WO2011162558A2 - 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)의 유전자를 함유하는 자궁경부암세포의 증식 억제용 재조합벡터 및 자궁경부암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)의 유전자를 함유하는 자궁경부암세포의 증식 억제용 재조합벡터 및 자궁경부암 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2011162558A2
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adcyap1
cervical cancer
adenylate cyclase
activating polypeptide
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안성환
문영호
오태정
이승훈
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a treatment for cervical cancer using a recombinant vector containing a gene encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1 ) or a fragment thereof. More specifically, a gene or fragment thereof encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland), in which the promoter region is specifically methylated in cervical cancer cells, where the expression of the gene is significantly reduced.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for cervical cancer that inhibits proliferation of cervical cancer cells by introducing a recombinant vector into cervical cancer cells.
  • oncogenes In normal cells, oncogenes, tumor suppressor genes, and apoptosis regulating genes are complementarily regulated to maintain harmonious growth, but the cells proliferate abnormally due to various causes. It is known that cancer occurs by growth, and its root cause is caused by abnormality of genes in cells. These genetic abnormalities are largely genetic and epigenetic.
  • CpG islands are multiple sites including the coding sequence upstream of the regulatory region, including the promoter region of a particular gene, the coding region (eg exon region), downstream of the coding region (eg, enhancer region and intron).
  • DNA methylation one of epigenetic variations, occurs mainly in the cytosine of CpG islands at the promoter region of a particular gene, and methylation of CpG islands in promoters that regulate gene expression inhibits expression of the gene of interest.
  • the cancer suppression gene, DNA repair gene (DNA repair gene), cell cycle control gene, etc. are hyper-methylated (hyper-methylation) in several cancers, it was confirmed that the expression of these genes are blocked. Has been shown to induce gene expression due to hypo-methylation.
  • a gene therapy method using a gene or a protein thereof for cancer treatment using a tumor suppressor containing p43 protein as an active ingredient, including a specific base sequence that induces cytokines to increase an immune response and inhibit blood vessel formation.
  • Method Korean Patent Publication No. 2001-0112108
  • an anticancer agent containing mycolactone a substance that kills cancer cells
  • an antisense Rb nucleotide and an anticancer agent containing mycolactone and the antisense Rb nucleotide that lower the expression of retinoblastoma protein Korean Patent Publication No. 2002-0040521).
  • an anticancer composition comprising a recombinant vector expressing an importin ⁇ gene and a recombinant p53 gene
  • prostate cancer used for treating and diagnosing prostate cancer -Specific proteins or compositions comprising genes encoding them (US Pat. No. 6,329,505) and the like.
  • genes or their proteins are often used to treat cancer, and research on this is ongoing.
  • research is underway to find genes that are deficient in cancer patients, genes that cause cancer, and genes that have anticancer effects.
  • new cancer suppressor genes that can be applied to gene therapy of cancer more effectively. The need for a very urgent situation.
  • the present inventors have applied for a patent application that revealed that gene expression is inhibited in cancer tissue cells by DNA methylation at the CpG island of the gene promoter region (Korean Patent Publication No. 10-2007-0109811).
  • the present inventors have made efforts to develop a therapeutic drug for cervical cancer using a gene, and as a result, a promoter of a gene coeld of adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADCYAP1 ) in cervical cancer cell lines, tissues and cytoplasms
  • a promoter of a gene coeld of adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADCYAP1 ) in cervical cancer cell lines, tissues and cytoplasms When the site is specifically methylated to confirm that the expression of the gene is inhibited and a recombinant vector containing a gene encoding the adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADCYAP1 ) is introduced into cervical cancer cells
  • the present invention has been completed by confirming that it has an effect of suppressing proliferation of cervical cancer cells.
  • the main object of the present invention is to provide a recombinant vector for inhibiting the proliferation of cervical cancer cells containing a gene encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADCYAP1 ), which is introduced into the cervical cancer cells It is to provide a pharmaceutical composition that can effectively treat cervical cancer by inhibiting the proliferation of cervical cancer cells.
  • the present invention is a cervical cancer cell containing a gene or fragment thereof encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1, ADCYAP1 ) Provide a vector for suppression of growth.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cervical cancer containing the recombinant vector or ADCYAP1 protein or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a gene therapy agent for cervical cancer, characterized in that the gene encoding the adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADPIAAP1 ) or a fragment thereof is introduced into a transporter for delivery in the body. .
  • the present invention also provides a method for screening anticancer substances for treating cervical cancer, wherein the promoter region is characterized by selecting a candidate substance for dimethylating the ADCYAP1 gene methylated as an anticancer substance.
  • Figure 1 shows the process of finding the ADCYAP1 gene down-regulated by methylation in cervical cancer through methylation measurement using gene expression experiments, insilico analysis and pyro sequencing methods in cervical cancer tissues and cell lines.
  • Figure 2 shows the degree of gene expression in cervical tissue (A) of the ADCYAP1 gene and the increase in expression after DAC treatment in cervical cancer cell lines (B).
  • Figure 3 measures the degree of methylation of the ADCYAP1 gene in cervical cancer cell line (A) and cervical cancer tissue (B).
  • Figure 4 is a measure of the degree of methylation of the ADCYAP1 gene in normal and cervical cancer cytology (A) and the sensitivity and specificity for the diagnosis of cervical cancer of the ADCYAP1 gene was measured by ROC curve analysis (B).
  • Figure 5 is a measure of the effect of the ADCYAP1 gene on cell proliferation in cervical cancer cell line (A: microscopic observation of the proliferation of HeLa cervical cancer cell line incorporating the p ADCYAP1 recombinant vector; B: killed using ELISA Measured cell mass).
  • Figure 6 shows the results of the peptide fragment constituting the ADCYAP1 protein treated with a uterine cancer cell line, and confirmed by the WST assay experiment (A) and the results confirmed by the optical microscope (B).
  • the present invention provides a suppression of proliferation of cervical cancer cells containing a gene encoding the adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1, ADCYAP1 ) or a fragment thereof. It relates to a recombinant vector for.
  • the ADCYAP1 protein of the present invention may be represented by SEQ ID NO: 2 (GenBank NP — 001093203), and in the recombinant vector, the adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADCYAP1 ) gene is SEQ ID NO 1 derived from human. It may be characterized by the cDNA described as.
  • adenylate cyclase activating polypeptide 1 epitary gland
  • ADPDAP1 adenylate cyclase activating polypeptide 1
  • the recombinant vectors or their proteins may be used for the treatment of cervical cancer. Check if available.
  • the fragment of the gene encoding ADCYAP1 preferably has 30 to 527 bases in the nucleotide sequence of the gene encoding ADCYAP1 .
  • microarray hybridization was performed to confirm expression of ADCYAP1 gene in cervical cancer.
  • the degree of ADCYAP1 gene expression in total RNA isolated from normal and near tumor tissues of cervical cancer patients was measured by an indirect comparison method.
  • the dimethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC)
  • DAC 5-aza-2'-deoxycytidine
  • the ADCYAP1 gene represented by SEQ ID NO: 1 in which the promoter region of the gene is not methylated in the cervical cancer cells is expressed, thus proliferating cervical cancer cells. Confirmed to be inhibited.
  • cervical cancer cells are treated with a dimethylating agent to cause dimethylation, thereby expressing the ADCYAP1 gene represented by SEQ ID NO: 1, in which the promoter region of the gene is not methylated, or a gene having sequence similarity thereto. Proliferation of cells can be inhibited.
  • Dimethylating agent having this effect can be used as an anticancer substance that inhibits the proliferation of cervical cancer cells, and treated with several anticancer candidates to the ADCYAP1 gene in which the promoter region of the gene is methylated, and confirms the degree of dimethylation.
  • a substance that causes dimethylation can be selected as an anticancer substance for the treatment of cervical cancer.
  • the ADCYAP1 gene in order to transfer the ADCYAP1 gene into cervical cancer cells, the ADCYAP1 gene was inserted into the pcDNA TM 3 vector (Invitrogen) to prepare an ADCYAP1 gene expression vector (p ADCYAP1 ) capable of expressing the ADCYAP1 gene. If the introduction of ADCYAP1 gene expression vector (p ADCYAP1) in cervical cancer cells to determine whether the proliferation of cervical cancer cells, the expression vector p ADCYAP1 0.1 ⁇ 2 ⁇ g / 10 5 cells and liposomes 1 ⁇ 20 ⁇ g / 10 5 cells Cultured by introducing into cervical cancer cells. As a result, the ADCYAP1 gene is expressed at a high efficiency with the introduction of ADCYAP1 gene expression vector (p ADCYAP1) the proliferation of cervical cancer cells was confirmed suppressed.
  • ADCYAP1 gene can be isolated from human tissue or synthesized according to known DNA synthesis methods.
  • the ADCYAP1 gene (GenBank NM_001099733, SEQ ID NO: 1) was used in the cDNA base sequence derived from 531 bp Homosapiens .
  • the ADCYAP1 protein represented by SEQ ID NO: 2 may be used, but not limited thereto, and the protein is expressed by culturing a microorganism transformed with a recombinant vector containing a gene encoding the ADCYAP1 protein. It can collect and manufacture by a conventional method.
  • the pcDNA3 vector was used as an expression vector to introduce the ADCYAP1 gene into cervical cancer cells, but various expression vectors may be used according to expression purposes without being limited thereto, and the gene inserted into the foreign gene insertion site of the expression vector.
  • the size, nucleotide sequence and the like can also be variously changed by known techniques.
  • the produced recombinant vector can be introduced into cervical cancer cells by conventional methods.
  • the method of introducing the recombinant vector of the present invention into a cell includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and may be performed by selecting a suitable technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate precipitation, calcium chloride precipitation, retroviral infection, microinjection method, PEG, cationic liposome method, lithium acetate-DMSO method, etc. are mentioned.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cervical cancer, comprising a recombinant vector or ADCYAP1 protein or fragment thereof containing the gene encoding ADCYAP1 as an active ingredient.
  • the fragment of the ADCYAP1 protein preferably has an amino acid sequence of 10 to 175 of the amino acid sequence of the ADCYAP1 protein.
  • a peptide fragment of ADCYAP1 protein having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 is administered to a Hela cell line, a uterine cancer cell line, the peptide fragment of the ADCYAP1 protein Inhibition of apoptosis and cell growth of uterine cancer cells was confirmed.
  • composition of the present invention can be formulated or used in combination with drugs such as antihistamines, anti-inflammatory drugs, anticancer agents and antibiotics that are already in use.
  • drugs such as antihistamines, anti-inflammatory drugs, anticancer agents and antibiotics that are already in use.
  • compositions of the present invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds, as well as in any suitable collection.
  • compositions according to the invention can be used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., respectively, according to conventional methods.
  • sterile injectable solutions such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., respectively, according to conventional methods.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the extract. Or lactose, gelatin, or the like is mixed.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, cap group 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the extract of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably at 0.001 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
  • compositions of the present invention or pharmaceutically acceptable salts thereof can be used as the main ingredient or additives and auxiliaries of foods in the manufacture of various functional foods and dietary supplements.
  • the present invention provides that a gene encoding an adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1 ) is introduced into a transporter for delivery in the body.
  • the present invention relates to a gene therapy agent for cervical cancer.
  • Gene therapy means a therapeutic agent that is used in gene therapy to treat a disease by gene transfer and expression, which means the accurate delivery of the gene to the disease site, complete degradation in vivo, absence of toxic and immunogenic antigens, and genetic factors. Has long-term stable expression.
  • a viral vector-based transfer method as a technique for delivering a gene of interest, a viral vector-based transfer method, a non-viral delivery method using synthetic phospholipids or synthetic cationic polymers, etc. and physical methods such as electroporation, which introduces genes by applying temporary electrical stimulation to cell membranes, and the method of using a viral transporter in the above-described delivery technique is a part or all of which have a gene replaced with a therapeutic gene. It is the preferred method for gene therapy because it can efficiently transfer genes as a vector lacking the ability to replicate.
  • viruses used as viral transporters or viral vectors include RNA viral vectors (retroviral vectors, lentivirus vectors, etc.) and DNA viral vectors (adenovirus vectors, adeno-associated viral vectors, etc.).
  • RNA viral vectors retroviral vectors, lentivirus vectors, etc.
  • DNA viral vectors adenovirus vectors, adeno-associated viral vectors, etc.
  • herpes simplex viral vector alpha viral vector and the like.
  • a virus transporter used in a technique for delivering a gene of interest may be used.
  • the sample containing the ADCYAP1 gene methylated promoter region can be prepared using cervical cancer cell lines, tissues and cytoplasm, and the step of treating the sample with an anticancer candidate substance is a conventional anticancer candidate It means contacting a substance with a sample.
  • the candidate material for dimethylating the ADCYAP1 gene methylated by the promoter region is not only 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC), but also trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor. ), Trapoxin, oxamflatin, N-hydroxy-N'-phenyloctanediamide (SAHA), m-Carboxycinnamic acid bis-Hydroxamide (CBHA), butyric acid, phenylbutyric acid, HC toxin , Depsipeptide, N-acetyldinaline, MS-275 and the like can be exemplified.
  • DAC 5-aza-2'-deoxycytidine
  • trichostatin A a histone deacetylase inhibitor.
  • Trapoxin oxamflatin
  • SAHA N-hydroxy-N'-phenyloctanediamide
  • CBHA m-Carboxycinnamic acid bis-Hyd
  • the step of selecting a candidate substance for dimethylating the ADCYAP1 gene methylated by the promoter region as an anticancer substance can be confirmed by comparing the sequence list of the ADCYAP1 gene before and after treatment with the anticancer candidate substance.
  • indirect comparison evaluates the level of nucleic acid isolated from the first source and the same allele level in the nucleic acid isolated from the second source using a reference probe hybridized to the nucleic acid isolated from the first source and the second source, respectively. And comparing the results to determine the relative amount of nucleic acid present in the sample without competing direct binding to the reference probe. As a result, it was confirmed that the expression of the gene was down-regulated in the tumor tissue, and the ADCYAP1 gene was also down-regulated.
  • vector is meant a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with the plasmid vector. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene and a restriction enzyme cleavage site (c) allows foreign DNA fragments to be inserted. Although no suitable restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods can facilitate ligation of the vector and foreign DNA.
  • transformation refers to the introduction of DNA into a host cell so that the DNA can be reproduced as a factor of a chromosome or by completion of chromosome integration. It means a phenomenon.
  • transformation methods include electroporaton, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, lithium acetate-DMSO method, and the transformed recombinant microorganism is DNA.
  • Host cells having high transduction efficiency and high expression efficiency of introduced DNA are commonly used.
  • all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells, bacteria, yeasts, molds and the like can be used.
  • pcDNA3 vector was used as an expression vector, and there is no specific example using a viral vector such as adeno-associated virus (AAV) as an expression vector.
  • AAV adeno-associated virus
  • ADCYAP1 a recombinant vector containing a gene encoding the adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADCYAP1 ) was introduced to only inhibit the proliferation of cervical cancer cells by overexpression of the ADCYAP1 gene. It will also be apparent to those skilled in the art that the dimethylated ADCYAP1 gene may be treated with a dimethylating agent to inhibit the proliferation of cervical cancer cells by reactivating the genes whose expression was suppressed.
  • Example 1 Determination of the expression of genes encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) in cervical cancer tissues and cervical cancer cell lines
  • Microarray hybridization was performed to confirm the expression of the gene encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADCYAP1 ) in cervical cancer tissue or cervical cancer cells. Microarray hybridization was performed using standard protocols (Schena et al ., Science , 270: 467,1995).
  • standard comparative RNAs indirect comparisons
  • RNA was isolated from Molt-4 (KCLB 21582) and brain cancer cell line U-87MG (KCLB 30014) using Tri Reagent (Sigma, USA).
  • total RNA isolated from the 11 cell lines was mixed in equal amounts and used as an internal control.
  • RNAs isolated from normal tissues and tumor tissues were indirectly compared to standard comparison RNAs.
  • 100 ⁇ g total RNA was labeled with Cy3-dUTP or Cy5-dUTP
  • the standard comparative RNA was labeled with Cy3
  • RNA isolated from stomach tissue was labeled with Cy5.
  • the two cDNAs labeled Cy3- and Cy5- were purified using a PCR purification kit (Qiagen, Germany).
  • the purified cDNA was mixed and concentrated to a final volume of 27 ⁇ l using Microcon YM-30 (Millipore Co., USA).
  • hybridization reaction solution (27 ⁇ l of labeled cDNA target, 20 ⁇ l of 20X SSC, 8 ⁇ l of 1% SDS, 24 ⁇ l of formamide (Sigma, USA) and 20 ⁇ g of human Cot1 DNA (Invitrogen, USA)) at 100 ° C. Heated at 2 min and immediately hybridized to a human 35K oligonucleotide (GenomicTree, Inc., Korea) microarray at 42 ° C., 12-16 hours in HybChamber X (GenomicTree, Inc., Korea), humidity-controlled. The hybridized microarray slides were read using Axon 4000B (Axon Instrument Inc., USA).
  • a dimethylating agent is used in cervical cancer cell lines C33A (ATCC HTB-31), SiHa (KCLB 30035), HeLa (KCLB 10002) and Caski (KCLB 21550). 200 nM of 5-aza-2′-deoxycytidine (DAC, Sigma, USA) was treated for 3 days. The total RNA was isolated by treating the DAC-treated and untreated cell lines with Tri reagent.
  • the level of transcription between the untreated and treated cell lines was compared directly.
  • the cervical cancer cell lines were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration in RPMI culture medium (GIBCO / BRL, Grand Island, NY) containing 10% FBS, 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin, respectively.
  • RPMI culture medium GEBCO / BRL, Grand Island, NY
  • FBS 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • MethPrimer http://itsa.ucsf.edu/ ⁇ urolab/methprimer/index1.html was used. 14 of the 34 genes did not have CpG islands and the 14 genes were excluded from the list of common genes (FIG. 1).
  • Example 2 Determination of methylation of genes encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary) in cervical cancer cell lines
  • the degree of methylation was measured in the cervical cancer cell line.
  • cervical cancer cell lines C33A (ATCC HTB-31), SiHa (KCLB 30035), HeLa (KCLB 10002), and Caski (KCLB 21550) were used to transform unmethylated cytosine into uracil using bisulfite treatment.
  • the whole gDNA was purified, and 200 g of the gDNA was treated with bisulfite using EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA), and then eluted with 20 ⁇ l of sterile distilled water to be used for pyro sequencing.
  • PCR and sequencing primers for pyro sequencing of the ADCYAP1 gene were performed using the PSQ assay design program (Biotage, USA). PCR and sequencing primers for methylation measurement of ADCYAP1 gene are shown in Table 1 below.
  • the base sequence after the bisulfite treatment amplified with the primers described in Table 1 and the sequencing primer and the analysis base sequence for the methylation measurement are shown in SEQ ID NO: 6 below.
  • the underlined nucleotide sequence is the nucleotide sequence analyzed for methylation measurement of the CpG island region, and the site marked "y (C or T)" represents the cytosine of the CpG island region.
  • PCR reaction solution (20ng of bisulfite-converted DNA, 5 ⁇ l 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units (Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4 ⁇ l (Solgent, Korea), PCR primer 2 ⁇ l of 10pmole / ⁇ l) was treated at 95 ° C for 5 minutes, and then reacted 45 times at 95 ° C for 40 seconds, 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 40 seconds, and then at 72 ° C for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.
  • the amplified PCR product was subjected to pyro sequencing with a PSQ96MA system (Biotage, USA) using PyroGold reagent (Biotage, USA). After pyrosequencing, the degree of methylation was determined by calculating the methylation index. The methylation index was calculated by calculating the average rate of cytosine binding at each CpG island site. In the case of the ADCYAP1 gene, the degree of methylation of the four CpG island sites was measured.
  • the promoter region of the ADCYAP1 gene was not methylated in C33A (ATCC HTB-31) (less than 10%) and 50% or more in SiHa (KCLB 30035), HeLa (KCLB 10002) and Caski (KCLB 21550) cell lines. It was confirmed that it was hypermethylated (FIG. 3A).
  • Example 3 Determination of methylation of genes encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary) in cervical cancer tissues
  • ADCYAP1 gene in cervical cancer tissues was due to methylation
  • the degree of methylation was quantitatively analyzed by pyro sequencing.
  • Surgical tissues (Gynecology, Chungnam National University Hospital) and cancer patients were obtained from cervical normal tissues (Chungnam University Hospital, Obstetrics and Gynecology), and the methylation of ADCYAP1 gene in tumor tissues and normal tissues was measured.
  • Genomic DNA was isolated from tumor tissue and normal tissue using QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, USA), and then bisulfite using EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA) on 200 ng of the isolated gDNA. Was treated.
  • the bisulfite-treated DNA was eluted with 20 ⁇ l of sterile distilled water and used for pyrosequencing.
  • PCR reaction solution (20ng of DNA converted to bisulfite, 5 ⁇ l of 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units (Enzynomics, Korea), 4 ⁇ l of 2.5mM dNTP (Solgent, Korea), 2 ⁇ l of PCR primer / ⁇ l) was treated at 95 ° C for 5 minutes, and then reacted 45 times at 95 ° C for 40 seconds, at 60 ° C for 45 seconds, and at 72 ° C for 40 seconds, followed by PCR at 72 ° C for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.
  • the amplified PCR product was subjected to pyro sequencing using a PyroGold reagent (Biotage, USA) using a PSQ96MA system (Biotage, USA). After pyro sequencing, the degree of methylation was determined by methylation index. The methylation index was calculated by calculating the average rate of cytosine binding at each CpG island site.
  • the methylation degree of ADCYAP1 gene was shown to be very low level (less than 20%) in normal tissues, but it was confirmed that it is methylated at very high level (more than 20%) in most cancer tissues (FIG. 3B). These results indicate that the expression of the ADCYAP1 gene in cervical cancer tissues is due to methylation.
  • Example 4 Determination of methylation of genes encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) in cervical cancer cytoplasm
  • Cervical normal cytology (Gynecology, Chungnam National University Hospital) and cancer patients were obtained from the cervical cytology (Chungnam National University Hospital, Obstetrics and Gynecology), and the degree of methylation of ADCYAP1 gene in cervical cancer and normal cytology was measured.
  • Genomic DNA was isolated from cancer and normal using QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, USA), and then bisulfite was treated using EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA) on 200 ng of the isolated gDNA. It was. The bisulfite-treated DNA was eluted with 20 ⁇ l of sterile distilled water and used for pyrosequencing.
  • PCR reaction solution (20ng of DNA converted to bisulfite, 5 ⁇ l of 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units (Enzynomics, Korea), 4 ⁇ l of 2.5mM dNTP (Solgent, Korea), 2 ⁇ l of PCR primer / ⁇ l) was treated at 95 ° C for 5 minutes, and then reacted 45 times at 95 ° C for 40 seconds, at 60 ° C for 45 seconds, and at 72 ° C for 40 seconds, followed by PCR at 72 ° C for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.
  • the amplified PCR product was subjected to pyro sequencing using a PyroGold reagent (Biotage, USA) using a PSQ96MA system (Biotage, USA). After pyro sequencing, the degree of methylation was determined by methylation index. The methylation index was calculated by calculating the average rate of cytosine binding at each CpG site.
  • the degree of methylation of the ADCYAP1 gene was shown to be very low level (less than 10%) in the normal cytoplasm, but it was confirmed that the methylation at a high level of 10% or more in most cancer tissues (p ⁇ 0.0001, Figure 4A).
  • ROC curve analysis using MedCalc program (Belgium) to diagnose cervical cancer using methylation degree of ADCYAP1 gene showed very sensitive sensitivity of 85.7% and specificity of 95.2%. Excellent (FIG. 4B).
  • a 531 bp (SEQ ID NO: 1) cDNA clone containing the ADCYAP1 full-length gene was purchased from Invitrogen. PCR was performed to clone the 531 bp sequence to Hind III and Xho I sites of the pcDNA3 (Invitrogen, USA) expression vector. The primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 were used for PCR amplification. The ADCYAP1 gene was cloned into the Hind III and Xho I sites of the pcDNA3 expression vector to prepare an ADCYAP1 gene expression vector (p ADCYAP1 ).
  • Example 6 Determination of the gene encoding the adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) into cervical cancer cells and inhibition of cancer cell proliferation
  • TUNEL assay experiments were performed to determine the effect of apoptosis on cancer cells following overexpression of the gene encoding ADCYAP1 in uterine cancer cell lines.
  • the cervical cancer cell line HeLa (KCLB 10002) was inoculated in a 4 chamber at a concentration of 1.75 ⁇ 10 4 , 10% FBS (Sigma, USA), penicillin (100 units / ml, WelGENE, Korea) and streptomycin (100 units / ml, WelGENE, Korea) was added to DMEM medium (Gibco, USA) added to the incubator for 24 hours at 37 °C, CO 2 (5%) incubator (Forma Scientific Inc.).
  • the cultured uterine cancer cells were transfected with the ADCYAP1 gene expression vector (p ADCYAP1 ) prepared in Example 5 using Fugene HD transfection reagent (Roche Applied Science).
  • p ADCYAP1 gene expression vector
  • Fugene HD transfection reagent Fugene HD transfection reagent
  • pcDNA3 without the ADCYAP1 gene was transfected.
  • the cells were fixed using 4% PFA (paroformaldehyde), and then 50 ⁇ l of TUNEL assay mixture (Roche Applied Science) was added to each well in 37 ° C. and 5% CO 2 incubator. Further incubation for hours. After removing the reagents, the cells were observed under a fluorescence microscope to observe cell apoptosis.
  • the cell death time was significantly increased as the cell culture time was increased (FIG. 5A).
  • the cell growth curve after transfection it was confirmed that the growth is significantly reduced in the cell line into which the p ADCYAP1 expression vector was introduced (FIG. 5B). This means that the ADCYAP1 gene or a protein thereof can cause apoptosis of uterine cancer cells and can be used as a therapeutic agent for uterine cancer.
  • Example 7 Determination of cervical cancer cell proliferation inhibition by peptide fragment treatment of adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland)
  • the uterine cancer cell line HeLa (KCLB 10002) was cultured in 6-well plates at 5x10 4 cell concentration, and then ADCYAP1 (1-27) peptide fragments (GenScript, USA) and ADCYAP1 (1-D) dissolved in DW. 38) Peptide fragments (GenScript, USA) were treated for 18 hours at 1 nM and 100 nM concentrations.
  • ADCYAP1 (1-27): HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH 2 (C-terminal NH 2 modified; SEQ ID NO: 9); Peptide fragment having amino acid sequence from N-terminus to 27th amino acid of ADCYAP1 protein
  • ADCYAP1 (1-38): HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK-NH 2 (C-terminal NH 2 modified; SEQ ID NO: 10); Peptide fragment having amino acid sequence from N-terminus to 38th amino acid of ADCYAP1 protein
  • the cervical cancer cell line HeLa ADCYAP1 18 hours in (KCLB 10002) in the melt and incubated with 2.5x10 5 cells in 6-well plate at a concentration of distilled water (1-27) peptide fragment ADCYAP1 (1-38) peptide fragment in a concentration 100nM Treated during.
  • the growth state of cells not treated with ADCYAP1 peptide fragment and cells treated with ADCYAP1 peptide fragment under optical microscope was observed (FIG. 6B). As a result, it was confirmed that the growth of cervical cancer cells was significantly inhibited under the conditions treated with the ADCYAP1 (1-27) peptide fragment and the ADCYAP1 (1-38) peptide fragment.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cervical cancer by providing a recombinant vector containing a gene encoding adenylate cyclase activating polypeptide 1 (pituitary gland) ( ADPDAP1 ) or a fragment thereof to inhibit the proliferation of cervical cancer cells. It is effective to provide.

Abstract

본 발명은 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 이용한 자궁경부암 치료제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 이를 포함하는 약학조성물을 이용하면, 자궁경부암세포의 증식을 억제함으로써 자궁경부암을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.

Description

아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)의 유전자를 함유하는 자궁경부암세포의 증식 억제용 재조합벡터 및 자궁경부암 치료용 약학 조성물
본 발명은 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1)을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 함유하는 재조합벡터를 이용한 자궁경부암 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 자궁경부암세포에서 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되어 있어 유전자의 발현이 현저히 저하되어 있는 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 함유하는 재조합벡터를 자궁경부암세포에 도입함으로써 자궁경부암세포의 증식을 억제하는 자궁경부암 치료제에 관한 것이다.
정상적인 세포는 암 유전자(oncogene), 암 억제 유전자(tumor suppressor gene) 및 세포사멸 조절 유전자(apoptosis regulating gene)들이 상호 보완적으로 조절되어 조화롭게 생장유지되나, 여러 가지 원인에 의하여 세포가 비정상적으로 증식 및 생장을 거듭함으로써 암이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 이의 근본 원인은 세포 내 유전자들의 이상에 의해 유발된다. 이러한 유전적인 이상은 크게 유전적 변이와 후생유전학적 변이가 있다.
CpG 섬은 특정 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손 영역), 코딩 부위의 다운스트림(예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론)을 포함하는 여러 부위에서 발견된다. 후생유전학적 변이 중 하나인 DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위에서의 CpG 섬의 시토신(cytosine)에서 일어나며, 유전자 발현을 조절하는 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 대상 유전자의 발현을 억제시킨다. 특히, 여러 암에서 암 억제 유전자, DNA 회복 유전자(DNA repair gene), 세포 주기 조절 유전자 등이 하이퍼메틸화(hyper-methylation)되어 있어, 이들 유전자의 발현이 차단되어 있음이 확인되었으며, 암 유전자의 경우는 하이포메틸화(hypo-methylation)으로 인하여 유전자의 발현이 유도되는 것으로 밝혀졌다. 특히, 암 발생의 초기 단계에서 하이퍼메틸화(hyper-methylation) 및 하이포메틸화(hypo-methylation)가 발견된다. 따라서, 암세포에서 특정 유전자의 프로모터 부위에서의 CpG 섬의 메틸화는 유전자의 발현을 저해하거나 차단하여 궁극적으로 세포 내에서의 활성을 억제 내지 불활성화하기 때문에, 통상적으로 암세포에서 메틸화되어 있는 유전자는 암 억제 유전자일 가능성이 매우 높다고 볼 수 있다 (Baylin etal.,Adv.CancerRes.,72:141,1998;JonesandLaird,Nat.Genet.,21:163,1999).
인간의 사망 원인 중 가장 높은 비율을 차지하고 있는 암의 치료를 위하여 광범위한 연구가 진행되고 있으며, 현재까지 알려진 암 치료 방법으로는 수술, 방사선요법, 항암 화학요법, 면역요법 및 유전자 치료법 등이 있다. 이러한 항암 치료 연구 과정에서 암세포 및 암 조직 내의 세포에 선택적으로 암 치료를 위한 유전자를 도입발현시키는 새로운 치료방법에 대한 필요성이 대두되어 왔다.
최근 유전자 치료법은 새로운 표적 유전자의 발굴과 이를 효율적으로 표적세포에 도입하여 장기간 발현을 유도하고, 임상치료에 이용 시 유전자 전달 효율을 향상시키려는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다.
종래에는 유전자 또는 그 단백질을 암 치료에 사용하는 유전자 치료법으로, 사이토카인을 유도하여 면역 반응을 증가시키고, 혈관 생성을 억제하는 특정 염기서열을 포함하는 p43 단백질을 유효성분으로 함유하는 종양 억제제를 이용한 방법(대한민국 공개특허 제2001-0112108호), 암세포를 사멸시키는 물질인 마이코락톤을 함유하는 항암제, 레티노블라스토마 단백질의 발현을 저하시키는 안티센스 Rb 뉴클레오타이드 및 마이코락톤과 상기 안티센스 Rb 뉴클레오타이드를 함유하는 항암제(대한민국 공개특허 제2002-0040521호) 등에 대해 알려져 있었다. 또한, 임포틴 α유전자 및 재조합 p53 유전자를 발현하는 재조합벡터를 포함하는 항암 조성물을 이용하여 암을 억제하는 방법(대한민국 공개특허 제10-2005-0098800호) 및 전립선암 치료 및 진단에 사용되는 전립선-특이 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조성물(미국특허 제6,329,505호) 등에 대하여 알려져 있었다.
이외에도 유전자 또는 그 단백질을 암 치료에 사용하는 경우는 많으며, 이에 대한 연구가 지속으로 진행되고 있다. 현재 인체 게놈 프로젝트와 병행되어 암환자에 결핍된 유전자나 암 유발 유전자 및 항암 효과를 갖는 유전자 등을 찾기 위한 연구가 진행 중이며, 특히 더욱 효과적으로 암의 유전자 치료에 응용될 수 있는 신규 암 억제 유전자의 발굴에 대한 필요성이 매우 절실한 실정이다.
본 발명자들은 암 조직 세포에서 유전자 발현이 억제되는 원인이 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬에서의 DNA 메틸화에 의한 것임을 밝혀 특허 출원한 바 있다 (대한민국 공개특허 제10-2007-0109811호).
이에, 본 발명자들은 유전자를 이용한 자궁경부암 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 자궁경부암 세포주, 조직 및 세포진에서 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)을 코eld하는 유전자의 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되어 있어 유전자의 발현이 억제됨을 확인하고, 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 자궁경부암세포로 도입한 경우, 자궁경부암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)을 코딩하는 유전자를 함유하는 자궁경부암세포의 증식 억제용 재조합벡터를 제공하고, 이를 자궁경부암세포에 도입하여 자궁경부암세포의 증식을 억제시킴으로써 자궁경부암을 효과적으로 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1)을 코딩하는 유전자 또는 그단편을 함유하는자궁경부암세포의증식억제용재조합벡터를제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터 또는 ADCYAP1 단백질 또는 그 단편을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)을 코딩하는 유전자 또는 그 단편이 체내 전달용 수송체에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 유전자 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를디메틸화시키는후보물질을항암물질로선별하는것을특징으로하는자궁경부암치료용항암물질을스크리닝하는방법을제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부한 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 자궁경부암 조직 및 세포주에서 유전자 발현 실험, 인씰리코 분석 및 파이로시퀀싱 방법을 이용한 메틸화 측정을 통하여 자궁경부암에서 메틸화에 의해 발현이 하향조절되는 ADCYAP1 유전자를 찾는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 ADCYAP1 유전자의 자궁경부 조직에서의 유전자 발현 정도 (A)와 자궁경부암 세포주에 DAC 처리 후의 발현증가 (B)를 나타낸 것이다.
도 3은 자궁경부암 세포주 (A)와 자궁경부암 조직 (B)에서의 ADCYAP1 유전자의 메틸화 정도를 측정한 것이다.
도 4는 정상 및 자궁경부암 세포진에서의 ADCYAP1 유전자의 메틸화 정도를 측정한 결과 (A)와 ADCYAP1 유전자의 자궁경부암 진단에 대한 민감도 및 특이도를 ROC 커브 분석 (B)을 통하여 측정한 것이다.
도 5는 자궁경부암세포주에서 ADCYAP1 유전자가 세포 증식에 미치는 영향을 측정한 것이다 (A: pADCYAP1재조합벡터가 도입된 HeLa 자궁경부암세포주의 증식 여부를 현미경으로 관찰한 것; B: ELISA를 이용하여 사멸된 세포량을 측정한 것).
도 6은 ADCYAP1 단백질을 구성하고 있는 펩타이드 단편을 자궁암 세포주에 처리한 후, WST assay 실험으로 확인한 결과(A) 및 광학현미경으로 확인한 결과(B)를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1)을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 함유하는 자궁경부암세포의 증식 억제용 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 상기 ADCYAP1 단백질은서열번호 2(GenBank NP_001093203)로 표시될 수 있으며, 상기 재조합 벡터에 있어서, 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)유전자는 인간 유래의 서열번호 1로 기재되는 cDNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 자궁경부암세포에서 유전자 발현을 조절하는 프로모터가 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자들 중에서 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)을 코딩하는 유전자의 과메틸화와 그 유전자의 발현량의 관계를 확인하고, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터를 제조하고 이를 자궁경부암세포로 도입하여 자궁경부암세포의 증식을 억제할 수 있는지를 확인함으로써, 상기 재조합벡터 또는 그 단백질을 자궁경부암 치료에 이용할 수 있는지 확인하였다.
본 발명에서 ADCYAP1 을 코딩하는 유전자의 단편은 ADCYAP1 을 코딩하는 유전자의 염기서열 중 30~527개의 염기를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 자궁경부암에서 ADCYAP1 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 수행하였다. 즉, 자궁경부암 환자의 종양 부근 정상 조직과 종양 조직으로부터 각각 분리한 전체 RNA에서의 ADCYAP1 유전자 발현 정도를 간접 비교 방법으로 측정하였다. 또한, 유전자의 발현이 프로모터의 메틸화에 의해 조절되는지 확인하기 위하여 디메틸화제인 5-아자-2'-데옥시사이티딘(5-aza-2'-deoxycytidine:DAC)를 처리한 결과, DAC를 처리한 경우에 유전자의 발현이 증가되었는바, 이는 유전자 발현이 억제된 것이 프로모터의 메틸화에 의한 것임을 확인하였다.
본 발명에서는 ADCYAP1 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 자궁경부암세포에 도입함으로써, 자궁경부암세포 내에서 유전자의 프로모터 부위가 메틸화되어 있지 않은 서열번호 1로 표시되는 ADCYAP1 유전자가 발현되고 따라서 자궁경부암세포의 증식이 억제됨을 확인하였다. 또한, 본 발명에 있어서, 자궁경부암세포에 디메틸화제를 처리하여 디메틸화가 일어나서, 유전자의 프로모터 부위가 메틸화되어 있지 않은 서열번호 1로 표시되는 ADCYAP1 유전자 또는 그와 서열 유사성을 가지는 유전자가 발현됨으로써 자궁경부암세포의 증식이 억제될 수 있다. 이러한 효과를 갖는 디메틸화제는 자궁경부암세포의 증식을 억제하는 항암 물질로 활용될 수 있으며, 여러 항암 후보물질들을 유전자의 프로모터 부위가 메틸화되어 있는 ADCYAP1 유전자에 처리하여 디메틸화가 일어나는 정도를 확인하고, 그 중에서 디메틸화를 잘 일으키는 물질을 자궁경부암 치료를 위한 항암물질로 선정할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 ADCYAP1 유전자의 프로모터가 자궁경부암세포주에서 메틸화되었는지 여부를 파이로시퀀싱으로 확인하였다. 그 결과, ADCYAP1유전자의 프로모터가 자궁경부암세포에서 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 ADCYAP1 유전자를자궁경부암세포로전달하기위하여, ADCYAP1유전자를 pcDNA™3벡터 (Invitrogen)에 삽입하여 ADCYAP1 유전자를발현시킬수있는ADCYAP1 유전자발현벡터(pADCYAP1)를 제작하였고, ADCYAP1유전자 발현 벡터(pADCYAP1)를 자궁경부암세포에 도입한 경우 자궁경부암세포 증식 여부를 확인하기 위하여, 상기 pADCYAP1발현 벡터 0.1~2㎍/105cells과 리포좀 1~20㎍/105cells을 자궁경부암세포에 도입하여 배양하였다. 그 결과, ADCYAP1유전자 발현 벡터(pADCYAP1)의 도입으로 ADCYAP1 유전자가고효율로발현되어자궁경부암세포의증식이억제됨을확인하였다.
본 발명에 있어서, ADCYAP1유전자는 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 본 발명에서는 531bp의 호모 사피엔스(Homosapiens)유래의 cDNA 염기서열 중 ADCYAP1 유전자 (GenBank NM_001099733, 서열번호 1)를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 ADCYAP1 단백질을사용할수있으나이에한정되는것은아니며, ADCYAP1단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 단백질을 발현시킨 다음, 통상의 방법으로 회수하여 제조할 수 있다.
본 발명에서는, ADCYAP1유전자를 자궁경부암세포로 도입하기 위하여 발현벡터로 pcDNA3 벡터를 사용하였으나, 이에 제한되지 않고 발현 목적에 따라 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있으며, 발현 벡터의 외래 유전자 삽입 부위에 삽입되는 유전자의 크기, 염기서열 등도 공지의 기술에 의해 다양하게 변화시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 제작된 재조합벡터는 통상적인 방법으로 자궁경부암세포에 도입될 수 있다. 세포 내로 본 발명의 재조합벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당분야에서 공지된 바와 같이 적합한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션, 인산 칼슘 침전, 염화칼슘 침전, 레트로바이러스 감염, 미세주입법, PEG, 양이온 리포좀법, 초산 리튬-DMSO법 등이 있다.
발명은 또 다른 관점에서, ADCYAP1을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 함유하는 재조합 벡터 또는 ADCYAP1 단백질 또는 그 단편을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 ADCYAP1 단백질의 단편은 ADCYAP1 단백질의 아미노산 서열 중 10~175개의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 ADCYAP1 단백질 단편의 일예로, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열을 가지는 ADCYAP1 단백질의 펩타이드 단편을 자궁암 세포주인 Hela 세포주에 투여하여, 상기 ADCYAP1 단백질의 펩타이드 단편이 자궁암 세포의 세포자살 및 세포 성장을 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명의 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 캡기 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 함유하는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염은 다양한 기능성 식품 및 건강보조식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1)을 코딩하는 유전자가 체내 전달용 수송체에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 유전자 치료제에 관한 것이다.
유전자 치료제는 유전자 전달 및 발현에 의하여 질병을 치료하기 위한 유전자 치료법에 활용되는 치료제를 의미하는 것으로서, 질환부위로 유전인자의 정확한 전달, 생체 내에서의 완전한 분해, 독성 및 면역 항원성 부재 및 유전인자의 장기간 안정적인 발현 등의 장점을 가지고 있다.
본 발명에 있어서, 목적 유전자를 전달하는 기술로는 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기 자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법이 있으며, 상기 전달 기술 중 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료 유전자로 대체된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제 능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자 치료를 위해 선호하는 방법이다. 목적 유전자를 전달하는 기술로써, 바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다.
본 발명에 있어서, 체내 전달용 수송체는 목적 유전자를 체내로 전달하기 위한 매개체로써, 목적 유전자를 전달하는 기술에 활용되는 바이러스 수송체, 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를포함하는시료에항암후보물질을처리하는단계; 및
(b) 상기 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를디메틸화시키는후보물질을항암물질로선별하는단계를포함하는자궁경부암치료용항암물질을스크리닝하는방법을제공한다.
본 발명에 있어서, 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를포함하는시료는자궁경부암세포세포주, 조직 및 세포진을 이용하여 준비할 수 있고, 상기 시료에 항암 후보물질을 처리하는 단계는 통상의 방법으로 항암 후보물질과 시료를 접촉시키는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를디메틸화시키는후보물질은 5-아자-2'-데옥시사이티딘(DAC) 뿐만 아니라, 히스톤 디아세틸라아제 저해제인 트리코스탄틴 A(trichostatin A), 트라폭신(trapoxin), 옥삼플라틴(oxamflatin), N-히드록시-N'-페닐옥탄디아미드(SAHA), CBHA(m-Carboxycinnamic acid bis-Hydroxamide), butyric acid, phenylbutyric acid, HC toxin, Depsipeptide, N-acetyldinaline, MS-275 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를디메틸화시키는후보물질을항암물질로선별하는단계는항암후보물질을처리하기전과처리한후의ADCYAP1 유전자의서열목록을비교함으로써확인할수있다.
본 발명에서 "간접 비교"는 첫번째 소스와 두번째 소스에서 분리된 핵산에 각각 하이브리다이제이션되는 레퍼런스 프로브를 사용하여 첫번째 소스에서 분리된 핵산의 레벨과 두번째 소스에서 분리된 핵산에서 동일한 대립 유전자 레벨을 평가하고, 그 결과를 비교하여 레퍼런스 프로브와 직접적으로 경쟁 결합시키지 않고도, 샘플에 존재하는 핵산의 상대적 양을 결정하는 것이다. 그 결과, 종양 조직에서는 유전자의 발현이 하향조절되었고, ADCYAP1유전자도 하향조절되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.
본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO4)침전, 염화칼슘(CaCl2)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있고, 형질전환된 재조합 미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 발현벡터로 pcDNA3 벡터만을 사용하였고, 발현 벡터로서 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 등의 바이러스 벡터를 사용한 구체적인 실시예는 없으나, 공지의 유전자 전달체인 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 전달함으로써 in vivo 상에서자궁경부암치료제로이용할수있다는것은당업자에게자명한사항이다.
또한, 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터를 도입하여 ADCYAP1 유전자의과발현에의한자궁경부암세포의증식억제만을확인하였으나, 유전자의 프로모터 부위가 메틸화되어 있는 ADCYAP1 유전자에디메틸화제를처리하여발현이억제되어있던유전자가 reactivation됨으로써 자궁경부암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낼 것이라는 것 역시 당업자에게 자명하다고 할 것이다.
실시예 1: 자궁경부암 조직 및 자궁경부암세포주에서의 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)을 코딩하는 유전자의 발현 측정
자궁경부암 조직 또는 자궁경부암세포에서 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (ADCYAP1)을 코딩하는 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 수행하였다. 마이크로어레이 하이브리다이제이션은 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다 (Schena etal.,Science,270:467,1995).
자궁경부암 환자로부터 종양 조직 및 자궁근종 (myoma) 환자 중 자궁적출술을 시행한 환자의 정상 조직을 연세대학교 암전이 연구센터로부터 제공받아, 이로부터 전체 RNA를 분리하였다. 상기 정상 조직과 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적 차이를 간접적으로 비교하기 위하여, 표준 비교 RNA (간접 비교)를 제작하였다.
즉, 표준비교 RNA를 제작하기 위하여, 자궁경부암 세포주 A549(한국세포주은행:KCLB 10185), 위암 세포주 AGS(KCLB 21739), 신장암 세포주 Caki-2(KCLB 30047), 결장암 세포주 HCT116(KCLB 10247), 자궁경부암 세포주 Hela(KCLB 10002), 혈액암 세포주 HK-60(KCLB 10240), HT1080(KCLB 10121), 유방암 세포주 MDA-MB231(KCLB 30026), 간암 세포주 SK-hep1(KCLB 30052), T 세포 유래 세포주 Molt-4(KCLB 21582) 및 뇌암 세포주 U-87MG(KCLB 30014)로부터 전체 RNA를 Tri Reagent (Sigma, USA)를 사용하여 분리하였다. 표준 비교 RNA를 제작하기 위하여, 상기 11개 세포주로부터 분리한 전체 RNA를 동량으로 혼합하였고, 이를 내부 대조군으로 사용하였다.
상기 정상 조직 및 종양 조직의 상대적 유전자 발현 정도를 비교하기 위하여, 정상 및 종양 조직으로부터 분리한 RNA와 표준 비교 RNA를 간접적으로 비교하였다. 이를 위하여, 전체 RNA 100㎍을 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP로 표지하였고, 상기 표준 비교 RNA는 Cy3로 표지하였으며, 위 조직으로부터 분리한 RNA는 Cy5으로 표지하였다. 상기 Cy3- 및 Cy5-로 표지한 두 cDNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 cDNA를 혼합하고, Microcon YM-30(Millipore Co., USA)을 이용하여 최종 부피가 27㎕가 되도록 농축하였다.
하이브리다이제이션 반응액(표지된 cDNA 타겟 27㎕, 20X SSC 20㎕, 1% SDS 8㎕, 포름아마이드(Sigma, USA) 24㎕ 및 인간 Cot1 DNA(Invitrogen, USA) 20㎍) 80㎕를 100℃에서 2분간 가열하고, 즉시 인간 35K 올리고뉴클레오티드(GenomicTree, Inc., 한국) 마이크로어레이에 습도 조절된 HybChamber X(GenomicTree, Inc., 한국)에서 42℃, 12~16시간 동안 하이브리다이제이션 시켰다. 상기 하이브리다이제이션된 마이크로어레이 슬라이드를 Axon 4000B(Axon Instrument Inc., USA)를 이용하여 판독하였다. 신호와 배경 형광 강도는 GenePix Pro 4.0 소프트웨어(Axon Instrument Inc., USA)를 사용하여 타겟 부위 내부의 모든 픽셀의 강도를 평균하여 각 프로브에 대해 측정하였다. 명백한 비정상성을 보이는 스팟은 분석에서 제외하였다. 모든 데이타는 GeneSpring 7.3 (Agilent, USA)을 이용하여 정상화, 통계학적 분석 및 클러스트 분석을 수행하였다.
또한, 정상 및 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적인 차이를 결정하기 위하여, 간접 비교를 위한 통계학적 분석 (ANOVA, p<0.01)을 수행하였다. 그 결과, 정상 조직과 비교하여 종양 조직에서 282개의 유전자 전체가 하향조절(down regulated)되는 것을 확인하였다(도 1).
상기 유전자의 발현이 유전자 프로모터의 메틸화에 의하여 조절되는지 확인하기 위하여, 자궁경부암 세포주인 C33A(ATCC HTB-31), SiHa(KCLB 30035), HeLa (KCLB 10002) 및 Caski(KCLB 21550)에 디메틸화제인 5-아자-2'-데옥시사이티딘(DAC, Sigma, USA) 200nM을 3일간 처리하였다. 상기 DAC를 처리한 세포주와 처리하지 않은 세포주에 Tri reagent를 처리하여 전체 RNA를 분리하였다.
DAC 처리에 의한 유전자 발현 변화를 확인하기 위하여, 비처리 세포주 및 처리 세포주간의 전사 수준을 직접적으로 비교하였다. 상기 자궁경부암 세포주를 각각 10% FBS, 페니실린 100units/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖를 함유하는 RPMI 배양 배지(GIBCO/BRL, Grand Island, NY)에서 37℃, 5% CO2농도 조건하에서 배양한 후, DAC를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 DAC 처리군의 유전자 발현을 측정하였다. 그 결과, DAC를 처리한 경우 총 2,428개의 발현 증가 유전자를 확인할 수 있었다.
상기 282개 자궁경부암 조직에서 하향발현되는 유전자와 2,428개의 재발현 유전자 목록을 비교하여 공통되는 34개 유전자를 자궁경부암에서 메틸화에 의해 발현이 하향조절되는 유전자 후보로 선택하였다(도 1).
상기 34개 후보 유전자의 프로모터 부위에서 CpG 섬의 존재를 찾기 위하여, MethPrimer(http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html)을 이용하였다. 상기 34개 유전자 중 14개의 유전자가 CpG 섬을 가지고 있지 않았으며, 상기 14개의 유전자를 공통 유전자 목록에서 제외시켰다(도 1).
상기 20개 유전자중 메틸화에 의해 발현되는 유전자를 확인하기 위하여 4종의 자궁경부암 세포주 C33A(ATCC HTB-31), SiHa(KCLB 30035), HeLa (KCLB 10002) 및 Caski(KCLB 21550)를 대상으로 파이로 시퀀싱 방법으로 메틸화 정도를 측정하였다. 그 결과, 3종 이상의 세포주에서 과메틸화를 나타내는 ADCYAP1 유전자를 암 억제 기능 규명을 위한 유전자로 확보하였다(도 1). 상기 ADCYAP1 유전자의 DNA 마이크로어레이 실험을 통한 자궁경부암에서의 하향 발현과 자궁경부암 세포주에서의 DAC 처리에 의한 재발현 결과는 도 2에 나타내었다.
실시예 2: 자궁경부암 세포주에서 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)을 코딩하는 유전자의 메틸화 측정
상기 실시예 1에서 확인된 ADCYAP1 유전자의자궁경부암세포주에서의재발현이디메틸화에의한것인지확인하기위하여, 자궁경부암 세포주에서 메틸화 정도를 측정하였다.
이를 위하여 바이설파이트(bisulfite) 처리를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형시키기 위하여 자궁경부암 세포주인 C33A (ATCC HTB-31), SiHa (KCLB 30035), HeLa (KCLB 10002) 및 Caski (KCLB 21550)에서 전체 gDNA를 정제하여, 그 중 gDNA 200ng을 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 후, 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱에 사용하였다.
ADCYAP1 유전자의 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)를 이용하여 수행하였다. ADCYAP1유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 1과 같다.
표 1
Figure PCTKR2011004594-appb-T000001
표 1에 기재된 프라이머로 증폭되는 바이설파이트 처리 후의 염기서열과 시퀀싱 프라이머 및 메틸화 측정을 위한 분석 염기서열은 하기 서열번호 6과 같다. 밑줄로 표시된 염기서열은 CpG 섬 부위의 메틸화 측정을 위하여 분석한 염기서열이고, "y(C 또는 T)"로 표시된 부위는 CpG 섬 부위의 시토신을 나타낸 것이다.
서열번호 6:
5'-gggtggatt tayggttatt ttgtttttty gygttttatt ttatygtttt tttttttttt tttttgtttt tttttttgyg tttttttttt ttygtgttay gttttttttt ggttttgygy gtttataaat ttttgagtag aataygagtt tyggtaaayg agtttygtag ttttttttgt tgttttygtt ggtttttgyg gtttttgttt agatattaaygttagayggygatgtttttygggtggtgattttagygtaggaatttgaagaagygttttgttygtygttttatttggtagtttttttggtagygggaggagttgaagggtaagggagggaaaattt-3'
상기 바이설파이트로 전환시킨 gDNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕ of 10pmole/㎕)을 95℃에서 5 분간 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 반응시킨 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물을 대상으로 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 이용하여 PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)으로 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 섬 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.ADCYAP1유전자의 경우, 4개의 CpG 섬 부위의 메틸화 정도를 측정하였다.
그 결과, ADCYAP1유전자의 프로모터 부위는 C33A(ATCC HTB-31)에서는 메틸화 되어 있지 않고 (10% 미만), SiHa(KCLB 30035), HeLa(KCLB 10002) 및 Caski (KCLB 21550)세포주에서는 50% 이상으로 과메틸화되어 있는 것을 확인하였다(도 3A).
실시예 3: 자궁경부암 조직에서 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)을 코딩하는 유전자의 메틸화 측정
ADCYAP1 유전자의 자궁경부암 조직에서의 발현 저하가 메틸화에 의한 인지를 확인하기 위하여, 파이로시퀀싱 방법으로 메틸화 정도를 정량 분석하였다.
자궁경부 정상조직 (충남대학교 병원 산부인과)과 암 환자로부터 수술 조직 (충남대학교병원 산부인과)을 확보하고, 이로부터 종양 조직 및 정상 조직에서의 ADCYAP1 유전자의메틸화정도를측정하였다. 종양 조직 및 정상 조직으로부터 각각 genomic DNA를 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 분리한 후, 상기 분리된 gDNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱에 사용하였다.
상기의 바이설파이트로 전환시킨 gDNA 20ng을 PCR로 증폭시켰다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환시킨 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕ of 10pmole/㎕)을 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 반응시킨 다음, 72℃에서 5분 조건으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물을 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 이용하여 PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수 (methylation index)로 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 섬 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.
그 결과, ADCYAP1유전자의 메틸화 정도는 정상 조직에서는 매우 낮은 수준 (20% 미만)으로 나타내었으나, 대부분의 암조직에서 매우 높은 수준 (20% 이상)으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다(도 3B). 이러한 결과는 ADCYAP1 유전자의자궁경부암조직에서의발현저하가메틸화에의한것임을나타내주는것이다.
실시예 4:자궁경부암 세포진에서 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)을 코딩하는 유전자의 메틸화 측정
ADCYAP1 유전자의 자궁경부암 세포진에서의 발현 저하가 메틸화에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 파이로시퀀싱 방법으로 메틸화 정도를 정량 분석하였다.
자궁경부 정상 세포진(충남대학교 병원 산부인과)과 암 환자로부터 세포진(충남대학교병원 산부인과)을 확보하고, 이로부터 자궁경부암 및 정상 세포진에서의 ADCYAP1 유전자의메틸화정도를측정하였다. 암 및 정상으로부터 각각 genomic DNA를 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 분리한 후, 상기 분리된 gDNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱에 사용하였다.
상기의 바이설파이트로 전환시킨 gDNA 20ng을 PCR로 증폭시켰다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환시킨 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕ of 10pmole/㎕)을 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 반응시킨 다음, 72℃에서 5분 조건으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물을 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 이용하여 PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수 (methylation index)로 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.
그 결과, ADCYAP1유전자의 메틸화 정도는 정상 세포진에서는 매우 낮은 수준(10% 미만)으로 나타내었으나, 대부분의 암조직에서 10% 이상의 높은 수준으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다(p < 0.0001, 도 4A). 또한 ADCYAP1 유전자의메틸화정도를이용하여자궁경부암을진단할수있는지여부를 MedCalc 프로그램 (벨기에)을 이용하여 ROC curve 분석을 수행한 결과 민감도(Sensitivity)가 85.7%, 특이도(Specificity)가 95.2%로 매우 우수하였다(도 4B). 이러한 결과는 ADCYAP1 유전자는자궁경부암세포진에서도메틸화에의해발현저하가일어나는것임을나타내주는것이다.
실시예 5: 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)을 코딩하는 유전자의 발현벡터 제작
ADCYAP1 유전자를 인간 세포 안에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 제조하기 위하여, Invitrogen으로부터 ADCYAP1 전장유전자를포함하고있는 531bp(서열번호 1)의 cDNA 클론을 구입하였다. 상기 531bp의 염기서열을 pcDNA3(Invitrogen, USA) 발현벡터의 HindIII와 XhoI 부위에 클로닝하기 위하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭을 위하여 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하였다. ADCYAP1유전자를 pcDNA3 발현벡터의 HindIII 및 XhoI 부위에 클로닝하여 ADCYAP1 유전자 발현 벡터(pADCYAP1)를 제작하였다.
서열번호 7: 5 -ttt aagctt atgaccatgt gtagcggagc-3’
서열번호 8: 5 -ttc ctcgag ctacaaataagctattcggc-3’
실시예 6: 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)을 코딩하는 유전자의 자궁경부암세포로의 도입 및 암세포 증식 억제 여부 측정
자궁암세포주 내에서 ADCYAP1을코딩하는유전자의과발현에따른암세포의세포사멸효과를확인하기위하여 TUNEL assay 실험을 수행하였다.
세포사멸 실험을 수행하기 위하여, 자궁암세포주 HeLa(KCLB 10002)를 4 chamber에 1.75 x104의 농도로 접종하고, 10% FBS(Sigma, USA), 페니실린(100units/㎖, WelGENE, Korea) 및 스트렙토마이신(100units/㎖, WelGENE, Korea)이 첨가된 DMEM 배지(Gibco, USA)에 37℃, CO2(5%)배양기(Forma Scientific Inc.)에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양된 자궁암세포에 상기 실시예 5에서 제작한 ADCYAP1 유전자 발현 벡터(pADCYAP1)를 Fugene HD transfection 시약(Roche Applied Science)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 대조군으로는 ADCYAP1 유전자가 포함되지 않은 pcDNA3 를 트랜스펙션시켰다. 상기 형질전환체를 48시간 동안 배양한 후, 4% PFA(paroformaldehyde)를 이용하여 고정시킨 후, TUNEL assay mixture(Roche Applied Science)를 웰당 50㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO2배양기에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 시약을 제거 후 형광현미경 하에서 관찰하여 세포의 세포자살 현상을 관찰하였다.
그 결과, ADCYAP1유전자를 함유하는 pADCYAP1발현 벡터가 도입된 자궁암세포에서는 세포배양 시간이 경과할수록 핵 내 DNA의 분절이 현저하게 유발되는 세포사멸현상을 확인할 수 있었다(도 5A). 또한 트랜스펙션 후 세포성장 곡선을 측정한 결과, pADCYAP1발현벡터가 도입된 세포주에서 성장이 현저히 저하되는 것으로 확인할 수 있었다(도 5B). 이는 ADCYAP1 유전자 또는 그 단백질이 자궁암세포의 세포사멸을 야기시킬 수 있으며, 자궁암 치료제로서 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 7: 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)의 펩타이드 단편 처리에 의한 자궁경부암세포 증식 억제 여부 측정
ADCYAP1 단백질을 구성하고 있는 펩타이드 단편을 자궁암세포주에 처리하였을 때, 자궁암 세포의 세포사멸을 유도하는 지를 확인하기 위하여 WST assay 실험을 수행하였다.
세포사멸 실험을 수행하기 위하여, 자궁암세포주 HeLa(KCLB 10002)를 6 웰 플레이트에서 5x104세포농도로 배양한 후 D.W에 녹아있는 ADCYAP1(1-27) 펩타이드단편(GenScript, 미국)과 ADCYAP1 (1-38) 펩타이드 단편(GenScript, 미국)을 1 nM과 100 nM 농도로 18시간동안 처리하였다.
ADCYAP1(1-27): HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2(C-terminalNH2modified;서열번호 9); ADCYAP1단백질의 N-말단으로부터 27번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 단편
ADCYAP1(1-38): HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK-NH2(C-terminalNH2modified;서열번호 10); ADCYAP1단백질의 N-말단으로부터 38번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 단편
펩타이드 단편을 처리하지 않은 대조군과 상기 펩타이드 단편을 처리한 세포에 WST 시약 (Takara, 일본)을 10μl 첨가하여 발색반응을 유도하고 microplate reader에서 흡광도 (480 nm)를 측정하였다. 그 결과, 펩타이드 단편을 처리하지 않은 대조군에 비하여 1 nM의 펩타이드 단편과 100 nM의 펩타이드 단편을 처리한 세포에서 흡광도가 20% 이상 감소하는 것을 나타나, ADCYAP1의 펩타이드 단편이 자궁경부암 세포주의 생장을 20% 이상 억제하는 것으로 나타났다 (도 6A).
또한, 자궁암세포주 HeLa (KCLB 10002)를 6 웰 플레이트에 2.5x105세포농도로 배양한 후 증류수에 녹아있는 ADCYAP1(1-27) 펩타이드 단편과 ADCYAP1 (1-38) 펩타이드 단편을 100nM 농도로 18시간동안 처리하였다. 광학현미경하에서 ADCYAP1 펩타이드단편을처리하지않은세포와ADCYAP1 펩타이드단편을처리한세포의생장상태를관찰하였다 (도 6B). 그 결과, ADCYAP1(1-27)펩타이드 단편과 ADCYAP1 (1-38) 펩타이드 단편을 처리한 조건에서는 모두 자궁경부암 세포의 생장이 현저히 억제되는 것을 확인하였다.
상기 결과는 ADCYAP1 단백질 또는 ADCYAP1 단백질을 구성하고 있는 펩타이드 단편 또는 이 자궁암세포의 세포사멸을 야기시킬 수 있으며, 자궁암 치료제로서 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체)(ADCYAP1)을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 함유하는 재조합벡터를 제공하여, 자궁경부암세포의 증식을 억제함으로써 자궁경부암 치료용 약학조성물을 제공하는 효과가 있다.
전자파일로 첨부하였음.

Claims (7)

  1. 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1)을 코딩하는 유전자 또는 그단편을함유하는자궁경부암세포의증식억제용재조합벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ADCYAP1을코딩하는유전자는인간유래의서열번호 1로 표시되는 cDNA인 것을 특징으로 하는 자궁경부암세포의 증식 억제용 재조합 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항의 ADCYAP1을코딩하는 유전자 또는 그 단편을 함유하는 자궁경부암세포의 증식 억제용 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
  4. ADCYAP1 단백질 또는 그 단편을 함유하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, ADCYAP1 단백질은 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
  6. 아데닐레이트 싸이클라제 활성화 폴리펩타이드 1 (뇌하수체) (NM_001099733, Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 1 (pituitary), ADCYAP1)을 코딩하는 유전자 또는 그 단편이 체내 전달용 수송체에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 유전자 치료제.
  7. 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 치료용 항암 물질을 스크리닝하는 방법:
    (a) 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를포함하는시료에항암후보물질을처리하는단계; 및
    (b) 상기 프로모터 부위가 메틸화된 ADCYAP1 유전자를디메틸화시키는후보물질을항암물질로선별하는단계.
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