TWI684456B - 製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法、具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物以及含此萃取物之醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，包括：(a)將杭菊以一萃取溶劑進行一萃取程序，以獲得一萃取液；以及(b)將至少一糖苷酶加入該萃取液中，以發生一酵素反應而產生一沉澱物，其中該沉澱物為具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物。

Description

製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方 法、具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物以及含此萃取物之醫藥組成物
本發明係關於一種植物萃取物之製備方法，且特別關於一種製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法、與具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，以及含此萃取物之用於治療皮膚疾病的醫藥組成物。
皮膚疾病為全球最常見的疾病，約有1/3的人口於其一生中會出現一種病理性皮膚問題。在健康照護支出中，皮膚相關的醫療支出也高達25%。
皮膚疾病可分成四大類，分別為皮膚炎(例如，過敏性和接觸性)、癌症(例如，黑色素瘤)、免疫疾病(例如，乾癬)以及感染性皮膚疾病(例如，細菌，真菌和病毒感染)。
外用類固醇已被廣泛使用於各類皮膚疾病，尤其是異位性皮膚炎與乾癬，而於嚴重之皮膚炎病患，其類固醇使用劑 量更高。許多被歸類於類固醇(steroid)之化合物，例如倍他米松(betamethasone)或氫化波尼松(prednisolone)對於治療發炎性疾病的效果非常好，然而，這些化合物長期使用卻也可能造成病患的皮膚萎縮。病患若於類固醇治療期間出現皮膚萎縮之現象，則一般被認為是類固醇反應者(steroid responders)。皮膚萎縮對於已經具有皮膚疾病症狀的病患(如，乾癬病患)的影響是值得關切的。然而，即使是正常皮膚，在長期使用類固醇的情形下，亦會出現皮膚損傷之副作用。
因此，可取代類固醇之安全皮膚用藥，特別是植物藥的研發是一個重要的課題。
本發明提供一種製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，包括：(a)將杭菊以一萃取溶劑進行一萃取程序，以獲得一萃取液；以及(b)將至少一糖苷酶加入該萃取液中，以發生一酵素反應而產生一沉澱物，其中該沉澱物為具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物。
本發明也提供一種具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其係藉由如上述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法來獲得。
本發明還提供另一種具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，至少包括以下二個指標成分：木犀草素(luteolin)以及芹菜素(apigenin)，其中於該杭菊萃取物中，該木犀草素以及該芹菜素的含量比為約1：1-30。
本發明更提供一種用於治療皮膚疾病的醫藥組成 物，包括：上述任一種之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物；以及一藥學上可接受之媒劑、載體或鹽類。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
第1A圖顯示，未經處理組(未經任何處理)、控制組(50mg之咪喹莫特(imiquimod,IMQ)乳膏)、咪喹莫特+載劑處理組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之軟膏載劑)與實驗組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之PTBX軟膏)之小鼠之背部皮膚的發紅分數。平均值±標準差。###：p<0.001，相較於未經處理組；øø：p<0.01，相較於控制組。T-測試。
第1B圖顯示，未經處理組(未經任何處理)、控制組(50mg之咪喹莫特乳膏)、咪喹莫特+載劑處理組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之軟膏載劑)與實驗組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之PTBX軟膏)之小鼠之背部皮膚的脫屑分數。平均值±標準差。###：p<0.001，相較於未經處理組；øøø：p<0.001，相較於控制組；*：p<0.05，相較於咪喹莫特乳膏+載劑處理組。T-測試。
第1C圖顯示，未經處理組(未經任何處理)、控制組(50mg之咪喹莫特乳膏)、咪喹莫特+載劑處理組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之軟膏載劑)與實驗組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg 之PTBX軟膏)之小鼠之背部皮膚的總評分。平均值±標準差。###：p<0.001，相較於未經處理組；øøø：p<0.001，相較於控制組；*：p<0.05，相較於咪喹莫特+載劑處理組。T-測試。
第1D圖顯示，未經處理組(未經任何處理)、控制組(50mg之咪喹莫特乳膏)、咪喹莫特+載劑處理組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之軟膏載劑)與實驗組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之PTBX軟膏)之小鼠之背部皮膚的照片與背部皮膚樣本的蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,H&E)染色結果。
第1E圖顯示，未經處理組(未經任何處理)、控制組(50mg之咪喹莫特乳膏)、咪喹莫特+載劑處理組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之軟膏載劑)與實驗組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之PTBX軟膏)之小鼠之背部皮膚的厚度。平均值±標準差。###：p<0.001，相較於未經處理組；*：p<0.05，相較於咪喹莫特+載劑處理組。T-測試。
第1F圖顯示，未經處理組(未經任何處理)、控制組(50mg之咪喹莫特乳膏)、咪喹莫特+載劑處理組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之軟膏載劑)與實驗組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之PTBX軟膏)之小鼠背部皮膚組織的角蛋白(keratin,K14)基因表現量。平均值±標準差。###：p<0.001，相較於未經處理組；*：p<0.05，相較於咪喹莫特+載劑處理組。T-測試。
第1G圖顯示，未經處理組(未經任何處理)、控制組(50mg之咪喹莫特乳膏)、咪喹莫特+載劑處理組(50mg之咪喹莫特乳 膏+50mg之軟膏載劑)與實驗組(50mg之咪喹莫特乳膏+50mg之PTBX軟膏)之小鼠背部皮膚組織的絲聚蛋白(filaggrin,FLG)基因表現量。平均值±標準差。#：p<0.05，相較於未經處理組；**：p<0.01，相較於咪喹莫特+載劑處理組。T-測試。
本發明提供一種製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法。於此所述之皮膚疾病，並無特別限制，可例如，皮膚炎(如，過敏性和接觸性)、免疫疾病(如，乾癬)、感染性皮膚疾病(如，細菌，真菌和病毒感染)等。
而上述方法可包括，但不限於下述步驟。
首先，將杭菊以一萃取溶劑進行一萃取程序，以獲得一萃取液。上述萃取液可為由上述萃取程序所直接獲得之萃取液，也可為由上述萃取程序直接所獲得之萃取液進一步乾燥所形成之粉末以水或緩衝溶液回溶所形成之溶液，並無特別限制。而緩衝溶液的例子，可包括，但不限於，醋酸緩衝液(acetate buffer)。
又，上述萃取溶劑的例子，可包括水、醇類等，但不限於此。在一實施例中，上述萃取溶劑可為水。
上述萃取程序之溫度為約70-100℃，但不限於此。在一實施例中，上述萃取程序之溫度可為約80-95℃。又，萃取程序之時間可為約1-3小時，但不限於此。在一實施例中，上述萃取程序之時間可為約1-2小時。
接著，將至少一糖苷酶加入上述萃取液中，以發生一酵素反應而產生一沉澱物，而所獲得之沉澱物即為具有治療皮 膚疾病功效之杭菊萃取物。
上述至少一糖苷酶與上述杭菊與的重量比可為約1：200-10000，例如，1：3000-8000、1：1500-4000、1：750-2000、1：300-800等，但不限於此。在一實施例中，上述至少一糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：3000-8000。在另一實施例中，上述至少一糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：1500-4000。在又另一實施例中，上述至少一糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：750-2000。又，在另一實施例中，上述至少一糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：300-800。
又，上述酵素反應的溫度可為約25-45℃，例如25℃、30℃、35℃、36℃、37℃、37.5℃、38℃、39℃、40℃，但不限於此。在一實施例中，上述酵素反應的溫度可為約37℃。此外，上述酵素反應的時間可為，約5-30小時，例如，5-25小時、10-24小時等，但不限於此。在一實施例中，上述酵素反應的時間可為約16-24小時。
而上述至少一糖苷酶的例子，可包括，但不限於，葡萄糖苷酶(glucosidase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、葡萄醣醛酸酶(glucuronidase)、上述之任意組合等。上述葡萄糖苷酶可包括α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或其組合。上述半乳糖苷酶可包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶或其組合。而上述葡萄醣醛酸酶可包括α-葡萄醣醛酸酶、β-葡萄醣醛酸酶或其組合。
在一實施例中，上述至少一糖苷酶可為葡萄糖苷酶，而於此實施例中，上述葡萄糖苷酶可為β-葡萄糖苷酶。又，於此實施例中，上述β-葡萄糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約 1：200-10000，例如，1：3000-8000、1：1500-4000、1：750-2000、1：300-800等，但不限於此。在一實施例中，上述β-葡萄糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：3000-8000。在另一實施例中，上述β-葡萄糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：1500-4000。在又另一實施例中，上述β-葡萄糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：1500。又，在另一實施例中，上述β-葡萄糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：750-2000。在又另一實施例中，上述β-葡萄糖苷酶與上述杭菊的重量比可為約1：300-800。
在另一實施例中，上述至少一糖苷酶可為葡萄糖苷酶與葡萄醣醛酸酶。於此實施例中，葡萄糖苷酶與葡萄醣醛酸酶之重量比可為約1-2：1-2，例如1：1、1.5：1、2：1、1：1.5、1：2等，但不限於此。又，於此實施例中，葡萄糖苷酶加上葡萄醣醛酸酶與上述杭菊的重量比可為約1：200-10000，例如，1：3000-8000、1：1500-4000、1：750-2000、1：300-800等，但不限於此。在一實施例中，葡萄糖苷酶加上葡萄醣醛酸酶與上述杭菊的重量比可為約1：1500-4000。
又，在上述本發明之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法中，在一實施例中，於上述將杭菊係以水進行上述萃取程序以獲得杭菊水萃液。
而於此實施例中，上述萃取程序之溫度可為約70-100℃，而上述萃取程序時間可為約1-3小時。
又，對於上述使用水為萃取溶劑之實施例中，在一特定實施例中，在將至少一糖苷酶加入上述萃取液中，以發生一酵素反應而產生一沉澱物的步驟中，所採用之至少一糖苷酶為葡 萄糖苷酶。此葡萄糖苷酶可為β-葡萄糖苷酶。又，上述酵素反應的溫度可為約25-45℃，例如25℃、30℃、35℃、36℃、37℃、37.5℃、38℃、39℃、40℃，但不限於此，而於一特定實施例中，上述酵素反應的溫度可為約37℃。此外，上述酵素反應的時間可為約5-30小時，例如，5-25小時、16-24小時等，但不限於此，而於一特定實施例中，上述酵素反應的時間可為約16-24小時。而在所採用之至少一糖苷酶為β-葡萄糖苷酶的情況下，β-葡萄糖苷酶與杭菊的重量比可為約1：300-10000，例如，1：3000-8000、1：1500-4000、1：750-2000、1：400-800等，但不限於此。
另外，對於上述使用水為萃取溶劑之實施例中，在另一特定實施例中，在將至少一糖苷酶加入上述萃取液中，以發生一酵素反應而產生一沉澱物的步驟中，所採用之至少一糖苷酶為葡萄糖苷酶與葡萄醣醛酸酶。此葡萄糖苷酶可為β-葡萄糖苷酶，而此葡萄醣醛酸酶則可為β-葡萄醣醛酸酶。又，上述酵素反應的溫度可為約35-40℃，例如35℃、36℃、37℃、37.5℃、38℃、39℃、40℃，但不限於此，而於一特定實施例中，上述酵素反應的溫度可為約37℃。此外，上述酵素反應的時間可為約5-30小時，例如，5-25小時、16-24小時，但不限於此，而於一特定實施例中，上述酵素反應的時間可為約16-24小時。而在所採用之至少一糖苷酶為β-葡萄糖苷酶與β-葡萄醣醛酸酶的情況下，β-葡萄糖苷酶加上β-葡萄醣醛酸酶與杭菊的重量比可為約1：500-5000，例如，1：1500-4000等，但不限於此。又，β-葡萄糖苷酶與β-葡萄醣醛酸酶的重量比可為約1-2：1-2，例如1：1、1.5：1、2：1、1：1.5、1：2等。
關於上述本發明之製備具有治療皮膚疾病功效之杭 菊萃取物的方法，在另一實施例中，在將至少一糖苷酶加入上述萃取液中，以發生一酵素反應而產生一沉澱物的步驟中，於上述酵素反應後，可更進行一冷卻程序以促進上述沉澱物產生。冷卻程序之溫度可為約2-15℃，例如4℃，但不限於此，而冷卻程序之時間可為，但不限於約2-24小時，例如約24小時。
在又另一實施例中，上述本發明之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，在將至少一糖苷酶加入上述萃取液中，以發生一酵素反應而產生一沉澱物的步驟之後，可更包括對上述沉澱物進行一清洗程序。
而上述清洗程序則可包括，下述步驟，但不限於此。
首先，將上述沉澱物以一醇類溶劑回溶，以形成一混合液，而於此混合液可含有一溶液部分與一不溶物。在一實施例中，上述醇類溶劑的例子可包括，但不限於，甲醇、乙醇等。在一實施例中，上述醇類溶劑可為甲醇。
然後，將該上述溶液部分進行濃縮乾燥以獲得一經清洗之沉澱物。此沉澱物具有治療皮膚疾病之功效。
藉由任一上述本發明製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，杭菊萃取物在經由酵素處理而產生生物轉換後，不僅可提升其活性成分的含量，並可改變其成分對溶劑的溶解度，進而達到沉澱純化的目的。
又，藉由任一上述本發明製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，可大幅提高杭菊萃取物中之二個指標成份，木犀草素(luteolin)與芹菜素(apigenin)的總含量，且僅以單步驟之酵素處理即能夠獲得高純度之杭菊萃取物，而得到一步驟純 化之效果。在藉由任一上述本發明製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法所獲得之杭菊萃取物中，木犀草素與芹菜素含量總合可約為15-85wt%，但不限於此。
而木犀草素與芹菜素的含量比可為約約1：1-30，但不限於此。在一實施例中，木犀草素與芹菜素的含量比可為約1：1-30，例如1：1-25，但不限於此。
因此，由上述可知，本發明也可提供一種具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其可藉由任一上述本發明製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法來獲得。
藉由上述本發明之製備具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物的方法所獲得之杭菊萃取物至少可包括，但不限於，木犀草素與芹菜素二個指標成份。在上述杭菊萃取物中，木犀草素與芹菜素含量總合可約為15-85wt%，但不限於此。
而於藉由上述本發明之製備具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物的方法所獲得之杭菊萃取物中，木犀草素與芹菜素的含量比可為約1：1-30，但不限於此。在一實施例中，木犀草素與芹菜素的含量比可為約1：1-30，例如1：1-25，但不限於此。
另外，本發明也可提供另一種具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其至少可包括，但不限於，木犀草素與芹菜素等二個指標成份，且木犀草素與該芹菜素的含量比可為約1：1-30，但不限於此。
在一實施例中，木犀草素與芹菜素的含量比可為約1：1-30，例如1：1-25，但不限於此。
此外，本發明更提供一種用於治療皮膚疾病的醫藥 組成物。本發明之用於治療皮膚疾病的醫藥組成物可包括，但不限於，上述任一之本發明具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物與一藥學上可接受之媒劑、載體或鹽類。
藥學上可接受之媒劑可做為活性成分之稀釋劑、分散劑或載體。藥學上可接受之媒劑可包括常在皮膚護理產品中使用的材料，如水、液體或固體軟化劑、矽酮油、乳化劑、溶劑、濕潤劑、增稠劑、粉末、噴射劑與類似物。
媒劑可佔上述組合物之80-99.9wt%，較佳為90-99wt%，並可以在沒有其它佐劑的存在下構成組合物的其餘部份。
又，前述組合物也可更包括其它特殊的皮膚受益活化物，如防曬劑及皮膚淡化劑。媒劑也可以進一步包括如抗氧化劑、香料、遮光劑、防腐劑、著色劑及緩衝液之類的佐劑。
此外，前述之所有組合物於一實施例中皆可製作成一皮膚塗劑型式包括，但不限於，乳劑、膏劑、凝膠、噴劑、化妝水、洗髮水或幕斯等。一般來說，皮膚噴劑可由噴霧狀共聚物所組成，例如，聚乙烯吡咯烷酮、醋酸乙烯及其類似物，且其可具有化妝水之功能。皮膚凝膠的製備方法與噴劑類似，但其為凝膠狀且無乙醇的存在，可附著於皮膚上。皮膚幕斯為利用壓力釋放泡沫。皮膚乳劑為一疏水性或親水性乳劑、膏劑、凝膠、潤膚劑、噴劑、塗劑、皮膚調理水、洗髮水或幕斯。另外，更可添加適合的成份至皮膚乳劑，此額外添加的成份包括凡士林、蠟、羊毛脂、矽、微脂體、蔬菜、礦物油、增塑劑、香料、防腐劑、促滲透劑、pH值調整劑或其他適合用於局部皮膚的成份。此額外的成份可濕潤皮膚，穩定活性化合物，增加前述組合物-皮膚的接 觸，進而提升局部區域的濃度，並控制組合物的釋放。
前述藥學上可接受之載體可包括，但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配置成劑型(dosage form)。
又，上述藥學上可接受之鹽類可包括，但不限於鹽類包括無機陽離子，例如，鹼金屬鹽類，如鈉、鉀或胺鹽，鹼土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸醯胺。
本發明醫藥組成物給藥可以非口服、口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括塗擦患部、皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。
口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。
而塗擦之局部用藥成分的形式可包括軟膏、乳劑、液劑、凝膠等，但不限於此。
本發明之減緩皮膚疾病的醫藥組成物可為局部給藥劑型或全身給藥劑型，但不限於此。在一實施例中，本發明之減緩皮膚疾病的醫藥組成物可為局部給藥劑型，且此局部給藥劑型的例子可包括，但不限於軟膏、乳劑、液劑、凝膠等。
上述本發明之任一種治療皮膚疾病的醫藥組成物，可用於治療各種皮膚疾病，並無特別限制。又，上述本發明之任一種治療皮膚疾病的醫藥組成物對於治療各種皮膚疾病，皆具有優良的功效，特別是對於具有發炎症狀之皮膚疾病，具有優異之治療及/或減緩皮膚發炎效果。
在一實施例中，上述本發明之任一種治療皮膚疾病的醫藥組成物，可用於治療過敏性或接觸性皮膚炎。在另一實施例中，上述本發明之任一種治療皮膚疾病的醫藥組成物，可用於治療免疫性皮膚疾病，如乾癬。
實施例
實施例1
粗萃物PTB1的製備
將杭菊(Chrysanthemum morifolium)與15倍重量之水混合以形成一混合物。將混和物加熱至沸騰(約90-100℃)，以進行加熱萃取1小時，且之後移除其中之固體殘餘物，以獲得一萃取液。對此萃取液進行一減壓濃縮乾燥程序，以獲得粗萃物PTB1。所獲得之粗萃物PTB1之重量與原始藥材之重量的比例為約1：1.5-4。
實施例2
經酵素處理之萃取物PTBX的製備
將杭菊與15倍重量之水混合以形成一混合物。將混和物加熱至沸騰(約90-100℃)，以進行加熱萃取1小時，且之後移除其中之固體殘餘物，以獲得一萃取液。
將萃取液冷卻至室溫後，加入酵素，β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，而所添加之酵素的重量與原始藥材之重量的比例為1：1500。接著，將含有酵素之萃取液，放置於37℃培養箱以進行反應16-24小時。於反應完成後，將經酵素反應之萃取液置於4℃冰箱中24小時以促進沉澱產生。
將溶液固液分離以取出沉澱物，並以甲醇回溶，以形成一混合液，而此混合液含有一溶液部分與一不溶物。然後，將溶液部分取出並進行減壓濃縮乾燥，以獲得經酵素處理之萃取物PTBX。
實施例3
1. PTBX軟膏的製備
將PTBX乾燥粉末(1g)與95%酒精(1.4g)、聚乙二醇400(10g)、聚乙二醇4000(4.5g)、和聚氧乙烯氫化蓖麻油(0.15g)，及高純度的去離子水(2.95ml)之混合物加熱至60℃並攪拌至混合均勻，以製作成外用軟膏劑型，其中95%酒精、聚乙二醇400、聚乙二醇4000、和聚氧乙烯氫化蓖麻油及高純度的去離子水為載劑之成分。
2.單純載劑的製備：
將95%酒精(1.4g)、聚乙二醇400(10g)、聚乙二醇4000(4.5g)、和聚氧乙烯氫化蓖麻油(0.15g)，及高純度的去離子水(2.95ml)之混合物加熱至60℃並攪拌至混合均勻。
實施例4
杭菊萃取物於酵素處理前後的化學成份變化
利用高效液相層析法(high performance liquid chromatography,HPLC)來確認酵素反應前後萃取物中的指標成分含量變化。
於本試驗中選擇兩個黃酮類成分，木犀草素(luteolin)與芹菜素(apigenin)作為杭菊萃取物的指標成分，且同時觀察以上述兩個指標成份分別對應的糖基衍生物木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin 7-O-glucoside)與芹菜素-7-O-葡萄糖苷(apigenin-7-O-glucoside)的含量變化，並以高效液相層析法進行各成分含量分析。
於酵素處理前後之杭菊萃取物的高效液相層析法分析結果如表1所示。
Figure 106145261-A0101-12-0015-1
依據表1可知，杭菊萃取物之木犀草素與芹菜素的總含量由酵素處理前的0.063%(w/w，乾基(dry base))，提升到酵素處理後之60.848%(w/w，乾基)。換言之，藉由本發明所使用之酵素處理可大幅提升木犀草素與芹菜素的總含量，並達到1個步驟純化的效果。
實施例5
杭菊萃取物於酵素處理前後的生物活性變化
1.經酵素處理之萃取物PTBX之體外(in vitro)抑制角質細胞增生的活性評估
將5×103個HaCaT角質細胞接種於96孔盤中，置於37℃及5% CO2培養箱中培養。於培養16小時後，將此時間點(T0)之細胞數量作為細胞增生基準點，並對細胞分別加入不同製程之杭菊萃取物PTB1或PTBX以進行共同培養。於共同培養48小時(T48)之後，將培養盤中之上清液體移除，並對細胞加入50μl MTT溶液(0.5mg/mL)。之後，將培養盤置於37℃及5% CO2培養箱並培養1.5小時，接著加入150μL DMSO並搖盪5分鐘。然後，利用連續波長微孔盤分析儀測量波長570nm吸光值，且透過下列公式計算細胞增生率(cell proliferation activity)：細胞增生率=ODT0/ODT48×100。
實驗結果如表2所示。
2.對於經酵素處理之萃取物PTBX之體外抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導之發炎的評估
將5×105個細胞/mL的RAW264.7細胞種於96孔培養盤後於37℃、5% CO2培養隔夜。將培養盤中之上清液去除，並加 入脂多糖(50ng/mL)與不同濃度之PTB1或PTBX。
於反應24小時之後，吸取培養盤之上清液並藉由Griess reagent(Promega,Cat.No.G2930)來偵測其NO含量。
而於培養盤中之細胞部分則加入50μL含MTT(0.5mg/mL)的培養液。之後，將培養盤置於37℃及5% CO2培養箱並培養15-20小時，接著加入150μL DMSO並搖盪5-10分鐘。最後以連續波長微孔盤分析系統讀取OD570，且透過下列公式計算細胞存活率：
細胞存活率(%)=(實驗組OD值/控制組OD值)×100。實驗結果如表2所示。
3.經酵素處理之萃取物PTBX體外抑制DNFB引起之過敏的活性評估
將2×104個人類初級角質細胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes,NHEK)接種於96孔培養盤中，接著於培養盤加入重組蛋白TNF-α(100ng/ml；PeproTech Cat.No.300-01A)與細胞共同培養。於共培養6小時後，於培養盤中加入DNFB(1μM；Sigma Cat.No.D1529)與不同濃度的PTB1或PTBX繼續培養48小時。之後，收集培養盤中之上清液體，並藉由使用Human IL-1β DuoSet ELISA(Invitrogen；Cat.No.BMS224)與根據製造商建議之操作步驟來分析上清液體中的IL-1β含量，以確認細胞之IL-1β表現量。
實驗結果如表2所示。
4.經酵素處理之萃取物PTBX體外抑制IL-31導致之搔癢的活性評估
將2×104個人類初級角質細胞(NHEK)接種於96孔培養盤中，接著於培養盤中加入TLR1/2刺激劑，Pam3Cys-Ser-(Lys)4(1μg/ml；Abcam；Cat.No.ab14208)與細胞共同培養。於共培養6小時後，於培養盤中加入重組蛋白IL-31(100ng/ml；PeproTech；Cat.No.200-31)與不同濃度的PTB1或PTBX繼續培養48小時。之後，收集培養盤中之上清液體，並藉由使用人類CCL2/MCP-1 DuoSet ELISA(R&D；Cat.No.DY279)與根據製造商建議之操作步驟來分析上清液體中的MCP-1含量，以確認細胞之MCP-1表現量。
實驗結果如表2所示。
Figure 106145261-A0101-12-0018-2
根據表2可知，經酵素處理後之杭菊萃取物PTBX，在抑制皮膚角質細胞增生、發炎與接觸性過敏以及止癢的效果上均顯著被提升。
實施例6
經酵素處理之萃取物PTBX降低小鼠類乾癬皮膚發炎的功效評估
將Balb/c小鼠(6~8週齡)之背部毛髮剃除，並將小鼠分成四組，分別為未經處理組、控制組、咪喹莫特+載劑處理組以及實驗組。於未經處理組中未給予小鼠任何處理；於控制組中，將50mg之咪喹莫特(imiquimod,IMQ)乳膏(Aldara；3M Pharmaceuticals)塗抹於小鼠背部，每天給予一次咪喹莫特乳膏，連續給予六天，以誘導小鼠皮膚類乾癬症狀產生；於咪喹莫特+載劑處理組中，將50mg之咪喹莫特乳膏(Aldara；3M Pharmaceuticals)塗抹於小鼠背部，接著局部塗抹軟膏之載劑(50mg)，每天給予一次咪喹莫特乳膏與軟膏載劑，連續給予六天。於實驗組中，則將50mg之咪喹莫特乳膏(Aldara；3M Pharmaceuticals)塗抹於小鼠背部，接著局部塗抹PTBX軟膏(50mg)，每天給予一次咪喹莫特乳膏與PTBX軟膏，連續給予六天。
之後對小鼠背部之皮膚的發炎程度進行評分。皮膚發炎程度的評分項目包括發紅(erythema)與脫屑(scaling)。小鼠背部之皮膚係依照發紅或脫屑的嚴重程度給予0分(無病徵)至4分(嚴重)，並將發紅及脫屑的評分加總以計算出總評分(cumulative score)。各組小鼠之背部皮膚的發紅分數、脫屑分數以及總評分分別顯示於第1A、1B與1C圖。
於犧牲前，將小鼠背部之皮膚的乾癬病灶進行照相記錄，並於犧牲後將小鼠背部皮膚進行切片、量測表皮厚度並進行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,H&E)染色。各組小鼠之背部皮膚的照片與H&E染色結果以及各組小鼠之背部皮膚的厚度分別顯示於第1D與1E圖。
此外，也將小鼠背部皮膚之部分組織分別進行角蛋白(keratin,K14)與絲聚蛋白(filaggrin,FLG)之基因表現量的檢測，結果如第1F與1G圖所示。
第1A-1E圖顯示，在控制組中，給予50mg之咪喹莫特，可明顯造成小鼠背部皮膚發紅、脫屑與皮膚厚度增厚，然而在實驗組中藉由塗抹50mg之PTBX軟膏可減緩皮膚發紅與脫屑並減低皮膚厚度。
而在基因表現量上方面，第1F與1G圖顯示，相較於未經處理組，控制組之K14表現明顯增加(###p<0.001)，然而塗抹50mg之PTBX軟膏具有抑制K14表現的活性(*p<0.05)。相對於此，咪喹莫特造成FLG表現的降低(#p<0.05)，而塗抹50mg之PTBX軟膏則具有維持FLG表現的保護活性(**p<0.01)。實驗結果以平均值±標準差表示。
實施例7
酵素處理製程探討：酵素與萃取物之比例
將粗萃物PTB1之乾燥粉末約1g以50ml醋酸緩衝液(sodium acetate buffer)(pH 4.5)回溶，之後分別加入0.1、0.5、1、2及5mg的β-葡萄糖苷酶。接著將此含酵素之溶液放置於37℃培養箱以進行反應16-24小時。於反應完成後，將此溶液置於4℃冰箱 中24小時以促進沉澱產生。
將溶液固液分離以取出沉澱物，並將沉澱物以甲醇回溶，以形成一混合液。之後將此混合液進行高效液相層析法分析，結果如表3所示。
Figure 106145261-A0101-12-0021-3
 ND：未檢出
依據表3所示之結果可知，除了0.1mg的酵素量無法產生沉澱物外，其他酵素量均可產生沉澱效果。
實施例8
酵素處理製程探討：酵素種類
將粗萃物PTB1之乾燥粉末約1g以50ml醋酸鹽緩衝液(pH 4.5)回溶，之後分別加入1mg的β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)及β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase)。所添加之 酵素的重量與原始藥材之重量的比例為約1：1500-4000(粗萃物PTB1之重量與原始藥材之重量的比例為約1：1.5-4)。接著將此含酵素之溶液放置於37℃培養箱以進行反應16-24小時。於反應完成後，將此溶液置於4℃冰箱中24小時以促進沉澱產生。
將溶液離心以分離出沉澱物，並將沉澱物以甲醇回溶，以形成一混合液。之後將此混合液進行高效液相層析法分析以比較酵素處理前後指標成分含量差異，結果如表4所示。
Figure 106145261-A0101-12-0022-4
依據表4之結果可知，β-葡萄糖苷酶及β-葡萄醣醛酸酶均可藉由生物轉換增加杭菊萃取物中之木犀草素與芹菜素的含量。
實施例9
酵素處理製程探討：酵素組合
將粗萃物PTB1之乾燥粉末約1g以50ml醋酸鹽緩衝液(pH 4.5)回溶，之後同時加入1mg的β-葡萄糖苷酶與1mg的α-半乳糖苷酶，或1mg的β-葡萄糖苷酶與1mg的β-葡萄醣醛酸酶。所添加之酵素的重量與原始藥材之重量的比例為約1：750-2000(粗萃物PTB1之重量與原始藥材之重量的比例為約1：1.5-4)。接著將此含酵素之溶液放置於37℃培養箱以進行反應16-24小時。於反應完成後，將此溶液置於4℃冰箱中24小時以促進沉澱產生。
將溶液離心以分離出沉澱物，並將沉澱物以甲醇回溶，以形成一混合液。之後將此混合液進行高效液相層析法分析以比較酵素處理前後指標成分含量差異，結果如表5所示。
Figure 106145261-A0101-12-0023-5
Figure 106145261-A0101-12-0024-6
依據表5之結果可知，β-葡萄糖苷酶與β-葡萄醣醛酸酶同時存在時，可增加木犀草素-7-O-葡萄糖苷與芹菜素-7-O-葡萄糖苷分別對於木犀草素與芹菜素的轉換。
實施例10
酵素處理製程探討：不同菊屬植物
將金門油菊(Chrysanthemum indicum L)、除蟲菊(Chrysanthemum cinerariifolium)或台灣小油菊(Chrysanthemum indicum)與15倍重量之水混合以形成一混合物。將混和物加熱至沸騰(約90-100℃)，以進行加熱萃取1小時，且之後移除其中之固體殘餘物，以獲得一萃取液。
將萃取液冷卻至室溫後，加入酵素，β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，而所添加之酵素之重量與原始藥材之重量的比例為1：1500。接著，將含有酵素之萃取液，放置於37℃培養箱以進行反應16-24小時。於反應完成後，將經酵素反應之萃取液置於4℃冰箱中24小時以促進沉澱產生。
之後將萃取液離心，分別取上清液與沉澱物進行高效液相層析法分析以確認其他菊屬植物是否藉由酵素處理也可達成沉澱純化之效果，並將沉澱物進行體外抑制角質細胞活性分析，結果如表6所示。
Figure 106145261-A0101-12-0024-7
Figure 106145261-A0101-12-0025-8
由表6所示之結果可知，其他菊屬植物，例如金門油菊、除蟲菊與台灣小油菊，皆無法藉由酵素處理來進行沉澱純化與並藉此提高抑制角質細胞的活性。
然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (34)

  1. 一種製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，包括：(a)將杭菊以一萃取溶劑進行一萃取程序，以獲得一萃取液；以及(b)將至少一糖苷酶加入該萃取液中，以發生一酵素反應並同時提高該萃取液中木犀草素(luteolin)的含量與芹菜素(apigenin)的含量而產生一沉澱物，其中該至少一糖苷酶係擇自由下列所組成之群組中的至少一個：葡萄糖苷酶(glucosidase)；半乳糖苷酶(galactosidase)；以及葡萄醣醛酸酶(glucuronidase)，且其中該沉澱物為具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該萃取溶劑包括水或醇類。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該萃取程序之溫度為約70-100℃。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該萃取程序之時間為約1-3小時。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效 之杭菊萃取物的方法，其中該至少一糖苷酶為該葡萄糖苷酶，而該葡萄糖苷酶為β-葡萄糖苷酶。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該至少一糖苷酶為該葡萄糖苷酶與該葡萄醣醛酸酶，且其中該葡萄糖苷酶為β-葡萄糖苷酶，而該葡萄醣醛酸酶為β-葡萄醣醛酸酶。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該至少一糖苷酶與該杭菊的重量比為約1：200-10000。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該酵素反應的溫度為約25-45℃。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該酵素反應的時間為約5-30小時。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該萃取溶劑為水。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該萃取程序之溫度為約70-100℃。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該至少一糖苷酶為β-葡萄糖苷酶。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該β-葡萄糖苷酶與該杭菊的重量比為約1：200-10000。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該至少一糖苷酶為β-葡萄糖苷酶與β-葡萄醣醛酸酶。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該β-葡萄糖苷酶加上該β-葡萄醣醛酸酶與該杭菊的重量比為約1：200-10000。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該β-葡萄糖苷酶與該β-葡萄醣醛酸酶的重量比為約1-2：1-2。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中於步驟(b)中，於該酵素反應後，更進行一冷卻程序以促進該沉澱物產生。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該冷卻程序之溫度為約2-15℃，而該冷卻程序之時間為約2-24小時。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，於步驟(b)之後，更包括(c)對該沉澱物進行一清洗程序。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之製備具有治療皮膚疾病功 效之杭菊萃取物的方法，其中該清洗程序包括：(i)將該沉澱物以一醇類溶劑回溶，以形成一混合液，其中該混合液含有一溶液部分與一不溶物；以及(ii)將該溶液部分進行濃縮乾燥以獲得一經清洗之沉澱物。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法，其中該醇類溶劑包括甲醇或乙醇。
  22. 一種具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其係藉由如申請專利範圍第1項所述之製備具有治療皮膚疾病功效之杭菊萃取物的方法來獲得。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其中該萃取溶劑為水。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其中該萃取程序之溫度為約70-100℃。
  25. 如申請專利範圍第22項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其中該萃取程序之時間為約1-3小時。
  26. 如申請專利範圍第22項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其中該至少一糖苷酶為β-葡萄糖苷酶。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其中該β-葡萄糖苷酶與該杭菊的重量比為約1：200-10000。
  28. 如申請專利範圍第22項所述之具有治療皮膚疾病功效的 杭菊萃取物，其中該至少一糖苷酶為β-葡萄糖苷酶與β-葡萄醣醛酸酶。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其中該β-葡萄糖苷酶加上該β-葡萄醣醛酸酶與該杭菊的重量比為約1：200-10000。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，其中該β-葡萄糖苷酶與該β-葡萄醣醛酸酶的重量比為約1-2：1-2。
  31. 一種具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物，至少包括以下二個指標成分：木犀草素(luteolin)；以及芹菜素(apigenin)，其中於該杭菊萃取物中，該木犀草素與該芹菜素含量總合約為15-85wt%。
  32. 一種用於治療皮膚疾病的醫藥組成物，包括：如申請專利範圍第22或31項所述之具有治療皮膚疾病功效的杭菊萃取物；以及一藥學上可接受之媒劑、載體或鹽類。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之用於治療皮膚疾病的醫藥組成物，其中該醫藥組成物為局部給藥劑型，其中該局部給藥劑型包括軟膏、乳劑、液劑或凝膠。
  34. 如申請專利範圍第32項所述之用於治療皮膚疾病的醫藥 組成物，其中該皮膚疾病包括過敏性或接觸性皮膚炎，或乾癬。
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JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY,Vol.63,2015,p.A-G *
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Phytochemicals as a potentinal source for TNF-α inhibitors ,Phytochem Rev,30 August 2012 *
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