KR20020040521A

KR20020040521A - 마이코락톤을 함유하는 항암제, 사람 레티노블라스토마단백질의 발현을 저하시키는 안티센스 올리고누클레오티드및 마이코락톤과 상기 안티센스 올리고누클레오티드를함유하는 항암제

Info

Publication number: KR20020040521A
Application number: KR1020000080184A
Authority: KR
Inventors: 이태윤
Original assignee: 이태윤; 주식회사 바이오제니아
Priority date: 2000-11-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2002-05-30
Also published as: KR100408916B1; US20040048823A1

Abstract

본 발명은 암세포 사멸을 상승시키는 물질인 마이코락톤을 함유하는 항암제, 레티노블라스토마 단백질(retinoblastoma protein, 이하 Rb 단백질이라 약함)의 발현을 저하시키는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드 및 마이코락톤과 상기 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 함유하는 항암제에 관한 것이다.

마이코락톤은 유방암, 방광암, 피부암, 위암, 간암, 백혈병 및 림프종 등을 포함하는 다양한 암세포주에서 세포사멸을 유발시키며, 마이코락톤 처리에 의한 암세포의 사멸은 계획된 세포사멸(apoptosis, 이하 아포토시스로 약함)을 촉진한다.

마이코락톤 처리에 의한 암세포의 아포토시스는 Rb 단백질이 발현되지 않는 암세포에서 더 효과적이며, Rb 단백질이 발현되는 암세포라 할지라도 Rb 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드로 처리한 후 마이코락톤으로 처리하면 암세포 사멸이 증가한다.

Description

마이코락톤을 함유하는 항암제, 사람 레티노블라스토마 단백질의 발현을 저하시키는 안티센스 올리고누클레오티드 및 마이코락톤과 상기 안티센스 올리고누클레오티드를 함유하는 항암제{An anticancer drug comprising a mycolactone, an antisense Rb oligonucleotide that decreases human retinoblastoma protein expression and an anticancer drug comprising a mycolactone and the said antisense Rb oligonucleotide}

전 세계적으로 암은 사람에 있어 남녀를 불문하고 순환기계 질환 다음으로 두번째로 높은 사망의 원인이다. 한국의 경우에도 인구 10만명당 사망은 순환기계 질환의 경우가 1위로 123.7명이며, 각종 암에 의한 사망이 그 다음으로 110.8명을 차지하고 있다(통계청, 사망원인 통계연보, 1998).

이에 따라 전 세계적으로 암을 정복하고자 하는 다양한 기법 및 물질들이 개발되어 왔으며, 최근 항암제 개발에 있어서 활발한 연구중 하나는 정상적으로 세포가 사멸하게 되는 기전인 아포토시스를 암세포에 유발시키는 항암 후보물질의 발견 및 개량을 통한 항암제의 개발이다.

일반적으로 암 즉 악성종양(malignant tumor)은 여러가지 원인들에 의하여 세포가 비정상적으로 증식 및 성장을 거듭함으로써 발생하는 것으로 알려져 있다. 이러한 원인들에는 화학적 발암물질에의 노출, 발암 바이러스의 감염 및 선천적인 유전자 이상 등이 포함된다. 그러나 근본적으로 이러한 원인들은 모두 세포내 유전자들의 이상을 유발하는 것들이다.

정상적인 세포는 암유전자(oncogene), 암억제유전자(tumor suppressor gene) 및 아포토시스 조절유전자(apoptosis-regulating gene)들의 기능이 상호 보완적으로 조절되어 조화롭게 성장하고 유지된다.

암유전자는 정상적으로는 세포의 성장과 분화에 필수적인 유전자로서 단백질 합성 촉진 및 세포내 신호전달 등의 역할을 수행하여 세포의 증식 및 성장에 기여하고 있으나 돌연변이가 일어나면 과다한 세포증식을 유발하여 암을 유발하는데 기여하는 것으로 알려져 있다.

반면에 암억제 유전자의 경우는 세포주기를 조절함으로써 과다한 세포성장을 억제하고, 유전자 결함을 보수하는 등, 암 유전자와 상반된 기능을 수행함으로써 전반적인 조화를 이루고 있으나, 돌연변이와 같은 구조적 불활성화가 발생하거나, 돌연변이는 없더라도 암억제유전자 산물의 기능을 억제하는 단백질과의 결합을 통한 기능적 불활성화를 통하여 암 발생이 유발된다.

암유전자나 암억제유전자들의 유전적 이상 및 각 유전자 산물들의 기능적 이상이 발생하여도 이러한 세포는 아포토시스를 통한 사멸기전을 통하여 제거됨으로써 과다한 세포 성장이 억제되는데, 이 역할을 담당하는 것이 아포토시스 조절 유전자들이다.

암유전자, 암억제유전자 및 아포토시스 조절유전자들 이외에도 세포내에는 유전자 보수기능, 신호전달기능 등의 보호기구들이 존재하여 세포의 건전한 기능을 지켜주고 있다. 이러한 이중, 삼중의 보호벽이 세포를 정상적으로 유지함에도 불구하고 암유발물질에 과다하게 또한 지속적으로 노출되거나 상기한 보호벽 기능을 담당하는 여러 유전자들 중 어디에선가 유전적 결함이 나타나면 암이 발생할 수 있다.

한편 기존에 개발되어 사용되고 있는 암 치료법 및 항암제들의 현황을 살펴보면 다음과 같다.

암 치료법에는 일반적으로 수술, 방사선요법, 항암화학요법, 면역요법 및 유전자치료법 등이 포함된다.

수술은 가장 오래된 암 치료법이며 현재에도 암 치료에서 중요한 위치를 차지하고 있다. 암이 멀리 퍼지지 않고 국소적으로만 있을 경우 수술 단독으로도 완치할 수 있다. 그러나 환자의 70% 이상에서 진단 당시 현미경적 전이(micro-metastasis)가 있으므로, 더 좋은 치료 효과를 얻기 위해 수술과 함께 방사선치료나 항암 약물치료 등과 같은 치료방법들을 병행하여 사용한다. 즉, 수술은 국소적으로 존재하는 암종을 떼어내는 방법으로 전이가 되어 있지 않거나 암세포의 전이가 예상되더라도 방사선요법이나 항암화학요법 등의 보조요법에 의하여 치료가 가능할 때에만 사용할 수 있는 제한점을 가지고 있다.

한편, 방사선 치료법은 고에너지 방사선을 이용하여 암세포를 죽이는 암 치료법이다. 방사선은 암세포와 건강한 세포 모두에 영향을 줄 수 있으나 여러 가지 방법과 기술을 이용하여 정상 조직에는 영향을 덜 주면서 암세포를 많이 파괴하여 암을 치료한다. 방사선을 암에 쪼일 경우, 암세포를 즉각 죽이지는 못하나 암세포가 분열, 증식하는 기능을 파괴하여 새로운 암세포가 분열, 생성되지 못하게 하고 더 이상 분열하지 않는 암세포는 수명이 다해 죽게된다. 방사선 치료 때마다 더 많은 세포가 죽고, 죽은 세포는 분해되어 혈액으로 운반되어 몸밖으로 배출되어 종양의 크기는 줄어든다. 건강한 세포의 대부분은 회복되나 일부 회복되지 않는 경우에 방사선치료의 부작용이 발생하게 된다. 방사선치료 중 발생할 수 있는 부작용으로는 식욕감퇴, 설사, 구내염, 피로감 및 피부 부작용 등이 있다.

항암화학요법약물(이하 항암화학요법제로 약함)은 융모막암

(choriocarcinoma)에 메토트렉세이트(methotrexate)를 사용하여 완치효과를 얻은 이후부터 본격적으로 발전되기 시작하였다. 오늘날 약 50여종의 항암화학요법제가 사용되고 있다. 특히 융모막암, 백혈병, 윌름종양, 유잉육종(Ewing's sarcoma), 횡문근종(rhabdomyoma), 망막모세포종, 림프종 및 고환암등은 항암화학요법제 투여로 좋은 치료효과를 기대할 수 있는 암들이다.

대부분의 항암화학요법제는 세포내 유전인자의 본체인 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시킴으로 효과를 나타낸다. 그러나 이들 항암화학요법제는 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능 저하, 위장관 점막손상, 탈모등 여러 부작용이 나타난다. 항암화학요법제 사용의 가장 큰 문제점은, 다른 약물과 달리 특이성이 없는 것이다. 즉 분열이나 증식이 빠른 세포에 모두 작용하므로 정상적으로 세포분열이 왕성한 골수세포, 위장관 상피세포 및 모낭 등에도 피해를 입혀 정도의 차이는 있으나 골수억제, 위장장애, 탈모 등의 부작용이 거의 모든 환자에게서 발생한다. 다만 정상세포와 암세포에 대한 항암화학요법제의 효과는 질적인 차이라기보다 양적인 차이여서 암세포가 좀 더 예민하게 반응하므로 많이 파괴되고 또한 정상세포의 재생능력이 빠르기 때문에 치료효과를 거둘 수 있다.

한편 항암화학요법제는 항암효과 이외에 면역성을 억제하는 작용이 있어 장기이식 수술 후 거부반응을 억제시키는 목적으로도 사용되나 암 환자에게 면역성을 저하시켜 감염의 위험이 발생한다. 현재 사용되는 항암화학요법제들은 대부분 세포독성 항암제로 분류되며 그 외에는 호르몬성 항암제와 인터페론 및 인터루킨-2 등과 같은 생체반응 조절물질(biological response modifier, BRM)등에 속하며 생체 반응 조절물질의 일부는 면역요법제로 분류되기도 한다.

면역요법제에 대하여 간략히 설명하면 다음과 같다.

인체는 면역기구라는 시스템이 있어 내·외부의 적으로부터 자신을 방어하고 있다. 이러한 면역기구는 두 가지 시스템으로 구성되어 혈액속의 대식구와 림프구가 관여하는 세포성 면역(cellular immunity), 항체가 관여하는 체액성 면역(humoral immunity)으로 크게 구분한다. 이 중 세포성 면역에 이상이 생기면 암이 발생할 가능성이 높다.

면역요법이란 암세포를 항원으로 인식, 판별할 수 있는 면역기능을 회복 또는 증강시켜 암세포를 죽이거나 성장을 억제시키는 치료법으로서 능동면역법, 수동면역법 및 간접면역법 등으로 분류된다.

능동면역법은 다시 특이적 능동면역법 및 비특이적 능동면역법으로 나뉘는데 후자는Mycobacterium bovisBCG와 같은 면역보강제를 사용하여 숙주의 면역기능을 비특이적으로 향상시키는 방법이며, 특이적 능동면역법은 종양항원에 대한 백신을 통하여 특정 암세포에 대한 면역반응을 증강시키는 방법이다.

한편, 수동면역법은 단클론 항체와 같은 체액성 면역요법과 종양침투림프구 (tumor infiltrating lymphocyte)나 림포킨-활성화 살세포(lymphokine-activated killer cell, LAK)와 같은 세포성 면역요법으로 나뉜다. 체액성 면역요법에 속하는 단클론 항체에는 항암제나 방사성동위원소를 붙여서 사용하기도 한다.

간접면역법에는 세포 성장인자 혹은 혈관생성인자를 억제하는 방법이 사용되고 있다. 면역요법은 진행된 암에서는 면역요법 단독은 물론 항암화학요법과의 병용에서도 그 효과가 입증되지 않았으며, 따라서 대부분 초기 암의 국소주입에만 사용되고 있다.

최근 들어 세포의 정상적인 사멸기전인 아포토시스를 유발시키는 항암제의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

아포토시스는 발생, 분화과정과 같은 생리적인 환경 및 세포손상이나 미생물 감염등의 병리적인 환경하에서도 일어나는 적극적 세포기전을 통한 일종의 세포사멸 과정이다.

아포토시스 과정 중에 세포내에서 일어나는 생화학적 변화에 관한 연구는 최근 10년간 활발히 이루어져 왔다. 그 중 첫 번째 큰 발견은Caenorhabditis elegans에서 이루어졌다.C. elegans의 발생과정 중 일어나는 아포토시스 과정에는 ced-3, ced-4 및 ced-9 등의 유전자들이 관여하고 있다. 이들중 ced-3 및 ced-4는 세포사멸에 관여하는 유전자들인데 반하여 ced-9은 부적절한 아포토시스시에 세포 생존에 관여하는 생존유전자이다. 이들 ced 유전자들의 상동체(homolog)들이 포유동물세포에서도 밝혀졌는데, ced-3에 해당하는 상동체는 아포토시스시 활성화 되는 다양한 단백분해효소들인 카스파제들이고, ced-4 상동체는 미토콘드리아에서 씨토크롬 C 유리(cytochrome C release)에 의하여 활성화되어 다른 카스파제들을 활성화시키는데 관여하는 아팝1(apoptotic protease-activating factor 1, Apaf1)이며, ced-9 상동체는 아포토시스를 억제하는 것으로 알려진 bcl-2이다.

상기한 바와 같이 ced-3 상동체들로서 아포토시스 과정 중에 일련의 다양한 단백분해효소들이 활성화됨이 알려지고 이들은 기질 단백질의 특정 아스파테이트 (aspartate, asp) 잔기를 절단하므로 카스파제라고 명명되었다.

아포토시스를 유발시키는 외부 자극들은 크게 사멸수용체를 경유하는 자극과 그렇지 않은 것으로 나뉜다. 특정 리간드가 사멸수용체에 결합하여 아포토시스를 유발하는 경우의 사멸수용체들로는 파스(Fas), 티엔에프 수용체1(tumornecrotizing factor receptor 1, TNFR1), 트레일(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), 트램프(TNF-receptor-related apoptosis-mediated protein, TRAMP) 및 신경성장인자(nerve growth factor, NGF) 등이 있으며, 사멸수용체를 경유하지 않는 자극들로는 자외선, 감마 방사선조사, 열 쇼크, 세라미드, 항암약물, 반응성 산소종(reactive oxygen species), 바이러스감염 및 성장인자의 제거 등이 알려져 있다. 이와 같이 아포토시스를 유도하는 외부 자극들이 있을 때, 불활성화 상태의 전구형태(pro-form)로 존재하고 있던 개시자 카스파제는 일차적으로 C-말단의 작은 아단위(subunit)가 제거되고 자가촉매활성(autocatalytic activity)에 의해 활성화된 카스파제가 된다. 이와 같이 활성화된 개시자 카스파제는 다른 카스파제들의 단백분해성 분할(proteolytic cleavage)을 유도함으로써 일련의 단백분해 폭포(proteolytic cascade)를 시작하게 되고, 궁극적으로 세포사멸에 관여하는 효과체 카스파제들이 활성화되어 다양한 세포사멸 기질(cell death substrate)들에 작용함으로써 아포토시스의 전형적인 형태 변화 및 생물화학적 현상들이 유발된다.

아포토시스시 세포들은 핵크로마틴 응축(nuclear chromatin condensation), 원형질막 블레빙(plasma membrane blebbing), 아포토틱바디(apoptotic body)의 형성, 세포골격(cytoskeleton)의 변화, DNA 분절화등의 특징적인 변화를 보이며 사멸하게 된다.

사멸 수용체를 경유하는 경로에서는 사멸 수용체에 수용된 자극이 세포질단백질인 패드(Fas-associated death domain, FADD)와 같은 연결기 분자(adapter molecule)에 의하여 전-카스파제8(pro-caspase 8)으로 전달되어 활성화된카스파제8을 만들고 이는 다시 사멸기질에 작용하여 세포사멸에 직접 관여하는 효과 카스파제들인 카스파제6 및 카스파제3을 활성화시켜 세포사멸이 유발된다.

한편 전리 방사선 조사나 세포독성약물등의 사멸수용체를 경유하지 않는 자극들은 직접 미토콘드리아에 작용하여 미토콘드리아의 내막공간에 존재하는 씨토크롬 C의 유리를 유발하게 된다. 유리된 씨토크롬 C는 아팝1을 활성화시켜 [아팝1-씨토크롬 C-전 카스파제 9]로 구성된 아포토솜(apoptosome)을 형성하게 되고, 전-카스파제9(pro-caspase 9)가 활성화된다. 활성화된 카스파제9는 효과카스파제들인 카스파제3, 카스파제7 및 카스파제6 등을 활성화시켜 아포토시스를 유발하게 된다.

한편 이러한 아포토시스를 억제하는 단백질로는 bcl-2가 잘 알려져 있다. bcl-2와 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질들은 약 15종류가 존재하며 이들은 bcl-2과(bcl-2 family)라고 불린다. bcl-2과에 속하는 모든 단백질들은 4개의 bcl-2 상동 영역(bcl-2 homology domain, BH1~BH4) 중 적어도 하나의 영역을 가지고 있다.

모든 bcl-2과 단백질들이 아포토시스를 억제하는 것은 아니다.

bcl-2과에 속하는 단백질들은 크게 아포토시스를 억제하는 항-아포토시스 단백질(anti-apoptotic protein)들과 오히려 아포토시스를 촉진시키는 친-아포토시스 단백질(pro-apoptotic protein)들로 나뉜다. 이들은 서로간의 상호작용을 통하여 아포토시스를 유발하거나 혹은 억제하는 기능을 수행하고 있다.

예를 들면, 항-아포토시스 단백질 즉, 세포생존을 돕는 bcl-2 단백질들 중 대표적인 bcl-XL은 미토콘드리아를 통한 아포토시스 신호전달에 관여하는 아팝1 단백질이 전 카스파제 9와 결합할 수 있는 구조로 변화하지 못하게 함으로써 아포토시스를 억제하는 기능을 수행한다. 한편 이러한 bcl-XL의 항-아포토시스 기능은 친-아포토시스 단백질인 bik에 의하여 억제된다.

bcl-2나 bcl-XL과 같은 항-아포토시스 단백질들은 궁극적으로는 미토콘드리아로부터의 씨토크롬 C의 유리를 억제함으로써 아포토시스를 방해하는 것으로 알려져 있으며 이들은 모두가 적어도 BH1과 BH2 영역을 함유하고 있다.

한편, 아포토시스를 촉진하는 친-아포토시스 단백질인 bcl-2 단백질들은 크게 bcl-2의 구조와 유사한 bax, bak, bok 등이 포함되는 bax 아과(subfamily)와 BH3 영역만을 가진 BH3과로 나뉜다. bik과 같은 BH3 영역을 갖는 친-아포토시스 단백질들은 bcl-XL과 같은 항-아포토시스 단백질들의 길항제(antagonist)로 작용함으로써 아포토시스를 유발하는데 관여하고 있다.

또한, 항-아포토시스 bcl-2과 단백질들과 친-아포토시스 bcl-2과 단백질에 속하는 단백질들은 상호간에 이형이합체(heterodimer)를 형성하여 상호간의 기능을 약화시켜 세포사멸기전의 조절자로 작용하는 것으로 알려지고 있다. 이와 같이 사멸수용체를 경유하지 않는 아포토시스의 조절에는 bcl-2과 단백질들이 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 따라서, 사멸수용체 비의존성 아포토시스(death receptor-independent apoptosis)의 경우 아포토시스 신호의 중요 표적은 bcl-2과 단백질들이라고 할 수 있을 것이다.

대부분의 항암제들의 목표는 암세포의 아포토시스를 유도하는 것이다. 물론 기존의 항암제들도 아포토시스를 유발하지만 이는 항암제들의 특정 아포토시스의조절인자에 초점이 맞춰진 것은 아니며 이러한 항암제는 아직 시판되지는 않고 있다. 현재 개발 중인 아포토시스를 목표로 한 항암제의 실례를 들면 미국의 Cell pathway사(Horsham, PA, USA)는 Aptosyn을 개발하였는데, 이는 사이클릭 GMP 포스포디에스테라제(cyclic GMP phosphodiesterase)를 저해하여 선택적으로 비정상적인 세포들의 아포토시스를 촉진한다. 한편, Genta사(Lexington, MA, USA)의 G-3139는 아포토시스를 억제하는 bcl-2 유전자 mRNA의 합성을 저해하여, 암세포에서 bcl-2 단백질의 양을 저해시키는 물질로서, 이 G-3139를 도세탁셀(docetaxel), 이리노테칸(irinotecan) 혹은 파클리탁셀(paclitaxel) 등과 같은 다른 항암제와의 병용을 통한 암치료 보조제로서의 가능성을 타진 중이다.

미코박테리움 울세란스(M. ulcerans)는 부룰리궤양(Buruli ulcer)이라는 괴사성 피부 질환(necrotizing skin disease)을 유발하는 저속성장 미코박테리아 (slow-growing mycobacteria)이다. 저속성장 미코박테리아에는 미코박테리움 울세란스 이외에도 결핵균(Mycobacterium tuberculosis),나균(Mycobacterium leprae),

및 미코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) 등이 속한다. 미코박테리움 울세란스를 제외한 이들 저속성장 미코박테리아들은 사람의 대식세포내에서 생존하고 증식할 수 있는 능력을 통하여 병원성을 유지하고, 이들 세균들은 인체내에 오랜 기간 동안 존재하게 된다. 이들은 강력한 면역반응 및 염증반응을 유발하는데 이는 이들 항산균 세포벽에 소화 불가능한 지질이 존재하기 때문이다. 반면에 리보솜 RNA 염기서열(ribosomal RNA sequence)상에서는 이들과 유사한 유전적 배경을 갖는 미코박테리움 울세란스는 이러한 특징을 가지고 있지 않으면서도 부룰리 궤양이라는 피부 질환을 유발한다. 미코박테리움 울세란스는 면역원성이 낮은 일종의 독소와 같은 확산성물질을 만든다고 생각되어져 왔다. 그러나, 상기한 바와 같이 미코박테리움 울세란스 감염은 강력한 면역반응을 유발시키지 않는다는 점에서 이는 기존에 다른 병원성 세균들에서 알려진 바와 같은 단백독소와는 다른 독소일 것이라고 추정되어 왔다.

미국국립보건원(National Institute of Health) 산하 Rocky Mountain Laboratories의 K. George 및 P. Small등은 미코박테리움 울세란스 독소를 분리, 정제하여 그 특성을 조사한 결과 이 독소가 단백질이 아닌 지질임을 발견하였으며 [Infect. Immun., 66, (1998) 587~593], 이를 정제하여 그 구조를 조사한 결과 폴리케티드(polyketide)를 함유하는 작은 지질 분자임을 규명하여 이를 마이코락톤으로 명명하였다[Science, 283, (1999) 854~857].

또한 결핵균의 전 게놈서열(genomic sequence)이 규명됨에 따라 미코박테리움 울세란스와 동일 그룹에 속하는 결핵균내에는 약 10개 이상의 폴리케티드 합성효소(polyketide synthetase)의 유전자들이 존재함이 알려졌다.

K. George 등에 의하면 마이코락톤을 마우스 L929 세포주에 처리할 경우 G1기에서 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 유발하며 배양판에 붙어 있는 세포가 떨어지면서 세포의 모양이 둥글게 되는 등의 세포병리효과(cytopathic effect)가 유발됨이 알려졌다. 마우스 L929 및 J779 세포주들을 대상으로 한 실험에서 마이코락톤은 초기 48시간 이내에는 G1기에서 세포주기 정지를 유발하고 보다 장시간 처리시에는 아포토시스를 유발함이 보고되었다[K. George. et al,, Infect. Immun.,68, (2000) 877~883].

그러나 마이코락톤이 이러한 기전을 통하여 실제로 암세포에 대하여 효율적인 항암제로 작용하는지는 알려져 있지 않다.

한편, 아포토시스에 대한 저항성과 관련된 인자로는 세포주기의 G1기로부터 S기로 진입을 억제함으로써 과다한 세포증식을 조절하는 기능을 가지고 있는 Rb 단백질이 대표적이다[Bartkova J.et al., Cancer Res., 56, (1996) 5475~5483]. Rb 단백질은 110kDa 크기로 과다한 세포성장을 억제하는 기능을 담당하고 있다. Rb 단백질의 기능은 인산화 상태에 따라 변화하는데, 즉 저인산화(hypophosphorylation) 상태의 Rb 단백질은 S기에서 세포증식에 필요한 유전자들의 발현을 촉진시키는 전사인자인 E2F 단백질들과 결합하여 S기로의 진행을 방해하여 세포는 G1기에 머무르게 되어 세포증식이 억제된다. 한편, Rb 단백질이 과인산화(hyperphosphorylation)되면 E2F 단백질들과의 결합이 불가능해지며 이로 인해 자유스러워진 E2F 단백질들이 S기에서 세포증식에 관여하는 여러 유전자들의 발현을 증가시키게 되어 세포증식이 이루어진다[Li YJ. et al., Oncogene, 11 (1995) 597~600; Weinberg RA., Cytokines Mol Ther., 2, (1996) 105~110].

이와 같은 Rb 단백질의 과인산화는 세포 증식을 촉진시키는 인자들이 존재할 경우 발생하며 이는 구체적으로 씨클린 의존성 키나제(cyclin dependent kinase, 이하 CDK로 약함)라는 일련의 효소들에 의하여 이루어진다. 한편, 이러한 CDK들의 활성은 다시 CDK 억제인자(cyclin dependent kinase inhibitor)들에 의하여 조절되어 세포증식의 균형을 유지하고 있다[Kawamata N. et al., Cancer, 77 (1996)570~575]. Rb 단백질은 이와 같이 세포증식 촉진인자가 존재할 경우 G1기에서 세포증식을 억제하는 기능을 담당하고 있다.

그러나, 반대로 아포토시스를 촉진하는 인자가 존재할 경우에도 Rb 단백질은 G1기에서 세포사멸을 억제하는 역할을 담당하고 있다. 실제 p53 단백질의 과발현 및 방사선 조사 등과 같은 아포토시스 유발인자들에 의한 세포사멸은 Rb 단백질에 의하여 억제됨이 보고되었다[Haas-Kogan DA. et al., EMBO, 14, (1995) 461~472; Haupt Y. et al., Oncogene, 10 (1995) 1563~1571]. 따라서 아포토시스를 유발하는 항암제의 경우에는 Rb 단백질의 발현을 저하시키는 물질의 필요성이 요구되어졌다.

이에 본 발명은 마이코락톤의 암세포 사멸효과가 Rb 단백질을 발현하지 않는 암세포의 경우 Rb 단백질을 발현하는 암세포(혹은 정상세포)에 비하여 보다 효율적인 것에 착안한 것으로 마이코락톤을 Rb 단백질이 발현되지 않는 암세포에 선택적인 항암제로 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 Rb 단백질의 발현을 억제시키는 신규한 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 Rb 단백질을 발현하는 암세포의 경우 안티센스 Rb 올리고누클레오티드가 Rb 단백질의 발현을 억제시키는 것에 착안한 것으로 Rb 단백질의 발현을 억제시키는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드와 마이코락톤을 포함하는 항암제를 제공하는데 그 목적이 있다.

도1a, 도1b, 도1c, 도1d, 도1e, 도1f는 피부암, 위암, 유방암, 백혈병, 방광암 및 간암 등의 다양한 암세포들에 마이코락톤을 처리하였을 때 암세포의 사멸을 보여주는 광학현미경 사진이다.

도2는 암세포주들에 마이코락톤을 처리하였을 때 유발되는 암세포의 사멸이 아포토시스 현상임을 보여주는 전자현미경 사진이다.

도3은 암세포주들에 마이코락톤을 처리하였을 때 유발되는 암세포의 사멸이 아포토시스 현상임을 보여주는 웨스턴 블롯(western blot) 사진이다.

도4는 암세포에 마이코락톤을 처리하였을 때 영향을 주는 아포토시스 관련 유전자들의 mRNA 발현 양상이다.

도5는 사람 Rb 유전자의 전사를 저해하기 위해 설계된 안티센스 Rb 올리고누클레오티드(Antisense Rb, 하), 대조실험을 위해 사용한 센스 Rb 올리고누클레오티드(Sense Rb, 상)들의 염기서열 및 이들 올리고누클레오티드들의 사람 Rb mRNA 염기서열(Rb mRNA, 중)상의 표적부위이다.

도6은 Rb 단백질을 발현하는 암세포주인 SNU475에 도5에서 기술한 사람 안티센스 Rb 올리고누클레오티드 혹은 센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입한 후, Rb 단백질의 발현 양상을 Rb 단백질에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯팅한 사진이다.

도7은 Rb 단백질을 발현하는 암세포주인 SNU475에 도5에서 기술한 사람 안티센스 Rb 올리고누클레오티드(Antisense Rb, 우측 패널) 혹은 센스 Rb 올리고누클레오티드(Sense Rb, 좌측 패널)로 처리한 후 마이코락톤으로 처리하였을 때의 아포토시스 양상이다.

본 발명에서는 부룰리 궤양을 유발하는 미코박테리움의 독소이며 정상 세포주에서 아포토시스를 유발하는 것으로 알려져 있는 마이코락톤을 함유하는 다양한 종류의 암세포들에 대한 항암제를 제공한다.

본 발명은 Rb 단백질을 발현하지 않는 암세포에 대하여 선택적인 마이코락톤을 함유하는 항암제를 제공한다.

또한 본 발명은 Rb 유전자의 발현을 억제하여 Rb 단백질 생성을 효율적으로 억제하는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 제공한다.

또한 마이코락톤과 Rb 단백질 발현을 효과적으로 억제하는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 함유하고, Rb 단백질을 발현하는 암세포에 선택적으로 작용하는 항암제를 제공한다.

마이코락톤은 유방암, 방광암, 피부암, 위암, 간암, 백혈병 및 림프종 등 다양한 종류의 암세포들에서 사멸효과를 나타내었으며, 마이코락톤의 암세포 사멸효과는 Rb 단백질을 발현하지 않는 암세포에서 보다 효과적이었고, Rb 단백질을 발현하는 암세포에 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입함으로써 Rb 단백질의 합성이 현저히 저하되었으며, 안티센스 Rb 올리고누클레오티드 도입을 통하여 Rb 단백질의 합성이 억제된 암세포에 마이코락톤을 처리하였을 경우 마이코락톤의 암세포 사멸효과가 증가하였다.

따라서, 마이코락톤은 Rb 단백질을 발현하지 않는 암세포에서는 단독으로, Rb 단백질을 발현하는 암세포에서는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드와 병용함으로써 암세포 사멸효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 조성물은 암의 치료를 위해 임상적으로 이용시 약제학적 분야에서의 통상적인 방법에 따라 고분자등 약제학적으로 허용가능한 담체를 가하여 제제화 하여 사용할 수 있다. 환제, 정제, 캡슐제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제로 제형화시켜 사용할 수도 있으나, 국소주사 또는 전신주사등 주사제로 투여하는 것이 가장 바람직하다.

암의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 투여용량은 환자의 성별, 연령, 건강상태, 치료할 암의 종류, 중증도, 합병증 등에 따라 적절히 선택할 수 있으나, 일반적으로 1일 용량은 3~6㎎/㎏이며, 바람직하게는 4~5㎎/㎏이다.

이하 본 발명은 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 :암세포주, 세포배양 및 광학현미경 하에서 마이코락톤에 의한 암세포 사멸 관찰

실험에 사용된 암세포주들은 피부암 세포주 2주(Malme3M 및 SK-Mel-24), 유방암 세포주 1주(MDAMB231), 백혈병 세포주 1주(MOLT4), 위암 세포주 1주(SNU1), 방광암 세포주 1주(TCCSUP) 및 간암세포주 8주(SK-Hep1, Hep 3B, SNU182, SNU387, SNU398, SNU449, SNU475 및 HepG2)등이었다. 실험에 사용된 암세포주들은 10% 우태아혈청, 페니실린(100 unit/ml), 스트렙토마이신(100㎍/㎖)이 함유된 RPMI1640 배지를 사용하여 75cm²의 플라스크에서 5% CO₂, 37℃의 조건으로 배양하였다.

5 x l0⁶의 암세포를 6 well에서 24시간 배양한 후 1㎍/㎖의 마이코락톤으로 처리하고 72시간 후에 광학현미경으로 관찰한 결과 각 암세포주들은 세포가 둥글게 되면서 사멸해 가는 양상을 나타내었다. 마이코락톤을 넣지 않은 경우(B)에 비하여 마이코락톤을 넣어준 경우(A)에는 의미있는 암세포의 사멸이 관찰되었다.(도1a, 도1b, 도1c, 도1d, 도1e, 도1f).

도1a 내지 도1f에 보여주는 암세포들은 각각 피부암 세포주(Malme3M), 위암 세포주(SNU1), 유방암 세포주(MDAMB231), 백혈병 세포주(MOLT4), 방광암세포주

(TCCSUP) 및 간암세포주(Hep3B)들이다.

실시예 2 :아포토시스 유발을 통한 마이코락톤의 암세포 사멸효과

마이코락톤의 암세포 사멸효과가 가장 현저하였던 Hep3B 암세포를 대상으로 주사전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)으로 형태학적인 변화를 관찰하였다. 5 x l0⁶의 암세포를 배양하여 1㎍/㎖의 마이코락톤으로 처리하고 24시간 후 세포를 수집하여 2.5% 글루탈알데히드로 고정하였다. 사산화오스뮴(OsO₄)으로 처리한 후 에탄올 처리로 탈수하고 Epson 레진에 embed시켰다. 각 절편은 초산유라닐(uranyl acetate) 및 납 구연산염(lead citrate)로 염색하여 주사전자현미경

(Hitachi 7100B, Japan)으로 관찰하였다.

그 결과 마이코락톤을 처리하지 않은 경우(A)에 비하여 마이코락톤을 처리한 경우에서는 아포토시스의 전형적인 형태학적 특징인 핵 크로마틴 응축(백색 화살표) 및 아포토틱 바디(흑색 화살표) 형성(B)과 인접한 세포가 사멸한 세포로부터 빠져 나온 아포토틱 바디들(흑색 화살표)을 섭취하고 있는 모습(C)이 관찰되었다(도2).

마이코락톤의 암세포 사멸효과가 가장 현저하였던 Hep3B 암세포를 대상으로 마이코락톤 처리시 아포토시스의 전형적인 생화학적 변화인 씨피피32 카스파제 활성화 및 이에 수반되는 폴리 ADP-리보스 중합효소의 절단을 웨스턴 블롯으로 관찰하였다. 5 x l0⁶의 암세포를 배양하여 1㎍/㎖의 마이코락톤으로 처리하고 2, 4, 8, 12, 24 혹은 48 시간후 세포를 수집하여 씨피피32 카스파제에 대한 항체(Oncogene,MA, USA) 혹은 폴리 ADP-리보스 중합효소에 대한 항체(Enzyme Systems Products, CA, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯을 시행하였다. 단백질분리를 위하여 세포를 400㎕의 용해 완충액(lysis buffer; 125mM Tris-HCl [pH 6.8], 20% 글리세롤, 2% SDS, 10% 머캅토에탄올)에 부유시켜 30초간 vortex한 후 95℃에서 5분간 방치하였다. 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 니트로셀룰로스 막에 전이시킨 다음 상기한 항체들로 웨스턴 블롯을 시행하였다.

그 결과 씨피피32 카스파제의 경우는 마이코락톤 처리 후 4시간째부터 24시간째까지 활성화가 관찰되었고, 씨피피32 카스파제에 의하여 절단되는 폴리 ADP-리보스 중합효소의 경우는 마이코락톤 처리 후 8시간째부터 절단이 시작되어 48시간째에는 모든 폴리 ADP-리보스 중합효소가 절단된 형태로 관찰되었다(도3).

도3 좌측에 표시된 Pro-CPP32는 활성화되기 전의 씨피피32 카스파제, Active CPP32는 활성화 된 후의 씨피피32 카스파제, PARP는 상기한 폴리 ADP-리보스 중합효소, Cleaved PARP는 절단된 폴리 ADP-리보스 중합효소를 표시한다.

이상의 결과는 마이코락톤에 의한 암세포 사멸은 아포토시스 유발에 의한 것임을 보여주는 형태학적(도2) 및 생화학적(도3) 증거들이다.

실시예 3 :마이코락톤이 발현에 영향을 주는 아포토시스 조절 유전자들

상기한 결과들은 마이코락톤이 아포토시스 유발을 통하여 암세포의 사멸을 유도함을 보여주는 결과이다. 이러한 현상이 암세포 내의 어떠한 유전자의 발현에 영향을 줌으로써 일어나는지를 알아보고자 아포토시스를 조절하는 유전자군으로 대표적인 bcl-2 유전자군들을 대상으로 마이코락톤의 효과를 조사하였다. 이를 위하여 마이코락톤으로 처리한 Hep3B 암세포에서 RNA를 분리하고 ribonuclease protection assay(RPA)법으로 bcl-2 유전자군에 속하는 총 7개의 유전자들의 발현양상을 조사하였다.

RNA는 RNeasy미니키트(Qiagen Inc., Chatsworth, Ca)로 분리하였다.

그 과정을 간략히 설명하면 다음과 같다.

먼저 마이코락톤으로 처리한 암세포를 수확하여 PBS로 세척하고 β-머캅토에탄올이 함유된 키트내의 용해 완충액을 첨가한 후 세포를 잘 현탁시켰다. 세포를 20-G 주사기에 5번 이상 통과시킨 후, 동일한 용적의 70% 에탄올을 첨가한 다음 잘 섞어주었다. 이를 키트내의 RNeasy미니스핀컬럼에 점적하여 10,000rpm에서 15초간 원침한 다음 세척 완충액으로 2회 세척하고, PRE 완충액를 첨가하여 세척하였다. 컬럼에 부착되어있는 RNA를 RNase가 없는 증류수로 용출하여 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

분리된 RNA를 사용하여 bcl-2 유전자군의 mRNA 발현양상을 다중프로브 RNase Protection Assay System(PharMingen, CA, USA)을 사용하여 RPA법으로 조사하였다. 그 과정을 간략히 설명하면 다음과 같다.

RPA법은 시험관 내에서 방사능 동위원소로 표지된 특이적인 RNA 프로브를 합성하여 각 시료에서 분리한 RNA와 혼성화 시킨 후 RNase로 혼성화하지 않은 단일쇄(single strand RNA) 및 리보프로브(riboprobe)를 제거하고 이를 변성 폴리아크릴아미드 젤상에서 전기영동 후 자가방사기록법(autoradiography)을 시행하여그 밀도를 비교함으로써 mRNA 전사의 양을 정량하는 방법이다. RPA 분석 과정은 크게 3과정으로 나눌 수 있는데 각각의 과정을 기술하면 다음과 같다.

1) 프로브 합성 과정

시험관내 전사혼합액(10㎕ [α-32P]UTP, 1㎕ GACU pool, 2㎕ DTT, 4㎕ 5 x 전사완충액, 1㎕ RPA 템플레이트 세트, 1㎕ T7 폴리머라제)을 잘 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응하여 프로브를 합성하였다. 여기에 2㎕의 DNase를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 페놀 처리하여 원침한 후 상등액을 취하고 상등액을 에탄올 침전하여 50㎕의 혼성완충액에 녹여 프로브를 합성하였다.

2) RNA 준비 및 혼성화

분리한 총 RNA(10~20㎍)를 -70℃에서 15분간 방치한 후 감압증발기(vacuum evaporator)에서 완전히 건조시켰다. 여기에 8㎕의 혼성완충액을 첨가한 후 vortex하여 짧게 원침한 후 3x10⁵cpm/㎕ 정도로 희석한 프로브 2㎕를 첨가하여 잘 혼합하고 광유(mineral oil)를 첨가하여 혼성화를 시행하였다. 먼저 혼성혼합액을 90℃에서 짧게 정치한 후 56℃에서 12시간 내지 16시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 37℃에서 15분간 반응하여 혼성화를 마무리하였다.

3) RNase 처리, 전기영동 및 자가방사기록법

혼성화 용액에 100㎕의 키트 내의 RNase 혼합액를 첨가한 후 30℃에서 45분간 반응시켜 혼성화가 되지 않은 RNA를 제거하였다. 여기에 키트내의 proteinase K 혼합 용액을 첨가하여 RNase digestion을 종료시킨 다음 페놀 처리 후 에탄올 침전하여 건조시켰다. 준비된 시료를 5㎕의 1 x loading buffer와 혼합한 후 90℃에서 3분간 가열하고 얼음에 방치한 다음 미리 준비된 변성 폴리아미드 젤에서 전기영동한 후 건조하여 X-선 필름에 노출시켰다.

이러한 방법으로 마이코락톤을 Hep3B 암세포에 처리하였을 경우 bcl-2 유전자군에 속하는 유전자들의 mRNA 발현양상을 조사한 결과 아포토시스를 촉진하는 유전자들인 bad, bak 및 bax들은 마이코락톤 처리 후 24시간까지 처리전과 비교하여 차이를 보이지 않았다. 한편, 아포토시스를 억제하는 유전자들 중 bcl-XL은 마이코락톤 처리 후 8시간째부터 발현이 감소하여 24시간까지 감소양상이 지속되었다.

또 다른 아포토시스 억제 유전자인 mcl-1은 마이코락톤 처리 후 2시간째에 일시적으로 그 발현이 증가하었다가 4시간째부터는 서서히 발현이 감소되었고 이러한 감소양상은 24시간째까지 지속되었다. bcl-w의 경우는 마이코락톤의 처리에 의하여 mRNA 발현양상의 차이는 관찰되지 않았으며 bcl-2의 경우는 매우 약한 발현을 보였으며 특이한 발현증감은 관찰되지 않았다(도4).

이상의 결과로 보아 마이코락톤이 아포토시스를 유발하는 기전들 중 일부는 아포토시스를 억제하는 유전자들 중 bcl-XL 및 mcl-1의 발현을 억제함에 기인하는 것을 알 수 있다.

실시예 4 :안티센스 Rb 올리고누클레오티드의 합성

사람 Rb 유전자의 cDNA 염기서열(서열번호 2)을 바탕으로 Rb 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드(서열번호 3)를 합성하였다. 본 연구에서는 Rb mRNA 단백질 합성 개시 부분을 표적으로 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 합성하였으며, 세포내에 존재하는 올리고누클레오티드를 파괴시키는 핵산분해효소에 의한 안티센스 Rb 올리고누클레오티드의 파괴를 억제하기 위해 각 핵산간의 결합에 관여하는 인산기를 황산기로 치환하여 합성하였다.

안티센스 Rb 올리고누클레오티드와 함께 대조실험으로 사용하기 위해 센스 Rb 올리고누클레오티드(서열번호 1)도 안티센스 Rb 올리고누클레오티드와 동일한 방법으로 합성하여 사용하였다.

각 올리고누클레오티드들의 염기서열은 도5에 제시되어 있다.

실시예 5 :Rb 단백질을 발현하는 암세포에 안티센스 Rb 올리고누클레오티드의 도입을 통한 Rb 단백질 합성 억제

Rb 단백질을 발현하는 SNU475 암세포주를 사용하여 6 well plate에서 각 well 당 5 X 10⁶의 암세포를 RPMI1640 배지에서 밤새 배양하였다. 배양한 암세포에 실시예 4에서 기술한 센스 혹은 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 LIPOFECTAMINE-PLUS(Gibco BRL, Grand Island, NY)를 사용하여 도입하였다.

그 과정을 설명하면 다음과 같다.

센스 혹은 안티센스 Rb 올리고누클레오티드의 최종농도가 1uM이 되게 우태아혈청이 없는 RPMI1640 배지에 희석하고 여기에 PLUS 시약(Gibco BRL, NY, USA)을 넣어 잘 혼합한 후, 상온에서 15분간 정치하였다. 그 동안 또 다른 시험관에Lipofectamine을 우태아혈청이 없는 RPMI1640 배지에 희석하였다. 15분 후 2개의 시험관을 잘 섞은 후 상온에서 30분간 정치시켜 올리고누클레오티드-Lipofectamine 복합체가 형성되도록 하였다. 이 과정 동안 밤새 배양한 암세포가 들어있는 6 well plate의 배지를 우태아혈청이 없는 새로운 RPMI1640 배지로 교체하였다. 올리고누클레오티드-Lipofectamine 복합체를 각 배양판에 조심스럽게 떨어뜨린 후 37℃에서 3시간 반응시킨 후, 우태아혈청이 함유된 RPMI1640 배지를 첨가하여 밤새 배양하였다.

센스 혹은 안티센스 Rb 올리고누클레오티드가 도입된 SNU475 암세포주에서 Rb 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 조사하기 위하여 핵단백질을 다음과 같이 분리하였다.

일단 배양용기 내의 배지를 제거하고 찬 PBS를 첨가한 후 스크레이퍼(scraper)로 세포를 배양용기로부터 분리하였다. 분리된 세포를 함유하는 PBS용액을 10초간 원침하여 상등액을 버린 후 400㎕의 찬 완충액 A(10mM Hepes-KOH [pH7.9], 1.5mM MgCl₂, 10mM KCl, 0.5mM DTT, 0.2mM PMSF, 0.1% NP-40)에 잘 현탁하여 얼음에서 30분간 방치하였다. 10초간 vortex한 후 원침하고 침전물에 찬 완충액 C(20mM Hepes-KOH [pH7.9], 25% glycerol, 420mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM EDTA, 0.5mM DTT, 0.2mM PMSF)를 침전물 용적의 2배로 첨가하여 잘 현탁하여 얼음에 30분간 방치하였다. 마지막으로 4℃에서 2분간 원침하여 세포 부스러기를 제거하고 상등액을 취하여 단백질의 농도를 측정한 후 웨스턴 블롯에 사용하였다.

Rb 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯을 하기 위하여 각 암세포주의 핵단백질 40㎍을 4-20% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide tris-glycine gel(Novex, CA, USA)에서 전기영동하였다. 전기영동후 젤을 분리하여 웨스턴 블롯 기구(Novex, CA, USA)에 설치하였다. 여기에 전이 완충액(transfer buffer; 12mM Tris, 96mM glycine, 20% methanol, pH 8.3)을 사용하여 30V로 2시간 동안 니트로셀룰로스막에 전이한 후 니트로셀룰로스막을 분리하여 30분간 차단 용액(blocking solution; PBS 내 5% non-fat milk 및 0.02% sodium azide 함유)으로 차단한 후 마우스 항-사람 Rb 단클론항체(mouse anti-human Rb monoclonal antibody, PharMingen, CA, USA) 2㎍/ml를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 니트로셀룰로스막을 PBS로 한 번, PBS에 0.02% 트윈20을 첨가한 PBST로 두 번 세척하고 마지막으로 PBS로 한 번 더 세척하였다. 니트로셀룰로스막을 차단용액(PBS 내 5% non-fat milk 함유)에 잘 스며들게 한 후 여기에 horseradish peroxidase(HRP)가 결합되어 있는 항-마우스 면역글로불린 G 항체(anti-mouse immunoglobulin G antibody)를 첨가하여 30분간 반응시켰다. 상기한 바와 같이 PBS 및 PBST를 번갈아 가며 니트로셀룰로스막을 세척한 다음 enhanced chemiluminescence(ECL) 시약을 사용하여 발광시킨 후 X-선 필름에 적당한 시간 감광시킨 후 현상하였다. 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입한 SNU475 암세포에서 센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입한 SNU475 세포에서보다 Rb 단백질의 발현이 시간이 경과함에 따라 현저히 감소되는 것을 알 수 있었다(도6).

이러한 결과로 미루어 보아 본 발명의 안티센스 Rb 올리고누클레오티드는 효과적으로 Rb 단백질의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 6 :안티센스 Rb 올리고누클레오티드 및 마이코락톤의 동시처리에 의한 Rb 발현 암세포 SNU475의 세포사멸효과 증강

5 x l0⁶의 SNU475 암세포에 실시예4에서 합성한 센스 혹은 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 실시예5와 같이 도입하고, 마이코락톤 1㎍/ml을 가한 후 24시간, 48시간 혹은 72시간 동안 배양하여 세포를 수확한 다음 유세포 분석을 통하여 암세포 사멸효과를 조사하였다. 유세포 분석은 다음과 같이 시행하였다.

수확한 세포들을 PBS로 세척하고 450㎕의 PBS에 잘 현탁하였다. 암세포를 1㎖의 70% 에탄올로 30분간 고정하고 원심 분리하여, 1㎖ 의 FACS 완충액(PBS 내 10㎍/㎖ RNase 및 50 ㎍/㎖ propidium iodide 함유)에 잘 현탁한 후 37℃ 에서 30분간 정치하였다. 빠른 시간 내에 FACStar Instrument(Beckton-Dickinson Immunocytometry Systems)로 분석하였다.

암세포 사멸양상은 센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입한 경우와 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입한 경우에서 현저한 차이를 보였다. 즉, 센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입한 후 마이코락톤을 처리한 경우는 시간대 별로 아포토시스에 의하여 사멸된 암세포가 각각 전체 암세포의 9.0%, 9.4% 및 16.9%이었는데 반하여 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입한 후 마이코락톤을 처리한 경우는 각각 10.1%, 16.3% 및 26.3%이었다. 72시간 후에 사멸된 암세포가 26.3%인 점은 도6에서 보는 바와 같이 도입된 안티센스 Rb 올리고누클레오티드가 Rb 단백질의 합성을 완전히 저해하지 못하여 일부 발현되는 Rb 단백질이 마이코락톤에 의한 암세포의 사멸을 억제하고 있기 때문으로 생각되었다.

이와 같은 결과로 보아 안티센스 Rb 올리고누클레오티드로 처리한 후 마이코락톤을 처리하면 암세포가 마이코락톤에 보다 민감하게 반응하여 아포토시스 정도가 증가함을 알 수 있다(도7).

본 발명의 항암제에 의한 암세포 사멸효과는 마이코락톤이 암세포의 아포토시스를 유발함에 기인하였고, 이는 아포토시스 억제 유전자들 중 bcl-XL 및 mcl-1의 mRNA 발현 억제에 의함을 알 수 있었으며, 이러한 마이코락톤의 암세포 사멸효과는 Rb 단백질을 발현하는 암세포에서 보다 Rb 단백질을 발현하지 않는 암세포에서 더 현저함을 알 수 있었다.

Rb 단백질을 발현하는 암세포 내에 Rb 단백질의 합성을 억제하는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 도입함으로써 Rb 단백질 합성억제가 가능하였고, 이러한 상황에서 마이코락톤을 처리하였을 때 마이코락톤에 의한 암세포 사멸이 증가하였다. 따라서 Rb 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 마이코락톤과 함께 사용할 때 Rb 단백질을 발현하는 암세포에 대한 마이코락톤의 항암효과가 증대된다.

이와 같은 본 발명의 항암제는 유방암, 방광암, 피부암, 위암, 간암 및 백혈병 등의 다양한 암에서 항암효과를 발휘하는데 사용될 수 있다.

Claims

마이코락톤을 함유하는것을 특징으로 하는 항암제
제1항에 있어서, 상기 항암제는 Rb 단백질이 발현되지 않는 암을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 항암제
서열번호 3으로 이루어진 안티센스 Rb 올리고누클레오티드
마이코락톤과 서열번호 3으로 이루어진 안티센스 Rb 올리고누클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제
제4항에 있어서, 상기 항암제는 Rb 단백질이 발현되는 암을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 항암제
제1항, 제2항, 제4항, 제5항에 있어서, 유방암, 방광암, 피부암, 위암, 간암, 백혈병 및 림프종등의 암을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 항암제