WO2023171998A1 - 동맥경화를 포함하는 노화성 혈관질환 치료 또는 예방용 조성물로서의 사이코사포닌 c - Google Patents

동맥경화를 포함하는 노화성 혈관질환 치료 또는 예방용 조성물로서의 사이코사포닌 c Download PDF

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WO2023171998A1
WO2023171998A1 PCT/KR2023/003013 KR2023003013W WO2023171998A1 WO 2023171998 A1 WO2023171998 A1 WO 2023171998A1 KR 2023003013 W KR2023003013 W KR 2023003013W WO 2023171998 A1 WO2023171998 A1 WO 2023171998A1
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vascular
aging
psychosaponin
vascular endothelial
arteriosclerosis
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PCT/KR2023/003013
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김병모
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에이징타겟 주식회사
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • the present invention relates to psychosaponin C as a composition for treating or preventing age-related vascular diseases including arteriosclerosis.
  • arteriosclerosis has mainly consisted of statin drugs or stent surgery to lower bad cholesterol (low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C) in the blood.
  • Non-statin drugs are used in combination with or as a supplement to statin drugs. Both statins and non-statin drugs are effective by lowering LDL-C, the bad cholesterol.
  • statins and non-statin drugs are effective by lowering LDL-C, the bad cholesterol.
  • arteriosclerosis is a disease caused by vascular aging
  • the present invention sought to develop a treatment that can suppress the development of arteriosclerosis by keeping the blood vessels themselves healthy by suppressing vascular aging, thereby dramatically reducing the number of medications.
  • the present invention was completed after confirming that it could not only be effective, but also a more fundamental therapeutic agent.
  • it is an anti-aging treatment based on anti-aging, not only therapeutic efficacy but also preventive efficacy can be expected, so it is believed to be more in line with the treatment paradigm for aging diseases such as arteriosclerosis.
  • the inventor of the present invention confirmed that the aging phenomenon in the area of arteriosclerotic plaques is more pronounced than in other areas of blood vessels, and confirmed that many of the active substances derived as vascular aging inhibitors show efficacy as a treatment for arteriosclerosis, It was confirmed that the disease was caused by vascular aging.
  • the present inventor confirmed that psychosaponin C inhibits vascular aging caused by aging of vascular endothelial cells, and monocyte-endothelial cell adhesion and NLRP3, which play an important role in the early stage of the development of arteriosclerosis. By confirming that it inhibits macrophage foam cell formation by the NLRP3 inflammasome, it was confirmed that psychosaponin C can be used as a new concept arteriosclerosis treatment based on the inhibition of vascular aging, and the present invention was developed. Completed.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases caused by vascular aging, comprising psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving or preventing diseases caused by vascular aging, comprising psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of symptoms due to vascular aging, comprising psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving or preventing symptoms due to vascular aging, comprising psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide the use of psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of medicines for the treatment or prevention of diseases caused by vascular aging.
  • Another object of the present invention is to provide the use of psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof for manufacturing food for the improvement or prevention of diseases caused by vascular aging.
  • Another object of the present invention is to provide the use of psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of medicines for the treatment or prevention of symptoms due to vascular aging.
  • Another object of the present invention is to provide the use of psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof for manufacturing food for improving or preventing symptoms due to vascular aging.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating or preventing diseases caused by vascular aging or symptoms caused by vascular aging, comprising the step of administering psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual.
  • the present invention relates to the use of psychosaponin C, which simultaneously exhibits therapeutic effects on vascular aging and arteriosclerosis resulting from it, and which contains psychosaponin C as an active ingredient for the treatment, prevention, and improvement of diseases or arteriosclerosis caused by vascular aging. It provides a composition that can be effectively used to treat, prevent, or improve vascular aging and arteriosclerosis.
  • Figure 1 is an MTT assay evaluating whether psychosaponin C alleviates the growth inhibition of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high-concentration glucose corresponding to a high-fat diet.
  • VEC vascular endothelial cells
  • Figure 2 evaluates whether psychosaponin C alleviates the growth inhibition of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high concentration glucose using Trypan blue staining.
  • VEC vascular endothelial cells
  • FIG. 3 shows whether psychosaponin C alleviates aging of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high-concentration glucose using SA- ⁇ -gal staining and vascular aging marker proteins (PAI-1, ICAM-1, VCAM-1). This was evaluated by measuring expression.
  • Figure 4 shows cell cycle analysis to determine whether psychosaponin C alleviates the G1 growth delay of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high concentration glucose and measuring the expression of G1 growth delay-inducing proteins (p21, p27, p16). It was evaluated.
  • VEC vascular endothelial cells
  • HPAEC vascular endothelial cells
  • Figure 5 evaluates through fluorescence analysis whether psychosaponin C alleviates the generation of reactive oxygen species in vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high concentration of glucose.
  • Figure 6 evaluates whether psychosaponin C alleviates the decrease in nitric oxide concentration and the decrease in nitric oxide synthase activity, protein expression, and phosphorylation in vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high concentration of glucose.
  • Figure 7 evaluates whether psychosaponin C alleviates the decrease in Sirt1 activity, protein expression, and phosphorylation in vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high concentration of glucose.
  • Figure 8 shows psychosaponin C treated with a nitric oxide synthase inhibitor and a Sirt1 protein inhibitor to evaluate the mechanism of action of the effect of alleviating aging of vascular endothelial cells (HUVEC) caused by high-concentration glucose corresponding to a high-fat diet.
  • the role of nitric oxide synthase and Sirt1 protein in the anti-vascular aging effect of saponin C and the relationship between these proteins were evaluated.
  • Figure 9 shows adhesion analysis of monocytes labeled with a fluorescent substance (Calcein AM) to vascular endothelial cells (HUVEC, HCAEC) to determine whether psychosaponin C inhibits monocyte-vascular endothelial cell adhesion caused by TNF- ⁇ , an atherosclerosis inducer. It was evaluated through .
  • Figure 10 shows wound healing analysis and Transwell cell migration analysis to determine whether psychosaponin C inhibits abnormal proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (AoSMC, CASMC) caused by PDGF, which is involved in the progression of arteriosclerosis. It was evaluated through
  • Figure 11 is an evaluation of whether psychosaponin C inhibits macrophage foam cell formation caused by oxidized LDL (ox-LDL), a typical finding of early-stage arteriosclerosis, through Oil Red O staining.
  • ox-LDL oxidized LDL
  • Figure 12 evaluates whether psychosaponin C inhibits the activity of NLRP3 inflammasome, a protein complex that promotes macrophage foam cell formation, through IL-1 ⁇ secretion and caspase-1 cleavage analysis.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases caused by vascular aging, comprising psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • psychosaponin C is one of the main components of the medicinal plant called "Bupleuri Radix" and corresponds to saponins of the triterpene series.
  • the molecular weight of psychosaponin C is 927.12, its chemical formula is C 48 H 78 O 17 , and it has the structure of Formula 1.
  • the pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases caused by vascular aging containing psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention has the effect of suppressing vascular aging by inhibiting aging of vascular endothelial cells and arteries. It can be used as a new concept arteriosclerosis treatment based on the inhibition of vascular aging by inhibiting monocyte-vascular endothelial cell adhesion and macrophage foam cell formation by the NLRP3 inflammasome, which play an important role in the early stages of sclerosis development.
  • disease caused by vascular aging refers to a vascular disease caused by aging of vascular endothelial cells, including arteriosclerosis, and specifically may be arteriosclerosis caused by aging of vascular endothelial cells.
  • the composition containing psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective for monocyte-endothelial cell adhesion, NLRP3 inflammasome activity, and macrophage foam cell formation. It can treat or prevent arteriosclerosis, a disease caused by vascular aging, by inhibiting macrophage foam cell formation caused by foam cell formation or NLRP3 inflammasome.
  • the pharmaceutical composition contains psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be prepared as a powder or granule according to a conventional method.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and aerosols, external preparations, and sterile injectable solutions.
  • the term “pharmaceutically acceptable salt” refers to any salt that retains the desired biological and/or physiological activity of the compound and exhibits minimal undesirable toxicological effects. It refers to a salt prepared according to a conventional method in the art, and this manufacturing method is known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutically acceptable salt refers to a salt commonly used in the pharmaceutical industry, for example, inorganic ion salts made of calcium, potassium, sodium and magnesium, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, bromine, etc.
  • Inorganic acid salts made from acids, iodic acid, perchloric acid, tartaric acid and sulfuric acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, lactic acid, glycolic acid, glue
  • Organic acid salts made from conic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanillic acid, hydroiodic acid, etc., methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, A group consisting of sulfonates made from p-toluenesulfonic acid and naphthalenesulfonic acid, amino acid salts made from glycine, arginine, lysine, etc., and
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have toxicity beyond what the subject of application (prescription) can adapt to.
  • carrier is defined as a compound that facilitates the addition of a compound into cells or tissues.
  • the pharmaceutically acceptable carriers include those commonly used in the art, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, Includes, but is not limited to, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • composition of the present invention may contain diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, and other pharmaceutically acceptable additives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in the form of liquid, suspension, powder, granules, tablets, capsules, pills, or extract.
  • compositions of the present invention can be administered orally or parenterally (e.g., by application or injection intravenously, subcutaneously, or intraperitoneally).
  • oral administration refers to a method of injecting a drug for improving pathological symptoms (periodontal disease) into the mouth
  • parenteral administration refers to administration by mouth. This refers to methods of administration, excluding subcutaneous, intramuscular, intravenous, and intraperitoneal administration using a tube.
  • Solid preparations for oral administration include powders, granules, tablets, capsules, soft capsules, pills, etc.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquids, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives are included. may be included.
  • Preparations for parenteral administration include aqueous solutions, liquids, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, eye drops, eye ointments, syrups, suppositories, aerosols, etc., sterilized according to conventional methods, and are formulated as external preparations and sterilized injection preparations. It can be used in combination, preferably in the form of a pharmaceutical composition such as cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent, lotion, liniment agent, eye ointment, eye drop, paste or cataplasma agent. However, it is not limited to this. Compositions for topical administration may be in anhydrous or aqueous form depending on clinical prescription.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurel, glycerogelatin, etc. can be used.
  • Diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, and other pharmaceutically acceptable additives according to the present invention may be included in an amount of 0.1 to 99.9% by weight based on the composition, specifically 0.1 to 99.9% by weight. It may contain 50% by weight, but is not limited thereto.
  • compositions for the treatment or prevention of diseases caused by vascular aging containing psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention can be administered orally, rectally, intravenously, intraarterially, intraperitoneally, intramuscularly, intrasternally, It can be administered in a conventional manner via transdermal, topical, intraocular or intradermal routes, and specifically can be administered orally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, It can be determined based on factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, concurrently used drugs, and other factors well known in the field of medicine. For example, when administered once or several times a day, it may be administered at a dose of 0.001 mg/kg to 5 g/kg, and the administration may be administered once a day or in divided doses several times. Additionally, the pharmaceutical composition of the present invention may contain 0.001 to 50% by weight of psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof based on the total weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more active ingredients showing the same or similar medicinal effects in addition to psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and can be administered in combination with a conventional vascular aging inhibitor or arteriosclerosis treatment agent. possible.
  • the present invention provides a food composition for improving or preventing diseases caused by vascular aging, comprising psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • disease caused by vascular aging refers to a vascular disease caused by aging of vascular endothelial cells, including arteriosclerosis, and specifically may be arteriosclerosis caused by aging of vascular endothelial cells.
  • the food composition of the present invention may contain acceptable food auxiliary additives and may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the production of food.
  • the food composition of the present invention may include the form of pills, powders, granules, steeps, tablets, capsules, or liquids, and types of food to which the psychosaponin C of the present invention or a foodologically acceptable salt thereof can be added.
  • food to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, These include alcoholic beverages and vitamin complexes.
  • compositions may be added to the food composition, and the types are not particularly limited.
  • the types are not particularly limited.
  • it may contain various herbal extracts, foodologically acceptable food additives, or natural carbohydrates as additional ingredients, but is not limited thereto.
  • the term “food supplement” refers to a component that can be added as an auxiliary food additive, and can be appropriately selected and used by a person skilled in the art as it is added to prepare each type of food.
  • food supplements include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, and protective colloidal thickeners. , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated drinks, etc., but the types of food supplements of the present invention are not limited to the above examples.
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Flavoring agents other than those mentioned above include natural flavoring agents (such as thaumatin) and stevia extract (rebaudioside A, glycyrrhizin). hygin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be used to advantage.
  • the food composition of the present invention may include health functional foods.
  • the term “health functional food” refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills using raw materials or ingredients with functional properties useful to the human body.
  • functionality means controlling nutrients for the structure and function of the human body or obtaining useful effects for health purposes such as physiological effects.
  • the health functional food of the present invention can be manufactured by a method commonly used in the art, and can be manufactured by adding raw materials and components commonly added in the art.
  • unlike general drugs it is made from food, so it has the advantage of not having any side effects that may occur when taking the drug for a long time, and it can be highly portable.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the active ingredient of the present invention may be added in an amount of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight, of the raw material composition, but is not limited thereto.
  • the amount may be used even below the above range.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing symptoms due to vascular aging, comprising psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Symptoms due to vascular aging may be arteriosclerosis.
  • the symptoms due to vascular aging or arteriosclerosis include inhibition of vascular endothelial cell growth, increased vascular endothelial cell aging, increased production of reactive oxygen species in vascular endothelial cells, decreased nitric oxide concentration in vascular endothelial cells, and nitric oxide synthase enzyme.
  • decreased expression or activity decreased Sirt1 protein expression or activity, increased monocyte-vascular endothelial cell adhesion, increased NLRP3 inflammasome activity, increased macrophage foam cell formation, and increased macrophage foam cell formation by the NLRP3 inflammasome. There may be more than one selected.
  • composition containing psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention as an active ingredient is effective in treating or preventing the symptoms caused by vascular aging as described above.
  • the present invention provides a food composition for improving or preventing symptoms due to vascular aging, comprising psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Symptoms due to vascular aging may be arteriosclerosis.
  • the symptoms due to vascular aging or arteriosclerosis include inhibition of vascular endothelial cell growth, increased vascular endothelial cell aging, increased production of reactive oxygen species in vascular endothelial cells, decreased nitric oxide concentration in vascular endothelial cells, and nitric oxide synthase enzyme.
  • decreased expression or activity decreased Sirt1 protein expression or activity, increased monocyte-vascular endothelial cell adhesion, increased NLRP3 inflammasome activity, increased macrophage foam cell formation, and increased macrophage foam cell formation by the NLRP3 inflammasome. There may be more than one selected.
  • the food composition containing psychosaponin C or a food-acceptable salt thereof of the present invention as an active ingredient has the effect of improving or preventing the symptoms caused by vascular aging as described above.
  • the present invention provides the use of psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of medicines for the treatment or prevention of diseases caused by vascular aging.
  • the present invention provides the use of psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof for manufacturing food for the improvement or prevention of diseases caused by vascular aging.
  • the present invention provides the use of psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a medicine for the treatment or prevention of symptoms due to vascular aging.
  • the present invention provides the use of psychosaponin C or a foodologically acceptable salt thereof for manufacturing food for improving or preventing symptoms due to vascular aging.
  • the present invention provides a method for treating or preventing diseases caused by vascular aging or symptoms caused by vascular aging, comprising administering psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual.
  • the term “individual” refers to all animals, including humans, that have developed a disease caused by vascular aging or symptoms caused by vascular aging. Includes mammals, birds, etc., including cattle, pigs, sheep, chickens, dogs, humans, etc., and is caused by diseases or vascular aging caused by the psychosaponin C or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention. Subjects in which symptoms due to vascular aging are suppressed and thereby diseases due to vascular aging or symptoms due to vascular aging are treated are included without limitation.
  • Saikosaponin C (SSc) is one of the main components of the medicinal plant called " Bupleuri Radix " and is a saponin of the triterpene series.
  • the molecular weight of psychosaponin C is 927.12, and its chemical formula corresponds to C 48 H 78 O 17. It was used in the following experiments at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M, and was purchased from Abcam (Cambridge, MA, USA).
  • a high fat diet evaluation system at the cellular level was constructed using a high concentration of glucose (HG) of 33mM, which is 6 times the standard glucose concentration of 5.5mM in vascular endothelial cell culture medium.
  • SSc psychosaponin C
  • Figure 1 is an MTT assay evaluating whether psychosaponin C alleviates growth inhibition of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high-concentration glucose corresponding to a high-fat diet.
  • the growth of vascular endothelial cells was evaluated by measuring the absorbance of MTT formazan at a wavelength of 590 nm.
  • HUVEC and HPAEC cells were inhibited by high-concentration glucose treatment.
  • cell growth inhibition caused by high-concentration glucose was alleviated, and in particular, it was confirmed that the cell growth inhibition alleviation effect increased as the concentration of psychosaponin C increased.
  • HUVEC and HPAEC cells two types of vascular endothelial cells, HUVEC and HPAEC cells, were pretreated with psychosaponin C at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M for 2 hours and then treated with a high concentration of 33mM glucose for 1 week. Afterwards, the number of living cells was analyzed through Trypan blue staining. The number of cells in the control group (none) was set to "100" and the relative values were compared.
  • Figure 2 evaluates whether psychosaponin C alleviates growth inhibition of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high-concentration glucose corresponding to a high-fat diet using Trypan blue staining.
  • the growth of vascular endothelial cells was evaluated by observing cell number using Trypan blue staining.
  • HUVEC and HPAEC cells were inhibited by high-concentration glucose treatment.
  • cell growth inhibition caused by high-concentration glucose was alleviated, and in particular, it was confirmed that the cell growth inhibition alleviation effect increased as the concentration of psychosaponin C increased.
  • vascular endothelial cells two types of vascular endothelial cells, HUVEC and HPAEC, were pretreated with psychosaponin C at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M for 2 hours, and then treated with high concentration of glucose at 33mM for 72 hours (for SA- ⁇ -gal staining) or 48 hours. (for analysis of vascular aging marker proteins). Afterwards, the degree of cellular senescence was measured through SA- ⁇ -gal staining, and senescence was measured by the proportion of blue-stained cells (SA- ⁇ -gal positive) among all cells. In addition, the expression of vascular senescence marker proteins such as PAI-1, ICAM-1, and VCAM-1 was analyzed.
  • vascular senescence marker proteins such as PAI-1, ICAM-1, and VCAM-1 was analyzed.
  • FIG 3 shows whether psychosaponin C alleviates aging of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high-concentration glucose corresponding to a high-fat diet using SA- ⁇ -gal (senescence-associated ⁇ -galactosidase) staining and Western blotting ( It was evaluated by Western blotting. Specifically, aging of vascular endothelial cells is evaluated through SA- ⁇ -gal staining, which measures the activity of ⁇ -galactosidase, an enzyme present in an intracellular organelle called lysosome (Figures 3c, 3d), and this is presented in graph form. shown ( Figure 3a, Figure 3b).
  • SA- ⁇ -gal staining measures the activity of ⁇ -galactosidase, an enzyme present in an intracellular organelle called lysosome
  • Figures 3e and 3f show the results of confirming the expression of vascular aging marker proteins such as PAI-1, ICAM-1, and VCAM-1 in two types of vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) through Western blotting.
  • vascular aging marker proteins such as PAI-1, ICAM-1, and VCAM-1
  • vascular endothelial cells two types, HUVEC and HPAEC cells, were pretreated with psychosaponin C at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M for 2 hours, then treated with high concentration of glucose at 33mM for 48 hours, and then fixed with cold 70% ethanol.
  • PI sodium iodide, 50 ⁇ g/ml
  • the cell cycle was analyzed using flow cytometry.
  • the expression of cell cycle regulatory proteins such as p21, p27, and p16 was analyzed.
  • Figure 4 shows cell cycle analysis and G1-phase growth delay-inducing protein ( This was evaluated by measuring the expression of p21, p27, and p16). Since cell aging is closely related to growth delay in the G1 phase of the cell cycle, the cell cycle was evaluated using flow cytometry ( Figures 4a and 4b). In addition, the expression of p21, p27, and p16 proteins, which are proteins that cause G1 growth delay, were measured through Western blotting ( Figures 4c and 4d).
  • HUVEC and HPAEC cells two types of vascular endothelial cells, HUVEC and HPAEC cells, were pretreated with psychosaponin C at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M for 2 hours and then treated with high concentration of glucose at 33mM for 24 hours. Afterwards, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and superoxide anion (O 2 ⁇ - ) generated in the cytoplasm and mitochondria were measured using respective fluorescent probes. In addition, a sample treated with 100 ⁇ M hydrogen peroxide for 1 hour and then treated for an additional 23 hours after medium change was used as a positive control for reactive oxygen species induction.
  • H2DCFDA 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate
  • DHE dihydroethidium
  • DHR dihydrorhodamine 123
  • Mito-SOX reagents were used to analyze cytoplasmic hydrogen peroxide, intracytoplasmic superoxide anion, mitochondrial hydrogen peroxide, and mitochondrial superoxide anion, respectively. did.
  • the H2DCFDA (1 ⁇ M, staining for 45 minutes), DHE (10 ⁇ M, staining for 60 minutes), DHR (20 ⁇ M, staining for 30 minutes), and Mito-SOX (5 ⁇ M, staining for 10 minutes) are reactive oxygen species-specific for fluorescence image analysis. Used as fluorescent probes.
  • Figure 5 evaluates through fluorescence image analysis whether psychosaponin C alleviates the generation of reactive oxygen species (ROS) in vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high concentration of glucose corresponding to a high-fat diet.
  • Figure 5b shows the results of fluorescence image analysis, and Figure 5a shows this in graph form.
  • ROS reactive oxygen species
  • vascular endothelial cells two types, HUVEC and HPAEC cells, were pretreated with psychosaponin C at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M for 2 hours and then treated with a high concentration of 33mM glucose for 36 hours. Afterwards, nitric oxide (NO) concentration was analyzed as well as nitric oxide synthase (endothelial nitric oxide synthase (eNOS)) activity, protein expression, and phosphorylation level.
  • nitric oxide (NO) concentration was analyzed as well as nitric oxide synthase (endothelial nitric oxide synthase (eNOS)) activity, protein expression, and phosphorylation level.
  • eNOS endothelial nitric oxide synthase
  • Figure 6 evaluates whether psychosaponin C alleviates the decrease in NOS-NO signaling in vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high-concentration glucose corresponding to a high-fat diet.
  • Nitric oxide generation was measured using the Nitric Oxide Assay Kit (FIGS. 6a and 6b). Specifically, nitrate (NO 3 - ) and nitrite (nitrite, NO 2 - ) levels were analyzed by measuring them using nitrate reductase and Griess reagent.
  • Nitric oxide synthase activity was measured using the NOS Activity Assay Kit ( Figures 6c, 6d), and expression and phosphorylation (Ser114) of nitric oxide synthase were measured through Western blotting ( Figures 6e, 6f).
  • nitric oxide (NO) levels decreased nitric oxide (NO) levels, enzymatic activity of nitric oxide synthase (eNOS), protein expression, and phosphorylation of Ser114 residue (p-eNOS) in HUVEC and HPAEC cells. Confirmed.
  • eNOS nitric oxide synthase
  • p-eNOS Ser114 residue
  • HUVEC and HPAEC cells pretreated with psychosaponin C the decrease in NOS-NO signaling caused by high-concentration glucose was alleviated, and as the concentration of psychosaponin C increased, the effect of alleviating the decrease in NOS-NO signaling increased.
  • Nitric oxide produced by nitric oxide synthase is a vasodilator that induces vascular relaxation, contrary to reactive oxygen species, and thus keeps blood vessels healthy, so these results support the anti-vascular aging effect of psychosaponin C.
  • HUVEC and HPAEC cells two types of vascular endothelial cells, HUVEC and HPAEC cells, were pretreated with psychosaponin C at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M for 2 hours and then treated with a high concentration of 33mM glucose for 36 hours. Afterwards, Sirt1 activity, protein expression, and phosphorylation level were analyzed.
  • Figure 7 evaluates whether psychosaponin C alleviates Sirt1 activity, protein expression, and phosphorylation in vascular endothelial cells (HUVEC, HPAEC) caused by high concentration of glucose corresponding to a high-fat diet.
  • Sirt1 activity was measured using the Sirt1 Activity Assay Kit ( Figure 7a, Figure 7b), and Sirt1 protein expression and phosphorylation (Ser27, Ser47) were measured through Western blotting ( Figure 7c, Figure 7d).
  • HUVEC cells which are vascular endothelial cells, were pretreated with psychosaponin C at a concentration of 20 ⁇ M for 2 hours, and then treated with high-concentration glucose at a concentration of 33mM for 72 hours (for SA- ⁇ -gal staining) or 36 hours (for nitric oxide synthase activity and (for analysis of Sirt1 enzyme activity). Afterwards, SA- ⁇ -gal staining, nitric oxide synthase activity, and Sirt1 enzyme activity were analyzed.
  • LN G -Nitro arginine methyl ester (Nitro arginine methyl ester), an inhibitor of nitric oxide synthase, was used.
  • L-NAME (5mM)
  • EX-527 (10 ⁇ M), an inhibitor of Sirt1 protein, were used.
  • Figure 8 shows whether nitric oxide synthase and Sirt1 protein are involved in the efficacy of psychosaponin C in alleviating aging of vascular endothelial cells (HUVEC) caused by high-concentration glucose corresponding to a high-fat diet, as well as the relationship between nitric oxide synthase and Sirt1 protein. The correlation was evaluated. Aging of vascular endothelial cells was evaluated through intracellular SA- ⁇ -gal staining ( Figure 8a), and the activities of nitric oxide synthase (Figure 8b) and Sirt1 protein (Figure 8c) were assessed using NOS Activity Assay Kit and Sirt1 Activity Assay, respectively. It was measured using a kit.
  • HUVEC cell senescence (SA- ⁇ -gal positive cells) was increased by high-concentration glucose treatment, and HUVEC cell senescence was alleviated by psychosaponin C pretreatment.
  • psychosaponin C the anti-vascular aging effect of psychosaponin C was significantly inhibited in HUVEC cells pretreated with L-NAME, an inhibitor of nitric oxide synthase, or EX-527, an inhibitor of Sirt1 protein.
  • psychosaponin C was administered to two types of vascular endothelial cells, HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) and HCAEC (human coronary artery endothelial cells), at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M. After pretreatment for 2 hours, the cells were treated with TNF- ⁇ (20ng/ml) for 8 hours. Afterwards, monocyte-vascular endothelial cell adhesion and expression of adhesion proteins (cell adhesion molecules) (ICAM-1, VCAM-1) of vascular endothelial cells were observed.
  • the THP-1 cell line a human monocyte cell, was used as the mononuclear cell line.
  • the THP-1 cells were labeled with the green fluorescent substance Calcein AM (1 ⁇ g/ml per 1 ⁇ 10 6 cell) for 30 minutes, and then incubated with the two types of vascular endothelium. It was spread on the cells.
  • Monocyte-vascular endothelial cell adhesion was evaluated through imaging analysis using a confocal microscope, fluorescence analysis using a microplate reader, and Western blotting for expression of adhesion proteins (ICAM-1, VCAM-1). .
  • Figure 9 evaluates whether psychosaponin C inhibits monocyte-vascular endothelial cell adhesion caused by TNF- ⁇ , an arteriosclerosis inducer.
  • Calcein AM fluorescence analysis using confocal microscopy and microplate reader equipment, and expression of cell adhesion proteins (ICAM-1, VCAM-1) were evaluated through Western blotting.
  • Figures 9a and 9b show the results of analyzing monocyte-vascular endothelial cell adhesion in two types of vascular endothelial cells (HUVEC, HCAEC) through confocal microscopy
  • Figures 9c and 9d show Calcein analysis using a microplate reader device in the same experiment. This is the result of analyzing AM fluorescence (excitation wavelength 488nm, emission wavelength 517nm).
  • Figures 9e and 9f show the results of confirming the expression of adhesion proteins such as ICAM-1 and VCAM-1 in two types of vascular endothelial cells (HUVEC and HCAEC) through Western blotting.
  • monocyte-vascular endothelial cell adhesion increased in both types of vascular endothelial cells (HUVEC, HCAEC) by treatment with TNF- ⁇ .
  • this adhesion was inhibited when pretreated with psychosaponin C.
  • psychosaponin C inhibits the expression of adhesion protein of vascular endothelial cells, which is involved in monocyte-vascular endothelial cell adhesion.
  • Monocyte-vascular endothelial cell adhesion is considered to be the initial step in the development of arteriosclerosis, and adhesion proteins such as ICAM-1 and VCAM-1 are also vascular aging marker proteins, so these results suggest that psychosaponin C has anti-vascular aging efficacy and anti-vascular properties based on it. This means that it has arteriosclerotic effects.
  • AoSMC human aortic smooth muscle cells
  • CASMC human coronary artery smooth muscle cells
  • PDGF-BB a platelet-derived growth factor
  • a wound healing assay was performed to observe the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells
  • a transwell migration assay was performed to observe the migration ability of vascular smooth muscle cells.
  • Figure 10 evaluates whether psychosaponin C inhibits the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells caused by PDGF-BB, an arteriosclerosis inducer.
  • Figures 10a and 10b show the results of evaluating the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells in two types of vascular smooth muscle cells (AoSMC, CASMC) through wound healing analysis by scratch.
  • Figures 10c and 10d show the results of analyzing cell migration ability in the same cells using a Transwell migration chamber with a pore size of 8.0 ⁇ m.
  • THP-1 cells a mononuclear cell line
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • Differentiated macrophages were pretreated with psychosaponin C at concentrations of 5 ⁇ M and 20 ⁇ M for 2 hours, and then treated with oxidized LDL (ox-LDL) (100 ⁇ g/ml), a foam cell inducer, for 24 hours.
  • ox-LDL oxidized LDL
  • Foam cell formation was evaluated through microscopic analysis after staining with Oil Red O, which adsorbs to fat molecules, and absorbance analysis using microplate reader equipment.
  • Figure 11 evaluates whether psychosaponin C inhibits macrophage foam cell formation caused by oxidized LDL (ox-LDL), an atherosclerosis inducer.
  • Figure 11 shows the results of analysis of the degree of macrophage foam cell formation after cells fixed with 10% formalin for 30 minutes were stained with Oil Red O dye for 30 minutes. Nucleus was stained with hematoxylin dye for 1 minute.
  • the degree of foam cell formation can be determined by analyzing the degree of red staining by Oil Red O dye under a microscope, as shown in Figure 11a, or by eluting the Oil Red O dye with 100% isopropanol for 10 minutes, as shown in Figure 11b, and then measuring at 540 nm using a microplate reader equipment. It was analyzed by measuring absorbance.
  • NLRP3 NOD-like receptor protein-3
  • ASC which acts as an adapter
  • caspase-1 which acts as an effector.
  • the NLRP3 inflammasome causes pyroptosis, an inflammation-related cell death, through secretion of the inflammatory cytokine IL-1 ⁇ and activation of caspase-1 in response to infection and cell damage.
  • the NLRP3 inflammasome is known to promote macrophage foam cell formation through IL-1 ⁇ secretion and caspase-1 activation.
  • THP-1 cells a mononuclear cell line
  • PMA monosodium urate crystal
  • activator an NLRP3 inflammasome inducer
  • IL-1 ⁇ secretion and caspase-1 cleavage were analyzed.
  • MCC950 (1 ⁇ M) an NLRP3 inflammasome inhibitor
  • Figure 12 evaluates whether psychosaponin C inhibits the activity of the NLRP3 inflammasome, which promotes macrophage foam cell formation seen in early arteriosclerosis.
  • Figure 12a shows the results of analyzing NLRP3 inflammasome activity by measuring the secretion of IL-1 ⁇ , an inflammatory cytokine, through Solid Phase Sandwich ELISA.
  • Figure 12b shows the results of analyzing NLRP3 inflammasome activity by evaluating caspase-1 cleavage through Western blotting.
  • IL-1 ⁇ secretion and caspase-1 cleavage increased by treatment with urate crystals (MSU).
  • MSU urate crystals
  • an NLRP3 inflammasome inhibitor pretreatment with psychosaponin C inhibited IL-1 ⁇ secretion and caspase-1 cleavage.
  • caspase-1 cleavage and subsequent IL-1 ⁇ secretion are required, and the inhibitory effect of IL-1 ⁇ secretion and caspase-1 cleavage suggests that psychosaponin C can inhibit NLRP3 inflammasome activity. means.
  • activated NLRP3 inflammasome promotes foam cell formation, these results once again prove the anti-atherosclerotic effect of psychosaponin C in the early stages of arteriosclerosis through inhibition of macrophage foam cell formation.
  • psychosaponin C inhibited vascular aging caused by vascular endothelial cell aging and inhibited monocyte-vascular endothelial cell adhesion, which plays an important role in the early stages of arteriosclerosis, and macrophage foam cell formation by the NLRP3 inflammasome. did. Therefore, psychosaponin C can be used as a treatment for arteriosclerosis based on the inhibition of vascular aging.
  • This new concept of arteriosclerosis treatment based on the inhibition of vascular aging can be used alone for arteriosclerosis disease and show independent therapeutic effects, or it can be used in combination with existing arteriosclerosis treatments that lower LDL-C to enhance the treatment effect.

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Abstract

본 발명은 혈관노화와 이로 인한 동맥경화 조절제로서의 사이코사포닌 C에 관한 것으로, 사이코사포닌 C를 유효성분으로 포함하는 노화성 혈관질환, 혈관노화로 인한 질환, 구체적으로 동맥경화증, 또는 혈관노화로 인한 증상의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물을 사용하여 LDL-C를 낮추는 기존 동맥경화 치료제의 보완제, 대체제 혹은 병용제로서 동맥경화를 치료, 예방뿐만 아니라 개선하는데 큰 활용을 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

동맥경화를 포함하는 노화성 혈관질환 치료 또는 예방용 조성물로서의 사이코사포닌 C
본 발명은 동맥경화를 포함하는 노화성 혈관질환에 대한 치료 또는 예방용 조성물로서의 사이코사포닌 C에 관한 것이다.
혈관노화와 연관된 가장 근본적인 혈관의 기능적 변화는 혈관 팽창성(distensibility)의 장애와 동맥의 경직도(stiffness)라 할 수 있다. 즉, 동맥경화 발생은 혈관의 노화와 밀접히 연관되어 있다.
하지만 현재까지의 동맥경화 치료는 혈액 내의 나쁜 콜레스테롤(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)을 낮추는 스타틴 계열 약물이나 스텐트 수술 정도가 주를 이루고 있다. 비스타틴 계열 약물은 스타틴 계열 약물과 병용 혹은 보완제로 사용되고 있는데, 스타틴과 비스타틴 계열 약물 모두 나쁜 콜레스테롤인 LDL-C를 낮춤으로써 효능을 나타낸다. 이러한 동맥경화 치료제는 LDL-C 생성을 억제함으로써 동맥경화에 대한 우수한 치료효과를 보이는 장점이 있으나, 치료효과는 일시적인 것으로 투약을 1주일 정도 멈추면 다시 원래의 LDL-C 수치로 돌아오기 때문에 지속해서 투약해야 하는 한계점이 있다.
따라서, 혈관노화 억제에 기반한 신개념 동맥경화 치료제를 개발할 필요성이 대두되었다. 동맥경화가 혈관노화에 기인한 질병임을 고려하여, 본 발명에서는 혈관노화 억제를 통해 혈관 자체를 건강하게 유지하여 동맥경화 발병을 억제할 수 있는 치료제를 개발하고자 하였으며, 이에 의해 투약 횟수를 획기적으로 줄일 수 있을 뿐만 아니라 더 근본적인 치료제가 될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 또한, 노화 억제 기반 치료제이므로 치료 효능뿐만 아니라 예방 효능도 기대할 수 있어 동맥경화와 같은 노화질환 치료 패러다임에 더 부합한다고 사료된다.
본 발명의 발명자는 동맥경화 플라크(plaques) 부위가 다른 혈관 부위에 비해 노화 현상이 두드러짐을 확인하였고, 혈관노화 억제제로서 도출된 유효물질 상당수가 동맥경화 치료제로서의 효능을 보이는 것을 확인하고, 동맥경화가 혈관노화에 기인한 질병임을 확인하였다.
또한, 본 발명자는 사이코사포닌 C가 혈관내피세포 노화로 인한 혈관노화를 억제하는 것을 확인하였으며, 동맥경화 발병의 초기단계에서 중요한 역할을 하는 단핵구-혈관내피세포 부착(monocyte-endothelial cell adhesion)과 NLRP3 인플라마좀(NLRP3 inflammasome)에 의한 대식세포 거품세포 형성(macrophage foam cell formation)을 억제하는 것을 확인하여, 사이코사포닌 C가 혈관노화 억제 기반의 신개념 동맥경화 치료제로 이용이 가능한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 의약품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방용 의약품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관노화로 인한 질환 또는 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 혈관노화와 이로 인한 동맥경화에 대해 동시에 치료효과를 보이는 사이코사포닌 C의 용도에 관한 것으로, 사이코사포닌 C를 유효성분으로 포함하는 혈관노화로 인한 질환 또는 동맥경화 치료, 예방뿐만 아니라 개선하는 조성물을 제공하며 효과적으로 혈관노화와 동맥경화증을 치료, 예방 또는 개선하는데 이용이 가능하다.
도 1은 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 성장 억제를 완화시키는 지를 MTT assay로 평가한 것이다.
도 2는 사이코사포닌 C가 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포(HUVEC, HPAEC)의 성장 억제를 완화시키는 지를 Trypan blue staining으로 평가한 것이다.
도 3은 사이코사포닌 C가 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포(HUVEC, HPAEC)의 노화를 완화시키는 지를 SA-β-gal 염색 및 혈관노화 표지단백질(PAI-1, ICAM-1, VCAM-1)의 발현을 측정하여 평가한 것이다.
도 4는 사이코사포닌 C가 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포(HUVEC, HPAEC)의 G1기의 성장지연을 완화시키는 지를 세포 주기 분석 및 G1기 성장지연 유발 단백질(p21, p27, p16)의 발현을 측정하여 평가한 것이다.
도 5는 사이코사포닌 C가 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 활성산소종 발생을 완화시키는 지를 형광 분석을 통해 평가한 것이다.
도 6은 사이코사포닌 C가 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 산화질소 농도 감소 및 산화질소 합성효소 활성, 단백질 발현 및 인산화 감소를 완화시키는 지를 평가한 것이다.
도 7은 사이코사포닌 C가 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)에서의 Sirt1 활성, 단백질 발현 및 인산화 감소를 완화시키는 지를 평가한 것이다.
도 8은 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC)의 노화를 완화시키는 효능의 작용기전을 평가하기 위하여, 산화질소 합성효소 저해제와 Sirt1 단백질 저해제를 처리하여 사이코사포닌 C의 항혈관노화 효능에 있어서의 산화질소 합성효소와 Sirt1 단백질의 역할 및 이들 단백질 간의 연관성을 평가한 것이다.
도 9는 사이코사포닌 C가 동맥경화 유도제인 TNF-α에 의한 단핵구-혈관내피세포 부착을 억제하는 지를 형광물질(Calcein AM)로 표지된(labeled) 단핵구의 혈관내피세포 (HUVEC, HCAEC) 부착 분석을 통해 평가한 것이다.
도 10은 사이코사포닌 C가 동맥경화 진행에 관여하는 PDGF에 의한 혈관평활근세포 (AoSMC, CASMC)의 비이상적 증식(proliferation)과 이동(migration)을 억제하는 지를 상처 치유 분석 및 Transwell 세포 이동능 분석을 통해 평가한 것이다.
도 11은 사이코사포닌 C가 초기단계 동맥경화의 전형적 소견인 산화된 LDL(ox-LDL)에 의한 대식세포 거품세포 형성을 억제하는 지를 Oil Red O 염색을 통해 평가한 것이다.
도 12는 사이코사포닌 C가 대식세포 거품세포 형성을 촉진하는 단백질 복합체인 NLRP3 인플라마좀 활성을 억제하는 지를 IL-1β 분비 및 caspase-1 절단(cleavage) 분석을 통해 평가한 것이다.
이하 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어 (open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 사이코사포닌 C는 "시호(Bupleuri Radix)"라는 약용식물의 주성분 중 하나로 트리테르펜(triterpene) 계열의 사포닌(saponins)에 해당한다. 사이코사포닌 C의 분자량은 927.12이고, 화학식은 C48H78O17에 해당하며 화학식 1의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023003013-appb-img-000001
본 발명에 따른 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 혈관내피세포의 노화를 억제하여 혈관노화를 억제하는 효과가 있으며, 동맥경화 발병의 초기단계에서 중요한 역할을 하는 단핵구-혈관내피세포 부착과 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성을 억제하여, 혈관노화 억제 기반의 신개념 동맥경화 치료제로 이용이 가능하다.
본 발명에서 용어 "혈관노화로 인한 질환"은 혈관내피세포의 노화에 의해 유발되는 혈관질환으로, 동맥경화증이 있으며, 구체적으로 혈관내피세포의 노화로 인한 동맥경화증일 수 있다.
본 발명에서 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 단핵구-혈관내피세포 부착(monocyte-endothelial cell adhesion), NLRP3 인플라마좀(NLRP3 inflammasome) 활성, 대식세포 거품세포 형성(macrophage foam cell formation) 또는 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성을 억제하여 혈관노화로 인한 질환인 동맥경화증을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 의약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 칼슘, 칼륨, 나트륨 및 마그네슘 등으로 제조된 무기이온염, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 요오드산, 과염소산, 주석산 및 황산 등으로 제조된 무기산염, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등으로 제조된 유기산염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 및 나프탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염, 글리신, 아르기닌, 라이신 등으로 제조된 아미노산염 및 트리메틸아민, 트라이에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "약학적으로 허용가능한"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 "담체"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 액상제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제 또는 엑기스제의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여 (예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 「경구 투여」란, 병리학적 증상(치주 질환)을 호전하기 위한 약제를 입으로 주입하는 방법이며, 본 발명에 있어서, 용어 「비경구투여」란, 입으로 투여하는 것을 제외한 피하, 근육내, 정맥, 튜브를 이용한 복강내로 투여하는 방법을 의미한다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 등이 포함된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 액상제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액상제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스제 또는 카타플 라스마제의 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~99.9 중량%가 포함될 수 있으며, 구체적으로는 0.1~50 중량%를 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며 구체적으로는 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 ㎎/kg 내지 5 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물 총 중량에 대하여 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 0.001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있으며, 종래 혈관노화 억제제 또는 동맥경화 치료제와 병용 투여가 가능하다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "사이코사포닌 C"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "혈관노화로 인한 질환"은 혈관내피세포의 노화에 의해 유발되는 혈관질환으로, 동맥경화증이 있으며, 구체적으로 혈관내피세포의 노화로 인한 동맥경화증일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염 이외에 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 「식품보조첨가제」란, 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 「건강기능식품」이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 유효성분은 원료 조성물 중 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "사이코사포닌 C", "약학적으로 허용가능한 염", "약학적 조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 혈관노화로 인한 증상은 동맥경화증일 수 있다.
또한, 상기 혈관노화로 인한 증상 또는 동맥경화증으로 인한 증상은 혈관내피세포 성장 억제, 혈관내피세포 노화 증가, 혈관내피세포의 활성산소종 생성 증가, 혈관내피세포의 산화질소 농도 감소, 산화질소 합성효소 발현 또는 활성 감소, Sirt1 단백질 발현 또는 활성 감소, 단핵구-혈관내피세포 부착 증가, NLRP3 인플라마좀 활성 증가, 대식세포 거품세포 형성 증가 및 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성 증가로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 상기와 같은 혈관노화로 인한 증상을 치료 또는 예방하는 효과가 있다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "사이코사포닌 C", "식품학적으로 허용가능한 염", "식품 조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 혈관노화로 인한 증상은 동맥경화증일 수 있다.
또한, 상기 혈관노화로 인한 증상 또는 동맥경화증으로 인한 증상은 혈관내피세포 성장 억제, 혈관내피세포 노화 증가, 혈관내피세포의 활성산소종 생성 증가, 혈관내피세포의 산화질소 농도 감소, 산화질소 합성효소 발현 또는 활성 감소, Sirt1 단백질 발현 또는 활성 감소, 단핵구-혈관내피세포 부착 증가, NLRP3 인플라마좀 활성 증가, 대식세포 거품세포 형성 증가 및 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성 증가로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 상기와 같은 혈관노화로 인한 증상을 개선 또는 예방하는 효과가 있다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 의약품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방용 의약품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 제조를 위한 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관노화로 인한 질환 또는 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "사이코사포닌 C", "약학적으로 허용가능한 염", "식품학으로 허용가능한 염", "혈관노화로 인한 질환", "혈관노화로 인한 증상", "약학적 조성물", "식품조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "개체"란 혈관노화로 인한 질환 또는 혈관노화로 인한 증상이 발생한 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 의해 혈관노화로 인한 질환 또는 혈관노화로 인한 증상이 억제되고 이에 의해 혈관노화로 인한 질환 또는 혈관노화로 인한 증상이 치료되는 개체는 제한없이 포함한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1. 사이코사포닌 C 준비
사이코사포닌 C (Saikosaponin C, SSc)는 "시호 (Bupleuri Radix)"라는 약용식물의 주성분 중 하나로 트리테르펜 계열의 사포닌에 해당한다. 사이코사포닌 C의 분자량은 927.12이고, 화학식은 C48H78O17에 해당하며, 5μM과 20μM 농도로 하기 실험에 사용하였으며, Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
[실험예]
실험예 1. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 혈관내피세포 성장억제 완화 효과 (물질대사 분석-MTT assay)
혈관내피세포 배양 배지의 표준 포도당 농도인 5.5mM의 6배에 해당하는 33mM의 고농도 포도당(high glucose, HG)을 사용하여 세포 수준의 고지방 식이(high fat diet) 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC(인간 제대 정맥 내피 세포, human umbilical vein endothelial cells)과 HPAEC(인간 폐동맥 내피 세포, human pulmonary artery endothelial cells) 세포에 사이코사포닌 C(SSc)를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리(pre-treatment)한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 72시간 동안 처리하였다. 이후 살아있는 세포의 미토콘드리아 물질대사 능력을 측정하는 MTT assay를 통해 세포성장을 분석하였다.
도 1은 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 성장억제를 완화시키는 지를 MTT assay로 평가한 것이다. 혈관내피세포의 성장은 MTT formazan의 흡광도(absorbance)를 590nm 파장에서 측정함으로써 평가하였다.
그 결과, 고농도 포도당 처리에 의해 HUVEC 및 HPAEC 세포의 성장이 억제되었다. 그러나 사이코사포닌 C를 전처리한 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 고농도 포도당에 의한 세포성장 억제가 완화되었으며, 특히, 사이코사포닌 C의 농도가 증가할수록 세포성장 억제 완화 효과가 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 2. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 혈관내피세포 성장억제 완화 효과 (세포 수 분석-Trypan blue staining)
실험예 1과 동일하게, 세포 수준의 고지방 식이 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC과 HPAEC 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 1주일 동안 처리하였다. 이후 살아있는 세포의 수를 Trypan blue staining을 통해 분석하였다. 대조군(none)의 세포수를 "100"으로 놓고 상대적인 수치를 비교하여 나타냈다.
도 2는 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 성장억제를 완화시키는 지를 Trypan blue staining로 평가한 것이다. 혈관내피세포의 성장은 Trypan blue 염색법을 통해 세포 수(cell number)를 관찰함으로써 평가하였다.
그 결과, 고농도 포도당 처리에 의해 HUVEC 및 HPAEC 세포의 성장이 억제되었다. 그러나 사이코사포닌 C를 전처리한 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 고농도 포도당에 의한 세포성장 억제가 완화되었으며, 특히, 사이코사포닌 C의 농도가 증가할수록 세포성장 억제 완화 효과가 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 3. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 혈관내피세포 노화 완화 효과 분석 (SA-β-gal 염색 및 혈관노화 표지단백질 발현 분석)
실험예 1과 동일하게, 세포 수준의 고지방 식이 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC과 HPAEC 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 72시간 (SA-β-gal 염색용) 또는 48시간 (혈관노화 표지단백질 분석용) 동안 처리하였다. 이후 SA-β-gal 염색을 통해 세포노화 정도를 측정하였으며, 노화 여부는 전체 세포 중 파란색으로 염색이 된 세포(SA-β-gal positive)의 비중으로 측정하였다. 또한, PAI-1, ICAM-1 및 VCAM-1 등과 같은 혈관노화 표지단백질(vascular senescence marker protein)의 발현을 분석하였다.
도 3은 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 노화를 완화시키는 지를 SA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase) 염색과 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 평가한 것이다. 구체적으로, 혈관내피세포의 노화는 세포내 리소좀(lysosome)이라는 소기관에 존재하는 효소인 β-galactosidase 활성을 측정하는 SA-β-gal 염색을 통해 평가하고(도 3c, 도 3d) 이를 그래프 형태로 나타냈다(도 3a, 도 3b). 또한, 도 3e, 도 3f는 2종류의 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)에서 PAI-1, ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 혈관노화 표지단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.
그 결과, 고농도 포도당 처리에 의해 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 파란색으로 염색이 된 세포(SA-β-gal positive)의 비중(도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d)과 혈관노화 표지단백질의 발현(도 3e, 도 3f)이 증가하여 고농도 포도당에 의해 혈관 세포의 노화가 유발되는 것을 확인하였다. 그러나 사이코사포닌 C를 전처리한 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 SA-β-gal positive 세포와 PAI-1, ICAM-1 및 VCAM-1의 발현이 감소하여, 고농도 포도당에 의한 혈관 세포의 노화가 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 특히, 사이코사포닌 C의 농도가 증가할수록 혈관 세포의 노화 억제 효과가 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 4. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 G1 성장지연 완화 효과 분석 (세포주기 분석 및 세포주기 조절단백질 발현 분석)
실험예 1과 동일하게, 세포 수준의 고지방 식이 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC과 HPAEC 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 48시간 동안 처리한 후 차가운 70% 에탄올로 고정하였다. PI (propidium iodide, 50μg/ml) 용액으로 고정된 혈관내피세포의 DNA를 염색한 후 유세포 분석기를 통해 세포주기를 분석하였다. 또한, 고농도 포도당 33mM 농도를 36시간 동안 처리한 후 p21, p27 및 p16 등과 같은 세포주기 조절단백질의 발현을 분석하였다.
도 4는 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 G1기의 성장지연(growth arrest)을 완화시키는 지를 세포 주기 분석 및 G1기 성장지연 유발 단백질(p21, p27, p16)의 발현을 측정하여 평가한 것이다. 세포의 노화는 세포주기의 G1기 성장지연과 밀접히 연관되어 있으므로, 유세포분석기를 활용하여 세포주기를 평가하였다(도 4a, 도 4b). 또한, G1기 성장지연 유발 단백질인 p21, p27 및 p16 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 측정하였다(도 4c, 도 4d).
그 결과, 고농도 포도당 처리에 의해 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 세포주기의 G1기 arrest와 더불어 p21, p27 및 p16 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 사이코사포닌 C를 전처리한 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 고농도 포도당에 의한 G1기 성장지연과 p21, p27 및 p16 단백질 발현증가가 억제되었으며, 사이코사포닌 C의 농도가 증가할수록 G1기 성장지연 억제 효과와 G1기 성장지연 유발 단백질 발현 증가 억제 효과가 증가하는 것을 확인하였다. G1기 성장지연은 세포노화 과정에서 보여지는 현상이므로 이러한 결과는 사이코사포닌 C의 항혈관노화 효능을 뒷받침한다.
실험예 5. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 활성산소종 발생 완화 효과 분석 (형광 이미지 분석)
실험예 1과 동일하게, 세포 수준의 고지방 식이 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC과 HPAEC 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 24시간 동안 처리하였다. 이후 세포질과 미토콘드리아에서 발생하는 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O2˙ -)을 각각의 형광 probes를 활용하여 측정하였다. 또한, 100μM의 과산화수소를 1시간 처리한 다음 배지교체(medium change) 후 추가로 23시간을 처리한 샘플을 활성산소종 유발 양성대조군(positive control)으로 사용하였다.
활성산소종 종류 및 발생하는 세포내 위치에 따라 각기 다른 분석용 시약을 사용하였다. 구체적으로 H2DCFDA (2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate), DHE (dihydroethidium), DHR (dihydrorhodamine 123), Mito-SOX 시약을 이용하여 각각 세포질내 과산화수소, 세포질내 슈퍼옥사이드 음이온, 미토콘드리아 과산화수소 및 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 음이온을 분석하였다. 상기 H2DCFDA (1μM, 45분 염색), DHE (10μM, 60분 염색), DHR (20μM, 30분 염색), Mito-SOX (5μM, 10분 염색)는 형광이미지 분석을 위한 활성산소종-특이적 형광 probes로 사용하였다.
도 5는 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 발생을 완화시키는 지를 형광 이미지 분석을 통해 평가한 것이다. 도 5b는 형광 이미지 분석결과이고, 도 5a는 이를 그래프 형태로 나타낸 것이다.
그 결과, 고농도 포도당 처리에 의해 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 세포질내 과산화수소, 세포질내 슈퍼옥사이드 음이온, 미토콘드리아 과산화수소 및 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 음이온 등과 같은 다양한 활성산소종 생성이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 사이코사포닌 C를 전처리한 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 고농도 포도당에 의한 다양한 활성산소종이 감소하였으며, 사이코사포닌 C의 농도가 증가할수록 활성산소종 생성억제 효과가 증가하였다. 과산화수소와 슈퍼옥사이드 음이온은 대표적인 활성산소종이므로 이러한 결과는 사이코사포닌 C의 활성산소종 제거(ROS scavenging) 기반 항혈관노화 효능을 뒷받침한다.
실험예 6. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 NOS-NO 신호전달 감소 완화 효과 분석 (산화질소 농도와 더불어 산화질소 합성효소 활성 및 단백질 발현 분석)
실험예 1과 동일하게, 세포 수준의 고지방 식이 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC과 HPAEC 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 36시간 동안 처리하였다. 이후 산화질소(nitric oxide, NO) 농도와 더불어 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 활성, 단백질 발현 및 인산화 정도를 분석하였다.
도 6은 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)의 NOS-NO 신호전달 감소를 완화시키는 지를 평가한 것이다. 산화질소 발생은 Nitric Oxide Assay Kit를 활용하여 측정하였다(도 6a, 도 6b). 구체적으로, 질산염(nitrate, NO3 -)과 아질산염(nitrite, NO2 -) 수치를 질산염 환원효소(nitrate reductase)와 Griess 시약을 사용하여 측정함으로써 분석하였다. 산화질소 합성효소 활성은 NOS Activity Assay Kit를 활용하여 측정하였고(도 6c, 도 6d), 산화질소 합성효소의 발현과 인산화(Ser114)는 웨스턴 블롯팅을 통해 측정하였다(도 6e, 도 6f).
그 결과, 고농도 포도당 처리에 의해 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 산화질소(NO) 수치와 더불어 산화질소 합성효소(eNOS)의 효소활성, 단백질 발현과 Ser114 잔기의 인산화(phosphorylation, p-eNOS)가 감소되는 것을 확인하였다. 그러나, 사이코사포닌 C를 전처리한 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 고농도 포도당에 의한 NOS-NO 신호전달 감소가 완화되었으며, 사이코사포닌 C의 농도가 증가할수록 NOS-NO 신호전달 감소 완화효과가 증가되었다. 산화질소 합성효소에 의해 생성되는 산화질소는 활성산소종과 반대로 혈관이완을 유도하는 혈관 확장인자(vasodilator)로 혈관을 건강하게 유지하게 하므로 이러한 결과는 사이코사포닌 C의 항혈관노화 효능을 뒷받침한다.
실험예 7. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 Sirt1 활성/발현 감소 완화 효과 분석 (Sirt1 효소활성, 단백질 발현 및 인산화 분석)
실험예 1과 동일하게, 세포 수준의 고지방 식이 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC과 HPAEC 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 36시간 동안 처리하였다. 이후 Sirt1 활성, 단백질 발현 및 인산화 정도를 분석하였다.
도 7은 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC, HPAEC)에서 Sirt1 활성, 단백질 발현 및 인산화를 완화시키는 지를 평가한 것이다. Sirt1 활성은 Sirt1 Activity Assay Kit를 활용하여 측정하였고(도 7a, 도 7b), Sirt1 단백질의 발현과 인산화(Ser27, Ser47)는 웨스턴 블롯팅을 통해 측정하였다(도 7c, 도 7d).
그 결과, 고농도 포도당 처리는 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 Sirt1의 효소활성, 단백질 발현 및 Ser27/Ser47 잔기의 인산화 감소를 유발하였다. 그러나, 사이코사포닌 C를 전처리한 HUVEC 및 HPAEC 세포에서 고농도 포도당에 의한 Sirt1 효소활성, 단백질 발현 및 인산화 감소가 완화되었으며, 사이코사포닌 C의 농도가 증가할수록 Sirt1 효소활성, 단백질 발현 및 인산화 감소 완화효과가 증가되었다. Sirt1 단백질은 노화과정에서 발현이 감소하고, 혈관세포의 노화를 억제하는 항혈관노화 기능을 나타내는 것으로 알려져 있으므로 이러한 결과는 사이코사포닌 C의 항혈관노화 효능을 뒷받침한다.
실험예 8. 사이코사포닌 C의 고농도 포도당에 의해 유발되는 혈관내피세포 노화 완화 작용기전 분석 (SA-β-gal 염색, 산화질소 합성효소 활성 및 Sirt1 효소활성 분석)
실험예 1과 동일하게, 세포 수준의 고지방 식이 평가 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 사이코사포닌 C를 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 고농도 포도당 33mM 농도를 72시간 (SA-β-gal 염색용) 또는 36시간 (산화질소 합성효소 활성 및 Sirt1 효소활성 분석용) 동안 처리하였다. 이후 SA-β-gal 염색, 산화질소 합성효소 활성 및 Sirt1 효소활성을 분석하였다. 산화질소 합성효소와 Sirt1 단백질이 사이코사포닌 C의 항혈관노화 효능에 관여하는지 여부와 더불어 산화질소 합성효소와 Sirt1 단백질의 연관성을 분석하기 위해 산화질소 합성효소의 저해제인 L-NG-Nitro arginine methyl ester (L-NAME) (5mM)와 Sirt1 단백질의 저해제인 EX-527 (10μM)을 사용하였다.
도 8은 사이코사포닌 C가 고지방식이에 해당하는 고농도 포도당에 의한 혈관내피세포 (HUVEC)의 노화를 완화시키는 효능에 산화질소 합성효소와 Sirt1 단백질의 관여 여부와 더불어 산화질소 합성효소와 Sirt1 단백질 간의 연관성을 평가한 것이다. 혈관내피세포의 노화는 세포내 SA-β-gal 염색을 통해 평가하였고(도 8a), 산화질소 합성효소(도 8b) 및 Sirt1 단백질의 활성(도 8c)은 각각 NOS Activity Assay Kit와 Sirt1 Activity Assay Kit를 활용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 확인된 바와 같이, 고농도 포도당 처리에 의해 HUVEC 세포 노화(SA-β-gal positive 세포)가 증가되었고, 사이코사포닌 C 전처리에 의해 HUVEC 세포 노화가 완화되었다. 그러나, 산화질소 합성효소의 저해제인 L-NAME 또는 Sirt1 단백질의 저해제인 EX-527을 전처리한 HUVEC 세포에서는 사이코사포닌 C에 의한 항혈관노화 효능이 유의하게 저해됨을 확인하였다. 또한, L-NAME 전처리와 EX-527를 전처리한 HUVEC 세포 모두에서 사이코사포닌 C에 의한 산화질소 합성효소(NOS) 활성 감소 완화 효과를 억제하였으나, L-NAME 전처리가 사이코사포닌 C에 의한 Sirt1 단백질 활성 감소 완화 효과는 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 고농도 포도당에 의한 혈관노화를 억제하는 사이코사포닌 C의 효능에 있어 Sirt1 단백질 활성과 그로 인한 후속(subsequent) 산화질소 합성효소 활성이 중요한 역할을 함을 의미한다.
실험예 9. 사이코사포닌 C의 동맥경화 중 TNF-α에 의해 유발되는 단핵구-혈관내피세포 부착 억제 효과 (형광 분석과 단백질 발현 분석)
상기 실험예 3에서 사이코사포닌 C가 혈관내피세포 노화를 억제하는 것을 확인하였다. 혈관노화에 기인한 대표적인 질병이 동맥경화이므로, 다음으로 사이코사포닌 C가 동맥경화 억제능을 보이는지를 규명하고자 하였다. 첫번째 동맥경화 분석은 동맥경화 발병의 초기단계에서 중요한 역할을 하는 단핵구-혈관내피세포 부착 평가를 통해 이루어졌다.
구체적으로, 2 종류의 혈관내피세포인 HUVEC(인간 제대 정맥 내피 세포, human umbilical vein endothelial cells)과 HCAEC(인간 관상동맥 내피 세포, human coronary artery endothelial cells) 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 TNF-α (20ng/ml)를 8시간 동안 처리하였다. 이후, 단핵구-혈관내피세포 부착과 혈관내피세포의 부착단백질(cell adhesion molecules)(ICAM-1, VCAM-1) 발현을 관찰하였다. 단핵구 세포주로는 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포주를 사용하였으며, 상기 THP-1 세포에 녹색 형광물질인 Calcein AM (1Х106 세포당 1μg/ml)을 30분 동안 라벨링한 후 상기 2종류의 혈관내피세포 위에 도말(spread)하였다. 단핵구-혈관내피세포 부착은 공초점 현미경(confocal microscope) 장비를 활용한 이미징 분석과 microplate reader 장비를 활용한 형광 분석 및 부착단백질(ICAM-1, VCAM-1) 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 평가하였다.
도 9는 사이코사포닌 C가 동맥경화 유도제인 TNF-α에 의한 단핵구-혈관내피세포 부착을 저해하는 지를 평가한 것이다. 공초점 현미경과 microplate reader 장비를 활용한 Calcein AM 형광 분석 및 세포 부착단백질(ICAM-1, VCAM-1)의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 평가하였다.
도 9a, 도 9b는 2종류의 혈관내피세포 (HUVEC, HCAEC)에서 단핵구-혈관내피세포 부착을 공초점 현미경을 통해 분석한 결과이고, 도 9c, 도 9d는 동일실험에서 microplate reader 장비를 통해 Calcein AM 형광(excitation wavelength 488nm, emission wavelength 517nm)을 분석한 결과이다. 도 9e, 도 9f는 2종류의 혈관내피세포 (HUVEC, HCAEC)에서 ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 부착단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.
그 결과, TNF-α 처리에 의해 2종류의 혈관내피세포 (HUVEC, HCAEC) 모두에서 단핵구-혈관내피세포 부착이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 사이코사포닌 C를 전처리한 경우 이러한 부착이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 사이코사포닌 C가 단핵구-혈관내피세포 부착에 관여하는 혈관내피세포의 부착단백질의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 단핵구-혈관내피세포 부착은 동맥경화 발생의 초기단계로 여겨지고 있고, ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 부착단백질은 혈관노화 표지단백질이기도 하므로 이러한 결과는 사이코사포닌 C가 항혈관노화 효능과 그에 기반한 항동맥경화 효능을 가짐을 의미한다.
실험예 10. 사이코사포닌 C의 동맥경화 중 PDGF에 의해 유발되는 혈관평활근세포 이동 억제 효과 분석 (상처 치유능 및 세포 이동능 분석)
상기 실험예 9에서와 같이, 사이코사포닌 C가 동맥경화 억제능을 보이는지를 규명하고자 하였다. 두번째 동맥경화 분석은 동맥경화로의 본격적인 진행을 알려주는 주요 기전인 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell) 비이상적 증식(proliferation)과 이동(migration) 평가를 통해 이루어졌다.
구체적으로, 2 종류의 혈관평활근세포인 AoSMC(인간 대동맥 혈관평활근세포, human aortic smooth muscle cells)와 CASMC(인간 관상동맥 혈관평활근세포, human coronary artery smooth muscle cells) 세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)인 PDGF-BB (20ng/ml)를 24시간 동안 처리하였다. 이후, 혈관평활근세포의 증식과 이동을 관찰하였다. 혈관평활근세포의 증식과 이동을 관찰하기 위해 상처 치유 분석(wound healing assay)을 실시하였고, 혈관평활근세포의 이동능을 관찰하기 위해 이동능 분석(Transwell migration assay)을 실시하였다.
도 10은 사이코사포닌 C가 동맥경화 유도제인 PDGF-BB에 의한 혈관평활근세포의 증식과 이동을 저해하는 지를 평가한 것이다. 도 10a, 도 10b 는 2종류의 혈관평활근세포 (AoSMC, CASMC)에서 혈관평활근세포의 증식과 이동을 스크래치(scratch)에 의한 상처 치유 분석을 통해 평가한 결과이다. 도 10c, 도 10d는 동일세포에서 세포 이동능을 8.0μm 포어(pore) 사이즈의 트랜스웰 이동 챔버(Transwell migration chamber)를 활용하여 분석한 결과이다.
그 결과, PDGF-BB 처리에 의해 2종류의 혈관평활근세포 (AoSMC, CASMC) 모두에서 혈관평활근세포의 증식과 이동이 증가하는 것을 확인하였다. 앞서 실험예 9와는 달리 사이코사포닌 C를 전처리 하여도 이러한 증식과 이동이 억제되지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 사이코사포닌 C의 항동맥경화 효능에 혈관평활근세포의 증식과 이동이 관여하지는 않음을 의미한다.
실험예 11. 사이코사포닌 C의 동맥경화 중 대식세포 거품세포 형성 억제 효과 (이미징 분석과 흡광도 분석)
상기 실험예 9 및 실험예 10에서와 같이, 사이코사포닌 C가 TNF-α에 의한 단핵구-혈관내피세포 부착은 저해하고, PDGF에 의한 혈관평활근세포 비정상적 증식과 이동은 저해하지 않았기에 또 다른 동맥경화 표현형 분석을 통해 동맥경화 억제능을 보이는지를 규명하고자 하였다. 세번째 동맥경화 분석은 단핵구-혈관내피세포 부착과 같이 동맥경화 초기단계에서 중요한 역할을 하는 대식세포 거품세포 형성(macrophage foam cell formation) 관찰을 통해 이루어졌다. 대식세포 거품세포 형성은 동맥경화로의 진행에 있어 단핵구-혈관내피세포 부착과 혈관평활근세포 비이상적 증식과 이동 사이의 단계에 해당하는 단계이다.
구체적으로, 단핵구 세포주인 THP-1 세포에 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)를 150nM의 농도로 48시간 동안 처리하여 대식세포로 분화시켰다. 분화된 대식세포에 사이코사포닌 C를 5μM과 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 거품세포 유도제인 산화된 LDL(oxidized LDL, ox-LDL) (100μg/ml)을 24시간 동안 처리하였다. 이후, 대식세포로부터 거품세포로의 형성을 관찰하였다. 거품세포 형성은 지방 분자에 흡착하는 Oil Red O 염색 후의 현미경 분석과 microplate reader 장비를 활용한 흡광도(absorbance) 분석을 통해 평가하였다.
도 11은 사이코사포닌 C가 동맥경화 유도제인 산화된 LDL(oxidized LDL, ox-LDL)에 의한 대식세포 거품세포 형성을 저해하는 지를 평가한 것이다. 도 11은 대식세포 거품세포 형성 정도를 10% 포르말린(formalin)으로 30분간 고정한 세포를 Oil Red O 염색약으로 30분간 염색한 후 분석한 결과이다. 핵(nucleus)은 헤마톡실린(hematoxylin) 염색약으로 1분간 염색되었다. 거품세포 형성 정도는 도 11a와 같이 Oil Red O 염색약에 의해 붉은색으로 착색되는 정도를 현미경으로 분석하거나, 도 11b와 같이 Oil Red O 염색약을 100% isopropanol로 10분간 용출한 후 microplate reader 장비로 540nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다.
그 결과, 산화된 LDL 처리에 의해 대식세포가 지질을 다량 섭취하여 거품세포로 변환하는 것을 확인하였다. 그러나 사이코사포닌 C를 전처리한 경우 이러한 지질침착에 의한 거품세포 형성이 억제되는 것을 확인하였다. 대식세포의 거품세포로의 변환은 단핵구-혈관내피세포 부착과 더불어 초기 동맥경화의 전형적인 병리학적 소견으로 여겨지고 있으므로 이러한 결과는 사이코사포닌 C가 동맥경화 초기단계에 작용하여 항동맥경화 효능을 가짐을 의미한다.
실험예 12. 사이코사포닌 C의 동맥경화 중 NLRP3 인플라마좀 활성 억제 효과 (ELISA 분석과 단백질 발현 분석)
상기 실험예 9, 실험예 10 및 실험예 11에서와 같이, 사이코사포닌 C가 동맥경화 억제능을 보이는지를 규명하고자 하였다. 센서(sensor) 역할을 하는 NLRP3 (NOD-like receptor protein-3)는 어답터(adaptor) 역할을 하는 ASC 및 이펙터(effector) 역할을 하는 caspase-1 등과 함께 NLRP3 인플라마좀이라고 하는 단백질 복합체를 형성한다. NLRP3 인플라마좀은 감염 및 세포 손상에 대한 반응으로 염증성 사이토카인인 IL-1β 분비와 caspase-1 활성화를 통해 염증과 관련된 세포사멸인 파이롭토시스(pyroptosis)을 일으킨다. 무엇보다도 NLRP3 인플라마좀은 IL-1β 분비와 caspase-1 활성화를 통해 대식세포 거품세포 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 상기 실험예 11에서 사이코사포닌 C가 산화된 LDL에 의한 대식세포 거품세포 형성을 저해하는 효능을 보임에 따라, 네번째 동맥경화 분석은 대식세포 거품세포 형성을 촉진하는 NLRP3 인플라마좀 활성 평가를 통해 이루어졌다.
구체적으로, 단핵구 세포주인 THP-1 세포에 PMA를 150nM의 농도로 48시간 동안 처리하여 대식세포로 분화시켰다. 분화된 대식세포에 사이코사포닌을 20μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 NLRP3 인플라마좀 유도제(activator)인 요산염 결정(monosodium urate crystal, MSU)을 200μg/ml 농도로 6시간 동안 처리하였다. 이후 IL-1β 분비와 caspase-1 절단을 분석하였다. 또한, 사이코사포닌 C의 효능 비교를 위한 대조군으로 NLRP3 인플라마좀 저해제인 MCC950 (1μM)을 사이코사포닌 C와 마찬가지로 2시간 동안 전처리하였다.
도 12는 사이코사포닌 C가 초기 동맥경화에서 보여지는 대식세포 거품세포 형성을 촉진하는 NLRP3 인플라마좀의 활성을 저해하는 지를 평가한 것이다. 도 12a는 염증성 사이토카인인 IL-1β 분비를 Solid Phase Sandwich ELISA를 통해 측정함으로써 NLRP3 인플라마좀 활성을 분석한 결과이다. 도 12b는 caspase-1 절단을 웨스턴 블롯팅을 통해 평가함으로써 NLRP3 인플라마좀 활성을 분석한 결과이다.
그 결과, 요산염 결정(MSU) 처리에 의해 IL-1β 분비와 caspase-1 절단이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 NLRP3 인플라마좀 저해제인 MCC950 전처리와 마찬가지로 사이코사포닌 C를 전처리한 경우 이러한 IL-1β 분비와 caspase-1 절단이 억제되는 것을 확인하였다. NLRP3 인플라마좀이 활성화되기 위해서는 caspase-1 절단과 그로 인한 후속 IL-1β 분비가 필요한데, 이러한 IL-1β 분비와 caspase-1 절단 억제 효과는 사이코사포닌 C가 NLRP3 인플라마좀 활성을 억제할 수 있음을 의미한다. 또한, 활성화된 NLRP3 인플라마좀은 거품세포 형성을 촉진하므로 이러한 결과는 사이코사포닌 C의 대식세포 거품세포 형성억제를 통한 동맥경화 초기단계에서의 항동맥경화 효능을 다시 한번 입증한다.
요약하면, 사이코사포닌 C가 혈관내피세포 노화로 인한 혈관노화를 억제하였으며, 동맥경화 발병의 초기단계에서 중요한 역할을 하는 단핵구-혈관내피세포 부착과 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성을 억제하였다. 따라서, 사이코사포닌 C는 혈관노화 억제 기반의 동맥경화 치료제로 이용이 가능하다. 이러한 혈관노화 억제 기반 신개념 동맥경화 치료제는 동맥경화 질병에 단독으로 사용되어 독립적으로 치료효과를 나타내거나, LDL-C를 낮추는 기존 동맥경화 치료제와 병용해서 치료효과를 증진시키는 방식으로 활용될 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (16)

  1. 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈관노화로 인한 질환은 동맥경화증인 것인, 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혈관노화는 혈관내피세포의 노화인 것인, 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 단핵구-혈관내피세포 부착 (monocyte-endothelial cell adhesion), NLRP3 인플라마좀(NLRP3 inflammasome) 활성, 대식세포 거품세포 형성(macrophage foam cell formation) 또는 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성을 억제하는 것인, 혈관노화로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  5. 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 혈관노화로 인한 질환은 동맥경화증인 것인, 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 혈관노화는 혈관내피세포의 노화인 것인, 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 단핵구-혈관내피세포 부착 (monocyte-endothelial cell adhesion), NLRP3 인플라마좀(NLRP3 inflammasome) 활성, 대식세포 거품세포 형성(macrophage foam cell formation) 또는 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성을 억제하는 것인, 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것인, 혈관노화로 인한 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  10. 사이코사포닌 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈관노화로 인한 증상은 동맥경화증인 것인, 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 혈관노화로 인한 증상은 혈관내피세포 성장 억제, 혈관내피세포 노화 증가, 혈관내피세포의 활성산소종 생성 증가, 혈관내피세포의 산화질소 농도 감소, 산화질소 합성효소 발현 또는 활성 감소, Sirt1 단백질 발현 또는 활성 감소, 단핵구-혈관내피세포 부착 증가, NLRP3 인플라마좀 활성 증가, 대식세포 거품세포 형성 증가 및 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성 증가로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 혈관노화로 인한 증상의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  13. 사이코사포닌 C 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 혈관노화로 인한 증상은 동맥경화증인 것인, 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 혈관노화로 인한 증상은 혈관내피세포 성장 억제, 혈관내피세포 노화 증가, 혈관내피세포의 활성산소종 생성 증가, 혈관내피세포의 산화질소 농도 감소, 산화질소 합성효소 발현 또는 활성 감소, Sirt1 단백질 발현 또는 활성 감소, 단핵구-혈관내피세포 부착 증가, NLRP3 인플라마좀 활성 증가, 대식세포 거품세포 형성 증가 및 NLRP3 인플라마좀에 의한 대식세포 거품세포 형성 증가로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것인, 혈관노화로 인한 증상의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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KR20070002446A (ko) * 2005-06-30 2007-01-05 박정휘 Ｈｇｄ­ｓｊ­101 생약 복합제 추출물을 포함하는 동맥경화예방 및 치료용 조성물
KR20110061883A (ko) * 2009-12-02 2011-06-10 한국생명공학연구원 트리터페노이드계 사포닌 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물
KR20170014975A (ko) * 2015-07-31 2017-02-08 연세대학교 산학협력단 알츠하이머성 치매 원인단백질의 조절제로서의 사이코사포닌 c

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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