WO2011152525A1 - 抗体およびその利用 - Google Patents

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WO2011152525A1
WO2011152525A1 PCT/JP2011/062810 JP2011062810W WO2011152525A1 WO 2011152525 A1 WO2011152525 A1 WO 2011152525A1 JP 2011062810 W JP2011062810 W JP 2011062810W WO 2011152525 A1 WO2011152525 A1 WO 2011152525A1
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acid sequence
egfr
region
antibody
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PCT/JP2011/062810
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信義 清水
淳 高柳
徹彦 吉田
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東亞合成株式会社
学校法人慶應義塾
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
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    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to an artificially designed antibody and use thereof. Specifically, the present invention relates to an artificial antibody that specifically binds to epidermal growth factor receptor cells of human cells and use thereof.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2010-128623 filed on June 4, 2010, the entire contents of which are incorporated herein by reference. ing.
  • Epidermal Growth Factor also referred to as epidermal growth factor; hereinafter referred to as “EGF” is a receptor (receptor) present on the surface of a cell, that is, epidermal growth factor receptor (epidermal growth factor receptor). It is also known that cell growth and proliferation are promoted by binding as a ligand to the extracellular domain of factor receptor (hereinafter referred to as “EGFR”). In particular, EGFR is overexpressed on the surface of various tumor cells, and it has been revealed that it is deeply involved in the growth and malignancy of such tumors.
  • drugs that specifically block EGFR can block the binding of EGF to EGFR and block signal transduction involving EGFR, resulting in suppression of the growth of malignant tumor cells.
  • antibody drugs anti-tumor agents
  • matuzumab MATERIAL
  • cetuximab CETUXIMAB
  • anti-EGFR antibodies that can bind to EGFR competitively with EGF and thereby inhibit EGFR activation and dimerization, and malignant tumors such as colorectal cancer. It has a certain effect on cell growth inhibition (growth inhibition).
  • Patent Document 1 describes an example of this type of conventional antibody and its production example.
  • conventional anti-EGFR antibodies as described above are effective against KRAS gene-mutated malignant tumor cells (cancer cells) such as certain colorectal cancers (cell growth inhibitory action). ) Is reported to be extremely low and substantially ineffective. Therefore, it is desired to develop an antibody drug having a high cell growth inhibitory effect against such KRAS gene mutant-type malignant tumor cells. Therefore, the present invention was created to solve such conventional problems, and is a cell that expresses EGFR at a high rate, for example, a KRAS gene mutant type in which conventional antibody drugs have not been able to produce a good effect.
  • An object of the present invention is to provide a new cell growth inhibitor (cell growth inhibitor) that exhibits a preferable cell growth inhibitory effect on cells. Another object is to create a new anti-EGFR antibody used as a component of such a cell growth inhibitor.
  • the present invention provides a method for suppressing (inhibiting) the growth of a target EGFR-expressing cell (particularly, a KRAS gene-mutated malignant tumor cell) by using the anti-EGFR antibody disclosed herein. For other purposes.
  • the extracellular domain of human epidermal growth factor receptor (typically composed of 621 amino acid residues) is a secretory signal sequence consisting of four further subdomains, ie, 24 amino acid residues. (1) from the N-terminal side of the amino acid sequence.
  • “Ligand-binding subdomain 1 (hereinafter referred to as“ L1 domain ”: typically a domain consisting of 165 amino acid residues from the N-terminal to the 25th to 189th positions following the signal sequence)”, (2).
  • Cysteine-rich subdomain 1 (hereinafter referred to as“ C1 domain ”: typically a domain consisting of 144 amino acid residues from 190 to 333 following the L1 domain)”, (3).
  • L2 domain typically a domain consisting of 172 amino acid residues from 334 to 505 after the C1 domain
  • C2 domain typically, a domain consisting of 140 amino acid residues from the 506 th to 645 th typically following the L2 domain
  • the conventional anti-EGFR antibody as described in Patent Document 1 mainly has a property of binding to the L2 domain of (3) above.
  • the present inventor has artificially produced an anti-EGFR antibody derived from a phage library possessed and having an epitope different from that of the conventional one, and by using several of the obtained anti-EGFR antibodies alone or in combination, Found that the growth of so-called KRAS gene-mutated cells (for example, colon cancer cells), for which a high cell growth inhibitory effect was not observed with the use of antibody drugs, could be suitably suppressed, and the present invention was completed. .
  • KRAS gene-mutated cells for example, colon cancer cells
  • one antibody disclosed herein is an artificially produced anti-EGFR antibody that specifically binds to epidermal growth factor receptor (EGFR), and the epitope constitutes the extracellular domain of EGFR.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the heavy chain variable region (VH region) is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a modification in which the specific binding ability is maintained by substituting, deleting and / or adding one to several amino acid sequences to the amino acid sequence.
  • the light chain variable region is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a modification in which the specific binding ability is maintained by substituting, deleting and / or adding one to several amino acid sequences to the amino acid sequence
  • An anti-EGFR antibody having an amino acid sequence hereinafter referred to as “C2 domain-binding anti-EGFR antibody”.
  • Another antibody disclosed herein is an artificially produced anti-EGFR antibody that specifically binds to epidermal growth factor receptor (EGFR), wherein the epitope is an extracellular domain of EGFR In the first ligand binding domain 1 (L1) counted from the N-terminal side of the four subdomains constituting
  • the heavy chain variable region (VH region) is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a modification in which the specific binding ability is maintained by substituting, deleting and / or adding one to several amino acid sequences to the amino acid sequence.
  • the light chain variable region is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a modification in which one to several amino acid sequences are substituted, deleted and / or added to the amino acid sequence to maintain the specific binding ability.
  • An anti-EGFR antibody having an amino acid sequence hereinafter referred to as “L1 domain-binding anti-EGFR antibody”.
  • epitope refers to a binding part of EGFR recognized by a target anti-EGFR antibody and having a high affinity (binding activity).
  • the target anti-EGFR antibody is selected with a higher affinity (specificity) than other subdomains of the extracellular domain.
  • it is a term that means binding to the L1 domain (or C2 domain) by antigen-antibody reaction.
  • the C2 domain-binding anti-EGFR antibody and the L1 domain-binding anti-EGFR antibody prepared by the present inventors are high EGFR-expressing cells including KRAS gene mutant cells (for example, malignant tumor cells such as colon cancer). Proliferation can be suitably suppressed. Therefore, according to the artificial antibody disclosed herein, it is possible to provide an antibody drug having a high effect of suppressing the growth of EGFR high-expressing cells (for example, KRAS gene-mutated cancer cells).
  • One preferable aspect of the antibody disclosed herein is a human type comprising a heavy chain constant region (CH region) and a light chain constant region (CL region) of human IgG in addition to the VH region and the VL region. It is formed in IgG. By adopting a structure of human IgG, it can be used more suitably for patients.
  • CH region heavy chain constant region
  • CL region light chain constant region
  • the present invention also provides a cytostatic agent prepared using the anti-EGFR antibody disclosed herein.
  • the cell growth inhibitor disclosed herein is a cell growth inhibitor (cell growth inhibitor) for suppressing the growth of at least one epidermal growth factor receptor (EGFR) -expressing cell, Antibodies whose characteristics are described in A) and (B), respectively:
  • (A) C2 domain binding anti-EGFR antibody An artificially produced anti-EGFR antibody that specifically binds to EGFR, wherein the epitope is the fourth cysteine counted from the N-terminal side of the four subdomains constituting the extracellular domain of EGFR;
  • the heavy chain variable region (VH region) is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a modification in which the specific binding ability is maintained by substituting, deleting and / or adding one to several amino acid sequences to the amino acid sequence.
  • the light chain variable region is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a modification in which the specific binding ability is maintained by substituting, deleting and / or adding one to several amino acid sequences to the amino acid sequence
  • L1 domain binding anti-EGFR antibody An artificially produced anti-EGFR antibody that specifically binds to EGFR, wherein the first ligand binding is counted from the N-terminal side of four subdomains whose epitope constitutes the extracellular domain of EGFR In domain 1 (L1)
  • the heavy chain variable region is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a modification in which the specific binding ability is maintained by substituting, deleting and / or adding one to several amino acid sequences to the amino acid sequence.
  • the light chain variable region is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a modification in which one to several amino acid sequences are substituted, deleted and / or added to the amino acid sequence to maintain the specific binding ability.
  • the antibody contained in the cytostatic agent comprises a human IgG further comprising a heavy chain constant region (CH region) and a light chain constant region (CL region) of human IgG in addition to the VH region and the VL region. It is formed into IgG.
  • the cytostatic agent disclosed herein by using the above-mentioned C2 domain-binding anti-EGFR antibody and / or L1 domain-binding anti-EGFR antibody whose epitope is different from that of the conventional anti-EGFR antibody as an antibody component, The growth of not only high EGFR-expressing cells but also KRAS gene mutant cells can be suppressed (inhibited). Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a cell growth inhibitor for suppressing the growth of a KRAS gene mutant-type malignant tumor cell as a target for EGFR-expressing malignant tumor cells. .
  • the present invention also relates to a method for suppressing the growth of at least one epidermal growth factor receptor (EGFR) -expressing cell, the C2 domain-binding anti-EGFR antibody and / or the L1 domain-binding anti-antibody disclosed herein.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Provided is a method characterized by using an EGFR antibody (preferably formed in human IgG) and applying the anti-EGFR antibody to a target EGFR-expressing cell.
  • an EGFR antibody preferably formed in human IgG
  • a method for suppressing cell growth a method for suppressing the growth of KRAS gene-mutated malignant tumor cells, where the EGFR-expressing cells are KRAS gene-mutated malignant cells.
  • the present invention provides various artificially designed polynucleotides (for example, plasmids used as expression vectors described later) used for producing the anti-EGFR antibodies disclosed herein by genetic engineering. To do. Typically, it comprises a nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence set forth in at least one of SEQ ID NOs: 1-4 disclosed herein, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence (ie, wherein Artificially designed polynucleotides for expressing peptides comprising any of the disclosed VH or VL region amino acid sequences are provided by the present invention.
  • FIG. 1A is a plasmid map illustrating the outline of the expression plasmid vector “pHIgHzeo”.
  • FIG. 1B is a plasmid map explaining the outline of the expression plasmid vector “pHIgKneo”.
  • FIG. 2 is a view showing a deletion part (left side) of each EGFR extracellular domain deletion mutant peptide obtained in the test example and a part (right side) to which each test antibody binds.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of each test antibody on the growth of the A431 cell line over time as a result of AlamarBlue (registered trademark) assay.
  • FIG. 1A is a plasmid map illustrating the outline of the expression plasmid vector “pHIgHzeo”.
  • FIG. 1B is a plasmid map explaining the outline of the expression plasmid vector “pHIgKneo”.
  • FIG. 2 is a view showing a deletion part (left side) of each
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of each test antibody on the growth of the A549 cell line over time as a result of AlamarBlue (registered trademark) assay.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of each test antibody on the growth of NA cell lines over time as a result of AlamarBlue (registered trademark) assay.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of each test antibody on the growth of the MDA-MB-231 cell line over time as a result of the Alamar Blue® assay.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of different test antibody concentrations (0.1, 1, 10, 100 ⁇ g / mL) on the growth of the A549 cell line as a result of the Alamar Blue (registered trademark) assay.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of different test antibody concentrations (0.1, 1, 10, 100 ⁇ g / mL) on the growth of the A549 cell line as a result of the Alamar Blue (registered trademark) as
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of different test antibody concentrations (0.1, 1, 10, 100 ⁇ g / mL) on the growth of NA cell lines as a result of Alamar Blue (registered trademark) assay.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of different test antibody concentrations (0.1, 1, 10, 100 ⁇ g / mL) on the growth of the SK-OV3 cell line, as a result of the Alamar Blue® assay. is there.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of each test antibody at different addition concentrations (0.1, 1, 10, 100 ⁇ g / mL) on the growth of the HCT-116 cell line, as a result of the Alamar Blue® assay. is there.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of each test antibody at different addition concentrations (0.1, 1, 10, 100 ⁇ g / mL) on the growth of the Caki-2 cell line, as a result of Alamar Blue® assay. is there.
  • an “artificially produced antibody” is different from an antibody produced by a natural immune response in a human or animal body, and is typically produced artificially by genetic engineering techniques.
  • antibody is a term that refers to an immunoglobulin that is typically composed of a heavy chain and a light chain, but a native structure of an immunoglobulin molecule (typically an IgG, eg, a human IgG ), And various fragment antibodies such as Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments.
  • the “antibody” in the present specification includes an antibody molecule that can be formed by a genetic engineering technique.
  • an artificially produced so-called single chain antibody comprising an amino acid sequence constituting a VL region and an amino acid sequence constituting a VH region on a single peptide chain is also included in the “antibody” referred to herein.
  • antibody referred to herein.
  • amino acid residue is a term encompassing the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • modified amino acid sequence for a predetermined amino acid sequence constituting the VH region or VL region means one to several (for example, 1) without impairing the antigen-binding ability of the predetermined amino acid sequence.
  • amino acid sequence formed by substitution, deletion and / or addition (insertion) of amino acid residues For example, sequences generated by so-called conservative amino acid replacement (for example, basic amino acid residues are separated) in which one or several (typically 2 or 3) amino acid residues are conservatively substituted. 1 or several (typically 2 or 3) of a predetermined amino acid sequence, or a sequence in which an acidic amino acid residue is replaced with another acidic amino acid residue) ) Are added (inserted) or deleted sequences, and the like are typical examples included in the modified amino acid sequences referred to in the present specification.
  • conservative amino acid replacement for example, basic amino acid residues are separated
  • amino acid residues are conservatively substituted.
  • Are added (inserted) or deleted sequences, and the like are typical examples included in the modified amino acid sequences referred to in the present specification.
  • polynucleotide is a term indicating a polymer (nucleic acid) in which a plurality of nucleotides are linked by phosphodiester bonds, and is not limited by the number of nucleotides. Various lengths of DNA fragments are encompassed by the polynucleotides herein.
  • artificially designed polynucleotide means that the nucleotide chain (full length) does not exist in nature alone, but is artificially generated by chemical synthesis or biosynthesis (ie, production based on genetic engineering). It refers to a synthesized polynucleotide.
  • recombinant plasmid DNA, recombinant phage DNA and the like containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence disclosed herein are typical examples encompassed by the artificially designed polynucleotides herein.
  • the cytostatic agent provided by the present invention comprises at least one antibody created by the present inventors (ie, C2 domain-binding anti-EGFR antibody and / or L1 domain-binding anti-EGFR antibody), and at least one kind
  • This is a composition characterized by suppressing the proliferation of EGFR-expressing cells, and other ingredients, preparation methods, storage methods, usage methods, etc. as conventional drugs (pharmaceutical compositions containing antibodies) ), And is not particularly limited.
  • physiologically acceptable carriers include physiological saline, PBS and other buffers, Ringer's solution, and the like.
  • the additive include various antibiotics, pH adjusters, antioxidants, chelating agents, dyes, preservatives, various vitamins and enzymes.
  • the present inventor has known a known anti-human EGFR monoclonal from a phage-displayed single-chain antibody library constructed and possessed by the present inventors (refer to the above-mentioned Patent Document 2 for an example of the production of such a library).
  • a plurality of new single-chain antibodies (scFv) having different epitopes from those of conventional anti-EGFR antibodies are selected, and amino acid sequences corresponding to the variable regions of these scFvs and the
  • the present invention has been completed by identifying the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence.
  • one suitable anti-EGFR antibody (C2 domain-binding anti-EGFR antibody) disclosed herein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or a modified amino acid sequence thereof) in the VH region, and / or It is an antibody characterized by having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (or its modified amino acid sequence) in the VL region, and is a novel artificially produced antibody having an epitope in the C2 domain.
  • L1 domain-binding anti-EGFR antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (or a modified amino acid sequence thereof) in the VH region, and / or Alternatively, the antibody is characterized by having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (or a modified amino acid sequence thereof) in the VL region, and is a novel artificially produced antibody having an epitope in the L1 domain.
  • the antibody disclosed here can be easily produced by genetic engineering techniques since the amino acid sequence of the variable region binding to the epitope is clear. For example, it can be sufficiently used as an antibody drug even in the state of a single chain antibody (scFv) obtained from the above-mentioned library, but it is a complete type in order to improve the binding affinity and physical stability in vivo. It is preferable to be formed into an antibody (for example, human IgG).
  • a nucleotide sequence encoding a VH region (VH gene) and a nucleotide sequence encoding a VL region (VL gene) from a plasmid vector containing a nucleotide sequence encoding scFv are used in a general PCR technique. And is introduced into an antibody expression vector (such as a plasmid) having a constant region (CH region and CL region), and an animal such as a predetermined host cell (typically a CHO cell (Chinese Hamster Ovary Cell)). Cell), it can be easily produced.
  • an antibody expression vector such as a plasmid having a constant region (CH region and CL region
  • an animal such as a predetermined host cell (typically a CHO cell (Chinese Hamster Ovary Cell)). Cell
  • the present invention provides a method for producing an anti-EGFR antibody characterized by utilizing nucleotide information (that is, nucleotide sequence) encoding the amino acid sequence of the VH region and / or VL region disclosed herein. It is.
  • the cytostatic agent disclosed herein is derived from Examples described later.
  • KRAS gene-mutant high EGFR-expressing cells for example, metastatic colorectal cancer cells
  • the cell proliferation can be effectively suppressed. Therefore, according to the present invention, at least one C2 domain-binding anti-EGFR antibody and / or L1 domain-binding anti-EGFR antibody (that is, a pharmaceutical composition containing the antibody) disclosed herein is administered to a patient. It is possible to provide a method for controlling a malignant tumor composed of KRAS gene mutant-type high EGFR-expressing cells such as metastatic colorectal cancer.
  • the dosage, administration frequency or mode of administration (oral administration, subcutaneous injection, intravenous injection, enemas, etc.) of the cytostatic agent disclosed herein to the patient is the state of the subject patient (symptom).
  • the form of the administration destination (malignant tumor), the shape of the cytostatic (pharmaceutical composition) used, the form of the antibody (eg, scFv or fully human IgG), the concentration of the antibody contained is a design matter that can vary depending on the presence or absence of subcomponents and their concentrations.
  • a person skilled in the art can prepare an appropriate form of a cytostatic agent based on pharmacological, clinical, physiological, or hygienic knowledge in addition to antibody engineering knowledge, which is a well-known technique, depending on circumstances.
  • a cell growth inhibitor in an appropriate form can be administered (added) in an appropriate amount to a predetermined patient's body or a tissue or cell culture removed from the patient. This in itself does not characterize the present invention and will not be described in further detail.
  • the obtained scFv gene is amplified by PCR using predetermined primers, and the nucleotide sequence of the VH region and the amino acid sequence encoded by the sequence, and the nucleotide sequence of the VL region and the amino acid sequence encoded by the sequence are identified. did.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence information about the four obtained antibody samples are as follows.
  • human IgG was produced by a gene recombination technique.
  • the expression plasmid vector “pHIgHzeo” shown in the plasmid map of FIG. 1A and the expression plasmid vector “pHIgKneo” shown in the plasmid map of FIG. 1B were used.
  • the complete nucleotide sequence of pHIgHzeo is shown in SEQ ID NO: 17, and the complete nucleotide sequence of pHIgKneo is shown in SEQ ID NO: 18.
  • SEQ ID NO: 17 The complete nucleotide sequence of pHIgHzeo is shown in SEQ ID NO: 17
  • SEQ ID NO: 18 As shown in the plasmid map of FIG.
  • pH IgHzeo has a gene (CH1 to CH3) encoding the heavy chain constant region (CH region) of human IgG1.
  • pHIgKneo has a gene (CK1) encoding a light chain ( ⁇ chain) constant region (CL region) of human IgG1.
  • these plasmid vectors have two restriction enzyme Esp3I cleavage sites (the recognition sites for Esp3I are agagagg at positions 619 to 625 and gtctcg at positions 2336 to 2341 of SEQ ID NO: 17).
  • VH encoding gene a nucleotide sequence encoding the target VH region amino acid sequence
  • VL encoding gene a nucleotide sequence encoding the VL region amino acid sequence
  • each of the obtained recombinant expression vectors was introduced into a general competent cell, E. coli TOP10 competent cell, and 10% added with zeocin or kanamycin to a concentration of 50 ⁇ g / mL. Transformants were selected on sucrose-containing SOB medium plates. Subsequently, in order to obtain a positive clone in which the target gene (insert) is correctly infused, that is, VH recombinant pHIgHzeo and VL recombinant pHIgKneo, pFUSEseq-f represented by SEQ ID NO: 19 is used for the two sets of primers, ie, the VH side.
  • ⁇ Test Example 2 Confirmation of epitope existing region>
  • FIG. 2 The left side of FIG. 2 is a diagram showing a deletion portion of each EGFR extracellular domain deletion mutant peptide.
  • the portion indicated by ⁇ in this figure (the number indicates the position and range of the deleted amino acid residue when counted from the N-terminus) is the deletion portion.
  • each of the EGFR extracellular domain peptides constructed in this test example has a signal sequence (SS) on the N-terminal side and an EGFR transmembrane domain (TM) on the C-terminal side. Furthermore, it is constructed so that V5-tag is added to the C-terminal side.
  • SS signal sequence
  • TM transmembrane domain
  • the deletion subdomain on the left side of FIG. 2 corresponding to the position indicated by + in each test antibody column on the right side of FIG. 2 is the binding portion of the antibody. That is, as is clear from the results shown in FIG. 2, the binding part (epitope) of hIgG45 obtained in Test Example 1 is in the C2 domain, the binding part (epitope) of hIgG38 is in the L1 domain, and the binding part of hIgG40 It was confirmed that (Epitope) is in the C1 domain and the binding part (epitope) of hIgG42 is in the C2 domain.
  • Example 3 Evaluation of cell growth suppression (inhibition) performance of each anti-EGFR antibody (1)> Next, each obtained antibody was supplied to various cultured cells, and its cell growth suppression (inhibition) performance was evaluated in an in vitro cell culture test.
  • the cell lines (cell lines) used are 4 types of known A431, A549, NA, and MDA-MB-231. That is, A431 is a human squamous cell carcinoma cell line, A549 is a human squamous lung cancer cell line, NA is a human oral squamous cell carcinoma cell line, and MDA-MB-231 is a human breast cancer cell line.
  • Almar Blue registered trademark: an invitrogen product
  • an antibody at a predetermined concentration was added to the cell line, and a predetermined culture time (24 hours, The degree of cell proliferation after 48 hours and 72 hours) was measured by the OD value of the dye. That is, the cells were seeded in each well of a 96-well plate containing DMEM medium containing 10% FCS so that the cell concentration was 1 ⁇ 10 4 cells / well, and maintained at 37 ° C., 5% CO 2 until the middle of logarithmic growth. It was cultured for 2 days under 2 conditions.
  • the medium was replaced with FCS-free DMEM medium (without phenol red in order to eliminate the influence of the medium color), and the culture was continued overnight.
  • the medium was replaced with a DMEM medium containing 0.1% FCS, and either of the test antibodies was added at a predetermined concentration (here, 0.1 ⁇ g / mL or 10 ⁇ g / mL), and the culture was continued.
  • a predetermined concentration here, 0.1 ⁇ g / mL or 10 ⁇ g / mL
  • an antibody-free product and a B4G7 antibody added at the same concentration were provided.
  • the dye Alamar Blue registered trademark
  • FIG. 3 A431 cell line
  • FIG. 4 A549 cell line
  • FIG. 5 NA cell line
  • FIG. 6 MDA-MB-231 cell line
  • IgG45 and IgG38 are markedly suppressed in cell proliferation (A431 cell line, A549 cell line, NA cell line expressing EGFR at a relatively high rate ( Inhibition) effect was observed.
  • a high cell growth suppression (inhibition) effect was also observed for the A549 cell line derived from a KRAS gene mutant malignant tumor cell.
  • IgG42 and IgG45 seem to bind to the same site (ie, C2 domain), the responses to the cell lines differed as described above. It is understood that the actual epitope is at two different narrower sites in the C2 domain. This is because IgG45 and / or IgG38 is effective against a malignant tumor of KRAS gene mutation type such as A549, which was not effective with a conventional anti-EGFR antibody (for example, B4G7 which is a comparative control of this test example). It shows that it can act as an antibody drug.
  • ⁇ Test Example 4 Evaluation of cell growth suppression (inhibition) performance of each anti-EGFR antibody (2)> Next, the concentration (dose) dependence (Dose) on the cell growth inhibitory ability of the test antibody In order to examine (Dependency), the same Alamar Blue (registered trademark) assay as described above was performed, and the cell viability (%) at each antibody addition concentration (0.1, 1, 10, 100 ⁇ g / mL) was examined.
  • the cell lines used are those of SK-OV3 (human ovarian tumor cell line), HCT-116 (human colorectal cancer cell line), Caki-2 (human renal cancer cell line) in addition to A549 and NA described above. Each cell line was used.
  • FIG. 7 A549 cell line
  • FIG. 8 NA cell line
  • FIG. 9 SK-OV3 cell line
  • FIG. 10 HCT-116 cell line
  • FIG. 11 Caki-2 cell line.
  • IgG45 and IgG38 express EGFR at a relatively high rate and significantly suppress cell growth (inhibition) against malignant tumor cells in which the KRAS gene is mutated. It was recognized that the effect can be stably exhibited from a low concentration (typically a concentration of 1 ⁇ g / mL or more, particularly a concentration of 10 ⁇ g / mL or more).
  • Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments obtained by general enzyme treatment from the above-mentioned fully human IgG45 and fully human IgG38 are also typical examples included in the antibody of the present invention disclosed herein.
  • the anti-EGFR antibody disclosed herein has a high cell growth suppression (inhibition) activity particularly against malignant tumor cells (high EGFR expressing cells) in which the KRAS gene is mutated.
  • the cell growth inhibitor containing can be used as a composition for pharmaceutical use such as an anticancer agent.
  • SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 Synthesized peptide SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 Artificial IgG heavy chain variable region SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 Artificial IgG light chain variable region SEQ ID NO: 17, 18 Plasmid DNA SEQ ID NO: 19-22 Primer

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Abstract

　本発明によって提供される細胞増殖抑制剤は、抗体成分として　ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのシステイン－リッチサブドメイン２（Ｃ２ドメイン）にあることを特徴とする抗ＥＧＦＲ抗体、及び／又は、リガンド結合ドメイン１（Ｌ１ドメイン）にあることを特徴とする抗ＥＧＦＲ抗体を含む。

Description

抗体およびその利用
　本発明は、人工的に設計された抗体とその利用に関する。詳しくは、ヒト細胞の上皮増殖因子受容体の細胞に特異的に結合する人工抗体とその利用に関する。
　なお、本出願は２０１０年６月４日に出願された日本国特許出願２０１０－１２８６２３号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
　上皮増殖因子（Epidermal Growth Factor：上皮成長因子ともいう。以下「ＥＧＦ」と記載する。）が細胞の表面に存在するレセプター（受容体）、即ち上皮増殖因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor：上皮成長因子受容体ともいう。以下「ＥＧＦＲ」と記載する。）の細胞外ドメインにリガンドとして結合することによって、細胞の成長や増殖が促進することが知られている。特に、ＥＧＦＲは種々の腫瘍細胞表面において過剰に発現しており、かかる腫瘍の増殖や悪性化に深く関わっていることが明らかになっている。
　このため、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックしてＥＧＦＲの関与するシグナル伝達を遮断し、その結果として悪性腫瘍細胞の増殖を抑えることのできる薬剤、特にＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（抗ＥＧＦＲ抗体）を主体とする抗体医薬（抗腫瘍剤）の開発が行われている。例えば、ＥＧＦと競合的にＥＧＦＲに結合し、それによってＥＧＦＲの活性化やダイマー化を阻み得る抗ＥＧＦＲ抗体として、マツズマブ（ＭＡＴＵＺＵＭＡＢ）やセツキシマブ（ＣＥＴＵＸＩＭＡＢ）が知られており、大腸癌等の悪性腫瘍細胞の増殖抑制（増殖阻害）に関して一定の効果をあげている。特許文献１には、従来のこの種の抗体の一例とその生産例が記載されている。
日本国特許公開公報第２００６－２５７９４号 国際公開第ＷＯ２００３／０４４１９８号
　しかしながら、上述したような従来の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば上記セツキシマブ）は、ある種の大腸がんのようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞（がん細胞）に対しては効果（細胞増殖抑制作用）が極めて低く実質的に無効であることが報告されている。従って、このようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞に対しても細胞増殖抑制効果の高い抗体医薬の開発が望まれている。
　そこで、本発明は、かかる従来の課題を解決すべく創出されたものであり、ＥＧＦＲを高率に発現する細胞であって例えば従来の抗体医薬が芳しい効果を上げられなかったＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞に対しても、好ましい細胞増殖抑制効果を奏する新たな細胞増殖抑制剤（細胞増殖阻害剤）の提供を目的とする。また、そのような細胞増殖抑制剤の成分として用いられる新たな抗ＥＧＦＲ抗体の創出を他の目的とする。また、本発明は、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体を使用することにより、目的とするＥＧＦＲ発現細胞（特にはＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞）の増殖を抑制する（阻害する）方法の提供を他の目的とする。
　ヒトの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン（典型的には６２１アミノ酸残基から構成される。）は、さらに４つのサブドメイン、即ち、２４個のアミノ酸残基からなる分泌シグナル配列に続いてアミノ酸配列のＮ末端側から
（１）．「リガンド結合サブドメイン１（以下「Ｌ１ドメイン」という。：典型的には、上記シグナル配列に続くＮ末端から第２５番目～第１８９番目までの１６５アミノ酸残基からなるドメイン）」、
（２）．「システインリッチサブドメイン１（以下「Ｃ１ドメイン」という。：典型的には、上記Ｌ１ドメインに続く第１９０番目～第３３３番目までの１４４アミノ酸残基からなるドメイン）」、
（３）．「リガンド結合サブドメイン２（以下「Ｌ２ドメイン」という。：典型的には、上記Ｃ１ドメインに続く第３３４番目～第５０５番目までの１７２アミノ酸残基からなるドメイン）」、
（４）．「システインリッチサブドメイン２（以下「Ｃ２ドメイン」という。：典型的には、上記Ｌ２ドメインに続く第５０６番目～第６４５番目までの典型的には１４０アミノ酸残基からなるドメイン）」、
　の順に並ぶ４つのサブドメインから構成されているところ、上記特許文献１に記載されているような従来の抗ＥＧＦＲ抗体は、主として上記（３）のＬ２ドメインに結合する性質を有する。
　本発明者は、保有するファージライブラリー由来であり、従来のものとはエピトープが異なる抗ＥＧＦＲ抗体を人為的に作製し、得られた幾つかの抗ＥＧＦＲ抗体の単独又は組合せの使用により、従来は抗体医薬の使用では高い細胞増殖抑制効果が認められなかった所謂ＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞（例えば大腸がん細胞）の増殖を好適に抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、ここで開示される一つの抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン－リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあり、
　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする抗ＥＧＦＲ抗体（以下「Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体」という。）である。
　また、ここで開示される他の一つの抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあり、
　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする抗ＥＧＦＲ抗体（以下「Ｌ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体」という。）である。
　ここで「エピトープ」とは、対象とする抗ＥＧＦＲ抗体が認識するＥＧＦＲの結合部分であって、高い親和性（結合活性）を有する部分をいう。従って、例えば「エピトープがＬ１ドメイン（或いはＣ２ドメイン）にある」という場合は、対象とする抗ＥＧＦＲ抗体が、細胞外ドメインの他のサブドメインと比較して、高い親和性（特異性）をもって選択的に当該Ｌ１ドメイン（或いはＣ２ドメイン）に抗原抗体反応により結合することを意味する用語である。
　本発明者により作製された上記Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体ならびにＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体は、ＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞（例えば大腸がん等の悪性腫瘍細胞）を包含する高ＥＧＦＲ発現細胞の増殖を好適に抑制することができる。従って、ここで開示される上記人工抗体によると、ＥＧＦＲ高発現細胞（例えばＫＲＡＳ遺伝子変異型のがん細胞）の増殖を抑制する効果の高い抗体医薬を提供することができる。
　ここで開示される抗体として好ましい一態様は、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含む、ヒト型ＩｇＧに形成されていることを特徴とする。ヒト型ＩｇＧの構成とすることによって患者に対してより好適に使用することができる。
　また、本発明は、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体を使用して調製される細胞増殖抑制剤を提供する。
　即ち、ここで開示される細胞増殖抑制剤は、少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖を抑制するための細胞増殖抑制剤（細胞増殖阻害剤）であり、以下の（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ特徴を記載した抗体：
（Ａ）Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体：
　ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン－リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあり、
　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
（Ｂ）Ｌ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体：
　ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあり、
　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
　のうちのいずれか一方若しくは両方の抗体を含む。また、典型的には、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む。
　好ましくは、細胞増殖抑制剤に含まれる抗体は、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含むヒト型ＩｇＧに形成されている。
　ここで開示される細胞増殖抑制剤によると、エピトープが従来の抗ＥＧＦＲ抗体とは異なる上記Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体を抗体成分とすることにより、一般的な高ＥＧＦＲ発現細胞のみならず、ＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞の増殖を抑制（阻害）することができる。
　従って、本発明によると、ＥＧＦＲ発現細胞としてＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞を対象とする、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための細胞増殖抑制剤を提供することができる。
　また、本発明は、少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖を抑制する方法であって、ここで開示されるＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体（好ましくはヒト型ＩｇＧに形成されているもの）を使用し、当該抗ＥＧＦＲ抗体を対象とするＥＧＦＲ発現細胞に付与することを特徴とする方法を提供する。
　かかる細胞増殖抑制方法の好適な一態様として、ＥＧＦＲ発現細胞がＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞であり、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法が挙げられる。
　また、本発明は、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体を遺伝子工学的に製造するために使用される人為的に設計された種々のポリヌクレオチド（例えば後述する発現ベクターとして使用されるプラスミド）を提供する。典型的には、ここで開示される配列番号１～４のうちの少なくとも一つの配列番号に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列（即ち、ここで開示される何れかのＶＨ領域またはＶＬ領域を構成するアミノ酸配列）を備えるペプチドを発現するために人為的に設計されたポリヌクレオチドが本発明によって提供される。
図１Ａは、発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＨｚｅｏ」の概要を説明するプラスミドマップである。 図１Ｂは、発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＫｎｅｏ」の概要を説明するプラスミドマップである。 図２は、試験例で得られた各ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドの欠失部分（左側）と、各供試抗体の結合する部分（右側）を示した図である。 図３は、時間経過に伴うＡ４３１細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamarBlue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図４は、時間経過に伴うＡ５４９細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamarBlue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図５は、時間経過に伴うＮＡ細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamarBlue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図６は、時間経過に伴うＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図７は、Ａ５４９細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図８は、ＮＡ細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図９は、ＳＫ－ＯＶ３細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図１０は、ＨＣＴ－１１６細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。 図１１は、Ｃａｋｉ－２細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
　以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば遺伝子組み換え技術やタンパク質（抗体）の精製、或いはバイオアッセイに関する一般的事項）は、細胞工学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
　本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
　また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
　本明細書において「人為的に製造された抗体」とは、ヒト又は動物の体内における自然な免疫反応により産生された抗体とは異なり、典型的には遺伝子工学的手法により人為的に製造された抗体をいう。
　ここで「抗体」とは、典型的には重鎖と軽鎖とから構成される免疫グロブリンを示す用語であるが、ネイティブな構造の免疫グロブリン分子（典型的にはＩｇＧ、例えばヒト型のＩｇＧ）の他、種々のフラグメント抗体、例えばＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含する。
　また、本明細書においての「抗体」は、遺伝子工学的手法によって形成され得る抗体分子を包含する。例えば、単一のペプチド鎖上にＶＬ領域を構成するアミノ酸配列とＶＨ領域を構成するアミノ酸配列とを備える人為的に製造されたいわゆる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）もここでいう「抗体」に包含される。
　また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
　また、本明細書において上記ＶＨ領域若しくはＶＬ領域を構成する所定のアミノ酸配列について「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する抗原結合能を損なうことなく、１～数個（例えば１個又は２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列や酸性アミノ酸残基が別の酸性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。
　また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。
　また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。例えば、ここで開示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドＤＮＡ、組換えファージＤＮＡ等は、本明細書における人為的に設計されたポリヌクレオチドに包含される典型例である。
　本発明によって提供される細胞増殖抑制剤は、本発明者によって創出された少なくとも１種の抗体（即ちＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体）を含み、少なくとも１種のＥＧＦＲ発現細胞の増殖を抑えることにより特徴付けられる組成物であり、その他の含有成分や薬剤としての調製法、保存法、使用法、等は従来の抗体医薬（抗体を含む薬学上の組成物）と同様でよく、特に限定されない。例えば、薬学的に許容される担体として、生理食塩水、ＰＢＳその他のバッファー類、リンゲル溶液等が挙げられる。また、添加剤として、各種の抗生物質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、キレート剤、色素、保存料、各種のビタミンや酵素等が挙げられる。
　本発明者は、本発明者らが構築・保有するファージ提示型の単鎖抗体ライブラリー（この種のライブラリーの製造例は上記特許文献２が参考になる。）から既知の抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体をいわゆるガイド分子として使用したスクリーニングを行うことによって、従来の抗ＥＧＦＲ抗体とはエピトープの異なる新たな単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を複数種類選抜し、それらｓｃＦｖの可変領域に対応するアミノ酸配列ならびに該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を同定することによって本発明を完成するに至った。
　即ち、ここで開示される一つの好適な抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体）は、ＶＨ領域に配列番号１に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、及び／又は、ＶＬ領域に配列番号２に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、によって特徴付けられる抗体であり、エピトープをＣ２ドメインに有する新規な人為的に作製された抗体である。
　また、ここで開示される他の一つの好適な抗ＥＧＦＲ抗体（Ｌ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体）は、ＶＨ領域に配列番号３に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、及び／又は、ＶＬ領域に配列番号４に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、によって特徴付けられる抗体であり、エピトープをＬ１ドメインに有する新規な人為的に作製された抗体である。
　ここで開示される抗体は、エピトープに結合する可変領域のアミノ酸配列が明らかであるため、遺伝子工学的手法によって容易に製造することができる。
　例えば、上記ライブラリーから得られた単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の状態でも抗体医薬として十分使用することができるが、生体内での結合親和性の向上や物理的安定性を付与するために完全型の抗体（例えばヒト型ＩｇＧ）に形成されることが好ましい。後述する実施例に示すように、ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターからＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列（ＶＨ遺伝子）とＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を（ＶＬ遺伝子）を一般的なＰＣＲ技法を用いて増幅し、これを定常領域（ＣＨ領域及びＣＬ領域）を有する抗体発現ベクター（プラスミド等）に導入し、所定の宿主細胞（典型的にはＣＨＯ細胞（Chinese Hamster Ovary Cell）等の動物細胞）で発現させることにより、容易に製造することができる。
　従って、本発明は、ここで開示されるＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド情報（即ちヌクレオチド配列）を利用することを特徴とする、抗ＥＧＦＲ抗体の製造方法を提供するものである。
　ここで開示される細胞増殖抑制剤は、本発明者が創出した少なくとも一種のＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体を抗体成分として使用する結果、後述する実施例からも明らかなように、従来のこの種の抗体が無効であったＫＲＡＳ遺伝子変異型の高ＥＧＦＲ発現細胞（例えば転移性大腸癌の細胞）に対してもＫＲＡＳ遺伝子無変異型の高ＥＧＦＲ発現細胞と同様に、その細胞増殖を効果的に抑制することができる。
　従って、本発明によると、ここで開示される少なくとも一種のＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体（即ち該抗体を含む薬剤組成物）を患者に投与することを特徴とする、転移性大腸癌のようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の高ＥＧＦＲ発現細胞からなる悪性腫瘍を制御する方法を提供することができる。
　なお、ここで開示される細胞増殖抑制剤の患者への投与量や投与頻度或いは投与の態様（経口投与、皮下注射、静脈内注射、灌腸、等）は、対象とする患者（症状）の状態や、投与先（悪性腫瘍）の形態ならびに使用する細胞増殖抑制剤（薬剤組成物）の形状、抗体の形態（例えばｓｃＦｖか或いは完全ヒト型ＩｇＧかなど）、含まれる抗体の濃度、抗体以外の副成分の有無やその濃度、等によって適宜異なり得る設計事項である。当業者は事情に応じて周知技術である抗体エンジニアリングの知見に加えて薬学上、臨床医学上、生理学上或いは衛生学上の知見に基づいて、適切な形態の細胞増殖抑制剤を調製し得、さらに所定の患者の体内或いは患者から取り出した組織や細胞の培養物に適切な形態の細胞増殖抑制剤（抗体医薬）を適切な量で投与（添加）することができる。このこと自体は、本発明を特徴付けるものではないため、これ以上の詳細な説明は省略する。
　以下の実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明を以下の実施例に記載のものに限定することを意図したものではない。
＜試験例１：抗ＥＧＦＲ抗体の製造＞
　予め用意してあったファージ提示型単鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリーに対し、発明者らが創出したマウス由来の抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体であって現在では市販もされている「Ｂ４Ｇ７」モノクローナル抗体をガイド分子とするスクリーニングを実施し、ガイド分子の近傍に結合するｓｃＦｖ提示ファージを選択的に回収し、最終的には計４つの新規な抗ＥＧＦＲ単鎖抗体（ｓｃＦｖ）と該抗体をコードする遺伝子が得られた。
　得られたｓｃＦｖ遺伝子を所定のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、ＶＨ領域のヌクレオチド配列と該配列にコードされるアミノ酸配列、ならびにＶＬ領域のヌクレオチド配列と該配列にコードされるアミノ酸配列を同定した。
　得られた４つの抗体試料（サンプルＮｏ．４５、Ｎｏ．３８、Ｎｏ．４０、Ｎｏ．４２とする。）についてのアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列情報は以下のとおり。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に、上記得られた各サンプルｓｃＦｖの配列情報を利用して、ヒト型ＩｇＧを遺伝子組換え技法により作製した。
　図１Ａのプラスミドマップに示す発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＨｚｅｏ」ならびに図１Ｂのプラスミドマップに示す発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＫｎｅｏ」を使用した。ｐＨＩｇＨｚｅｏの全ヌクレオチド配列を配列番号１７に示し、ｐＨＩｇＫｎｅｏの全ヌクレオチド配列を配列番号１８に示す。
　図１Ａのプラスミドマップに示すように、ｐＨＩｇＨｚｅｏは、ヒト型ＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ領域）をコードする遺伝子（ＣＨ１～ＣＨ３）を有している。他方、図１Ｂのプラスミドマップに示すように、ｐＨＩｇＫｎｅｏは、ヒト型ＩｇＧ１の軽鎖（κ鎖）定常領域（ＣＬ領域）をコードする遺伝子（ＣＫ１）を有している。これらプラスミドベクターは、図示されるように、２箇所の制限酵素Ｅｓｐ３Ｉの切断サイト（Ｅｓｐ３Ｉの認識部位は、配列番号１７の第６１９位～第６２５位のａｇａｇａｃｇと第２３３６位～第２３４１位のｇｔｃｔｃｇ、配列番号１８の第６２２位～第６２７位のｇａｇａｃｇと第２３１９位～第２３２４位のｇｔｃｔｃｇに認められる。）を有しており、当該Ｅｓｐ３Ｉで処理することにより開裂した部位（切断サイト）に、目的とするＶＨ領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（以下「ＶＨコード遺伝子」という。）あるいは、ＶＬ領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（以下「ＶＬコード遺伝子」という。）を挿入することができる。
　具体的には、Ｅｓｐ３Ｉで酵素処理した各プラスミドベクター５０ｎｇに対して、いずれかのサンプルＮｏ．のＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子をそれぞれ１０ｎｇ添加し、市販(Clontech社製品）のIn-Fusion Advantage PCR Cloning Kitを製品マニュアルに準じて使用することにより、目的のＶＨコード遺伝子（即ち、配列番号９、１１、１３、１５に示すいずれかのヌクレオチド配列）がＥｓｐ３Ｉ切断サイトに組み込まれた組換えｐＨＩｇＨｚｅｏを得た。同様に、目的のＶＬコード遺伝子（即ち、配列番号１０、１２、１４、１６に示すいずれかのヌクレオチド配列）がＥｓｐ３Ｉ切断サイトに組み込まれた組換えｐＨＩｇＫｎｅｏを得た。
　次いで、得られた各組換え発現ベクターを一般的なコンピテントセルである大腸菌ＴＯＰ１０コンピテントセルに導入し、５０μｇ／ｍＬ濃度となるようにゼオシン（Zeocin）若しくはカナマイシン（Kanamycin）を添加した１０％シュクロース含有ＳＯＢ培地プレート上で形質転換体をセレクトした。
　次いで、目的の遺伝子（インサート）が正しくインフュージョンされたポジティブクローン、即ちＶＨ組換えｐＨＩｇＨｚｅｏとＶＬ組換えｐＨＩｇＫｎｅｏとを得るべく、２セットのプライマー、即ちＶＨ側については配列番号１９で示すｐＦＵＳＥｓｅｑ－ｆと配列番号２０で示すＣＨｓｅｑ－ｒとのセット、ＶＬ側については配列番号２１で示すＩｇＫｓｓ－ｆと配列番号２２で示すＣｋｓｅｑ－ｒとのセットを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートチェックを行った。
　次いで、正しくインサートがインフュージョンされたポジティブクローン（大腸菌ＴＯＰ１０）を単離し、１０％シュクロース含有ＳＯＢ培地にて増殖させた。
　こうして得られた組換え発現ベクターのうち、対象とする各サンプル（Ｎｏ．４５、３８、４０、４２）に正しく対応するＶＨ組換えｐＨＩｇＨｚｅｏとＶＬ組換えｐＨＩｇＫｎｅｏとを等量混合したものを市販（invitrogen社製品）のFreeStyle（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞に導入し、常法に基づいて当該細胞を培養し、二価抗体である完全ヒト型ＩｇＧ（ｈＩｇＧ）を製造した。以下、上記４種のｓｃＦｖサンプルにそれぞれ対応して得られたＩｇＧを、上記サンプル番号を引用してｈＩｇＧ４５、ｈＩｇＧ３８、ｈＩｇＧ４０、ｈＩｇＧ４２とする。
＜試験例２：エピトープ存在領域の確認＞
　上記得られた４種の人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体（ヒト型ＩｇＧ）のＥＧＦＲの結合部分について調べた。
　即ち、適当なプライマーを用いたＰＣＲ技法により、ＥＧＦＲの細胞外ドメインのうちの上記４つのサブドメイン（Ｌ１、Ｃ１、Ｌ２、Ｃ２）の何れかを欠失させたＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドをコードする遺伝子を計４種類作製した。また、欠失なしのＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドをコードする遺伝子も作製した。
　かかる遺伝子を組み込んだ発現ウイルスベクターを構築し、ＢＪ細胞をトランスフェクトすることにより、上記ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドあるいは欠失なしのＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドを発現するＢＪ細胞を得た。
　図２の左側は、各ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドの欠失部分を示す図である。この図のΔで示す部位（数字はＮ末端から数えたときの欠失アミノ酸残基の位置と範囲を示す）が欠失部分である。なお、図示されるように、本試験例で構築したＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドは何れもＮ末端側にシグナル配列（ＳＳ）を有し且つＣ末端側にＥＧＦＲの膜貫通ドメイン（ＴＭ）を有すると共にさらにそのＣ末端側にＶ５－ｔａｇが付与されるように構築されている。
　而して、ＢＪ細胞で発現された上記ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドあるいは欠失なしのＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドを使用し、試験例１で得られたｈＩｇＧ４５、ｈＩｇＧ３８、ｈＩｇＧ４０、ｈＩｇＧ４２、更に比較対象として市販の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である「Ｂ４Ｇ７」及び「セツキシマブ」を用いて一般的なウェスタンブロット解析を行った。
　本ウェスタンブロットにおける供試抗体の各供試ペプチドに対する結合能の対比解析、即ち細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのどのサブドメインが欠失した場合に結合力を失うかの解析によって、図２の右側に示すように、各供試抗体の結合する部分が明らかとなった。図２の右側における各供試抗体の欄の＋で示す位置に対応する図２左側の欠失サブドメインが当該抗体の結合部分である。
　即ち、図２に示す結果から明らかなように、試験例１で得られたｈＩｇＧ４５の結合部分（エピトープ）はＣ２ドメインにあり、ｈＩｇＧ３８の結合部分（エピトープ）はＬ１ドメインにあり、ｈＩｇＧ４０の結合部分（エピトープ）はＣ１ドメインにあり、そしてｈＩｇＧ４２の結合部分（エピトープ）はＣ２ドメインにあることが確認された。
＜試験例３：各抗ＥＧＦＲ抗体の細胞増殖抑制（阻害）性能の評価（１）＞
　次に、得られた各抗体を種々の培養細胞に供給し、その細胞増殖抑制（阻害）性能をインビトロの細胞培養試験において評価した。使用したセルライン（細胞株）は、いずれも公知のＡ４３１、Ａ５４９、ＮＡ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の４種である。即ち、Ａ４３１はヒト扁平上皮がん細胞株、Ａ５４９はヒト扁平上皮肺がん細胞株、ＮＡはヒト口腔扁平上皮がん細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はヒト乳がん細胞株である。
　具体的には、細胞増殖測定用色素である「Alamar Blue（登録商標）：invitrogen社製品」を使用して、上記細胞株に対して所定濃度の抗体を添加し、所定培養時間（２４時間、４８時間、７２時間）経過した後の細胞増殖の程度を上記色素のＯＤ値で測定した。
　即ち、１×１０４セル／ウェルの細胞濃度となるように１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートの各ウェルに細胞を播種し、対数増殖中期になるまで３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した。次いでＦＣＳフリーＤＭＥＭ培地（培地の色による影響をなくすためにフェノールレッドを含まないもの）に交換し、さらに一晩培養を継続した。次いで、０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に交換するとともに、所定濃度（ここでは０．１μｇ／ｍＬ若しくは１０μｇ／ｍＬ）で供試抗体のいずれかを添加し、培養を継続した。比較対照として抗体無添加のものと、上記Ｂ４Ｇ７抗体を同濃度で添加したものを設けた。また、色素Alamar Blue（登録商標）は、ウェルあたり最終濃度１０％となるように添加しておいた。
　抗体添加後、２４時間、４８時間そして７２時間経過後に、それぞれ、一般的な分光光度計を用いて５７０ｎｍと６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を、図３（Ａ４３１細胞株）、図４（Ａ５４９細胞株）、図５（ＮＡ細胞株）、図６（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株）に示す。これらのグラフから明らかなように、供試抗体のうち、ＩｇＧ４５とＩｇＧ３８については、ＥＧＦＲを比較的高率に発現するＡ４３１細胞株、Ａ５４９細胞株、ＮＡ細胞株に対して顕著な細胞増殖抑制（阻害）効果が認められた。特にＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞由来のＡ５４９細胞株に対しても高い細胞増殖抑制（阻害）効果が認められた。図２に示すように、ＩｇＧ４２とＩｇＧ４５は、見かけ上では同じ部位（即ちＣ２ドメイン）に結合するものであるのに、上述のように細胞株に対する反応が異なったのは、ＩｇＧ４２とＩｇＧ４５それぞれの実際のエピトープがＣ２ドメインにおける２つの異なるより狭い部位にあることによると解される。このことは、従来の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば本試験例の比較対照であるＢ４Ｇ７）では効果が認められなかったＡ５４９のようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍に対してＩｇＧ４５及び／又はＩｇＧ３８が有効な抗体医薬として作用し得ることを示すものである。
＜試験例４：各抗ＥＧＦＲ抗体の細胞増殖抑制（阻害）性能の評価（２）＞
　次に供試抗体の細胞増殖抑制能に関する濃度（用量）依存性（Dose
Dependency）を調べるため、上記と同様のAlamar Blue（登録商標）アッセイを行い、各抗体の添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における細胞生存率（％）を調べた。
　使用したセルラインは上述のＡ５４９、ＮＡに加えて新たにＳＫ－ＯＶ３（ヒト卵巣腫瘍細胞株）、ＨＣＴ－１１６（ヒト大腸がん細胞株）、Ｃａｋｉ－２（ヒト腎がん細胞株）の各細胞株を使用した。
　なお、吸光度測定は、上記試験例３で説明した培養条件で所定量の抗体を添加後、７２時間経過した時点で行った。細胞生存率（％）は、以下の式：
生存率（％）＝［（抗体無添加処理の標準ＯＤ値－ＩｇＧ添加処理の標準ＯＤ値）／抗体無添加処理の標準ＯＤ値］×１００
　結果を図７（Ａ５４９細胞株）、図８（ＮＡ細胞株）、図９（ＳＫ－ＯＶ３細胞株）、図１０（ＨＣＴ－１１６細胞株）、図１１（Ｃａｋｉ－２細胞株）に示す。
　これらのグラフから明らかなように、供試抗体のうち、ＩｇＧ４５とＩｇＧ３８については、ＥＧＦＲを比較的高率に発現し、ＫＲＡＳ遺伝子が変異した悪性腫瘍細胞に対して顕著な細胞増殖抑制（阻害）効果を低濃度（典型的には１μｇ／ｍＬ以上の濃度、特に１０μｇ／ｍＬ以上の濃度）から安定して発揮させ得ることが認められた。
　以上の試験例により、本発明によって提供される有用な抗ＥＧＦＲ抗体（即ちＩｇＧ４５ならびにＩｇＧ３８）の好適なものを説明したが、この形態に限られない。例えば、上記完全ヒト型ＩｇＧ４５や完全ヒト型ＩｇＧ３８から一般的な酵素処理で得られるＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントもここで開示される本発明の抗体に包含される典型例である。
　上述のように、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体は、特にＫＲＡＳ遺伝子が変異した悪性腫瘍細胞（高ＥＧＦＲ発現細胞）に対して高い細胞増殖抑制（阻害）活性を有しているため、該抗体を含む細胞増殖抑制剤は、例えば抗がん剤等の医薬用途の組成物として利用することができる。
配列番号１～配列番号８　合成されたペプチド
配列番号９、１１、１３、１５　人工ＩｇＧの重鎖可変領域
配列番号１０、１２，１４、１６　人工ＩｇＧの軽鎖可変領域
配列番号１７、１８　プラスミドＤＮＡ
配列番号１９～２２　プライマー

Claims (9)

  1. 　少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖を抑制するための細胞増殖抑制剤であって、
    （１）以下の（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ特徴を記載した抗体：
    　（Ａ）ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン－リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあり、
    　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
    　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
    　（Ｂ）ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあり、
    　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
    　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
    　のうちのいずれか一方若しくは両方の抗体と、
    （２）少なくとも１種の薬学的に許容される担体と、
    を含むことを特徴とする、細胞増殖抑制剤。
  2. 　前記抗体は、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含むヒト型ＩｇＧに形成されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
  3. 　前記ＥＧＦＲ発現細胞がＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞である、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための請求項１又は２に記載の細胞増殖抑制剤。
  4. 　上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、
    　エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン－リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあり、
    　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
    　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする、抗ＥＧＦＲ抗体。
  5. 　上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、
    　エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあり、
    　重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
    　軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１～数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする、抗ＥＧＦＲ抗体。
  6. 　前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含む、ヒト型ＩｇＧに形成されていることを特徴とする、請求項４又は５に記載の抗ＥＧＦＲ抗体。
  7. 　少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖を抑制する方法であって、
    　請求項４～６のいずれかに記載の抗ＥＧＦＲ抗体を対象とするＥＧＦＲ発現細胞に付与することを特徴とする、細胞増殖抑制方法。
  8. 　前記ＥＧＦＲ発現細胞がＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞である、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための請求項７に記載の方法。
  9. 　配列番号１～４のうちの少なくとも一つの配列番号に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列を備えるペプチドを発現するために人為的に設計されたポリヌクレオチド。
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