組織に関する。
　また、本発明の別の態様としては、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰを生体内へ移植又は注入する免疫反応を誘導する方法や、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰを生体内へ移植又は注入する免疫作用を活性化する方法や、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰを生体内へ移植又は注入するリンパ節様組織の形成方法や、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰを、生体内への移植用又は注入用の免疫誘導剤として使用する方法や、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰを、生体内への移植用又は注入用のリンパ節様組織の形成剤として使用する方法や、生体内への移植用又は注入用の免疫誘導剤の調製のための気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰの使用や、生体内への移植用又は注入用のリンパ節様組織の形成剤の調製のための気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰの使用を挙げることができる。
　本発明によれば、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰを含む免疫誘導剤を生体内、特にがん等の病変部の近傍（非病変部）に移植又は注入するという簡便な操作で免疫作用を活性化することにより、病変部位に対して治癒効果を発揮することができ、さらにがん等の病変部を切除した部位において再発防止を図ることが期待できる。また、移植又は注入されるのは、生体適合性のあるβ－ＴＣＰであり、患者の体内に元々存在しているリンパ球及び樹状細胞が誘導されるので、免疫活性化以外の反応が体内で起きるのを防ぐことができる。
　また、粒径が０．０５μｍ以上２５μｍ未満の気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ粒子若しくは顆粒を注入又は移植した場合、２５μｍ以上の気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ粒子若しくは顆粒を注入又は移植した場合に比べて、より多くのリンパ球や樹状細胞を誘導することができる。気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ錠剤を移植又は注入した場合、長期にわたる免疫誘導効果が期待できる。気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ粒子（顆粒）やβ－ＴＣＰ柱状体の場合、注射器等により、簡単に複数回投与や局所投与ができる。
本発明の免疫誘導剤の一実施形態であるβ－ＴＣＰ錠剤の全体構成図である。 気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤の割断面のＳＥＭ写真である。 気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤を移植した皮膚組織のＨＥ染色写真である。 図３の領域ａを拡大した写真である。 図３の領域ｂを拡大した写真である。 未処理の正常な皮膚組織のＨＥ染色写真である。 気孔率６０％のβ－ＴＣＰ多孔体を移植した皮膚組織のＨＥ染色写真である。 気孔率７５％のβ－ＴＣＰ多孔体を移植した皮膚組織のＨＥ染色写真である。 プラスチックを移植した皮膚組織のＨＥ染色写真である。 皮膚組織に移植された移植片の種類と、該移植片により誘導されたリンパ球とマクロファージとの細胞数の関係を示すグラフである。 β－ＴＣＰの気孔率とリンパ球誘導との関係を示す表である。 Ｔ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したβ－ＴＣＰの移植部位の写真（×１０倍）である。 Ｔ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したマウス脾臓リンパ組織の写真（×１０倍）である。 Ｂ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したβ－ＴＣＰの移植部位の写真（×１０倍）である。 Ｂ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したマウス脾臓リンパ組織の写真（×１０倍）である。 ＮＫ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したβ－ＴＣＰの移植部位の写真（×４０倍）である。 ＮＫ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したマウス脾臓リンパ組織の写真（×４０倍）である。 ＤＣ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したβ－ＴＣＰの移植部位の写真（×４０倍）である。 ＤＣ細胞に特異的な抗体を用いて免疫染色したマウス脾臓リンパ組織の写真（×４０倍）である。 β－ＴＣＰ粉体を移植した皮膚組織のＨＥ染色写真である。 β－ＴＣＰ粉体の粒径と細胞誘導との関係を示す表である。 β－ＴＣＰ粉体の粒径０．０５～２５μｍの分画のＳＥＭ写真である。 β－ＴＣＰ粉体の粒径０．０５～２５μｍの分画の粒度分布図である。
　本発明の免疫誘導剤としては、気孔率が５０％以下であるβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）を含む免疫誘導剤であれば特に制限されず、ここで、免疫誘導とは、免疫反応を誘導すること、すなわち免疫系が異物（抗原）に対して起こす作用を誘導することをいう。上記β－ＴＣＰはＣａ３（ＰＯ４）２で表される組成物の一結晶形態であって、常温において安定であり生体親和性のある化合物である。また、上記β－ＴＣＰは焼結体であることが好ましい。
　上記β－ＴＣＰの気孔率を算出する方法としては、気孔率が０％のβ－ＴＣＰ石（測定対象の焼結体と同じ組成、結晶形の気孔をもたないβ－ＴＣＰ焼結体）の真密度ρを測定しておき、測定対象の焼結体の体積と重さから算出した見かけ密度ρ’とから気孔率Ｐ(％)＝（１－ρ’／ρ）×１００として算出する方法を挙げることができる。
　また、本発明の免疫誘導剤としては、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ粒子、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ顆粒（複数の粒子の結合体）、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ錠剤、気孔率が５０％以下であるβ－ＴＣＰ柱状体等を例示することができ、これらはβ－ＴＣＰのみからなるものであっても、β－ＴＣＰを有効成分とし、他の成分を含むものであってもよい。５０％以下のβ－ＴＣＰの気孔率は、４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、中でも２０％以下が特に好ましい。
　上記β－ＴＣＰ粒子やβ－ＴＣＰ顆粒は、粉末や懸濁液（ゾル）や粘稠物（ゲル）等の形態で生体のがん等の病変部の近傍など（非がん部など）に投与される。かかるβ－ＴＣＰ粒子やβ－ＴＣＰ顆粒の気孔率Ｐは、例えば、アキュピック１３３０シリーズ（株式会社島津製作所製）を用いて測定することができる。
　上記β－ＴＣＰ粒子やβ－ＴＣＰ顆粒の製造方法としては、例えば、リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウムの粉末をモル比で１：１～３、好ましくは１：１．５～２．５になるように秤量して混合し、かかるリン酸水素カルシウム－炭酸カルシウム混合物に純水を添加してスラリーを調製し、調製されたスラリーをボールミルにより約２４時間湿式磨砕処理を行うことでメカノケミカル法による反応をすすめ、磨砕処理されたスラリーを、７０～９０℃、好ましくは７５～８５℃にて乾燥し、乾燥して得られた固形物を粉砕して得られたβ－ＴＣＰ粉末を７００～８００℃にて、数時間仮焼することで、β－ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ－ＴＣＰ仮焼粉末をふるいにかけることで各粒径の分画を得ることができ、分画ごとの気孔率を測定することで、気孔率５０％以下の分画を得ることができる。具体的には、まずふるい目が１０５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が７５μｍのふるいにかけ残ったβ－ＴＣＰを分画（Ａ）とし、次にふるい目が７５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が２５μｍのふるいにかけ残ったβ－ＴＣＰを分画（Ｂ）とし、さらに２５μｍのふるいを通過したβ－ＴＣＰを分画（Ｃ）とした場合に、分画（Ｃ）は、気孔率が確実に５０％以下のβ－ＴＣＰとなる。
　上記β－ＴＣＰ粒子やβ－ＴＣＰ顆粒の粒径としては、例えば、０．０５以上で５００μｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、より好ましくは５０μｍ未満、さらに好ましくは２５μｍ未満、中でも１５μｍ未満を好適に例示することができる。これら粒径は、上記ふるいによる分画により、又はＳＥＭ写真でマーカーと比較して確認したβ－ＴＣＰの粒子や顆粒の大きさをもって評価することができる。
　移植又は注入されるβ－ＴＣＰ粒子やβ－ＴＣＰ顆粒の投与量は、免疫誘導効果が発揮される限り制限はされないが、疾病の種類、病変の大きさ、患者の体重等により適宜選定することができ、好ましくは０．０１ｍｇ～１００ｇ、より好ましくは０．１ｍｇ～１０ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ～１ｇを例示することができる。移植及び／又は注入の頻度としては、１週間～６週間に一回を例示することができる。
　上記β－ＴＣＰ錠剤やβ－ＴＣＰ柱状体の形状としては、円板体、円柱体、略円柱体、楕円柱体、三角～七角柱体などの柱状体を挙げることができ、上記β－ＴＣＰ錠剤や柱状体のサイズとしては、病変部の種類、投与部位、病変の大きさ、患者の体重等を勘案の上適宜決定することができる。β－ＴＣＰ錠剤の直径としては、１．０～１０．０ｍｍ、好ましくは、３．０～７．０ｍｍ、より好ましくは４．０～６．０ｍｍを挙げることができ、高さとしては、０．５～４．０ｍｍ、好ましくは１．０～３．０ｍｍ、より好ましくは１．５～２．５ｍｍを挙げることができる。上記β－ＴＣＰ柱状体の直径としては、０．１～２．０ｍｍ、好ましくは、０．３～１．０ｍｍ、より好ましくは０．４～０．６ｍｍを挙げることができ、長さとしては、１．０～６．０ｍｍ、好ましくは２．０～５．０ｍｍ、より好ましくは３．０～４．０ｍｍを挙げることができる。
　上記β－ＴＣＰ錠剤やβ－ＴＣＰ柱状体の製造方法としては、気孔率が５０％以下の、単一相又はほぼ単一相のβ－ＴＣＰの錠剤や柱状体を製造することができる方法を挙げることができる。具体的には、前述のようにβ－ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ－ＴＣＰ仮焼粉末を圧縮成形（打錠）することにより錠剤や柱状体に賦形し、かかる賦形されたβ－ＴＣＰ仮焼錠剤や柱状体を４５０～６５０℃、好ましくは６００℃にて２．５～３．５時間、好ましくは３時間焼結し、次いで８５０～９５０℃、好ましくは９００℃で０．５～１．５時間、好ましくは１時間焼結し、さらに１０００～１３００℃で０．７５～１．５時間、好ましくは１時間焼結することで燒結体としてのβ－ＴＣＰの錠剤や柱状体を得る方法を挙げることができ、また上記β－ＴＣＰ仮焼粉末を燒結し、β－ＴＣＰの焼結体としての粉体を得た後に圧縮成形（打錠）してβ－ＴＣＰの錠剤や柱状体を作製してもよい。なお、β－ＴＣＰ柱状体は、β－ＴＣＰ錠剤を柱状に打ち抜くことにより作製してもよい。
　本発明における生体内としては、骨や歯以外の部位であれば特に制限されず、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、脳内を挙げることができ、好ましくは皮下を挙げることができる。本発明の免疫誘導剤を生体内に移植及び／又は注入すると、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のリンパ球及び樹状細胞を移植及び／又は注入された免疫誘導剤の近傍に集積させてリンパ節様組織を構築することができる。ここで、リンパ節様組織とは、リンパ球や樹状細胞が集積した細胞集塊を意味する。
　上記リンパ球及び樹状細胞を誘導する免疫誘導剤の近傍としては、病変部位の近傍に位置するが非病変部である部位や、病変部位から離れた遠隔部位や、病変部位を切除した後の部位を挙げることができ、具体的には病変部位や病変の切除部位から１ｍｍ以上１００ｃｍ以内、好ましくは５０ｃｍ以内、より好ましくは５ｃｍ以内、さらに好ましくは３ｃｍ以内、例えば１．５ｃｍ～２．０ｃｍの距離にある領域を挙げることができる。免疫誘導剤の近傍に誘導されるリンパ球及び樹状細胞は患者の体内に元々存在しているリンパ球や樹状細胞であるから、免疫活性化以外の反応が体内で起きることが防止される。
　本発明における病変としては、骨や歯以外における病変であれば特に制限はされず、がん、アレルギー免疫、感染症を例示することができ、中でもがんを好適に挙げることができ、頭蓋骨内組織、肺、皮膚、乳腺、軟組織、膀胱、胃、肝臓、胆嚢、すい臓、頭部、頸部、腎臓、副腎、前立腺、大腸、小腸、食道、女性器（例えば卵巣、子宮）又は甲状腺のがんを特に好適に例示することができる。
　本発明の免疫誘導剤の移植方法としては、上記錠剤を外科的処置による切開箇所に設置する方法や、上記粒子や顆粒を外科的処置による切開箇所に撒布する方法を挙げることができ、本発明の免疫誘導剤の注入方法としては、上記粒子や顆粒の懸濁液等を充填した注射器を用いて最小限の開口部から生体内へ直接注入する方法や、上記柱状物を注射針に装着した注射器を用いて最小限の開口部から生体内へ直接押出注入する方法を挙げることができる。
　本発明の免疫誘導剤には、本発明の効果を減殺又は阻害しない限りにおいて、β－ＴＣＰ以外に薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含めることもでき、これらの成分を上記粒子又は顆粒と混合して注入することもできるし、あらかじめ混合して圧縮成形（打錠）することで作製することもできる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に制限されるものではない。
（β－ＴＣＰ錠剤の調製）
　リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウムの粉末をモル比で１：２になるように秤量して混合し、かかるリン酸水素カルシウム－炭酸カルシウム混合物に純水を適切な割合で添加してスラリーを調製し、調製されたスラリーをボールミルにより約１日湿式磨砕処理を行い、磨砕処理されたスラリーを、８０℃にて数時間乾燥し、乾燥して得られた固形物を粉砕してβ－ＴＣＰ粉末を得た。得られたβ－ＴＣＰ粉末を７５０℃にて数時間仮焼してβ－ＴＣＰ仮焼粉末を作製した。上記β－ＴＣＰ仮焼粉末を内径５ｍｍ、高さ２ｍｍの容器内に収容し、回転数１００ｒｐｍで打錠することにより、錠剤に賦形した。かかる錠剤は、６００℃で３時間、９００℃で１時間、さらに１０００～１３００℃で１時間焼結した。得られたβ－ＴＣＰ錠剤は、一部が結晶構造を有するために半透明であり、吸湿性が高いという特徴を有していた。図１は、β－ＴＣＰ錠剤の全体構成図である。
（β－ＴＣＰ錠剤の物性）
　上記β－ＴＣＰ錠剤の気孔率を調べた。気孔率が０％のβ－ＴＣＰ石（測定対象の焼結体と同じ組成、結晶形の気孔を持たない焼結体）の真密度ρを測定しておき、測定対象の焼結体の体積と重さから算出した見かけ密度ρ’とから気孔率Ｐ(％)＝（１－ρ’／ρ）×１００として算出した。その結果、気孔率３，８，１８，４２，５０，６０，及び７５％のβ－ＴＣＰ錠剤を得た。図２は、気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤について、その割断面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した写真である。写真内のビーズは、寸法の指標として用いたものであり、直径２μｍである。
（β－ＴＣＰ錠剤の免疫細胞誘導効果の検討）
　上記実施例１で作製したβ－ＴＣＰ錠剤のうち、気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤を用いて、本願の免疫誘導剤の免疫細胞誘導効果を２匹の７週齢のマウスの皮下に移植することで評価した。具体的には、マウスを麻酔し、背部皮膚を約１０ｍｍ切開し、気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤を皮下に移植後、マウスを２週間飼育し、錠剤の移植部位を含む皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織を、ホルマリンにより固定した後、パラフィン包埋し、病理標本用の薄切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシン・エオシン）染色を施し、光学顕微鏡により観察した。
　気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤を移植した場合の写真を図３～図５に示す。図４及び図５はそれぞれ、図３の移植部位の縁部分ａ又は中心部分ｂを拡大した写真である。また、ネガティブコントロールとしてβ－ＴＣＰ錠剤を移植していない皮膚組織から作製した薄切片のＨＥ染色画像を図６に示す。
　比較実験として、気孔率１８％β－ＴＣＰ錠剤に代えて、気孔率６０％のβ－ＴＣＰ錠剤、気孔率７５％のβ－ＴＣＰ錠剤、またはプラスチック片を移植片として用いたことのほかは、実施例３と同様の手順で移植、飼育及び薄切片の作製・染色を行い、光学顕微鏡で観察した。図７は気孔率６０％のβ－ＴＣＰ錠剤、図８は気孔率７５％のβ－ＴＣＰ錠剤、図９はプラスチック片を移植した結果を示している。また、各移植片を移植した皮膚組織を撮影したＨＥ染色画像内において、移植片に誘導されたリンパ球とマクロファージの数を比較した。その結果を図１０に示す。
（結果）
　図３～図５から、気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤を移植した場合、錠剤の周囲全体にリンパ球が多く分布し、特に錠剤の縁部分にリンパ球が高密度で局在するリンパ節様組織が形成されていることが確認された。具体的には、図１０からわかるように、気孔率１８％β－ＴＣＰ錠剤の移植部位には、比較実験で用いた他の移植片の約１２０～６５０倍の数のリンパ球が存在する一方、マクロファージはほとんど存在しなかった。気孔率６０％及び７５％のβ－ＴＣＰ多孔体を移植した場合では、移植部位の縁部分を中心に骨芽細胞が確認されたが、リンパ球はほとんど確認されず、プラスチックを移植した場合、リンパ球が分散して確認されたが、その数は極めて少なかった。
　同様の分析を上記実施例１で調製された気孔率 ３，８，１８，４２，５０，６０，７５％のβ－ＴＣＰ錠剤についても実施した結果を図１１に示す。結論として、気孔率５０％以下では、リンパ球の誘導を認めたが、気孔率６０％及び７５％のβ－ＴＣＰ錠剤では、いずれのリンパ球の誘導もほとんど確認されなかった。
　以上の結果から、気孔率５０％以下のβ－ＴＣＰ錠剤は、リンパ球を効果的に誘導し、誘導されたリンパ球によって免疫機能が活性化される免疫誘導作用を有することが確認された。
（リンパ球の種類及び分布の検討）
　上記実施例１で調製されたβ－ＴＣＰ錠剤によって誘導されたリンパ球の種類及び分布を、免疫染色により調べた。気孔率１８％のβ－ＴＣＰ錠剤を、上記実施例２と同様の手順でマウスの皮下に移植し、移植後２週間マウスを飼育し、移植部位を採取し、薄切片を作製し、薄切片にＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＤＣ細胞にそれぞれ特異的な抗体を用いた免疫染色を施した。また、免疫誘導剤を移植したマウスから採取したリンパ節の薄切片にも、各細胞の免疫染色を施した。気孔率１８％のβ－ＴＣＰを移植した移植部位近傍と移植を行っていない上記マウスの脾臓のリンパ組織とを光学顕微鏡により観察した結果を図１２～図１９に示す。
　図１２及び図１３はそれぞれ、上記移植部位近傍及び脾臓リンパ組織においてＴ細胞を染色したものである。両者において同様に、縁部分よりも中心部分においてＴ細胞の密度が高くなっていることがわかる。
　図１４及び図１５はそれぞれ、上記移植部位近傍及び脾臓リンパ組織においてＢ細胞を染色したものである。両者において同様に、縁部分にＢ細胞が密集している（図１４及び図１５の矢印参照）ことがわかる。
　図１６及び図１７はそれぞれ、上記移植部位近傍及び脾臓リンパ組織においてＮＫ細胞を染色したものである。矢印で示されている細胞がＮＫ細胞である。両者において同様に、少数のＮＫ細胞が分散して確認された。
　図１８及び図１９はそれぞれ、上記移植部位近傍及び脾臓リンパ組織において樹状細胞を染色したものである。矢印で示されている細胞がＤＣ細胞である。両者において同様に、少数のＤＣ細胞が分散して確認された。
　以上の免疫染色の観察結果から、上記実施例１で作製されたβ－ＴＣＰ錠剤は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等の各種類のリンパ球を誘導し、さらに樹状細胞をも誘導することが確認され、体内に移植後に正常のリンパ節と同様の分布及び密度を有し、正常のリンパ節と同様の細胞集塊構造を構築することが確認された。これらの結果は、本発明のβ－ＴＣＰを含む錠剤が、天然のリンパ節と同様のリンパ節様組織を誘導して免疫機能を発揮することができる、優れた免疫誘導剤であることを示唆するものである。
（β－ＴＣＰ粒子又は顆粒の調製）
　前記実施例１にて得られたβ－ＴＣＰ仮焼粉末をふるいにかけ、ふるい目が１０５μｍのふるいを通過し、更にふるい目が７５μｍのふるいにかけ残ったβ－ＴＣＰの粒径を７５μｍ以上１０５μｍ未満（Ａ）とし、ふるい目が７５μｍのふるいを通過し、さらにふるい目が２５μｍのふるいにかけ残ったβ－ＴＣＰの粒径を２５μｍ以上７５μｍ未満（Ｂ）とし、２５μｍのふるいを通過したβ－ＴＣＰの粒径を０．０５μｍ以上２５μｍ未満（Ｃ）として、３つの分画（Ａ）～（Ｃ）を得た。
（β－ＴＣＰ粒子又は顆粒の気孔率）
　上記（Ａ）～（Ｃ）の３種類の分画について、気孔率を乾式自動密度計（アキュピック１３３０、株式会社島津製作所製）で計測したところ（Ａ）分画は、気孔率：６０～７０％、（Ｂ）分画は、気孔率：４０～５０％、（Ｃ）分画は、気孔率：０～３０％であることが確認された。
（β－ＴＣＰ粒子又は顆粒の免疫細胞誘導効果の検討）
　上記で選別した（Ａ）～（Ｃ）分画を各々等量で混合し、さらに、２００ｇ／ｍｌの割合でＰＢＳに懸濁させた。その後、皮内に注射して移植し、ＨＥ染色を行い、光学顕微鏡により薄切片を観察した。その観察結果の写真を図２０に示す。また、図２１にβ－ＴＣＰ粉体の粒径と細胞誘導との関係を示す。
　図２０において、Ａは気孔率６０～７０％、Ｂは気孔率４０～５０％、Ｃは気孔率０～３０％のβ－ＴＣＰの粉体をそれぞれ示している。Ａの周囲にはマクロファージが多く分布することが確認された。これに対し、Ｂの周囲にはリンパ球の分布が確認され、Ｃの周囲には非常に高密度にリンパ球が局在することが確認された。このように、特にＣにおいては、より効果的にリンパ球を誘導することが明らかとなった。図２２には、（Ｃ）分画の下限である粒径０．０５μｍの粒子について、そのＳＥＭ像を示した。また、図２３には、（Ｃ）分画の粉体の粒度分布を示した。
（β－ＴＣＰ錠剤による抗腫瘍効果）
　気孔率が０．１～１２％の円板状のβ－ＴＣＰ錠剤（直径５ｍｍ、高さ２ｍｍ）を用いてマウスにおける抗腫瘍効果について調べた。対照として、同サイズの、免疫原性をもつ可能性のある異種タンパク質を含まないプラスチックキャリアマテリアルを用いた。
（方法）
　６週齢の雄性ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）皮内に２．５×１０６個のヒト大腸癌細胞COLO 205（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、５～７日後、マウスに形成された腫瘍サイズを計測して腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出は以下の数式によった。
　　　腫瘍体積＝（長径×短径２）／２（ｍｍ３）
（結果）
　β－ＴＣＰ錠剤と対照としてのプラスチックキャリアマテリアルを、形成腫瘍から１５～２０ｍｍ離れた部位の皮下にそれぞれ移植した。約１ヶ月後に腫瘍サイズを計測し、腫瘍の増殖に対するβ－ＴＣＰの作用を観察した。その結果、対照の腫瘍体積は１４００ｍｍ３であったのに対し、β－ＴＣＰ錠剤投与群では腫瘍体積は１２００ｍｍ３に減少していた。
１ 免疫誘導剤
２ β－ＴＣＰ

Claims (7)

  1. 気孔率が５０％以下であるβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）を含む免疫誘導剤。
  2. 生体内への移植用又は注入用であることを特徴とする請求項１記載の免疫誘導剤。
  3. 近傍にリンパ球及び樹状細胞を誘導することを特徴とする請求項１又は２記載の免疫誘導剤。
  4. リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞から選ばれる１又は２以上であることを特徴とする請求項１～３いずれか記載の免疫誘導剤。
  5. 剤型が、粒径０．０５以上２５μｍ未満の粒子又は顆粒であることを特徴とする請求項１～４いずれか記載の免疫誘導剤。
  6. 剤型が、錠剤又は柱状体であることを特徴とする請求項１～４いずれか記載の免疫誘導剤。
  7. 請求項１～６いずれか記載の免疫誘導剤により形成されたリンパ節様組織。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2796141A1 (en) * 2011-12-22 2014-10-29 Olympus Corporation Cancer cell-inhibiting ceramics and method for producing cancer cell-inhibiting ceramics, method for treating bone neoplasm, and use of b tricalcium phosphate porous granules having grain size of 1 to 10 mm

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH041122A (ja) * 1990-04-16 1992-01-06 Olympus Optical Co Ltd 薬物徐放材
JPH05237178A (ja) * 1991-04-08 1993-09-17 Olympus Optical Co Ltd 骨補填材及びその製造方法
JP2010126434A (ja) * 2008-11-25 2010-06-10 Olympus Corp 癌細胞抑制剤および癌細胞抑制シート

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19940717A1 (de) * 1999-08-26 2001-03-01 Gerontocare Gmbh Resorblerbares Knochenersatz- und Knochenaufbaumaterial
JP4801316B2 (ja) * 2003-03-24 2011-10-26 太平化学産業株式会社 リン酸カルシウム多孔体の製法
US7901650B2 (en) * 2005-06-22 2011-03-08 Skeletal Kinectics, LLC Porous beta-tricalcium phosphate and methods for producing the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH041122A (ja) * 1990-04-16 1992-01-06 Olympus Optical Co Ltd 薬物徐放材
JPH05237178A (ja) * 1991-04-08 1993-09-17 Olympus Optical Co Ltd 骨補填材及びその製造方法
JP2010126434A (ja) * 2008-11-25 2010-06-10 Olympus Corp 癌細胞抑制剤および癌細胞抑制シート

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