WO2011152671A2 - 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2011152671A2
WO2011152671A2 PCT/KR2011/004049 KR2011004049W WO2011152671A2 WO 2011152671 A2 WO2011152671 A2 WO 2011152671A2 KR 2011004049 W KR2011004049 W KR 2011004049W WO 2011152671 A2 WO2011152671 A2 WO 2011152671A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inflammatory
ramalin
disease
pharmaceutical composition
formula
Prior art date
Application number
PCT/KR2011/004049
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011152671A3 (ko
WO2011152671A9 (ko
Inventor
임정한
김일찬
이성구
김덕규
한세종
이형석
김성진
김태경
강필성
박희용
박하주
표석능
Original Assignee
한국해양연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국해양연구원 filed Critical 한국해양연구원
Priority to EP11790029.0A priority Critical patent/EP2578214A4/en
Priority to JP2013513112A priority patent/JP2013534517A/ja
Priority to CN2011800328082A priority patent/CN103140222A/zh
Priority to US13/701,113 priority patent/US20130116324A1/en
Publication of WO2011152671A2 publication Critical patent/WO2011152671A2/ko
Publication of WO2011152671A3 publication Critical patent/WO2011152671A3/ko
Publication of WO2011152671A9 publication Critical patent/WO2011152671A9/ko
Priority to US14/261,551 priority patent/US9539227B2/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/45—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cycloheximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • the present invention relates to the use of ramalin, which is a new use for the treatment of inflammatory diseases or immune diseases. More particularly, the present invention relates to a composition containing ramalin having an anti-inflammatory activity or a salt thereof, and a pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory diseases or immune diseases, and a method for preventing or treating inflammatory diseases or immune diseases using the composition. .
  • Inflammatory reactions are biological defense reactions caused by various factors, such as infection by tissue or damage to tissues, and perform an initial protective action to limit the damage to only the infected or damaged area. In most cases, this inflammatory response leads to the elimination of pathogenic agents using intrinsic immune components and induction of specific adaptive immunity (Hawiger J., Innate Immunity and Inflammation: A Transcriptional Paradigm. Immunologic Research. 23, pp. 99-109, 2001). Rubs, tumors, fever, and pain, known as inflammation-associated features, are associated with the expansion of local blood flow due to the expansion of blood vessels by the action of inflammatory mediators and cytokines.
  • Acute inflammation is accompanied by a systemic reaction called an acute phase reaction.
  • chronic inflammation can be induced as a result of constant immune activation associated with some diseases such as infections and autoimmune diseases, and the accumulation and activation of macrophages is evidence of chronic inflammatory response (Huang AL, Vita JA). , Effects of Systemic Inflammation on Endothelium-Dependent Vasodilation.Trends , Cardiovasc.Med . 16, p. 1520, 2006).
  • persistent chronic inflammatory reactions can cause serious damage to host cells or tissues.
  • Inflammatory responses at the site of infection are initiated by the response of macrophages to pathogens.
  • Reactive reactive oxygen species and reactive nitrogen species e.g. NO
  • inflammatory mediators such as prostaglandins, leukotrienes, and the like
  • TNF- ⁇ , IL-6 and IL-8 Inflammatory cytokines are known to be involved in inflammatory reactions (Renauld JC, New insights into the role of cytokines in asthma. J. Clin. Pathol . 54, pp. 577-589, 2001; Blake GJ, Ridker PM , Tumour necrosis factor- ⁇ , inflammatory biomarkers, and atherogenesis.Eur . Heart J.
  • NF- ⁇ B a transcription factor of genes involved in the production of these inflammatory mediators.
  • Inflammatory genes such as inducible nitric oxide synthase (iNOS2), cyclooxygenase (COX-2), TNF- ⁇ , IL-6, and IL-8 are found in macrophages. It has been reported to be transcribed by ⁇ B.
  • Nitric oxide is produced from L-arginine by nitric oxide synthetase (NOS) in human macrophages (Kerwin, JF et al., J). Med. Chem ., 38: 4343, 1995).
  • the human NOS includes three types of endothelial constitutive NOS (hereinafter referred to as ecNOS), neuronal constitutive NOS (hereinafter referred to as ncNOS), and inducible NOS (hereinafter referred to as iNOS). Branch isomers exist.
  • ecNOS and ncNOS are expressed in endothelial and neuroendocrine cells, respectively, and are dependent on calcium and calmodulin
  • iNOS is lipopolysaccharide (LPS), which is a cell membrane component of pathogens.
  • LPS lipopolysaccharide
  • a large amount is expressed in various cells only when cells are activated by cytokines such as -1, cytokines such as TNF- ⁇ , and radiation, and are independent of calcium and calmodulin.
  • NO protects against tumor cells and pathogens at high concentrations, and low concentrations of NO produced by vascular endothelial cells control blood pressure, and NO produced by neurons affects neurotransmitters, learning and memory. Perform various related physiological reactions.
  • Non-inducible constitutive NOS plays an important role in maintaining the homeostasis of the human body.
  • NO produced by ecNOS acts on the vascular system to inhibit vasodilation, platelet adhesion or aggregation, and NO produced by ncNOS It acts on the nervous system to increase long-term memory, which is important for memory, or to cause depression as a neurotransmitter, as well as to the motility of the digestive system and the erection of the penis.
  • NO produced by iNOS expression induced by specific cytokines or LPS acts on inflammation and host defense mechanisms.
  • stimulation of endotoxin activates the transcription factor NF- ⁇ B in macrophage and induces iNOS expression, thereby increasing NO production (Butler, AR, Chemistry & Industry, 16: 828, 1995).
  • iNOS expression is induced by external stimuli such as LPS, proinflammatory factors, and irradiation, a large amount of NO is continuously produced for 4-6 hours, which is known to cause an inflammatory response in the human body.
  • mice In addition, in mice, a large amount of iNOS mRNA and protein are expressed in macrophages by external stimulation of LPS, and the synthesized NO performs microbial bactericidal and antitumor effects. However, excessive production of excess NO is known to cause inflammatory diseases such as arthritis, sepsis and tissue transplant rejection reactions, autoimmune diseases such as diabetes and neuronal cell death.
  • an iNOS activity inhibitor is highly likely to be developed as a therapeutic agent for such diseases, and in this respect, a compound that inhibits NO production by iNOS can be used as a therapeutic agent for various inflammatory diseases in the human body.
  • Research into substances that inhibit the production of NO has been mainly focused on the development of substances that specifically inhibit the enzymatic activity of iNOS, derivatives of L-arginine, precursors of L-citrulline, Development studies of amino guanidine derivatives and isothiourea derivatives are being conducted (Babu, BRB and Griffith OW, Current Opinionin Chemical Biology , 2: 491, 1998).
  • Lichens are similar to non-flowering plants and are a symbiotic association of mycobiant and alga (photobiant) and / or cyanobacteria.
  • fungi form mossized substrates containing fronds or typical secondary metabolites (Ahmadjin V., The lichen symbiosis, Wiley, New York, pp. 1-6 , 1993).
  • Lichens are less well studied than higher plants because it is difficult to collect sufficient natural samples, and mass cultivation techniques are not known.
  • Ramalina terebrata is a native lichen that colonizes King George Island in Antarctica and can be easily collected from various parts of King George Island.
  • the present inventors have isolated a novel compound called Ramalin (Ramalin) having excellent antioxidant activity while studying the Antarctic lichen Ramalina terebrata (KR Application No. 2008-111021).
  • Ramalin having anti-inflammatory activity.
  • the present inventors conducted comparative experiments in vitro and in vivo to investigate the effect of Ramalin (Lamalin) on LPS-induced NO production in mouse macrophage RAW264.7 and examined the cell immune suppression activity. It was the first time that marlin had the effect of suppressing the inflammatory response. More specifically, the RAMALINTM of the present invention inhibits mRNA expression of iNOS significantly inhibits NO production, inhibits NF- ⁇ B activation, inhibits p38 MAPK, ERK1 / 2 and JNK signaling pathways, In addition, the expression of LLR receptor TLR4 was also suppressed. In addition, in vivo experiments confirmed that it showed excellent anti-inflammatory and immunomodulatory effects, and the present invention was completed.
  • Ramalin Ramalin
  • An object of the present invention is to provide a novel use of Ramalin (Ramalin) having anti-inflammatory and immunomodulatory activity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of inflammatory diseases or immunological diseases containing Ramalin (Ramalin) having a structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Ramalin Rostin
  • the RAMALIN (Ramalin) may be characterized by inhibiting the overproduction of nitric oxide (NO) by inhibiting the expression of the iNOS gene.
  • the inflammatory disease or immune disease is atopic dermatitis, arthritis, urethritis, cystitis, arteriosclerosis, allergic diseases, rhinitis, asthma, acute pain, chronic pain, periodontitis, gingivitis, inflammatory bowel disease, gout, myocardial infarction, Congestive heart failure, hypertension, angina pectoris, gastric ulcer, cerebral infarction, Down syndrome, multiple sclerosis, obesity, diabetes, dementia, depression, schizophrenia, tuberculosis, sleep disorders, sepsis, burns, pancreatitis, Parkinson's disease, stroke, stroke Or an autoimmune disease.
  • the composition may be characterized in that it further comprises a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the composition may be characterized in that it is formulated or used in combination with one or more drugs selected from the group consisting of antihistamines, anti-inflammatory drugs, anticancer agents and antibiotics.
  • the present invention provides a use for the prophylaxis or treatment of inflammatory or immunological diseases of Ramalin (Ramalin) having a structure of formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory disease or an immune disease using Ramalin having a structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a method of preventing or treating an inflammatory disease or an immune disease, which comprises the step of treating (administering) Ramalin having a structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • the present invention also provides a functional food and functional cosmetics for preventing or ameliorating an immune disease or an inflammatory disease containing a RAMALIN having the structure of Formula 1 as an active ingredient.
  • Figure 1 shows the result of measuring the amount of nitrite (nitrite) in the medium for 24 hours after LPS treatment.
  • Figure 2 shows the results obtained by RT-PCR analysis of the expression level of GAPDH mRNA as iNOS mRNA and control.
  • Figure 3 is the result of Western blot analysis of the amount of beta actin ( ⁇ -actin) protein as the amount of iNOS protein and the control group.
  • Figure 5 shows the results obtained by RT-PCR analysis of TLR4 mRNA and GAPDH mRNA expression as a control.
  • FIG. 6 shows the results of Western blot analysis of the amount of TLR4 protein and the amount of beta actin ( ⁇ -actin) protein as a control.
  • FIG. 7 shows RAW 264.7 cells transformed with pGL3-NF- ⁇ B-Luc reporter plasmid and pCMV- ⁇ -gal, followed by LPS treatment (4 hours), followed by measurement of relative luciferase values.
  • FIG. 10 shows the effects of ramalin on p-p38, p-JNK, and p-ERK activation in LPS-stimulated macrophages. After treatment, total cell lysates are analyzed by Western blot.
  • FIG. 11 shows the results of paw edema size in rats induced by carrageenan (or carrageenan), compared to a control group treated with an excipient and a ramalin compared with a positive control group treated with indomethacin (SigmaI-7378).
  • the administration group (100mg / kg) shows an anti-inflammatory effect of about 50% after 6 hours.
  • the present invention relates to a novel use of the compound ramaline having the structure of Formula 1:
  • Ramalin of the present invention is a compound having antioxidant activity isolated from the Antarctic lichen, Ramalina terebrata, The ramalin is confirmed by using a high-resolution ES-MS, molecular weight is 254.1141, the molecular formula C 11 H 16 N 3 O It was confirmed that the compound of Formula 4 has the structure of Formula 1, it was named as ramalline because it is a compound separated from ramalina terebrata.
  • iNOS nitric oxide oxidase
  • iNOS nitric oxide oxidase
  • phosphorylation of NF- ⁇ B, an inflammatory mediator, inhibition of p38 MAPK, ERK1 / 2 and JNK signaling pathways, and expression of LLR receptor TLR4 were also inhibited. The confirmation results are described in detail in Examples below.
  • the present invention provides a use for the prophylaxis or treatment of inflammatory or immunological diseases of Ramalin (Ramalin) having a structure of formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of inflammatory diseases or immune diseases, which contains Ramalin having a structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Eggplant provides a method of preventing or treating an inflammatory disease or an immune disease using Ramalin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a method of preventing or treating an inflammatory disease or an immune disease the method comprising administering (administering) to a subject Ramalin having a structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the treatment or administration can be performed in vivo or in vitro .
  • the inflammatory disease or immune disease is atopic dermatitis, arthritis, urethritis, cystitis, arteriosclerosis, allergic disease, rhinitis, asthma, acute pain, chronic pain, periodontitis, gingivitis, inflammatory bowel disease, gout, myocardial infarction , Congestive heart failure, hypertension, angina pectoris, gastric ulcer, cerebral infarction, Down syndrome, multiple sclerosis, obesity, diabetes, dementia, depression, schizophrenia, tuberculosis, sleep disorders, sepsis, burns, pancreatitis, Parkinson's disease, stroke, brain by seizures Impaired or autoimmune disease.
  • inflammatory disease used in the present invention is a disease caused by an inflammatory response derived from an external substance or an internal substance, and typically includes neuroinflammatory disease, arthritis, and the like.
  • immune disease refers to a disease caused by excessive reaction of the immune system in the human body, and typically includes an allergic disease.
  • inflammatory diseases and immune diseases can be used as terms that refer to similar ranges in large terms, and thus are not used as distinct terms in this specification. I will use it.
  • Routes of administration of the pharmaceutical compositions according to the invention are not limited to these, but are oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes pia, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • compositions of the present invention may be administered orally in any orally acceptable dosage form including, but not limited to, capsules, tablets, and aqueous suspensions and solutions.
  • commonly used carriers include lactose and corn starch.
  • Lubricants such as magnesium stearate are also typically added.
  • Useful diluents for oral administration in capsule form include lactose and dried corn starch.
  • the active ingredient is combined with emulsifiers and suspending agents when the aqueous suspension is administered orally. If desired, sweetening and / or flavoring and / or coloring agents may be added.
  • compositions of the present invention vary depending on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed. Can be changed.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the pharmaceutical composition may be formulated or used in combination with one or more agents selected from the group consisting of antihistamines, anti-inflammatory drugs, anticancer agents and antibiotics.
  • the present invention is an inflammatory disease for administering a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases or immunological diseases containing Ramalin (Ramalin) having a structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Or it relates to a method for preventing or treating immune diseases.
  • Ramalin Ramalin
  • the pharmaceutical composition and the method for preventing or treating the present invention are excellent in anti-inflammatory activity, and because they are made of ramalin, which is a compound derived from a natural product without toxicity and side effects, it can be usefully used.
  • the present invention relates to a functional food for preventing or ameliorating an immune disease or an inflammatory disease, which contains a RAMALIN having the structure of Formula 1 as an active ingredient.
  • Functional food of the present invention can be used in various ways, such as drugs for preventing inflammation, food and beverages.
  • the functional food of the present invention includes various foods, candy, chocolate, beverages, gums, teas, vitamin complexes, dietary supplements, and the like, and can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules or beverages.
  • Immune or inflammatory diseases of the present invention are atopic dermatitis, arthritis, urethritis, cystitis, arteriosclerosis, allergic diseases, rhinitis, asthma, acute pain, chronic pain, periodontitis, gingivitis, inflammatory bowel disease, gout, myocardial infarction, congestive heart failure , Hypertension, angina pectoris, gastric ulcer, cerebral infarction, Down syndrome, multiple sclerosis, obesity, diabetes, dementia, depression, schizophrenia, tuberculosis, sleep disorders, sepsis, burns, pancreatitis, Parkinson's disease, stroke, brain damage due to seizures or autoimmunity Disease.
  • the present invention relates to a functional cosmetic containing a RAMALIN having the structure of Formula 1 as an active ingredient.
  • the functional cosmetics of the present invention can be prepared in the form of general emulsion formulations and solubilization formulations.
  • Cosmetics of the emulsified formulations include nutrient cosmetics, creams, essences, etc., and cosmetics of the solubilized formulations are flexible lotion.
  • Formulations of suitable cosmetics of the present invention include, for example, emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes) obtained by dispersing an oil phase in solutions, gels, solids, anhydrous products, water phases, for example.
  • ionic vesicle dispersants creams, skins, lotions, powders, ointments, sprays or concealed sticks. It may also be prepared in the form of an aerosol composition which further contains the foam's presence or compressed propellant.
  • Cosmetics of the present invention may further comprise fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, blowing agents, fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers And adjuvant such as chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, pigments, dyes, hydrophilic or lipophilic actives, lipid vesicles or any other ingredients commonly used in cosmetics. And the above ingredients may be introduced in amounts generally used in the field of dermatology.
  • Functional cosmetics of the present invention is particularly excellent in anti-inflammatory effects can be usefully used as a functional cosmetics to alleviate the symptoms of inflammation caused by atopic dermatitis or burn disease, which is an inflammatory disease of the skin mainly used cosmetics.
  • the solvent system used was 10 minutes for a 0% methanol-water mixed solution for water mixed with 0.1% formic acid, 20 minutes for a 20% methanol-water mixed solution and 30 minutes for a 100% methanol solution.
  • the flow rate was 2 mL / min.
  • the compound was absorbed at 280 nm ultraviolet.
  • the mouse macrophage line RAQ 264.7 (ATCC, Rockville, MD, US) was verified.
  • Cells were cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY, US) with 2 ⁇ m L-glutamine, 100 ⁇ l IU / ml penicillin, 100 ⁇ l / ml streptomycin, and 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS: Carlsband, US).
  • FBS Carlsband, US
  • the culture was incubated at 37 °C, 5% CO2, humid air conditions, medium was changed twice a week.
  • Macrophages were cultured at 1 x 10 5 cells / well in 96-well tissue culture dishes and treated with ramalin for 2 hours to test for cytotoxicity.
  • Cell viability was measured by MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) quantitative colorimeter analysis, which showed the mitochondrial activity of living cells.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the amount of MTT reduced to formazan was analyzed by optical density at 550 nm using a Molec ⁇ lar Device microplate reader (Sunnyvale, CA, US).
  • the amount of nitrogen dioxide accumulated in the medium was separated from each well by 100 ⁇ l of supernatant and placed in an empty well dish, followed by 100 ⁇ l of grease solution (0.1% naphthylethylene diamine dihydrochloride in distilled water and 5 1: 1 mixture of 1% sulfanilamide dissolved in% H 3 PO 4 ) was added, and then absorbance was measured at 550 nm using a Molecular Device microplate reader (Sunnyvale, CA, US). Nitrogen dioxide concentration can be calculated from the nitrite (NaNO 2 ) standard curve. Nitrogen dioxide levels can be an indicator of the amount of nitric oxide (NO).
  • RNA production was determined by RT-PCR, and protein production was analyzed by Western blot analysis. This is because the reduction in NO production is due to the inhibition of iNOS production.
  • RT-PCR was treated with LDS and ramalin as in Example 2, and then all RNAs of the cultured cells were collected using Trizol (Introvigen, US). Then, all RNAs were amplified by performing Superscript one step RT-PCR using PLATINUM Taq kit (Introvigen, US). PCR results were stained with EtBr on a 1.2% agarose gel. GAPDH was examined as a control.
  • the sequence of the primer used for PCR is as follows.
  • iNOS-F is 5'-AGA CTG GAT TTG GCT GGT CCC TCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • iNOS-R is 5'-AGA ACT GAG GGT ACA TGC TGG AGC-3' (SEQ ID NO: 2)
  • GAPDH- F was 5'-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • GAPDH-R was the same as 5'-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3' (SEQ ID NO: 4).
  • Western blot was treated with LDS and Ramalin as in Example 2, washed twice with PBS (Phosphate Buffered Saline) and lysed (lysis buffer) (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1%).
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • lysis buffer 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1%).
  • TLR4 (Toll-like Receptor 4) signaling has been found to play a pivotal role in the induction of inflammatory responses. Since LPS is a ligand recognized by TLR4, surface expression has been shown to analyze the effects of lamline pretreatment on TLR4 expression. The extent, mRNA amount and protein amount were measured. TLR4 test method is as follows.
  • Macrophage cell line Raw264.7 was passaged and diluted to a concentration of 1 ⁇ 4 x 10 4 cells / well, and then cultured in 96 well plates. After 12 hours of incubation, the RAMALIN is treated at various concentrations of 0.1, 1, 10 ⁇ g / mL, and then incubated for 2 hours. The supernatant of the cultured cells is removed, washed with d-PBS and treated with LPS (1 ⁇ g / mL). After 8 hours, TLR4 expressed on the cell surface was measured using the ELISA method. Remove the cell culture supernatant, wash twice with d-PBS, and add 200 mL of blocking buffer (1% bovine serum FBS to in d-PBS) for 30 minutes at room temperature.
  • blocking buffer 1% bovine serum FBS to in d-PBS
  • the primary antibody TLR4 was diluted 1: 500 in blocking buffer and added to 100 ⁇ L and left at room temperature for 2 hours. After washing with washing buffer five times, diluted 1: 1000-fold alkaline phosphatase-conjugated anti-rat secondary antibody in blocking buffer, added 100 ⁇ L each, left for 1 hour at room temperature and washing buffer Washed 7 times. 100 ⁇ L of a peroxidase substrate was added to light shield and incubated at room temperature for 30 minutes. Absorbance was measured at 650 nm using a microplate reader.
  • Luciferase assay is an experiment to check whether the promoter is activated. We used the principle of ligation of the promoter of a specific gene into a vector containing Luciferase and emitting light when the promoter was activated.
  • the supernatant was removed from the cultured cells and washed with d-PBS, followed by 200 ⁇ l of 1 ⁇ lysis buffer (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminocyclohexane-N, N, N, N 'tetracetic acid, 10% glycerol, 1% triton X-100, 1.25 mg / mL lysozyme, 2.5 mg / mL BSA) were added and stirred at room temperature to lyse the cells.
  • Bright-Glo luciferase assay system was used to measure the luciferase activity of cell lysate, and luciferase activity was measured according to the method provided by the supplier.
  • I ⁇ B ⁇ is an NF- ⁇ B inhibitor that normally binds to NF- ⁇ B and inhibits its activity. Since LPS or IFN-gamma promotes the separation of I ⁇ B ⁇ , it is known that NF- ⁇ B is activated. The amount of protein was determined.
  • Luciferase amount was determined by transfection and reporter analysis. Specifically, RAW 264.7 cells (5 ⁇ 10 5 cells / ml) were plated in 6-well dishes and transfected with pGL3-NF- ⁇ B and pCMV-beta-gal plasmids using LipofectAMINE Plus (Sigma). Transfection was performed by mixing 0.5 ⁇ g pGL3-NF- ⁇ B and 0.2 ⁇ g pCMV-beta-gal with LipofectAMINE Plus solution into the cells, pretreatment with ramalin for 4 hours, and LDS treatment after 2 hours.
  • luciferase activity assay was performed using 10 ⁇ l of cell lysate. Was performed. Three experiments were performed on the luciferase and beta galactosidase at least three times, and the luciferase amount was normalized by the amount of beta galactosidase.
  • p65 and I ⁇ B ⁇ proteins were analyzed by Western blot analysis used in Example 3.
  • FIG 8 when pretreated with ramalline, macrophages produced significantly less p65 NF- ⁇ B compared with the pretreatment.
  • Figure 9 when the pre-treatment of ramalin to macrophages, I ⁇ B ⁇ was not decomposed and still combined with NF- ⁇ B compared to the non-pretreatment showed less amount.
  • ramalin inhibits the activation of NF- ⁇ B by blocking the intermediate inflammatory response induced by LPS or IFN-gamma.
  • the protein amounts of p38, ERK and JNK were the same regardless of the RAMAL pretreatment, but the protein amounts of the p-p38, p-ERK and p-JNK, respectively, phosphorylated forms were pretreated.
  • the RAMALIN inhibits the phosphorylation of each protein and consequently inhibits the inflammatory response.
  • Example 2-6 the effect of the treatment of ramalin in vitro was analyzed.
  • Example 7 it was tested whether the ramalin actually had an anti-inflammatory effect using a live mouse. Therefore, excipients (control), ramalin 50mg / kg, ramalin 100mg / kg, and indomethacin (anti-inflammatory, positive control) were administered, and then carcininan, which is a type of IDS, caused an inflammatory response, resulting in anti-inflammatory effects. Measured via edema size increase rate.
  • Pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of inflammatory diseases or immune diseases containing as a active ingredient Ramalin (Ramalin) having a structure of formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • Carrageenan used in the experiment was CAS number: 9000-07-1, EC number 232-524-2, manufacturer (product number) sigma (C-1867), and in particular, a mixture of kappa and lambda carrageenan Used. It is used as a thickener, gelling agent, stabilizer, etc. as a food additive to increase the adhesiveness and viscosity of foods, to improve emulsion stability, and to improve the physical properties and feel of foods.
  • Carrageenan is obtained by extracting seaweeds of the red algae, Chondrus, Eucheuma, Gigartina, Hypnea, and Iridaea, which are called Irish moss, with hot water or hot alkaline aqueous solution and then purifying them.
  • the main components are i (Iota) -carrageenan, k ( Kappa) -carrageenan, l (Lambda) -carrageenan.
  • l (Lambda) -carrageenan (about 1-2%) is used as a substance that causes edema in animal experiments related to inflammation.
  • mice used in the experiment were male Sprague-Dawley rats, 150-200 g, 6 weeks old, and were purchased from Daehan Bio Co., Ltd., Korea. In the laboratory, the animals were cared for according to the specified guidelines for proper treatment and use of laboratory animals by national sanitation agencies.
  • Carrageenan used a mixture of kappa and lambda carrageenan and was purchased from Sigma, USA, along with Indomethacin.
  • Ramalin was mixed with 500 ⁇ l saline (50 mg / kg, 100 mg / kg), excipient was used with saline, and indomethacin (500 ⁇ l saline) at a concentration of 10 mg / kg for each rat.
  • 500 ⁇ l saline 50 mg / kg, 100 mg / kg
  • indomethacin 500 ⁇ l saline
  • 100 ⁇ l of carrageenan 1% saline solution was injected subcutaneously into carrageenan in the hind paw of the rat, and the thickness of the foot was measured for 6 hours, and the result of observing the size steam ratio of edema is shown in FIG. 11. Three measurements at each time point were used to average the values.
  • the anti-inflammatory effect was high at a high concentration of ramalin 100 mg / kg, and there was a significant difference in the size of the edema with the control group administered with the excipient. Therefore, it was confirmed that the inflammatory response was significantly reduced during the RAMALIN pretreatment.
  • the pharmaceutical composition containing the RAMALIN according to the present invention shows an effect of inhibiting the production of nitric oxide (NO) due to the superior suppression of iNOS production compared to the conventional pharmaceutical composition to inhibit excessive inflammatory reactions and immune responses, thereby inhibiting inflammatory diseases or immunity. It is effective in treating diseases, and can be used for functional foods and functional cosmetics.
  • NO nitric oxide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 남극 지의류인 Ramalina terebrata로부터 분리한 라말린의 신규한 용도인 항염증 활성에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 라말린을 유효성분으로 함유하는 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명의 라말린은 천연물 유래의 물질로 독성 및 부작용이 없으며, iNOS(산화질소생성효소)의 발현을 전사단계에서 억제하여 염증 반응의 핵심 매개물질인 NO(산화질소)의 생성을 현저히 억제하고, 염증매개전구물질인 NF-κB의 활성화를 억제하고, p38 MAPK, ERK1/2 및 JNK 신호전달 경로를 억제하고, LPS 수용체인 TLR4의 발현도 억제한 결과 나타나는 탁월한 항염증 효과를 가지므로, 이를 함유하는 조성물은 염증질환 또는 면역질환들을 근본적으로 치료하고 예방할 뿐만 아니라 증상을 완화 및 개선시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 라말린의 새로운 용도인 염증 질환 또는 면역 질환 치료용 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 항염증 활성을 갖는 라말린 또는 그의 염을 함유하는 조성물로, 염증질환 또는 면역질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 상기 조성물을 이용한 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
염증반응은 병원체에 의한 감염이나 조직의 손상과 같은 다양한 요인에 의해 일어나는 생체방어반응으로, 감염부위나 손상부위에만 피해를 국한시키기 위한 초기 보호작용을 수행한다. 대부분의 경우, 이러한 염증반응은 내재면역의 구성 요소를 이용한 병원성 요인의 제거 및 특이적 적응면역의 유도 등으로 이어진다 (Hawiger J., Innate Immunity and Inflammation: A Transcriptional Paradigm. Immunologic Research. 23, pp.99-109, 2001). 염증에 수반되는 특징으로 알려진 발적 (rubor), 부종 (tumor), 열 (calor), 통증 (dolor) 등은 염증부위에서의 염증 매개체와 사이토카인 등의 작용에 의한 혈관의 확장에 따른 국소혈류의 증가 및 국소혈류속도의 감소, 혈관의 투과성증가에 따른 혈장성분의 혈관 외 유출 증가, 혈관내피세포의 순환면역세포에 대한 부착성 증가에 따른 면역세포의 혈관 외 유출 증가 및 화학주성에 의한 감염부위로의 이동 증가와 같은 연속적인 면역반응들의 결과이다 (Gallo RL, Murakami M, Takaaki O, Zaiou M., Biology and clinical relevance of naturally occurring antimicrobial peptides. J. Allergy. Clin. Immunol. 110, pp.823-831. 2002; Graeme B. Ryan, MB, and Guido M., Acute Inflammation. American Journal of Pathology. 86(1), pp.185-274, 1977). 조직손상에 대한 반응으로서 일부 세포들에서 생성되는 히스타민, 그리고 혈액 내에서 비활성화 상태로 존재하다가 조직손상에 의해 활성화되는 저분자 펩티드성 키닌도 염증관련 혈관확장과 혈관의 투과성 증가에 기여한다 (Yamaki K, Thorlacius H, Xie X, Lindbom L, Hedqvist P, Raud J., Characteristics of histamineinduced leukocyte rolling in the undisturbed microcirculation of the rat mesentry. British J.Pharmacol. 123, pp.390-399, 1998; Brocklehurst WE, Role of Kinins and Prostaglandins in Inflammation. Proc. Roy. Soc. Med. 64, pp.4-6, 1971).
일반적으로 급성염증반응은 빠르게 진행되고 짧은 기간 유지되며, 급성염증에는 급성기 반응이라는 전신성 반응이 동반된다. 한편 감염이나 자가면역질환과 같은 일부 질환과 관련하여 지속적인 면역활성화의 결과로 만성염증이 유발될 수 있으며, 대식세포 (macrophages)의 축적과 활성화는 만성염증반응의 증거가 된다 (Huang AL, Vita JA, Effects of Systemic Inflammation on Endothelium-Dependent Vasodilation. Trends, Cardiovasc. Med. 16, p.1520, 2006). 그러나 지속적인 만성염증반응의 경우, 숙주세포나 조직에 심각한 손상을 유발할 수 있다.
감염부위에서의 염증반응은 병원체에 대한 대식세포의 반응에 의해 개시된다. 병원체에 의해 활성화된 대식세포가 생성하는 반응성 활성산소종 및 활성질소종(예를 들어 NO), 프로스타글란딘, 루코트리엔 등과 같은 염증매개체, 그리고 TNF-α, IL-6 및 IL-8 등과 같은 염증유발성 사이토카인 등이 염증반응에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Renauld JC, New insights into the role of cytokines in asthma. J. Clin. Pathol. 54, pp.577-589, 2001; Blake GJ, Ridker PM, Tumour necrosis factor-α, inflammatory biomarkers, and atherogenesis. Eur. Heart J. 23, pp.345347, 2002). 이러한 염증매개체들의 생성에 관련된 유전자들의 전사인자인 NF-κB의 활성화가 대식세포의 염증관련 작용에 매우 중요하다. 대식세포 내에서 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS2), 시클로옥시게나제 (cyclooxygenase, COX-2), TNF-α, IL-6, IL-8 등의 염증관련 유전자들이 NF-κB에 의해 전사되는 것으로 보고되었다.
산화질소(NO)는 인체의 대식세포(macrophage)에서 산화질소 합성효소(nitric oxide synthetase, 이하 NOS라 칭한다)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성된다 (Kerwin, J.F. et al., J. Med. Chem., 38:4343, 1995). 인체의 NOS에는 내피세포 구성형 NOS (endothelial constitutive NOS, 이하 ecNOS라 칭한다), 신경세포 구성형 NOS (neuronal constitutive NOS, 이하 ncNOS라 칭한다) 및 유도성 NOS(inducible NOS, 이하 iNOS라 칭한다)의 3가지 이성체가 존재한다. 이중 ecNOS와 ncNOS는 각각 내피세포와 신경외피세포에서 발현되며, 칼슘 및 칼모듈린 (calmodulin)에 의존적인 반면, iNOS는 병원균의 세포막 성분인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, 이하 LPS라 칭한다), IL-1, TNF-α와 같은 사이토카인 (cytokine), 방사선 등의 면역 자극제에 의해 세포가 활성화될 때에만 여러 세포에서 많은 양이 발현되며 칼슘 및 칼모듈린에 비의존적이다. NO는 높은 농도에서는 종양세포와 병원균에 대해서 방어기능을 하며, 혈관내피세포에서 생성된 낮은 농도의 NO는 혈압조절작용을, 신경세포에서 생성되는 NO는 신경전달물질(neurotransmitter), 학습, 기억 등에 관련된 다양한 생리반응을 수행한다. 유도형이 아닌 구성형 NOS (cNOS)는 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데, ecNOS에 의해 생성된 NO는 혈관계에 작용하여 혈관확장, 혈소판 부착이나 응집을 억제시키며, ncNOS에 의해 생성된 NO는 신경계에 작용하여 기억능력에 중요한 장기 기억능력을 상승시키거나 신경전달물질로서 우울증을 일으킬 뿐만 아니라, 소화기관의 운동성이나 음경의 발기에도 관여한다.
반면에, 특정 사이토카인이나 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현에 의해 생성되는 NO는 염증발현이나 숙주방어기전 등에 작용한다. 또한, 균체내독소 (endotoxin)의 자극에 의해 대식세포 (macrophage)에서 전사인자 NF-κB가 활성화 되어 iNOS 발현이 유도되고, 이로부터 NO의 생성이 증가되기도 한다 (Butler, A.R., Chemistry ＆ Industry, 16:828, 1995). LPS, 염증유발인자, 방사선조사 등의 외부 자극에 의해 iNOS의 발현이 유도되면 많은 양의 NO가 4~6 시간 동안 계속적으로 생성되고, 이는 인체에 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 쥐의 경우 LPS의 외부 자극에 의해 대식세포에서 많은 양의 iNOS mRNA와 단백질이 발현되고 여기서 합성된 NO는 미생물 살균 작용과 항종양 작용을 수행한다. 그러나, 필요 이상의 과다한 NO의 생성은 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식거부반응, 자가면역질환 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 야기시키는 것으로 알려져 있다.
따라서, iNOS 활성 억제제의 개발은 이러한 질병치료제로서의 개발가능성이 높으며, 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 이용될 수 있다. NO의 생산을 억제하는 물질의 연구는 주로 iNOS의 효소활성을 특이적으로 저해하는 물질의 개발에 집중되어 연구되었는데, 전구체인 L-아르기닌 (arginine)의 유도체, L-시트룰린 (citrulline)의 유도체, 아미노구아니딘 (amino guanidine) 유도체, 이소티오우레아 (isothiourea) 유도체 등의 개발연구가 진행되고 있다 (Babu, B.R.B. and Griffith O.W., Current Opinionin Chemical Biology, 2:491, 1998).
그러나 염증반응에 있어서 iNOS의 전사단계에서의 발현조절은 NO의 생성정도를 결정하는데 있어서 대단히 중요하므로, 대식세포 내의 전사인자 NF-κB의 저해제인 IkB의 인산화에 의한 NF-κB의 활성 조절과 관련한 약품 또는 NF-κB의 활성 조절과 관련된 Akt 신호전달, ERK, c-jun- 및 p38-MAPK 신호전달 경로와 관련한 약제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
지의류는 비개화식물과 비슷하며, 곰팡이(mycobiant) 및 조류(alga, photobiant) 및/또는 시아노박테리아의 공생연합이다. 지의류에서, 곰팡이는 엽상체 또는 전형적인 이차대사산물을 함유하고 있는 이끼화된 기질을 형성한다(Ahmadjin V., The lichen symbiosis, Wiley, New York, pp.1-6, 1993). 지의류는 충분한 양의 천연샘플을 수집하기가 어렵고, 대량재배 기술이 알려져 있지 않기 때문에, 고등식물보다는 연구가 미진하였다. 지의류의 조직배양법, 대량생산 방법 및 생화학적 분석 방법 등이 개선됨에 따라, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Behera, B.C. et al., Lebensm. Wiss. Technol., 39:805, 2006). 세포독성, 살곰팡이, 항미생물, 항산화 등의 여러 생물학적 활성을 가지는 지방산, depside 및 depsidones, 디벤조푸란 (debenzofurans), diterpenes, 안트라퀴논 (anthraquinones), 나프토퀴논 (naphtoquinones), 우스닉산 (usninic acid), 풀비닉 산 (pμlvinic acids), 잔톤 (xanthones) 및 에피디티오피퍼라진이온 (epidithiopiperazinediones)을 포함하는 화합물들이 지의류로부터 분리된 바 있다(Mμller, K., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:9-16, 2001).
라말리나 테레브라타 (Ramalina terebrata)는 남극대륙 킹조지섬에 군락을 이루어 자생하는 지의류로서, 킹조지섬의 곳곳에서 용이하게 채취할 수 있다. 본 발명자들은 상기 남극 지의류 Ramalina terebrata를 연구하던 중에 우수한 항산화 활성을 가진 라말린(Ramalin)이라는 신규 화합물을 분리한 바 있다(KR 출원번호 2008-111021호). 그러나, 라말린(Ramalin)이 항염증 활성이 있음을 보고한 예는 없다.
이에 본 발명자들은 마우스 대식세포 RAW264.7를 대상으로 LPS 유도 NO생산에 미치는 라말린(Ramalin)의 효과를 알기 위해 in vitro와 in vivo에서 비교실험을 수행하여 세포면역 억제활성을 검토한 결과, 라말린이 염증반응을 억제하는 효과가 있음을 최초로 확인하였다. 보다 상세하게는 본 발명의 라말린이 iNOS의 mRNA 발현을 억제하여 NO의 생성을 유의적으로 억제하고, NF-κB 활성화를 억제하며, p38 MAPK, ERK1/2 및 JNK 신호전달 경로를 억제하고, LPS 수용체인 TLR4의 발현도 억제하였으며, 아울러 in vivo 실험 결과, 우수한 항염증 및 면역조절 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 항염증 및 면역조절 활성을 갖는 라말린(Ramalin)의 신규용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린 (Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
화학식 1
Figure PCTKR2011004049-appb-I000001
본 발명에 있어서, 상기 라말린(Ramalin)은 iNOS 유전자의 발현을 저해하여 산화질소 (nitric oxide, NO)의 과잉생성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환 또는 면역질환은 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상, 췌장염, 파킨슨병, 뇌졸중, 발작에 의한 뇌손상 또는 자가면역질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린 (Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린 (Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 이용하여 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린 (Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 대상에 처리(투여)하는 단계를 포함하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 화학식 1의 구조를 가지는 라말린을 유효성분으로 함유하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 및 기능성 화장품을 제공한다.
도 1은 LPS 처리 후, 24시간 동안 배지에 있는 아질산염(nitrite)의 양을 측정한 결과이다.
도 2는 iNOS mRNA과 대조군으로 GAPDH mRNA 발현량을 RT-PCR 분석으로 알아본 결과이다.
도 3은 iNOS 단백질의 양과 대조군으로 베타액틴 (β-actin) 단백질의 양을 웨스턴 블롯(Western blot) 분석으로 알아본 결과이다.
도 4는 LPS 처리 후, 24시간 동안 표면 발현되는 TLR4의 양을 측정한 결과이다.
도 5는 TLR4 mRNA과 대조군으로 GAPDH mRNA 발현량을 RT-PCR 분석으로 알아본 결과이다.
도 6은 TLR4 단백질의 양과 대조군으로 베타액틴 (β-actin) 단백질의 양을 웨스턴 블롯(Western blot) 분석으로 알아본 결과이다.
도 7은 RAW 264.7 세포들을 pGL3-NF-κB-Luc reporter plasmid와 pCMV-β-gal로 형질 전환시킨 후, 이를 LPS 처리(4시간) 한 다음 상대적인 루시페라아제 값을 측정한 결과이다.
도 8은 NF-κB의 translocation을 분석하기 위해 p65 핵단백질의 양을 측정한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 9는 라말린 10ug/ml를 2시간 동안 전처리 하거나, 하지 않고 LPS ug/ml를 표시된 시간만큼 처리한 후 안티 IκBα 항체로 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 10은 LPS 자극 받은 대식세포 (macrophages)에서 p-p38, p-JNK, p-ERK 활성화에 대한 라말린의 효과를 나타내는 결과로, 한 시간동안 라말린을 전처리한 후, LPS를 20분 동안 처리한 후, 전체 세포 용해물을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 11은 카라기난(또는 캐라지난; carrageenan)에 의해 유도된 쥐의 발 부종 크기 결과로, 부형제를 투여한 대조군과 인도메타신(Indomethacin, SigmaI-7378)을 투여한 양성 대조군과 비교하였을 때 라말린 투여군(100mg/kg)은 6시간 후 50%정도의 항염증 효과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
일 관점에서, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 화합물 라말린의 신규한 용도에 관한 것이다:
화학식 1
Figure PCTKR2011004049-appb-I000002
본 발명의 라말린은 남극 지의류인 라말리나 테레브라타로부터 분리한 항산화 활성을 갖는 화합물로, 상기 라말린은 고분해능 ES-MS를 이용해 확인한 결과, 분자량이 254.1141이고, 분자식 C11H16N3O4의 화합물로 화학식 1의 구조를 가지는 것으로 확인하였으며, 라말리나 테레브라타로부터 분리된 화합물이므로 라말린으로 명명되었다.
본 발명에서는 라말린의 신규한 효능인 항염증 활성을 분석하기 위하여, iNOS(산화질소생성효소)의 발현을 전사단계에서 억제하여 염증 반응의 핵심 매개물질인 NO(산화질소)의 생성을 현저히 억제하고, 염증매개전구물질인 NF-κB의 인산화를 억제하고, p38 MAPK, ERK1/2 및 JNK 신호전달 경로를 억제하고, LPS 수용체인 TLR4의 발현도 억제하는 것을 확인하였다. 상기 확인 결과를 아래 실시예 등에 상세히 설명하였다.
본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린 (Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린(Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이고, 상기 화학식 1의 구조를 가지는 라말린 (Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 이용하여 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예로, 상기 화학식 1의 구조를 가지는 라말린 (Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 대상에 처리(투여)하는 단계를 포함하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 여기서, 상기 처리 또는 투여는 in vivo 또는 in vitro로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기의 염증질환 또는 면역질환은 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상, 췌장염, 파킨슨병, 뇌졸중, 발작에 의한 뇌손상 또는 자가면역질환을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "염증질환"은 외부물질 또는 내부물질이 유래하는 염증반응으로 인해 일어나는 질환으로 대표적으로 신경염증질환, 관절염 등이 있다. 본 발명에 사용된 용어 "면역질환"이란 인체 내 면역체계의 과도한 반응으로 일어나는 질환을 뜻하며, 대표적으로 알러지 질환 등이 있다. 그러나 염증 반응이란 결국 생체 내 면역체계의 반응으로 인해 일어나게 되는 것이므로, 염증질환과 면역질환은 크게 볼 때 유사한 범위를 지칭하는 용어로 사용될 수 있는 바, 본 명세서 내에서는 뚜렷하게 구별되는 용어로 사용하지 않고, 혼용하도록 하겠다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피아, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린(Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 투여하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물 및 예방 또는 치료방법은 항염증 활성이 뛰어나고, 독성과 부작용이 없는 천연물 유래의 화합물인 라말린을 이용한 것이므로, 유용하게 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린을 유효성분으로 함유하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
본 발명의 기능성 식품은 염증 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은, 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 면역질환 또는 염증질환은 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상, 췌장염, 파킨슨병, 뇌졸중, 발작에 의한 뇌손상 또는 자가면역질환을 의미한다.일 수 있다.
본 발명의 기능성 식품에 유효성분으로 함유된 라말린은 아래 기재한 생물학적 메커니즘을 분석한 결과에 의해 항염증 활성이 뛰어난 것이 분명하므로, 식품에 사용할 경우 뛰어난 효능을 나타내는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 라말린을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장품에 관한 것이다.
본 발명의 기능성 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연 화장수가 있다.
본 발명의 적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀전, 현탁액, 마이크로에멀전, 마이크로 캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태가 있다. 또한 포말의 현태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명의 화장품은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 킬레이트제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 안료, 염료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 기능성 화장품은 특히 항염증 효과가 뛰어나 화장품이 주로 사용되는 피부의 염증질환인 아토피 피부염 또는 화상 질환 등에 의한 염증의 증상을 완화시키는 기능성 화장품으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품에 유효성분으로 함유된 라말린은 아래 기재한 생물학적 메커니즘을 분석한 결과에 의해 항염증 활성이 뛰어난 것이 분명하므로, 화장품에 사용할 경우 뛰어난 효능을 나타내는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아닌 것은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1 : 라말린의 분리
완전히 동결 건조되고, 분쇄된 지의류 라말리나 테레브라타 샘플 672g을 메탄올:물 (5L, 80:20 v/v) 혼합용액을 이용하여 3회 반복하여 추출한 후, 동결건조를 거쳐 83g의 조추출물을 얻었다. 상기 조추출물을 1L의 증류수에 녹인 다음, 1L의 n-hexane과 클로로포름 (CHCl3)으로 추출하여 n-hexane 12.7g과 클로로포름 (CHCl3) 9.1g, 수용성 추출물 61.0g을 얻었다. 상기 수용성 추출물은 DPPH 자유 라디컬에 대해 높은 활성 IC50=9ug/ml를 나타냈다. 상기 수용성 추출물 중 5g을 이용하여 자동화된 MPLC (mild pressure liquid chromatography)를 적용시키고, 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올-물 혼합용액으로 단계적으로 그래디언트 용매 시스템을 실시하였다. 0% 메탄올-물 혼합용액에 녹여진 추출물은 DPPH 자유 라디컬에 대해 높은 활성 IC50=8ug/ml를 나타냈고, 그 중 100mg 부분을 C18ODS 칼럼(250cm x 10cm)를 사용하여 준 분취 역상 HPLC(semi-preparative reverse phase HPLC)로 분석하였다. 사용한 용매 시스템은 0.1% 포름산이 섞인 물에 대해 0% 메탄올-물 혼합용액의 경우 10분, 20% 메탄올-물 혼합용액은 20분, 100% 메탄올용액에 대해서는 30분 이상 수행하였다. 유속은 2mL/분으로 하였다.
그 결과, 화합물은 자외선 280nm에서 흡수되었다. 다섯 번째 분획 (45mg; tR = 18.88 분)의 경우, DPPH 자유 라디칼에 대해 가장 높은 활성 IC50=1μg/ml를 나타냈으며, 그 분획을 C18ODS 칼럼 (250cm x 10cm)를 사용하여 준 분취 역상 HPLC (semi-preparative reverse phase HPLC)로 반복하여 정제하였다. 그래디언트 용매 시스템은 10~30% 아세토니트릴 (acetonitrile) 수용액 (0.1% 포름산)을 사용하여 50분 이상 수행하였으며, 유속은 2mL/분이었다. 그 결과, 8.26분에 DPPH 자유라디칼에 대한 활성이IC50=0.99μg/mL인 라말린 30mg을 얻었다.
ESIMS (Electrospray ionization mass spectrometry) 데이터는 Mariner ESI-MS 기계 (Perseptive Biosystem, USA)를 사용하여 얻었다. NMR 스펙트럼 (1D 및 2D)는 D2O 에 더하여, 아세톤-d 6 를 사용하여, JEOL JNM ECP-400 spectrometer (13 C 1 H 및 400 MHz에 대한 400 MHz)를 이용하여 기록하였다. 이 때, 케미컬 쉬프트는 잔여 아세톤-d 6 (dH/dC = 2.22/21.0)을 참조하였다. HMQC 및 HMBC 실험은 1 J CH = 140 Hz, n J CH = 8 Hz 조건에서 최적화 되었다. 그 결과 구조는 다음과 같이 밝혀졌다.
화학식 1
Figure PCTKR2011004049-appb-I000003
이하, 다르게 기술되지 않는 이상, 모든 화합물은 Sigma Chemical Co.(US)에서 구매하여 사용하였다. 또한 이하, 모든 세포 배양물, 티오글리콜레이트 배양물 및 라말린은 Limμlus lysate test (E-Toxate kit, Sigma, US)를 이용하여 엔도톡신 (endotoxin) 오염 여부를 검사하여 10pg/ml 이하임을 확인하였다.
실시예 2 : LPS 처리된 대식세포에서 산화질소 발생량에 대한 라말린 처리의 효과
LPS 유도 NO 발생량에 대한 라말린의 전처리 효과를 알아보기 위하여, 생쥐 대식세포주 RAQ 264.7 (ATCC, Rockville, MD, US)을 이용하여 검증하였다. 세포는 RPMI 1640 배지 (GIBCO, Grand Island, NY, US)에 2　mM L-glutamine, 100　IU/ml penicillin, 100　㎕/ml streptomycin, and 10% 열 불활성화 fetal bovine serum (FBS: Carlsband, US) 을 공급하여 배양하였다. 또한 37℃, 5% CO2, 습한 공기조건에서 배양되었으며, 일주일에 두 번 배지를 교체하였다.
대식세포의 농도는 96-well 조직배양접시에 1 x 105 cells/well 농도로 배양되었으며, 세포 독성을 검사하기 위하여 라말린을 2시간 동안 처리해 보았다. 세포 생존률은 살아있는 세포의 미토콘드리아 활동을 보여주어 세포 생존률을 측정 가능한 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 양적색도계 분석으로 시행하였다. MTT가 formazan으로 환원된 양을 Molecμlar Device microplate reader (Sunnyvale, CA, US)를 이용하여 550nm에서 광학 밀도로 분석하였다.
그 결과, 0.1, 1, 10ug/ml의 농도의 라말린을 처리한 경우, 세포 독성이 없어 생존률에 변화가 없었다. 단, 데이터로 보여지지 않으나 100ug/ml에서는 세포 독성이 나타났다.
이산화질소(NO2 -) 축적량을 파악하기 위해 라말린 전처리를 한 실험군과 아무런 처리도 하지 않은 대조군을 준비하였다. 라말린 전처리는 LPS 1ug/ml를 처리하기 2시간 전에 0.1, 1, 10ug/ml의 농도로 하였다. 배지에 축적된 이산화질소의 양은 100㎕의 상층액을 각 well에서 분리하여 빈 well 접시에 위치시킨 후, 100μl의 그리스 (Griess) 용액 (증류수에 용해된 0.1% 나프틸에틸렌 다이아민 다하이드로클로라이드와 5% H3PO4에 용해된 1% sulfanilamide의 1:1 혼합액)을 추가한 후, Molecular Device microplate reader (Sunnyvale, CA, US)를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 이산화질소 농도는 아질산염(nitrite; NaNO2) 표준곡선에서 계산될 수 있다. 이산화질소 수준은 산화질소(NO)의 양을 나타내는 지표가 될 수 있다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 아질산염의 농도로부터 10ug/ml의 라말린을 전처리한 결과 유의미한 산화질소의 생산의 감소가 나타났으며, 그보다 낮은 농도에서도 산화질소의 생산의 감소가 나타났음을 확인할 수 있었다.
통계적 분석은 ±S.E.M. 통계 차이를 Fisher's PLSD 에 의한 그룹 간 단방향 분산분석(ANOVA)하여 확인하였으며, 유의값을 별표로 나타내었다. 특별한 기술이 없는 한, 아래 실시예에도 같은 통계 분석 방법을 사용하였다.
실시예 3 : LPS 처리된 대식세포에서 iNOS 발생량에 대한 라말린 처리의 효과
LPS 유도 iNOS 발생량에 대한 라말린의 전처리 효과를 알아보기 위하여, mRNA 발생량을 RT-PCR로 알아보고, 단백질 발생량을 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석으로 알아보았다. NO 생산 감소는 iNOS 생성 억제에 의한 것이기 때문이다. RT-PCR은 실시예 2와 같이 LDS와 라말린을 처리하고 난 후, Trizol (Introvigen, US)를 사용하여 배양된 세포의 모든 RNA를 수집하였다. 그 후 모든 RNA를 PLATINUM Taq kit (Introvigen, US)를 이용하여 Superscript one step RT-PCR을 수행하여 증폭하였다. PCR 결과물은 1.2% 아가로즈 젤에 걸어서 EtBr로 염색하여 보았다. GAPDH는 대조군으로 살펴보았다. PCR에 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다. iNOS-F는 5’-AGA CTG GAT TTG GCT GGT CCC TCC-3’(서열번호 1), iNOS-R은 5’-AGA ACT GAG GGT ACA TGC TGG AGC-3’(서열번호 2), GAPDH-F는 5’-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3’(서열번호 3), GAPDH-R은 5’-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3’(서열번호 4)와 같았다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 라말린을 각 농도로 전처리한 경우, iNOS mRNA 발현량이 적음을 확인할 수 있었다. 단, 농도의존적 결과를 보이며, 대조군인 GADPH와 비교한 결과, 억제효과는 특이적임을 확인하였다.
웨스턴 블롯은 실시예 2와 같이 LDS와 라말린을 처리하고 난 후, PBS (Phosphate Buffered Saline)로 두 번 세척하고 라이시스 버퍼 (lysis buffer) (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 0.5% sodium deoxycholate, 1% NP40, 100 μg/ml phenylsulfonyl fluoride, 2μg/ml aprotinin, 1μg/ml pepstatin, and 10μg/ml leupeptin)에 녹였다. 그 후 30분간 얼음에 재운 후, 15000 g을 40℃에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 모았다. 단백질 밀도는 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad Lab, Hercμles, CA)와 BSA (Sigma)를 이용하여 분석하였다. 전체 용해물 (lysates, 20μg)을 7.5% SDS-polyacrylamide gel로 분석하였고, 이를 immobilon polyvinylidene difuride membrane (Amersham, Arlington heights, IL)로 옮겨 항체로 표지하였다. 블롯은 Enhanced chemoluminescence (ECL) kit (Amersham)을 이용하였다. 모든 항체블롯 실험은 단백질 로딩 대조군으로 안티베타액틴 항체를 사용하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 라말린을 각 농도로 전처리한 경우, iNOS 단백질의 발현량이 적음을 확인할 수 있었다. 역시 농도의존적 결과를 보이며, 대조군인 GADPH와 비교한 결과, 억제효과는 특이적임을 확인하였다.
실시예 4 : LPS 처리된 대식세포에서 TLR4에 대한 라말린 전처리의 효과
TLR4 (Toll-like Receptor 4) 신호전달은 염증 반응의 유도의 중추적 역할을 하고 있다고 파악되고 있으며, LPS는 TLR4가 인지하는 리간드이므로, 라말린 전처리가 TLR4의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 표면 발현 정도, mRNA 양 및 단백질 양을 측정하였다. TLR4 실험방법은 아래와 같다.
대식세포 세포주인 Raw264.7을 계대배양 후 1~4 x 104 cells/well의 농도로 희석하여 96 well plate에 분주하고 배양하였다. 12시간 배양 후 라말린을 0.1, 1, 10 μg/mL의 다양한 농도로 처리한 후 2시간 동안 배양한다. 배양된 세포의 상등액을 제거하고 d-PBS로 세척한 후 LPS (1μg/mL)를 처리한다. 8시간 후에 ELISA 방법을 이용하여 세포 표면에서 발현되는 TLR4를 측정하였다. 세포 배양 상등액을 제거하고 d-PBS로 2번 세척한 후 차단 완충액 (blocking buffer) (in d-PBS에 1% 소혈청 FBS) 200mL를 넣어 상온에서 30분동안 비 특이적으로 결합시킨다. 세척완충액 (washing buffer) (0.05% Tween 20 in d-PBS)로 3회 세척하고 1차 항체 TLR4를 차단 완충액에 1:500으로 희석하여 100 μL씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 방치하였다. 그 후 세척완충액으로 5회 세척하고 알카린포스포테이즈 접합 이차 항체 (alkaline phosphatase-conjugated anti-rat secondary antibody)를 차단 완충액에 1:1000배로 희석하여 100 μL씩 첨가하여 상온에서 1시간 방치 후 washing buffer로 7회 세척하였다. 퍼록시데이즈 기질 (peroxidase substrate)을 100μL 첨가하여 차광시키고 30분 동안 상온 배양하였다. Microplate reader를 이용하여 650nm에서 흡광도를 측정하였다.
mRNA 양과 단백질 양의 측정 방법은 실시예 3에 기재된 바와 같다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 라말린을 전처리한 실험군들은 LPS-유도 TLR4의 표면 발현이 현저히 줄어든 결과를 보였다. 또한 mRNA 단계와 단백질 모두 줄어든 결과를 확인하였다(도 5, 6).
실시예 5: LPS 처리된 대식세포에서 NF-κB에 대한 라말린 전처리의 효과
NF-κB는 iNOS 발현에 가장 중요한 전사인자이므로, 라말린 전처리가 NF-κB에 미치는 효과를 관찰하기 위하여 루시페라아제 발현량을 관찰하였다. NF-κB의 발현을 확인하기 위한 하나의 방법이 Luciferase assay이다. Luciferase assay는 프로모터 활성화 여부를 확인하는 실험이다. 특정 gene의 프로모터 부분을 Luciferase가 있는 vector에 ligation시켜서 그 프로모터가 활성화 되면 발광하는 원리를 이용하였다.
상세한 실험방법은 세포에 NF-κB의 프로모터 부분을 도입하기 위하여 세포 (1x106 cells/mL)를 10% FBS, penicillin (100 IU/mL)과 streptomycin (100 mg/mL)을 함유한 media 에 부유액을 60 mm petri dish에 배양하고 24시간 동안 세포 안정시킨 후 도입하고자 하는 프로모터 부위와 트랙스팩션 혼합물을 세포에 처리한 후 24시간 배양한다. 이 후 다양한 처리조건에서 세포를 배양한다. 배양된 세포로부터 상등액을 제거하고 d-PBS를 이용하여 세척한 후 well당 200 ㎕의 1xlysis buffer (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminocyclohexane-N, N, N, N' tetracetic acid, 10% glycerol, 1% triton X-100, 1.25 mg/mL lysozyme, 2.5 mg/mL BSA)를 가하여 상온에서 교반하여 세포를 용해하였다. Cell lysate의 luciferase 활성을 측정하기 위하여 Bright-Glo luciferase assay system을 이용하였으며, 공급사에서 제공하는 방법에 따라 luciferase activity를 측정하였다.
또한, NF-κB의 p65 서브유닛이 염증 유전자의 전사 개시에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 바, p65 서브유닛 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯으로 조사하여 라말린의 효과를 알아보았다. 더하여, IκBα는 평상시에 NF-κB와 결합하여 활성을 억제하고 있는 NF-κB 억제제이며, LPS나 IFN-감마가 IκBα가 분리되는 것을 촉진하여 NF-κB가 활성화 된다고 알려져 있으므로, 60분 동안 IκBα의 단백질 양을 알아보았다.
루시페라아제 양은 트랜스팩션 (Transfection)과 리포터 분석으로 하였다. 상세하게는 RAW 264.7 세포 (5 x 105 cells/ml)를 6-well 접시 각각에 도말하고 LipofectAMINE Plus (Sigma)를 이용하여, pGL3-NF-κB 와 pCMV-베타-gal 플라스미드를 트랜스팩션 시킨다. 트랜스팩션은 0.5 μg pGL3-NF-κB와 0.2 μg pCMV-베타-gal을 LipofectAMINE Plus 용액과 섞어 세포에 넣고 4시간 후, 4시간 동안 라말린을 전처리 하고, 2시간 후 LDS를 처리하여 실시한다. 그 후 200μl의 라이시스 버퍼24 mM Tris-HCl (7.8 PH) 2 mM dithiotreitol 2 mM EDTA, 10% 글리세롤 및 1% 트리톤 X-100)에 녹인 후, 10μl의 세포 용해물을 이용하여 루시페라아제 활성 분석을 수행하였다. 루시페라아제와 베타갈락토시다아제에 대해 실험을 다른 세 실험자가 각 3번 이상 수행한 후, 베타갈락토시다아제의 양으로 루시페라아제 양을 노멀라이즈하였다.
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, LPS 처리로 인해 루시페라아제 양은 1.5배 증가하였으나, 라말린을 처리한 경우 루시페라아제 양의 증가가 일어나지 않음을 확인하였다.
p65와 IκBα 단백질은 실시예 3에서 사용한 웨스턴 블롯 분석법으로 그 양을 분석하였다. 그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 라말린을 대식세포에 전처리 한 경우, 전처리 하지 않은 것에 비해 p65 NF-κB가 현저히 적게 생성되었다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 라말린을 대식세포에 전처리 한 경우, 전처리 하지 않은 것에 비해 IκBα가 분해되지 못하고 여전히 NF-κB와 결합되어 양이 적게 나타났다. 따라서, 위 결과들을 종합하여 볼 때, 라말린은 LPS 또는 IFN-감마에 의해 유도되는 염증 반응 중간단계를 막아서 NF-κB의 활성화를 저해함을 확인하였다.
실시예 6: LPS 처리된 대식세포에서 p38 MAPK, ERK1/2 및 JNK 에 대한 라말린 전처리의 효과
p38 MAPK, ERK1/2 및 JNK kinase pathway는 염증 반응 중간단계를 조절하는 신호전달 단계로 알려져 있으므로, p38 MAPK, ERK1/2 및 JNK 발현 정도를 분석하여 라말린 전처리의 효과를 알아보았다. 실험과정은 상기 실시예 3과 동일하며, 단백질 양을 분석하는 방법은 웨스턴 블롯을 사용하였으며, 그 과정 또한 실시예 3과 동일하였다.
그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, p38, ERK 및 JNK 의 단백질 양은 라말린 전처리에 관계없이 동일하나, 각각의 인산화된 형태인 p-p38, p-ERK 및 p-JNK의 단백질 양은 전처리한 라말린 농도 의존적으로 감소함을 확인하였는 바, 라말린이 상기 각 단백질의 인산화를 저해하여 결과적으로 염증반응을 저해한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: LPS 처리된 쥐에서 부종의 크기에 대한 라말린 전처리의 효과
상기 실시예 2-6에서, in vitro 상태에서 라말린의 처리 효과를 분석해 본 바, 실시예 7에서는 살아있는 쥐를 이용하여 실제로 라말린이 항 염증효과가 있는지 실험하였다. 따라서 각각 부형제(대조군), 라말린 50mg/kg, 라말린 100mg/kg, 인도메타신(항염증제, 긍정 대조군)을 투여시킨 뒤 IDS의 한 종류인 카라기난을 이용하여 염증 반응을 일으켜 항 염증 효과를 발 부종 크기 증가 비율을 통해 측정하였다. 화학식 1의 구조를 가지는 라말린(Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물:
화학식 1
Figure PCTKR2011004049-appb-I000004
실험에 사용한 카라기난(Carrageenan)은 CAS번호: 9000-07-1, EC 번호 232-524-2, 제조사 (제품번호) sigma (C-1867)를 사용하였으며, 특히, 카파와 람다 카라기난을 혼합한 제품 사용하였다. 식품의 점착성 및 점도를 증가시키고 유화안정성을 증진하며 식품의 물성 및 촉감을 향상시키기 위한 식품첨가물로, 증점제, 겔화제, 안정제 등으로 사용되고 있다. 카라기난은 Irish moss라고 하는 홍조류인 Chondrus속, Eucheuma 속, Gigartina 속, Hypnea 속, Iridaea 속의 해초를 뜨거운 물 또는 뜨거운 알카리성 수용액으로 추출한 다음 정제하여 얻어지는 것으로서 그 주 성분은 i(Iota)-카라기난, k(Kappa)-카라기난, l(Lambda)-카라기난이다. 특히 l(Lambda)-카라기난 (1~2% 정도)은 염증 관련 동물실험에 있어 부종을 유발하는 물질로 사용되고 있다.
실험에 사용한 쥐는 수컷 Sprague-Dawley 쥐로, 150-200g, 6 주 이전의 것이며, 대한 Bio사, 한국에서 구입하였다. 실험실에서는 동물들을 국가 위생 기관의 실험실 동물 사용에 대한 적절한 치료 및 사용에 대한 명시된 지침에 따라 돌보았다. 카라기난은 카파와 람다 카라기난을 혼합한 제품을 사용하였고, 인도메타신 제품과 같이 Sigma사, 미국에서 구입하였다.
라말린은 500μl의 식염수(saline)에 각 50mg/kg, 100mg/kg을 섞어 사용하였고, 부형제는 식염수를 사용하였으며, 인도메타신은 500μl의 식염수(saline)에 각 10mg/kg의 농도로 하여 각 쥐에게 투여하였다. 1시간 후, 카라기난 1% 식염수 용액 100μl를 쥐의 뒷다리 발에 카라기난을 피하 주사하고, 6시간 동안 발의 두께를 측정하여 부종의 크기 증기 비율을 관찰한 결과를 도 11에 나타내었다. 각 시점에서 3번 측정하여 평균값을 사용하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 항 염증 효과는 높은 농도인 라말린 100mg/kg에서 높게 나타났으며, 부형제를 투여한 대조군과는 부종의 크기에서 상당한 차이를 보였다. 따라서 라말린 전처리 시, 염증반응이 상당히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점을 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 라말린을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 기존의 약학조성물에 비해 뛰어난 iNOS 생성 억제로 인한 산화질소(NO) 생성 억제효과를 보여 과도한 염증반응 및 면역반응을 억제하여 염증질환 또는 면역질환을 치료하는 효과가 있으며, 기능성 식품 및 기능성 화장품 등에 활용될 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (9)

  1. 화학식 1의 구조를 가지는 라말린(Ramalin) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물:
    화학식 1
    Figure PCTKR2011004049-appb-I000005
  2. 제1항에 있어서, 상기 염증질환 또는 면역질환은 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상, 췌장염, 파킨슨병, 뇌졸중, 발작에 의한 뇌손상 또는 자가면역질환인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용하는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 화학식 1의 구조를 가지는 라말린(Ramalin)을 유효 성분으로 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품:
    화학식 1
    Figure PCTKR2011004049-appb-I000006
  6. 제5항에 있어서, 상기 염증질환 또는 면역질환은 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상, 췌장염, 파킨슨병, 뇌졸중, 발작에 의한 뇌손상 또는 자가면역질환인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 화학식 1의 구조를 가지는 라말린(Ramalin)을 유효 성분으로 함유하는 기능성 화장품:
    화학식 1
    Figure PCTKR2011004049-appb-I000007
  8. 제7항에 있어서, 상기 기능성 화장품은 염증질환 개선용인 것을 특징으로 하는 기능성 화장품.
  9. 제8항에 있어서, 상기 염증질환은 아토피 피부염증 또는 화상염증인 것을 특징으로 하는 기능성 화장품.
PCT/KR2011/004049 2008-11-10 2011-06-02 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 WO2011152671A2 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11790029.0A EP2578214A4 (en) 2010-06-03 2011-06-02 PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH RAMALIN FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF INFLAMMATORY OR IMMUNE DISEASES
JP2013513112A JP2013534517A (ja) 2010-06-03 2011-06-02 ラマリンを含有する炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用医薬組成物
CN2011800328082A CN103140222A (zh) 2010-06-03 2011-06-02 用于预防和治疗炎性疾病或免疫疾病的含树花素的药物组合物
US13/701,113 US20130116324A1 (en) 2010-06-03 2011-06-02 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases or immune diseases containing ramalin
US14/261,551 US9539227B2 (en) 2008-11-10 2014-04-25 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases or immune diseases containing ramalin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100052551A KR101290745B1 (ko) 2010-06-03 2010-06-03 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR10-2010-0052551 2010-06-03

Related Parent Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/128,586 Continuation-In-Part US8809578B2 (en) 2008-11-10 2009-11-10 Compound ramalin and use thereof
PCT/KR2009/006562 Continuation-In-Part WO2010053327A2 (ko) 2008-11-10 2009-11-10 신규 화합물인 r a m a l i n 및 그 용도

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/701,113 A-371-Of-International US20130116324A1 (en) 2010-06-03 2011-06-02 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases or immune diseases containing ramalin
US14/261,551 Continuation US9539227B2 (en) 2008-11-10 2014-04-25 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases or immune diseases containing ramalin

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2011152671A2 true WO2011152671A2 (ko) 2011-12-08
WO2011152671A3 WO2011152671A3 (ko) 2012-03-29
WO2011152671A9 WO2011152671A9 (ko) 2012-05-24

Family

ID=45067197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2011/004049 WO2011152671A2 (ko) 2008-11-10 2011-06-02 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20130116324A1 (ko)
EP (1) EP2578214A4 (ko)
JP (1) JP2013534517A (ko)
KR (1) KR101290745B1 (ko)
CN (1) CN103140222A (ko)
WO (1) WO2011152671A2 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013141576A1 (ko) * 2012-03-19 2013-09-26 한국해양연구원 다공성 매트릭스를 이용한 라말린의 안정화 방법 및 안정화된 라말린 용액
US8865934B2 (en) 2010-07-14 2014-10-21 Korea Ocean Research And Development Institute Method for preparing ramalin
EP2821068A4 (en) * 2012-02-28 2015-12-02 Korea Inst Of Ocean Science And Technology PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH RAMALIN FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF LIVER FIBROSIS AND CIRRHOSIS
CN112203674A (zh) * 2018-03-29 2021-01-08 S.I.S舒洛夫创新科学有限公司 用于抑制炎性细胞因子的药物组合物

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101025612B1 (ko) * 2008-11-10 2011-03-30 한국해양연구원 신규 화합물인 Ｒａｍａｌｉｎ 및 그 용도
KR101290745B1 (ko) 2010-06-03 2013-07-29 한국해양과학기술원 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR101371045B1 (ko) 2012-01-19 2014-03-14 한국해양과학기술원 글루탐산 유도체와 하이드록시 아닐린 또는 하이드록시기가 보호된 하이드록시 아닐린을 이용한 라말린 및 라말린 전구체의 합성방법
CN107205973A (zh) * 2014-10-24 2017-09-26 韩国海洋研究院 用于预防或治疗神经变性疾病的含有Ramalin的组合物
KR101637240B1 (ko) * 2014-10-24 2016-07-08 한국해양과학기술원 라말린을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101642291B1 (ko) * 2015-01-19 2016-07-26 한국해양과학기술원 라말린을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
KR101951788B1 (ko) * 2017-09-21 2019-02-25 한국해양과학기술원 라말린을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물
KR102393317B1 (ko) * 2017-10-31 2022-05-03 광주과학기술원 글루탐산 유도체 및 이를 포함하는 조성물
KR102509430B1 (ko) * 2020-11-11 2023-03-13 한국해양과학기술원 남극 지의류 아만디네아 추출물의 제조방법 및 아만디네아 추출물을 포함하는 조성물
CN114480625A (zh) * 2022-03-04 2022-05-13 浙江省立同德医院 Mapk信号通路抑制在慢性骨髓炎改善、诊断和治疗中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080111021A (ko) 2006-03-29 2008-12-22 바스프 에스이 철 대사 장애의 치료를 위한 스트로빌루린의 용도

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR980008216A (ko) * 1996-07-01 1998-04-30 성재갑 지의류 추출물을 함유하는 세안제 조성물
US5789395A (en) 1996-08-30 1998-08-04 The Research Foundation Of State University Of New York Method of using tetracycline compounds for inhibition of endogenous nitric oxide production
AU3511500A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Trustees Of University Technology Corporation, The Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide-induced clinical conditions
JP2005082531A (ja) * 2003-09-09 2005-03-31 Maruzen Pharmaceut Co Ltd 抗炎症剤、並びに化粧料及び飲食物
US20060105989A1 (en) * 2004-11-18 2006-05-18 Kinya Takagaki Food for improving arthritis
AP2011005681A0 (en) 2008-10-02 2011-04-30 George Zabrecky Methods and formulations for treating chronic liver disease.
KR101025612B1 (ko) * 2008-11-10 2011-03-30 한국해양연구원 신규 화합물인 Ｒａｍａｌｉｎ 및 그 용도
KR101290745B1 (ko) 2010-06-03 2013-07-29 한국해양과학기술원 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR101182334B1 (ko) 2010-07-14 2012-09-20 한국해양연구원 라말린의 합성방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080111021A (ko) 2006-03-29 2008-12-22 바스프 에스이 철 대사 장애의 치료를 위한 스트로빌루린의 용도

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHMADJIN V.: "The lichen symbiosis", 1993, WILEY, pages: 1 - 6
BABU, B.R.B; GRIFFITH O.W., CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY, vol. 2, 1998, pages 491
BEHERA, B.C. ET AL., LEBENSM. WISS. TECHNOL., vol. 39, 2006, pages 805
BLAKE GJ; RIDKER PM: "Tumour necrosis factor-a , inflammatory biomarkers, and atherogenesis", EUR. HEART J., vol. 23, 2002, pages 345347
BROCKLEHURST WE: "Role of Kinins and Prostaglandins in Inflammation", PROC. ROY. SOC. MED., vol. 64, 1971, pages 4 - 6
BUTLER, A.R., CHEMISTRY & INDUSTRY, vol. 16, 1995, pages 828
GALLO RL; MURAKAMI M; TAKAAKI 0; ZAIOU M.: "Biology and clinical relevance of naturally occurring antimicrobial peptides", J. ALLERGY. CLIN. IMMUNOL., vol. 110, 2002, pages 823 - 831
GRAEME B; RYAN, MB; GUIDO M., ACUTE INFLAMMATION. AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 86, no. 1, 1977, pages 185 - 274
HAWIGER J.: "Innate Immunity and Inflammation: A Transcriptional Paradigm", IMMUNOLOGIC RESEARCH, vol. 23, 2001, pages 99 - 109
HUANG AL; VITA JA: "Effects of Systemic Inflammation on Endothelium-Dependent Vasodilation", TRENDS, CARDIOVASC. MED., vol. 16, 2006, pages 1520
KERWIN, J.F. ET AL., J. MED. CHEM., vol. 38, 1995, pages 4343
MULLER, K., APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 56, 2001, pages 9 - 16
RENAULD JC: "New insights into the role of cytokines in asthma", J. CLIN. PATHOL., vol. 54, 2001, pages 577 - 589
See also references of EP2578214A4
YAMAKI K; THORLACIUS H; XIE X; LINDBOM L; HEDQVIST P; RAUD J.: "Characteristics of histamineinduced leukocyte rolling in the undisturbed microcirculation of the rat mesentry", BRITISH J.PHARMACOL, vol. 123, 1998, pages 390 - 399

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8865934B2 (en) 2010-07-14 2014-10-21 Korea Ocean Research And Development Institute Method for preparing ramalin
EP2821068A4 (en) * 2012-02-28 2015-12-02 Korea Inst Of Ocean Science And Technology PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH RAMALIN FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF LIVER FIBROSIS AND CIRRHOSIS
WO2013141576A1 (ko) * 2012-03-19 2013-09-26 한국해양연구원 다공성 매트릭스를 이용한 라말린의 안정화 방법 및 안정화된 라말린 용액
CN112203674A (zh) * 2018-03-29 2021-01-08 S.I.S舒洛夫创新科学有限公司 用于抑制炎性细胞因子的药物组合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2578214A2 (en) 2013-04-10
EP2578214A4 (en) 2013-11-20
US20130116324A1 (en) 2013-05-09
CN103140222A (zh) 2013-06-05
US20140235719A1 (en) 2014-08-21
WO2011152671A3 (ko) 2012-03-29
JP2013534517A (ja) 2013-09-05
KR20110132938A (ko) 2011-12-09
KR101290745B1 (ko) 2013-07-29
US9539227B2 (en) 2017-01-10
WO2011152671A9 (ko) 2012-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011152671A2 (ko) 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2020141685A1 (ko) 락토바실러스 파라카제이 유래 소포 및 이의 용도
WO2016104911A1 (ko) 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 치료용 약학조성물
JP6411680B1 (ja) Ｌｓｄ１阻害剤を用いて多発性硬化症を処置する方法
WO2010079978A2 (ko) Abh 항원을 이용한 염증질환 개선용 조성물
WO2015002393A1 (ko) 감귤 미성숙과 추출물, 또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물
WO2019103541A1 (ko) 그래핀 나노구조체를 포함하는 항염증용 조성물
WO2019004668A1 (ko) 프로테우스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2018155921A1 (ko) 고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 및 치료용 약학적 조성물
TWI684456B (zh) 製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法、具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物以及含此萃取物之醫藥組成物
WO2015034247A1 (ko) 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2019143145A1 (ko) 레졸빈 d2를 유효성분으로 함유하는 피부 염증 치료용 조성물
WO2022255744A1 (ko) 락토바실러스 플란타룸 유래 소포 및 이의 용도
WO2023042959A1 (ko) 복합 진세노사이드 조성물을 포함하는 항염증 조성물
WO2019031655A1 (ko) 티몰을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 또는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2021033995A1 (ko) 초과 추출물을 함유하는 근육 감소 관련 질병의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
WO2021002664A1 (ko) 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2015156558A1 (ko) 신규 5,6-다이하이드로에르고스테롤 글리코시드 유도체를 포함하는 조성물
WO2019190290A1 (ko) 피부장벽 기능 이상의 개선용 조성물
WO2013154373A1 (ko) 퓨린 유도체 또는 그의 염을 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2019078381A1 (ko) 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제
WO2022145711A1 (ko) 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포를 포함하는 대사질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2017078353A1 (ko) 스티피탈리드를 유효성분으로 포함하는 조성물
WO2023063585A1 (ko) 남극 진균 균주 pleosporales sp. sf-7343 유래 대사화합물을 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2023171998A1 (ko) 동맥경화를 포함하는 노화성 혈관질환 치료 또는 예방용 조성물로서의 사이코사포닌 c

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201180032808.2

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11790029

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013513112

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2011790029

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011790029

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13701113

Country of ref document: US