CN101909630A - 预防和治疗肿瘤的方法和化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
相关申请的交叉参考
该申请参考并要求在2008年6月6日向美国专利和商标局提交的申请“Methods And Compounds For Preventing And Treating A Tumour”(适时分配的序列号61/059,482),以及在2007年11月2日向美国专利和商标局提交的申请“′DACT3Is A Key Epigenetic Regulator Of Wnt/β-cateninSignaling In Colorectal Cancer And Is A Therapeutic Target Of HistoneModifications”的优先权(适时分配的序列号60/948,835)的优先权。根据PCT的第4.18条,所述两个申请的内容为所有目的引入作为参考,包括引入说明书、权利要求书或在20.5(a)条中未包含和提及的附图的任何元素或部分。
发明领域
本发明提供用于预防和治疗肿瘤的方法和化合物。还提供在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的方法和在受试者中诊断发生赘生物风险的方法。
发明背景
癌症是全世界死亡的主要原因,并且是发达国家中死亡的第二个主要原因,甚至是例如澳大利亚、日本、韩国、新加坡和英国及西班牙的男性人群死亡的首要原因。每年患癌症的人数量不断增加。
目前,癌症治疗包括手术或集中在与细胞转化成恶性细胞相关的功能或遗传改变上。理想的抗癌药物应该选择性地杀死,或至少抑制快速增殖的癌性细胞,而不影响非癌性细胞。目前的方法包括使用针对选定类型癌细胞的标记的抗体的免疫疗法(例如美国专利申请2005/0244417)、应用在特定类型癌细胞上表达的受体的拮抗剂(美国专利申请2006/0147456)、应用含有干扰素的壳聚糖-脂类颗粒(美国专利申请2005/0266093),以及应用作为特定类型前列腺癌细胞的细胞毒性剂通过未知机制起作用的化合物(美国专利申请2005/0245559)。
目前已经努力研究的另一手段是开发外遗传癌症疗法,因为已知在癌细胞中具有DNA甲基化的异常模式超过20年了(对于综述,参阅例如Brown,R.和Strathdee,G.,Trends in Molecular Medicine(2002)8,4(Suppl.),S43-S48,or Yoo,C.B.和Jones,P.A.,Nature Reviews Drug Discovery(2006)5,1,37-50)。然而,仅两种DNA甲基转移酶抑制剂5-氮胞苷()和脱氧氮杂胞苷()已经进入市场。已经允许它们用于治疗骨髓增生异常综合征,这是也称为“白血病前期”的一种血液学病症。因此本领域仍然需要用于治疗或预防癌或肿瘤性疾病的新化合物和组合物,其优先快速杀死癌性细胞。
因此,本发明的目标是提供能够优先杀死癌细胞而不影响非癌性细胞的方法,以及化合物和组合物。本发明的另一目标是提供诊断肿瘤发生风险的方法。
发明概述
第一方面,本发明提供防止、抑制、阻止或逆转细胞中肿瘤发生的方法。所述方法包括增加细胞中DACT(“dapper、β联蛋白的激动剂、同源物”)蛋白质或其功能片段的量和/或活性。
第二方面,本发明提供在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的方法。所述方法包括增加细胞中DACT蛋白质或其功能片段的量和/或活性。一般地,程序性细胞死亡在肿瘤细胞中被优先诱导,而非肿瘤细胞保持基本不受影响。在一些实施方案中,程序性细胞死亡仅在肿瘤细胞中选择性被诱导,而非肿瘤细胞保持不受影响。
第三方面,本发明提供药物组合物。所述药物组合物包括以下两种化合物的组合:第一种化合物是通式(I)的化合物
在通式(I)中,A是CH或N,R4和R5相互独立地是H、脂肪族基团、脂环族基团、芳香族基团、芳基脂肪族基团和芳基脂环族基团,其可任选地包括0-3个杂原子。所述杂原子可以是N、O、S或Si。R4和R5可任选地连接,以确定脂肪族烃基桥。R2是H或卤素,如F、Cl、Br或I。R3是H,或包括1-8个主链碳原子和0-3个杂原子的脂肪族或芳基脂肪族基团。所述杂原子可以是N、O、S、Si,或卤素,例如Cl、F、Br或I。在一些实施方案中,R2是F或CI。在一些实施方案中,R3也可以单独或与R2同时是F或Cl。第二种化合物是组蛋白脱乙酰酶抑制剂,如异羟肟酸化合物、环四肽、苯甲酰胺、亲电子的酮、SAHA()、PXD101()、MS275、LAQ824/LBH589、CI994、MGCD0103或sirtuin抑制剂。
第四方面,本发明提供通式(I)的化合物在治疗肠肿瘤,包括直肠肿瘤和结肠肿瘤中的用途。在该方面,本发明还涉及通式(I)的化合物在制备用于治疗肠肿瘤,例如肠癌的药物中的用途。
第五方面,本发明提供诊断细胞中肿瘤发生风险的方法。所述方法包括评估(i)细胞中DACT蛋白质的量,(ii)细胞中DACT蛋白质的活性,和(iii)翻译后组蛋白修饰模式中的一项或更多项。该翻译后组蛋白修饰通常是组蛋白甲基化和/或组蛋白乙酰化。
第六方面,本发明涉及预测赘生物对通式(I)的化合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合是否敏感的方法。所述方法包括评估(i)DACT蛋白质的量,(ii)DACT蛋白质的活性,和(iii)赘生物中翻译后组蛋白修饰的模式中的一项。在评估DACT蛋白质的量中,其减少的量表明赘生物对通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合敏感。在评估DACT蛋白质的活性中,其降低的活性表明赘生物对通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合敏感。在评估翻译后组蛋白修饰的模式中,改变的翻译后组蛋白修饰其改变表明赘生物对通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合敏感。例如可在DACT蛋白质的基因座处改变翻译后组蛋白修饰的模式。
第七方面,本发明涉及增加细胞中DACT蛋白质的量,如绝对量的核酸分子和/或低分子量有机分子在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
第八方面,本发明提供鉴定能够在细胞中预防肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的候选化合物的方法。所述方法包括向能够表达DACT蛋白质或其功能片段的细胞中导入所述化合物。此外,所述方法包括确定DACT蛋白质的表达。DACT蛋白质的升高表达表示所述化合物能够在细胞中预防肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。
第九方面,本发明提供鉴定能够在细胞中预防肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的化合物的体外方法。所述方法包括将所述化合物、DACT蛋白质或其功能片段与dishevelled蛋白接触。DACT蛋白质与dishevelled蛋白之间复合体形成的增强表明所述化合物能够在细胞中预防肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。
附图简述
当结合非限制性实例和附图进行考虑时,参考详细说明更好地理解本发明。
图1是Wnt/β-联蛋白途径特征的简化图。没有Wnt信号,β-联蛋白被降解(A)。Wnt/β-联蛋白信号途径激活后,Dvl结合Frz受体,由此允许β-联蛋白进入细胞核并激活转录(B)。在本发明方法的实施方案中,期望Dvl与DACT蛋白质形成复合体,从而恢复到图1A的状态(C)。
图2描述了人DACT3转录起始位点的作图。
图3比较了结肠癌中的DACT3表达与DNA甲基化。A:肿瘤(T)相比于正常粘膜(N)中Wnt抑制剂(上图)与Wnt/β-联蛋白靶基因(下图)的等级聚类。B:来自肿瘤和粘膜样品的SFRP1和DACT基因的RT-PCR分析。C:肿瘤中SFRP1和DACT3的甲基化状态。D:癌细胞系相比于正常组织中SFRP1和DACT基因的RT-PCR分析。E:癌细胞系中SFRP1和DACT基因的甲基化状态。F:非癌性细胞系和癌细胞系的DNA中的CpG位点的甲基化状态。G:在没有和有5-AzaC的癌细胞中以及缺少DNA甲基转移酶1和3b的细胞中DACT基因启动子的甲基化特异性PCR。H:用5-AzaC处理的癌细胞中SFRP1和DACT基因的RT-PCR分析。
图4描述了通过ChIp技术对DACT基因中组蛋白修饰的分析,显示了癌细胞(B)和非癌细胞(C)中DACT3处的组蛋白标记(A)、H3K27me3和H3K4me3。
图5表明了DZNep/TSA组合对癌细胞中DACT3表达(A,B)和组蛋白修饰(C,D)的影响。
图6表明了DZNep/TSA组合对癌细胞中β-联蛋白磷酸化(A)和定位(B)、Wnt/β-联蛋白信号途径组分(C,D)和程序性细胞死亡(E-G)的影响。
图7描述了癌细胞中DACT基因的组蛋白修饰。
图8显示了在mRNA水平(A,C)和程序性细胞死亡(B,C)方面,与使用siRNA缺失DACT1的癌细胞相比,DZNep/TSA对使用shRNA(A,B)和siRNA(C,D)缺失DACT3的癌细胞的影响。
图9表明通过Western印迹(A,B)、免疫荧光成像(C)和细胞生长(D)检测在结肠直肠癌细胞中异源过表达DACT3对Dvl2和β-联蛋白的影响。
图10显示了在DZNep/TSA存在和缺失下GSK-3抑制(LY2119301)对B-联蛋白水平的影响。
图11描述了癌细胞系中DACT3mRNA(A)和蛋白质(B)的水平。
图12列出了癌细胞中被DZNep/TSA处理重新激活的基因。
图13表明了DZNep与其他组蛋白脱乙酰酶抑制剂在诱导程序性细胞死亡(A)和诱导DACT3并抑制β-联蛋白(B)中的协同作用。
图14A显示了DZNep/TSA施用对肿瘤体积的体内影响。
图14B显示了DZNep与其它组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合对肿瘤体积的体内影响。
图15描述了用于获得图14B数据的方案设计。
图16描述了在用DZNep和SAHA抑制HCT116异种移植物肿瘤生长的过程中体重的改变。
图17描述了在用DZNep和SAHA抑制HCT116异种移植物肿瘤生长的过程中的肿瘤体积。
图18是总结在体内用DZNep和SAHA处理的过程中肿瘤生长抑制的表。
发明详述
本发明基于发现DACT蛋白质,特别是DACT3作为Wnt/β-联蛋白信号转导的负调节物起作用。在多种生物中也称为Dapper(Dpr)、Frodo、(Frd)、THYEX3、HNG3和MTNG3的DACT蛋白质家族目前已知包括3个成员,称为DACT1到DACT3(Fisher,D.A.,等,Developmental Dynamics(2006)235,2620-2630)。DACT3包括例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q96B18(人)、Q0PHV7(小鼠),NCBI登录号AAH16161(人),UniProtKB/TrEMBL登录号A8IP73(小鼠)的蛋白质或NCBI登录号NW_001838496(人)、NM_145056(人)、NM_145056(爪蟾)、XR_027789(牛)、NW_001084763(大鼠)、NW_047556(大鼠)、NM_001081655(小鼠)、NW_001030832(小鼠)、DQ832319(小鼠)或NW_876270(狗)的核酸分子编码的蛋白质。DACT2包括例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q673G8(斑马鱼)、Q5SW24(人),或Q7TN08(小鼠),UniProtKB/TrEMBL登录号Q4V9Q8(斑马鱼)的蛋白质或NCBI登录号BC111790(人)、BC111764(人)、BC092498(人)、NM_001077794(斑马鱼)、NM_001107464(大鼠)、NW_001236578(黑猩猩)、XM_001145122(黑猩猩)、BV677538(猕猴)、AC_000039(小鼠)、NM_172826(小鼠)、NW_001030598(小鼠)、NT_039649(小鼠)或BC058740(小鼠)的核酸分子编码的蛋白质。已经鉴定了编码人DACT1的HDPR1基因的两个选择性剪接转录物,称为α和β(Yau,Oncogene(2005)24,1607-1614)。
术语“信号转导”和“信号转导途径”指细胞机制和响应某一条件或变化而在细胞组分上起作用的分子。通常此类机制和分子传送胞外信号通过细胞膜变成胞内信号。该信号然后可以刺激细胞响应。“Wnt信号转导途径组分”通常是转导来自Wnt蛋白质和Frz受体和/或Wnt蛋白质和LRP蛋白质(LDL-相关受体蛋白),例如LRP5或LRP6之间相互作用的信号的组分。因为Wnt信号转导途径是复杂的,并涉及广泛的反馈调节,所以具有许多可能还未发现的Wnt信号转导途径的成员。示例性Wnt信号转导途径组分包括(至少暂时地)膜结合蛋白Axin和Dishevelled、胞外Wnt相互作用蛋白sFRP、WIF-I、LRP灭活蛋白Dkk和Krn、胞质蛋白β-联蛋白、β-联蛋白“降解复合体”APC、GSK3β、CKIα和PP2A的成员、核转运蛋白APC、pygopus和bcl9/legless、和转录因子TCF/LEF、Groueho和多种组蛋白乙酰基转移酶如CBP/p300和Brg-1。
已经显示DACT(Dpr/Frodo)基因家族的成员通过与Dishevelled(Dvl)相互作用参与Wnt/β-联蛋白信号转导(Cheyette,B.N.,等,Dev Cell(2002)2,449-461),所述Dishevelled(Dvl)是胞质支架蛋白,其是Wnt信号转导的核心组分(Bilic,J.,等,Science(2007)316,1619-1622;Logan,C.Y.,& Nusse,R.,Annu Rev Cell Dev Biol(2004)20,781-810)。已经显示DACT 1通过保守的C末端PDZ结合基序结合Dvl PDZ结构域与Dvl形成复合体(Cheyette等,2002,上文;Wong,H.-C.,等,Molecular Cell(2003)12,5,1251-1260)。公开的数据揭示,DACT 1的PDZ结合肽可与Frizzled受体竞争Dvl-1的相同位点(Wong,H.-C.,等,2003,上文)。然而迄今为止没有确定DACT蛋白质的确切功能。一些数据看起来表明DACT1和DACT2在一些生物背景中拮抗Wnt信号转导,而其它数据看起来表明它们可能在其它生物背景中激活Wnt信号转导,并且它们也可能在TGF-β/Nodal信号转导中起作用(Gloy,J.,等,Nat Cell Biol(2002)4,351-357;Hikasa,H.,& Sokol,S.Y.,Development(2004)131,4725-4734;Su,Y.,等,FASEB J(2007)21,682-690;Zhang,L.,等,J Biol Chem(2006)281,8607-8612;Zhang,L.,等,Science(2004)306,114-117;Bikkavilli,R.K.,等Journal of Cell Science(2008),121,2,234-245)。在本申请的优先权日后,独立于本发明,已经报道了DACT1通过防止β-联蛋白与转录因子淋巴增强因子1(LEF1)形成复合体并通过增强细胞核中LEF1与组蛋白脱乙酰酶1之间的相互作用来控制Wnt/β-联蛋白信号转导(Gao,X.,等,J.Biol.Chem.(2008)doi/10.1074/jbc.M804088200)。特别是对于DACT3,在任何生物中至今仍未知道信号转导的功能并且对与疾病如肿瘤发生的任何相关性也一无所知。
Wnt/β-联蛋白信号转导(对于最近的简单综述,参阅例如Cadigan,K.M.,Current Biology(2008)18,20,R943-R947)是古老且高度保守的信号转导途径,参与多种生理学过程如胚胎发育、组织再生,包括例如祖细胞形成和增殖、前体细胞的分化和维持、和干细胞系或干细胞的自我更新。Wnt/β-联蛋白途径的激活增强了体细胞重新发育成诱导的多能干细胞(Marson,A.,等Cell Stem Cell(2008)3,132-135)。所述途径也涉及多种状况如心血管疾病、骨畸形、衰老、肥胖、糖尿病、神经变性(包括精神分裂和阿尔茨海默病)、急性肾功能衰竭和多囊肾以及炎症。其也可促进附肢再生和伤口恢复。此外,已经发现氧化应急激活该信号转导途径。在该方面,在视网膜色素上皮中,已经报道了所述途径在白光照射后被激活,导致失去上皮标记并获得间质标记(Iriyama,A.,等,Biochem.Biophys.Res.Commun.(2008)375,173-177)。
还已知异常的Wnt/β-联蛋白信号转导与癌相关。也已经在溃疡性结肠炎中发现了异常的Wnt/β-联蛋白信号转导,其中所述途径在恶性发展的早期阶段被激活(van Dekken,H.,等,Acta Histochemica(2007)109,4,266/272)。Wnt/β-联蛋白信号转导的异常激活例如是结肠癌中的主要驱动力(Kinzler,K.W.,& Vogelstein,B.,Cell(1996)87,159-170;Su,L.K.,等,Science(1992)256,668-670;van de Wetering,M.,等,Cell(2002)111,241-250)。多于90%的全部结肠直肠癌包括Wnt/β-联蛋白途径的激活突变,使得这种癌成为用于分子干预的有吸引力的模型。
Wnt/β-联蛋白途径组分包括APC、Axin和β-联蛋白本身中的突变是导致癌症的异常信号转导激活的公认原因(Lammi,L.,等,Am J Hum Genet(2004)74,1043-1050.;Liu,W.,等,Nat Genet(2000)26,146-147.;Morin,P.J.,等,Science(1997)275,1787-1790.;Su等,1992,上文)。作为示例性实例,由移码、无义或剪接位点突变引起的APC等位基因的截短突变导致腺瘤息肉病,其为一种类型的人类结肠癌。作为另一实例,已经显示乳腺和上皮的癌干细胞的形成通过Wnt/β-联蛋白途径被激活。也已经显示β-联蛋白信号转导参与癌干细胞群体的维持(Malanchi,I.,等,Nature(2008)452,7187,650-653)。已经显示DMBA-TPA或Ras-诱导的肿瘤中β-联蛋白基因的缺失导致肿瘤的完全消退。
导致癌症的Wnt/β-联蛋白途径的组分的遗传缺陷共同拥有的是它们导致β-联蛋白在细胞核中的积累。在非癌性细胞中,因为酪蛋白激酶1和糖原合酶激酶3的磷酸化作用,在缺少Wnt配体的情况下β-联蛋白的胞质水平保持低水平。磷酸化的β-联蛋白被泛素化,随后被降解(参阅图1A)。然而突变可导致胞质β-联蛋白的积累,由此模仿组成型的Wnt信号转导。已经在多种癌形式中发现了Wnt/β-联蛋白途径组分(包括β-联蛋白基因)的突变,所述癌形式如黑素瘤、食管癌、甲状腺癌、小肠腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌、肝细胞癌、乳腺癌、毛基质细胞肿瘤(毛基质瘤)、硬纤维瘤、Wilm’s肿瘤(肾)、成神经管细胞瘤(儿童期最常见的脑肿瘤)、滑膜肉瘤和子宫内膜癌(对于综述,参阅例如Giles,RH,等,Biochim Biophys Acta(2003)1653,1-24)。已经发现Wnt信号转导在肿瘤发展和转移中起作用。
认为非磷酸化并因此稳定的β-联蛋白易位到细胞核中(参阅图1B)。细胞核β-联蛋白与TCF/LEF转录辅因子家族的成员相互作用来激活下游靶基因,如可导致细胞转化的Cyclin D1和Myc(He,T.C.,等,Science(1998)281,1509-1512;Morin等,1997,上文;Tetsu和McCormick,1999,上文;van de Wetering等,2002,上文)。结肠癌细胞中Wnt/β-联蛋白信号转导的阻断在体外和体内诱导程序性细胞死亡或生长抑制这一事实(Fujii,N.,等,Cancer Res(2007)67,573-579;He,B.,等,Oncogene(2005)24,3054-3058;Kwong,K.Y.,等,Oncogene(2002)21,8340-8346)已经推动了开发靶向该途径的治疗策略的大量努力(Barker,N.,&Clevers,H.Nat Rev Drug Discov(2006)5,997-1014;Lepourcelet,M.,等,Cancer Cell(2004)5,91-102;Li,H.,等,Cancer Biol Ther(2002)1,621-625)。
如上所提及,最近其它人也已经发现DACT1可通过其C末端结构域与β-联蛋白相互作用(Gao等,2008,上文)。DACT1还具有核定位信号以及核输出信号并从细胞质中转移到细胞核中,反之亦然(如上)。已经揭示β-联蛋白的与DACT1相互作用的区域对应于与LEF/TCF相互作用的区域,并且已经显示β-联蛋白与LEF1之间复合体的形成被DACT1破坏(如上)。通过该机制,DACT1很可能拮抗Wnt/β-联蛋白信号转导。进一步显示DACT1能通过其C末端结构域结合组蛋白脱乙酰酶1并加强组蛋白脱乙酰酶1与LEF1之间的相互作用(如上)。这揭示了DACT1能够控制Wnt/β-联蛋白的靶标,例如c-MYC或细胞周期蛋白D1的表达,通过增强协阻抑物组蛋白脱乙酰酶1的作用进行信号转导。
本发明人已经观察到包括DACT3的DACT蛋白质与Dishevelled(DVL)蛋白质形成复合体。术语“复合体”指至少两个分子彼此结合的装配体。Dvl蛋白由N末端DIX结构域、中间PDZ结构域和C末端DEP结构域组成。这三个结构域中,PDZ结构域在Wnt信号转导中起最重要的作用。已经报道了超过20种天然配体结合Dvl PDZ结构域,已经表明其中大多数对经典或非经典的Wnt信号途径在生物学上是重要的。Dvl也对Wnt信号转导至关重要(Bilic等,2007,上文;Logan,C.Y.,& Nusse,R.Annu Rev Cell Dev Biol(2004)20,781-810)。癌细胞和其它背景中Wnt/β-联蛋白途径的激活在分子上观察为细胞核与细胞质中未磷酸化的非膜结合的β-联蛋白的积累(Peifer,M.,& Polakis,P.,Science(2000)287,1606-1609;Polakis,P.,Curr Opin Genet Dev(2007)17,45-51)。已经在几种类型的癌,如非小细胞肺癌和间皮瘤中观察到了Dvl蛋白的过表达。已经显示Dvl蛋白的表达与肺癌的弱分化相关,并且已经显示Dvl蛋白通过Wnt/β-联蛋白信号转导促进了肺癌的转移(Wei,Q.,等,Lung Cancer(2008)doi:10.1016/j.lungcan.2008.06.018)。
如上指出,前面已经通过酵母双杂交系统和免疫沉淀表明DACT 1与Dvl之间可形成复合体,其为Wnt/β-联蛋白途径的主要激活子(Gloy,J.,等,Nature Cell Biology(2002)4,351-357,Cheyette等,2002,上文)。Gloy等(上文)鉴定了DACT的保守C末端结构域与N末端DIX结构域之间的相互作用和Dvl的相邻序列(如上),其含有PDZ结构域。基于结构数据,Cheyette等(上文)鉴定了在复合体形成中Dvl 1的PDZ结构域与DACT的C末端区的相互作用。使用化学位移干扰NMR谱和酵母双杂交筛选,Wong等(2003,上文)鉴定了DACT的C末端结构域是PDZ结合基序并且Dvl 1的中心结合区是Dvl 1的PDZ结构域。同时已经发现所述PDZ结构域为许多蛋白质,包括Frizzled受体的C末端区,以及蛋白激酶、磷酸酶和接头蛋白质提供停靠位点,而已经发现DIX结构域允许Dvl蛋白与Dvl家族的其它成员以及与Axin二聚化。
所有三种Dishevelled蛋白具有相同的结构域排列,包括PDZ结构域和DIX结构域。所有三种蛋白质也在细胞系中表达,其中Dvl2表达最强(Lee,Y.-N.,等,Cellular Signalling(2008)20,443-452)。使用siRNA进行的敲除和缺失揭示了三种蛋白质的各自作用,它们至少在Wnt/β-联蛋白信号转导中的作用看起来依赖于彼此的存在并协同作用(如上)。
不希望受限于理论的束缚,推测增加细胞中DACT蛋白的量和/或活性的一种结果涉及DACT蛋白之间复合体的形成以及随后Dvl蛋白的降解。在该方面,本发明人的发现与以前观察结果一致,即升高的DACT蛋白水平的一种结果可能是Dishevelled(DVL)蛋白的降解(Zhang,L.,等,Science(2004)306,114-117)。在一些实施方案中,本发明的用途和方法因此是实现细胞中Dvl蛋白,如Dvl-1、Dvl-2或Dvl-3总量降低的方法。本发明人的发现也为人结肠直肠癌中DACT1的表达下调的前述报道提供了新思路(Yau,T.-O.,等,2005,上文)。
在一般基础上,本发明还涉及诊断、预防和/或治疗Wnt-介导的病症,即以异常Wnt信号转导为特征的生理病症、状况或疾病的方法和用途(例如参阅上文)。在该方面,本发明还提供药物组合物,以及预测Wnt-介导的病症对该组合物反应性的方法。在特定方面,异常的Wnt信号转导是怀疑患有疾病的细胞或组织中Wnt信号转导的水平超过类似的没有患病的细胞或组织中Wnt信号转导的水平。在一些实施方案中,Wnt-介导的病症包括肿瘤,包括癌。在该实施方案中,本发明的方法、化合物和组合物可用于与肿瘤,包括癌相关的诊断和/或治疗目的。在一些实施方案中,这些方法、化合物和组合物可用于与生理状况相关的诊断和/或治疗目的,所述生理状况选自例如神经变性状况、心血管疾病、急性肾衰竭和多囊肾、骨畸形、衰老、肥胖、糖尿病或炎症。此外合适的用途包括维持干细胞或祖细胞的多潜能状态和/或自我更新特征、祖细胞形成、祖细胞增殖或体细胞重新发育成诱导的多潜能干细胞的调节/控制。
术语“癌”指由恶性赘生性细胞的增殖引起的任何癌,例如肿瘤、赘生物、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤。例如,癌包括,但不限于,间皮瘤、白血病和淋巴瘤,如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、非皮肤外周T细胞淋巴瘤、与人T细胞淋巴细胞病毒(HTLV)相关的淋巴瘤,如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、B细胞淋巴瘤、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人T细胞白血病淋巴瘤、急性粒细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)或肝细胞癌。更多的实例包括脊髓发育不良综合征、儿童实体瘤,如脑肿瘤、成神经细胞瘤、视网膜成神经细胞瘤、维尔姆斯瘤、骨肿瘤和软组织肉瘤、成人常见的实体瘤如头颈癌-如口腔、喉、鼻咽和食管癌;生殖泌尿癌-如前列腺、膀胱、肾脏、子宫、卵巢、睾丸癌;肺癌-如小细胞和非小细胞癌;乳腺癌;胰腺癌;黑素瘤和其它皮肤癌;胃癌;脑肿瘤;与戈尔林综合征相关的肿瘤-如成神经管细胞瘤或脑脊膜瘤;和肝癌。本发明方法处理的癌的额外示例性形式包括,但不限于,骨骼或平滑肌的癌、胃癌、小肠癌、直肠癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、肾上腺癌、肛门癌、直肠癌、甲状旁腺癌和垂体癌。
因此,在一些实施方案中,本发明涉及预防细胞中癌发生的方法。如此处所用,术语癌发生(癌发生)指将正常细胞转化成具有增殖病症的细胞,特别是肿瘤细胞的过程。各细胞可产生良性肿瘤和/或恶性肿瘤(癌)。良性肿瘤不扩散到身体的其它部位或侵入其它组织。然而,其可以变得危及生命,其中其压缩重要结构或在生理上活跃(例如通过产生激素)。恶性肿瘤可侵入其它器官,扩散到远处(转移)并对生命造成威胁。各方法包括施用如上定义的通式(I)的化合物和任选地组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在其它实施方案中,例如通过测定个体细胞,例如肿瘤细胞中DACT蛋白的量监测个体中的治疗。在监测疾病的治疗或进行中,可在不同时间点,如在治疗疾病如癌之前、过程中和/或之后从个体中获得样品。在特定实施方案中,将来自个体样品的DACT蛋白的量、其活性水平和/或外遗传变化(见下文)的存在与在不同时间点获得的其各自对应物进行比较。将DACT蛋白的量或活性和/或外遗传变化的存在与例如疾病的治疗的成功和/或进展相关联。
在本发明的一些方法和用途中,DACT蛋白或其功能片段的量和/或活性在细胞中升高。所述细胞可以是能够表达Dact蛋白的任何细胞。其例如可以是单个细胞或细胞群的细胞。在一些实施方案中,所述细胞是体细胞。合适的体细胞的实例包括,但不限于成纤维细胞、髓样细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、骨细胞、骨髓细胞、周细胞、树突细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、软骨细胞、丘细胞、神经细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食管细胞、肌细胞(例如平滑肌或骨骼肌细胞)、胰脏β细胞、黑素细胞、造血细胞、肌细胞、巨噬细胞、单核细胞和单核细胞。体细胞可以是任何组织,如皮肤、肾、脾、肾上腺、肝、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、脾、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、心脏、眼或神经组织的细胞。
在一些实施方案中,细胞获得于或来自宿主生物,其可以是任何生物。例如可从各宿主生物中以样品例如活组织解剖或血样的形式直接取得(例如分离)细胞。其也可以从宿主生物中例如分离获得并随后培养、生长、转化或暴露于所选治疗。在一些实施方案中,所述细胞可包括在宿主生物中。其例如存在于宿主生物的血液或组织中,包括器官中。从中衍生或获得(包括分离、纯化或富集)细胞的宿主生物,或其中包括细胞的宿主生物可以是任何生物,如微生物、动物,如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物,包括啮齿类、无脊椎动物类,例如滑体亚纲,其包括例如青蛙、蟾蜍、蝾螈或东方蝾螈,或植物。哺乳动物的实例包括但不限于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、狗、山羊、猪、鸡、猕猴、黑猩猩或人。
在一些实施方案中,细胞是肿瘤细胞,例如癌细胞。也可从生物,例如从哺乳动物中获得各种肿瘤细胞。在其它实施方案中,所述肿瘤细胞可包括在哺乳动物,例如大鼠、奶牛、猪和人中。也可培养各种肿瘤细胞。其例如可以是细胞系的细胞,如,但不限于,结肠直肠癌细胞系SW480、HT29、RKO、LST-R1、Caco-2、WiDr、GP2d、HCT116、LoVo、LS174T、VACO5HCA7、LS411、C70、LIM1863、SL-174T、SW1417、SW403、SW620、SW837或VACO4A,黑素瘤细胞系A375、B16(包括B16-F10)、BN1、K1735-M2、M14、OCM-1或WM793,肝瘤细胞系FHCC-98、H4IIEHep G2、Hep G2f、Huh-7、PLHC-1、SMMC-7721、SK-Hep1或QGY,肺癌细胞系A549、ABC-1、EBC-1、LC-1/sq、LCD、LCOK、LK-2、Lu135、MS-1、NCI-H69、NCIH157、NCI-N231、NL9980、PC1、PC3、PC7、PC9、PC10、PC14、QG56、RERF-LCMS、RERF-LCAI、RERF-LCKJ、SBC3或SQ5,食管癌细胞系A549、EC109、EC9706或HKESC-4,胃癌细胞系BGC823、KATO-III、MGC803、MKN-45、SGC7901或卵巢癌细胞系A2780、C13*、CAOV3、DOV-13、HO8910(包括HO-8910PM)、OvCA 3、OvCA 420、OvCA 429、OvCA 432、OvCA 433、OvCar 3、OvCar5、OvCA 420、OVHM或SKOV-3。
用于本发明方法中的细胞通常能够表达DACT蛋白,因为其包括一般以DACT蛋白(无论内源还是外源)的功能基因形式存在的编码DACT蛋白(如DACT2或DACT3)的核酸序列。在一些实施方案中,所述细胞表达DACT蛋白。在一些实施方案中,例如编码DACT蛋白的各内源基因在功能上活跃并表达DACT蛋白。在一些实施方案中,编码DACT蛋白的内源核酸序列是功能上活跃的。然而在这些实施方案中的一些实施方案中,DACT蛋白一般从外源DACT基因表达。可通过重组技术,例如通过携带DACT蛋白基因的载体(也参考下文)引入编码DACT蛋白的外源基因。在该方面,进一步使用含有在宿主细胞中有效起始转录的启动子(无论内源还是外源)的载体是有利的。
术语“载体”指可转染到细胞中并在细胞基因组内复制或独立于基因组复制的单链或双链环形核酸分子。可切割环形双链核酸分子并由此通过限制性酶处理将其线性化。本领域技术人员能够容易地获得各种核酸载体、限制性酶和核苷酸序列切割知识。可通过用限制性酶切割载体并连接两个片段将编码DACT蛋白的核酸分子插入到载体中。
如此处所用,术语“启动子”指基因序列表达所需的核酸序列。启动子区因生物不同而有所变化,但本领域技术人员熟知不同生物的启动子区。例如,在原核生物中,启动子区含有启动子(其指导RNA转录的起始)以及DNA序列,当转录成RNA时,其将发起始合成的信号。这种区域通常包括参与转录和翻译起始的那些5′-非编码序列,如TATA盒、帽化序列、CAAT序列等。根据具体实施方案的需要,组成型和诱导型启动子均可用于本发明。众所周知多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子。所选启动子可效连接编码此处所述多肽的顺反子DNA,通过限制酶消化去除来自源DNA的启动子并将分离的启动子序列插入所选载体中实现所述连接。天然启动子序列和许多异源启动子可用于指导所选核酸序列的扩增和/或表达。
如此处所用,术语“核酸”指任何可能构型,如单链、双链或其组合的任何核酸分子。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA的类似物、锁定核酸分子(LNA)、肽核酸分子(PNA)和tecto-RNA分子(例如Liu,B.,等,J.Am.Chem.Soc.(2004)126,4076-4077)。PNA分子是其中主链是假肽而非糖的核酸分子。因此,与例如DNA或RNA相反,PNA一般具有荷电的中性主链。然而,PNA能够杂交至少互补的和基本互补的核酸链,就像DNA或RNA一样(认为PNA是其结构模拟物)。LNA分子具有修饰的RNA主链,其在C4′和O2′之间具有亚甲基桥,所述亚甲基桥锁定了N型构型中的呋喃糖,为各分子提供了更高的双链体稳定性和核酸酶抵抗力。不像PNA分子,LNA分子具有荷电的主链。DNA或RNA可以是基因组或合成来源并可以是单链或双链的。核酸分子一般是寡聚或多聚的。寡聚核酸分子理解为是大致具有约6到约15个单体单元的分子。该核酸可以是例如mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。各核酸还含有非天然核苷酸类似物和/或连接到亲和标记或标签。
已知具有许多核苷酸类似物并且其可用于本发明的方法中。核苷酸类似物是在例如碱基、糖或磷酸部分具有修饰的核苷酸。作为示例性实例,已知2’F,2’O-Me或2’H残基对siRNA的2’-OH残基的取代提高了各RNA的体内稳定性。碱基部分的修饰包括A、C、G和T/U的天然和合成修饰、不同嘌呤或嘧啶碱基,如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基,以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸碱基。其它核苷酸类似物作为通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能够与任何其它碱基形成碱基对。碱基修饰经常与例如糖修饰,如2′-O-甲氧基乙基组合,例如以实现独特的性质(如提高的双链体稳定性)。
可通过增加的表达,通过降低的降解或通过两者的组合来增加细胞中DACT蛋白的量。可通过刺激细胞中内源DACT蛋白的表达来确定DACT蛋白的增加的表达。因此,可刺激编码各DACT蛋白的细胞的各内源基因的转录和翻译或可降低或终止其抑制状态。
也可通过在细胞中表达外源DACT蛋白实现DACT蛋白的增加的表达(上文)。作为示例性实例,例如以载体的形式将包括编码各DACT蛋白的序列的核酸分子引入各细胞中。
在一些实施方案中,提高细胞中DACT蛋白的活性包括在DACT蛋白与化合物,如有机低分子量化合物、无机化合物、肽或蛋白质之间形成复合体。
如上指出,在一些实施方案中,细胞不表达DACT蛋白。在此类实施方案中,本发明的方法可包括激活编码DACT蛋白的内源基因。在一些实施方案中,本发明的方法包括向细胞中引入核酸分子,通常是异源核酸分子(上文),其编码DACT蛋白,其能够允许该蛋白质在细胞中表达。此类实施方案中的方法还包括表达外源DACT蛋白。
本发明的方法和用途可还包括评估细胞中DACT蛋白或DACT蛋白的相应功能片段的量或活性。
例如可通过抗体如缀合到标记上的免疫球蛋白来评估细胞中DACT蛋白的量。在细胞是分离的细胞或微生物的情况下,例如在细胞膜透化后将细胞内免疫球蛋白引入细胞。然后可在体内或离体进行检测。在一些实施方案中,例如对细胞提取物或细胞裂解物体外进行所述检测。此类技术可包括电泳、HPLC、流式细胞术、荧光相关光谱学或这些技术的修饰形式或组合。
术语“抗体”一般指免疫球蛋白、其片段或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。(重组)免疫球蛋白片段的实例是Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双抗体、三抗体(Iliades,P.,等,FEBS Lett(1997)409,437-441),四抗体(Stone,E.,等,Journal of Immunological Methods(2007)318,88-94)和其它结构域抗体(Holt,L.J.,等,Trends Biotechnol.(2003),21,11,484-490)。具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子的实例是基于脂笼蛋白家族的多肽的突变蛋白(WO 2003/029462;WO 2005/019254;WO2005/019255;WO 2005/019256;Beste等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96,1898-1903)。脂笼蛋白,如后胆色素结合蛋白、人嗜中性粒细胞明胶酶结合的脂笼蛋白、人载脂蛋白D、人眼泪脂笼蛋白或生殖糖蛋白具有天然配体结合位点,其可被修饰使得它们结合所选的称为半抗原的小蛋白区域。其他蛋白质结合分子的其它非限制性实例是所称作的球体(glubody)(参阅WO 96/23879)、基于锚蛋白支架的蛋白质(Mosavi,L.K.,等,Protein Science(2004)13,6,1435-1448)或基于晶状支架的蛋白质(WO2001/04144)、Skerra描述的蛋白质(J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187)、AdNectins、四连蛋白、Avimers和拟肽。Avimers含有所谓的A结构域,其在几种细胞表面受体中作为多个结构域串出现(Silverman,J,等,Nature Biotechnology(2005)23,1556-1561)。来自人纤连蛋白结构域的Adnectins含有三个环,其可被改造用于免疫球蛋白样结合靶标(Gill,D.S.& Damle,N.K.,Current Opinion in Biotechnology(2006)17,653-658)。来自各种人同三聚体蛋白质的四连蛋白同样在C型凝集素结构域中含有环区,其可被改造用于想要的结合(上文)。可作为蛋白质配体的拟肽是不同于肽的寡聚(N-烷基)甘氨酸,因为侧链连接酰胺氮而非α碳原子。拟肽通常对蛋白酶和其它修饰酶具有抗性并且比肽具有高得多的细胞渗透性(参阅例如Kwon,Y.-U.,和Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。当想要时,可使用修饰剂进一步增加各部分对任何或某一形式、类型等的靶物质的亲和力。
评估DACT蛋白活性可包括测定所述蛋白质与Dv1蛋白的结合。此类测定例如依赖于体内和体外的光谱、光化学、光度计、荧光计、放射学、酶学或热力学手段。光谱检测方法的实例是荧光相关光谱学(参阅例如Haustein,E.,& Schwille,P.,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2007)151-169)。光化学方法例如是光化学交联。光敏的、荧光的、放射性的或酶促标记各自的用途是光度计、荧光计、放射学和酶促检测方法的示例性实例。作为示例性实例,也可以使用荧光团和量子点,包括体内测定(参阅例如D.S.,等,Current Protocols in Cell Biology(2007)25.1.1-25.1.18,doi:10.1002/0471143030.cb2501s36)。体内荧光用途的其它示例性实例是在双分子荧光互补方法中使用合适的蛋白质,例如增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、“超折叠GFP”(sfGFP)或增强的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)(对于综述参阅例如Shyu,Y.J.,& Hu C.-D.,Trends Biotech.(2008)26,11,622-630)。Xie et al.(Annu.Rev.Biophys.(2008)37,417-44)给出了使用荧光探针的一般性综述。检测可例如基于荧光共振能量转移或光谱。热力学检测方法的实例是等温滴定量热法。测定DACT蛋白与Dvl蛋白结合的合适方法的又一实例是表面等离振子共振技术,如局部表面等离子体共振(例如Endo,T.,等,Analytica Chimica Acta(2008)614,2,182-189)。这些方法中的一些可包括额外的分离技术,如电泳或HPLC。详细地说,标记用途的实例包含作为探针的化合物或具有附着酶的免疫球蛋白,其催化的反应产生可检测的信号。使用放射性标记和通过电泳分离的方法的实例是电泳迁移率变动分析。
评估细胞中DACT蛋白的量也包括评估细胞中编码各DACT蛋白的核酸例如RNA的量。核酸探针可用于通过任何常见杂交方法探测样品以检测DACT蛋白的核酸分子的量。为了获得核酸探针,可进行化学合成。合成的核酸探针首先可用作聚合酶链式反应(PCR)中的引物,该PCR根据公认的PCR技术,主要根据标准PCR方案,利用合适的模板进行来获得本发明的探针。本领域的技术人员将能够容易地基于为DACT蛋白获得的序列设计这种探针。可通过标准的标记技术如用放射性标记、酶标记、荧光标记、生物素-亲和素标记、化学发光、纳米颗粒等标记杂交探针。杂交后,使用标准技术显示探针。尽管技术人员熟知该事实,保险起见应注意的是在大多数实施方案中,在细胞中核酸量的评估不足以评估细胞中蛋白质的量,因为细胞中各蛋白质的半衰期不能仅基于编码核酸评估。然而,该技术可用于某些实施方案或与使用蛋白质结合剂组合例如用于验证目的。
如上指出,在一些实施方案中,可通过在细胞中增加内源核酸序列,通常是编码所述DACT蛋白的基因的表达来增加细胞中DACT蛋白的量。可通过实现外遗传改变实现这种表达的增加。因此,在一些实施方案中,本发明的方法是外遗传方法。例如可通过实现一种或更多翻译后组蛋白修饰模式的改变来进行提高DACT蛋白的表达。例如其可通过实现组蛋白甲基化的改变来进行。其也可通过实现组蛋白乙酰化的模式的改变来进行(也参阅下文)。在一些实施方案中,改变组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化的模式。在一个实施方案中,在DACT蛋白的基因座处,如DACT3蛋白的基因座处改变组蛋白甲基化和/或组蛋白乙酰化的模式。作为实例,编码DACT3蛋白的NCBI GeneID 629378的基因定位在小鼠基因组7号染色体位置7A2上。编码DACT3蛋白的具有NCBI GeneID 539209的相应基因定位在牛基因组18号染色体位置LOC539209上。在黑猩猩基因组19号染色体位置LOC745677和人基因组19号染色体位置19q13.32上发现了相应基因。编码DACT2蛋白的NCBI GeneID 240025的基因定位在小鼠基因组17号染色体位置17A2上。在黑猩猩基因组(NCBIGeneID 742130)6号染色体位置LOC741906和LOC742320之间、猕猴基因组4号染色体位置LOC694467、人基因组(NCBI GeneID 168002)6号染色体位置6q27、大鼠基因组1号染色体位置1q12、斑马鱼基因组6号染色体位置LOC799123和LOC100000099之间以及鸡基因组(NCBI GeneID421561)3号染色体邻近LOC395933位置处发现了相应基因。在一些实施方案中,检测一个或更多,或任何上文命名的外遗传改变(也参阅上文)。在一些实施方案中,在所选时间里监测一个或更多外遗传改变。监测该改变例如可用于监测治疗、预测对治疗的反应或确定诊断。监测外遗传改变以及监测DACT蛋白的水平或活性可进一步定义为确定个体对癌治疗的抵抗力,特别是定义为确定对通式(I)的化合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合的抵抗力。当个体对这种癌治疗具有抵抗力时,可对所述个体施用备选的癌治疗。
可使用本领域确定的常规方法检测技术人员称为可逆改变的外遗传改变(对于一般介绍,参阅例如Iacobuzio-Donahue,C.A.,Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.(2009)4,229-249)。作为实例,甲基化特异性PCR,为基于亚硫酸氢盐转化的聚合酶链式反应技术。为此,使用对未甲基化DNA(U)特异的一对引物,和对甲基化DNA(M)特异的一对引物(也参考下文实施例)。各引物对中至少一条引物具有有一个或更多CpG位点的序列。作为四个其它实例,亚硫酸氢盐基因组测序、亚硫酸氢盐焦磷酸测序、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)和甲基化敏感的单链构象分析(MS-SSCA)可用于测定DNA分子胞嘧啶残基的任何甲基化。在这些方法中,用亚硫酸氢盐处理DNA,引起胞嘧啶残基脱氨成尿嘧啶,而5-甲基胞嘧啶残基保持大部分完整。作为两个其它实例,甲基化特异性限制性分析和甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)可用于评估DNA甲基化。
外遗传改变一般伴随备选的基因表达模式。此类改变包括例如DNA的一个或更多共价修饰,如胞嘧啶甲基化,一个或更多染色体蛋白质,尤其是组蛋白的一个或更多共价修饰,和染色体外调节性小RNA和非编码RNA分子群体的形成。在该方面,肉眼可见的染色质由DNA和周围缠绕DNA的组蛋白构成。组蛋白装配成由两个拷贝的组蛋白2A、组蛋白2B、组蛋白3和组蛋白4组成的八聚体。
迄今为止在体外和体内获得的数据表明外遗传改变不仅是基因表达的反映,在该方面还指导基因表达或引发基因。某些这些改变引起转录沉默,而其它改变激活转录。因此,在各细胞中存在翻译后外遗传修饰的模式。改变这些修饰中单个修饰,例如改变基因组中一个碱基的甲基化从而导致翻译后外遗传修饰的细胞模式的改变,并可产生改变的基因活性状态。因此,单个基因型可采取赋予不同表型的多种后生型。与等位基因的存在类似,因此也存在表等位基因。已经在多种癌中发现了外遗传改变,例如整体DNA低甲基化或启动子超甲基化(参考Iacobuzio-Donahue,2009,上文)。
组蛋白的外遗传修饰因此是翻译后修饰。已知有许多组蛋白的翻译后修饰,并且更多的可能仍未发现。在本发明方法的过程中,可改变,例如添加、去除或防止改变任何此类组蛋白修饰。迄今为止已经发现组蛋白的乙酰化、磷酸化和泛素化增加转录,而发现苏素化减少转录。在一些情况下已经发现组蛋白甲基化增加转录,在其它情况下减少转录。通过特定酶如组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白甲基转移酶或某些转录因子如具有组蛋白乙酰转移酶活性的激活转录因子2(ATF2)或CLOCK实现这些修饰的改变。组蛋白甲基化特别复杂并可以单、二(me2)或三甲基化(me3)状态存在。这些状态的每一种状态均可募集独特的辅调蛋白并对转录活性施加不同的影响。此外,组蛋白各赖氨酸残基的甲基化对转录具有不同,且经常相反的影响。
例如可通过染色质免疫沉淀(ChIP)检测组蛋白、特别是高度保守的核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的修饰,如单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化或磷酸化。通常用交联分子如甲醛或3,3’-二硫代丙亚氨酸二甲酯将组蛋白与DNA交联。在细胞裂解并且DNA片段化后,可使用特异性抗体检测改变的或未改变的组蛋白的存在。适合于检测组蛋白修饰的技术的其它实例是质谱技术(参阅例如Brumbaugh,J.,等,Epigenetics(2008)3,5;可在http://www.landesbioscience.com/_journals/epigenetics/article/7005获得)。例如可通过串联MS方法测定组蛋白任何修饰的位置。第一步,可通过蛋白质水解消化产生组蛋白片段。然后例如可通过碰撞激活解离(CAD)MS/MS进行测序。作为另一此类方法,如上述可进行亚硫酸氢盐-转化。然后,DNA分子或其目的片段例如可在体外转录成RNA,然后使用RNase A进行碱基特异性切割,并通过MALDI-TOF分析切割的片段。
如上解释,已知外遗传事件在没有DNA突变的情况下在基因表达中诱导改变。在该方面,本发明的方法也涉及鉴定与DACT蛋白的改变表达相关的外遗传模式。肿瘤细胞,特别是癌细胞用于介导不适当的基因表达的基因调节的两个主要外遗传机制是DNA甲基化和组蛋白修饰,其通常在赖氨酸或精氨酸侧链上。基因启动子区域中CpG富含区的超甲基化通过阻断转录因子的进入或通过增强转录阻抑物的结合诱导转录沉默,并认为是通过引起肿瘤抑制基因的表达降低在癌中起重要作用。异常的组蛋白修饰如低乙酰化通过肿瘤抑制基因的转录沉默同样与恶性肿瘤相关。组蛋白结合DNA并调节染色质结构,并且组蛋白脱乙酰化通过如下事实介导转录抑制:从组蛋白去除乙酰基团允许它们与DNA更紧密相互作用,由此限制DNA用于转录的可及性。通过组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的相反活性调节组蛋白乙酰化。
前面已知外遗传事件可促进包括癌细胞中Wnt/β-联蛋白信号转导途径的异常激活。在人结肠直肠癌细胞中已经报道了导致细胞外Wnt抑制子,如分泌的Frizzled相关蛋白(SFRPs)、Wnt抑制因子1(WIF-1)和DICKKOPF-1(DKK-1)转录沉默的启动子甲基化(Aguilera,O.,等,Oncogene(2006)25,4116-4121;He等,2005,上文;Morin等,1997,上文;Suzuki,H.,等,Nat Genet(2002)31,141-149)。相反,Wnt抑制子表达如SFRP1/2的恢复甚至在存在下游APC或β-联蛋白突变的情况下也导致Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制和结肠直肠癌细胞的程序性细胞死亡(Baylin,S.B.,& Ohm,J.E.,Nat Rev Cancer(2006)6,107-116;Suzuki,H.,等,Nat Genet(2004)36,417-422)。与本发明方法和用途相反,外遗传沉默领域中的努力至今却集中在直接干扰癌细胞中与TCF/β联蛋白介导的转录激活上(Barker & Clevers,2006,上文;Lepourcelet等,2004,上文)。
本发明方法的一些实施方案包括实现或防止翻译后组蛋白修饰的模式,如组蛋白甲基化和/或组蛋白乙酰化的改变。实现翻译后组蛋白修饰的改变可包括在一个或更多氨基酸位置上实现一个或更多翻译后组蛋白修饰的去除。该修饰例如可以是转录抑制修饰。实现翻译后组蛋白修饰模式改变可包括在一个或更多氨基酸位置上实现一个或更多翻译后组蛋白修饰的添加。在该方面,术语“添加”指共价结合相应氨基酸,例如共价附着甲基或乙酰基基团的形成。该修饰例如可以是转录激活修饰。实现翻译后组蛋白修饰模式的改变也可包括在一个或更多氨基酸位置上抑制或防止一个或更多翻译后组蛋白修饰的去除。在一些实施方案中,翻译后组蛋白修饰的改变包括在两个氨基酸位置上翻译后组蛋白修饰的改变。在一些实施方案中,可实现激活翻译后组蛋白修饰和失活(抑制)翻译后组蛋白修饰的组合。在一些实施方案中,可实现去除一个或更多转录抑制翻译后组蛋白修饰和添加一个或更多转录激活翻译后组蛋白修饰的组合。
在下文实施例中还示例的是,本发明人已经在DACT3启动子中鉴定了组蛋白甲基化模式,其包括抑制和激活组蛋白甲基化事件的共存。在一些实施方案中,本发明预后和诊断的方法包括检测此类组蛋白甲基化模式的存在。对应地,预防、阻止或逆转细胞中肿瘤发生方法的一些实施方案包括降低或去除激活组蛋白修饰的组合,例如甲基化和失活组蛋白修饰,例如甲基化,或防止该组合的形成。本发明的一些方法包括检测激活组蛋白甲基化和失活组蛋白甲基化的此类组合的存在。本发明的一些方法还包括其它外遗传修饰,如DNA甲基化的检测。还可在本发明方法的一些实施方案中改变这种其它的外遗传修饰或防止其改变。
在本发明方法的一些实施方案中,在一个或更多组蛋白氨基酸位置上实现转录抑制翻译后组蛋白修饰的去除,所述实施方案包括引起翻译后组蛋白修饰模式的改变。在本发明方法的一些实施方案中,在一个或更多组蛋白氨基酸位置上实现转录激活翻译后组蛋白修饰的附着,所述方案包括引起翻译后组蛋白修饰模式的改变。在防止翻译后组蛋白修饰抑制模式改变的一些实施方案中,在组蛋白氨基酸位置上引起转录抑制翻译后组蛋白修饰附着的抑制或阻断。在防止翻译后组蛋白修饰抑制模式改变的一些实施方案中,在组蛋白氨基酸位置上引起转录激活翻译后组蛋白修饰去除的抑制或阻断。
在该方法的一些实施方案中,实现转录抑制翻译后组蛋白修饰的去除与转录激活翻译后组蛋白修饰的附着的组合。合适的激活翻译后组蛋白修饰的实例包括,但不限于组蛋白3上赖氨酸4的甲基化、组蛋白3上赖氨酸9的乙酰化和组蛋白3上赖氨酸14的乙酰化。合适的抑制性翻译后组蛋白修饰的实例包括,但不限于组蛋白3上赖氨酸9的甲基化、组蛋白3上赖氨酸27的甲基化和组蛋白4上赖氨酸20的甲基化。
通过应用,例如施用化合物或化合物的组合在本发明的特定方法和用途的一些实施方案中引起组蛋白甲基化和/或组蛋白乙酰化模式的改变。如下文解释,可使用鉴定在该方面有效的化合物的方法鉴定此类化合物。合适的化合物的其它实例是通式(I)的化合物(上文,也参阅下文)。化合物组合的示例性实例是通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合。
除了或除改变各细胞的内源组蛋白的甲基化和/或乙酰化模式之外,可使用异源组蛋白。例如可在细胞中通过常规重组技术表达编码组蛋白的异源核酸分子形成此类异源组蛋白。当与细胞的内源组蛋白相比时,该组蛋白可具有突变/改变,其模拟具有特定甲基化/乙酰化模式的组蛋白或者其在目的位置不能被甲基化和/或乙酰化。在进行体外方法时,一个或更多分离的组蛋白也可进行化学修饰。也可使用一个或更多氨基酸衍生物,例如一个或更多甲基化赖氨酸类似物在体外形成组蛋白。
本发明的一些方法和用途包括或旨在在参与细胞增殖病症,如超常增生、发育不良和癌前病变的一个或更多细胞中诱导程序性细胞死亡。在一些实施方案中,这些方法包括或旨在在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。程序性细胞死亡是编程性细胞死亡并通常是多细胞生物中去除不想要的细胞的机制。当细胞经历或起始程序性细胞死亡的能力受损或终止时,损坏的细胞能够以不加控制的方式增殖,由此发展成癌细胞。凋亡细胞显示了特征性形态,在显微镜下通过所述特征性形态其可以得到鉴定。通过在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡,还可使用相应的方法作为治疗或预防癌症的疗法。
在一些实施方案中,通过改变,例如增加蛋白质β-联蛋白的磷酸化状态在肿瘤细胞,包括癌细胞中诱导程序性细胞死亡。在此类实施方案中,例如通常通过改变肿瘤细胞中DACT蛋白质的量和/或活性改变,例如增加蛋白质β-联蛋白的磷酸化状态。作为示例性实例,可在肿瘤细胞中增加DACT蛋白质的量,由此降低肿瘤细胞中dishevelled蛋白质的量。例如一旦在dishevelled蛋白质和DACT蛋白之间形成了复合体,可通过降解降低肿瘤细胞中dishevelled蛋白的量。因此,可激活蛋白糖原合酶激酶3,由此增加蛋白质β-联蛋白的磷酸化状态。
需要时,例如通过溴化乙锭染色、膜联蛋白V-FITC染色、流式细胞分析或其组合,以及线粒体功能异常或胱天蛋白酶3激活监测肿瘤细胞中的程序性细胞死亡的进程。本发明的方法通常触发凋亡细胞死亡应答,涉及线粒体破裂和胱天蛋白酶激活。然而,非癌性细胞仅显示微小的细胞死亡响应(如果存在)。在一些实施方案中,除了在各细胞中测定程序性细胞死亡,本发明方法可包括在各细胞中测定细胞活力。在本领域中良好建立了各方法。
如上指出,在本发明方法的一些实施方案中,在各细胞中降低dishevelled蛋白和/或DACT蛋白的量。这可通过将异源分子,如核酸分子引入细胞中来进行。作为实例,可使用非编码核酸分子,例如适体或(描述于WO 01/92655)。非编码核酸分子也可以是nc-RNA分子(对于天然nc-RNA分子的介绍,参阅例如Costa,FF,Gene(2005),357,83-94)。nc-RNA分子的实例包括,但不限于反义RNA分子、L-RNA、沉默RNA分子(如双链神经元限制性沉默子元件)、微小RNA(miRNA)分子、短发夹RNA(shRNA)分子、小干扰RNA(siRNA)分子、重复相关的小干扰RNA(rasiRNA)分子或与Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)(简短的综述,参阅例如Lin,H.,Science(2007)316,397)。此类非编码核酸分子例如可用于指导mRNA降解或终止mRNA翻译。
小干扰RNA的使用变成了“击倒”特异基因的工具。Weiss等已经给出了合成小有机化合物和RNAi用途之间差异的综述(Nature Chem.Biol.(2007)3,12,739-744)。小的干扰RNA通过RNA干扰(RNAi)利用基因沉默或基因抑制,其在翻译后水平上发生并涉及mRNA降解。RNA干扰代表了保护基因组的细胞机制。SiRNA分子通过连接siRNA与多酶复合体形成所谓的RNA诱导的沉默复合体(RISC)介导其互补RNA的降解。所述siRNA变成RISC的一部分并靶向互补RNA种类,其然后被切割。这导致各基因表达的损失(对于简短综述参阅Zamore,PD,&Haley,B,Science(2005)309,1519-1524)。该技术例如应用于沉默寄生DNA序列,如HIVRNA的切割,如在美国专利申请2005/0191618中公开。
当siRNA分子从外源双链RNA形成时,miRNA分子是从基因组转录的RNA分子,尽管其在结构上与siRNA分子类似。原则上,miRNA分子可以与siRNA分子相同的方式进行操作(对于综述,参阅例如Liu,J.,Current Opinion in Cell Biology(2008)20,214-221)。尽管最初仅知道miRNA作用于转录物3’-非翻译区,同时还已经描述了miRNA,其可在单个mRNA分子的编码序列或不同mRNA分子的CDS中同时靶定几个位点(Tay,Y.,等,Nature(2008)doi:10.1038/nature07299)。还揭示了短干扰RNA分子可通过与siRNA仅部分互补的编码序列内的位点调节基因表达(如上)。这些发现打开了指导蛋白质的所选同种型、剪接变体或突变体的降解或破坏其翻译的可能性。
本发明siRNA或miRNA的典型实施方案包括约10到35个核苷酸的体外或体内合成分子,在一些实施方案中为约15到25个核苷酸。在目的细胞,包括微生物和动物部分的细胞中直接合成各siRNA或miRNA分子。其也可以引入各细胞和/或递送到各细胞中。向所选的细胞体内递送siRNA分子的示例性实例是其非共价结合重链抗体片段(Fab)和核酸结合蛋白鱼精蛋白的融合蛋白(Song,E.等,Nature Biotech.(2005)23,6,709-717)。在本发明的实施方案中,使用siRNA和/或miRNA分子诱导编码一个或更多DACT蛋白或目的dishevelled蛋白的mRNA分子的降解。
如上指出,Wnt/β-联蛋白途径的激活在癌干细胞形成中起作用(Malanchi等,2008,上文)。也有证据表明Wnt/β-联蛋白信号转导在上皮干细胞和早期祖细胞的维持中起重要作用(de Lau,W.,等,Front Biosci(2007)12,471-491;Fodde,R.,& Brabletz,T.,Curr Opin Cell Biol(2007)19,150-158)。已经显示激活Wnt/β-联蛋白途径的GSK-3抑制剂6-溴代靛红玉-3′-肟维持多能性人和小鼠胚胎干细胞的未分化状态(Sato,N.,等,NatureMedicine(2004)10,1,55-63)。已经显示通过Wnt/β-联蛋白途径的激活引起成人骨骼肌的干细胞群体卫星细胞的增殖(Otto,A.,等,Journal of CellScience(2008)121,2939-2950)。已经显示Wnt/β-联蛋白信号途径的抑制降低了兔胚胎干细胞的多潜能性和增殖能力并导致了其增强的分化(Wang,S.,等,J.Biol.Chem.(2008)doi/10.1074/jbc.M804091200)。还已经显示果蝇(Drosophila)的多能肠干细胞的维持和自我更新依赖对应于Wnt/β-联蛋白信号途径的途径,其为Wingless(Wg)途径(Lin,G.,等,Nature(2008)455,1119-1124)。同样,已经显示通过Wnt/β-联蛋白途径的激活增强了体细胞向诱导的干细胞的重新编程(Marson等,2008,上文)。在该方面,还有数据表明在腺瘤获得完全转化APC突变之前,上调Wnt/β-联蛋白信号途径的初始外遗传事件可能在结肠直肠腺瘤中发生(Siu,I.M.,等,Cancer Res(1999)59,63-66;Suzuki等,2004,上文)。DACT3处的二价组蛋白修饰是一个此类外遗传事件。本发明的组合药理学方法(其在一些实施方案中靶定结肠直肠癌细胞特征性外遗传特征并且能够消除Wnt/β-联蛋白信号转导)可能具有靶向癌干细胞的潜力,所述癌干细胞依赖于这种基因沉默机制并需要高水平的Wnt/β-联蛋白信号活性用于其自我更新和存活。
因此,本发明的方法也可用于控制,包括防止和终止干细胞的维持和/或增殖。在一些实施方案中,该干细胞可以是癌干细胞,例如结肠癌干细胞。结肠癌干细胞,也称为结肠癌肿瘤起始细胞通常发现于原发结肠癌中(例如Huang,E.H.,& Wicha,M.S.,Trends Mol.Med.(2008)14,11,503-509)。本发明的方法还可用于控制,包括防止或终止至少部分分化细胞的重新编程,如体细胞向多能细胞,尤其是干细胞的重新编程。在后一种情况的典型实施方案中,所述方法是控制,包括防止和终止至少部分分化细胞的去分化的方法。在一些实施方案中,该方法是防止癌细胞形成的方法。
在一些实施方案中,本发明的方法可以是在治疗和/或预防心血管疾病或病症如心肌梗塞中的方法或用途。如在国际专利申请WO 2008/122440中公开的,β-联蛋白的消耗对心脏具有保护效果。在该公开内容中显示β-联蛋白的下调在成人心脏中起始适应性心肌细胞肥大并在血管紧张肽II-诱导的应激后恢复保护性肥大需要的信号途径。本发明的方法导致激活的β-联蛋白水平的降低(参考例如图6A)和TCF/β-联蛋白靶基因的表达(参考例如图6C和图6D)。已经显示该影响导致适应性心脏肥厚,其具有心脏保护性功能(WO/2008/122440)。本领域技术人员将理解与前述方法相反(如上),本发明方法的一些实施方案可在不需要向靶细胞插入外源DNA的情况下实现该效果。
在一些实施方案中,本发明的方法或用途包括使用以下通式(I)的化合物
在该通式(I)中,A是CH或N,R4和R5是H或独立选择的脂肪族基团、脂环族基团、芳香族基团、芳基脂肪族基团和芳基脂环族基团,其可任选地包括0-6个,在一些实施方案中0-4个,并且在一些实施方案中0-3个杂原子。所述杂原子可以是N、O、P、S、Se或Si。在一些实施方案中,R4和R5可以相同。在一些实施方案中,R4和R5可以连接以确定脂肪族桥,例如烃基桥。各桥可以例如包括1-12个,在一些实施方案中2-10个,并且在一些实施方案中2-8个主链碳原子,并含有1-5个,在一些实施方案中1-4个,并且在一些实施方案中1-3个选自N、O、P、S、Se和Si的杂原子。R2可以是H或卤素原子,如F、Cl、Br或I。在一些实施方案中,R2是F或Cl。R3可以是H,卤素原子如F或Cl,或脂肪族、脂环族、芳香族、芳基脂肪族、芳基脂环族烃基基团。该烃基基团可包括1-12个,在一些实施方案中1-8个,并且在一些实施方案中1-4个主链碳原子和0-4,如0-3、0-2个选自N、O、P、S、Se或Si的杂原子。烃基基团还可结合任一取代基或多个取代基(见下文),其包括一个或更多官能团,如卤素,例如F或Cl。
杂原子是不同于碳原子的任何原子。实例包括,但不限于N、O、P、S、Si和Se。其中在本发明方法的反应物或产物的部分中存在几个杂原子时,它们可独立地选择。
除非另有说明,术语“脂肪族的”表示直链或分支烃链,其可以是饱和的或单不饱和或多不饱和的。不饱和脂肪族基团含有一个或更多双键和/或三键。烃链的分支包括线性链以及非芳香族环状元素。除非另有说明,烃链可以是任何长度并含有任何数量的分支。主链以及分支还可包含杂原子,例如N、O、P、S、Se或Si。
除非另有说明,术语“脂环族的”表示非芳香环状烃部分,其可以是饱和的或单不饱和或多不饱和的。环状烃部分可用成非芳香环以及链元素取代。除非另有说明,环状烃部分的主链可以是任何长度并含有任何数量的非芳香环状和链元素。环状烃部分及环状和链状取代基还可包含杂原子,例如N、O、S、Se或Si。
除非另有说明,术语“芳香族的”表示共轭双键的平面环状烃部分,其可以是单环或包括多个稠合的或共价连接的环。除非另有说明,环状烃部分的主链可以是任何长度并含有任何数量的杂原子,例如N、O、和S。
术语“芳基脂肪族”表示烃部分,其中一个或更多芳基附着到一个或更多脂肪族基团上或是其上的取代基。因此,术语“芳基脂肪族”包括例如烃部分,其中两个或更多芳基通过一个或更多脂肪族链或任何长度的链,如亚甲基连接。
如此处所用,术语“脂肪族的”、“脂环族的”、“芳香族的”和“芳基脂肪族”意在包括各部分的取代和非取代形式。取代基可以是任何功能基团,例如,但不限于氨基、酰氨基、叠氮基、羰基、羧基、氰基、异氰基、二噻烷、卤素、羟基、硝基、有机金属、有机硼、硒基、甲硅烷基、silano、磺酰基、硫代、氰硫基、三氟甲基磺酰基、对-甲苯磺酰基、溴代苯磺酰基、硝基苯磺酰基和甲烷磺酰基。
可将通式(I)的典型化合物认为是腺苷的类似物(包括碳环类似物)。合适的化合物的示例性实例是3-deazaneplanocin A(5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,化学文摘号102052-95-9),5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(1-羟乙基)-3-环戊烯-1,2-二醇,化学文摘号146424-81-9,5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(1,1-二羟丙基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.851071-63-1,5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-[1-羟基-2-丙烯基]-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.851071-61-9,5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-4-氟-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.127828-67-5,5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(2-丙烯基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.851071-58-4,5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-甲基-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.224453-13-8,5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.111005-71-1,5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-4-氯-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.127828-64-2,5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.88824-06-0,4-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3a,6a-二氢-2,2-二甲基-4H-环戊二烯并-1,3-间二氧杂环戊烯-6-甲醇,CAS-No.88824-08-2,N-[9-[5-(乙酰氧基)-4-羟基-3-(羟甲基)-2-环戊烯-1-基]-9H-嘌呤-6-基]-苯甲酰胺,CAS-No.83844-33-1,5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(甲氧基甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.138571-48-9,4-甲基-苯甲酸[3-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基-5-[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-1-环戊烯-1-基]甲酯,CAS-No.142888-07-1,5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.(盐酸盐)138660-07-8,5-(6-氨基-8-氯代-9H-嘌呤-9-基)-4-氯代-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.127828-72-2,3-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4,5-二羟基-1-环戊烯-1-羧酸,CAS-No.179929-29-4,5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-丙基-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.851071-49-3,5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(氟代甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.303964-14-9,5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟代-3-(氟代甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.805245-51-6,5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟代-3-(巯基甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.805245-54-9,5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(1-羟基-2-丙炔基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.141794-36-7,9-[(3aS,4R,6aR)-6-[[[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]氧基]甲基]-3a,6a-二氢-2,2-二甲基-4H-环戊二烯并-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺,CAS-No.952418-12-1,9-[(3aS,4R,6aR)-3a,6a-二氢-2,2-二甲基-6a-[2-(三苯基甲氧基)乙基]-4H-环戊二烯并-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺,CAS-No.902455-29-2,9-[(3′aS,6′aR)-3′a,6′a-二氢螺[环己烷-1,2′-[4H]环戊二烯并[1,3]间二氧杂环戊烯]-4′-基]-9H-嘌呤-6-胺,CAS-No.874443-97-7,9-[(3aS,4R,6aR)-3a,6a-二氢-2,2-二甲基-6-(三氟代甲基)-4H-环戊二烯并-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺,CAS-No.872624-41-4,(1S,2R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(三氟代甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.872624-35-6,(1S,2R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(1,1-二羟基-2-丙烯基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.851071-54-0,(1S,2R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(2-丙烯基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No 851071-50-6,1-[(3′aS,6′aR)-3′a,6′a-二氢螺[环己烷-1,2′-[4H]环戊二烯并[1,3]间二氧杂环戊烯]-4′-基]-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4-胺,CAS-No.874443-98-8,(1R,2S,5S)-5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.948306-87-4,(1S,2R,5S)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟代-3-(氟代甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇,CAS-No.805245-51-6,CAS-No.1062238-89-4的化合物,CAS-No.1062238-85-0的化合物,CAS-No.1062238-82-7的化合物,CAS-No.1062238-79-2的化合物,CAS-No.1062238-77-0的化合物,和CAS-No.1062238-66-7的化合物。
通式(I)的化合物例如通常能够引起或防止翻译后组蛋白修饰模式,特别是一个或更多组蛋白甲基化或组蛋白乙酰化的改变。此类化合物通常能够引起组蛋白3上赖氨酸27的脱甲基化或组蛋白4上赖氨酸20的脱甲基化和/或防止这些赖氨酸残基,特别是如图5C中所示在DACT蛋白质基因座上这些赖氨酸残基的甲基化。
在一些实施方案中,通式(I)的化合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂组合使用。任何组蛋白脱乙酰酶抑制剂可用于本发明的上下文中。已经描述了来自多种化学类别的组蛋白脱乙酰酶抑制剂,其具有四个最重要的类别,即(i)异羟肟酸类似物,(ii)苯甲酰胺类似物,(iii)环肽(一般是四肽)/肽内酯类和(iv)脂肪酸类似物。组蛋白脱乙酰酶抑制剂在其针对多种组蛋白脱乙酰基酶的特异性上不同。根据其序列同源性和表达模式将这些酶分成四个主要类别。组蛋白脱乙酰酶抑制剂在其对四个主要类别的组蛋白脱乙酰酶的特异性上不同。根据其序列同源性和表达模式将这些酶分成四个类别。一般地,异羟肟酸类似物对类别I,II、IV酶有效,苯甲酰胺类似物对类别I有效,并且一些也对类别II、III和/或IV有效,环肽/肽内酯类对类别I有效,脂肪酸类似物对类别I和II有效。Smith和Workman最近已经给出了关于组蛋白脱乙酰酶抑制剂的简短综述(International Journal of Biochemistry & Cell Biology(2008)doi:10.1016/j.biocel.2008.09.008),并且在更广背景中,Szyf也给出了这方面的综述(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(2009)49,243-263)。
组蛋白脱乙酰酶抑制剂的合适实例包括,但不限于N′-羟基-N-苯基-辛二酰胺(辛二酰苯胺异羟肟酸,SAHA)、pyroxamide、M-羧基肉桂酸双羟酰胺(CBHA)、曲古抑菌素A(TSA)、曲古抑菌素C、水杨酸基异羟肟酸(SBHA)、壬二双羟肟酸(azelaic bishydroxamic acid)(ABHA)、壬二-1-异羟肟酸-9-苯胺(AAHA)、6-(3-氯代苯基脲基)carpoic异羟肟酸(3C1-UCHA)、oxamflatin、A-161906、scriptaid、PXD-101、LAQ-824、含异羟肟酸的环肽(CHAP)、ITF-2357、MW2796、MW2996、trapoxin A、FR901228(FK 228或Depsipeptide)、FR225497、apicidin、CHAP、HC-毒素、WF27082、chlamydocin、丁酸钠、异戊酸盐、戊酸盐、4-苯丁酸盐(4-PBA)、4-苯基丁酸钠(PBS)、精氨酸丁酸酯、丙酸盐、丁酰胺、异丁酰胺、苯乙酸盐、3-溴代丙酸盐、丁酸甘油酯、丙戊酸、丙戊酸盐、CI-994、MS-27-275(MS-275或SNDX-275)、MS-27-275的3′-氨基衍生物、MGCD0103或Depudecin,和SNDX-275。目前在临床上检测了许多组蛋白脱乙酰酶抑制剂,FDA目前已经批准SAHA()用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中,组蛋白脱乙酰酶抑制剂是通式(II)或通式(III)的化合物:
在这些通式(II)和(III)中,L是包括脂肪族或芳基脂肪族基团的桥,其包括1到约8个主链碳原子和0到约3个杂原子,如N、O或Si。R6是H,氨基、醚基团、脂肪族基团或芳基脂肪族基团。R6是氨基时,可用两部分独立取代该氨基。这些例如可以是H、脂肪族基团、脂环族基团、芳香族基团、芳基脂肪族基团或芳基脂环族基团。此类基团可以独立地包括0到约3个杂原子,如N、O、S或Si。R6是醚基团时,可用脂肪族、脂环族、芳香族、芳基脂肪族或芳基脂环族基团取代醚基团的氧原子,所述基团可包括0到约3个杂原子,如N、O、S或Si。
通式(II)的实例包括,但不限于,7-[R-(E,E)]-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(曲古抑菌素A,化学文摘号58880-19-6),7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-4,6,6-三甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-84-3),4-(二甲氨基)-N-羟基- -氧-苯戊酰胺(CASNo.139675-90-4),N-羟基-6-(苯甲酰基)己酰胺(CAS No.91489-63-3),3-对-甲苯酰基-丙烯异羟肟酸(CAS No.96985-88-5),(2E,4E,6R)-7-[4-(环己基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-79-6),N-羟基-6,6-二甲基-7-(4-甲氧基苯甲酰基)庚酰胺(CAS No.362669-76-9),(2E,4E,6R)-6-[4-(二甲氨基)苯甲酰基]-N-羟基-4-甲基-2,4-八碳二烯酰胺(CAS No.1051944-83-2),(2E,4E,6R)-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-7-[4-(1-吡啶基)苯基]-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-81-0),(2E,4E,6R)-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-7-[4-(1-吡咯烷基)苯基]-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-80-9),(2E,4E,6R)-N-羟基-7-[4-[[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基]苯基]-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-77-4),(2E,4E,6R)-7-[4-(环戊基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-78-5),(2E,4E,6R)-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-7-[4-[(苯基甲基)氨基]苯基]-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-76-3),(2E,4E,6R)-N-羟基-4,6-二甲基-7-[4-[(1-甲基乙基)氨基]苯基]-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-74-1),(2E,4E,6R)-7-[4-(二丁基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-72-9),(2E,4E,6R)-7-[4-(二乙基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-70-7),(2E,4E,6R)-7-[4-(二丙基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-71-8),(2E,4E,6R)-N-羟基-4,6-二甲基-7-[4-[(2-甲基丙基)氨基]苯基]-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CASNo.1051944-75-2),(2E,4E,6R)-7-[4-[二[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基]苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.1051944-73-0),N-羟基-4-甲氧基-ε,ε-二甲基-ξ-氧-苯庚酰胺(CAS No.1044238-80-3),9-[1,1′-二苯基]-4-基-N-羟基-9-氧-2,4-壬二碳烯酰胺(CAS No.1025304-96-4),6-[[4-[3-(羟基氨基)-1,3-二氧丙基]苯基]氨基]-3-吡啶羧酸(CAS No.867336-59-2),N-羟基-β,4-二甲基-γ-氧-苯丁酰胺(CAS No.861777-21-1),7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.503610-77-3),(2E,4E,6R)-7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-6-甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.674767-32-9),(2E,4E,6R)-7-(4-氨基苯基)-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.528854-93-5),N-羟基-ε-氧-4-苯氧基-苯己酰胺(CAS No.461404-99-9),(E,E)-N-羟基-7-[(4-二苯基)羰基]-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.362671-60-1),(2E,4E,6R)-N-羟基-4,6-二甲基-7-[4-(甲基氨基)苯基]-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No.528854-92-4),4′-氯代-N-羟基-η-氧-[1,1′-二苯基]-4-辛酰胺(CAS No.461404-93-3),4′-氯代-N-羟基-ξ-氧-[1,1′-二苯基]-4-庚酰胺(CAS No.461404-92-2),N-羟基-7-[4-(4-吗啉基)苯甲酰基]庚酰胺(CAS No.362670-88-0),N-羟基-7-[4-(1-吡啶基)苯甲酰基]庚酰胺(CASNo.362670-85-7),N-羟基-η-氧-4-(4-苯基-1-哌嗪基)-苯辛酰胺(CAS No.362670-82-4),N-羟基-η-氧-4-[(3-吡啶基甲基)氨基]-苯辛酰胺(CAS No.362670-79-9),N-羟基-η-氧-4-(1-哌嗪基)-苯辛酰胺(CAS No.362670-72-2),N-羟基-η-氧-4-(2-吡啶基氨基)-苯辛酰胺(CAS No.362670-73-3),4-[4-[8-(羟基氨基)-1,8-二氧代辛基]苯基]-1-哌嗪羧酸1,1-二甲基乙酯(CAS No.362670-69-7),N-羟基-4-(甲基苯基氨基)-η-氧-苯辛酰胺(CAS No.362670-66-4),N-羟基-7-[4-(4-甲氧基苯基)苯甲酰基]庚酰胺(CAS No.362670-48-2),N-羟基-6-(4-甲氧基苯甲酰基)己酰胺(CAS No.362670-37-9),N-羟基-8-(苯甲酰基)辛酰胺(CAS No.362670-36-8),N-羟基-5-(苯甲酰基)戊酰胺(CAS No.362670-35-7),N-羟基-7-(4-苯氧基苯甲酰基)庚酰胺(CASNo.362670-31-3),N-羟基-7-[(4-二苯基)羰基]庚酰胺(CAS No.362670-01-7)和4-(二甲氨基)-N-羟基-ε,γ-二甲基-ξ-氧-苯庚酰胺(CAS No.362669-82-7)。
通式(III)的化合物的示例性实例包括,但不限于,N-羟基-6-甲氧基-ε-氧-2-萘己酰胺(CAS No.110842-40-5),N-羟基-ξ-氧-2-萘庚酰胺(CAS No.362670-38-0),N-羟基-η-氧-2-萘辛酰胺(CAS No.362669-68-9),N-羟基-α-甲基-η-氧-2-萘辛酰胺(CAS No.362671-29-2),N-羟基-6-甲氧基-η-氧-2-萘辛酰胺(CAS No.362670-32-4),N-羟基-ε-氧-2-萘己酰胺(CAS No.461404-94-4)和N-羟基-β-甲基-η-氧-2-萘辛酰胺(CAS No.362671-55-4)。
组蛋白脱乙酰酶抑制剂如通式(II)的化合物和通式(I)的化合物的组合一般能够引起,例如引起或诱导,或防止翻译后组蛋白修饰模式,如组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化的改变。翻译后组蛋白修饰的模式也可以位于DACT蛋白质的基因座上。通常,组蛋白脱乙酰酶抑制剂和通式(I)的化合物的组合能够引起氨基酸位置上转录抑制翻译后组蛋白修饰的去除和/或引起氨基酸位置上转录激活翻译后组蛋白修饰的附着。组蛋白脱乙酰酶抑制剂和通式(I)的化合物的组合也能够阻止氨基酸位置上转录抑制翻译后组蛋白修饰的附着和/或氨基酸位置上转录激活翻译后组蛋白修饰的去除。各组合一般也能够引起转录抑制翻译后组蛋白修饰去除和转录激活翻译后组蛋白修饰附着的组合。其还能够阻止转录抑制翻译后组蛋白修饰的附着和转录激活翻译后组蛋白修饰的去除的组合。
组蛋白脱乙酰酶抑制剂和通式(I)的化合物的组合一般能够引起的激活翻译后组蛋白修饰,和/或其去除后通常能够防止激活翻译后组蛋白修饰的实例包括,但不限于,组蛋白3上赖氨酸4的甲基化、组蛋白3上赖氨酸9的乙酰化和组蛋白3上赖氨酸14的乙酰化。组蛋白脱乙酰酶抑制剂和通式(I)的化合物的组合一般能够去除的,和/或通常能够防止其附着的转录抑制翻译后组蛋白修饰的实例包括,但不限于组蛋白3上赖氨酸9的甲基化、组蛋白3上赖氨酸27的甲基化和组蛋白4上赖氨酸20的甲基化。作为示例性实例,图5C描述了3-deazaneplanocin A和曲古抑菌素A的组合能够引起组蛋白3上赖氨酸4的甲基化、组蛋白3上赖氨酸9和/或组蛋白3上赖氨酸14的乙酰化水平提高。该图还表明这两种化合物的组合能够引起组蛋白3上赖氨酸27的甲基化、组蛋白3上赖氨酸9的甲基化和组蛋白4上赖氨酸20的甲基化的水平降低。
在一些实施方案中,通式(I)的化合物(上文)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂顺序施用。在一些实施方案中,通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂以至少基本同时的方式施用。在一些实施方案中,在同一药物组合物中包括通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在一些实施方案中,通过由肠内、静脉内、腹膜内、吸入、肌内、皮下和经口组成的一种或更多种途径对患者施用所述组合。在一些实施方案中,通过相同途径施用通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在其它实施方案中,通过不同于组蛋白脱乙酰酶抑制剂的途径施用通式(I)的化合物。
与一种或更多其它治疗剂“组合”施用包括同时(共同)和以任何顺序连续施用。
已经鉴定了11种人组蛋白脱乙酰酶并且基于序列和功能同源性可将它们细分成类型I(组蛋白脱乙酰酶1、2、3、8、11)和类型II组蛋白脱乙酰酶(组蛋白脱乙酰酶4、5、6、7、9、10)。此外,具有7个辅因子依赖性脱乙酰酶,其被分类为类型III的组蛋白脱乙酰酶或sirtuins。组蛋白脱乙酰酶抑制剂诱导组蛋白尾部的超乙酰化,导致DNA染色质结构的松弛和被抑制基因的再激活。
还提供的是通过对需要该治疗的患者施用调节DACT蛋白的活性和/或量的物质来治疗或预防疾病或病症的方法。在一些实施方案中,待治疗或预防的疾病或病症涉及Wnt/β-联蛋白信号转导途径的异常组分,其可能是因为突变或种系改变。待用本发明方法治疗或预防的疾病或病症例如是癌症。
术语“预防”指降低生物感染或发生异常状况的可能性。
“治疗”或“治疗”或“减轻”指治疗性治疗和预防性或预防措施,其中目标是在生物中预防、减缓(减轻)或至少部分缓和或消除异常的,包括病理学状况。需要治疗的那些人包括已经患有病症的那些人以及易于患病症的那些人或其中待预防所述病症(预防)的那些人。当Wnt-介导的病症是癌症时,如果已经经历了包括增加本发明DACT蛋白的量和/或活性的治疗后,个体显示一种或更多以下情况的可观察和/或可检测降低或缺失:癌细胞数量的减少或癌细胞的缺失;肿瘤大小的减少;癌细胞渗入外周器官包括癌扩散到软组织和骨中的抑制(即,一定程度上减慢并优选终止);肿瘤生长得到一定程度上的抑制;和/或一定程度上减轻了与特定癌相关的一种或更多症状;降低的发病率和死亡率,和生活质量的改善,那么受试者或哺乳动物被成功“治疗”或显示减少的肿瘤负担。在本发明用途或方法可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上,其可以是细胞生长抑制的和/或细胞毒性的。各患者还可感受这些体征或症状的减轻。
可通过医师熟悉的常规操作容易地测定用于评估成功治疗和疾病改善的上述参数。对于癌治疗,例如可通过评估疾病进展的时间(TDP)和/或确定应答率(RR)来测定效果。可通过分期测试和用于钙水平的骨扫描和测试和其它酶测定来测定向骨的扩散来测定转移。也可以进行CT扫描来寻找区域内向骨盆和淋巴结的扩散。通过已知方法进行的肝脏酶水平的胸部X线检查和测定用于寻找分别到肺和肝的转移。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸组织检查(TRNB)。
术语“施用”指向生物的一个或更多细胞或组织中掺入化合物的方法。
术语“治疗效果”指引起或促进异常状况的因素的抑制或激活。治疗效果在一定程度上减轻了异常状况的一种或更多症状。
术语“异常”或“异常的”与细胞信号转导过程的功能结合时指该过程的组分,例如在生物中过表达或表达不足的激酶发生改变,使得其催化活性比相应的野生型活性更低或更高,使得其不再与天然结合配偶体相互作用,不再被另一因子例如蛋白质或蛋白质磷酸酶修饰,或不再与天然结合配偶体相互作用。
当生物的细胞或组织在生物内或生物外存在时,可预防或治疗由DACT蛋白的量或活性降低引起的异常状况。可在细胞培养皿中维持或培养生物外存在的细胞。对于生物内携带的细胞,本领域中存在许多技术施用化合物,包括(但不限于)口腔、肠胃外、皮肤、注射和气溶胶应用。对于生物外的细胞,本领域中存在许多技术施用化合物,包括(但不限于)细胞显微注射技术、转化技术和载体技术。
还可通过向Wnt/β-联蛋白信号转导途径中具有异常的一组细胞施用化合物来预防或治疗异常状况,其中所述细胞包括在生物内或是生物的一部分。然后可监测施用化合物对生物功能的影响。所述生物可以是或者例如是哺乳动物,如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、狗、猴子或猿。在一些实施方案中,所述生物是人。
术语“异常状况”指生物的细胞或组织中偏离该生物中其正常或标准功能的功能。异常状况可涉及细胞增殖、细胞分化或细胞存活。术语“细胞增殖病症”和“增殖病症”指与一定程度的异常细胞增殖相关的病症,如肿瘤。如此处所用,词语“肿瘤”指所有的赘生细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,和所有癌变前的和癌性细胞和组织。因此,词语“肿瘤发生”指赘生细胞生长和增殖的产生,包括诱导。肿瘤发生的实例是癌发生——癌细胞的产生,其通常是体细胞向癌细胞,包括癌干细胞转化的结果。
异常细胞增殖病症包括癌、纤维变性和系膜病症、异常血管发生和血管发生、创伤愈合、牛皮癣、糖尿病和炎症。此外,所述增殖病症可涉及其中消除程序性细胞死亡(凋亡)途径的病症。表达处于Wnt/β-联蛋白信号转导途径控制下的许多蛋白质与程序性细胞死亡途径相关,Wnt/β-联蛋白信号转导途径的异常可导致细胞永生。
在本发明的方法和用途中,可使用额外的化合物,例如改变dishevelled蛋白活性的化合物,例如其拮抗剂。低分子量有机化合物(Dvl PDZ结构域相互作用的拮抗剂)的实例是吲哚-2-甲醇衍生物,其已经由You等公开(Mol Cancer Ther(2008)7,6,1633-1638)。Dvl PDZ结构域相互的拮抗剂的其它合适实例是Mahindroo等(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters(2008)18,946-949)公开的吲哚-2-羧酸酰胺衍生物。
例如可用于与3-Deazaneplanocin A和组蛋白脱乙酰酶抑制剂或与如上述组合物组合的额外化合物的其它实例是抑制蛋白激酶功能的化合物。已经报道抑制蛋白激酶功能的低分子量化合物的实例包括,但不限于,双单环、二环或杂环芳基化合物(国际专利申请WO 92/20642)、亚乙烯基-氮杂吲哚衍生物(国际专利申请WO 94/14808)、1-环丙基-4-吡啶基-喹诺酮(美国专利号5,330,992)、苯乙烯基化合物(美国专利号5,217,999)、苯乙烯基-取代的吡啶基化合物(美国专利号5,302,606),某些喹唑啉衍生物(欧洲专利申请号0 566 266A1)、硒代吲哚和硒化物(国际专利申请WO 94/03427)、三环多羟基化合物(国际专利申请WO 92/21660)和苄基膦酸化合物(国际专利申请WO 91/15495)。
能够调节蛋白激酶活性的物质的其它实例包括,但不限于,吲哚酮、tyrphostins、喹唑啉、喹喔啉和喹啉。上文涉及的吲哚酮、喹唑啉、tyrphostins、喹啉和喹喔啉包括文献中描述的众所周知的化合物。
可用于与本发明化合物、药物组合物、方法或用途组合的化合物的其它实例是抗激素剂,其发挥作用以调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素的效果。此类化合物经常是系统或全身治疗的形式。它们本身可以是激素。实例包括抗雌激素和选择性的雌激素受体调节物(SERM),包括例如他莫昔芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬、着洛西芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛西芬、LYl 17018、奥那斯酮和托瑞米芬;抗-黄体酮;雌激素受体下调物(ERD);抑制或关闭卵巢的试剂,例如促促黄体素释放素-释放激素(LHRH)激动剂,如和醋酸亮丙瑞林、醋酸性瑞林、醋酸布舍瑞林和tripterelin;其它抗雄激素,如氟利坦、尼鲁米特和比卡鲁胺;和抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂,其调节在肾上腺中雌激素的产生,例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、formestanie、法曲唑、伏罗唑、来曲唑和阿那曲唑。此外,化学治疗剂的此类定义包括二膦酸类,如氯屈膦酸二钠(例如,或)、羟乙磷酸、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐、阿仑特罗、氨羟二磷酸二钠、替鲁膦酸钠或利塞膦酸钠;以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环腺苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号途径中基因表达的那些,例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗,如疫苗和基因治疗疫苗,例如疫苗、疫苗和疫苗;拓扑异构酶1抑制剂;rmRH;拉帕替尼二甲苯磺酸盐(ErbB-2和还称为GW572016的EGFR二元酪氨酸激酶小分子抑制剂);和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。如此处所用,术语“药学上可接受的”指待施用物质的性质,例如组合物、载体、稀释剂或活性化合物的性质,其能够对人或在人上施用,在所用剂量或量时至少基本上不产生不希望的生理效应,如恶心、头晕或心嘈。特别地,该物质的所用量或剂量不会在阻止施用组合物的程度上引起这种效应。
当用于此处时,“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞生长,尤其是具有Wnt信号活性的癌细胞生长的化合物或组合物。因此,生长抑制剂可以是显著降低此类细胞在S期中百分比的试剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(处于非S期)的试剂,如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。典型的M期阻滞剂包括长春胺(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类,和拓扑异构酶II抑制剂,如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。阻滞G1的那些试剂还导致S期阻滞,例如DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)是来自紫杉的抗癌药物。来自欧洲紫杉的多西他赛()是紫杉醇()的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进从微管蛋白二聚体装配微管并通过防止解聚稳定微管,其导致对细胞中有丝分裂的抑制。
在药物组合物中包括的其它活性成分的实例包括,但不限于,核酸烷化剂、蒽环类抗生素、抗生素、芳香酶抑制剂、叶酸拮抗剂、雌激素受体调节物、无机砷酸盐、亚硝基脲、破骨细胞抑制剂、含铂化合物、类维生素A、拓扑异构酶1抑制剂、异构酶2抑制剂、胸苷酸合酶抑制剂、芳香酶抑制剂、环加氧酶抑制剂、异黄酮、酪氨酸激酶抑制剂、生长因子、二膦酸和单克隆抗体。
本发明药物组合物中可包括的烷化剂包括但不限于白消安( )、苯丁酸氮芥()、异环磷酰胺(有或没有MESNA)、环磷酰胺( )、葡磷酰胺、苯丙氨酸氮芥/L-PAM()、达卡巴嗪()和temozolamide()。作为示例性实例,也常称为环磷酰胺的化合物2-二[(2-氯代乙基)氨基]四-氢-2H-1,3,2-氧氮磷杂环己烷,2-氧化物是用于治疗III和IV期恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、蕈样霉菌病、成神经细胞瘤、卵巢腺癌、视网膜母细胞瘤和乳腺癌的烷化剂。
本发明药物组合物中可包括的蒽环类抗生素包括,但不限于阿霉素( )、米托蒽醌()、伊达比星()、戊柔比星()和表柔比星()。作为一个实例,化合物(8S,10S)-10-(4-氨基-5-羟基-6-甲基-四氢-2H-吡喃-2-基氧基)-6,8,11-三羟基-8-(2-羟基乙酰基)-1-甲氧基-7,8,9,10-四氢并四苯-5,12-二酮,更常称为阿霉素,是从波赛链霉菌青灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius)的培养物中分离的细胞毒性蒽环类抗生素。阿霉素已经成功用于产生散布的瘤形成状况的消退,所述状况如急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、软组织和骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、移行细胞膀胱癌、甲状腺癌、霍奇金和非霍奇金类型的淋巴瘤、支气管癌和胃癌。
本发明药物组合物中可包括的抗生素包括但不限于更生霉素、更生霉素D()、柔红霉素/道诺霉素( )、博来霉素()、表柔比星()和米托蒽醌()。用于本发明实践中的芳香酶抑制剂包括但不限于阿那曲唑()和来曲唑()。本发明药物组合物中可包括的二膦酸抑制剂包括但不限于唑来膦酸盐()。
本发明药物组合物中可包括的环加氧酶抑制剂包括但不限于乙酰水杨酸()、塞来考昔()和罗非考昔( )。本发明药物组合物中可包括的雌激素受体调节物包括但不限于他莫昔芬()和氟维司群()。本发明药物组合物中包括的叶酸拮抗剂包括但不限于氨甲喋呤( )和曲美沙特()。作为示例性实例,化合物(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲基氨基)苯甲酰氨基)戊二酸,常称为氨甲喋呤,是已经用于治疗妊娠绒毛膜癌并用于治疗患绒毛膜腺瘤和葡萄胎的患者的抗叶酸药物。其还用于治疗恶性淋巴瘤的晚期并用于治疗蕈样肉芽肿病的晚期。
如上指出,本发明还涉及鉴定处于变成致肿瘤性的,包括致癌的风险中细胞和/或具有肿瘤易感性的细胞的方法。本发明还涉及预后、评估疾病状态、预测个体响应,包括个体的肿瘤对治疗的响应、评估对治疗响应的可能性、预测疾病过程并监测已知患有或怀疑发生肿瘤如癌的个体的癌疾病的治疗的方法。在一些实施方案中,各方法是预测赘生物对通式(I)的化合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合是否敏感的方法。所述赘生物例如肿瘤,如癌在一些实施方案中可包括在哺乳动物中。
这些方法包括评估三个参数中的一个或更多个。这些参数中的第一个参数是各细胞中或各个体的细胞中DACT蛋白的量。也可从相应的个体中分离该细胞或者该细胞可以是从相应个体中取出的组织样品的细胞。
上述三个参数的第二个参数是细胞中DACT蛋白的活性,并且第三个参数是组蛋白修饰的模式,通常是组蛋白甲基化和/或组蛋白乙酰化。在其中评估细胞中或组织样品中DACT蛋白的量或活性时,DACT蛋白的量或活性降低表明细胞将变成致肿瘤性的风险增加。在诊断的上下文中,DACT蛋白的降低的活性和/或细胞量表明个体发生癌的风险增加。当预测赘生物的敏感时,DACT蛋白的量或活性降低可表明所述赘生物对通式(I)的化合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合敏感。
例如可在DACT蛋白的基因座处评估组蛋白甲基化和/或组蛋白乙酰化的模式。DACT蛋白的基因座理解为包括编码DACT蛋白的序列的区域。在一些实施方案中,其可指从各基因转录起始下游约900bp的区域,包括从其下游约600bp到编码DACT蛋白的序列末端。在一些实施方案中,其可指从DACT蛋白的基因的转录起始下游约600bp到该基因的转录起始的区域,并可包括所述基因编码区。组蛋白3上赖氨酸9和/或赖氨酸14的乙酰化降低表示细胞具有变成致肿瘤性的易感性。在诊断的上下文中,组蛋白3上赖氨酸9和/或赖氨酸14的乙酰化降低表示个体患癌的风险增加。组蛋白3上赖氨酸4和27的甲基化增加也表示细胞具有变成致肿瘤性的易感性。组蛋白4上赖氨酸20和组蛋白3上赖氨酸9的额外增加的甲基化通常还表示细胞具有变成致肿瘤性的易感性。同样,在诊断的上下文中,组蛋白3上赖氨酸4和27甲基化的增加值表示个体患癌的风险增加。组蛋白4上赖氨酸20和组蛋白3上赖氨酸9的额外增加的甲基化通常还表示个体患癌的风险增加。
在一些实施方案中,该方法是评估个体将响应治疗的机会的方法,所述治疗包括组合施用通式(I)的化合物(上文)与组蛋白脱乙酰酶抑制剂。组蛋白3上赖氨酸9和/或赖氨酸14的乙酰化降低表示各个体将响应治疗,所述治疗包括组合施用通式(I)的化合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂。此外,组蛋白3上赖氨酸4和27的甲基化增加表示各个体将响应该治疗。组蛋白4上赖氨酸20和组蛋白3上赖氨酸9的额外增加的甲基化通常也表示个体将响应该治疗。
在一些实施方案中,本发明的方法包括检测例如生物或其组织或细胞中DACT蛋白的表达、亚细胞定位和/或活性。作为示例性实例,可在一段时间里监测DACT蛋白的细胞量、表达、亚细胞定位和/或活性。
本发明的方法还包括比较测定DACT蛋白的细胞量、表达、亚细胞定位和/或活性的结果与对照测定(或“参考”测定)的结果。在该对照测定中,在对照组织或对照细胞中评估一个或更多上面提到的参数,即DACT蛋白的量、DACT蛋白的活性和组蛋白修饰的模式。该对照组织或对照细胞一般至少基本没有变成致肿瘤性的风险。在一些实施方案中,将已经在许多前述对照测定中获得的一个或更多参数与平均值比较,可能进行统计学分析。在诊断背景的一些实施方案中,例如怀疑与先有平均数据具有可能小的差异时,来自同一个体的一个或更多组织样品可用于进行一个或更多对照测定。通常从期望具有变成致肿瘤性的相当低的风险的组织中或已知没有变成致肿瘤性的可能风险的健康组织中取得各样品。
在鉴定适合于阻滞、抑制或预防肿瘤发生的化合物的方法的上下文(见下文)中,对照测定可包括使用不调节DACT蛋白的细胞量、表达、亚细胞定位和/或活性的条件。在比较细胞量、表达和/或活性时,例如将检测到的水平与对照水平比较。如此处所用,术语“对照水平”指例如在细胞中各蛋白的分子数量,DACT蛋白的mRNA或蛋白质表达水平,以及对照样品中DACT蛋白的活性水平。所述术语因此包括正常对照水平和癌对照水平(也见下文)。该术语可指单次参考测定或多次参考测定。在一些实施方案中,对照水平可以是从前面进行的测定中得到的表达或活性值数据库。术语“常规水平”指在正常健康个体或已知没有遭受赘生物,包括癌的个体群体中检测的DACT蛋白的表达水平或DACT蛋白的活性水平。正常个体是没有各赘生物临床症状的个体。
根据本发明,当与对照水平相比,基因表达/活性/量增加或降低约10%、约25%、约50%、约75%、约100%或更高时,认为例如细胞中蛋白质的基因表达水平或活性水平或量“改变了”或“不同了”。或者,当与对照水平相比,基因表达/或活性增加或降低至少约0.1、至少约0.2、至少约1、至少约2、至少约5或至少约10或更高倍时,认为表达水平或活性水平“增加了”或“降低了”。
本发明的方法可包括改变细胞中Dishevelled蛋白,如Dishevelled-1、Dishevelled-2或Dishevelled-3的量。在一些实施方案中,所述方法包括防止、抑制、阻滞或逆转Dishevelled蛋白的激活。在典型实施方案中,调节DACT蛋白的量或活性可导致在细胞中调整Dishevelled蛋白的活性和Dishevelled蛋白的降解。
通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂还可以代谢产物或前体药物的形式使用。
如此处所用,术语“前体药物”表示在人或动物体内例如酶促、机械或电磁转化或释放成其具有药效的活性形式的化合物。“前体药物”因此是亲本“药物”分子的药理学上无活性的衍生物。其需要在向其中施用的人或动物的生理系统内的自发或酶促生物转化。“前体药物”在本领域中通常用于克服与稳定性、毒性、特异性缺失或有限的生物利用率相关的问题。它们经常在哺乳动物生物中提供可溶性、组织相容性或延迟释放的优势。作为示例性实例,“前体药物”可以是金属triangulo化合物,其具有保护基保护部分或其官能团,由此可逆地抑制金属triangulo化合物的活性。当保护基被溶剂解离或酶去除时,各“前体药物”可在体内或体外变得在药学上有活性。作为其它示例性实例,可仅在生化转化如氧化、磷酸化或糖基化时将官能团引入通式(I)的化合物中。因此,在人或动物体中仅通过酶、胃酸等将各“前体药物”转化成通式(I)的化合物。通式(I)的化合物的“前体药物”可以是水合物或非水合物。常见的“前体药物”包括酸衍生物,如通过亲本酸与合适的醇(例如低级链烷醇)反应制备的酯、通过亲本酸化合物与胺(例如上述的)反应制备的酰胺,或反应形成酰化碱衍生物(例如低级烷基酰胺)的碱性基团。
此处所述的化合物,以及通过本发明方法鉴定的化合物可对细胞、动物或人患者本身施用,或在药物组合物中,其中它们与其它活性成分混合(如在组合疗法中)或与合适的载体或赋形剂,包括稳定剂、增溶剂和乳化剂混合。此类载体、赋形剂或稳定剂一般是药学上可接受的,因为它们在使用的剂量和浓度上对暴露于其的细胞或哺乳动物没有毒性。通常,生理上可接受的载体是水性pH缓冲液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲液,如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸;低分子量(低于约10个残基)的多肽;蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如EDTA;糖醇,如甘露醇或山梨醇;盐形成平衡离子,如钠;和/或非离子表面活性剂,如聚乙二醇(PEG)和示例性途径包括,但不限于口腔、经皮肤和肠胃外递送。
合适的施用途径例如包括贮库、口腔、直肠、经粘膜或肠内施用;肠胃外递送,包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射,以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。合适的施用途径例如包括贮库、口腔、直肠、经粘膜或肠内施用,肠胃外递送,包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射,以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。还可以例如通过将化合物如以贮库或持续释放制剂直接注射到实体瘤中以局部而不是全身方式施用化合物或药物组合物。此外,各化合物或药物组合物可用于靶向药物递送系统中,例如用于肿瘤特异性抗体包被的脂质体中。例如此类脂质体可被肿瘤选择性地靶定并吸收。
此外,可将药物在靶向药物递送系统中施用,例如用肿瘤特异性抗体包被的脂质体。例如脂质体将被肿瘤可选择性地靶定并吸收。
例如通过常规的混合、溶解、粒化、制成锭剂、研磨、乳化、包胶、捕获(entrapping)或冻干方法以本身已知的方式制备本发明的药物组合物。
因此,使用一种或更多种生理上可接受的载体,包括促进活性化合物加工成可在药学上使用的制剂的赋形剂和辅剂以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。适当的制剂依赖于所选的施用途径。
为了注射,在水溶液,例如在生理上相容的缓冲液如Hanks′s溶液、林格液或生理盐水缓冲液中配制本发明的化合物。为了经粘膜施用,在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂一般为本领域所知。
为了经口施用,可通过组合活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体来容易地配制化合物。此类载体使得本发明的化合物可配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等用于被待治疗的患者经口摄入。
可通过添加固体赋形剂,任选地研磨所得混合物并在需要时,在添加合适的辅助剂后加工颗粒混合物以获得片剂或锭剂核来获得用于经口使用的药物制剂。合适的赋形剂特别是充填剂,如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇;纤维素制剂,如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠,和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
需要时,可添加崩解剂,如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐,如藻酸钠。
以合适的包衣提供锭剂核。为此,可使用浓缩糖溶液,其可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或锭剂包衣中加入染料或色素用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可经口使用的药物制剂包括由明胶制成的推入契合胶囊,以及由明胶和增塑剂,如甘油或山梨醇制成的软的密封胶囊。推入契合胶囊可含有与充填剂如乳糖,粘合剂如淀粉,和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁,和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中,可将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中,如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外,可加入稳定剂。用于经口施用的所有制剂应该是适合于此类施用的剂量。对于含服施用,组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
对于通过吸入施用,根据本发明使用的化合物以加压包装或喷雾器产生的气雾剂形式方便地递送,所述加压包装或喷雾器使用合适的推进剂,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体。在加压气雾剂的情况下,可通过提供阀门递送测定量来测定剂量单位。可配制用于吸入器或吹出器的例如明胶胶囊和药筒,其含有所述化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可配制化合物用于通过注射,例如快速浓注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以单位剂量形式,例如安瓿或多剂量容器呈现,其添加有防腐剂。组合物可采取这样的形式,如油或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂,并含有配制试剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外,可将活性化合物的悬浮液制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油,如芝麻油,或合成的脂肪酸酯,如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质,如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地,所述悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。
或者,活性成分可以是粉末形式,用于在使用前用合适载体,例如灭菌无致热原水重构。还可在直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂中配制化合物,例如含有常规的栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。
除了上述制剂,化合物还可配制成贮库制剂。可通过移植(例如皮下或肌内)或通过肌内注射使用此类长效制剂。因此,例如,化合物可用合适的聚合或疏水性材料(例如在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制,或配制成微溶性衍生物,例如微溶的盐。
用于本发明疏水性化合物的药物载体是共溶剂系统,其包括苯甲醇、非极性表面活性剂、可与水混溶的有机聚合物和水相。所述共溶剂系统可以是VPD共溶剂系统。VPD是3%w/v苯甲醇、8%w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80和65%w/v聚乙二醇300的溶液,用无水乙醇补足体积。所述VPD共溶剂系统(VPD:D5W)由VPD用5%葡萄糖水溶液1∶1稀释组成。
该共溶剂系统很好地溶解疏水性化合物,并且在全身施用后其自身产生低毒性。自然界中,共溶剂系统的比例有显著变化,但不破坏其可溶性和毒性特征。
此外,共溶剂组分的身份可以变化:例如,可以使用其它低毒性非极性表面活性剂代替聚山梨酯80;聚乙二醇的级分大小可以变化;其它生物相容的聚合物可替换聚乙二醇,例如聚乙烯吡咯烷酮;并且其它糖或多糖可替换葡萄糖。
还可使用用于疏水性药物化合物的其它递送系统。脂质体和乳剂是用于疏水性药物的递送运载体或载体的众所周知的实例。也可使用某些有机溶剂,如二甲基亚砜,尽管一般以更高的毒性为代价。此外,可使用持续释放系统,如含治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质递送化合物。已经确定了多种类型的持续释放材料,并为本领域技术人员所熟知。根据其化学性质,持续释放胶囊可在几周到超过100天时间里释放化合物。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性,可使用用于蛋白质稳定的其它策略。
药物组合物还可包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。
本发明中使用的许多化合物提供为具有药学上相容的平衡离子的盐。可用许多酸,包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等形成药学上相容的盐。盐在水或其它质子溶剂(其为相应的游离碱形式)中趋向于更可溶。
适合用于本发明的药物组合物包括组合物,其中以有效达到其预期目的的量包含活性成分。更尤其是,治疗有效量表示有效预防、减轻或改善疾病症状或延长所治疗受试者存活的化合物的量。治疗有效量的确定为本领域技术人员能力范围之内,尤其是参考此处提供的详细公开内容。
对于用于本发明方法的任何化合物,可从细胞培养测定中初步评估治疗有效剂量。例如,可用动物模型中设计剂量以达到循环浓度范围,其包括如细胞培养中测定的IC50(即,在细胞中实现DACT的活性半最大抑制或DACT蛋白的量半最大减小的测试化合物的浓度)。该信息可用于更精确地在人类中确定有用剂量。
可通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序确定此处所述化合物的毒性和治疗效果,例如用于确定LD50(50%群体致死的剂量)和ED50(在50%群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数,并且其可表达为LD50和ED50之间的比例。可期望使用显示高治疗指数的化合物。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于设计用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选处在包括几乎没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。该剂量根据所用的剂量形式和利用的施用途径在所述范围内变动。各医师可根据患者的状况选择精确制剂、施用途径和剂量。
可个别调整剂量和时间间隔以提供足以维持DACT、调整效果的活性部分的血清水平,或最低有效浓度(MEC)。MEC对每一种化合物不同,但可从体外数据估计;例如,达到DACT蛋白50-90%抑制必须的浓度。达到MEC必须的剂量将取决于个体特征和施用途径。然而,HPLC测定或生物测定可用于确定血清浓度。
还可使用MEC值确定剂量间隔。应使用方案施用化合物,所述方案维持高于MEC的血清水平10-90%时间,例如从约30到约90%,如从约50到约90%。在局部施用或选择性吸收的情况下,药物的有效局部浓度可以不与血清浓度相关。当然所施用组合物的量将取决于被治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重程度、施用方式和处方医师的判断。
需要时,可在包装或分配器装置中给予组合物,所述包装或分配器装置包含含有活性成分的一个或更多单位剂量形式。所述包装可例如包括金属或塑料箔,如泡罩包装。包装或分配器装置可附带施用说明书。包装或分配器还可以附带与容器结合通知,其为政府机构规定药物的生产、使用或销售的形式,所述通知反映了该机构批准该化合物形式用于人或兽医施用。此类通知例如可以是美国食品和药品管理局或其他政府部门为处方药批准的标签,或批准的产品说明书。
还可用相容性药物载体配制本发明的组合物,置于适当容器中,并将其标记用于治疗指出的状况。在标签上指出的合适状况包括,例如癌的治疗。
根据本发明,方法、化合物和药物组合物可用于治疗细胞增殖病症,如肿瘤或癌。任何肿瘤或癌可被选择用于治疗,包括例如良性肿瘤和转移性恶性肿瘤。实例包括,但不限于血液学恶性肿瘤和实体瘤。实体瘤包括例如来自结缔组织或支持组织的肉瘤、来自身体腺细胞和上皮细胞的癌、或淋巴瘤(淋巴组织的癌,如淋巴结、脾和胸腺)。实体瘤的实例包括,但不限于乳腺癌、肺癌、脑肿瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、肝肿瘤、胰脏肿瘤、卵巢癌、前列腺癌和黑素瘤。
如上解释,本发明包括细胞中DACT蛋白的诊断、预后和治疗用途,包括其量或活性。特别是基于所述量或活性,尤其提供监测治疗、预测对治疗响应、监测最小残留疾病和/或疾病预后的方法和用途。基于发明人的发现,本发明还提供鉴定能够在细胞中预防、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生,包括癌发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的化合物的方法。这些方法中的一些方法是体内或离体方法。一些方法是鉴定各种化合物的体外方法。所述化合物能够与DACT蛋白或其功能片段形成复合体。本发明的一些方法包括将该复合体的组分彼此暴露,无论是体外或体内。一种该方法是体外方法,其包括将彼此形成或怀疑形成复合体的组分接触。例如,怀疑与DACT蛋白形成复合体的DACT蛋白和药物候选分子可彼此接触。化合物能够改变DACT蛋白与dishevelled蛋白之间的复合体形成。在一些实施方案中,各方法包括将化合物、DACT蛋白或其功能片段和dishevelled蛋白接触。在此类实施方案中,检测DACT蛋白与dishevelled蛋白之间的复合体形成。
在一些实施方案中,方法还包括检测复合体的形成。可使用检测复合体形成的任何合适方法。检测方法例如可包括电泳、HPLC、流式细胞术、荧光相关光谱或这些技术的修饰形式(也见上文)。其它技术涉及生物分子结合本身的测定。此类测定例如可依靠光谱、光化学、光度计、荧光计、放射学、酶学或热力学手段(上文)。DACT蛋白与dishevelled蛋白之间复合体形成的增强说明所述化合物能够在细胞中预防、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。
当所述方法是体内或离体方法时,其可包括提供微生物。所述微生物表达DACT结合蛋白,怀疑所述化合物能够与所述结合蛋白形成复合体,怀疑所述化合物增加所述结合蛋白与dishevelled蛋白的复合体形成或怀疑所述化合物能够增加所述结合蛋白的表达。在一些实施方案中,所述微生物可内源表达所述DACT结合蛋白。在一些实施方案中,所述微生物是重组细胞或转基因微生物(也见上文)。
本发明的方法包括向微生物中加入各化合物。在各方法的一些实施方案中,监测DACT蛋白的表达。在各方法的一些实施方案中,监测DACT蛋白的活性。在一些实施方案中,监测细胞表型的改变。在一些实施方案中,该方法包括对照测定(也见上文)。将对照测定的结果与使用该化合物获得的结果比较。对照测定例如可包括使用已知不影响DACT结合蛋白的表达或活性,或已知不影响DACT蛋白与dishevelled蛋白之间形成的化合物。
在一些实施方案中,本发明的方法包括使各微生物例如细胞(如肿瘤细胞)与预定量的通式(I)的化合物(见上文)和预定量的组蛋白脱乙酰酶抑制剂接触。在一些实施方案中,使用至少两种不同预定量的通式(I)的化合物。在一些实施方案中,使用至少两种不同预定量的通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合。在这些实施方案的一些实施方案中,使用至少第一种和第二种细胞。所述第一种细胞与两个预定量的较低者接触,并且第二种细胞与两个预定量的较高者接触。各实施方案例如可以是筛选测定、细胞毒性测试或剂量/响应曲线的测定。
在一些实施方案中,从同一患者中获得第一种细胞(例如肿瘤细胞)和第二种细胞(例如肿瘤细胞)。该方法例如可以是预测患者或动物对通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合的个体响应的方法。单核苷酸多态性和基因表达的个体差异一般在响应所施用的化合物的患者间引起个体差异。在一些实施方案中,本发明的各方法也可以是鉴定影响患者对通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合的响应的遗传变体的方法。通常,通过许多蛋白质测定对动物或患者作为药物应用的化合物的效果,使得与非遗传因素偶联的多个基因中的混合遗传多态性决定了对化合物的响应。本发明的各方法因此可以是测定患者基因型的方法,例如来保证最大效果与最小不利效应。
对于本发明的一些实施方案,可以文库形式使用化合物。此类文库的实例是化学合成为模式化合物的多种小的有机分子,或含有大量序列变体的核酸分子的集合。
在根据本发明方法分析大量候选化合物以鉴定能够预防、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生的实施方案中,该实施方案通常称为筛选方法。例如可同时、连续或以任何不同相方式彼此独立地分析这些候选化合物。在体内或离体实施方案中,例如可向细胞培养基中加入候选抑制剂或向生物例如小鼠或果蝇施用候选抑制剂。在一些体外实施方案中,例如使用市售机器人自动地,也可以重复地进行多种候选化合物的任何大量分析步骤。为此,可使用任何数量的自动装置,例如自动化的读出系统、移液机器人、冲洗机器人或全自动筛选系统。作为示例性实例,所述方法可以是例如使用一个或更多自动工作站在多孔微量培养板(例如常规的48孔、96孔、384孔或1536孔板)中进行的体外筛选方法。因此,在一些实施方案中,本发明提供高通量筛选的方法。也可以使用试剂盒,例如设计用于进行本发明方法的试剂盒实施所述方法。
其它相关方法是体内方法,其包括提供宿主生物。可以提供任何想要的宿主生物,只要其能够容纳并培养肿瘤细胞,例如癌细胞。宿主生物的实例包括,但不限于哺乳动物、鱼、两栖动物和鸟。合适哺乳动物的实例见上文。任何想要的癌细胞可用于该目的(见上文的实例)。所述方法还包括向宿主生物中引入癌细胞。此外,所述方法包括如上述化合物,即怀疑能够与DACT蛋白形成复合体、能够调节DACT结合蛋白的量、能够调节DACT蛋白的活性、或能够增强DACT蛋白和dishevelled蛋白之间复合体形成的化合物的用途。在一些实施方案中,所述癌细胞包括所述化合物。因此,可在向宿主生物中引入同一化合物之前将其引入癌细胞中。在一些实施方案中,在宿主生物中引入癌细胞之前、之后或同时向宿主生物施用所述化合物。通常,在方法的特定阶段向癌细胞中引入所述化合物。所述方法还包括监测在宿主生物中肿瘤的生长。
通过以下非限制性实施例和附图进一步说明本发明。如本领域普通技术人员从本发明公开内容中容易理解的,根据本发明还可利用与此处所述相应示例性实施方案行使基本相同功能或实现基本相同结果的目前存在的或以后开发的其它物质组合物、手段、用途、方法或步骤。
发明的示例性实施方案
图1.Wnt/β-联蛋白途径的重要特征的简化图示:(A)在缺少Wnt信号的情况下,通过形成多蛋白复合体来调节β-联蛋白的水平,确定了细胞质破坏复合体。所述复合体包括肿瘤抑制剂腺瘤性结肠息肉病(APC)、支架蛋白轴蛋白、酪蛋白激酶1(CKI)和糖原合酶激酶3(GSK3β)。其引起β-联蛋白的磷酸化,由此标记其用于泛素化,并因此通过蛋白酶体被降解。(B)在Wnt结合Frizzled(Fz)受体和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白如LDL受体相关蛋白6(LRP6)时,Dvl被募集到该受体上,导致其激活,由此触发事件级联。由于破坏复合体被抑制,低磷酸化的β-联蛋白被稳定,累积并转移到细胞核中。在那里其与T细胞因子(TCF)和/或淋巴样增强子结合因子(LEF)形成复合体,由此激活包括c-MYC、细胞周期蛋白D1、胃泌素或基质溶解因子在内的许多基因的转录。(C)预期增加本发明DACT的量和/或活性可导致其与Dvl形成复合体,由此阻断图1B中描述的信号转导途径。因为形成了图1A中指示的多蛋白复合体,β-联蛋白被磷酸化并降解。
图2描述了跨越人DACT3转录起始位点的基因组区的基因作图。5’RACE用于确定实验操作中描述的DACT3的转录起始位点。转录起始位点示于黑色的“克隆X的数目(相对于ORF起始密码子)”。显示了启动子区和外显子1的DNA序列。斜体序列(白色框)指出了外显子1的编码区。
图3显示了结肠癌中不依赖于DNA甲基化的DACT3表达的损失。A:人结肠直肠肿瘤(T)和匹配的正常粘膜(N)中Wnt抑制剂(上)和Wnt/β-联蛋白靶基因(下)的分级聚类。上图中的白色信号表示超过平均表达;下图中的白色信号表示低于平均表达。B:来自随机选择的8对人结肠直肠肿瘤和匹配的粘膜的SFRP1和DACT1、2和3的RT-PCR分析。C:通过甲基化特异性PCR(MSP)检测测定的8个肿瘤中SFRP1和DACT3的甲基化状态。M1、M2、M3和M4代表覆盖DACT3启动子的完整CpG岛的检测的PCR区。D:一组结肠直肠癌细胞系相比于正常组织SFRP1和DACT1、2和3的RT-PCR分析。E:结肠直肠癌细胞系中SFRP1和DACT1、2和3的甲基化状态。F:通过测序来自正常和结肠直肠癌细胞系中的亚硫酸氢盐修饰的DNA测定CpG位点的甲基化状态。箭头指示转录起始位点。空心圆形代表未甲基化的CpG;实心圆形表示甲基化的CpG。G:未用5-AzaC处理或用其处理的HCT116细胞和HCT116-DNMT1/DNMT3b-/-(DKO)细胞中DACT1、2和3启动子的MSP分析。H:用5-AzaC(5μM)处理3天的HCT116和DLD1细胞和DKO细胞中SFRP1和DACT1、2和3的RT-PCR分析。
图4.结肠癌细胞中DACT1、2和3的组蛋白修饰。使用针对指定组蛋白修饰的抗体进行ChIP测定并通过定量PCR进行分析。以数字说明用于PCR分析的覆盖相对于DACT1、2和3的转录起始位点的-3.5kb到+3.5kb区的基因组DNA片段。显示了在各基因座上各组蛋白标记的包含所指区域的相对富集(结合/输出)(一式三份测定的均值±SD)。A:HT-29细胞中DACT1-3基因座上的组蛋白标记。B:SW480和RKO细胞中DACT3基因座上H3K27me3和H3K4me3的富集。C:正常人肠上皮细胞(FHs 74Int)、非癌性乳腺上皮MCF10A细胞和肺成纤维MRC5细胞中DACT1-3基因座上H3K27me3和H3K4me3的富集。
图5.DZNep和TSA的组合对DACT3和组蛋白修饰的影响。A:在用5μM DZNep、5μM 5-AzaC、200nM TSA或其组合处理的DLD1细胞中使用Illumina Beadarray的DACT3mRNA表达分析。所示数据代表三次独立实验的均值±SD。B:用DZNep、TSA或两者处理所示结肠直肠癌细胞系。收集RNA并进行阵列分析(1:DCAT2,2:DACT2,3:DCAT3,4:DKK4,5:DKK3,6:DKKL1,7:DKK2,8:DKK3,9:DKK1,10:SFRP4,11:SFRP2,12:SFRP5,13:SFRP3,14:SFRP1)。显示了已知Wnt/β-联蛋白拮抗剂的表达变化。C:HT29细胞和SW480细胞中用DZNep、TSA或两者诱导的大量组蛋白修饰的免疫印迹分析。D:表示未用DZNep和TSA处理(白色条)或用其处理(黑色条)的HT29细胞中DACT1和DACT3基因座上组蛋白标记的改变的ChIP分析。所述值代表在药物处理前和后针对低背景区的改变的归一化富集。所述数据表示三次独立实验的均值±SD。
图6.DZNep和TSA的组合导致结肠直肠癌细胞中Wnt/β-联蛋白信号的阻断和大量程序性细胞死亡。A:在用DZNep(5μM)、TSA(100nM)或两者处理的SW480和DLD1细胞中DACT3、DVL2、总的β-联蛋白和非磷酸化β-联蛋白(活性β-联蛋白)的免疫印迹分析。B:用DZNep/TSA处理的DLD1和SW480细胞的免疫荧光图。β-联蛋白染色是红色,细胞核染色是绿色(DRAQ5)。C:如上处理所示的结肠直肠癌细胞系;收集RNA并进行阵列分析。使用基因聚类程序显示已知的Wnt/β-联蛋白靶基因的表达变化。上图中的白色表示上调的基因,下图中的白色表示下调的基因。D:图6C中所示数据的数值(D+T=DZNep+TSA)。E:如在A中处理DLD1和HT29细胞,并通过PI染色和FACS分析测定细胞死亡。所述数据表示三次独立实验的均值±SD。F:如在A中处理HT29细胞,并通过FACS分析测定胱天蛋白酶3活性。G:如在A中处理HT29细胞,然后进行JC-1染色和FACS分析。
图7.SW480细胞中DACT1-DACT3基因座上的组蛋白标记。使用Solexa技术进行SW480细胞的所示组蛋白标记的ChIP测序。显示了完整的DACT1、2和3基因座上H3K27me3、H3K4me3和H3K9/14ac的富集。
图8.DACT3在通过DZNep/TSA抑制Wnt/β-联蛋白信号转导和程序性细胞死亡诱导中起作用。A:用DZNep、TSA或两者处理表达DACT3shRNA的两个DLD1稳定克隆(DACT3-sh1和DACT3-sh2)或表达非靶定对照shRNA的DLD1细胞(NC)。通过RT-PCR分析测定DACT3和肌动蛋白mRNA水平;通过免疫印迹评估DVL2、活性β-联蛋白和总β-肌动蛋白水平。B:如上处理NC、DACT3-sh1和DACT3-sh2细胞并通过PI染色和FACS分析测定程序性细胞死亡。所述数据代表三次独立实验的均值±SD。**,p<0.01。C:如在A中处理用DACT3 SmartPool siRNA(DACT3-SP)和独立的DACT3 siRNA(DACT3-2)转染的SW480细胞。A.所述数据表示三次独立实验的均值±SD。**,p<0.05。如上述测定程序性细胞死亡、DACT3 mRNA水平、DVL2、活性β-联蛋白水平和程序性细胞死亡。D:不用或用DZNep/TSA处理转染了DACT1 siRNA的SW480细胞,并如上收集用于mRNA和程序性细胞死亡分析。所述数据表示三次独立实验的均值±SD。
图9.结肠直肠癌细胞中DACT3过表达对Dvl2和β-联蛋白的影响。A:内源表达的DACT3与Dvl2结合。用所示Flag或HA标签的表达构建体瞬时转染SW480细胞。用抗Flag免疫沉淀DACT3,并用抗HA抗体探测免疫沉淀物。在下图中显示DACT3和Dvl2之间的相互共免疫沉淀。B:在共转染了Flag-DACT3或空载体的SW480细胞中的HA标记的Dvl2蛋白水平的Western印迹分析。C:转染了Myc-标记的DACT1或DACT3表达构建体72小时的SW480细胞的免疫荧光图像。通过用抗myc(绿色)和抗β-联蛋白(红色)染色检测Myc-标记的DACT1或DACT3和β-联蛋白的水平。通过DRAQ5染色细胞核(蓝色)。箭头表示表达DACT3-myc的转染细胞。D:显示DACT3的异位表达抑制结肠细胞生长的集落形成测定。用DACT3表达载体或空载体转染DLD1细胞,并用Zeocin选择12天。在右边显示了一式三份中相对于对照的集落数目(误差线:均值±SD)。
图10.GSK-3处理的低分子量有机化合物抑制恢复了DZNep/TSA对β-联蛋白的下调。如在GSK-3抑制剂LY2119301(5mM)存在或缺失下所示处理DLD1细胞。然后收集细胞用于与指定抗体进行免疫印迹。
图11.DACT3抗血清检测预期大小(69kD)的DACT3。在图11A中显示了RKO、HCT116和SW480细胞中DACT3mRNA的表达水平。如同下文实施例中所述通过针对人DACT3肽产生的抗体所检测到的,图11B显示了这些细胞中相应的DACT3蛋白的水平。
图12列出了发现在DLD1、SW480和HT29细胞中通过DZNep和TSA组合处理再激活的81种基因。通过数值描述了三种癌细胞系中所有81种基因表达的增加。显著的是,DACTA3的诱导是最高的。
图13.DZNep还与其它HDAC抑制剂协作以诱导程序性细胞死亡(A)和DACT3的诱导和β-联蛋白的抑制(B)。SAHA(2μM)、PXD101(1μM)和DZNep(5μM)。
图14A.结肠癌HT-29细胞异种移植物模型,显示了对用载体、TSA[0.5mg/kg]、DZNep[2mg/kg]和DZNep[2mg/kg]与TSA[0.5mg/kg]组合处理的动物的体内影响。
图14B.在HCT116异种移植物肿瘤生长抑制中DZNep和SAHA的协同作用。描述了肿瘤体积(SB-030)。*表示与载体对照相比在One-WayANOVA/Dunnett中p<0.05。
图15.为SB-HCT-116-030设计方案,其肿瘤体积数据示于图14B中。当根据肿瘤大小将动物随机化以实现均匀组(平均肿瘤体积91-107mm3,在该研究中不包括一些小鼠,因为它们不产生肿瘤或产生太大/不均匀形状的肿瘤)时,通过在第-7天皮下植入5×106HCT-116细胞并以在第0天开始描述的DZNep和SAHA的组合对动物给药,在雌性BALB/c裸鼠中建立肿瘤。如所示(红色和蓝色箭头)在第0天开始用DZNep、SAHA和各载体对四组给药,并在灰色箭所示的日期评估体重(BW)和肿瘤体积。在第14天终止所有处理。
图16.在用DZNep和SAHA进行的HCT116异种移植物肿瘤生长抑制中体重的改变。当平均肿瘤体积为91-107mm3时,通过在第-7天皮下植入5×106HCT-116细胞并以在第0天开始描述的DZNep和SAHA的组合对动物给药在雌性BALB/c裸鼠中建立肿瘤。在所有组中体重维持在>80%。在SAHA组中记录了1NTRD(第4天)和1TRD(第10天,体重82%)。n=7/组。
图17.在用DZNep和SAHA进行的HCT116异种移植物肿瘤生长抑制中的肿瘤体积。当平均肿瘤体积为91-107mm3时,通过在第-7天皮下植入5×106HCT-116细胞并以在第0天开始描述的DZNep和SAHA的组合对动物给药,在雌性BALB/c裸鼠中建立肿瘤。在第14天评估肿瘤负荷(体积以mm3计)并显示为肿瘤体积的中值/分布(Box & WhiskersDiagram)。与载体对照组相比,仅用DZNep+SAHA处理的动物的肿瘤体积显著不同(单向ANOVA中p<0.01,然后是Dunnett’s post检验)。
图18.SB-HCT-116-030中肿瘤生长抑制的百分比(参考图14B到图17)。当平均肿瘤体积为91-107mm3时,通过在第-7天皮下植入5×106HCT-116细胞并以在第0天开始描述的DZNep和SAHA的组合对动物给药在雌性BALB/c裸鼠中建立肿瘤。在第3、7、10和14天评估肿瘤负荷(体积以mm3表示),并如下文描述计算肿瘤生长抑制(TGI)。显示的是基于平均数以及基于中值计算的数据集。由于在第4天的管饲失误失去了SAHA组的一只动物(NTRD),并且在SAHA组中第二只小鼠在82%的体重时死亡(TRD)。
实施例
实验方法
样品、细胞系和药物处理
使用由新加坡国立大学的学院审查委员会批准的方案从Singapore Tissue Network获取人组织样品;从提供组织的每一个体获得了知情同意书。本研究中使用的结肠直肠癌细胞系和非转化细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(Manassas,VA))。具有DNMT1(DNA甲基转移酶1)和DNMT3B(DNA甲基转移酶3B)(HCT116DKO)遗传破坏的HCT116细胞由Bert Vogelstein博士(Johns Hopkins University,MD)友情提供。对于药物处理,在药物处理前一天接种细胞。将细胞用5μM 3-Deazaneplanocin A(DZNep)(获自National Cancer Institute,USA的Victor E.Marquez博士)或5μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AzaC;Sigma)处理72小时并用100-200nM的曲古抑菌素A(TSA;Cell Signaling)处理24小时。对于5-AzaC处理,每24小时用新加入的5-AzaC替换培养基。对于用DZNep和TSA共处理细胞,加入DZNep 24小时后加入TSA额外24小时用于基因表达分析并且在48小时后用于FACS分析。
1.2小鼠和饲养
按照National Institutes of Health(NIH)和National Advisory Committee for Laboratory Animal Research(NACLAR)的教导在受控条件下(12小时光周期,21-22℃,40-60%湿度,任意接触灭菌后的自来水和由19%蛋白质/5%脂肪/5%纤维组成的受辐射的标准啮齿类饮食)将雌性无胸腺BALB/c裸鼠(Harlan,UK,10-12周龄)饲养在Biological Resource Centre,Biopolis(BRC)的独立通风笼中。动物护理许可获自Biopolis Institutional Animal Care and Use Committee(Biopolis IACUC approval#050076)。
1.3定位DACT3转录起始位点和克隆全长DACT3cDNA
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从HEK293细胞分离10μg总RNA。除了逆转录和PCR步骤外,使用FirstChoice RLM-RACE kit(Ambion)根据生产商说明书通过RNA连接介导的5’RACE来定位DACT3转录起始位点。使用Thermo-X聚合酶(Invitrogen)和基因特异性寡核苷酸:5-GACCCAGGCGACCATAGGAGCTGGATC-3’(SEQ ID NO:1)在接头连接后在64℃进行逆转录1小时。使用PfuUltraPhusion聚合酶(Stratagene)以及由FirstChoice RLM-RACE试剂盒提供的正向引物和基因特异性反向引物:5’-GCTGGATCCAGAGA AGCCACTGTCCCCA-3’(SEQ ID NO:2)和5’-CACAGAAGGTTGAGGGTGGTGAATCTGGACCT-3’(SEQ ID NO:3)来进行嵌套PCR。将PCR产物克隆至pCR-BluntII-TOPO载体(Invitrogen)并且用M13引物测序。基于mRNA起始位点定位产生含最长的可读框的经标记的DACT3表达构建体用于过表达研究。使用来自HEK293细胞的5μg总mRNA和以下引物:5’-ATTGAATTCAATGATC CGGGCCTTCTCGTTCCCGGT-3’(SEQ ID NO:4)和5’-ATTAGATCTTCACACTGTAGTCATGACCTTGAGAGAACCCGA-3’(SEQ ID NO:5)通过RT-PCR扩增全长DACT3编码区。将PCR产物克隆至p3xFLAG-CMV10的EcoRI和BglII位点间并测序。
1.4RNA干扰
从Dharmacon(Lafayett,CO)购买靶向DACT3的siRNA和非靶向对照。从Sigma-Proligo获得靶向以下序列:5’-GGUUCUCUCAAGGUCAUGA-3’(SEQ ID NO:6)的单独的DACT3siRNA。为了产生DACT3小发夹RNA(shRNA)稳定细胞,将DACT3siRNA序列(GGAGAAUCGCCUGCCUUCA)(SEQ ID NO:7)克隆至pSIREN-RetroQ逆转录病毒表达载体。使用pSIREN-RetroQ-Neg载体作为阴性对照shRNA(BD Bioscience)并且如描述选择并扩大细胞(Tan,J.,等,Genes Dev(2007)21,1050-1063)。
1.5免疫印迹分析
如之前描述进行免疫印迹(Tan等,2007,上文)。用购自Upstate的以下抗体:抗H3K27me3(07-449)、抗H3K9me3(07-442)、抗H3K9/K14ac(06-599)、抗H3K4me3(07-473)和抗活性β-联蛋白(05-665)探测印迹。抗H4K20me3(ab9053)来自Abcam。抗β-联蛋白(6B3)和抗H3(3H1)来自Cell Signaling并且抗DVL2(sc-8026)来自Santa Cruz。针对来自人DACT3的14氨基酸肽(LSLESGGLEQESGR,(SEQ ID NO:8)产生抗DACT3的兔多克隆抗体并经亲和层析柱纯化。
1.6转染和免疫沉淀
使用Fugen 6.0(Roche)瞬时转染SW480细胞。转染后48小时时,用1ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,2mM EDTA,25mM NaF,1%Triton X-100)加蛋白酶抑制剂(Roche)在4℃裂解细胞30分钟。经12,000g离心30分钟后,裂解物与抗FLAG M2琼脂糖亲和凝胶(Sigma)或抗HA亲和基质(Roche)在4℃免疫沉淀过夜。用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0,150mM NaCl,1%Nonidet P-40,0.5%脱氧胆酸钠,和0.1%SDS)洗涤沉淀物三次并用含1%SDS的样品缓冲液在95℃洗脱免疫复合物5分钟并通过SDS-PAGE分析。用针对HA标签(sc-805,Santa Cruz)或FLAG标签(F1804,Sigma)的一级抗体进行免疫印迹。
1.7程序性细胞死亡和流式细胞术分析
收集细胞并在70%乙醇中固定。用RNase(100μg/mL)处理后用碘化丙锭(50μg/mL)染色固定的细胞。在FACSCalibur(Becton Dickinson Instrument,San Jose,CA)中用荧光激活细胞分选(FACS)分析染色细胞的DNA含量。使用CellQuest软件(Becton Dickinson)定量细胞凋亡亚G1级分。为了测定线粒体跨膜电势(MTP),根据生产商说明书(BD Bioscience)用JC-1对细胞染色,并使用CellQuest软件(BD Bioscience)测定JC-1检测阳性的细胞。为测定细胞胱天蛋白酶3活性,按说明用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)固定细胞并随后用异硫氰酸荧光素缀合的兔抗活性胱天蛋白酶3单克隆抗体(BD Biosciences)染色。通过流式细胞术进行对胱天蛋白酶3检测阳性的细胞的定量。
1.8微阵列基因表达分析和半定量RT-PCR
使用Trizol(Invitrogen)分离总RNA并用RNeasy Mini Kit(Qiagen)进行纯化。使用RNA Amplification试剂盒(Ambion)进行逆转录。如描述(Tan等,2007,前述)使用Illumina Gene Expression BeadChipHumanRef-8_V2进行微阵列杂交并使用来自Agilent Technologies的GeneSpring软件进行数据分析。对于RT-PCR,使用寡聚(dT)12-18引物用Superscript II逆转录酶(Invitrogene)对总RNA进行逆转录。使用100ngcDNA进行PCR并且引物序列如下:
DACT3正向:5’-CTCCCCAGCGTCGTCTGCTTTA-3’(SEQ ID NO:9)
DACT3反向:5’-ATTCGCTCTCCCCGTAACCC-3’(SEQ ID NO:10)
DACT2正向:5’-CCTGCACGCCGTGGCTCTAC-3’(SEQ ID NO:11)
DACT2反向:5’-CCCTGTTCTCCCTCGCTACCCTT-3’(SEQ ID NO:12)
DACT1正向:5’-CAGTCGCCTGGAGGAGAAGT-3’(SEQ ID NO:13)
DACT1反向:5’-CTGCTTGTCAAGCTCTTGCA-3’(SEQ ID NO:14)
DKK1正向:5’-AGGCGTGCAAATCTGTCTCG-3’(SEQ ID NO:15)
DKK1反向:5’-TGCATTTGGATAGCTGGTTTAGTG-3’(SEQ ID NO:16)
DKK2正向:5’-CGCGTTGATGCGGAGCAAGGAT-3’(SEQ ID NO:17)
DKK2反向:5’-TTATTGCAGCGGGTACTGGGGCAG-3’(SEQ ID NO:18)
DKK3正向:5’-AGGAGGCCACCCTCAATGAG-3’(SEQ ID NO:19)
DKK3反向:5’-CAGCTTCTTCTGCCTCCATC-3’(SEQ ID NO:20)
SFRP1正向:5’-TCGGCCGCGAGTACGACTA-3’(SEQ ID NO:21)
SFRP1反向:5’-TCTTGTAGCCCACGTTGTGG-3’(SEQ ID NO:22)
MYC正向:5’-CTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG-3’(SEQ ID NO:23)
MYC反向:5’-TCGCAGTAGAAATACGGCTG-3’(SEQ ID NO:24)
CCND1正向:5’-ATGGAACACCAGCTCCTGTG-3’(SEQ ID NO:25)
CCND1反向:5’-TTGAAGTAGGACACCGAGGG-3’(SEQ ID NO:26)
GAPDH正向:5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’(SEQ ID NO:27)
GAPDH反向:5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’(SEQ ID NO:28)
肌动蛋白正向:5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO:29)
肌动蛋白反向:5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(SEQ ID NO:30)
1.9DNA甲基化分析
通过在亚硫酸氢盐修饰后PCR分析并随后通过甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)测定CpG岛DNA甲基化状态(Yoshikawa,H.,等,Nat Genet(2001)28,29-35)。设计所有亚硫酸氢盐基因组测序和甲基化特异性PCR引物靠近转录起始位点并位于所研究基因的CpG岛中。引物序列如下:
MSP:
DACT1M正向:5’-TAGTTTTAGCGTTTTGTTTTTTCGT-3’(SEQ ID NO:31)
DACT1M反向:5’-TACCGCTCGATATCTACCTCG-3’(SEQ ID NO:32)
DACT1U正向:5’-TAGTTTTAGTGTTTTGTTTTTTTGT-3’(SEQ ID NO:33)
DACT1U反向:5’-CTACCACTCAATATCTACCTCACC-3’(SEQ ID NO:34)
DACT2M正向:5’-TAGGAGGATTCGCGATATAGTTC-3’(SEQ ID NO:35)
DACT2M反向:5’-TACAACTCCTACAACCCCGC-3’(SEQ ID NO:36)
DACT2U正向:
5’-TAGGAGGATTTGTGATATAGTTTGG-3’(SEQ ID NO:37)
DACT2U反向:5’-CCTACAACTCCTACAACCCCAC-3’(SEQ ID NO:38)
DACT3-1M正向:5’-AATTTTATCGGAGGACGTTC-3’(SEQ ID NO:39)
DACT3-1M反向:5’-CTTACGAACGAACGCTAACTAC-3’(SEQ ID NO:40)
DACT3-1U正向:5’-AATAATTTTATTGGAGGATGTTT-3’(SEQ ID NO:41)
DACT3-1U反向:
5’-CTTACAAACAAACACTAACTACCAT-3’(SEQ ID NO:42)
DACT3-2M正向:5’-AGTTTTCGTTAGGAAGTTTATTCGT-3’(SEQ ID NO:43)
DACT3-2M反向:5’-TATCACCGTCTCATCTACATAAACG-3’(SEQ ID NO:44)
DACT3-2U正向:5’-AGTTTTTGTTAGGAAGTTTATTTGT-3’(SEQ ID NO:45)
DACT3-2U反向:5’-ATCACCATCTCATCTACATAAACACC-3’(SEQ ID NO:46)
DACT3-3M正向:5’-GATAGTTCGGTTAGCGGGC-3’(SEQ ID NO:47)
DACT3-3M反向:5’-AACGCCTACTACACGCGATA-3’(SEQ ID NO:48)
DACT3-3U正向:5’-GGTGATAGTTTGGTTAGTGGGT-3’(SEQ ID NO:49)
DACT3-3U反向:5’-AACACCTACTACACACAATACTC-3’(SEQ ID NO:50)
DACT3-4M正向:5’-TTCGTTTGTGTTTGTTTGTTTC-3’(SEQ ID NO:51)
DACT3-4M反向:5’-ACCCGATCTCGAATTTAACA-3’(SEQ ID NO:52)
DACT3-4U正向:5’-ATTTTTGTTTGTGTTTGTTTGTTTT-3’(SEQ ID NO:53)
DACT3-4U反向:5’-TACCCAATCTCAAATTTAACACA-3’(SEQ ID NO:54)
SFRP1M正向:5’-CGCGTTTGGTTTTAGTAAATC-3’(SEQ ID NO:55)
SFRP1M反向:5’-CCGAAAATACGACGAACA-3’(SEQ ID NO:56)
SFRP1U正向:5’-AGTTGTGTTTGGTTTTAGTAAATT-3’(SEQ ID NO:57)
SFRP1U反向:5’-CTCCCAAAAATACAACAAACA-3’(SEQ ID NO:58)
BGS:
DACT1BGS正向:5’-ATTGGGGGTTATGAAGTYG-3’(SEQ ID NO:59)
DACT1BGS反向:5’-TCCAAAAACTTCTCCTCCAAAC-3’(SEQ ID NO:60)
DACT2BGS正向:5’-TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3’(SEQ ID NO:61)
DACT2BGS反向:5’-CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3’(SEQ ID NO:62)
DACT3BGS正向:5’-AAGAGGGTGGAATTTGTTGTA-3’(SEQ ID NO:63)
DACT3BGS反向:5’-TCACCRTCTCATCTACATAAAC-3’(SEQ ID NO:64)
1.10染色质免疫沉淀(ChIP)测定
如前述进行ChIP测定(Zhao等,2005,上文)。使用PRISM 7900Sequence Detection System(Applied Biosystems)通过实时定量PCR对免疫沉淀的DNA进行定量。选择引物对用于扩增所述区域附近约100-150bp。在ChIP研究中使用如下抗体:抗H3K27me3(Upstate)、抗H3K9me3和抗H3K9me2(Abcam)、抗H3K20me3(Upstate)、抗H3K9/K14ac和抗H3K4me3(Upstate)。相对于输入量对在检查区域处的这些组蛋白标记的富集进行定量。为了比较来自未处理细胞和处理细胞的两个DNA材料池,将ΔCt值针对显示低背景富集区域进行进一步的归一化。PCR引物的序列如下:
DACT1C正向1:5’-GTGCAACTGATGCCCCTTAC-3’(SEQ ID NO:65)
DACT1C反向1:5’-TTGTCCAGCGGTGAACATTC-3’(SEQ ID NO:66)
DACT1C正向2:5’-GCTTGTCTGCCTGACTTAAG-3’(SEQ ID NO:67)
DACT1C反向2:5’-TGGCCTGTGTTATGTCACAC-3’(SEQ ID NO:68)
DACT1C正向3:5’-TGTGCTAGCCACGTTGTAAG-3’(SEQ ID NO:69)
DACT1C反向3:5’-GCTATGGGAACCTGCTGTTG-3’(SEQ ID NO:70)
DACT1C正向4:5’-GACGAGAAAGAGCCAATGAG-3’(SEQ ID NO:71)
DACT1C反向4:5’-CCTTTTCGGGTTTACTGCAC-3’(SEQ ID NO:72)
DACT1C正向5:5’-CTTGGAGGAGAACATCTTGC-3’(SEQ IDNO:73)
DACT1C反向5:5’-TTCGGGCACGACCTACCAAT-3’(SEQ ID NO:74)
DACT1C正向6:5’-TCGCCTAGTTCTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:75)
DACT1C反向6:5’-CGGGAGGAGATAAAGTCAAG-3’(SEQ ID NO:76)
DACT1C正向7:5’-TCTGCCAGCTGTGATTGGTG-3’(SEQ ID NO:77)
DACT1C反向7:5’-ACTGAGACACTGACAGAAAC-3’(SEQ ID NO:78)
DACT1C正向8:5’-GAGGCGTTCAAATCTCGATG-3’(SEQ ID NO:79)
DACT1C反向8:5’-CCAGTGCCAAGTATAATGTG-3’(SEQ ID NO:80)
DACT1C正向9:5’-GTAAGTCAGAACTGGGCTAG-3’(SEQ ID NO:81)
DACT1C反向9:5’-AATCTAAGGAGCCCAAATGG-3’(SEQ ID NO:82)
DACT1C正向10:5’-AACTCGGTGTTCAGTGAGTG-3’(SEQ ID NO:83)
DACT1C反向10:5’-GGCAACCATCTGAGAGACTC-3’(SEQ ID NO:84)
DACT2C正向1:5’-GCTGACGTCATACTTAACAG-3’(SEQ ID NO:85)
DACT2C反向1:5’-CCAGGATGGGTACCTTTTAC-3’(SEQ ID NO:86)
DACT2C正向2:5’-AAGATGCTCAACGTCCTTAG-3’(SEQ ID NO:87)
DACT2C反向2:5’-CAGATGTGAAGTGGTATCTC-3’(SEQ ID NO:88)
DACT2C正向3:5’-GAGGTGCGGTTTCCAAACTG-3’(SEQ ID NO:89)
DACT2C反向3:5’-ATTGCAAGGACCGTGTTACC-3’(SEQ ID NO:90)
DACT2C正向4:5’-CAAGCCTTTCTCCGCCTTTG-3’(SEQ ID NO:91)
DACT2C反向4:5’-GAGCGCCTCCGTGACTTCAG-3’(SEQ ID NO:92)
DACT2C正向5:5’-CAGCCCACCTTGGCGACCTG-3’(SEQ ID NO:93)
DACT2C反向5:5’-GCGGATCCCGAGCTGTGTCG-3’(SEQ ID NO:94)
DACT2C正向6:5’-CCGACTTGTCCTCAGGAATG-3’(SEQ ID NO:95)
DACT2C反向6:5’-CTCCTTACAGGTCAGGTCAC-3’(SEQ ID NO:96)
DACT2C正向7:5’-GACTGTGTGGGATTAACCTG-3’(SEQ ID NO:97)
DACT2C反向7:5’-CTTTCCTCTCAGGAGGCATC-3’(SEQ ID NO:98)
DACT2C正向8:5’-GCTGCTGAGATGCTGTTGTG-3’(SEQ ID NO:99)
DACT2C反向8:5’-ACAGAACAGTTGAAGCCAGC-3’(SEQ ID NO:100)
DACT3C正向1:5’-CTCAGATGGGATGGACCCTA-3’(SEQ ID NO:101)
DACT3C反向1:5’-ATTCCCATTCAGCACAGGTC-3’(SEQ ID NO:102)
DACT3C正向2:5’-CTTCACTCGCACCACCAAAG-3’(SEQ ID NO:103)
DACT3C反向2:5’-CCTTTGAGGAAGGCGTGTAG-3’(SEQ ID NO:104)
DACT3C正向3:5’-GTGTCTGGGAAGGCTTCTTG-3’(SEQ ID NO:105)
DACT3C反向3:5’-CCCAACCTTCAGCTTCTGAG-3’(SEQ ID NO:106)
DACT3C正向4:5’-AGGCACAGACCAATGGCATT-3’(SEQ ID NO:107)
DACT3C反向4:5’-CCACGCGTCACAATGAAACA-3’(SEQ ID NO:108)
DACT3C正向5:5’-TTGCGAGCATGCGTCGTGTT-3’(SEQ ID NO:109)
DACT3C反向5:5’-CGAGCAACAGCCGCCTATTG-3’(SEQ ID NO:110)
DACT3C正向6:5’-TGTCTGTCTGTCTCGGTTGG-3’(SEQ ID NO:111)
DACT3C反向6:5’-ACCCCCTGTCCTTTCTCACT-3’(SEQ ID NO:112)
DACT3C正向7:5’-TTCCCTAAGTCCTGGTGTGC-3’(SEQ ID NO:113)
DACT3C反向7:5’-TCCTCAGGGACTGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO:114)
DACT3C正向8:5’-CTGGACTCTGGGTGTTCTCA-3’(SEQ ID NO:115)
DACT3C反向8:5’-CGGGAGACTCAAGGAATGAC-3’(SEQ ID NO:116)
DACT3C正向9:5’-CAGTCTCTAGGCAAAGCTTG-3’(SEQ ID NO:117)
DACT3C反向9:5’-GCCCTAATCCACTCTTCAGA-3’(SEQ ID NO:118)
DACT3C正向10:5’-GGAATTAGACTTGGCAGAAC-3’(SEQ ID NO:119)
DACT3C反向10:5’-CTTCAGCCTGAGAGACTTTG-3’(SEQ ID NO:120)
DACT3C正向11:5’-GTGAGGTCCCAGAGACTATG-3’(SEQ ID NO:121)
DACT3C反向11:5’-TGATTACAGCCTGCAGTCAC-3’(SEQ ID NO:122)
1.11免疫荧光染色和共焦显微术
将细胞接种至4孔或8孔培养室载玻片中。处理或转染72小时后,将细胞用PBS中3.7%的多聚甲醛固定并用0.2%Triton-X100进行透化。用一级抗体(抗Myc或抗β-联蛋白)和Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 546缀合的二级抗体(Invitrogen)每种顺序温育1小时并在Fluorsave(Merck)封固介质中封固。在封固介质中稀释DRAQ5(Biostats,UK)用于核染色。用Zeiss LSM510共焦显微镜检查染色的细胞。
1.12集落形成测定
如之前描述进行集落形成测定来体外评估肿瘤细胞生长(Yoshikawa等,2001,上文)。使用6孔平板以每孔30×104的密度将DLD1细胞铺板,并使用Fugen 6(Roche)根据生产商方案用pcDNA4.0-DACT3或骨架pcDNA4.0(2.0μg)转染。将细胞以一式三份重新铺板并在含Zeocin(100μg/ml)的完全DMEM培养基中培养10-15天。甲醇固定后用Gentian Violet将存活的集落染色并对可见集落(×50细胞)计数。
1.13小鼠中的肿瘤植入
使用G23针头将50μl体积中5×106个HCT-116人结肠癌细胞皮下植入到小鼠右侧腹。每周监测肿瘤生长两次。7天后,将动物分配至不同的处理组中,使得在三组的每一组中获得91-107mm3的平均肿瘤体积。使用以下公式计算肿瘤体积:肿瘤体积(mm3)=(w2×l)/2(w=HCT-116癌的宽度且l=HCT-116癌的长度,以mm计)。
1.14小鼠中使用的药物
由新加坡基因组研究所(Genome Institute Singapore(GIS,vial#11))提供DZNep,并溶解于盐水中。对于DZNep给药,每只小鼠接受按每千克体重10ml体积适当溶于盐水的DZNep(0.5mg/ml的浓度用于5mg/kg剂量等)。使用S*BIO制造的SAHA第8批,并将其溶于MC/Tween(20mg/ml的浓度用于200mg/kg给药等)。
1.15治疗时间表
对于最初MTD研究,将BALB/c裸鼠按每组3只动物随机分为4组。从第0天开始以2.5、5、10和15mg/kg剂量每周3次腹膜内施用DZNep。在第五天终止该MTD研究。
对于HCT-116研究,将在-7天已接受HCT-116异种移植物的裸鼠按每组7只动物分为4组,并且在第0天开始进行药物处理(方案概要见图1):组1-两种所用的化合物的载体对照(清晨每周三次腹膜内注射盐水,下午MC/Tween p.o.q.d.);组2-SAHA(下午200mg/kg q.d.p.o.,且3次/周清晨腹膜内注射DZNep载体盐水);组3-DZNep(清晨腹膜内注射5mg/kg,加下午SAHA载体MC/Tween p.o.q.d):组4-DZNep加SAHA(清晨腹膜内注射5mg/kg DZNep,且在下午200mg/kg q.d.p.o.)。在+14天终止该研究。
1.16功效评估
通过肿瘤生长抑制(TGI)方法评估DZNep治疗的功效,其中将多个治疗组中治疗实现的肿瘤体积的下降与载体组比较。使用以下公式计算肿瘤生长抑制:
%TGI=(VCon第x天-VTr第x天)/(VCon第x天-VCon第0天)×100
(%TGI=肿瘤生长抑制百分比,VCon第x天=在第x天时对照/载体组的肿瘤体积中值或平均值,VTr第x天=在第x天时治疗组中肿瘤体积的中值或平均值,VCon第0天=在第0天=研究起始时对照/载体组中的肿瘤体积中值或平均值)。
1.17毒性
每天对动物称重,并经常检查任何不利的、药物相关的副作用的临床病征,包括活性(无活性/过活性)、皮肤水化/脱水作用、当置于体重秤上时的姿势(例如弓背)、步态、抽搐、体温(例如触摸冷感)和发声。NCI将小鼠中癌症药物的可接受毒性定义为在试验过程中平均组体重下降少于20%,并且在十只处理动物中不多于一只因毒性死亡。如果在组中发现超过1只动物治疗相关死亡(TRD)或者当治疗组的体重下降至低于第0天体重的80%时,停止对该组的治疗。
1.18体内数据的统计
使用单向ANOVA(方差分析)及Dunnett’s post检验来确定肿瘤体积中值的统计学显著性。将p值<0.05用*号表示。使用软件GraphPad Prism(第4版)用于所有统计学分析和图形表示。
2.结果
2.1结肠直肠癌中DACT3的表达独立于启动子甲基化被抑制
如上提及,研究Wnt/β-联蛋白信号转导途径、及其病理性变更和其中的介入的近乎理想的模型是结肠直肠癌。本领域技术人员因此将理解用该模型所获的结果可以容易地转移至与异常Wnt/β-联蛋白信号转导相关的任何其它病症中。因此,本实施例基于该模型。
为了表征结肠直肠癌中Wnt/β-联蛋白信号转导的外遗传效应物,发明人最初关注14种代表性Wnt信号转导抑制剂上,包括SFRP、WIF1、DKK和DACT基因家族成员,其中一些之前已显示出在多种人癌症中转录失活或抑制(He等;2005,上文;Aguilera等,2006,前述;He等,2005,上文;Suzuki等,2002,上文;Suzuki等,2004,上文)。他们使用Illumina Human Ref-8_V2BeadChip(参考图3A)确定在24种人结肠直肠肿瘤相对于与之匹配的正常粘膜中的基因表达。发现与正常对照相比,SFRP家族成员的表达在几乎所有人结肠直肠肿瘤样品中都显著下降(p<0.001),该发现与之前的报道相一致(Suzuki等,2004,上文)。相反,尽管之前报道在建立的结肠直肠癌细胞系中的WIF-1和DKK1沉默(Aguilera等,2006,上文;He等,2005,上文),但在肿瘤样品中WIF-1和DKK1的表达并未与对照显著不同。有趣的是,在所有24个肿瘤样品中DACT3的表达下降(p<0.001),而在肿瘤和对照组织中DACT1和DACT2的表达水平并未出现显著差异(分别为p=0.24和p=0.64)。与导致增强的基线Wnt/β-联蛋白信号激活的Wnt抑制剂的表达下降相一致,与对照组织相比,这些肿瘤展现出包括MYC(He,T.C.,等,Science(1998)281,1509-1512)、细胞周期蛋白D1基因CCND1(Tetsu,O.,和McCormick,F.,Nature(1999)398,422-426)、LEF1(淋巴样增强子结合因子1;cf.Filali,M.,等,J Biol Chem(2002)277,33398-33410)和CD44(Wielenga,V.J.,等,Am JPathol(1999)154,515-523)在内的确定的β-联蛋白/TCF靶基因增强的表达。8对随机选择的患者样品的RT-PCR分析证实了与对照相比在结肠直肠癌中SFRP1和DACT3而非DACT1的抑制(图3B)。值得注意的是,还在8份肿瘤样品中的3份中观察到了DACT2表达的下降。因此,除了之前鉴定到的诸如SFRPs的Wnt抑制剂表达的下降,还发现了DACT3表达在结肠直肠癌中相应地下降。因此,发现了至少在一些结肠直肠肿瘤中DACT2表达也下降的证据。
已显示SFRPs在癌细胞中通过启动子甲基化转录失活(Suzuki等,2004,上文)。为了测定DACT3启动子的甲基化状态,本发明人在8份结肠直肠癌样品中在经5’-RACE测定的转录起始位点附近进行了甲基化特异性PCR(MSP)分析(图2)。DACT3启动子包含CpG岛(图3C)。覆盖整个CpG岛的MSP分析显示在结肠直肠肿瘤样品中的DACT3启动子处缺少DNA甲基化(图3C)。作为阳性对照,使用相同技术证实了在这些相同肿瘤样品中SFRP1的启动子区发生了甲基化(图3C)。该发现揭示了尽管在结肠直肠癌中DACT3表达下降,但它的发生独立于这些细胞中之前与基因沉默相关联的DNA甲基化。
为了确定在结肠直肠癌细胞系中如上观察是否重演,本发明人在7种此类株系中进行了DACT和SFRP1基因的RT-PCR分析(图3D)。与始终在结肠癌中沉默的SFRP1不同,DACT3显示出在不同的细胞系中变化的基础表达水平。值得注意的是,其它两个DACT家族成员DACT1和DACT2的表达在这些细胞系中的几种细胞系中几乎丧失,而这在上文检测的原发性肿瘤组织中未观察到。因此,检测了在这些结肠直肠癌细胞系中所有三种DACT基因的甲基化状态。如同在原发肿瘤样品中,在所有检测的细胞系中DACT3启动子未发生甲基化,而发现DACT1和DACT2启动子分别发生了部分和完全甲基化(图3E)。在RKO和HT29癌细胞系中的亚硫酸氢盐基因组测序确证了该MSP分析的结果,显示分别在DACT1和DACT2启动子中部分和几乎完全的甲基化CpGs,但在DACT3启动子中几乎没有甲基化的胞嘧啶(图3F)。
使用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-AzaC)在HCT116结肠直肠癌细胞系中在药理学上干扰启动子甲基化。5-AzaC处理降低了DACT1和DACT2启动子的甲基化(图3G),导致了SFRP1、DACT1和DACT2而非DACT3的表达增加(图3H)。类似地,其中DNA甲基转移酶基因DNMT1和DNMT3B被遗传破坏的HCT116细胞系(Rhee,I.,等Nature(2002)416,552-556)显示出DACT1、DACT2和SFRP1的下降的启动子甲基化(图3G;DKO)和增加的表达,但DACT3未出现明显变化(图1G和H)。在DLD1细胞中也获得了类似结果(图3H)。这些结果支持了在结肠直肠癌细胞中,与SFRP1和DACT1和DACT2基因不同,启动子甲基化不促进DACT3的外遗传抑制的结论。此外,发现在患者肿瘤样品中DACT1启动子未发生甲基化且仅在具有DACT2表达下降的几个肿瘤样品中检测到了DACT2启动子甲基化(数据未显示)。因此,所检测的在临床肿瘤样品中DACT1/2甲基化的缺乏可以解释为何通常在这些肿瘤中它们没有被下调。
2.2DACT3的外遗传抑制与二价组蛋白修饰相关
使用染色质免疫沉淀(ChIP)确定染色质状态是否与DACT3抑制相关。将该测定与定量PCR结合来表征潜在相关的染色质标记。设计覆盖三个DACT基因的每一个的转录起始位点附近>7kb区域的一组8-10个引物对。检测到存在组蛋白标记,包括存在抑制性标记(例如参考Szyf,2009,上文)H3K27me3、H3K9me3、H3K9me2和H4K20me3,以及激活标记H3K4me3(如上)和H3K9/14ac(图4A)。在HT29细胞中DACT3的转录起始位点下游500bp处检测到抑制性H3K27me3的大量富集和较少程度的抑制性的H4K20me3。此外,还在DACT3更上游的启动子区域检测到更弱的H3K27me3。该发现与最近几个基因组范围的研究是一致的,这些研究显示出在癌和胚胎干细胞中的转录起始位点的近下游区域均检测到大量的H3K27me3(Pan,G.,等,Cell Stem Cell(2007)1,299;Yu,J.,等,Cancer Res(2007)67,10657-10663;Zhao,Y.,等,Proc Natl Acad Sci USA(2005)102,16090-16095)。相反,在HT29细胞中DACT3启动子区未检测到抑制性H3K9甲基化标记。
在HT29细胞中DACT3转录起始位点附近还检测到了高水平的激活标记H3K4me3,揭示了在这些细胞中DACT3启动子同时受抑制性和激活性(二价)组蛋白甲基化事件的修饰。此类二价组蛋白状态之前已与低水平转录的基因相关(Azuara,V.,等,Nat Cell Biol(2006)8,532-538;Bernstein,B.E.,等,Cell(2006)125,315-326;Mikkelsen,T.S.,等,Nature(2007)448,553-560;Pan等,2007,上述;Zhao,X.,等,Cell Stem Cell(2007)3,286)。如果这种情况对于DACT3基因也是真实的话,可以预测抑制性H3K27me3的存在应该与DACT3表达水平负相关。与该假说一致的是,还在表达低水平DACT3的SW480细胞中DACT3处检测到了高水平的H3K27me3;在更低程度上在具有中度DACT3表达的RKO细胞中也检测到了H3K27me3(图4B)。此外,在正常人肠上皮细胞(FHs 74Iht)和其它两种非癌性细胞系乳腺上皮MCF10A和肺成纤维细胞MRC5中的DACT3处仅检测到了高水平的H3K4me3(而非H3K27me3)(图4C),提示了在DACT3处的该二价修饰是癌特异性的。为了进一步证实在DACT3启动子表达受到抑制的细胞中DACT3启动子处于二价组蛋白状态,使用ChIP-Seq Solexa技术在SW480细胞中进行主要组蛋白标记的全基因组作图。该组蛋白修饰的高分辨率图谱清楚地说明H3K27me3和H3K4me3在DACT3处的共修饰(图7)。
在DACT1处还检测到H3K4me3的富集和较低程度的H3K27me3,但在DACT2基因座上没有检测到包括H3K4me3在内的这些组蛋白标记的富集峰(图4A)。通常对于DACT基因家族,这些结果提示H3K4me3的水平与DNA甲基化状态负相关:在DACT1启动子(其部分甲基化)处及在DACT3启动子(其未甲基化)处而不在DACT2启动子(其完全甲基化)处检测到H3K4me3(参考图1F和图2)。该发现与近期关于DNA甲基转移酶优先与非甲基化的H3K4结合(Ooi,S.K.,等,Nature(2007)448,714-717)及H3K4的甲基化倾向于保护周围核苷酸免受甲基化(Weber,M.,等,NatGenet(2007)39,457-466)的报道是一致的。连同更早期的数据显示DACT3的表达对于CpG岛甲基化不敏感,我们的数据如下假说一致:与在结肠癌细胞中,DACT3主要经组蛋白修饰而抑制,并且尤其是在此类细胞中DACT3基因座存在于同时含有抑制性和激活性组蛋白修饰的二价染色质状态中。
2.3通过抑制组蛋白甲基化和脱乙酰化的药理学方法对DACT3的强烈去抑制
最近已公开了S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂3-Deazaneplanocin A(DZNep)消耗polycomb抑制性复合体2的组分并且抑制组蛋白甲基化,包括抑制性H3K27me3和H4K20me3(Tan等,2007,上文)。检测了在结肠直肠癌细胞中DZNep是否能够单独或与组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)、DNA甲基转移酶抑制剂5-AzaC或者两者组合来恢复DACT3表达。为了允许最准确地测定基因表达的变化,使用了Illumina beadarray。使用该工具可以在没有中间核酸扩增步骤的情况下准确测定转录水平。观察到当作为单一试剂使用时,这些药物在DLD1细胞中最低程度地诱导了DACT3表达(图5A)。然而,DZNep与TSA的组合处理强烈地诱导了DACT3表达,而其它组合如DZNep/Aza或TSA/Aza无法实现(图5A)。相反,DZNep/TSA组合仅诱导了DACT1表达的中度增加(图5B)。另一方面,通过含5-AzaC的处理仅诱导了DACT2表达(图3H和3B),这与通过更典型的启动子甲基化的外遗传沉默是一致的。
为了测定DZNep/TSA组合处理对于DACT3去抑制的特异性相对于其它已知的Wnt/β-联蛋白途径抑制剂表达上的变化,再次使用来自未经或经DZNep、TSA或其两者处理的2个结肠癌细胞系(DLD1和HT-29)中的RNA来分析Illumina基因的表达。该分析揭示了DACT3是DZNep/TSA处理强烈诱导的唯一Wnt/β-联蛋白途径抑制剂并且其在两种结肠癌细胞系中均发生(图5B)。总之,我们的发现显示出DACT3与其它Wnt途径抑制剂的不同,因为其在结肠癌细胞中的抑制似乎与二价组蛋白修饰而不是DNA甲基化相关,并且因此可经专门靶向组蛋白修饰的药理学方法来将其强烈地去抑制化。
为了更好地理解药物活性化合物DZNep和TSA的组合将DACT3表达再激活的机制,通过Western印迹在处理和未处理的细胞中检测组蛋白修饰谱(图5C)。如之前报道的,单独的DZNep处理导致了H3K27me3和H4K20me3的强烈减少,而对H3K9me3几乎没有影响(Tan等,2007,上文)。尽管组合处理导致H3K9me3一定的轻度抑制,但与用DZNep或TSA单独处理相比,最显著的协同变化是H3K9/14乙酰化的强烈诱导(图5C)。有趣的是,不考虑单独DZNep处理时H3K4me3的轻微下降,H3K4me3也受该组合处理诱导。因此,DZNep与TSA的药理学组合导致组蛋白修饰的有趣的总体偏移:它降低了某些抑制性组蛋白标记(H3K27me3、H4K20me3和H3K9me3)却显著增加了一些激活性组蛋白标记(H3K9/14ac和H3K4me3)。从机制上说,这揭示了这些染色质标记间存在相互干扰,使得由DZNep对抑制性组蛋白甲基化的抑制为受TSA诱导的组蛋白乙酰化产生了有利的染色质环境。在这些处理后的细胞中总体组蛋白谱中观察到效应强度进一步揭示了该现象在基因组中是广泛存在的。这又导致显然包括DACT3在内的特定靶基因表达的增加。
使用ChIP进一步评估在DACT3基因座上对DZNep/TSA组合处理特异应答中组蛋白修饰的变化。与由Western印迹分析发现的修饰的组蛋白水平的整体变化相一致,用DZNep/TSA处理的细胞在DACT3基因座上具有减少的H3K27me3和H4K20me3,并且伴随着H3K4me3和H3K9/K14ac增加(图5D)。DACT1基因座处的此类效应更微弱,并且因此与该药理学处理分别对DACT3和DACT1基因表达的相对效应良好相关。DACT3基因座上组蛋白甲基化和乙酰化标记的显著变化符合并有助于解释DZNep/TSA处理后DACT3表达水平上同样的显著变化。
总之,在附图中图解的上面的生化、药物学及表达数据都支持了如下模型:其中DACT3表达的抑制是经二价组蛋白结构域发生。此外,该抑制作用可通过组合药理学方法有效逆转,该方法同时抑制组蛋白甲基化和脱乙酰化,从而导致在显然包括DACT3基因座在内的此类二价修饰的基因的亚类中染色体结构的主要变化。
2.4结肠直肠癌细胞中DACT3的去抑制与Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制和大量程序性细胞死亡相关
检测了上述药物活性化合物单独和组合对DVL2和β-联蛋白水平的影响。由于DVL2是在所有或大部分细胞类型中均表达的三种功能冗余且保守的DVL家族成员之一(Hamblet,N.S.,等Development(2002)129,5827-5838),所以任意选择了它作为DVL基因家族的代表。与在转录物水平上观察到的变化相一致,如通过Western印迹分析检测到的(图6A和图11),DZNep和TSA组合处理时DACT3蛋白质水平显著提高(在SW480和D1D1细胞中)。组合处理进一步导致了DVL2水平的下降。相反,DZNep或TSA的单独处理不能引起此类变化(图6A)。
同时,如Western印迹所示,激活的(非磷酸化的)β-联蛋白的水平在DZNep/TSA处理的细胞中下降(参考图6A)。该发现通过免疫细胞化学得到验证,所述免疫细胞化学显示用DZNep/TSA处理后细胞核β-联蛋白染色减少(图6B)。最后,TCF/β-联蛋白靶基因(包括MYC、LEF、CCND1和CD44)的表达在DZNep/TSA处理的细胞中显著降低,但在单独用DZNep或TSA处理的细胞中没有降低(图6C和6D)。这些发现一致地说明DZNep/TSA组合处理抑制Wnt/β-联蛋白信号转导。此外,观察到通过用GSK-3的小分子抑制剂处理细胞可有效恢复DZNep/TSA处理后β-联蛋白的降低,而DVL2的下调保持不受影响(图10)。这揭示了DACT3-DVL2通过GSK-3传递来调节β-联蛋白的稳定性。
在所有三种癌细胞系中受DZNep/TSA处理表达增加的81种基因中,DACT3受诱导最强烈(参考图12)。根据本发明人知识,该列表中没有其它基因(参考图12)与Wnt/β-联蛋白信号转导直接相关。总之,此处所得的结果支持DZNep/TSA组合处理在结肠直肠癌细胞系中通过增加DACT3基因表达和蛋白质水平,其次使有效的Wnt信号转导所需的内源DVL蛋白去稳定而降低Wnt/β-联蛋白信号转导。相反,它们提示了DACT3的抑制是结肠直肠癌形成中的关键性外遗传事件。
预期Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制阻断前存活途径并在习惯于该途径的癌细胞中诱导程序性细胞死亡(Fujii等,2007,上文;He等,2005,上文)。实际上,如通过碘化丙锭(PI)和荧光激活细胞分选(FACS)评估(图6E),发现DZNep/TSA对Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制伴随着DLD1和HT29细胞中细胞死亡的强烈协同诱导(图6E)。使用其它结肠癌细胞系获得了类似的结果(数据未显示)。相反,用DZNep/Aza处理的细胞(所述处理不有效去抑制DACT3表达)不经历相当水平的细胞死亡。类似地,向DZNep/Aza组合中加入5-AzaC(其不产生DACT3基因表达的进一步增加)也不产生细胞死亡的额外增加。这揭示了5-AzaC对DNA甲基化的调节和对其它潜在靶基因的所得影响并不促进对Wnt/β-联蛋白信号转导的进一步影响,并且DZNep/TSA单独对DACT3的诱导与最大细胞死亡相关。进一步确定DZNep/TSA诱导的细胞死亡是程序性细胞死亡。如图6F所示,DZNep/TSA组合处理,而不是仅单个这些药物活性剂的处理导致HT29细胞中胱天蛋白酶3的显著激活(参考图6F)。此外,组合处理诱导线粒体跨膜电位(MTP)(Δψm)的急剧下降,表明特征为程序性细胞死亡的线粒体功能异常(参考图6G)。
也在组合DZNep与其它HDAC抑制剂(如PXD101和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA))的处理中见到DZNep/TSA处理对组蛋白修饰、DACT3基因表达、激活的β-联蛋白水平和程序性细胞死亡的特定影响(见图13)。这表示已经定义的该药理学策略的效果取决于DZNep与HDAC抑制剂的组合作用,并且不是与DZNep组合施用的TSA的特殊结果。
2.5DACT3作为Wnt/β-联蛋白信号转导的关键调节子的功能验证
为了评估是否需要DACT3转录去抑制以在处理的结肠直肠癌细胞中降低Wnt/β-联蛋白信号转导,从稳定表达短发夹RNA靶向DACT3的DLD1产生细胞系。与对照shRNA细胞相比,在DZNep/TSA处理后,表达DACT3shRNA的两个DLD1克隆中DACT3mRNA的水平极大地降低(图8A)。Western印迹分析表明对DVL2和未磷酸化的β-联蛋白水平的DZNep/TSA诱导的影响在DACT3shRNA细胞中降低(图8A)。此外,当测定程序性细胞死亡时,DZNep/TSA对程序性细胞死亡的诱导在表达DACT3shRNA的细胞系中显著下降(图8B)。这些DACT3击倒效果不大可能是由siRNA的脱靶效果引起,因为这些效果也在瞬时转染两个其它独立DACT3siRNA的SW480细胞中观察到了(图8C)。相反,DACT1的击倒(其在DZNep/TSA处理后仅显示轻微的增加)对程序性细胞死亡没有抑制效应(图8D)。总之,这些结果说明DACT3的转录去抑制促进对Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制和DZNep/TSA处理结肠直肠癌细胞后的程序性细胞死亡。
还直接检测了DACT3在调节Wnt/β-联蛋白信号转导中的功能。先前已经显示多个物种中DACT家族成员与DVL蛋白通过高度保守的C末端基序相互作用并负调节β-联蛋白的功能(Cheyette等,2002,上文;Zhang,L.,等,J Biol Chem(2006)281,8607-8612)。为了证实DACT3也与DVL蛋白相互作用,通过用Flag-标记的DACT3和HA-标记的Dvl2的表达载体转染SW480细胞进行免疫共沉淀实验。在使用任一标签抗体的这些条件下,Dvl2与DACT3有效地免疫沉淀,并且反过来DACT3与Dvl2有效地免疫沉淀(图9A)。此外,与共转染了空载体的Dvl2-HA表达细胞相比,Dvl2-HA与DACT3-Flag的共转染导致Dvl2-HA蛋白表达显著下降(图9B)。这些结果证明,如从与其它DACT家族成员的同源性预测,如通过Dvl2示例,DACT3确实可与DVL家族成员相互作用。它们还显示该相互作用可至少在这些共转染条件下降低DVL蛋白的稳定性。
使用共焦免疫化学类似地研究SW480细胞中异位DACT3表达对β-联蛋白水平的影响。表达Myc-标记的DACT3或DACT1的SW480细胞具有几乎检测不到水平的细胞核β-联蛋白,而未转染细胞或转染了非相关基因产物Myc-标记RPS27L的细胞保持高水平的细胞核β-联蛋白(图9C)。此外,异位表达DACT3的SW480细胞显示程序性细胞死亡典型的浓缩细胞核。这些结果证实像其它Dact家族成员一样(Cheyette等,2002,上文;Hikasa,H.,& Sokol,S.Y.Development(2004)131,4725-4734;Zhang等,2006,上文),异位表达的DACT3可负调节Wnt/β-联蛋白信号转导,包括在结肠直肠癌细胞中。
为了测定DACT3是否由于致癌Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制而抑制了细胞生长,用转染了DACT3表达质粒或对照空载体的DLD1细胞进行集落形成测定。转染了DACT3的细胞与对照细胞相比在集落数目上显示显著下降(图9D)。该结果进一步证实了DACT3在结肠癌中作为潜在的肿瘤抑制剂起作用。
2.6初始最大耐受剂量的DZNep毒性(体内MTD研究)
该研究的目标是(i)在BALB/c裸鼠中评估每周三次给予的3-Deazaneplanocin A(DZNep)的最大耐受剂量(MTD),并(ii)在HCT-116人结肠癌异种移植物模型中评估DZNep与HDAC抑制剂SAHA组合的功效。
在HCT-116细胞接种用于功效研究时,在第0、2和4天用2.5、5、10和15mg/kg DZNep腹膜内注射3只小鼠/组以收集原始MTD数据。体重减轻非常有限,并在10mg/kg组观察到最多的体重减轻(在第2天2.2%,原始数据未显示)。在第3天15mg/kg组中三只小鼠中的两只在没有显著的体重减轻的情况下死亡(原始数据未显示)。因此在该方案中DZNep的MTD是10mg/kg。对于使用DZNep作为致敏剂的以下组合研究,我们决定以充分低于MTD的剂量(即5mg/kg)施用DZNep。
如使用图15中描述的方案进行研究。使用携带HCT-116肿瘤的四组BALB/c裸鼠开始组合研究(n=7只小鼠/组,接种后6天的初始平均肿瘤体积:91-107mm3)。我们进行完全载体对照的该研究,其中一组小鼠作为两种所用化合物(每周上午盐水腹膜内注射3次,下午q.d.p.o.MC/Tween)的对照,第二组接受SAHA(下午q.d.p.o.200mg/kg)加上DZNep载体(每周上午盐水腹膜内注射3次),第三组用DZNep处理(上午腹膜内注射5mg/kg)加SAHA载体(下午MC/Tweenq.d.p.o.),最后一组用DZNep加SAHA处理(上午腹膜内注射5mg/kg DZNep,加下午200mg/kg q.d.p.o.)。
图16显示在14天内载体组中体重稳定增加至106.8%时,单独的DZNep和SAHA处理诱导了非常适度的体重减轻(分别为94.5%和96.8%)。组合治疗组在第14天显示为显著,但仍然可容许的体重减轻至87.9%。由于第4天的管饲法错误失去了SAHA组中的一只动物,并且SAHA组中的第二只小鼠在体重为82%的时候也死亡(视为TRD)。然而在该实验中BALB/c裸鼠很好地耐受每周三次5mg/kg DZNep加200mg/kg SAHA q.d.的组合。
2.7HCT-116模型中DZNep与SAHA组合的功效
如图14B所示,在14天里载体对照组中所有的肿瘤生长稳定,并且在处理后第14天的平均肿瘤体积是395.4mm3。在图17中以图示了MTV肿瘤分布数据,并在图18中显示了第3、7、10和14天的所有TGI数据。没有显示个体肿瘤测径器测定结果和体重(原始数据)。
在治疗14天后,SAHA组具有55%的肿瘤生长抑制(TGI)(不显著),而DZNep治疗的动物完全没有显示TGI。DZNep加SAHA的组合治疗诱导83%的显著TGI(145.1mm3的平均肿瘤体积,P<0.05ANOVA/Dunnett’s)。
3.讨论
本发明基于在人结肠直肠癌中促进Wnt/β-联蛋白信号转导组成型激活的外遗传事件的发现。此处显示DACT3基因的转录抑制在结肠直肠癌细胞系和患者来源的肿瘤中频繁地发生。给出了数据,其揭示DACT3与SFRP一起可能是在该疾病过程中Wnt/β-联蛋白信号转导途径的关键性外遗传调节物。DACT3因此是旨在控制异常Wnt/β-联蛋白信号转导的癌症疗法的潜在重要靶标。上文说明的技术可容易地用于本发明的方法和用途中。
不像SFRP基因(其表达经常被启动子DNA甲基化完全沉默),DACT3在结肠癌细胞系中以低水平表达。本发明显示该外遗传事件通过二价组蛋白修饰发生,所述二价组蛋白修饰在DACT3基因座含有抑制性(H3K27me3)和激活性的(H3K4me3)组蛋白标记并且不涉及或需要启动子DNA的甲基化。由于该外遗传调节,可通过靶向组蛋白修饰的药学治疗强烈诱导DACT3的水平:尤其是,同时干扰组蛋白甲基化和脱乙酰化的组合治疗。相比,该治疗不重新活化主要由DNA甲基化沉默的基因,如SFRP1或DACT2,并且仅适当地诱导DACT,在结肠癌细胞中其抑制与DNA甲基化和组蛋白修饰相关联。该数据说明DZNep和组蛋白脱乙酰酶抑制剂如TSA的组合施用优先再活化主要被最小DNA甲基化引起的二价组蛋白修饰抑制的基因。
先前已经在胚胎干细胞(ES)和一些分化细胞中描述了二价染色质,其中它们一般与低水平表达的基因相关(Azuara等,2006,上文;Barski,A.,等,Cell(2007)129,823-837;Bernstein等,2006,上文;Mikkelsen等,2007,上文;Pan等,2007,上文;Zhao等,2007,上文)。在ES细胞中具有二价组蛋白标记的一些肿瘤抑制基因在肿瘤生成过程中丢失H3K4me3标记,相反通过DNA甲基化变得完全沉默(Ohm,J.E.,等,Nat Genet(2007)39,237-242;Schlesinger,Y.,等,Nat Genet(2007)39,232-236;Widschwendter,M.,等,Nat Genet(2007)39,157-158)。本发明人获得的数据提示在癌细胞中发生的二价染色质状态还可能促进癌性转化。重要的是,因为在正常肠上皮细胞中DACT3基因座处没有观察到此类修饰,在DACT3基因座处的这种外遗传修饰显然是癌特异性的。在癌细胞中该二价染色质状态中发现的基因(如DACT3)因此代表了独特的治疗靶标。不像被DNA甲基化沉默的肿瘤抑制剂,可通过如用DZNep和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(其靶向组蛋白甲基化和脱乙酰化)处理特别操作携带二价染色质的基因(如DACT3)。因为它们很可能对仅靶向DNA甲基化的疗法(如Aza)不敏感,所以鉴定这些备选调节的肿瘤抑制基因也是重要的。
尽管目前是推测的,但在本发明上下文中结肠直肠癌细胞中DACT3基因座上观察到的染色质模式是干细胞样癌细胞的分子特征的一部分。有证据表明Wnt/β-联蛋白信号转导在维持上皮干细胞和早期祖细胞中起重要作用,并且其参与产生iPS细胞(见上文)。在一些实施方案中靶向尤其是结肠直肠癌细胞的外遗传特征并能够消除Wnt/β-联蛋白信号转导的本发明的组合药理学方法可能具有靶向癌干细胞的潜力,所述癌干细胞依赖于这种基因沉默机制并需要高水平的Wnt/β-联蛋白信号转导活性用于其自我更新和存活。
所获得的结果说明参与癌细胞中的基因抑制的外遗传机制的多样性和复杂性。DZNep作为组蛋白甲基化抑制剂与其它染色质重塑化合物的组合中的用途使得其可能发现通过多种外遗传机制调节的其它癌基因。DZNep和HDAC抑制剂如TSA对总的组蛋白修饰模式的组合效果是引人感兴趣的,因为这种药物组合看起来通过同时减少抑制性组蛋白标记(H3K27me3)和增加激活标记(H3K4me3和H3K9/14ac)将抑制性的染色质状态转换成激活状态。该药理学介入与DNA甲基化抑制剂一起因此可能具有将在一些癌细胞中发现的总的“恶性”染色质状态还原到更正常“良性”染色质状态的潜力。尽管在生物化学上仍然需要确定用DZNep和组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理怎样在组蛋白乙酰化中产生这种强烈的协同作用,但是这很可能反映了这两种类型组蛋白修饰之间的直接相互干扰。给出的数据还揭示了基因组中组蛋白修饰模式的此类药理学外遗传“重新编程”可导致基因表达的极大改变,同时影响多个信号转导途径。实际上,我们的微阵列数据显示DACT3不是以该方式调节的唯一基因;至少81种其它基因的表达显著受DZNep和组蛋白脱乙酰酶抑制剂组合处理的影响。Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制可能与其它信号转导协同作用导致产生在该组合处理时观察到的最大细胞凋亡应答。
本发明表明通过药理学去抑制或通过异位表达在结肠直肠癌细胞中提高DACT3蛋白的水平导致DVL2的强烈降解和激活的β-联蛋白的减少。该DACT3-DVL2信号转导相互作用可能通过GSK-3传送以调节β-联蛋白稳定性。GSK-3的小分子抑制剂可恢复由DZNep和组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理引起的激活β-联蛋白的减少这一发现支持了该想法。如此处报道,本发明人也已经发现由增加的DACT3引起的激活的β-联蛋白的降低甚至在APC突变存在下发生。该发现与揭示在携带APC突变的结肠直肠癌细胞中仍然发生失调的β-联蛋白磷酸化和降解的许多报道一致(Calviello,G.,等,Carcinogenesis(2007)28,1202-1209;Rice,P.L.,等,Mol Cancer Ther(2003)2,885-892;Suzuki等,2004,上文;Yang,J.,等,J Biol Chem(2006)281,17751-17757)。特别是,已经显示SFRP1/2的恢复表达可在携带这些下游突变的结肠直肠癌细胞中有效降解β-联蛋白(Calviello等,2007,上文;Rice等,2003,上文;Suzuki等,2004,上文)。这些发现与前面的研究一起提示存在备选的分子机制,其在结肠直肠癌细胞中独立于APC促进β-联蛋白调节。
本发明上下文中获得的数据也揭示多个异常外遗传事件可能促进结肠癌中Wnt/β-联蛋白信号转导途径的异常激活。这些多个事件可能在相同细胞中发生,或它们可在肿瘤内不同细胞中存在。通过增加肿瘤细胞群体中的异质性,外遗传事件可促进癌进展,并还促进治疗抗性和癌复发。
简而言之,该公开内容的数据表明DACT3的外遗传抑制在结肠直肠癌细胞中导致异常的Wnt/β-联蛋白信号转导。我们的数据代表了理解以前未知的外遗传事件怎样促进结肠直肠癌中Wnt/β-联蛋白信号转导失调的重要进展。该工作还提供了重要的理论证据,即药理学策略可特异性靶向此类外遗传事件以对Wnt/β-联蛋白信号转导产生强烈影响,导致癌根除的重要结果。
体内研究中获得的结果表明,当以低的良好耐受剂量给予DZNep时,S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂DZNep和SAHA可有效抵抗实体瘤。83%的TGI数据是显著的,而单独用DZNep处理根本无效(0%TGI)。因为单独的SAHA在几个前述实验中具有约50%的TGI,可断定在DZNep和SAHA的效应之间存在协同作用。
4.所用简写的列表
简写 描述
b.i.d. 每天两次
BRC 生物资源中心,Biopolis
BW 体重
CR 完全消退
DZNep 3-Deazaneplanocin A
HDAC 组蛋白脱乙酰酶
IACUC 机构动物管理和使用委员会
i.p. 腹膜内
LTTFS 长期无肿瘤存活者
MC/Tween 0.5%甲基纤维素+0.1%Tween 80
MTD 最大耐受剂量
MTV 中值肿瘤体积
NTRD 非处理相关的死亡
p.o. 经口,口服
PR 部分消退
q.d. 每天一次
SAHA 辛二酰苯胺异羟肟酸
TGI 肿瘤生长抑制
TRD 处理相关的死亡
TSA 曲古抑菌素A
此处已经广泛并一般性地描述了本发明。落入该一般性公开内容范围内各更窄的种类和亚类也构成部分本发明。这包括本发明的一般性描述,条件是或负面限定是从该属中去除任何主题,不管所去除的材料是否是此处明确引用的。其它实施方案在以下权利要求内。此外,在以马库什组描述了本发明的特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到本发明也按照马库什组的任何个体成员或亚组成员描述。
本领域技术人员将容易地理解本发明很好地适合进行目标并获得所提及的目的和优势,以及其中固有的那些。此外,对本领域技术人员显而易见的是可在不背离本发明范围和精神的情况下对此处公开的发明进行不同的替换和修饰。此处描述的组合物、方法、步骤、处理、分子和特定化合物目前代表优选的实施方案,其为示例性的并且不旨在限制本发明范围。本发明精神内包含的本领域技术人员想到的改变和其它用途由权利要求的范围定义。该说明书中先前出版文件的列表或讨论不应必然被认为承认所述文件是本领域现状的一部分或普遍的一般知识。
可在没有此处明确公开的任何要素、限制情况下适当地实践此处阐明性描述的本发明。因此,例如术语“包含”、“含有”等应广义地阅读并且没有限定。词语“包含”或变形如“含有”因此理解为暗示包含所述整数或整数组,但不排除任何其它整数或整数组。此外,此处所用的术语和表述已经用作说明书的术语,并且不是限制,并且在此类术语和表述的使用中不意在排除所示和所述特征的任何等同物或其部分,但认识到在本发明的范围内可进行多种修饰。因此,应理解尽管已经通过示例性实施方案和任选特征详细公开了本发明,但本领域技术人员可得到此处公开的其中体现的本发明的修饰和变型,并且认为此类修饰和变型在本发明范围内。
序列表
<110>新加坡科技研究局
<120>预防和治疗肿瘤的方法和化合物
<150>US 60/948,835
<151>2007-11-02
<150>US 61/059,482
<151>2008-05-06
<160>122
<170>MS Word for Windows
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>寡核苷酸
<400>1
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<210>2
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<212>DNA
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<223>引物
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cacagaaggt tgagggtggt gaatctggac ct 32
<210>4
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<220>
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>5
attagatctt cacactgtag tcatgacctt gagagaaccc ga 42
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<212>RNA
<213>人工序列
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<223>靶序列siRNA
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<212>RNA
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<223>siRNA序列
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ggagaaucgc cugccuuca 19
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<212>PRT
<213>人
<223>DACT3的抗原肽
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Leu Ser Leu Glu Ser Gly Gly Leu Glu Gln Glu Ser Gly Arg
1 5 10 14
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<220>
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<223>引物
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<220>
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<223>引物
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<220>
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<212>DNA
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<220>
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<212>DNA
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<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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cttacaaaca aacactaact accat 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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tatcaccgtc tcatctacat aaacg 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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atcaccatct catctacata aacacc 26
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<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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gatagttcgg ttagcgggc 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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aacgcctact acacgcgata 20
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<213>人工序列
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<223>引物
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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ttcgtttgtg tttgtttgtt tc 22
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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acccgatctc gaatttaaca 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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tacccaatct caaatttaac aca 23
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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ccgaaaatac gacgaaca 18
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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agttgtgttt ggttttagta aatt 24
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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ctcccaaaaa tacaacaaac a 21
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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attgggggtt atgaagtyg 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>60
tccaaaaact tctcctccaa ac 22
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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tggttataga ttttagttta ttttgg 26
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>62
caacccctac aactcctaca ac 22
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>63
aagagggtgg aatttgttgt a 21
<210>64
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>64
tcaccrtctc atctacataa ac 22
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>65
gtgcaactga tgccccttac 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>66
ttgtccagcg gtgaacattc 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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gcttgtctgc ctgacttaag 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>68
tggcctgtgt tatgtcacac 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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tgtgctagcc acgttgtaag 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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gctatgggaa cctgctgttg 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>71
gacgagaaag agccaatgag 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>72
ccttttcggg tttactgcac 20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>73
cttggaggag aacatcttgc 20
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>74
ttcgggcacg acctaccaat 20
<210>75
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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tcgcctagtt ctaacgttcg 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>76
cgggaggaga taaagtcaag 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>77
tctgccagct gtgattggtg 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>78
actgagacac tgacagaaac 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>79
gaggcgttca aatctcgatg 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>80
ccagtgccaa gtataatgtg 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>81
gtaagtcaga actgggctag 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>82
aatctaagga gcccaaatgg 20
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>83
aactcggtgt tcagtgagtg 20
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>84
ggcaaccatc tgagagactc 20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>85
gctgacgtca tacttaacag 20
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>86
ccaggatggg taccttttac 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>87
aagatgctca acgtccttag 20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>88
cagatgtgaa gtggtatctc 20
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>89
gaggtgcggt ttccaaactg 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>90
attgcaagga ccgtgttacc 20
<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>91
caagcctttc tccgcctttg 20
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>92
gagcgcctcc gtgacttcag 20
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>93
cagcccacct tggcgacctg 20
<210>94
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>94
gcggatcccg agctgtgtcg 20
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>95
ccgacttgtc ctcaggaatg 20
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>96
ctccttacag gtcaggtcac 20
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>97
gactgtgtgg gattaacctg 20
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>98
ctttcctctc aggaggcatc 20
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>99
gctgctgaga tgctgttgtg 20
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>100
acagaacagt tgaagccagc 20
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>101
ctcagatggg atggacccta 20
<210>102
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>102
attcccattc agcacaggtc 20
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>103
cttcactcgc accaccaaag 20
<210>104
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>104
cctttgagga aggcgtgtag 20
<210>105
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<223>引物
<400>105
gtgtctggga aggcttcttg 20
<210>106
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>106
cccaaccttc agcttctgag 20
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Claims (92)
1.防止、抑制、阻滞或逆转细胞中肿瘤发生的方法,所述方法包括增加DACT(“dapper、β-联蛋白的拮抗剂、同源物”)蛋白或其功能片段的量和活性中的至少一种。
2.权利要求1的方法,其中所述细胞是体细胞。
3.权利要求1或2的方法,其中所述细胞是直肠细胞或结肠细胞。
4.权利要求1-3任何一项的方法,其中所述肿瘤发生是癌发生。
5.在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的方法,所述方法包括在细胞中增加DACT蛋白或其功能片段的量和活性中的至少一种。
6.权利要求5的方法,其还包括测定肿瘤细胞中程序性细胞死亡。
7.权利要求5或6的方法,其中所述肿瘤是癌和溃疡性结肠炎中的一种。
8.权利要求7的方法,其中所述癌是结肠直肠癌、黑素瘤、食管癌、肺癌、卵巢癌、肝细胞癌和子宫内膜癌中的一种。
9.权利要求1-8任何一项的方法,其中所述细胞从宿主生物中获得,或包含在宿主生物中。
10.权利要求9的方法,其中所述宿主生物是微生物、鱼、两栖动物、鸟和哺乳动物中的一种。
11.权利要求10的方法,其中所述哺乳动物选自大鼠、小鼠、奶牛、山羊、绵羊、猪、狗、豚鼠、黑猩猩和人。
12.权利要求1-11任何一项的方法,其中培养所述细胞。
13.权利要求1-12任何一项的方法,其中所述方法包含在增殖疾病或病症的治疗或预防中。
14.权利要求13的方法,其中待治疗的所述增殖疾病或病症是癌。
15.权利要求1到14任何一项的方法,其包括施用增加DACT蛋白或其功能片段的表达和/或活性的化合物。
16.权利要求15的方法,其中所述化合物是肽、蛋白质、核苷酸、核酸分子、无机化合物和低分子量有机分子中的一种。
17.权利要求16的方法,其中所述核酸分子是DNA和RNA中的一种。
18.权利要求16或17的方法,其中所述核酸分子包含编码DACT蛋白或其功能片段的序列。
19.权利要求1-18任何一项的方法,其中在细胞中增加DACT蛋白或其功能片段的量包括增加DACT蛋白或其功能片段的表达。
20.权利要求19的方法,其中所述方法是外遗传方法。
21.权利要求20的方法,其包括实现或防止翻译后组蛋白修饰模式的改变。
22.权利要求21的方法,其中所述翻译后组蛋白修饰是组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化中的一种。
23.权利要求21或22的方法,其中在DACT蛋白的基因座处实现翻译后组蛋白修饰模式的改变。
24.权利要求21-23任何一项的方法,其中实现翻译后组蛋白修饰模式的改变包括实现(i)在氨基酸位置上去除转录抑制性翻译后组蛋白修饰和(ii)在氨基酸位置上附着转录激活翻译后组蛋白修饰中的至少一种。
25.权利要求21-24任何一项的方法,其中防止翻译后组蛋白修饰模式的改变包括抑制(i)在氨基酸位置上附着转录抑制翻译后组蛋白修饰和(ii)在氨基酸位置上去除转录激活翻译后组蛋白修饰中的至少一种。
26.权利要求21-24任何一项的方法,其包括实现在去除转录抑制翻译后组蛋白修饰和附着转录激活翻译后组蛋白修饰的组合。
27.权利要求24-26任何一项的方法,其中所述激活翻译后组蛋白修饰是在组蛋白3上赖氨酸4的甲基化、组蛋白3上赖氨酸9的乙酰化和组蛋白3上赖氨酸14的乙酰化中的一种,并且其中所述转录抑制翻译后组蛋白修饰是组蛋白3上赖氨酸9的甲基化、组蛋白3上赖氨酸27的甲基化和组蛋白4上赖氨酸20的甲基化中的一种。
28.权利要求1-27任何一项的方法,其中增加DACT蛋白或其功能片段的量和活性中的至少一种还包括增加蛋白质β-联蛋白的磷酸化状态。
29.权利要求28的方法,其中增加蛋白质β-联蛋白的磷酸化状态包括激活糖原合酶激酶3。
30.权利要求1-29任何一项的方法,其中增加DACT蛋白或其功能片段的量和活性中的至少一种还包括减少细胞中dishevelled蛋白的量。
31.权利要求30的方法,其中所述dishevelled蛋白是Dvl1、Dvl2和Dvl3中的一种。
32.权利要求30或31的方法,其中通过降解降低细胞中dishevelled蛋白的量。
33.权利要求30-32任何一项的方法,其中所述dishevelled蛋白与所述DACT蛋白形成复合体。
34.权利要求1-33任何一项的方法,其还包括评估细胞中DACT蛋白的量和活性的至少一种。
35.权利要求34的方法,其中评估所述DACT蛋白的量和/或活性包括评估一段时间内的量和/或活性。
36.权利要求34或35的方法,其中通过测定细胞中DACT蛋白的基因表达实现评估细胞中DACT蛋白的量。
37.权利要求36的方法,其还包括比较DACT基因表达的测定结果与对照测定的结果。
38.权利要求37的方法,其中所述对照测定包括使用至少基本上不调节DACT蛋白基因表达的条件。
39.权利要求1-38任何一项的方法,其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一种。
41.权利要求1-40任何一项的方法,其包括将所述细胞与预定量的通式(I)的化合物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合接触。
43.权利要求42的方法,其中R6的氨基或醚基用脂肪族、脂环族、芳族、芳基脂肪族或芳基脂环族基团取代,所述基团包含选自N、O、S和Si的0-3个杂原子。
44.权利要求40-43任何一项的方法,其中通式(I)的化合物是(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇(3-deazaneplanocin)。
45.权利要求43或44的方法,其中通式(II)的化合物是(2E,4E,6R)-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧代-2,4-七碳二烯酰胺(曲古抑菌素-A)。
46.诊断细胞中肿瘤发生风险的方法,所述方法包括评估(i)细胞中DACT蛋白的量,(ii)细胞中DACT蛋白的活性,(iii)细胞中翻译后组蛋白修饰的模式中的一种。
47.权利要求46的方法,其中所述翻译后组蛋白修饰是组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化中的至少一种。
48.权利要求46或47的方法,其中所述方法是鉴定具有变成肿瘤发生倾向的细胞的方法。
49.权利要求46-48任何一项的方法,其中所述方法包括比较所得结果与对照测定。
50.权利要求49的方法,其中所述对照测定包括在已知至少基本上没有变成肿瘤发生风险的细胞中评估(i)DACT蛋白的量,(ii)DACT蛋白的活性,(iii)翻译后组蛋白修饰的模式中的一种。
51.权利要求47-50任何一项的方法,其中在评估组蛋白乙酰化的模式中,组蛋白3上(i)赖氨酸9和(ii)赖氨酸14中至少一个的降低乙酰化表明所述细胞将变成肿瘤发生的风险增加。
52.权利要求47-51任何一项的方法,其中在评估组蛋白甲基化的模式中,组蛋白3上赖氨酸4和27的增加的甲基化表明所述细胞将变成肿瘤发生的风险增加。
53.权利要求46-52任何一项的方法,其中评估DACT蛋白的基因座上翻译后组蛋白修饰的模式。
54.权利要求46-53任何一项的方法,其中转录激活翻译后组蛋白修饰和转录抑制组蛋白翻译后组蛋白修饰的组合表明所述细胞将变成肿瘤发生的风险增加。
55.权利要求54的方法,其中所述激活翻译后组蛋白修饰是在组蛋白3上赖氨酸4的甲基化、组蛋白3上赖氨酸9的乙酰化和组蛋白3上赖氨酸14的乙酰化中的一种,并且其中所述转录抑制翻译后组蛋白修饰是组蛋白3上赖氨酸9的甲基化、组蛋白3上赖氨酸27的甲基化和组蛋白4上赖氨酸20的甲基化中的一种。
56.权利要求54或55的方法,其中组蛋白3上赖氨酸4和27的甲基化表明所述细胞将变成肿瘤发生的风险增加。
57.权利要求46-49任何一项的方法,其中在评估细胞中DACT蛋白的量中,DACT蛋白降低的量表明所述细胞将变成肿瘤发生的风险增加。
58.在受试者中诊断发生赘生物的风险的方法,所述方法包括评估(i)细胞中DACT蛋白的量,(ii)细胞中DACT蛋白的活性,(iii)翻译后组蛋白修饰的模式中的一种。
59.权利要求58的方法,其中所述赘生物是肿瘤。
60.权利要求59的方法,其中所述肿瘤是黑素瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、甲状腺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、带形纤维瘤、维尔姆斯瘤、成神经管细胞瘤和毛基质细胞肿瘤中的一种。
61.权利要求58-60任何一项的方法,其中所述翻译后组蛋白修饰是组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化的至少一种。
62.权利要求58-61任何一项的方法,其中转录激活翻译后组蛋白修饰和转录抑制组蛋白翻译后组蛋白修饰的组合表明受试者中发生赘生物的风险。
63.权利要求62的方法,其中转录激活翻译后组蛋白修饰和转录抑制组蛋白翻译后组蛋白修饰的组合是组蛋白3上赖氨酸4和27的甲基化组合。
64.权利要求58-63任何一项的方法,其中在DACT蛋白的基因座处评估翻译后组蛋白修饰的模式。
65.预测赘生物是否对组蛋白脱乙酰酶抑制剂和通式(I)的化合物的组合敏感的方法
其中在通式(I)中,
A是CH或N,
R1、R4和R5相互独立地选自H和脂肪族、脂环族、芳香族、芳基脂肪族和芳基脂环族烃基,包含选自N、O、S和Si的0-3个杂原子,其中R4和R5可任选地连接以确定脂肪族烃基桥,
R2选自H和卤素,并且
R3是H,或包含1-8个主链碳原子和选自N、O、S、Si,和卤素的0-3个杂原子的脂肪族或芳基脂肪族烃基,
所述方法包括评估赘生物中(i)DACT蛋白的量,(ii)DACT蛋白的活性,(iii)翻译后组蛋白修饰模式中的一种,
其中(i)DACT蛋白的减少量,(ii)DACT蛋白的降低活性,(iii)和改变的翻译后组蛋白修饰中的一种表明所述赘生物对通式(I)的化合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合敏感。
66.权利要求65的方法,其中所述赘生物包含在哺乳动物中。
67.权利要求65或66的方法,其中所述赘生物是肿瘤。
68.权利要求67的方法,其中所述肿瘤是黑素瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、甲状腺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、带形纤维瘤、维尔姆斯瘤、成神经管细胞瘤和毛基质细胞肿瘤中的一种。
69.权利要求65-68任何一项的方法,其中所述改变的翻译后组蛋白修饰是组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化的至少一种。
70.权利要求65-69任何一项的方法,其中在DACT蛋白的基因座处评估组蛋白甲基化和/或组蛋白乙酰化的模式。
71.在细胞中增加DACT蛋白的绝对量的核酸分子和/或低分子量有机分子在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
72.权利要求71的用途,其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3的一种。
76.权利要求75的药物组合物,其中R6是氨基或醚基,所述氨基或醚基被包含选自N、O、S和Si的0-3个杂原子的脂肪族、脂环族、芳香族、芳基脂肪族和芳基脂环族基团之一取代。
78.权利要求77的用途,其中所述用途还包括使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
79.鉴定能够在细胞中防止、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的候选化合物的的方法,所述方法包括向能够表达DACT蛋白或其功能片段的细胞中引入化合物,并确定所述DACT蛋白的表达,其中所述DACT蛋白的增加的表达表明所述化合物能够在细胞中防止、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。
80.权利要求79的方法,其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一种。
81.鉴定能够在细胞中防止、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的候选化合物的方法,所述方法包括向表达DACT蛋白或其功能片段的细胞中引入化合物,并确定所述DACT蛋白的表达和/或活性,其中所述DACT蛋白的增加的表达和/或活性表明所述化合物能够在细胞中防止、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。
82.权利要求81的方法,其还包括:比较所得结果与对照测定的那些结果。
83.权利要求82的方法,其中所述对照测定包括使用不调节DACT蛋白的表达和/或活性的化合物。
84.权利要求81-83任何一项的方法,其中所述细胞是癌细胞。
85.权利要求81-84任何一项的方法,其中所述细胞来自结肠直肠组织、皮肤组织、乳腺组织、肺组织、膀胱组织和输卵管组织中的一种。
86.权利要求85的方法,其中所述细胞是细胞系的细胞。
87.权利要求81-86任何一项的方法,其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一种。
88.鉴定能够在细胞中防止、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的化合物的体外方法,所述方法包括将化合物、DACT蛋白或其功能片段与dishevelled蛋白接触,其中所述DACT蛋白与Dishevelled蛋白之间的复合体形成的增强表明所述化合物能够在细胞中防止、抑制、阻滞或逆转肿瘤发生和/或在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。
89.权利要求88的方法,其中所述dishevelled蛋白是Dvl1、Dvl2和Dvl3中的一种。
90.权利要求88或89的方法,其包括
(a)向试管中加入怀疑能够增强DACT蛋白或其功能片段与dishevelled蛋白之间的复合体形成的化合物,
(b)向所述试管中加入所述DACT蛋白或其功能片段,
(c)加入所述dishevelled蛋白,并
(d)检测所述复合体形成。
91.权利要求90的方法,其中通过合适的光谱、光化学、光度计、荧光计、放射学、酶学或热力学方法进行所述检测。
92.权利要求88-91任何一项的方法,其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一种。
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