TWI539002B - 用於胃癌之生物標記ｄａｃｔ１ - Google Patents

Description

用於胃癌之生物標記DACT1

胃癌(Gastric cancer)(亦稱為胃癌，stomach cancer)係全世界第四最常見癌症，每年診斷病例有約1,000,000人。其係具有高死亡率(每年死亡約800,000人)之疾病，使其成為全世界癌症死亡中僅次於肺癌的第二最常見原因。胃癌發生率在男性及發展中國家(包括許多亞洲國家)中顯著較高。

胃癌在其早期通常保持無病狀或僅展現非特異性症狀，因此在許多情形下，直至疾病已到晚期才作出診斷。此導致通常較差之預後：80-90%診斷患有胃癌之個體發生轉移，彼等在早期診斷出者的六個月存活率為65%且彼等在晚期診斷出者的六個月存活率小於15%。

由於胃癌之盛行及其對患者預期壽命之重大影響，因此業內需要新穎方法來診斷、監測並治療胃癌。本發明滿足此需要及其他相關需要。

在第一態樣中，本發明提供檢測個體之胃癌之方法。該方法包括以下步驟：(a)量測取自個體之試樣中DACT1之表現量，及(b)比較步驟(a)中獲得之表現量與標準對照。當與標準對照比較檢測到DACT1之表現量降低時，其指示個體可能患有胃癌。通常，該方法中所用試樣係胃黏膜試樣，例如，包括胃上皮細胞者。

在一些實施例中，DACT1之表現量係DACT1蛋白量。在 其他實施例中，DACT1之表現量係DACT1 mRNA量。當量測DACT1蛋白量時，步驟(a)可包括使用特異性結合DACT1蛋白之抗體實施免疫分析。例如，可使用西方墨點分析(Western Blot analysis)。在其他情形下，步驟(a)可涉及質譜或基於雜交之分析，例如與微陣列、螢光探針或分子信標雜交。

當量測DACT1 mRNA量時，在一些情形下，步驟(a)可涉及擴增反應，例如聚合酶鏈反應(PCR)、尤其逆轉錄酶-PCR(RT-PCR)。在其他情形下，檢測步驟可涉及多核苷酸雜交分析，例如南方墨點分析(Southern Blot analysis)或北方墨點分析(Northern Blot analysis)或原位雜交分析。例如，可在多核苷酸雜交分析中使用多核苷酸探針以與SEQ ID NO：1、4或6或其互補物雜交。在一些情形下，多核苷酸探針可包括可檢測部分。

在一些實施例中，當在上述方法步驟之第一輪後指示個體患有胃癌時，所主張方法可進一步包括在隨後時間使用來自個體之試樣類型之試樣重複步驟(a)。DACT1之表現量隨後相對於來自初始步驟(a)之量之增加指示胃癌有所改善，而降低指示胃癌有所惡化。

在第二態樣中，本發明提供檢測個體之胃癌之方法。該方法包括以下步驟：(a)利用差異修飾甲基化DNA及未經甲基化DNA之試劑處理取自個體之試樣；及(b)確定含CpG之基因組序列中之各CpG經甲基化抑或未經甲基化，含CpG之基因組序列至少為SEQ ID NO：1或6之區段且包含至少一 個CpG。當在含CpG之基因組序列中檢測到存在一個甲基化CpG時，其指示個體可能患有胃癌。

在一些實施例中，含CpG之基因組序列含有兩個或更多個CpG，且當全部CpG中之至少50%經甲基化時，指示個體患有胃癌。在一些情形下，含CpG之基因組序列係SEQ ID NO：1或6之至少15個、20個、50個或更多個鄰接核苷酸之區段。在其他情形下，含CpG之基因組序列係SEQ ID NO：1或6。在所主張方法之一個實施例中，含CpG之基因組序列係SEQ ID NO：6，且當含CpG之基因組序列中全部CpG中之至少5個經甲基化時，指示個體可能患有胃癌。

在一些實例中，所主張方法中所用試樣係胃黏膜試樣。在其他實例中，當在上述方法步驟之第一輪後指示個體患有胃癌時，該方法進一步涉及在隨後時間使用來自個體之試樣類型之試樣重複步驟(a)及(b)。當檢測到甲基化CpG之數目隨後相對於自初始步驟(b)所測定甲基化CpG之數目之增加時，其指示胃癌有所惡化，而降低指示胃癌有所改善。

在一些實施例中，所主張方法中用於差異修飾甲基化DNA及未經甲基化DNA之試劑係優先裂解甲基化DNA之酶、優先裂解未經甲基化DNA之酶或亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，該方法之步驟(b)涉及擴增反應；或步驟(b)可涉及DNA分子之定序定序。

在第三態樣中，本發明提供用於檢測個體之胃癌之套組，其包含(1)提供平均量之DACT1蛋白或DACT1 mRNA 之標準對照；及(2)特異性且定量地鑑別DACT1蛋白或DACT1 mRNA之試劑。在一些情形下，該試劑可為特異性結合DACT1蛋白之抗體；或該試劑可為與DACT1 mRNA雜交之多核苷酸探針。例如，多核苷酸探針具有SEQ ID NO：1、4或6或其互補物中所述之核苷酸序列。該試劑可包括可檢測部分。在其他情形下，套組可進一步包含兩種寡核苷酸引子用於在擴增反應中特異性擴增SEQ ID NO：2或3或其互補物之至少一區段。通常，套組將進一步包括說明手冊。

在第四態樣中，本發明提供抑制胃癌細胞生長之方法。所主張方法包括使胃癌細胞與以下接觸之步驟：(1)有效量之包含SEQ ID NO：5中所述胺基酸序列之多肽或(2)包含編碼SEQ ID NO：5之多核苷酸序列之核酸。在一些實施例中，該核酸係包含可操作地連接至編碼SEQ ID NO：5之多核苷酸序列之啟動子的表現盒。可在此方法中使用各種啟動子，例如啟動子可為上皮特異性啟動子。在其他實施例中，該核酸包含SEQ ID NO：2或3中所述之多核苷酸序列。在其他實施例中，胃癌細胞係在患者體內。

在第五態樣中，本發明提供核苷酸序列與SEQ ID NO：1、2、3、4或6或其互補物之約20個至100個鄰接核苷酸之區段至少95%一致的分離核酸。在一些實施例中，核酸之核苷酸序列與SEQ ID NO：1、2、3、4或6或其互補物之約20個至100個鄰接核苷酸之區段一致。在其他實施例中，核酸係偶聯至可檢測部分。

另外，本發明提供檢測胃癌之套組。該套組包含：(1)差異修飾甲基化DNA及未經甲基化DNA之試劑，及(2)指示劑，其在已使用該試劑處理來自測試胃癌之個體之試樣後，確定含CpG之基因組序列中之各CpG經甲基化抑或未經甲基化。含CpG之基因組序列至少係SEQ ID NO：1或6之區段且包含至少一個CpG。本發明亦提供抑制胃癌細胞生長之組合物。該組合物含有有效量之(1)包含SEQ ID NO：5中所述胺基酸序列之多肽(例如，由胺基酸序列SEQ ID NO：5組成之多肽)或(2)包含編碼SEQ ID NO：5之多核苷酸序列或由其組成之核酸(例如，包含多核苷酸序列SEQ ID NO：2或3之核酸序列)及醫藥上可接受之載劑。就此而言，本發明進一步提供包含SEQ ID NO：5中所述胺基酸序列之多肽(例如，由胺基酸序列SEQ ID NO：5組成之多肽)或包含編碼SEQ ID NO：2或3之多核苷酸序列之核酸(例如，包含多核苷酸序列SEQ ID NO：2或3或由其組成之核酸序列)在製備用於抑制胃癌細胞生長之藥劑中之用途。此外，本發明提供包含SEQ ID NO：1、2、3、4或6或其互補物之區段或由其組成之多核苷酸序列在製備用於檢測胃癌之套組中之用途。該區段通常係SEQ ID NO：1、2、3、4或6或其互補物之約20個至100個鄰接核苷酸。

定義

本文所用術語「DACT1基因」或「DACT1蛋白」係指人類DACT1基因或DACT1蛋白之任何天然變體或突變體、種 間同源物或直向同源物或人造變體。人類DACT1基因係位於染色體14q23.1上。人類野生型DACT1基因之cDNA序列係以GenBank登錄號NM_016651闡述(在本文中以SEQ ID NO：3提供)，其編碼798-胺基酸DACT1蛋白(在本文中以SEQ ID NO：5提供)。在本申請案之含義內，DACT1蛋白通常與人類野生型DACT1蛋白具有至少80%、或90%、或95%或更高序列一致性。

在本發明中，術語「胃癌(gastric cancer)」與「胃癌(stomach cancer)」具有相同含義且係指胃或胃細胞之癌症。此等癌症可為發生於胃內層(黏膜或胃上皮)中之腺癌且可在胃之幽門、主體或賁門(下、主體及上)部分中。「胃癌細胞」係具有胃癌特性之胃上皮細胞且涵蓋在向癌症細胞轉化之早期或易於轉化成癌症細胞之癌前細胞。此等細胞可展現一或多種癌細胞所特有之表型特徵。

除非上下文另外明確說明，否則在本發明中，術語「或」通常以其包括「及/或」之意義來採用。

本文所用術語「基因表現」用於指DNA之轉錄以形成編碼特定蛋白(例如，人類DACT1蛋白)之RNA分子或由多核苷酸序列編碼之蛋白之轉譯。換言之，術語「基因表現量」在本發明中涵蓋由所關注基因(例如，人類DACT1基因)編碼之mRNA量與蛋白量二者。

在本發明中，術語「生物試樣」或「試樣」包括組織切片(例如生檢及剖檢試樣)及取出用於組織學目的之冷凍切片、或此等試樣中任一者之經處理形式。生物試樣包括血 液及血液部分或產物(例如，血清、血漿、血小板、紅血球及諸如此類)、痰或唾液、淋巴及舌組織、經培養細胞(例如，原代培養物、外植體及經轉化細胞)、糞便、尿液、胃生檢組織等。通常自真核有機體獲得生物試樣，該真核有機體可為哺乳動物，可為靈長類動物且可為人類個體。

在本發明中，術語「生檢」係指移出組織試樣用於診斷或預後評估之過程及組織樣品本身。業內已知任何生檢技術皆可應用於本發明之診斷及預後方法。所應用生檢技術將取決於所欲評估之組織類型(例如，舌、結腸、前列腺、腎、膀胱、淋巴結、肝、骨髓、血球、胃組織等)以及其他因素。代表性生檢技術包括(但不限於)切除生檢、切開生檢、針吸生檢、手術生檢及骨髓生檢且可包含結腸鏡檢查。寬範圍之生檢技術為彼等熟習此項技術者所熟知，彼等熟習此項技術者將在該等技術之間進行選擇並利用最少實驗來實施該等技術。

在本發明中，術語「經分離」核酸分子意指自通常與經分離核酸分子相關之其他核酸分子分離之核酸分子。因此，「經分離」核酸分子包括(但不限於)不含天然側接有機體之基因組中之核酸一端或兩端之核苷酸序列的核酸分子(例如，藉由PCR或限制核酸內切酶消化產生之cDNA或基因組DNA片段)，自該有機體獲取經分離核酸。通常將此一經分離核酸分子引入載體(例如，選殖載體或表現載體)中以便於操縱或產生融合核酸分子。另外，經分離核酸分 子可包括經改造核酸分子，例如重組或合成核酸分子。存在於(例如)含有限制性消化基因組DNA之核酸文庫(例如，cDNA或基因組文庫)或凝膠(例如，瓊脂糖或聚丙烯胺)內之數百至數百萬其他核酸分子中之核酸分子並非「經分離」核酸。

術語「核酸」或「多核苷酸」係指去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈單鏈或雙鏈形式之聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有與參照核酸具有類似結合特性且以類似於天然核苷酸之方式代謝之天然核苷酸已知類似物的核酸。除非另有指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如，簡併密碼子取代)、對偶基因、直向同源物、單核苷酸多態性(SNP)及互補序列以及明確指示之序列。具體而言，可藉由產生一或多個所選(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列達成簡併密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem. 260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。術語核苷酸可與基因、cDNA及由基因編碼之mRNA互換使用。

術語「基因」意指產生多肽鏈時所涉及之DNA區段；其包括基因產物轉錄/翻譯及對轉錄/翻譯之調節中所涉及的編碼區之前及之後的區(前導區及尾區)，以及在個別編碼區段(外顯子)之間之間插序列(內含子)。

在本申請案中，術語「多肽」、「肽」及「蛋白」在本文 中可互換使用，其係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然胺基酸之人工化學模擬物之胺基酸聚合物，以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。本文所用該等術語涵蓋任何長度之胺基酸鏈，包括全長蛋白(即抗原)，其中各胺基酸殘基係由共價肽鍵來連接。

術語「胺基酸」係指天然及合成之胺基酸，以及以類似於天然胺基酸之方式作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係彼等由遺傳密碼編碼者，以及彼等經後續修飾之胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。出於本申請案之目的，胺基酸類似物係指與天然胺基酸具有相同基本化學結構(即，結合至氫、羧基、胺基及R基團之碳)之化合物，例如，高絲胺酸、正白胺酸、蛋胺酸亞碸、蛋胺酸甲基鋶。此等類似物具有經修飾R基團(例如，正白胺酸)或經修飾肽骨架，但保持與天然胺基酸相同之基本化學結構。出於本申請案之目的，胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構，但以與天然胺基酸類似之方式起作用的化學化合物。

胺基酸可包括彼等具有非天然D-對掌性者，如WO01/12654中所揭示，其可增進包含此等D-胺基酸中之一或多者之多肽的穩定性(例如，半衰期)、生物利用度及其他特性。在一些情形下，治療性多肽之一或多個且可能全部胺基酸具有D-對掌性。

在本文中胺基酸可表示為眾所周知的三字母符號或 IUPAC-IUB生化術語委員會推薦之單字母符號。類似地，核苷酸可表示為其公認知單字母代碼。

在闡述兩個或更多個多核苷酸或胺基酸序列之背景下，本文所用術語「一致」或「一致性」百分比係指當在比較窗口或指定區內針對最大對應比較及比對(如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查所量測)時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有相同胺基酸殘基或核苷酸之指定百分比(例如，本發明方法中所用變體DACT1蛋白(例如，用於治療胃癌)與參照序列(例如，野生型人類DACT1蛋白)具有至少80%序列一致性、較佳85%、90%、91%、92%、93、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)。則認為此等序列「實質上一致」。就多核苷酸序列而言，此定義亦係指測試序列之互補物。較佳地，一致性存在於長度為至少約50個胺基酸或核苷酸之區內，或更佳存在於長度為75個至100個胺基酸或核苷酸之區內。

對於序列比較而言，通常一個序列用作與測試序列比較之參照序列。當使用序列比較演算法時，將測試及參照序列輸入電腦，若需要，則指定子序列坐標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較演算法然後基於程式參數計算測試序列相對於參照序列之序列一致性百分比。對於核酸及蛋白之序列比較而言，使用下文所述BLAST及BLAST 2.0演算法及預設參數。

本文所用「比較窗口」包括提及選自由以下組成之群之任一數目之鄰接位置的區段：20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150，其中在對兩個序列最佳比對後可將序列與相同數目之鄰接位置之參照序列比較。對序列實施比對以供比較之方法為業內所熟知。可藉由(例如)以下方式對序列實施最佳比以供比較：Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源性演算法、Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源性比對演算法、Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之對相似性方法之研究、該等演算法之電腦化實施方案(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，在Wisconsin遺傳學軟體包，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中)或人工比對及目視檢查(例如，參見Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編輯，1995年增刊))。

適於確定序列一致性及序列相似性百分比之演算法的實例係BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別闡述於Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人，(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中。用於實施BLAST分析之軟體可於國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)網站(ncbi.nlm.nih.gov)公開獲得。該演算法涉及首先藉由鑑別查詢序列中之長度為W之短字段來鑑別高分值序列對(HSP)，該等短字段在與數據庫序列中具有相同長度之字 段比對時匹配或滿足某一正臨限分值T。T稱作相鄰字段分值臨限值(Altschul等人，見上文)。該等初始相鄰字段匹配物(hit)用作種子以供起始搜尋以找到含有其之較長HSP。然後使字段匹配物沿各序列在兩個方向上延伸，直至可能增加累積比對分值。對於核苷酸序列而言，使用參數M(匹配殘基對之獎勵分值；始終>0)及N(錯配殘基之懲罰分值；始終<0)來計算累積分值。對於胺基酸序列而言，使用分值矩陣來計算累積分值。字段匹配物在各方向上之延伸在以下時間停止：累積比對分值自其最大達成值降低了X數量；由於一或多個負分值殘基比對累加而使累積分值變為零或負值；或達到任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列而言)使用字長(W)28、預期值(E)10、M=1、N=-2及兩條鏈之比較值作為預設值。對於胺基酸序列而言，BLASTP程式使用字長(W)3、預期值(E)10及BLOSUM62分值矩陣(參見Henikoff及Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))作為預設值。

BLAST演算法亦對兩個序列間之相似性實施統計學分析(例如，參見Karlin及Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST演算法提供之一種相似性量測係最小總和概率(P(N))，其用於指示兩個核苷酸或胺基酸序列間偶然發生匹配之概率。例如，若在測試核酸與參照核酸之比較中最小總和概率小於約0.2、更佳小於約0.01且最佳小於約0.001，則認為該核酸與該參照序列 相似。

指示兩個核酸序列或多肽實質上一致之情形係由第一核酸編碼之多肽與抵抗由第二核酸編碼之多肽產生之抗體發生免疫學交叉反應，如下文所述。因此，多肽通常與第二多肽實質上一致，例如，其中該兩個肽之不同之處僅在於保守取代。指示兩個核酸序列實質上一致之另一情形係該兩個分子或其互補物在嚴格條件下相互雜交，如下文所述。指示兩個核酸序列實質上一致之再一情形係可使用相同引子來擴增序列。

在本發明中，術語「嚴格雜交條件」及「高嚴格性」係指探針將通常在複雜核酸混合物中與其靶子序列而不與其他序列雜交之條件。嚴格條件具有序列依賴性且在不同情況下將有所不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的詳盡指導參見Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)且將容易地為彼等熟習此項技術者所理解。通常，嚴格條件經選擇以低於特定序列在界定離子強度pH下之熱熔點(T_m)約5℃至10℃。T_m係在平衡時50%與靶標互補之探針與靶序列雜交之溫度(在界定離子強度、pH及核酸濃度下)(由於靶序列在T_m下過量存在，因此在平衡時佔據50%探針)。嚴格條件亦可利用添加去穩定劑(例如甲醯胺)達成。對於選擇性或特異性雜交而言，陽性信號係至少兩倍背景、較佳10倍背景雜交。實例 性嚴格雜交條件可如下：50%甲醯胺，5×SSC及1% SDS，在42℃下培育；或5×SSC，1% SDS，在65℃下培育，在0.2×SSC及0.1% SDS中在65℃下洗滌。

若在嚴格條件下不彼此雜交之核酸編碼之多肽實質上一致，則其仍實質上一致。此發生在(例如)使用遺傳密碼允許之最大密碼子簡併性產生核酸拷貝時。在此等情形下，核酸通常在中等嚴格雜交條件下雜交。實例性「中等嚴格雜交條件」包括在37℃下在40%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS之緩衝液中之雜交及在45℃下在1×SSC中之洗滌。陽性雜交係至少兩倍背景。彼等熟習此項技術者將容易地認識到，可利用替代雜交及洗滌條件來提供相似嚴格性之條件。確定雜交參數之其他指南提供於諸多參考文獻(例如，Current Protocols in Molecular Biology，編輯Ausubel等人)中。

「表現盒」係利用一系列允許在宿主細胞中轉錄特定多核苷酸序列之指定核酸元件重組或合成產生的核酸構築體。表現盒可為質粒、病毒基因組或核酸片段之一部分。通常，表現盒包括可操作地連接至啟動子之欲轉錄多核苷酸。「可操作地連接」在此背景下意指兩個或更多個置於允許元件(例如引導編碼序列轉錄之啟動子)發揮適當生物學作用之相對位置中的遺傳元件，例如多核苷酸編碼序列及啟動子。可存於表現盒中之其他元件包括彼等增強轉錄(例如，增強子)及終止轉錄(例如，終止子)者，以及彼等賦予自表現盒產生之重組蛋白某些結合親和力或抗原性 者。

本文所用術語「亞硫酸氫鹽」涵蓋所有類型之亞硫酸氫鹽，例如亞硫酸氫鈉，其能將胞嘧啶(C)化學轉化成尿嘧啶(U)而不化學修飾甲基化胞嘧啶，且因此可用於基於DNA之甲基化狀態差異修飾DNA序列。

如本文所用，「差異修飾」甲基化或未甲基化DNA之試劑涵蓋在方法中與甲基化DNA及未經甲基化DNA差異反應之任何試劑，藉助此方法自甲基化及未甲基化DNA產生可區分產物或可定量區分之結果(例如結合或沈澱程度)，藉此允許鑑別DNA甲基化狀態。此等方法可包括(但不限於)化學反應(例如藉由亞硫酸氫鹽達成未經甲基化C→U轉化)、酶促處理(例如藉由甲基化依賴性內切核酸酶裂解)、結合及沈澱。因此，當DNA經甲基化時，優先裂解甲基化DNA之酶係能以高得多之效率裂解DNA分子者，而當DNA未經甲基化時，優先裂解未經甲基化DNA之酶展現顯著較高之效率。在本發明上下文中，「差異修飾」甲基化DNA及未經甲基化DNA之試劑亦係指在其結合至DNA序列或使DNA序列沈澱(端視其甲基化狀態而定)方面展現差異能力的任何試劑。一類此等試劑係由甲基化DNA結合蛋白組成。

本文所用「含CpG之基因組序列」係指個體之基因組中界定位置處之DNA序列的區段。通常，「含CpG之基因組序列」之長度係至少15個鄰接核苷酸，且含有至少一個CpG對。在一些情形下，其長度可至少18個、20個、25 個、30個、50個、80個、100個、150個、200個、250個或300個鄰接核苷酸，且含有至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個或30個CpG對。對於給定位置處(例如，在人類DACT1基因組序列之區(例如含有啟動子及外顯子1之區)內)之任一「含CpG之基因組序列」而言，在個體與個體之間及對偶基因與對偶基因之間(甚至對於同一個體而言)，可存在核苷酸序列變化形式。此外，「含CpG之基因組序列」可涵蓋經轉錄或未經轉錄用於蛋白產生之核苷酸序列，且核苷酸序列可為蛋白編碼序列、非蛋白編碼序列(例如轉錄啟動子)或其組合。

術語「免疫球蛋白」或「抗體」(在本文中可互換使用)係指具有由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之基本四多肽鏈結構的抗原結合蛋白，該等鏈係由(例如)鏈間二硫鍵穩定，該蛋白具有特異性結合抗原之能力。重鏈與輕鏈二者皆摺疊成結構域。

術語「抗體」亦係指抗體之可用於免疫學親和力分析中之抗原及表位結合片段，例如，Fab片段。存在諸多經充分表徵之抗體片段。因此，例如，胃蛋白酶於鉸鏈區中之二硫連接之C端消化抗體以產生F(ab)'₂(Fab之二聚物)，Fab本身係由二硫鍵接合至V_H-C_H1之輕鏈。F(ab)'₂可在溫和條件下還原以斷裂鉸鏈區中之二硫連接，藉此將(Fab')₂二聚物轉化成Fab'單體。Fab'單體基本上係具有一部分鉸鏈區之Fab(關於其他抗體片段之更詳細說明，例如，參見 Fundamental Immunology,Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993))。儘管依據完整抗體之消化方面界定各種抗體片段，但熟習此項技術者應瞭解，可以化學方式或藉由利用重組DNA方法從頭合成片段。因此，術語抗體亦包括藉由修飾完整抗體產生或使用重組DNA方法合成之抗體片段。

當在闡述特定分子與蛋白或肽之結合關係之背景下使用時，片語「特異性結合」係指確定在蛋白及其他生物製劑之異質群體中存在該蛋白之結合反應。因此，在所指定結合分析條件下，所指定結合劑(例如，抗體)以至少兩倍於背景之量結合至特定蛋白，且實質上不大量結合至存於試樣中之其他蛋白。在此等條件下抗體之特異性結合可需要針對特定蛋白或非其類似「姊妹」蛋白之蛋白之特異性而選擇之抗體。可使用多種免疫分析模式來選擇與特定蛋白發生特異性免疫反應或呈特定形式之抗體。例如，常規地使用固相ELISA免疫分析來選擇與蛋白發生特異性免疫反應之抗體(關於可用於確定特異性免疫反應性之免疫分析模式及條件的說明，例如，參見Harlow及Lane，Antibodies,A Laboratory Manual(1988))。通常，特異性或選擇性結合反應將為至少兩倍背景信號或雜訊且更通常超過10倍至100倍背景。另一方面，當在提及與另一多核苷酸序列形成雙鏈複合體之多核苷酸序列之背景下使用時，術語「特異性結合」闡述基於Watson-Crick鹼基配對之「多核苷酸雜交」，如在用於術語「多核苷酸雜交方法」之定義中所提供。

本申請案中所用「增加」或「降低」係指數量相對於比較對照(例如，已建立標準對照，例如在非癌胃組織中發現之平均表現量之DACT1 mRNA或蛋白)之可檢測的正或負變化。增加係通常為至少10%、或至少20%、或50%、或100%之正變化，且可高至為對照值之至少2倍或至少5倍或甚至10倍。類似地，降低係通常為對照值之至少10%、或至少20%、30%、或50%、或甚至高至至少80%或90%之負變化。指示相對於比較基礎之數量變化或差異的其他術語(例如「更多」、「更少」、「更高」及「更低」)在本申請案中係以與上文所述相同之方式使用。相反，術語「實質上相同」或「實質上無變化」指示數量相對於標準對照值變化極小或無變化，通常與標準對照相差標準對照之±10%以內，或±5%、2%以內，或甚至相差更少。

本文所用「多核苷酸雜交方法」係指在合適雜交條件下以已知序列之多核苷酸探針根據預定多核苷酸形成Watson-Crick鹼基配對之能力來檢測該多核苷酸之存在及/或數量之方法。此等雜交方法之實例包括南方墨點、北方墨點及原位雜交。

本文所用「引子」係指可用於擴增方法(例如聚合酶鏈反應(PCR))中以基於對應於所關注基因(例如人類DACT1之cDNA或基因組序列或其一部分)之多核苷酸序列擴增核苷酸序列之寡核苷酸。通常，至少一種用於擴增多核苷酸序列之PCR引子對該多核苷酸序列具有序列特異性。引子之實際長度將端視許多因素(包括溫度、引子來源及所用方 法)而定。例如，對於診斷及預後應用而言，端視靶序列之複雜性而定，寡核苷酸引子通常含有至少10個、或15個、或20個、或25個或更多個核苷酸，但其可含有更少核苷酸或更多核苷酸。熟習此項技術者容易瞭解確定引子之合適長度中涉及之因素。特定實施例中所用引子示於本發明之表1中，其中指示其具體應用。在本發明中，術語「引子對」意指一對與靶DNA分子之相反鏈或與靶DNA之側接欲擴增核苷酸序列之區雜交的引子。在本發明中，術語「引子位點」意指靶DNA或其他核酸之與引子雜交之區域。

「標籤」、「可檢測標籤」或「可檢測部分」係可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理手段檢測之組成。例如，可用標籤包括³²P、螢光染料、電子緻密試劑、酶(例如，如ELISA中所通常使用)、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原及蛋白，該等半抗原及蛋白可藉由(例如)將放射性組份納入肽中來檢測，或用於檢測與肽特異性反應之抗體。通常，可檢測標籤係附接至探針或具有界定結合特性之分子(例如，具有已知結合特異性之多肽或多核苷酸)，以允許可容易地檢測探針(且因此其結合靶)之存在。

本文所用「標準對照」係指預定量或濃度之存於已建立正常無病組織試樣(例如，正常胃上皮組織試樣)中之多核苷酸序列或多肽，例如，DACT1 mRNA或蛋白。標準對照值適用於在本發明方法中用作比較測試試樣中存在之 DACT1 mRNA或蛋白量之基礎。用作標準對照之已建立試樣提供平均量之DACT1 mRNA或蛋白，即未患任何常規定義胃病(尤其胃癌)之一般健康人類的胃上皮組織試樣(例如，胃黏膜)中之典型量。標準對照值可隨試樣性質以及其他因素而變化，例如用來確立此一對照值之個體的性別、年齡、種族。

在闡述未患任何具有常規定義之胃病(尤其胃癌)之健康人類的背景中使用之術語「一般的」係指某些特性(尤其人類DACT1 mRNA或DACT1蛋白在人胃組織(例如，上皮組織或胃黏膜)中所發現之量)，其代表未患任何胃病(尤其胃癌)之健康人類的隨機選擇組。此選擇組應包含足夠多的人類，從而使得該等個體中DACT1 mRNA或蛋白在胃黏膜中之平均量可以適當精確度反映一般健康人群中之相應DACT1 mRNA/蛋白量。另外，所選擇組中人類之年齡一般與用於測試胃組織試樣中胃癌病徵之個體相似。此外，亦考慮諸如性別、種族、醫療史等其他因素，且在測試個體與選擇用於建立「一般」值之個體組之檔案中該等因素較佳係非常相近的。

本申請案中所用術語「量」係指存於試樣中之所關注多核苷酸或所關注多肽(例如，人類DACT1 mRNA或蛋白)之數量。此數量可表示為絕對性術語，即多核苷酸或多肽在試樣中之總量；或表示為相對性術語，即多核苷酸或多肽在試樣中之濃度。

本申請案中所用術語「治療(treat或treating)」闡述消 除、降低、緩解、逆轉相關病況之任何症狀，或預防或延遲其發作或復發之行為。換言之，「治療」病況涵蓋治療性及預防性幹預該病況。

本文所用術語「有效量」係指給定物質之數量足以產生期望效應之量。例如，編碼DACT1 mRNA之多核苷酸之有效量係該多核苷酸達成增加之DACT1蛋白表現或生物活性量以在已給予多核苷酸用於治療目的之患者中降低、逆轉、消除胃癌之症狀，預防或延遲其發作的量。足以達成此目的之量定義為「治療有效劑量」。劑量範圍隨所投與治療劑之性質及其他因素(例如投與途徑及患者病況之嚴重程度)而變化。

本文所用術語「個體」或「需要治療之個體」包括因具有胃癌風險或實際罹患胃癌而尋求醫療照顧之個體。個體亦包括當前正經受尋求操縱治療方案之療法之個體。需要治療之個體(subject或individual)包括彼等顯示胃癌症狀或具有罹患胃癌或其症狀之風險者。例如，需要治療之個體包括具有胃癌遺傳傾向或家族史之個體、彼等過去已罹患相關症狀者、彼等已暴露於觸發性物質或事件者，以及彼等罹患病況之慢性或急性症狀者。「需要治療之個體」可處於生命任何年齡。

DACT1蛋白之「抑制劑」、「活化劑」及「調節劑」分別用於指抑制性、活化性或調節性分子，其係使用針對DACT1蛋白結合或信號傳導之活體外及活體內分析來鑑別，例如，配體、激動劑、拮抗劑及其同源物及模擬物。 術語「調節劑」包括抑制劑及活化劑。抑制劑係(例如)部分或完全阻斷DACT1蛋白與碳水化合物結合、降低、預防、延遲DACT1蛋白活化、使DACT1蛋白不活化、不敏感或下調DACT1蛋白活性之試劑。在一些情形下，抑制劑直接或間接結合至DACT1蛋白，例如中和抗體。本文所用抑制劑與不活化劑及拮抗劑同義。活化劑係(例如)刺激、增加、促進、增強DACT1蛋白活化、使DACT1蛋白敏感或上調DACT1蛋白活性之試劑。調節劑包括DACT1蛋白配體或結合伴侶(包括天然配體之修飾形式及合成設計之配體)、抗體及抗體片段、拮抗劑、激動劑、小分子(包括含碳水化合物之分子)、siRNA、RNA適配體及諸如此類。

I.說明

胃癌患者通常因此疾病在其早期發展階段具有缺乏特異性症狀之性質而面對嚴峻預後。因此，胃癌之早期檢測對於增進患者存活率至關重要。

本發明者首次發現，DACT1蛋白之表現在胃癌細胞中受到抑制。DACT1蛋白之此受抑制表現歸因於DACT1基因組序列中、尤其基因之啟動子區中導致DACT1 mRNA轉錄降低之甲基化增加。此發現為檢測、監測及治療胃癌提供重要手段。

II.一般方法

採用分子生物學領域之常規技術來實踐本發明。揭示本發明中所用一般方法之基礎教科書包括Sambrook及Russell，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3 版，2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編輯，1994)。

核酸大小表示為千鹼基(kb)或鹼基對(bp)。該等核酸大小係源自瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、源自核酸定序或源自已公開DNA序列之估計值。蛋白大小表示為千道爾頓(kDa)或胺基酸殘基數。蛋白大小係自凝膠電泳、自蛋白定序、自衍生胺基酸序列或自已公開蛋白序列來估計。

可根據(例如)首先由Beaucage及Caruthers，Tetrahedron Lett. 22：1859-1862(1981)闡述之固相亞磷醯胺三酯法使用自動化合成儀以化學方式合成非市售寡核苷酸，如Van Devanter等人，Nucleic Acids Res. 12：6159-6168(1984)中所述。使用任何業內公認策略來實施對寡核苷酸之純化，例如非變性丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換型高效液相層析(HPLC)，如Pearson及Reanier,J.Chrom.255：137-149(1983)中所述。

本發明中所用所關注序列(例如人類DACT1基因及合成寡核苷酸(例如引子)之多核苷酸序列)可使用(例如)用於對雙鏈模板進行定序之鏈終止方法(Wallace等人，Gene 16：21-26(1981))來驗證。

III.組織試樣之獲得及DACT1 mRNA或DNA之分析

本發明係關於量測DACT1 mRNA在人胃組織、尤其胃上皮試樣中所發現之量或分析DACT1基因組DNA在人胃組織、尤其胃上皮試樣中所發現之甲基化模式，其作為手段 來檢測胃癌之存在、評價產生胃癌之風險及/或監測胃癌之進展或治療效果。因此，實踐本發明之第一步驟係自測試個體獲得胃上皮組織試樣並自試樣提取mRNA或DNA。

A.胃組織試樣之獲得及製備

自欲使用本發明方法測試或監測胃癌之人獲得胃組織試樣。根據醫院或診所通常遵循之標準方案(例如在內窺鏡檢查期間)自個體採集胃上皮組織試樣。採集合適量之胃上皮且可在進一步製備之前根據標準程序進行儲存。

根據本發明分析在患者胃上皮試樣中發現之DACT1 mRNA或DNA可使用(例如)胃黏膜來實施。製備用於核酸提取之組織試樣之方法為彼等熟習此項技術者所熟知。例如，個體胃黏膜試樣應首先經處理以破壞細胞膜，以釋放含於細胞內之核酸。

B. RNA之提取及定量

有多種方法可用於自生物試樣提取mRNA。可遵循製備mRNA之一般方法(例如Sambrook及Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，2001中所述)；亦可使用各種市售試劑或套組自測試個體之生物樣品獲得mRNA，例如Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)、Oligotex Direct mRNA套組(Qiagen,Valencia,CA)、RNeasy Mini套組(Qiagen,Hilden,Germany)及PolyATtract® 9600^TM系列(Promega,Madison,WI)。亦可使用一種以上該等方法之組合。

必要的是，應自RNA製劑清除所有污染性DNA。因此， 在擴增及定量步驟中應謹慎地處置試樣、使用DNA酶徹底處理，且使用適當的陰性對照。

1.對mRNA量之基於PCR之定量測定

在自試樣提取mRNA後，可對人類DACT1 mRNA之量進行定量。測定mRNA量之較佳方法係藉由(例如)聚合酶鏈反應(PCR)、尤其逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)實施之基於擴增的方法。

在擴增步驟之前，必須合成人類DACT1 mRNA之DNA拷貝(cDNA)。此係藉由逆轉錄來達成，逆轉錄可作為單獨步驟來實施，或在均相逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)中實施，此反應係聚合酶鏈反應之修改形式，用於擴增RNA。適於核糖核酸之PCR擴增之方法闡述於以下文獻中：Romero及Rotbart，Diagnostic Molecular Biology：Principles and Applications，第401-406頁；Persing等人編輯，Mayo Foundation,Rochester,MN,1993；Egger等人，J.Clin.Microbiol.33：1442-1447,1995；及美國專利第5,075,212號。

PCR之一般方法為業內所熟知，且因此本文中並未詳細闡述。關於PCR方法、方案及引子設計原理之綜述，參見(例如)Innis，等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press公司，N.Y.,1990。PCR試劑及方案亦可自商業供應商(例如Roche Molecular Systems)購得。

PCR最常係以自動化製程使用熱穩定酶來實施。在此製 程中，使反應混合物之溫度經由變性區、引子退火區及延伸反應區自動循環。專門適用於此目的之機器可自市面購得。

儘管在本發明實踐中通常使用PCR來擴增靶mRNA。然而，熟習此項技術者應瞭解，母血試樣中該等mRNA物質之擴增可藉由任一已知方法來完成，例如聯接酶鏈反應(LCR)、轉錄介導擴增及自我持續序列複製或基於核酸序列之擴增(NASBA)，其各自提供充分擴增。亦可使用最近研發出之分支DNA技術來定量測定mRNA標記在母血中之量。關於用於直接定量臨床試樣中之核酸序列的分支DNA信號放大之綜述，參見Nolte,Adv.Clin.Chem.33：201-235,1998。

2.其他定量方法

亦可使用彼等熟習此項技術者熟知之其他標準技術來檢測DACT1 mRNA。儘管通常在檢測步驟之前實施擴增步驟，但在本發明方法中不需要擴增。例如，可藉由尺寸分級分離(例如凝膠電泳)來鑑別mRNA，之前實施或不實施擴增步驟。根據熟知技術(例如，參見Sambrook及Russell，見上文)在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中運行試樣並用溴化乙啶進行標記後，若存在與標準對照相同尺寸之區帶則指示存在靶mRNA，隨後可基於區帶強度比較其與對照之量。或者，可使用對DACT1 mRNA具有特異性之寡核苷酸探針來檢測此mRNA物質之存在並基於探針所產生信號之強度來指示mRNA相對於標準對照之量。

序列特異性探針雜交係檢測包含其他種類核酸之特定核酸的熟知方法。在足夠嚴格之雜交條件下，探針僅與實質上互補之序列特異性雜交。可降低雜交條件之嚴格性以容忍不同量之序列錯配。

業內熟知多種雜交模式，包括(但不限於)溶液相、固相或混合相雜交分析。以下文獻提供對各種雜交分析模式之概述：Singer等人，Biotechniques 4：230,1986；Haase等人，Methods in Virology，第189-226頁，1984；Wilkinson,In situ Hybridization,Wilkinson編輯，IRL Press,Oxford University Press,Oxford；及Hames及Higgins編輯，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach,IRL Press,1987。

根據熟知技術來檢測雜交複合體。可藉由若干種通常用於檢測雜交核酸之存在的方法中之任一者來標記能與靶核酸(即mRNA或經擴增DNA)特異性雜交之核酸探針。一種常用檢測方法係使用經³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P或諸如此類標記之探針來實施放射自顯影。放射性同位素之選擇取決於研究者因所選同位素之易合成性、穩定性及半衰期而產生之偏好。其他標記包括與經螢光團、化學發光劑及酶標記之反配體或抗體結合之化合物(例如生物素及地高辛)。或者，探針可直接與諸如螢光團、化學發光劑或酶等標籤偶聯。標籤之選擇取決於所需靈敏度、與探針偶聯之容易程度、穩定性要求及可用儀器。

實踐本發明所需之探針及引子可使用熟知技術來合成及 標記。用作探針及引子之寡核苷酸可根據固相亞磷醯胺三酯法(首先闡述於Beaucage及Caruthers，Tetrahedron Letts.,22：1859-1862,1981中)使用自動化合成儀以化學方式來合成，如Needham-VanDevanter等人，Nucleic Acids Res.12：6159-6168,1984中所述。寡核苷酸之純化係藉由非變性丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換型HPLC來實施，如Pearson及Regnier,J.Chrom.,255：137-149,1983中所述。

C. DACT1基因組序列中之甲基化之檢測

研究DACT1基因組序列之含有一或多個CpG(胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸)對之區段之甲基化狀態以提供關於以下之指示：測試個體是否罹患胃癌、個體是否具有產生胃癌之風險或個體胃癌正在惡化抑或改善。

通常，分析DACT1基因組序列之包括5'未轉譯區(例如啟動子區)且包括一或多個CpG核苷酸對之區段的甲基化模式。例如，可使用SEQ ID NO：1或6或其一部分來測定序列內經甲基化之CpG對之數目及未經甲基化之CpG對之數目。所分析序列應足夠長以含有至少1個CpG二核苷酸對，且檢測此CpG位點之甲基化通常足以指示胃癌細胞之存在。所分析序列之長度通常為至少15個或20個鄰接核苷酸，且可更長，為至少25個、30個、50個、100個、200個、300個、400個或更多個鄰接核苷酸。在序列內存在至少一個、通常2個或更多個、通常3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或更多個CpG核苷酸對。在分析多個(2個或更多個)CpG位點之甲基化狀態之情形下，當顯示所分析 基因組序列內至少50% CpG對經甲基化時，認為所測試個體患有胃癌或產生胃癌之風險升高。例如，SEQ ID NO：1(DACT1基因組序列之區段，相對於轉錄起始位點之-556至-383)及SEQ ID NO：6(DACT1基因組序列之區段，自轉錄起始位點起-18至+102)含有若干CpG對。在取自胃癌之已建立胃癌細胞系及試樣中發現此區中之一些或大多數CpG對經甲基化，而非癌胃上皮細胞顯示極少(若有)甲基化CpG位點。出於確定DACT1基因組序列之甲基化模式之目的，亞硫酸氫鹽處理、之後DNA定序尤其有用，此乃因亞硫酸氫鹽將未經甲基化胞嘧啶(C)轉化成尿嘧啶(U)，同時使甲基化胞嘧啶保持不變，從而允許經由DNA定序方法進行立即鑑別。視情況，在亞硫酸氫鹽轉化之後且在DNA定序之前包括諸如PCR等擴增方法。

1. DNA之提取及處理

自生物試樣提取DNA之方法在分子生物學技術領域中眾所周知且係常規實踐，例如，參見Sambrook及Russell，見上文。應消除RNA污染以避免干擾DNA分析。然後用能以甲基化差異方式修飾DNA之試劑處理DNA，即，在處理後將自甲基化胞嘧啶(C)殘基及未經甲基化C殘基產生不同且可區分之化學結構。通常，此一試劑與DNA分子中之未經甲基化C殘基反應並將各未經甲基化C殘基轉化成尿嘧啶(U)殘基，而甲基化C殘基保持不變。此未經甲基化C→U轉化允許基於核酸一級序列之變化來檢測並比較甲基化狀態。適於此目的之實例性試劑係亞硫酸氫鹽，例如亞硫酸 氫鈉。使用亞硫酸氫鹽對DNA進行化學修飾之方法為業內所熟知(例如，參見Herman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826,1996)。

如熟習此項技術者將認識到，可使用在本文中未命名但具有以差異方式化學(或經由任何其他機制)修飾甲基化DNA及未經甲基化DNA之相同性質的任何其他試劑來實踐本發明。例如，DNA之甲基化特異性修飾亦可藉由甲基化敏感性限制酶來達成，該等甲基化敏感性限制酶中之一些通常裂解未經甲基化DNA片段，而非甲基化DNA片段，而其他(例如，甲基化依賴性內切核酸酶McrBC)裂解含有甲基化胞嘧啶之DNA，而非未經甲基化DNA。另外，可使用化學修飾與限制酶處理之組合(例如，經組合亞硫酸氫鹽限制分析，COBRA)(Xiong等人，1997 Nucleic Acids Res. 25(12)：2532-2534)來實踐本發明。檢測DNA甲基化之其他可用方法包括(例如)藉由南方墨點或PCR分析之甲基化敏感性限制內切核酸酶(MSRE)分析、甲基化特異性或甲基化敏感性-PCR(MS-PCR)、甲基化敏感性單核苷酸引子延伸(Ms-SnuPE)、高解析度熔化(HRM)分析、亞硫酸氫鹽定序、焦磷酸定序、甲基化特異性單鏈構形分析(MS-SSCA)、甲基化特異性變性梯度凝膠電泳(MS-DGGE)、甲基化特異性熔化曲線分析(MS-MCA)、甲基化特異性變性高效液相層析(MS-DHPLC)、甲基化特異性微陣列(MSO)。該等分析可為PCR分析、具有螢光標記之定量分析或南方墨點分析。實例性甲基化敏感性DNA裂解試劑 (例如限制酶)包括AatII、AciI、AclI、AgeI、AscI、Asp718、AvaI、BbrP1、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、EagI-HF^TM、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NarI、NgoMIV、NotI、NotI-HF^TM、NruI、Nt.BsmAI、PaeR7I、PspXI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SalI-HF^TM、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI或TspMI。

2.可選擴增及序列分析

在以甲基化差異方式修飾DNA後，然後使經處理DNA經受基於序列之分析，以使得可確定DACT1基因組序列之甲基化狀態。在甲基化特異性修飾後在序列分析前，擴增反應係可選的。多種多核苷酸擴增方法為業內公認且通常用於研究中。例如，聚合酶鏈反應(PCR)用於多核苷酸序列擴增之一般方法為業內所熟知，且因此本文中並未詳細闡述。關於PCR方法、方案及引子設計原理之綜述，參見(例如)Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press公司，N.Y.,1990。PCR試劑及方案亦可自商業供應商(例如Roche Molecular Systems)購得。

儘管本發明實踐中通常使用PCR擴增，但熟習此項技術者將認識到，相關基因組序列之擴增可藉由任何已知方法來達成，例如聯接鏈反應(LCR)、轉錄介導擴增及自我持 續序列複製或基於核酸序列之擴增(NASBA)，其各自提供充分擴增。

測定多核苷酸序列之技術亦為業內公認且在相關研究領域中廣泛實踐。例如，用於多核苷酸定序之基本原理及一般技術闡述於關於分子生物學及重組遺傳學之各種研究報告及論文中，例如Wallace等人，見上文；Sambrook及Russell，見上文；及Ausubel等人，見上文。可使用常規地實踐於研究實驗室中之人工或自動化DNA定序方法來實踐本發明。適於檢測多核苷酸序列中之變化(例如，C→U)用於實踐本發明方法之其他手段包括(但不限於)質譜、引子延伸、多核苷酸雜交、即時PCR、熔化曲線分析、高解析度熔化分析、異源雙鏈體分析、焦磷酸定序及電泳。

IV.多肽之定量 A.獲得試樣

實踐本發明之第一步驟係自測試、評價或監測胃癌、產生胃癌之風險或該病況之嚴重程度/進展之個體獲得胃上皮試樣。相同類型之試樣應取自對照組(未罹患任何胃部病症、尤其贅瘤形成之正常個體)及測試組(例如，測試可能患有胃癌之個體)二者。對於此目的，通常遵循醫院或診所常用之標準程序，如前一部分中所述。

出於在測試個體中檢測胃癌之存在或評價產生胃癌之風險之目的，可獲取個別患者之胃黏膜試樣，且可量測人類DACT1蛋白之量並隨後與標準對照進行比較。若當與對照量比較時觀察到人類DACT1蛋白之量降低，則認為測試個 體患有胃癌或產生該病況之風險升高。出於在胃癌患者中監測疾病進展或評價治療有效性之目的，可於不同時間點獲取個別患者之胃上皮試樣，以使得可量測人類DACT1蛋白量，以提供指示疾病狀態之資訊。例如，當患者之DACT1蛋白量顯示隨時間增加之一般趨勢時，認為患者在胃癌嚴重程度方面有所改善或認為患者已接受之療法係有效的。另一方面，患者之DACT1蛋白量無變化或持續降低之趨勢將指示病況惡化及給予患者之療法之無效性。通常，在患者中觀察到較低DACT1蛋白量指示患者罹患較嚴重形式之胃癌且該疾病之預後較差，如以較短預期壽命、較高轉移率、抗治療性等所顯示。

B.製備用於DACT1蛋白檢測之試樣

來自個體之胃組織試樣適於本發明，且可藉由熟知方法獲得且如前一部分中所述。在本發明之某些應用中，胃黏膜可為較佳試樣類型。

C.確定人類DACT1蛋白量

任何特定一致性之蛋白(例如DACT1蛋白)可使用多種免疫學分析檢測。在一些實施例中，三明治(sandwich)分析可藉由利用對多肽具有特異性結合親和力之抗體自測試試樣捕獲多肽來實施。然後可利用對多肽具有特異性結合親和力之經標記抗體來檢測該多肽。此等免疫學分析可使用諸如微陣列蛋白晶片等微流體裝置來實施。所關注蛋白(例如，人類DACT1蛋白)亦可藉由凝膠電泳(例如2維凝膠電泳)及西方墨點分析使用特異性抗體來檢測。或者，可 使用標準免疫組織化學技術使用合適抗體來檢測給定蛋白(例如，人類DACT1蛋白)。單株及多株抗體二者(包括具有期望結合特異性之抗體片段)可用於特異性檢測多肽。此等抗體及其與特定蛋白(例如，人類DACT1蛋白)具有特異性結合親和力之結合片段可藉由已知技術產生。

亦可採用其他方法來量測實踐本發明中之DACT1蛋白量。例如，已基於質譜技術研發多種方法以甚至在大量試樣中快速且精確地定量靶蛋白。該等方法涉及高度精細之設備，例如使用多重反應監測(MRM)技術之三段四極(三段Q)儀器、基質輔助雷射去吸附/離子化飛行時間串聯質譜儀(MALDI TOF/TOF)、使用選擇性離子監測(SIM)模式之離子阱儀器及基於電噴射離子化(ESI)之QTOP質譜儀。例如，參見Pan等人，J Proteome Res.2009年2月；8(2)：787-797。

V.建立標準對照

為建立用於實踐本發明方法之標準對照，首先選擇未患任何具有常規定義之胃病(尤其任何形式之腫瘤，例如胃癌)之健康個體組。該等個體具有出於使用本發明方法篩選及/或監測胃癌之目的之合適參數(若適用)。視情況，該等個體具有相同性別、相似的年齡或相似的種族背景。

藉由業內公認的常用方法來確認所選個體之健康狀況，該等方法包括(但不限於)對個體之一般體格檢查及對其醫療史之全面審查。

此外，所選健康個體組必須具有適當大小，以使得可合 理地將人類DACT1 mRNA或DACT1蛋白在得自該組之胃組織試樣中之平均量/濃度視作一般健康人群中正常或平均量之代表。較佳地，所選組包含至少10個人類個體。

在根據所選健康對照組之各個體中發現之個別值確立DACT1 mRNA或DACT1蛋白之平均值後，可將此平均或中值或代表性值或譜視作標準對照。在該過程期間亦測定標準偏差。在一些情形下，對於單獨定義之具有諸如年齡、性別或種族背景等獨特特性之組可建立單獨的標準對照。

VI.胃癌之治療

藉由闡釋DACT1蛋白之受抑制表現與胃癌之相關性，本發明進一步提供藉助增加DACT1蛋白表現或生物活性來治療罹患胃癌之患者之手段。本文所用治療胃癌涵蓋降低、逆轉、減輕或消除胃癌之一或多種症狀，以及預防或延遲一或多種相關症狀之發作。

A.增加DACT1表現或活性 1.編碼DACT1蛋白之核酸

可經由使用編碼功能DACT1蛋白之核酸來增強DACT1基因表現。此等核酸可為可在有利條件下轉譯成DACT1蛋白之活性形式之單鏈核酸(例如mRNA)或雙鏈核酸(例如DNA)。

在一個實施例中，編碼DACT1之核酸係以通常重組產生之表現盒形式提供，該表現盒具有可操作地連接至編碼DACT1蛋白之多核苷酸序列之啟動子。在一些情形下，啟動子係引導全部或多數組織類型中之基因表現之通用啟動 子；在其他情形下，啟動子係特異性地引導上皮細胞、尤其胃上皮中之基因表現者。投與此等核酸可增加靶組織(例如，胃上皮)中之DACT1蛋白表現。由於人類DACT1基因cDNA序列稱為Genbank登錄號：NM_016651且在本文中以SEQ ID NO：3提供，因此可自該序列、該等序列之物種同源物及變體獲取編碼DACT1之適宜核酸。

2. DACT1蛋白

藉由直接向罹患胃癌且展現受抑制DACT1蛋白表現或活性之患者投與有效量之活性DACT1蛋白，亦可有效地治療該疾病。例如，此可藉由向罹患胃癌之患者投與重組產生之具有生物活性之DACT1蛋白達成。用於遞送基於蛋白或多肽之治療劑之調配物及方法為業內所熟知。

3. DACT1蛋白之活化劑

增加之DACT1蛋白活性可利用能活化DACT1蛋白表現或增強DACT1蛋白之活性之試劑達成。例如，去甲基化劑(例如，5-Aza)能夠藉由去除因此基因之啟動子區甲基化所引起DACT1基因表現之抑制來活化DACT1基因表現。其他活化劑可包括對DACT1啟動子及/或增強子具有特異性之轉錄活化劑。此等活化劑可使用本文實例中所述DACT1表現分析篩選並鑑別。

DACT1蛋白激動劑(例如活化抗體)係DACT1蛋白之另一類活化劑。此等活化劑係藉由通常(但未必)藉由與DACT1蛋白及/或其相互作用蛋白直接結合以增強DACT1蛋白之生物活性來作用。此等激動劑之初步篩選可以結合分析開 始用於鑑別與DACT1蛋白物理相互作用之分子。

B.醫藥組合物 1.調配物

本發明化合物可用於製造醫藥組合物或藥劑。可向個體投與醫藥組合物或藥劑用於治療胃癌。

本發明中所用化合物(例如，DACT1蛋白、編碼DACT1蛋白之核酸或DACT1基因表現活化劑)可用於製造包含其有效量以及或與適於施加之賦形劑或載劑之混合物之醫藥組合物或藥劑。

用於增強DACT1表現之實例性醫藥組合物包含(i)包含編碼本文所述人類DACT1蛋白之多核苷酸序列之表現盒，及(ii)醫藥上可接受之賦形劑或載劑。術語醫藥上可接受及生理學上可接受在本文中係同義使用。表現盒可以治療有效劑量提供用於本文所述治療方法中。

DACT1蛋白或編碼DACT1蛋白之核酸可經由脂質體投與，該等脂質體用於將偶聯物靶向特定組織，以及延長組合物之半衰期。脂質體包括乳液、發泡體、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散液、層狀層及諸如此類。在該等製劑中，將欲遞送抑制劑作為脂質體之一部分單獨或結合其所結合之分子(例如，盛行於靶細胞(例如，皮膚細胞)中之受體)或其他治療或免疫原性組合物納入。因此，可將填充有本發明期望抑制劑之脂質體引導至治療部位，其中脂質體然後遞送所選抑制劑組合物。自標準囊泡形成脂質形成用於本發明中之脂質體，該等脂質通常包括中性及帶負 電磷脂及固醇，例如膽固醇。脂質之選擇通常係藉由考慮(例如)脂質體大小、酸不穩定性及脂質體在血流中之穩定性來指導。多種方法可用於製備脂質體，如(例如)Szoka等人(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467；美國專利第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號中所述。

用於本發明中之醫藥組合物或藥劑可藉由標準技術使用一或多種生理學上可接受之載劑或賦形劑來調配。適宜醫藥載劑闡述於本文中及E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。本發明之化合物及試劑及其生理學上可接受之鹽及溶劑合物可經調配以供藉由任何適宜途徑投與，該途徑包括經由吸入、局部、鼻、口、非經腸或直腸。

用於局部投與之典型調配物包括乳膏、軟膏、噴霧劑、洗劑及貼片。然而，醫藥組合物可經調配用於任何類型之投與，例如，皮內、皮下、靜脈內、肌內、鼻內、大腦內、氣管內、動脈內、腹膜內、膀胱內、胸膜內、冠狀動脈內或瘤內注射，其中利用注射器或其他裝置。亦涵蓋藉由吸入(例如，氣溶膠)投與或用於經口、直腸或陰道投與之調配物。

2.投與途徑

用於局部施加(例如，施加至皮膚及眼)之適宜調配物較佳係業內熟知之水溶液、軟膏、乳膏或凝膠。此等調配物可含有增溶劑、穩定劑、增滲劑、緩衝劑及防腐劑。

用於經皮施加之適宜調配物包括有效量之本發明化合物 或試劑與載劑。較佳載劑包括醫藥上可接受之可吸收溶劑以輔助穿過宿主皮膚。例如，經皮裝置係呈繃帶形式，該繃帶包含背襯元件；含有該化合物(視情況具有載劑)之儲液器；視情況包含速率控制障壁以便以受控且預定之速率長時間將化合物遞送至宿主皮膚；及將裝置固定至皮膚之構件。亦可使用基質經皮調配物。

對於經口投與而言，醫藥組合物或藥劑可呈(例如)藉由習用手段利用醫藥上可接受之賦形劑製備之錠劑或膠囊形式。較佳者係包含活性成份(即，DACT1蛋白或編碼DACT1蛋白之核酸)以及以下物質之錠劑及明膠膠囊：(a)稀釋劑或填充劑，例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素(例如，乙基纖維素、微晶纖維素)、甘胺酸、果膠、聚丙烯酸酯及/或磷酸氫鈣、硫酸鈣；(b)潤滑劑，例如，二氧化矽、滑石粉、硬脂酸、其鎂或鈣鹽、金屬硬脂酸鹽、膠體二氧化矽、氫化植物油、玉米澱粉、苯甲酸鈉、乙酸鈉及/或聚乙二醇；對於錠劑而言，亦及(c)結合劑，例如，矽酸鎂鋁、澱粉膏糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯基吡咯啶酮及/或羥丙基甲基纖維素；若需要，(d)崩解劑，例如，澱粉(例如，馬鈴薯澱粉或澱粉鈉)、羥乙酸鹽、瓊脂、海藻酸或其鈉鹽、或泡騰劑混合物；(e)潤濕劑，例如，月桂基硫酸鈉、及/或(f)吸收劑、著色劑、矯味劑及甜味劑。

鈉劑劑可根據業內已知方法包膜或包衣。用於經口投與之液體製劑可呈(例如)溶液、糖漿或懸浮液形式，或其可 以乾燥產物提供以在使用前用水或其他適宜媒劑構造。此等液體製劑可藉由習用手段利用醫藥上可接受之添加劑製備，該等添加劑係(例如)懸浮劑，例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪；乳化劑，例如，卵磷脂或阿拉伯膠(acacia)；非水性媒劑，例如，杏仁油、油酯、乙基醇或分級分離植物油；及防腐劑，例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸。該等製劑亦可視需要含有緩衝鹽、矯味劑、著色劑及/或甜味劑。若需要，用於經口投與之製劑可適宜地經調配以獲得活性化合物之受控釋放。

本發明之化合物及試劑可經調配以供藉由注射(例如藉由濃注或連續輸注)實施非經腸投與。注射用調配物可以單位劑型提供，例如，存於安瓿中或存於多劑量容器中，且添加有防腐劑。可注射組合物較佳係等滲水溶液或懸浮液，且栓劑較佳係自脂肪乳液或懸浮液製備。該等組合物可經滅菌及/或含有佐劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、溶液促進劑、調節滲透壓之鹽及/或緩衝劑。或者，活性成份可呈粉末形式，以供在使用前用適宜媒劑(例如，無菌無致熱物之水)構造。另外，其亦可含有其他治療上有價值之物質。該等組合物分別係根據習用混合、造粒或塗佈方法製備，且含有約0.1%至75%、較佳約1%至50%之活性成份。

對於藉由吸入投與而言，活性成份(例如，DACT1蛋白或編碼DACT1蛋白之核酸)可藉助適宜推進劑(例如，二氯 二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適宜氣體)便利地以氣溶膠噴霧呈現形式自加壓包裝或霧化器遞送。在加壓氣溶膠之情形下，劑量單位可藉由提供遞送計量量之閥來測定。用於吸入器或吹入器中之(例如)明膠膠囊及藥筒可調配為含有化合物與適宜粉末基質(例如，乳糖或澱粉)之粉末混合物。

抑制劑亦可調配於直腸組合物(例如，含有(例如)習用栓劑基質(例如，可可油或其他甘油酯)之栓劑或保留灌腸劑)中。

此外，活性成份可調配成儲積製劑。此等長效調配物可藉由植入(例如，經皮下或肌內)或藉由肌內注射投與。因此，例如，活性成份可用適宜聚合或疏水材料(例如作為存於可接受之油中之乳液)或離子交換樹脂調配，或作為微溶衍生物(例如，作為微溶鹽)。

本發明醫藥組合物或藥劑包含(i)有效量之增加DACT1蛋白之量或活性的本文所述化合物及(ii)另一治療劑。當與本發明化合物使用時，此治療劑可個別地、依序地或與一或多種其他此等治療劑(例如，第一治療劑、第二治療劑及本發明化合物)組合使用。可藉由相同或不同投與途徑或以相同醫藥調配物一起投與。

3.劑量

可以治療有效劑量向個體投與醫藥組合物或藥劑以預防、治療或控制本文所述胃癌。以足以在個體中誘發有效治療反應之量向個體投與醫藥組合物或藥劑。

所投與活性劑之劑量取決於個體之體重、年齡、個體狀況、所欲治療區域之表面積或體積及投與形式。劑量大小亦可藉由伴有特定個體中特定化合物之投與之任何不良效應的存在、性質及程度來測定。例如，各類型之DACT1蛋白或編碼DACT1蛋白之核酸將可能具有獨特劑量。經口投與哺乳動物之約50 kg至70 kg之單位劑量可含有介於約5 mg與500 mg間之活性成份。通常，本發明活性化合物之劑量係足以達成期望效應之劑量。最佳給藥方案可自個體體內之藥劑累積之量測計算。一般而言，劑量可每日、每週或每個月給予一次或多次。熟習此項技術者可容易地確定最佳劑量、給藥方法及重複率。

為達成期望治療效應，化合物或試劑可以治療有效每日劑量投與多日。因此，治療有效投與化合物以治療個體之本文所述相關病況或疾病需要持續在3天至兩週或更長時間範圍內之時段之週期性(例如，每日)投與。通常，所投與藥劑將持續至少連續3天，通常持續至少連續5天，更通常持續至少10天，且有時持續連續20天、30天、40天或更多天。儘管每日連續劑量係達成治療有效劑量之較佳途徑，但即使不每日投與藥劑，亦可達成治療有益效應，只要重複投與之頻率足以維持藥劑在個體中之治療有效濃度即可。例如，可每隔一日、每隔三日或(若採用更高劑量範圍且個體耐受該等劑量範圍)每週一次投與藥劑。

此等化合物或試劑之最佳劑量、毒性及治療效果可端視個別化合物或試劑之相對效能而變化，且可藉由標準醫藥 程序在細胞培養物或實驗動物中(例如)藉由測定LD₅₀(導致50%群體死亡之劑量)及ED₅₀(對50%群體治療有效之劑量)來測定。毒性效應與治療效應間之劑量比係治療指數且可表示為比率LD₅₀/ED₅₀。展現大治療指數之藥劑較佳。儘管可使用展現毒性副效應之藥劑，但應小心設計遞送系統，該遞送系統使此等藥劑靶向受影響組織部位以將對正常細胞之潛在損害最小化，且藉此降低副效應。

可使用自(例如)細胞培養分析及動物研究獲得之數據來調配用於人類之劑量範圍。此等化合物之劑量較佳在具有較少毒性或沒有毒性之循環濃度(包括ED₅₀)範圍內。該劑量可在取決於所用劑型及投與途徑之此範圍內變化。對於本發明方法中所用任何藥劑而言，可首先自細胞培養分析估計治療有效劑量。可在動物模型中調配劑量以達成循環血漿濃度範圍(包括IC₅₀，達成症狀之半最大抑制之藥劑之濃度)，如在細胞培養中所測定。此資訊可用於更精確地確定可用於人類之劑量。可藉由(例如)高效液相層析(HPLC)量測在血漿中之量。一般而言，對於典型個體而言，藥劑之劑量當量係約1 ng/kg至100 mg/kg。

提供本文所述DACT1蛋白或編碼DACT1蛋白之核酸之實例性劑量。編碼DACT1之核酸(例如表現盒)之劑量可介於0.1 mg/眼與0.5 mg/眼之間，且經玻璃體內投與(例如，5 mg/kg至30 mg/kg)。小有機化合物活化劑可以介於5 mg與1000 mg之間經口或以介於10 mg/ml與500 mg/ml之間藉由靜脈內輸注投與。單株抗體活化劑可以50 mg/ml至500 mg/ml(經120分鐘)、1 mg/kg至500 mg/kg(經60分鐘)或1 mg/kg至100 mg/kg(濃注)藉由靜脈內注射或輸注每週投與5次。DACT1蛋白或肽活化劑可以10 mg至500 mg經皮下、0.1 mg/kg至500 mg/kg經靜脈內每日兩次、或約50 mg每週一次、或25 mg每週兩次投與。

本發明醫藥組合物可單獨或與至少一種其他治療化合物組合投與。實例性有利治療化合物包括全身性及局部抗炎劑、止痛劑、抗組胺劑、麻醉性化合物及諸如此類。其他治療化合物可於與主要活性成份(例如，DACT1蛋白或編碼該蛋白之核酸)相同之時間或甚至在具有該主要活性成份之相同組合物中投與。其他治療化合物亦可在單獨組合物中或在與主要活性成份不同之劑型中單獨地投與。主要成份(例如DACT1蛋白或編碼DACT1蛋白之核酸)之一些劑量可於與其他治療化合物相同之時間投與，而其他劑量係單獨地投與，此取決於個體之特定症狀及特性。

本發明醫藥組合物之劑量可在治療中進行調節，此取決於症狀之嚴重程度、復發頻率及對治療方案之生理學反應。彼等熟習此項技術者通常參與治療方案中之此等調節。

VII.套組及裝置

本發明提供用於實踐本文所述方法之組合物及套組以評價個體中DACT1 mRNA或DACT1蛋白之量，其可用於各種目的，例如在患者中檢測或診斷胃癌之存在、確定產生胃癌之風險及監測胃癌之進展。

實施分析以測定DACT1 mRNA量之套組通常包括至少一種可用於與DACT1編碼序列或其互補序列之至少一個區段特異性雜交的寡核苷酸。視情況，此寡核苷酸經可檢測部分標記。在一些情形下，套組可包括至少兩種可用於藉由PCR(尤其RT-PCR)擴增DACT1 DNA或mRNA之至少一個區段的寡核苷酸引子。

用於實施分析以測定DACT1蛋白量之套組通常包括至少一種可用於特異性結合DACT1蛋白胺基酸序列之抗體。視情況，此抗體經可檢測部分標記。抗體可為單株抗體或多株抗體。在一些情形下，套組可包括至少兩種不同抗體，一種用於特異性結合DACT1蛋白(即，一級抗體)且另一種用於檢測一級抗體(即，二級抗體)，另一種通常附接至可檢測部分。

通常，套組亦包括合適標準對照。標準對照指示未罹患胃癌之健康個體胃上皮中DACT1蛋白或DACT1 mRNA之平均值。在一些情形下，此標準對照可以設定值形式提供。另外，本發明套組可提供說明手冊以指導使用者分析測試試樣及評價測試個體中胃癌之存在、風險或狀態。

在又一態樣中，本發明亦可包括於能實施本文所述所有或一些方法步驟之裝置或包含一或多個該等裝置之系統中。例如，在一些情形下，該裝置或系統在接受取自所測試個體之胃組織試樣(例如，胃黏膜試樣)後實施以下步驟以檢測胃癌、評價產生胃癌之風險或監測該病況之進展：(a)測定試樣中DACT1 mRNA、DACT1蛋白之量或濃度； (b)比較該量或濃度與標準對照值；及(c)提供輸出來指示該個體中是否存在胃癌，或該個體是否具有產生胃癌之風險，或該個體之胃癌病況是否有變化(即，惡化或改善)。在其他情況下，本發明裝置或系統在已實施步驟(a)且已將步驟(a)之量或濃度輸入裝置中後實施步驟(b)及(c)之任務。較佳地，裝置或系統部分或完全自動化。

實例

僅以說明性而非限制性方式提供以下實例。熟習此項技術者可容易地瞭解多個非關鍵參數，可對該等參數進行改變或修改而獲得基本上相同或相似之結果。

材料及方法 人類胃樣品 組織試樣

於1999年1月至2006年12月，自205名於中山大學第一附屬醫院(中國廣州)診斷之胃癌患者獲得石蠟包埋腫瘤組織試樣。另外，招募20名具有正常上部胃鏡檢查之年齡匹配個體作為對照。研究方案經中山大學醫學院臨床研究倫理委員會(Clinical Research Ethics Committee of the Sun Yat-sen University of Medical Sciences)批準。

腫瘤細胞系

在此研究中使用十個胃癌細胞系(AGS、Kato III、MKN28、MKN45、N87、SNU1、SNU16、SNU719、BGC823及MGC803)及一個正常胃上皮細胞系(GES1)。將細胞系維持在具有10%胎牛血清之RPMI-1640或DMEM培 養基(Gibco BRL,Rockville,MD)中。

基因表現分析 RNA分離

使用Qiazol試劑(Qiagen,Valencia,CA,USA)分離總RNA。首先，將約5-10×10⁶個細胞或30 mg組織在1 mL Qiazol試劑中均質化且在室溫下培育10 min。對於各試樣而言，添加0.2 mL氯仿。應將混合物劇烈搖盪15 sec並置於室溫下再保持3 min。在4℃下將試樣以12,000 g離心20 min並分離成兩層。將含有RNA之上層水相轉移至新管，與0.7 ml異丙醇混合，在室溫下培育10 min且隨後在4℃下以12,000 g離心10 min。在丟棄上清液後，用1 mL 75%乙醇將RNA顆粒洗滌兩次；風乾5 min且用無RNase之H₂O使RNA再溶解。藉由無RNase之DNaseI消化(GE Healthcare,Buckinghamshire,England)消除DNA污染。藉由在260 nm/280 nm下使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)量測吸光度來測定總RNA之品質及數量。將經純化RNA儲存在-80℃下直至使用。

cDNA合成

使用MultiScribe逆轉錄酶套組(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)來合成cDNA。反應混合物含有1×反轉錄酶緩衝液、1×dNTP、1×隨機引子(由套組供應)、2.5 U/μL逆轉錄酶、1 U/μL RNase抑制劑及2 μg總RNA。將混合物在25℃下培育10 min，然後在37℃下培育120 min，隨 後在85℃下培育5 min，以使該酶不活化。將cDNA儲存在-80℃下直至另一應用。

半定量逆轉錄PCR(RT-PCR)

在總體積為25 μL之反應物中實施半定量RT-PCR，該反應物含有GeneAmp 1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems)、2.5 mM MgCl₂、200 μM各dNTP、200 nM各引子、0.5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)及30 ng至50 ng cDNA。PCR程式以在95℃下初始變性10 min開始，之後經32個至35個循環(94℃保持30 sec，退火溫度保持30 sec，及72℃保持30 sec)擴增，在72℃下最終延伸10 min。使PCR條帶在紫外光下顯現並攝影。藉由管家基因β-肌動蛋白(其用作內部對照)之表現將靶基因之表現正規化。用於擴增轉錄物之全部引子列示於表1中。

DNA甲基化分析 基因組DNA提取

藉由使用DNA微型套組(Qiagen)根據套組方案分離來自GC細胞系及組織試樣之基因組DNA。在56℃下將約25 mg試樣於1.5 mL微量離心管中之180 μL QIAamp ATL緩衝液及20 μL蛋白酶K中溶解1小時。添加4微升RNase A(100 mg/ml,QIAgen)且藉由脈衝渦流混合15 s，之後在室溫下培育2 min。然後將200 μL AL緩衝液添加至溶解物且在70℃下將試樣培育10 min。在添加200 μL無水乙醇後，藉由脈衝渦流將溶液混合15 s。然後經由製造商指定之QIAamp管柱純化溶解物。在200 μL無DNase之H₂O中稀釋 基因組DNA。藉由在260 nm/280 nm下使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop)量測吸光度來測定DNA之品質及數量。

亞硫酸氫鈉轉化

用偏亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，如由Tao等人，2002,Hum.Mol.Genet.,11(18)：2091-2101所述。簡言之，將存於30 μL TE緩衝液(Sigma-Aldrich)中之5 μg基因組DNA與3.3 μL 3 mM NaOH混合至0.3 mM之最終濃度且在37℃下培育15 min。將變性DNA與333 μL亞硫酸氫鹽溶液混合且在55℃下在黑暗中處理4 hr。亞硫酸氫鹽溶液製備成2.4 M偏亞硫酸氫鈉(pH 5.0-5.2)(Sigma-Aldrich)及0.5 mM氫醌(Sigma-Aldrich)。使用Qiaex II套組(Qiagen)根據由該套組供應之方案將經處理DNA去鹽並純化。然後在37℃下用0.3 M NaOH將DNA處理15 min且用3 M乙酸銨及3體積乙醇沈澱。將所回收DNA溶解於100μL TE緩衝液(pH 8.0)中並儲存在-20℃下。

使用5-氮雜-2'-去氧胞苷(「5-Aza」)實施去甲基化處理

以1x10⁵個/100 mm盤之密度接種細胞且使其生長24 hr。然後用2 μM 5-氮雜-2'-去氧胞苷(「5-Aza」)(Sigma-Aldrich)將細胞處理5日。每日補充5-Aza。使用半定量RT-PCR評估DACT1之基因表現。

甲基化特異性PCR(MSP)

設計甲基化特異性及未經甲基化特異性引子以評價GC細胞系中之甲基化狀態。用於PCR之混合物含有1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems)、2 mM MgCl₂、200 μM各 dNTP、600 nM各引子、0.5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)及20 ng亞硫酸氫鹽處理DNA。PCR程式係95℃保持10 min，之後經38個循環(94℃保持30 sec，60℃保持30 sec，及72℃保持30 sec)擴增，在72℃下最終延伸5 min。在紫外光下觀察MSP條帶並攝影。

直接亞硫酸氫鹽基因組定序(BGS)

用列示於表1中之引子擴增亞硫酸氫鹽處理DNA。對2 μL亞硫酸氫鹽處理DNA進行PCR擴增獲得約170 bp之PCR產物，該產物在DACT1啟動子區含有9個CpG二核苷酸。對擴增BGS產物實施定序。藉由SeqScape軟體(Applied Biosystems,Foster City,CA)實施定序分析。

陣列比較基因組雜交(陣列CGH)

使用不同螢光團差異標記來自五個胃癌細胞系(MKN45、MKN28、KatoIII、N87、SUN1)及正常胃組織參照試樣之DNA，且使其與陣列-CGH(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)雜交。藉由Agilent G4175AA CGH Analytics 3.4(Agilent Technologies)分析結果。然後計算胃癌細胞系對正常參照DNA之螢光強度之比率以評價基因組中特定位置之拷貝數變化。採用兩個探針來檢測DACT1基因之拷貝數變化：基因座I係位於chr14處，自58177255至58177309，基因座II係位於chr14處，自58179290至58179349。

生物功能分析 DACT1α之選殖及表現載體之構築

藉由PCR選殖產生DACT1α基因表現載體之全長cDNA。將來自人類胃(Ambion,Austin,TX,USA)之總RNA逆轉錄成cDNA。藉由PCR擴增對應於DACT1α之開放閱讀框(ORF)之序列。將PCR產物選殖至pCDNA3.1表現載體及pBABE-嘌呤黴素(puro)載體中。

DACT1α基因轉染

將細胞以約6×10⁵個細胞接種於無抗生素之6孔板上，並保持約24 hr，直至細胞密度達到約90%鋪滿。然後分別用2 μg DACT1α及對照載體(pCDNA3.1)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染細胞。在室溫下將在125 μL Opti-MEM(Invitrogen)中稀釋之Lipofectamine 2000(6.0 μL)培育5 min。然後，合併在125 μL Opti-MEM中稀釋之質粒DNA與Lipofectamine混合物。在37℃下於5% CO₂培育器中培育24 hr至48 hr後，收穫細胞用於測試轉基因表現。對於穩定細胞系而言，將細胞以1：10比率繼代至具有適當濃度之新黴素(neomycin)(G418)(Invitrogen)之新鮮生長培養基中。在14日至21日選擇後，收穫穩定轉染細胞用於功能分析。

集落形成分析

在轉染後兩日，隨後使細胞於具有RPMI1640之6孔板上於含有500 μg/mL新黴素(G418)之10% FBS中以1：20比率分裂。在14日至18日選擇後，用70%乙醇將細胞固定10 min並用0.5%結晶紫溶液染色10 min。對每集落具有超過50個細胞之集落計數。實施三次獨立的重複實驗。

膜聯蛋白V細胞凋亡分析

膜聯蛋白V係可在已發生細胞凋亡後且在已失去膜完整性之前結合細胞膜之蛋白。使用膜聯蛋白V及7-胺基-放線菌素(7-AAD)雙染色評估凋亡細胞之比例。簡言之，將用1×PBS洗滌之細胞懸浮於含有與Alexa Fluor 488(Invitrogen)及2 μL 7-AAD染色劑偶聯之5 μL膜聯蛋白V之100 μL冰冷膜聯蛋白結合緩衝液(10 mM HEPES、140 mM NaCl及2.5 mM CaCl₂，pH 7.4)中。在室溫下培育15 min後，將細胞與額外400 μL冰冷膜聯蛋白結合緩衝液混合並使用流式細胞術分析。

細胞鋪展分析及F-肌動蛋白染色

藉由胰蛋白酶化採集經pcDNA3.1-DACT1或pcDNA3.1細胞穩定轉染之BGC823及MGC803，用DMEM培養基洗滌兩次且再懸浮於蓋玻片及培養板上。使細胞在DMEM中鋪展6 h，並隨後攝影。用3%多聚甲醛將具有鋪展細胞之蓋玻片固定用於F-肌動蛋白染色。藉由Triton X-100使蓋玻片上之細胞透化且隨後實施封阻。對於F-肌動蛋白染色而言，用羅丹明鬼筆環肽(Rhodamine phalloidin)(Invitrogen)將細胞染色。最後，洗滌細胞並用含有DAPI之封固劑(Vector Laboratories,Burlingame,CA)封固。藉由螢光顯微術捕獲影像。

細胞遷移及侵襲分析

實施傷口癒合分析以分析細胞遷移。將經pcDNA3.1-DACT1或pcDNA3.1對照載體穩定轉染之AGS及MGC803接 種至6孔培養板中。在24 h後，利用塑膠吸管端手動刮出單層細胞且隨後用PBS洗滌。在培育後0及24 h對細胞攝影(相差顯微鏡)。量測細胞在非細胞區域之兩個邊界間移動之距離且將DACT1轉染組結果表示為對pcDNA3.1轉染細胞之比率。為量測細胞侵襲活性，使用BD BioCoat^TM減少生長因子基質膠^TM侵襲室(BD Biosciences)進行Transwell分析。

活體內致腫瘤性

對於逆轉錄病毒之產生而言，使用pBABE-嘌呤黴素-DACT1α或pBABE-嘌呤黴素空載體、兩種包裝質粒pUMVC(Addgene)及pCMV-VSV-G(Addgene)以1：0.9：0.1之比率對293FT細胞(Invitrogen)進行共轉染。於轉染後24小時，用新鮮培養基進給細胞。於轉染後48小時，收穫含有逆轉錄病毒pBABE-嘌呤黴素-DACT1α或pBABE-嘌呤黴素對照之上清液並將其儲存在-80℃下。為產生穩定的表現DACT1α之細胞系或對照細胞系，將含有逆轉錄病毒pBABE-嘌呤黴素-DACT1α或pBABE-嘌呤黴素對照之上清液添加至BGC823細胞。在24小時轉導後，移出含有逆轉錄病毒之培養基並更換為含有0.5 μg/ml抗生素嘌呤黴素(Invitrogen)之新鮮培養基以供選擇。將穩定的表現DACT1之BGC823細胞或對照BGC823細胞(5×10⁵個存於0.2 mL PBS中之細胞)經皮下單獨注射至4只4週齡雄性Balb/c裸小鼠之左或右背側中(4只/組)。每3日量測腫瘤直徑直至3週。藉由量測腫瘤之最長及最短直徑並進行如下計算來估 計腫瘤體積(mm³)：體積=(最短直徑)²×(最長直徑)×0.5。動物照護及全部實驗程序皆經香港中文大學動物倫理委員會(Animal Ethics Committee of the Chinese University of Hong Kong)批準。在3週後，處死小鼠，並將腫瘤稱重且在福馬林(formalin)中固定用於組織學分析。

統計學分析

數據表示為平均值±標準偏差(SD)。使用獨立的司徒登氏t測試(Student's t test)來比較2個預選組間之差異。藉由重複量測方差分析(ANOVA)來測定小鼠之細胞生長曲線或腫瘤生長速率之差異。使用皮爾森氏卡方測試(Pearson's chi-square test)比較胃癌患者之DACT1甲基化與臨床病理特性間之關係。使用卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活曲線及對數秩測試來評估對應於DACT1甲基化狀態之總體存活數據。當P小於0.05時，認為數據具有統計學顯著性；且當P小於0.01時，具有極顯著性。

結果 胃癌中DACT1之沉默或下調 DACT1在大部分人類組織中表現

DACT1在所檢查全部正常成人組織及胎兒組織以及正常人類胃上皮細胞系(GES1)中表現(圖1A)。

DACT1在癌細胞系中受到表觀遺傳學抑制

10個胃癌細胞系中有9個在DACT1之mRNA表現方面沉默或降低。為揭示啟動子甲基化在DACT1下調中之作用，藉由MSP檢查DACT1甲基化狀態。在5個沉默細胞系 (KatoIII、AGS、MKN45、SNU719、MGC803)中觀察到甲基化，但在正常胃上皮細胞GES1中未檢測到甲基化(圖1B)。藉由BGS驗證DACT1甲基化狀態。BGS結果與MSP之結果一致，其中在甲基化細胞系(MKN45及KatoIII)中發現密集甲基化(該含CpG之基因組序列中至少11%之該CpG序列經甲基化)，但在未經甲基化MKN28及正常胃組織中未發現密集甲基化(圖2)。

DACT1表現可在去甲基化處理後恢復

為測試甲基化是否直接介導DACT1沉默，用去甲基化劑5-Aza處理三個沉默細胞系(MKN28、AGS、KatoIII)。此處理恢復AGS及KatoIII細胞系中之DACT1表現(圖3)，從而推斷，DACT1之轉錄沉默係由胃癌細胞中之啟動子甲基化介導。

功能分析 DACT1α抑制細胞增殖

藉由集落形成分析及細胞生長曲線在不表現DACT1α之細胞系(AGS、BGC823及MGC803)中檢查DACT1α對細胞生長之活體外生物效應。三種DACT1α轉染細胞與對照載體轉染細胞相比，其中形成之集落數顯著更少且集落大小更小(圖4)。與此發現一致，在AGS細胞中，DACT1α之異位表現顯著降低細胞生長曲線(圖5)。集落形成與細胞生長曲線分析二者皆一致地顯示，DACT1α可抑制GC細胞在活體外之細胞生長。

DACT1α誘導細胞凋亡

為檢查細胞凋亡對所觀察DACT1α轉染細胞之生長抑制 的貢獻，藉由流式細胞術利用膜聯蛋白V-APC及7-AAD雙染色測定細胞凋亡。結果指示，DACT1α轉染細胞之早期凋亡細胞數與對照載體轉染細胞之早期凋亡細胞數相比有所增加(BGC823：2.73%±0.05%對3.60%±0.45%，P=0.03；MGC803：2.36%±0.25%對3.63%±0.25%)。

DACT1α抑制胃癌細胞鋪展、遷移及侵襲

DACT1α之再表現顯示細胞鋪展顯著減少(圖6A)。與對照細胞相比，DACT1α轉染BGC823(P<0.01)及MGC803細胞(P=0.001)中個別細胞之鋪展程度實質上受到抑制(圖6A)。伴隨地，藉由羅丹明標記之鬼筆環肽染色，DACT1α抑制BGC823與MGC803細胞二者中之肌動蛋白微絲形成(圖6B)。DACT1α再表現減緩AGS及MGC803細胞之邊緣處之細胞遷移刮擦「傷口」(圖6C)。24h定量分析確認，與載體轉染對照細胞相比，DACT1α轉染AGS(P<0.01)及MGC803(P<0.05)細胞之傷口閉合顯著降低(圖6C)。另外，DACT1α顯著阻抑細胞侵襲能力，如藉由分別對AGS(P<0.05)及MGC803(P<0.01)細胞實施transwell分析所量測(圖6D)。

活體內腫瘤抑制

穩定的表現DACT1α之細胞系及對照細胞系係藉由用逆轉錄病毒(pBABE-嘌呤黴素-DACT1α或pBABE-嘌呤黴素對照)感染BGC823細胞並用嘌呤黴素進行選擇來產生。將穩定的表現DACT1α之BGC823細胞或對照BGC823細胞經皮下注射至4週齡雄性Balb/c裸小鼠之左或右背側中以比較活 體內腫瘤生長模式。經DACT1α或空載體活體內穩定轉染之BGC823之腫瘤生長曲線示於圖7A中。與載體對照小鼠相比，DACT1α轉染祼小鼠之腫瘤體積顯著更低(P<0.001)。在實驗結束時，分離腫瘤並稱重。與載體對照小鼠相比，DACT1α轉染祼小鼠之平均腫瘤重量顯著更小(P<0.01)(圖7B)，從而指示DACT1α用作致胃癌作用中之腫瘤抑制劑。

胃癌患者中之甲基化狀態 胃癌組織及正常胃組織中之甲基化狀態

在205個原發性胃癌及20個健康胃組織試樣中評估DACT1甲基化之臨床應用。在205個胃癌病例中，在29.3%(60/205)病例中檢測到DACT1之部分且密集之啟動子甲基化(該含CpG之基因組序列中至少11%之該CpG序列經甲基化)，但在20個健康胃組織試樣中未檢測到該情形(圖8A)。

DACT1甲基化與臨床特性間之相關性

DACT1甲基化與晚期腫瘤大小(P<0.05)、淋巴結轉移(P<0.05)及遠端轉移(P=0.05)相關(表2)。DACT1甲基化在TNM III/IV期情形中比在I/II期情形中更頻繁(P<0.0005)(表2)。此外，如卡本-麥爾存活曲線中所示，具有DACT1甲基化之胃癌患者比無DACT1甲基化之胃癌患者具有顯著更短之存活(P=0.007，對數秩測試)(圖8B)。

出於所有目的，本申請案中所引用所有專利、專利申請案及其他出版物(包括GenBank登錄號)皆全文以引用方式併入本文中。

非正式序列表

SEQ ID NO：1人類DACT1基因之啟動子區之序列(自轉錄起始位點起-566至-383)GTTTGGGAAGTGAAAGAAATTTAATTCGGTGTGAGTGGAAATGAGGAGTGGTCGTGTGGGGAAAGGGTTAAGATTGTGTTGTAATTTGGTCGAGTTTTAGAAAGTTTTTCGGAGAGTTTAATTGTCGCGTTTCGTCGCGGTTTTTGTTTGCGCGGTCGATTGTAATAGGATGTTGGGGTTTTAG

SEQ ID NO：2編碼DACT1α蛋白之cDNA序列(2511 bp)ATGAAGCCGAGTCCGGCCGGGACGGCGAAGGAGCTGGAGCCTCCGGCGCCGGCCCGAGGCGAGCAGCGCACGGCGGAGCCCGAGGGGCGCTGGCGGGAGAAGGGCGAGGCAGACACCGAGCGGCAGCGCACCCGGGAGCGGCAGGAGGCCACGCTGGCCGGGCTGGCGGAGCTGGAGTACCTGCGCCAGCGCCAAGAGCTGCTGGTCAGGGGCGCCCTGCGCGGCGCCGGGGGTGCGGGAGCCGCTGCGCCCCGCGCTGGGGAGCTACTGGGGGAGGCGGCGCAGCGCAGTCGCCTGGAGGAGAAGTTCTTGGAGGAGAACATCTTGCTGCTAAGAAAGCAATTGAACTGTTTGAGGCGAAGAGATGCTGGTTTGTTGAATCAGTTGCAAGAGCTTGACAAGCAGATAAGTGACCTGAGACTGGATGTAGAAAAGACATCTGAAGAGCACCTGGAGACAGACAGTCGGCCTAGCTCAGGGTTTTATGAGCTGAGTGATGGGGCTTCAGGATCCCTTTCCAATTCCTCTAACTCGGTGTTCAGTGAGTGTTTATCCAGTTGTCATTCCAGCACCTGCTTTTGCAGCCCCTTGGAGGCGACCTTGAGTCTCTCAGATGGTTGCCCCAAATCTGCAGATCTCATAGGATTGTTGGAATATAAAGAAGGCCACTGTGAAGACCAGGCCTCAGGGGCAGTTTGCCGTTCCCTCTCCACACCACAATTTAATTCCCTTGATGTCATTGCAGATGTGAATCCCAAGTACCAGTGTGATCTGGTGTCTAAAAACGGGAATGATGTATATCGCTATCCCAGTCCACTTCATGCTGTGGCTGTGCAGAGCCCAATGTTTCTCCTTTGTCTGACGGGCAACCCTCTGAGGGAAGAGGACAGGCTTGGAAACCATGCCAGTGACATTTGCGGTGGATCTGAGCTAGATGCCGTCAAAACAGACAGTTCCTTACCGTCCCCAAGCAGTCTGTGGTCTGCTTCCCATCCTTCATCCAGCAAGAAAATGGATGGCTACATTCTGAGCCTGGTCCAGAAAAAAACACACCCTGTAAGGACCAACAAACCAAGAACCAGCGTGAACGCTGACCCCACGAAAGGGCTTCTGAGGAACGGGAGCGTTTGTGTCAGAGCCCCGGGCGGTGTCTCACAGGGCAACAGTGTGAACCTTAAGAATTCGAAACAGGCGTGTCTGCCCTCTGGCGGGATACCTTCTCTGAACAATGGGACATTCTCCCCACCGAAGCAGTGGTCGAAAGAATCAAAGGCCGAACAAGCCGAAAGCAAGAGGG TGCCCCTGCCAGAGGGCTGCCCCTCAGGCGCTGCCTCCGACCTTCAGAGTAAGCACCTGCCAAAAACGGCCAAGCCAGCCTCGCAAGAACATGCTCGGTGTTCCGCCATTGGGACAGGGGAGTCCCCTAAGGAAAGCGCTCAGCTCTCAGGGGCCTCTCCAAAAGAGAGTCCTAGCAGAGGCCCTGCCCCGCCGCAGGAGAACAAAGTTGTACAGCCCCTGAAAAAGATGTCACAGAAAAACAGCCTGCAGGGCGTCCCCCCGGCCACTCCTCCCCTGCTGTCTACAGCTTTCCCCGTGGAAGAGAGGCCTGCCTTGGATTTCAAGAGCGAGGGCTCTTCCCAAAGCCTGGAGGAAGCGCACCTGGTCAAGGCCCAGTTTATCCCGGGGCAGCAGCCCAGTGTCAGGCTCCACCGGGGCCACAGGAACATGGGCGTCGTGAAGAACTCCAGCCTGAAGCACCGCGGCCCAGCCCTCCAGGGGCTGGAGAACGGCTTGCCCACCGTCAGGGAGAAAACGCGGGCCGGGAGCAAGAAGTGTCGCTTCCCAGATGACTTGGATACAAATAAGAAACTCAAGAAAGCCTCCTCCAAGGGGAGGAAGAGTGGGGGCGGGCCCGAGGCTGGTGTTCCCGGCAGGCCCGCGGGCGGGGGCCACAGGGCGGGGAGCAGGGCGCATGGCCACGGACGGGAGGCGGTGGTGGCCAAACCTAAGCACAAGCGAACTGACTACCGGCGGTGGAAGTCCTCGGCCGAGATTTCCTACGAAGAGGCCCTGAGGAGGGCCCGGCGCGGTCGCCGGGAGAATGTGGGGCTGTACCCCGCGCCTGTGCCTCTGCCCTACGCCAGCCCCTACGCCTACGTGGCTAGCGACTCCGAGTACTCGGCCGAGTGCGAGTCCCTGTTCCACTCCACCGTGGTGGACACCAGTGAGGACGAGCAGAGCAATTACACCACCAACTGCTTCGGGGACAGCGAGTCGAGTGTGAGCGAGGGCGAGTTCGTGGGGGAGAGCACAACCACCAGCGACTCTGAAGAAAGCGGGGGCTTAATTTGGTCCCAGTTTGTCCAGACTCTGCCCATTCAAACGGTAACGGCCCCAGACCTTCACAACCACCCCGCAAAAACCTTTGTCAAAATTAAGGCCTCACATAACCTCAAGAAGAAGATCCTCCGCTTTCGGTCTGGCTCTTTGAAACTGATGACGACGGTTTGA

SEQ ID NO：3 DACT1α mRNA序列(Genbank登錄號：NM_016651,3877 bp)GGCGGTCGCGCGCAGGACTCGAGGGCTTCTAGCCACCGTCCCCGCCAGCGCCGCGCCCCGCCACAGGGCGGCATGAGCCCACCCGCGGCCGCAGCCCTAGCGCCCTGCTCCTCCGCCTGGGCGGCCCGGCTGCGGTGACGGCTCTCGCTGCCCGACTGGGGGCCATGAAGCCGAGTCCGGCCGGGACGGCGAAGGAGCTGGAGCCTCCGGCGCCGGCCCGAGGCGAGCAGCGCACGGCGGAGCCCGAGGGGCGCTGGCGGGAGAAGGGCGAGGCAGACACCGAGCGGCAGCGCACCCGGGAGCGGCAGGAGGCCACGCTGGCCGGGCTGGCGGAGCTGGAGTACCTGCGCCAGCGCCAAGAGCTGCTGGTCAGGGGCGCCCTGCGCGGCGCCGGGGGTGCGGGAGCCGCTGCGCCCCGCGCTGGGGAGCTACTGGGGGAGGCGGCGCAGCGCAGTCGCCTGGAGGAGAAGTTCTTGGAGGAGAACATCTT GCTGCTAAGAAAGCAATTGAACTGTTTGAGGCGAAGAGATGCTGGTTTGTTGAATCAGTTGCAAGAGCTTGACAAGCAGATAAGTGACCTGAGACTGGATGTAGAAAAGACATCTGAAGAGCACCTGGAGACAGACAGTCGGCCTAGCTCAGGGTTTTATGAGCTGAGTGATGGGGCTTCAGGATCCCTTTCCAATTCCTCTAACTCGGTGTTCAGTGAGTGTTTATCCAGTTGTCATTCCAGCACCTGCTTTTGCAGCC CCTTGGAGGCGACCTTGAGTCTCTCAGATGGTTGCCCCAAATCTGCAGATCTCATAGGATTGTTGGAATATAAAGAAGGCCACTGTGAAGACCAGGCCTCAGGGGCAGTTTGCCGTTCCCTCTCCACACCACAATTTAATTCCCTTGATGTCATTGCAGATGTGAATCCCAAGTACCAGTGTGATCTGGTGTCTAAAAACGGGAATGATGTATATCGCTATCCCAGTCCACTTCATGCTGTGGCTGTGCAGAGCCCAATGTTTCTCCTTTGTCTGACGGGCAACCCTCTGAGGGAAGAGGACAGGCTTGGAAACCATGCCAGTGACATTTGCGGTGGATCTGAGCTAGATGCCGTCAAAA CAGACAGTTCCTTACCGTCCCCAAGCAGTCTGTGGTCTGCTTCCCATCCT TCATCCAGCAAGAAAATGGATGGCTACATTCTGAGCCTGGTCCAGAAAAAAACACACCCTGTAAGGACCAACAAACCAAGAACCAGCGTGAACGCTGACCCCACGAAAGGGCTTCTGAGGAACGGGAGCGTTTGTGTCAGAGCCCCGGGCGGTGTCTCACAGGGCAACAGTGTGAACCTTAAGAATTCGAAACAGGCGTGTCTGCCCTCTGGCGGGATACCTTCTCTGAACAATGGGACATTCTCCCCACCGAAGCAGTG GTCGAAAGAA TCAAAGGCCGAACAAGCCGAAAGCAAGAGG GTGCCCCTGCCAGAGGGCTGCCCCTCAGGCGCTGCCTCCGACCTTCAGAG TAAGCACCTGCCAAAAACGGCCAAGCCAGCCTCGCAAGAACATGCTCGGTGTTCCGCCATTGGGACAGGGGAGTCCCCTAAGGAAAGCGCTCAGCTCTCAGGGGCCTCTCCAAAAGAGAGTCCTAGCAGAGGCCCTGCCCCGCCGCAGGA GAACAAAGTTGTACAGCCCCTGAAAAAGATGTCACAGAAAAACAGCCTGC AGGGCGTCCCCCCGGCCACTCCTCCCCTGCTGTCTACAGCTTTCCCCGTGGAAGAGAGGCCTGCCTTGGATTTCAAGAGCGAGGGCTCTTCCCAAAGCCTGGAGGAAGCGCACCTGGTCAAGGCCCAGTTTATCCCGGGGCAGCAGCCCAGTGTCAGGCTCCACCGGGGCCACAGGAACATGGGCGTCGTGAAGAACTCCAGCCTGAAGCACCGCGGCCCAGCCCTCCAGGGGCTGGAGAACGGCTTGCCCACCGTCAGGGAGAAAACGCGGGCCGGGAGCAAGAAGTGTCGCTTCCCAGATGACTTGGATACAAATAAGAAACTCAAGAAAGCCTCCTCCAAGGGGAGG AAGAGTGGGGGCGGGCCCGAGGCTGGTGTTCCCGGCAGGCCCGCGGGCGGGGGCC ACAGGGCGGGGAGCAGGGCGCATGGCCACGGACGGGAGGCGGTGGTGGCCAAACCTAAGCACAAGCGAACTGACTACCGGCGGTGGAAGTCCTCGGCCGAGATTTCCTACGAAGAGGCCCTGAGGAGGGCCCGGCGCGGTCGCCGGGAGAATGTGGGGCTGTACCCCGCGCCTGTGCCTCTGCCCTACGCCAGCCCCTACGCCTACGTGGCTAGCGACTCCGAGTACTCGGCCGAGTGCGAGTCC CTGTTCCACTCCACCGTGGTGGACACCAGTGAGGACGAGCAGAGCAATTA CACCACCAACTGCTTCGGGGACAGCGAGTCGAGTGTGAGCGAGGGCGAGTTCGTGGGGGAGAGCACAACCACCAGCGACTCTGAAGAAAGCGGGGGCTTAATTTGGTCCCAGTTTGTCCAGACTCTGCCCATTCAAACGGTAACGGCCCCAGACCTTCACAACCACCCCGCAAAAACCTTTGTCAAAATTAAGGCCTCACATAACCTCAAGAAGAAGATCCTCCGCTTTCGGTCTGGCTCTTTGAAACTGATGACGACGGTTTGAGTGACATCATTGGTGTAGAAAGTTTGTGTGTTTTTTTTTCTTCTCCCTAGTTGCCAAAATTAAAAAGGTGGTGTTTTCATTTTTGTATAATACTTTAATGGAATGCTTTTTAAAAAAATATAAAACCAAGGTAAATTATTGTTTCATCTTCACGTATGGATGCTAGTGCCTTTAATGGAAGGTAAAGAATGTTTTGCTAGTTAGAAGTACATATTGAGGTTTTAATGGTGGTGATAGTGAGTTTTGTGGCACCAGCTGTTTTTTATTTTAAACTTTCTGAGCATCCGGCAAGGTACAGGTTTTGATGTTCAAGTTTTATTGGGATAAGATCTTTTGATCCCAAGGTCAGGTGGATGGAATTTTTGGATTTATATTTGTTCCTTGAGTCTTCAGGGCAGTGTCTCC ATGAGGGTTTTCCTGTTGAGGGGCACCACATACAATAGTGTGAAGTAGGTATGAGGGGCAGTCATTGTATTCTATAGTTTTTTTATGTAGTCTACATTTCTCAGATGTATCCCCATTCGGTTTTATTCTCAGAACTGTTACTAGACTCATGACTTGGAGGCCAAACCTTAAATCCAGAGATAGCAGCCTCGATAGGGACCTTAAAAGGATTCACAAAAACTTTTGCCACACTTGGTGCCTAGGCCCTGTTCCTAATAACCCCTTCTAGGGCCGTTTATCCAACATTTAGATGCCTTCTTTTCCCTCCCTAATTTGTAGCCAGTCCAACCTTTCATTCCTTGGAGGATTTAGTTTTGGGATAAAATTTTGGTCCTTGGGCACAGAGACATTCACTATTAATGAAGTAACCCTTGGGCATGACTCCAATCCCAGAATTGCTCACTGAGCGCTATGCCACCGAAGCGTTGACCTGAACATATTAGTGCAATCCAGTCCAGATTGGACCTTTGATCCTATGTGGAAGGGCTGTTTTTTAAGAAAAAATTTTTGGTAAACAGTATTGTGTAAAATTGCTTTTTGTATACCAATATATGCATGTTTTGTGCATGAGTAGTACTTGTGTTGATACTCCTGTTGATGTTAAATTACTATATAATATAAACAGTATGTGTTTTTATATATCATTGTGTAAATTTAATATAACATATGCAGTAATAAACCATTTGTTTTACTGCTGTTAAGTTTGTTATTTGGGTATAAAACCAGATGTTTACACCTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO：4用於檢測人類DACT1 mRNA之部分編碼序列(179 bp)AGGAGAAGTTCTTGGAGGAGAACATCTTGCTGCTAAGAAAGCAATTGAACTGTTTGAGGCGAAGAGATGCTGGTTTGTTGAATCAGTTGCAAGAGCTTGACAAGCAGATAAGTGACCTGAGACTGGATGTAGAAAAGACATCTGAAGAGCACCTGGAGACAGACAGTCGGCCTAGCTCA

SEQ ID NO：5 DACT1α_智人(Homo sapiens)dapper(β-連環蛋白拮抗劑)同源物1(非洲爪蟾，Xenopus laevis)(DACT1)，轉錄體變體1，798個胺基酸MKPSPAGTAKELEPPAPARGEQRTAEPEGRWREKGEADTERQRTRERQEATLAGLAELEYLRQRQELLVRGALRGAGGAGAAAPRAGELLGEAAQRSRLEEKFLEENILLLRKQLNCLRRRDAGLLNQLQELDKQISDLRLDVEKTSEEHLETDSRPSSGFYELSDGASGSLSNSSNSVFSECLSSCHSSTCFCSPLEATLSLSDGCPKSADLIGLLEYKEGHCEDQASGAVCRSLSTPQFNSLDVIADVNPKYQCDLVSKNGNDVYRYPSPLHAVAVQSPMFLLCLTGNPLREEDRLGNHASDICGGSELDAVKTDSSLPSPSSLWSASHPSSSKKMDGYILSLVQKKTHPVRTNKPRTSVNADPTKGLLRNGSVCVRAPGGVSQGNSVNLKNSKQACLPSGGIPSLNNGTFSPPKQWSKESKAEQAESKRVPLPEGCPSGAASDLQSKHLPKTAKPASQEHARCSAIGTGESPKESAQLSGASPKESPSRGPAPPQENKVVQPLKKMSQKNSLQGVPPATPPLLSTAFPVEERPALDFKSEGSSQSLEEAHLVKAQFIPGQQPSVRLHRGHRNMGVVKNSSLKHRGPALQGLENGLPTVREKTRAGSKKCRFPDDLDTNKKLKKASSKGRKSGGGPEAGVPGRPAGGGHRAGSRAHGHGREAVVAKPKHKRTDYRRWKSSAEISYEEALRRARRGRRENVGLYPAPVPLPYASPYAYVASDSEYSAECESLFHSTVVDTSEDEQSNYTTNCFGDSESSVSEGEFVGESTTTSDSEESGGLIWSQFVQTLPIQTVTAPDLHNHPAKTFVKIKASHNLKKKILRFRSGSLKLMTTV

SEQ ID NO：6 DACT1基因之啟動子區之序列(自轉錄起始位點起-18至+102)GCCGGGACAGCAGCAGCCGGCGGTCGCGCGCAGGACTCGAGGGCTTCTAGCCACCGTCCCCGCCAGCGCCGCGCCCCGCCACAGGGCGGCATGAGCCCACCCGCGGCCGCAGCCCTAGCG

SEQ ID NO：7引子DACT1-F AGGAGAAGTTCTTGGAGGAG TGAGCTAGGCCGACTGTCTG

SEQ ID NO：9引子DACT1-BGS-F GTTTGGGAAGTGAAAGAAATTTAATT

SEQ ID NO：10引子DACT1-BGS-R CTAAAACCCCAACATCCTATTACAAT

SEQ ID NO：11引子DACT1-MSP-MF CGGGATAGTAGTAGTCGGC

SEQ ID NO：12引子DACT1-MSP-MR CGCTAAAACTACGACCGCG

SEQ ID NO：13引子DACT1-MSP-UF GTTGGGATAGTAGTAGTTGGT

SEQ ID NO：14引子DACT1-MSP-UR AAACACTAAAACTACAACCACA

圖1顯示在一實施例中正常組織及胃細胞系中之DACT1 mRNA表現。

圖2顯示在一實施例中胃癌細胞系中之DACT1啟動子之亞硫酸氫鹽基因組定序結果(SEQ ID NO：15-18)。

圖3顯示在一實施例中去甲基化劑對DACT1表現之效應。

圖4顯示在一實施例中在集落形成分析中DACT1α表現對經轉染細胞之效應。

圖5顯示在一實施例中在細胞生長曲線中DACT1α表現對經轉染細胞之效應。

圖6顯示在一實施例中DACT1α對細胞鋪展、F-肌動蛋白 形成、細胞遷移及侵襲能力之抑制效應。

圖7顯示在一實施例中DACT1α表現在裸小鼠中之生長抑制效應。

圖8顯示在一實施例中DACT1(SEQ ID NO：16及18)在原發性胃癌及正常胃組織試樣中之甲基化狀態及對胃癌患者存活之卡本-麥爾分析。

<110> 香港中文大學

<120> 用於胃癌之生物標記DACT1

<130> 80015-857313

<140> 101147704

<141> 2012-12-14

<150> 13/328,785

<151> 2011-12-16

<160> 18

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 184

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 啟動子

<222> (1)...(184)

<223> 人類dapper(β-連環蛋白拮抗劑)同源物1(非洲爪蟾)(DACT1)之啟動子區，自轉錄起始位點起-566位至-383位，DACT1基因組序列

<400> 1

<210> 2

<211> 2511

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(2511)

<223> DACT1α蛋白cDNA編碼區

<400> 2

<210> 3

<211> 3877

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> 人類dapper(β-連環蛋白拮抗劑)同源物1(非洲爪蟾)，轉錄物變體1(DACT1,DACT1α)cDNA

<220>

<221> CDS

<222> (165)...(2675)

<223> DACT1α

<400> 3

<210> 4

<211> 179

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> 用於檢測人類DACT1 mRNA之部分編碼序列

<400> 4

<210> 5

<211> 836

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人類dapper(β-連環蛋白拮抗劑)同源物1(非洲爪蟾)，同種型1(DACT1,DACT1α)

<400> 5

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 啟動子

<222> (1)...(120)

<223> 人類dapper(β-連環蛋白拮抗劑同源物1)(非洲爪蟾)(DACT1)之啟動子區，自轉錄起始位點起-18位至 +102位，DACT1基因組序列

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測DACT1 mRNA表現之合成RT-PCR引子DACT1-F

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測DACT1 mRNA表現之合成RT-PCR引子DACT1-R

<400> 8

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成直接亞硫酸氫鹽基因組定序(BGS)引子DACT1-BGS-F

<400> 9

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成直接亞硫酸氫鹽基因組定序(BGS)引子DACT1-BGS-R

<400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子DACT1-MSP-MF

<400> 11

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子DACT1-MSP-MR

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子DACT1-MSP-UF

<400> 13

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子DACT1-MSP-UR

<400> 14

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胃癌細胞系MKN45中DACT1啟動子之合成直接亞硫酸氫鹽定序(BGS)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)...(60)

<223> n=g、a、c或t

<400> 15

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胃癌細胞系Kato III及原發性胃癌(GC(Z4))中DACT1啟動子之合成直接亞硫酸氫鹽定序(BGS)

<400> 16

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胃癌細胞系MKN28中DACT1啟動子之合成直接亞硫酸氫鹽定序(BGS)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (9)...(9)

<223> n=g、a、c或t

<400> 17

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正常胃組織中DACT1啟動子之合成直接亞硫酸氫鹽定序(BGS)

<400> 18

Claims (12)

1. 一種檢測個體之胃癌之方法，其包含以下步驟：(a)用差異修飾甲基化DNA及未經甲基化DNA之試劑處理取自該個體之試樣；及(b)確定含CpG之基因組序列中之各CpG經甲基化抑或未經甲基化，其中該含CpG之基因組序列為至少一來自DACT1轉錄起始位點-465至-406區域之區段，其包含至少一個CpG，其中該含CpG之基因組序列中至少11%之該CpG序列經甲基化指示該個體可能患有胃癌。
2. 如請求項1之方法，其中該含CpG之基因組序列包含兩個或更多個CpG，且其中全部CpG之至少50%經甲基化指示該個體可能患有胃癌。
3. 如請求項1或2之方法，其中該含CpG之基因組序列係來自DACT1轉錄起始位點-465至-406區域之至少15個鄰接核苷酸之區段。
4. 如請求項1或2之方法，其中含CpG之基因組序列係來自DACT1轉錄起始位點-465至-406區域之至少20個鄰接核苷酸之區段。
5. 如請求項1或2之方法，其中含CpG之基因組序列係來自DACT1轉錄起始位點-465至-406區域之至少50個鄰接核苷酸之區段。
6. 如請求項1或2之方法，其中含CpG之基因組序列係來自DACT1轉錄起始位點-465至-406之區域。
7. 如請求項1之方法，其中含CpG之基因組序列係來自DACT1轉錄起始位點-465至-406之區域，且其中全部CpG中之至少5個被至少部分地經甲基化指示該個體可能患有胃癌。
8. 如請求項1之方法，其中該試樣係胃黏膜試樣。
9. 如請求項1之方法，當指示該個體患有胃癌時，其進一步包含在隨後時間使用來自該個體之該試樣類型之試樣重複步驟(a)及(b)，其中甲基化CpG之數目在該隨後時間相對於自初始步驟(b)所測定甲基化CpG之數目之增加指示胃癌有所惡化，且降低指示胃癌有所改善。
10. 如請求項1之方法，其中該差異修飾甲基化DNA及未經甲基化DNA之試劑係優先裂解甲基化DNA之酶、優先裂解未經甲基化DNA之酶或亞硫酸氫鹽。
11. 如請求項1之方法，其中步驟(b)包含擴增反應。
12. 如請求項1之方法，其中步驟(b)包含對DNA分子之定序。