WO2011149102A1 - 生体イメージングに最適化された高度免疫不全マウス - Google Patents

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WO2011149102A1
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cells
mice
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hairless
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岡田誠治
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国立大学法人熊本大学
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    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence

Definitions

  • the present invention relates to a hairless immunodeficient mouse optimized for bioimaging and its use.
  • Biological imaging is a technique for visualizing and quantifying biological information noninvasively and over time.
  • nude mice with no hair and no T cell function are used for in vivo imaging using mice.
  • NK normal killer
  • only about 20% of human-derived cancer cells can be engrafted by transplanting human-derived cancer cells into nude mice. Does not engraft at all. Therefore, when nude mice are used, it has been difficult to analyze these transplanted cells, particularly human-derived normal cells, over time by biological imaging.
  • immunodeficient mice are known as mice that are easy to engraft transplanted cells.
  • mice lacking the Rag-1 gene or the Rag-2 gene are known as mice lacking T cells and B cells (Shinkai Y. et al., Cell. 1992 Mar 6; 68 ( 5): 855-67, Chen J. et al., Curr Opin Immunol.1994 Apr; 6 (2): 313-9), mice lacking the NK cell, and mice lacking the Jak3 gene or common ⁇ Mice deficient in chain genes are known (Park SY. Et al., Immunity. 1995 Dec; 3 (6): 771-82, Suzuki K. et al., Int Immunol. 2000 Feb; 12 (2 ): 123-32).
  • NOD / Scid / ⁇ 2 microglobulin deficient mouse As a highly immunodeficient mouse in which NK activity is lost in addition to T cell and B cell, NOD / Scid / ⁇ 2 microglobulin deficient mouse (Kollet O. et al., Blood 2000; 95 (10): 3102- 5) NOD / Scid / common ⁇ chain-deficient mice (Japanese Patent No. 3753321) are known, and these mice are used as model animals of the human immune system (Legrand N. et al., J Immunol). 2006 Feb 15; 176 (4): 2053-8). However, these mice have been used for experiments relating to immune cell engraftment and human antibody production, but are not used for temporal biological imaging because they are hairy.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and a problem to be solved is to provide a hairless highly immunodeficient mouse suitable for biological imaging and a biological imaging method using the mouse. It is in.
  • the present inventors have succeeded in producing a hairless highly immunodeficient mouse.
  • human-derived cells were transplanted into the hairless hyperimmune-deficient mouse, it was found that the transplanted cells could be analyzed over time by fluorescence imaging, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows. (1) An immunodeficient mouse having the following properties (a) to (c).
  • T cell and B cell are deficient
  • NK activity is lost
  • Hairless Selected from mice described in (a) to (c) below
  • the mouse according to (1) above which is a mouse obtained by mating another kind of mouse with a mouse obtained by mating two kinds of mice.
  • (A) Immunodeficient mouse deficient in T cells and B cells (b) Immunodeficient mouse in which NK activity has been lost (c) Hairless mice (3) Deletion of T cells and B cells is caused by Rag-1 gene or Rag- The mouse according to (1) or (2) above, which is caused by knocking out two genes.
  • the disappearance of NK activity is due to the knockout of at least one gene selected from the Jak3 gene, the common ⁇ chain gene, and the ⁇ 2 microglobulin gene, as described in (1) or (2) above mouse.
  • the mouse according to (1) above, wherein the hairless property can be obtained by mating nude mice or hairless mice.
  • the mouse according to (1) above, wherein the hairless property is due to the knockout of the FOXN1 gene.
  • the mouse according to (2) above, wherein the hairless mouse is a nude mouse or a hairless mouse.
  • the mouse described in (a) above is a Rag-1 gene or Rag The method according to (12) above, wherein the -2 gene is knocked out.
  • the method according to (12) above, wherein the mouse according to (a) has a homozygous mutation at the Scid locus.
  • the mouse according to (b) is one in which at least one gene selected from a Jak3 gene, a common ⁇ chain gene and a ⁇ 2 microglobulin gene is knocked out.
  • a biological imaging method in the mouse comprising irradiating light and detecting fluorescence generated from at least one selected from the group consisting of administered cells, protozoa, bacteria and viruses.
  • the fluorescent label is made of a near-infrared fluorescent protein.
  • the cells are at least one selected from the group consisting of human-derived tumor cells, stem cells, and normal cells differentiated from stem cells.
  • Normal cells differentiated from stem cells are selected from the group consisting of blood cells, skin cells, hepatocytes, nerve cells, muscle cells, bone cells, intestinal cells, blood vessel cells, adipocytes, kidney cells, pancreatic cells and germ cells.
  • the method according to (20) above which is at least one selected.
  • (22) A biological imaging method using the mouse according to (10) above.
  • (23) A method for producing a cancer model mouse, comprising transplanting tumor cells into the mouse according to any one of (1) to (11) above.
  • (24) An infectious disease model mouse, characterized in that the mouse according to any one of (1) to (11) is infected with at least one selected from the group consisting of protozoa, bacteria and viruses. Manufacturing method.
  • a hairless highly immunodeficient mouse suitable for biological imaging can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of analyzing the presence or absence of B cells, T cells, and NK cells in various mice.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of comparing the mouse (Nude-RJ) and nude mouse (Nude) of the present invention regarding the engraftment of the human erythroleukemia cell line K562.
  • FIG. 3 is a diagram showing the result of transplantation of fluorescently labeled tumor cells (bile duct cancer cell line: M213-mcherry) and analysis by fluorescence imaging. Of the two images in the figure, the left image shows the result of detecting autofluorescence (nonspecific fluorescence), and the right image shows only the specific fluorescence of mCherry except for nonspecific fluorescence by computer processing. The result of detecting is shown.
  • FIG. 4 shows a mouse expressing GFP.
  • FIG. 5 is a view showing each tissue excised from a mouse expressing GFP.
  • hyperimmune-deficient mice lack T cells and B cells and have lost NK activity. Therefore, when cells are transplanted into the mouse of the present invention, the engraftment efficiency of the transplanted cells is high.
  • hairless mice do not have hair on the body surface, when tumor cells are transplanted subcutaneously, it is easy to evaluate the growth, size, etc. of the tumor from outside the body under white light without being blocked by the hair.
  • the transplanted cells are fluorescently labeled, the fluorescence emitted by the transplanted cells is easily detected from outside the living body under excitation light.
  • the mouse of the present invention has the characteristics of both the highly immunodeficient mouse and the hairless mouse, so that the engraftment efficiency of transplanted cells and the like is extremely high and the transplanted cells can be easily evaluated from outside the body. .
  • the present invention provides a hairless highly immunodeficient mouse suitable for in vivo imaging having such characteristics. Furthermore, the present invention relates to a hairless highly immunodeficient mouse that crosses a hairless highly immunodeficient mouse with a fluorescent protein-expressing mouse and emits fluorescence of a predetermined color.
  • a host that emits green fluorescence when transplanted with a tumor cell introduced with a red fluorescence gene into a hairless highly immunodeficient mouse that emits this fluorescence (for example, a mouse obtained by mating with a transgenic mouse introduced with a GFP gene) Can be easily distinguished from cells. As a result, analysis of cell interaction, which has been difficult in the past, becomes easy. Since the mouse of the present invention can replace the experiment with the Nude mouse at a higher level, it becomes a better research mouse suitable for biological imaging (live imaging).
  • the immunodeficient mouse of the present invention is an immunodeficient mouse having the following properties (a) to (c), and can be obtained by mating individual mice having one of the following properties.
  • an “immune-deficient mouse” means a mouse whose immune system is not functioning normally. In the present invention, at least both T cells and B cells are lost and NK activity is lost. Included mice. In addition, the immunodeficient mouse of the present invention includes mice that lack both T cells and B cells, lose NK activity, and lack NKT (natural killer T) cells and / or dendritic cells. It is. T cell and B cell deficiency means that T cells and B cells are not present in the mouse of the present invention.
  • T cells and B cells are responsible for cellular immunity and humoral immunity, and when a heterologous cell is transplanted into a mouse, an immune response such as rejection occurs. Therefore, it is difficult to engraft heterologous cells in mice in which T cells and B cells are present.
  • the immunodeficient mouse of the present invention does not have T cells and B cells, even when heterologous cells are transplanted into the mouse, no immune response such as rejection occurs. Therefore, the mouse of the present invention can engraft transplanted cells due to the lack of T cells and B cells.
  • a mouse deficient in T cells and B cells can generally be obtained by performing treatment such that gene rearrangement of T cells and B cells is not performed. Can be used.
  • mice lacking T cells and B cells can generally be obtained by knocking out a predetermined gene.
  • Knockout mice can be produced by a method well known in the art, for example, a method using a targeting vector (Capecchi, MR, Science, (1989) 244, 1288-1292). This method utilizes homologous recombination between a predetermined gene in mouse ES cells and a gene on a targeting vector.
  • the predetermined gene to be knocked out may be selected from the viewpoint that it is an essential gene for maturation / proliferation or gene rearrangement of T cells and B cells, and these genes may be knocked out.
  • the Rag-1 gene or Rag-2 gene is knocked out, but the Rag-2 gene is knocked out.
  • Rag (Recombination activating gene) -1 gene and Rag-2 gene are genes that are expressed in immature lymphocytes and have functions essential for reconstitution of immunoglobulin genes and T cell receptors. It is an essential gene for cell maturation.
  • a method for producing a mouse in which these genes are knocked out and details of the genes are described in Shinkai Y. et al. et al. Cell. 1992 Mar 6; 68 (5): 855-67, Chen J. et al. et al. Curr Opin Immunol. 1994 Apr; 6 (2): 313-9.
  • the term “knocked out” means that the function of the gene is destroyed due to deletion of all or part of the gene.
  • a mouse in which the Rag-2 gene is knocked out has the same meaning as “a Rag-2 gene-deficient mouse”.
  • a mouse in which two kinds of genes are knocked out has the same meaning as “a double-deficient mouse”.
  • T cell and B cell deficiency can also occur when the mouse has a homozygous mutation at the Scid locus.
  • the Scid (severe combined immunodeficiency) gene is a recessive gene involved in gene rearrangement of the T cell receptor and immunoglobulin genes, and has homozygous mutations at the Scid locus, thereby A defect occurs.
  • the locus of the Scid gene exists on chromosome 16.
  • mice having a homozygous mutation at the Scid locus examples include Scid mice and NOD / Shi-scid mice.
  • the mouse of the present invention has lost NK activity. Loss of NK activity means that NK cells do not exist in mice and therefore do not have NK activity originally, and that NK cells exist but do not have their functions and thus have lost activity. Mean both. NK cells are cells that show nonspecific cytotoxicity against heterologous cells. Therefore, when a heterologous cell is transplanted into a mouse having active NK cells, the transplanted cell is damaged and difficult to engraft.
  • nude mice since nude mice have NK activity, only about 20% of human cancer cells can be engrafted even when transplanted with human-derived cancer cells, and no engraftment occurs when normal cells of human origin are transplanted. .
  • the NK activity has disappeared in the mouse of the present invention, cytotoxicity to heterologous cells does not occur, and the transplanted cells can be engrafted.
  • Mice in which NK activity has disappeared can be obtained by disrupting the function of genes (Perforin, Granzyme B, etc.) involved in the function of NK cells. These mice can be used for mating described later.
  • mice that have lost NK activity can also be obtained by treating NK cells with antibodies specific for NK cells such as anti-IL-2 receptor antibodies and anti-asialo GM1 antibodies.
  • NK cells disappear temporarily, but the effect is not inherited in children.
  • the loss of NK activity may be caused by knockout of at least one gene selected from a Jak3 gene, a common ⁇ (common- ⁇ ) chain gene, and a ⁇ 2 microglobulin gene. It is preferable that the gene is knocked out.
  • Jak3 (Janus kinase 3) is a non-receptor tyrosine kinase and is an intracellular component of a common ⁇ chain common to IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, and IL-21 receptors. It is a protein having a function of associating with a region and transmitting a signal through a common ⁇ chain into cells. Since the signal via the common ⁇ chain, Jak3, is an essential signal for NK cells, NK cells are lost when this pathway is damaged.
  • ⁇ 2 microglobulin is a molecule that binds to MHC class I molecules on the cell surface and stabilizes MHC class I molecules.
  • mice having an immune system in which NK activity is lost can be obtained.
  • the hairless body is used.
  • the hair of haired mice is usually removed with a hair removal cream or the like, or shaved for use.
  • hair removal cream or the like or shaved for use.
  • hair of a hairy mouse is removed or shaved, there is recurring hair, so that it is necessary to repeat hair removal or shaving for continuous analysis. Even if imaging is performed with hair on, the tissue cannot be observed accurately. Therefore, in the present invention, a mouse that is inherently hairless can be used.
  • the hairless property can be obtained by mating hairless mice.
  • hairless mice include nude mice and hairless mice. These mice include those having the same genetic background as NOD mice or Balb / c mice, such as Balb / c nude mice. Since Balb / c nude mice are marketed by Claire Japan and hairless mice are marketed by Charles River, USA, they can be obtained by purchasing them. Since hairless mice have thinner skin than nude mice, it is easy to evaluate the transplanted cells or tissues from the outside, and when fluorescently labeled cells or tissues are transplanted, the fluorescence generated from the transplanted cells etc. It is advantageous that it is easy to measure. Hairless mice have a normal immune system.
  • mice Crl: SHO-Prkdc scid Hr hr A mouse (Charles River, USA) can be mentioned.
  • the hairless property can be obtained by knocking out the FOXN1 gene. Since the FOXN1 (forkhead box 1) gene is a regulatory factor associated with thymus and skin development, knocking out this gene results in a loss of the thymus and a hairless phenotype. Examples of mice in which the FOXN1 gene has been knocked out include nude mice. 2.
  • the mouse of the present invention comprises two kinds of mice arbitrarily selected from (a) an immunodeficient mouse in which T cells and B cells are deleted, (b) an immunodeficient mouse in which NK activity is lost, and (c) a hairless mouse. After obtaining F1 mice by mating, they can be obtained by mating another type of mouse to F2 mice obtained by mating F1 mice. The combination and order of the mating of the mice (a), (b) and (c) are arbitrary and can be determined as appropriate.
  • mice of the present invention can be obtained by further mating the obtained children.
  • the mouse of (a) and the mouse of (c) are mated to obtain F1 mice, and then the F2 mice obtained by mating F1 mice together with the mice of (b)
  • the mice of the present invention can be obtained by mating and further mating the obtained children.
  • mice of (b) and the mouse of (c) are crossed to obtain an F1 mouse, and then the F2 mouse obtained by mating the F1 mice together with the mouse of (a) above
  • the mice of the present invention can be obtained by further mating the obtained children.
  • immunodeficient mice deficient in T cells and B cells include mice in which the Rag-1 gene or Rag-2 gene has been knocked out, mice having homozygous mutations in the Scid locus, and NK activity has been lost.
  • the immunodeficient mouse include a mouse in which at least one gene selected from a Jak3 gene, a common ⁇ chain gene, and a ⁇ 2 microglobulin gene is knocked out.
  • hairless mice include nude mice and hairless mice.
  • the explanation for the hairless mouse is the same as described above.
  • the mouse of the present invention preferably has the same genetic background as the NOD mouse or Balb / c mouse in order to improve the survival rate of human cells.
  • Examples of such mice include Balb / c Rag2 deficient ( ⁇ / ⁇ ) mice and Balb / c Jak3 deficient ( ⁇ / ⁇ ) mice.
  • Rag2 deficient ( ⁇ / ⁇ ) mice and Jak3 deficient ( ⁇ / ⁇ ) mice can be obtained from Kumamoto University Bioresource Research and Support Center.
  • a hairless immunodeficient mouse can be specifically produced as follows. First, by mating a Balb / c Rag-2 deficient ( ⁇ / ⁇ ) mouse and a Balb / c Jak3 deficient ( ⁇ / ⁇ ) mouse prepared by the method described in “1. Hairless immunodeficient mouse” above.
  • F1 mice (Balb / c Rag-2 (+/ ⁇ ) / Jak3 (+/ ⁇ ) mice) having a gene deletion heterogeneously are obtained.
  • the F1 mice are crossed to obtain F2 mice (Balb / c Rag-2 deficient ( ⁇ / ⁇ ) / Jak3 deficient ( ⁇ / ⁇ ) mice) having a homologous gene defect.
  • this F2 mouse and a Balb / c nude mouse are mated, and the resulting offspring are mated again to produce a hairless immunodeficient mouse (Balb / c Rag2 ( ⁇ / ⁇ ) / Jak3 ( ⁇ / -) Nude mice) can be obtained. 3.
  • the present invention is a hairless hyperimmune-deficient mouse that emits fluorescence (for example, green fluorescence) from whole cells, which is produced based on the hyperimmune-deficient mouse, and has the following characteristics.
  • fluorescence for example, green fluorescence
  • Iii Because of hairlessness, it is easy to identify transplanted cells / tissues using a fluorescence imaging apparatus.
  • mice T cell, B cell deficient
  • Jak3 deficient mice NK cell deficient
  • Nude mice hairless
  • Hyperimmune deficient mice Nude-Rag-2 deficient / Jak3 deficient mice: hairless and all lymphocytes were deficient
  • Tg transgenic mice
  • the highly immunodeficient mouse obtained in the present invention (Nude-Rag-2 deficient / Jak3 deficient mouse) and a transgenic mouse that emits fluorescence are mated to offspring mice. Get.
  • a target mouse By mating a hyperimmune deficient mouse again to this pup, a target mouse can be produced with a probability of 1/16. If a mouse lacking homozygous Rag-2 or Jak3 cannot be obtained, the mouse can be obtained by mating with a hairless highly immunodeficient mouse again.
  • the target mouse (Nude-Rag-2 deficiency / Jak3 deficiency / GFP expression) can be established by normal mating for the next two generations.
  • the mouse of the present invention can express a fluorescent protein in the whole body, that is, in all organs and tissues of the mouse, and thus can be used for in vivo imaging.
  • organs or tissues for biological imaging include brain, heart, lung, kidney, liver, spleen, pancreas, esophagus, stomach, small intestine, and large intestine, but are not particularly limited. Absent.
  • the fluorescent protein that can be expressed by the hairless immunodeficient mouse of the present invention is not limited, and examples thereof include green fluorescent protein (GFP, EGFP), blue fluorescent protein (CFP), red fluorescent protein (RFP), Near-infrared fluorescent proteins, more specifically, fruit fluorescent proteins (mCherry, mOrange, mStrawberry, tdTomato, etc.), DsRed proteins (DsRed1, DsRed2), etc., as long as they are proteins that emit the desired fluorescence It may be a mutant.
  • the fluorescent protein used in the present invention for example, the proteins shown in Table 1 can also be used (note that some of the exemplified proteins are included in Table 1).
  • a transgenic mouse into which a green fluorescent protein (GFP) gene has been introduced is preferred.
  • a fluorescent protein-expressing mouse to be mated with a hairless immunodeficient mouse can be obtained from a commercially available product (for example, Clontech).
  • genes may be introduced into host mice using genetic engineering techniques.
  • Expression vectors that can be used for producing a transgenic animal can be appropriately used those used in the art, and are appropriately selected according to the type of cell or animal into which the fluorescent protein gene is introduced. be able to. Examples of such an expression vector include pCAGGS expression vector.
  • fluorescence can be detected by irradiating light of a predetermined wavelength or ultraviolet light.
  • the excitation wavelength and fluorescence wavelength of the fluorescent protein vary depending on the type of the fluorescent protein, but can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, when EGFP is used as the fluorescent protein, the maximum excitation wavelength is 489 nm, and when DsRed is used, the maximum excitation wavelength is 558 nm. 4).
  • Biological imaging method In the living body imaging method of the present invention, a hairless immunodeficient mouse expressing a fluorescent protein can be used as the hairless immunodeficient mouse.
  • the fluorescent protein and the fluorescent protein are expressed. It is possible to more clearly distinguish the cells of hairless immunodeficient mice. Thereby, it becomes possible to grasp
  • the in vivo imaging method of the present invention uses a hairless immunodeficient mouse that expresses the fluorescent protein obtained as described above, and also has a hairless immunodeficiency in which T cells and B cells are lost and NK activity is lost.
  • Fluorescence produced from administered cells, etc. is detected by administering fluorescence-labeled cells, protozoa, bacteria and / or viruses (hereinafter also referred to as “cells”) to mice and irradiating them with excitation light from outside the body. It is characterized by doing.
  • “administration” means that cells or the like are present in the living body, such as transplantation, infection, inoculation.
  • the biological imaging method refers to a technique for visualizing or quantifying and analyzing information in a living body over time.
  • fluorescent labeling refers to treatment of an administered cell or the like so as to generate fluorescence under a specific excitation wavelength, and labeling by introducing a fluorescent substance into the cell or the like.
  • Fluorescent substances used for fluorescent labeling include green fluorescent protein (GFP), blue fluorescent protein (CFP), red fluorescent protein (RFP), near infrared fluorescent protein, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), PE-TexasRED, PE-Cy5, PE-Cy7, APC (allophycocyanin), antibodies labeled with these fluorescent substances, fluorescent protein expression vectors, quantum dots (diameter number nm) Nanocrystals made of semiconductor materials).
  • near-infrared fluorescent substances include fruit fluorescent proteins (mCherry, mOrange, mStrawberry, tdTomato, etc.), DsRed protein, PKH26-Red Fluorescence, Qdot (registered trademark) nanocrystals (Qdot625, Qdot 655, Qdot 705, etc.). Fluorescent proteins shown in Table 1 can also be used.
  • the “cell” is a eukaryotic cell, preferably a mammal-derived cell.
  • the mammal-derived cells include cells derived from mice, rats, rabbits, dogs, pigs, monkeys, humans, etc., but human-derived cells are preferred.
  • the cells may be normal cells or abnormal cells. Examples of such cells include tumor cells, stem cells, and normal cells differentiated from stem cells.
  • tumor cells include blood tumors (leukemia, lymphoma, multiple myeloma, etc.), bile duct cancer, brain tumor, esophageal cancer, tongue cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, small intestine cancer, duodenal cancer, colon cancer, bladder Cells such as cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, gallbladder cancer, pharyngeal cancer, sarcoma, skin tumor (melanoma etc.) can be used.
  • blood tumors leukemia, lymphoma, multiple myeloma, etc.
  • bile duct cancer brain tumor, esophageal cancer, tongue cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, small intestine cancer, duodenal cancer, colon cancer, bladder Cells such as cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, gallbladder
  • Stem cells include hematopoietic stem cells, embryonic stem cells (ES cells), iPS (Induced Pluripotent stem) cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, and the like.
  • “normal cells differentiated from stem cells” include blood cells, skin cells, hepatocytes, nerve cells, muscle cells, bone cells, intestinal cells, vascular cells, adipocytes, kidney cells, pancreatic cells, germ cells. Etc.
  • blood cells include erythrocytes, granulocytes, monocytes, lymphocytes, platelets, megakaryocytes, and the like
  • skin cells include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and the like.
  • Muscle cells include cardiomyocytes, skeletal muscle cells, and smooth muscle cells. Examples of bone cells include osteoblasts and osteoclasts, and examples of pancreatic cells include pancreatic beta cells.
  • “normal cells differentiated from stem cells” may be cells differentiated either in vitro or ex vivo or in vivo. Normal cells differentiated from ES cells or iPS cells in vitro include blood cells, hepatocytes, nerve cells, muscle cells, osteoblasts, osteoclasts, pancreatic beta cells, etc., and differentiate from stem cells in vivo Examples of such cells include blood cells, skin cells, and hepatocytes.
  • Cells differentiated from stem cells in vivo can be obtained by collecting a biological sample (eg, blood, skin tissue, etc.) from a human.
  • a biological sample eg, blood, skin tissue, etc.
  • stem cells such as ES cells and iPS cells fluorescently labeled are used as transplanted cells for in vivo imaging, whether these stem cells have differentiated into functional mature cells, can be maintained in vivo, cancer It is possible to analyze over time whether or not. This is useful in regenerative medicine research and preclinical studies using ES cells and iPS cells.
  • the cells to be transplanted can be transplanted in tissue units, and examples of such tissues include tumor tissue, skin tissue, hematopoietic tissue, liver tissue, brain tissue and the like.
  • transplanting skin tissue research on skin tissue such as hair growth, hair growth, hair loss, and burns can be performed.
  • human-derived skin tissue it can be used for screening for hair growth agents, hair growth agents, hair removal agents, burn treatment agents, and the like.
  • in vivo imaging using transplanted cells can be performed by the following method. However, the following method is merely an example, and the present invention is not limited to this.
  • the transplanted cells are transfected with a fluorescent protein expression vector, and the fluorescent protein expressing cells are isolated.
  • the fluorescent protein-expressing cells are inoculated into the hairless immunodeficient mouse of the present invention.
  • fluorescence emitted from the transplanted cells is detected and analyzed using a fluorescence detection device.
  • a method for transfection into a transplanted cell a known method such as an electroporation method, a liposome method, a calcium phosphate method, or the like can be used.
  • a well-known method can be used also about the isolation and culture
  • the number of cells used for transplantation is 1 to 1.0 ⁇ 10 when cancer cells are used. 9 Pieces, preferably 1.0 ⁇ 10 4 Pieces-1.0 ⁇ 10 8 Pieces, more preferably 1.0 ⁇ 10 6 Pieces-1.0 ⁇ 10 7 It is a piece.
  • ES cells or iPS cells When ES cells or iPS cells are used, 1 to 1.0 ⁇ 10 9 Pieces, preferably 1.0 ⁇ 10 4 Pieces-1.0 ⁇ 10 8 Pieces, more preferably 1.0 ⁇ 10 6 Pieces-1.0 ⁇ 10 7 It is a piece.
  • the route and place of transplantation include vein, subcutaneous, intradermal, intrasplenic, intrahepatic, etc., and can be appropriately selected according to the type of transplanted cell or the purpose of research. For example, in the case of cancer cells, the mice can be transplanted subcutaneously on both flank.
  • the period from the inoculation of the transplanted cells to the detection of fluorescence can be appropriately set, for example, in the range of 1 day to 60 days.
  • protozozoa refers to sporozoa among single cell organisms.
  • protozoa belonging to spores include malaria parasites, toxoplasma and cryptosporidium.
  • bacteria include pathogenic Escherichia coli, Staphylococcus aureus, tuberculosis and tetanus.
  • viruses include, but are not limited to, viruses having a human host, such as HIV (Human Immunodefectivity Virus), HCV (Hepatitis C virus), HSV (Herpes simplex virus), measles virus, and the like. Since viruses are species-specific, HIV and HSV usually do not infect mice.
  • the mouse of the present invention can engraft human-derived cells, the engrafted human-derived cells can be infected with these viruses. Therefore, by fluorescently labeling both the human-derived cell and the virus, the behavior of the virus with respect to the human-derived cell can be confirmed by in vivo imaging. In addition, for example, by fluorescently labeling both human-derived blood cells and malaria parasites, it is possible to confirm the behavior of malaria parasites on the blood cells by in vivo imaging.
  • the administration route and dosage of protozoa, bacteria, and virus can be appropriately set by those skilled in the art according to the above-mentioned examples of transplanted cells.
  • Maestro (Kurabo), NightOWL II (Beltold Japan), FluorVivo (Intermedical) or the like is used as a device that irradiates excitation light from outside the body and detects fluorescence generated from the administered cells. Can do. 5.
  • Method for producing cancer or infectious disease model mouse The mouse of the present invention can be used as a cancer model mouse.
  • Such cancer model mice can be produced by transplanting tumor cells into hairless immunodeficient mice in which T cells and B cells are deficient and NK activity is lost.
  • the type, number of cells, administration route and location of tumor cells used for transplantation are the same as those described in “4. Bioimaging method”.
  • the mouse of the present invention can be used as an infectious disease model mouse.
  • Such an infectious disease model mouse can be produced by infecting a hairless immunodeficient mouse in which T cells and B cells are deficient and NK activity is lost with protozoa, bacteria and / or viruses.
  • the explanation of protozoa, bacteria and viruses used in the present invention is the same as that described in “4. Bioimaging method” above.
  • the virus since the virus is species-specific, HIV and HSV usually do not infect mice.
  • the mouse of the present invention can engraft human-derived cells, the engrafted human-derived cells can be infected with these viruses. Therefore, the mouse of the present invention can be used as an HIV or HSV infection model for human cells.
  • the dose of the virus for preparing the infectious disease model of the present invention is, for example, 1.0 to 1.0 ⁇ 10 6. 5 It is in the range of pfu / ml.
  • the administration route can be exemplified by vein, bone marrow, liver, abdominal cavity, subcutaneous and the like.
  • the mouse of the present invention can engraft human-derived blood cells, the engrafted blood cells can be infected with malaria parasites. Therefore, the mouse of the present invention can be used as a malaria parasite infection model for human blood cells.
  • the dose and route of administration of the malaria parasite can be appropriately set according to the example of the virus. EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
  • Balb / c Rag-2 ⁇ / ⁇ mice and Balb / c Jak3 ⁇ / ⁇ mice were obtained.
  • a Balb / c Rag-2 / Jak3 double deficiency (Balb / c Rag-2 ⁇ / ⁇ is obtained by crossing Balb / c Rag-2 ⁇ / ⁇ mice with Balb / c Jak3 ⁇ / ⁇ mice. Jak3 ⁇ / ⁇ ) mice were obtained.
  • Mouse spleen cells were obtained from Nude / RJ mice and labeled with fluorescent dyes: DX5-FITC (pan NK marker), mCD122 (IL-2Rb) -PE, mCD19-APC and mCD3-PE / Cy7 Mouse lymphocytes were detected by staining with (eBiosciences, CA) and analysis by flow cytometry using LSR II (BD Biosciences, CA). The data was analyzed using FlowJo (Tree Star, CA), which is analysis software. As a result, mature B cells (CD19 positive), T cells (CD3 positive), and NK cells (DX5 positive, CD122 positive) are completely deficient in the spleen of the mouse (Nude-RJ) of the present invention.
  • mice 1 ⁇ 10 6 K562 cells were suspended in 100 ⁇ L PBS and 8-10 weeks old Balb / c Rag-2 ⁇ / ⁇ Jak3 ⁇ / ⁇ nude mice (Nude / RJ mice) and Balb / c Nude mice Transplanted subcutaneously on both sides. Two weeks after transplantation, mice transplanted with K562 were sacrificed, tumors were excised, and weighed. As a result, it became clear that the mouse of the present invention formed a tumor that was clearly larger than the nude mouse. From this result, it was shown that the engraftment of human cancer cells in Nude / RJ mice is significantly higher than that in Nude mice (FIG. 2). In addition, the statistically significant difference recognized between experimental groups was determined using Student's t test. A P value of less than 0.05 was considered significant.
  • mCherry is a red monomeric fluorescent protein that is less susceptible to autofluorescence of animals and plants, and is suitable for in vivo imaging.
  • the transfection was performed using the pmCherry-N1 vector (Clontech, CA) and the transfection reagent Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) according to the instructions attached to the reagent.
  • Transfected cells (M213-mCherry) were selected in a medium containing neomycin (G418, Carbiochem) and then subjected to limiting dilution to isolate a stable strain.
  • M213-mCherry cells were suspended in 100 ⁇ L PBS and placed on the flank of 8-10 week old Balb / c Rag-2 ⁇ / ⁇ Jak3 ⁇ / ⁇ nude mice (Nude / RJ mice). Inoculated subcutaneously.
  • (2) Biological Imaging On the 21st day after inoculating M213-mCherry cells into Nude / RJ mice, biological imaging was performed using Maestro Instruments (Kurabo). First, the whole mouse was scanned at all fluorescence wavelengths. Next, the spectrum of food in the skin and intestinal tract was measured, and the fluorescence spectrum was subtracted as the background.
  • GFP mice C57 / BL6 back, provided by Dr. Masaru Okabe, Osaka University
  • Balb / c-GFP mice did.
  • Balb / c-GFP mice and hairless hyperimmune-deficient mice Nude-Rag-2 deficient / Jak3 deficient mice
  • Nude-RJ mice prepared in Example 1 were mated to Balb-c GFP, Nude -RJ hetero mice were prepared.
  • the left mouse represents a GFP-expressing Nude / RJ mouse
  • the right mouse represents a Nude / RJ mouse that does not express GFP.
  • Panels c and d show the results of GFP-expressing Nude / RJ mice observed under excitation light and white light, respectively.
  • various tissues were removed from GFP-expressing Nude / RJ mice, and the presence or absence of GFP expression in these tissues was confirmed. Expression was observed ( Figure 5). As described above, in this example, a hairless immunodeficient mouse expressing a fluorescent protein could be produced.
  • the hairless immunodeficient mouse expressing the fluorescent protein of the present invention
  • the cancer cell and the host cell are transplanted by transplanting the cancer cell into which the gene for the red fluorescent protein is introduced. It has an outstanding feature that it can be easily identified based on fluorescence. For this reason, it is possible to easily analyze the invasion process of cancer cells into tissues and angiogenesis in cancer tissues, which have been difficult in the past.
  • the present invention can provide a hairless highly immunodeficient mouse suitable for biological imaging.
  • the mouse of the present invention and the method using the same are particularly useful for cancer research and regenerative medicine research.

Landscapes

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Abstract

　本発明は、生体イメージングに適した無毛の高度免疫不全マウス及び当該マウスを用いた生体イメー ジング方法の提供を目的とする。　本発明は、以下の(a)～(c)の性質を有する免疫不全マウスに関する。(a) T細胞及びB細胞が欠損している(b) NK活性が消失している(c) 無毛である。

Description

生体イメージングに最適化された高度免疫不全マウス
　本発明は、生体イメージングに最適化された無毛の免疫不全マウス及びその用途に関する。
　生体イメージングは、生体情報を非侵襲的及び経時的に可視化及び定量化して解析する技術である。現在、マウスを用いた生体イメージングには、無毛でＴ細胞機能のないヌード（Ｎｕｄｅ）マウスが用いられている。しかしながら、ヌードマウスはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性が正常であるため、ヒト由来の癌細胞をヌードマウスに移植しても約２０％しか生着せず、ヒト由来の正常細胞を移植した場合には全く生着しない。従って、ヌードマウスを用いた場合、これらの移植細胞、特にヒト由来の正常細胞を生体イメージングにより経時的に解析することは困難であった。
　他方、移植細胞が生着しやすいマウスとして、免疫不全マウスが知られている。このうち、Ｔ細胞及びＢ細胞を欠損しているマウスとして、Ｒａｇ−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子が欠損したマウスが知られており（Ｓｈｉｎｋａｉ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９２　Ｍａｒ　６；６８（５）：８５５−６７、Ｃｈｅｎ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４　Ａｐｒ；６（２）：３１３−９）、ＮＫ細胞が欠損しているマウスとして、Ｊａｋ３遺伝子が欠損したマウスや共通γ鎖遺伝子が欠損したマウスなどが知られている（Ｐａｒｋ　ＳＹ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９５　Ｄｅｃ；３（６）：７７１−８２、Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００　Ｆｅｂ；１２（２）：１２３−３２）。また、Ｔ細胞及びＢ細胞に加えてＮＫ活性が消失している高度免疫不全マウスとして、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／β２　ミクログロブリン欠損マウス（Ｋｏｌｌｅｔ　Ｏ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　２０００；９５（１０）：３１０２−５）、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／共通γ鎖欠損マウス（特許第３７５３３２１号）などが知られており、これらのマウスはヒト免疫系のモデル動物として用いられている（Ｌｅｇｒａｎｄ　Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６　Ｆｅｂ　１５；１７６（４）：２０５３−８）。しかしながら、これらのマウスは、免疫細胞の生着実験やヒト抗体の産生に関する実験には用いられているが、有毛であるため、経時的な生体イメージングには用いられていない。
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、生体イメージングに適した無毛の高度免疫不全マウス及び当該マウスを用いた生体イメージング方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、無毛の高度免疫不全マウスを作製することに成功した。さらに、当該無毛の高度免疫不全マウスにヒト由来細胞を移植した場合、当該移植細胞は蛍光イメージングにより経時的に解析できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）~（ｃ）の性質を有する免疫不全マウス。
　（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損している
　（ｂ）ＮＫ活性が消失している
　（ｃ）無毛である
（２）以下の（ａ）~（ｃ）に記載のマウスから選択される二種類のマウスを交配させて得られるマウスに、さらに他の一種類のマウスを交配させることにより得られるマウスである、上記（１）に記載のマウス。
　（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損した免疫不全マウス
　（ｂ）ＮＫ活性が消失した免疫不全マウス
　（ｃ）無毛マウス
（３）Ｔ細胞及びＢ細胞の欠損は、Ｒａｇ−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子がノックアウトされたことによるものである、上記（１）又は（２）に記載のマウス。
（４）Ｔ細胞及びＢ細胞の欠損は、Ｓｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有することによるものである、上記（１）又は（２）に記載のマウス。
（５）ＮＫ活性の消失は、Ｊａｋ３遺伝子、共通γ鎖遺伝子及びβ２ミクログロブリン遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がノックアウトされたことによるものである、上記（１）又は（２）に記載のマウス。
（６）無毛の性質は、ヌードマウス又はヘアレスマウスを交配させることにより得ることができる、上記（１）に記載のマウス。
（７）無毛の性質は、ＦＯＸＮ１遺伝子がノックアウトされたことによるものである、上記（１）に記載のマウス。
（８）無毛マウスがヌードマウス又はヘアレスマウスである、上記（２）に記載のマウス。
（９）ＮＯＤマウス又はＢａｌｂ／ｃマウスと同系統の遺伝的背景を有する、上記（１）に記載のマウス。
（１０）蛍光タンパク質をコードする遺伝子がさらに導入され、蛍光を発する上記（１）に記載のマウス。
（１１）生体イメージングに使用するための、上記（１）~（１０）のいずれか１項に記載のマウス。
（１２）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失した無毛の免疫不全マウスの製造方法であって、以下の（ａ）~（ｃ）に記載のマウスから選択される二種類のマウスを交配させて得られるマウスに、さらに他の一種類のマウスを交配させることを特徴とする、前記方法。
　（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損した免疫不全マウス
　（ｂ）ＮＫ活性が消失した免疫不全マウス
　（ｃ）無毛マウス
（１３）前記（ａ）に記載のマウスは、Ｒａｇ−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子がノックアウトされたものである、上記（１２）に記載の方法。
（１４）前記（ａ）に記載のマウスは、Ｓｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有するものである、上記（１２）に記載の方法。
（１５）前記（ｂ）に記載のマウスは、Ｊａｋ３遺伝子、共通γ鎖遺伝子及びβ２ミクログロブリン遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がノックアウトされたものである、上記（１２）に記載の方法。
（１６）前記（ｃ）に記載のマウスがヌードマウス又はヘアレスマウスである、上記（１２）に記載の方法。
（１７）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失した無毛の免疫不全マウスであって蛍光を発するマウスの製造方法であって、上記（１）~（９）のいずれか１項に記載のマウスに、さらに蛍光タンパク質をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスを交配することを特徴とする、前記方法。
（１８）上記（１）~（１１）のいずれか１項に記載のマウスに、蛍光標識した細胞、原虫、細菌及びウイルスからなる群から選択される少なくとも１種を投与し、生体外より励起光を照射し、投与された細胞、原虫、細菌及びウイルスからなる群から選択される少なくとも１種から生じる蛍光を検出することを含む、前記マウスにおける生体イメージング方法。
（１９）蛍光標識が近赤外蛍光タンパク質によるものである、上記（１８）に記載の方法。
（２０）細胞が、ヒト由来の腫瘍細胞、幹細胞及び幹細胞から分化した正常細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、上記（１８）に記載の方法。
（２１）幹細胞から分化した正常細胞が、血液細胞、皮膚細胞、肝細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、腸管細胞、血管細胞、脂肪細胞、腎細胞、膵細胞及び生殖細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、上記（２０）に記載の方法。
（２２）上記（１０）に記載のマウスを用いることを特徴とする生体イメージング方法。
（２３）上記（１）~（１１）のいずれか１項に記載のマウスに、腫瘍細胞を移植することを特徴とする、癌のモデルマウスの製造方法。
（２４）上記（１）~（１１）のいずれか１項に記載のマウスに、原虫、細菌及びウイルスからなる群から選択される少なくとも１種を感染させることを特徴とする、感染症モデルマウスの製造方法。
　本発明により、生体イメージングに適した無毛の高度免疫不全マウスを提供することができる。
　図１は、各種マウスにおけるＢ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の有無について解析した結果を示す図である。
　図２は、ヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２の生着性について、本願発明のマウス（Ｎｕｄｅ−ＲＪ）とヌードマウス（Ｎｕｄｅ）とを比較した結果を示す図である。
　図３は、蛍光標識した腫瘍細胞（胆管癌細胞株：Ｍ２１３−ｍｃｈｅｒｒｙ）を移植して、蛍光イメージングにより解析した結果を示す図である。図中の二つの画像のうち、左の画像は、自家蛍光（非特異的蛍光）を検出した結果を示し、右の画像は、コンピューター処理により非特異的蛍光を除いてｍＣｈｅｒｒｙの特異的蛍光のみを検出した結果を示す。
　図４は、ＧＦＰを発現するマウスを示す図である。
　図５は、ＧＦＰを発現するマウスから摘出した各組織を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１０年５月２４日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１０−１１８４５２号）の明細書に記載の内容を包含する。
　本発明のマウスは、高度免疫不全マウスと無毛マウスの両者の性質を併せ持つことを特徴とする。すなわち、高度免疫不全マウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失している。従って、本発明のマウスに細胞を移植すると、移植細胞の生着効率が高い。他方、無毛マウスは体表に毛が存在しないことから、腫瘍細胞を皮下に移植した場合、腫瘍の増殖、大きさ等を毛によって遮られることなく白色光下で生体外から評価しやすい。また、移植細胞等を蛍光標識した場合も、移植細胞等の発する蛍光を励起光下で生体外から検出しやすい。本発明のマウスは、このような高度免疫不全マウスと無毛マウスの両者の性質を併せ持つことにより、移植細胞等の生着効率が極めて高く、かつ移植細胞を生体外から評価しやすい特徴を有する。本発明は、このような特徴を有する生体イメージングに適した無毛の高度免疫不全マウスを提供するものである。
　さらに、本発明においては、無毛高度免疫不全マウスに蛍光タンパク質発現マウスを交配し、所定の色の蛍光を発する無毛高度免疫不全マウスに関する。この蛍光を発する無毛高度免疫不全マウス（例えばＧＦＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスとの交配により得られたマウス）に、赤色蛍光遺伝子を導入した腫瘍細胞を移植した場合、緑色蛍光を発する宿主細胞と容易に区別することができる。その結果、従来困難であった細胞相互作用の解析が容易となる。本発明のマウスはＮｕｄｅマウスでの実験をより高度なレベルで置換できるので、生体イメージング（ライブイメージング）に適したより優れた研究用マウスとなる。
１．無毛の免疫不全マウス
　本発明の免疫不全マウスは、以下の（ａ）~（ｃ）の性質を有する免疫不全マウスであり、以下の性質を１つ有する個々のマウスを交配することにより得ることができる。
（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損している
（ｂ）ＮＫ活性が消失している
（ｃ）無毛である
　本発明において、「免疫不全マウス」とは、免疫系が正常に機能していないマウスを意味し、本発明においては、少なくともＴ細胞及びＢ細胞の双方を欠損し、かつＮＫ活性を消失しているマウスが含まれる。また、本発明の免疫不全マウスには、Ｔ細胞及びＢ細胞の双方を欠損し、ＮＫ活性を消失し、かつＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞及び／又は樹状細胞を欠損しているマウスも含まれる。
　Ｔ細胞及びＢ細胞の欠損とは、Ｔ細胞及びＢ細胞が本発明のマウスに存在しないことを意味する。
　正常な免疫系において、Ｔ細胞及びＢ細胞は細胞性免疫及び体液性免疫を担っているため、異種細胞をマウスに移植すると、拒絶反応等の免疫応答が生じる。従って、Ｔ細胞及びＢ細胞が存在するマウスに異種細胞を生着させることは困難である。これに対し、本発明の免疫不全マウスにはＴ細胞及びＢ細胞が存在しないため、異種細胞を当該マウスに移植しても、拒絶反応等の免疫応答は生じない。従って、本発明のマウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損していることにより、移植細胞を生着させることができる。
　本発明において、Ｔ細胞及びＢ細胞を欠損するマウスは、一般にはＴ細胞及びＢ細胞の遺伝子再構成が行われなくなるような処理を施すことにより得ることができ、これらのマウスは後述する交配に使用することができる。
　Ｔ細胞及びＢ細胞を欠損するマウスは、一般には所定遺伝子をノックアウトすることにより得ることができる。ノックアウトマウスは、当分野において周知の方法、例えば、ターゲッティングベクターを用いる方法により、作製することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）２４４，１２８８−１２９２）。この方法は、マウスＥＳ細胞における所定遺伝子とターゲッティングベクター上の遺伝子との相同組換えを利用したものである。ノックアウトさせる所定遺伝子は、Ｔ細胞及びＢ細胞の成熟・増殖あるいは遺伝子再構成に必須の遺伝子であることを観点として選択し、これらの遺伝子をノックアウトさせればよい。本発明においては、Ｒａｇ−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子がノックアウトされることによるものが挙げられるが、Ｒａｇ−２遺伝子がノックアウトされることによるものが好ましい。Ｒａｇ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｇｅｎｅ）−１遺伝子及びＲａｇ−２遺伝子は、未熟なリンパ球に発現する遺伝子であって、免疫グロブリン遺伝子及びＴ細胞受容体の再構成に必須の機能を有し、Ｔ細胞Ｂ細胞の成熟に不可欠の遺伝子である。これらの遺伝子がノックアウトされたマウスの作製手法、及び当該遺伝子についての詳細は、Ｓｈｉｎｋａｉ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９２　Ｍａｒ　６；６８（５）：８５５−６７、Ｃｈｅｎ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４　Ａｐｒ；６（２）：３１３−９などに記載されている。
　本発明において、「ノックアウトされた」とは、遺伝子の全体又は一部が欠損していることにより遺伝子の機能が破壊されていることを意味する。従って、例えば、「Ｒａｇ−２遺伝子がノックアウトされたマウス」は、「Ｒａｇ−２遺伝子欠損マウス」と同じ意味を表す。また、「二種類の遺伝子がノックアウトされたマウス」は、「二重欠損マウス」と同じ意味を表す。
　また、Ｔ細胞及びＢ細胞の欠損は、当該マウスがＳｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有することによっても生じうる。Ｓｃｉｄ（重症複合免疫不全症）遺伝子は、Ｔ細胞受容体及び免疫グロブリン遺伝子の遺伝子再構成に関与する劣性遺伝子であり、Ｓｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有することにより、Ｔ細胞及びＢ細胞の欠損が生じる。Ｓｃｉｄ遺伝子の遺伝子座は１６番染色体上に存在する。Ｓｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有するマウスとしては、Ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスなどが挙げられる。
　本発明のマウスは、ＮＫ活性を消失している。ＮＫ活性の消失とは、ＮＫ細胞がマウスに存在しないためにＮＫ活性を本来有さないこと、及びＮＫ細胞は存在しているがその機能を有さないために活性を消失していることの双方を意味する。
　ＮＫ細胞は、異種細胞に対して非特異的な細胞傷害性を示す細胞である。従って、活性を有するＮＫ細胞が存在するマウスに異種細胞を移植すると、当該移植細胞は細胞傷害を受け、生着することが困難である。例えば、ヌードマウスはＮＫ活性を有しているため、ヒト由来の癌細胞をヌードマウスに移植しても約２０％しか生着せず、ヒト由来の正常細胞を移植した場合には全く生着しない。これに対し、本発明のマウスではＮＫ活性が消失しているため、異種細胞に対する細胞傷害は生じず、移植細胞は生着することができる。
　ＮＫ活性が消失したマウスは、ＮＫ細胞の機能に関わる遺伝子（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢなど）の機能を破壊することにより得ることができる。これらのマウスは、後述する交配に使用することができる。また、ＮＫ活性が消失したマウスは、ＮＫ細胞を抗ＩＬ−２受容体抗体や抗アシアロＧＭ１抗体等のＮＫ細胞に特異的な抗体で処理することによって得ることもできる。なお、抗体処理したマウスは一時的にＮＫ細胞が消失するが、その効果は子供には遺伝しない。
　あるいは、本発明において、ＮＫ活性の消失は、Ｊａｋ３遺伝子、共通γ（ｃｏｍｍｏｎ−γ）鎖遺伝子及びβ２ミクログロブリン遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がノックアウトされることによるものが挙げられるが、Ｊａｋ３遺伝子がノックアウトされることによるものが好ましい。
　Ｊａｋ３（Ｊａｎｕｓ　ｋｉｎａｓｅ　３）は、非受容体型チロシンキナーゼであり、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−９，ＩＬ−１５，ＩＬ−２１受容体に共通する共通γ鎖の細胞内領域に会合して共通γ鎖を介したシグナルを細胞内に伝達するという機能を有するタンパク質である。共通γ鎖、Ｊａｋ３を介するシグナルはＮＫ細胞に必須のシグナルであるので、この経路が傷害されるとＮＫ細胞が欠損することになる。また、β２ミクログロブリンは、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子と結合してＭＨＣクラスＩ分子を安定化する分子であり、β２ミクログロブリンが欠損するとＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面への発現が抑制されるため、ＭＨＣクラスＩ分子依存性細胞であるＣＤ８陽性Ｔ細胞やＮＫ細胞が消失する。
　Ｊａｋ３遺伝子及び共通γ鎖遺伝子についての詳細は、Ｐａｒｋ　ＳＹ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９５　Ｄｅｃ；３（６）：７７１−８２、Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００　Ｆｅｂ；１２（２）：１２３−３２などに記載されている。また、β２ミクログロブリン遺伝子とＮＫ活性との関係についての詳細は、Ｌｉａｏ　ＮＳ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９１　Ｊｕｌ　１２；２５３（５０１６）：１９９−２０２に記載されており、これらの文献を参照して、ＮＫ活性が消失した免疫系を有するマウスを得ることができる。
　生体イメージングを行うには、皮膚を介して組織を観察する必要があるため、無毛であることが好ましい。このため、通常は有毛マウスの体毛を除毛クリーム等で除毛するか、あるいは剃毛して使用する。しかし、有毛のマウスの体毛を除毛又は剃毛した場合は再発毛があるため、継続的な解析をするためには除毛又は剃毛を繰り返す必要があるなど操作が煩雑である。仮に有毛のままイメージングを行っても正確に組織を観察することはできない。そこで、本発明においては、先天的に無毛であるマウスを使用することができる。
　本発明において、無毛の性質は、無毛マウスを交配させることにより得ることができる。無毛マウスとしては、ヌードマウス又はヘアレスマウスが挙げられる。これらのマウスは、ＮＯＤマウス又はＢａｌｂ／ｃマウスと同系統の遺伝的背景を有するものが挙げられ、例えばＢａｌｂ／ｃヌードマウスが挙げられる。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスは日本クレア社によって市販されており、ヘアレスマウスは米国チャールズリバー社によって市販されていることから、それぞれ購入することにより入手することができる。ヘアレスマウスは、ヌードマウスよりも皮膚が薄いため、移植した細胞又は組織を外部から評価することが容易であり、また蛍光標識した細胞又は組織を移植した場合には、当該移植細胞等から生じる蛍光を測定しやすい点が有利である。なお、ヘアレスマウスは免疫系が正常である。このようなヘアレスマウスとしては、Ｃｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウス（米国チャールズリバー社）が挙げられる。
　また、無毛の性質は、ＦＯＸＮ１遺伝子をノックアウトすることにより得ることができる。ＦＯＸＮ１（ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｂｏｘ　１）遺伝子は、胸腺及び皮膚の発生に関連する調節因子であるため、この遺伝子をノックアウトすることにより、胸腺が欠損し、無毛の表現型を示す。ＦＯＸＮ１遺伝子がノックアウトされたマウスとしては、ヌードマウスが挙げられる。
２．無毛の免疫不全マウスの製造方法
　本発明のマウスは、（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損した免疫不全マウス、（ｂ）ＮＫ活性が消失した免疫不全マウス、及び（ｃ）無毛マウスから任意に選択した二種類のマウスを交配させることによりＦ１マウスを得た後、Ｆ１マウス同士を交配して得られたＦ２マウスに、さらに他の一種類のマウスを交配させることにより得ることができる。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のマウスの交配の組み合わせと順番は任意であり、適宜定めることができる。
　例えば、（ｉ）上記（ａ）のマウスと上記（ｂ）のマウスとを交配させてＦ１マウスを得た後、Ｆ１マウス同士を交配させて得られたＦ２マウスに、上記（ｃ）のマウスを交配させ、得られた子同士をさらに交配させて、本発明のマウスを得ることができる。また、（ｉｉ）上記（ａ）のマウスと上記（ｃ）のマウスとを交配させてＦ１マウスを得た後、Ｆ１マウス同士を交配させて得られたＦ２マウスに、上記（ｂ）のマウスを交配させ、得られた子同士をさらに交配させることにより、本発明のマウスを得ることができる。さらには、（ｉｉｉ）上記（ｂ）のマウスと（ｃ）のマウスとを交配させてＦ１マウスを得た後、Ｆ１マウス同士を交配させて得られたＦ２マウスに、上記（ａ）のマウスを交配させ、得られた子同士をさらに交配させて、本発明のマウスを得ることができる。
　Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損した免疫不全マウスとしては、例えばＲａｇ−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子がノックアウトされたマウス、Ｓｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有するマウスが挙げられ、ＮＫ活性が消失した免疫不全マウスとしては、例えばＪａｋ３遺伝子、共通γ鎖遺伝子及びβ２ミクログロブリン遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がノックアウトされたマウスが挙げられる。また、無毛マウスとしては、例えばヌードマウス又はヘアレスマウスが挙げられる。無毛マウスについての説明は上記と同様である。
　また、本発明のマウスは、ヒト細胞の生着率を向上させるためにＮＯＤマウス又はＢａｌｂ／ｃマウスと同一系統の遺伝的背景を有することが好ましい。このようなマウスとしては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ２欠損（−／−）マウス、Ｂａｌｂ／ｃ　Ｊａｋ３欠損（−／−）マウスが挙げられる。
　Ｒａｇ２欠損（−／−）マウス及びＪａｋ３欠損（−／−）マウスは、熊本大学生命資源研究・支援センターから入手することができる。これらのマウスと、市販のＢａｌｂ／ｃマウスとを１０回以上戻し交配することにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスと同一系統の遺伝的背景を有するＢａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ２欠損（−／−）マウス及びＢａｌｂ／ｃ　Ｊａｋ３欠損（−／−）マウスをそれぞれ得ることができる。
　本発明の好ましい態様において、無毛の免疫不全マウスは、具体的には以下のようにして作製することができる。
　まず、上記「１．無毛免疫不全マウス」に記載した方法で作製したＢａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２欠損（−／−）マウスとＢａｌｂ／ｃ　Ｊａｋ３欠損（−／−）マウスとを交配することにより、遺伝子の欠損をヘテロに有するＦ１マウス（Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２（＋／−）／Ｊａｋ３（＋／−）マウス）を得る。このＦ１マウス同士を交配し、遺伝子の欠損をホモに有するＦ２マウス（Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２欠損（−／−）／Ｊａｋ３欠損（−／−）マウス）を得る。次に、このＦ２マウスと、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスとを交配し、得られた子同士を再度交配することにより、無毛免疫不全マウス（Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ２（−／−）／Ｊａｋ３（−／−）ヌードマウス）を得ることができる。
３．蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウス
　本発明は、上記高度免疫不全マウスをベースとして作製された、全細胞から蛍光（例えば緑色蛍光）を発する無毛高度免疫不全マウスであり、以下の特徴を有する。
（ｉ）蛍光を発することから、宿主と移植された異種組織との区別が容易である。
（ｉｉ）高度免疫不全のためヒト細胞（癌細胞、ｉＰＳ、正常細胞など）の移植が容易である。
（ｉｉｉ）無毛のため、蛍光イメージング装置を用いた移植された細胞・組織の同定が容易である。
　従って、本発明のマウスに例えば赤色蛍光を発するヒト腫瘍細胞株を移植すると、宿主（マウス）由来の緑色蛍光を発する細胞と赤色蛍光を発する腫瘍由来の細胞が明確に区別可能となる。これにより、従来は困難であった宿主と腫瘍の相互作用の解析が容易になり、腫瘍遺伝子発現・腫瘍進行の経時的解析・腫瘍血管新生や腫瘍進展における宿主細胞の役割などの解析が可能となる。そして、血管新生阻害剤などの新たな作用機序を持つ抗腫瘍薬の開発が容易になる。その他多くの医学生物学研究において従来困難であった解析が容易になり、特に（ａ）ヒト癌研究、（ｂ）再生医療研究、（ｃ）ヒトに特有の感染症研究等の医学・生物学研究の進展に寄与することができる。
　ところで、ライブイメージングに最適化されたマウスの条件は下記の３点である。
（ｉ）高度免疫不全状態であること：ヒト癌細胞・幹細胞などが生着するためには、拒絶反応のない高度免疫不全マウスが必要である。
（ｉｉ）無毛であること：蛍光は毛により著しく透過が阻害されるため無毛であることが必要である。
（ｉｉｉ）宿主（マウス）と移植片の区別が容易につくこと：マウス個体が蛍光標識されていること。
　そこで本発明においては、上記の通り、Ｒａｇ−２欠損マウス（Ｔ細胞、Ｂ細胞欠損）、Ｊａｋ３欠損マウス（ＮＫ細胞欠損）、Ｎｕｄｅマウス（無毛）を交配して、これらのすべての特徴をもった高度免疫不全マウス（Ｎｕｄｅ−Ｒａｇ−２欠損／Ｊａｋ３欠損マウス：無毛ですべてのリンパ球が欠損している）を樹立した。
　次に、このように樹立した高度免疫不全マウス（Ｎｕｄｅ−Ｒａｇ−２欠損／Ｊａｋ３欠損マウス）と全身の細胞が蛍光を発色するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを交配して、ライブイメージングに最適化された高度免疫不全マウスを作製した。
　マウスの形質はメンデルの法則に従って遺伝することから、本発明において得られた高度免疫不全マウス（Ｎｕｄｅ−Ｒａｇ−２欠損／Ｊａｋ３欠損マウス）と、蛍光を発するトランスジェニックマウスとを交配させて子マウスを得る。この子マウスに、高度免疫不全マウスを再度交配させることにより、確率１／１６で目的のマウスを作ることができる。Ｒａｇ−２やＪａｋ３がホモで欠損したマウスが得られない場合は、再度無毛の高度免疫不全マウスと交配することにより目的マウスが得られる。目的のマウス（Ｎｕｄｅ−Ｒａｇ−２欠損／Ｊａｋ３欠損／ＧＦＰ発現）は、後２世代の通常交配で樹立できる。
　本発明のマウスは、全身、すなわちマウスの全ての器官、組織において蛍光タンパク質を発現することができることから、生体イメージングに用いることができる。このような生体イメージングの対象となる器官又は組織としては、例えば、脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、食道、胃、小腸、大腸などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
　本発明の無毛免疫不全マウスが発現することができる蛍光タンパク質は、限定されるものではなく、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、近赤外光蛍光タンパク質、より具体的には、フルーツ蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等）、ＤｓＲｅｄタンパク質（ＤｓＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ２）などが挙げられ、目的の蛍光を発するタンパク質である限り、これらの変異体であってもよい。
　また、本発明において使用される蛍光タンパク質は、例えば、表１に示すタンパク質を使用することもできる（なお、上記例示したタンパク質の一部は表１に含まれる）。
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 本発明においては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスが好ましい。
　本発明において、無毛免疫不全マウスと交配する対象となる、蛍光タンパク質発現マウスは、市販品（例えばクロンテック社）から得ることができる。
　また、これらの蛍光タンパク質を発現させるためには、遺伝子工学的手法を用いて宿主マウスに遺伝子を導入すればよい。トランスジェニック動物を作製するために使用可能な発現ベクターは、当分野において使用されるものを適宜使用することができ、上記蛍光タンパク質の遺伝子を導入する細胞又は動物の種類などに応じて適宜選択することができる。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒなどが挙げられる。
　上記のようにして作製された本発明の蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウスにおいて、所定波長の光又は紫外線を照射することにより蛍光を検出することができる。
　蛍光タンパク質の励起波長及び蛍光波長は、蛍光タンパク質の種類によって異なるが、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、蛍光タンパク質としてＥＧＦＰを使用した場合、その最大励起波長は４８９ｎｍであり、ＤｓＲｅｄを使用した場合、その最大励起波長は５５８ｎｍである。
４．生体イメージング方法
　本発明の生体イメージング方法には、無毛免疫不全マウスとして蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウスを使用することができる。この場合、当該マウスが発現する蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）とは異なる波長特性を有する蛍光物質（例えば赤色蛍光物質）で上記細胞等を蛍光標識することにより、蛍光標識した細胞等と蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウスの細胞とをより明確に区別することができる。これにより、無毛免疫不全マウスにおける、蛍光標識した細胞等の動態や当該マウスとの相互作用をより正確に把握することが可能となる。
　また、本発明の生体イメージング方法には、上記の通り得られた蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウスを用いるほか、Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失した無毛免疫不全マウスに、蛍光標識した細胞、原虫、細菌及び／又はウイルス（以下、「細胞等」とも称する）を投与し、生体外より励起光を照射することにより、投与された細胞等から生じる蛍光を検出することを特徴とする。
　ここで、「投与」とは、移植、感染、接種など、生体内に細胞等を存在させることを意味する。
　本発明において、生体イメージング方法とは、生体内における情報を非侵襲的かつ経時的に可視化又は定量化して解析する技術をいう。
　本発明において、「蛍光標識する」とは、投与した細胞等が特定の励起波長下で蛍光を生じるように処理することをいい、蛍光物質を細胞等の内部に導入することにより標識するものと、蛍光物質を細胞等の表面に結合させることにより標識するものの双方がこれに含まれる。
　蛍光標識に用いる蛍光物質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、近赤外光蛍光タンパク質、ＤＡＰＩ（４′，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＰＥ−ＴｅｘａｓＲＥＤ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、これらの蛍光物質で標識された抗体、蛍光タンパク質発現ベクター、量子ドット（直径数ｎｍの半導体素材からなるナノクリスタル）などが挙げられる。本発明においては、生体透過性の高さの観点から近赤外蛍光物質を選択することが好ましい。近赤外蛍光物質としては、フルーツ蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等）、ＤｓＲｅｄタンパク質、ＰＫＨ２６−Ｒｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノクリスタル（Ｑｄｏｔ６２５、Ｑｄｏｔ６５５、Ｑｄｏｔ７０５等）などが挙げられる。表１に示す蛍光タンパク質を用いることもできる。
　本発明において、「細胞」は真核細胞であり、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。哺乳動物由来の細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル、ヒトなどに由来する細胞が挙げられるが、ヒト由来の細胞が好ましい。また、前記細胞は、正常細胞又は異常細胞のいずれであってもよく、このような細胞としては、腫瘍細胞、幹細胞、幹細胞から分化した正常細胞が挙げられる。
　腫瘍細胞としては、例えば、血液腫瘍（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫など）、胆管癌、脳腫瘍、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、皮膚腫瘍（メラノーマなど）などの細胞を用いることができる。
　幹細胞としては、造血幹細胞、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ＥＳ細胞）、ｉＰＳ（Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ）細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。
　本発明において、「幹細胞から分化した正常細胞」としては、血液細胞、皮膚細胞、肝細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、腸管細胞、血管細胞、脂肪細胞、腎細胞、膵細胞、生殖細胞などが挙げられる。血液細胞としては、赤血球、顆粒球、単球、リンパ球、血小板、巨核球などが挙げられ、皮膚細胞としては、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞などが挙げられる。筋細胞には、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞が含まれる。骨細胞としては、骨芽細胞、破骨細胞などが挙げられ、膵細胞としては、膵ベータ細胞が挙げられる。本発明において、「幹細胞から分化した正常細胞」は、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｅｘ　ｖｉｖｏ）又は生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）のいずれで分化した細胞であってもよい。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化した正常細胞としては、血液細胞、肝細胞、神経細胞、筋細胞、骨芽細胞、破骨細胞、膵ベータ細胞などが挙げられ、生体内で幹細胞から分化した細胞としては、血液細胞、皮膚細胞、肝細胞などが挙げられる。生体内で幹細胞から分化した細胞については、ヒトから生体試料（例えば血液、皮膚組織等）を採取することにより得ることができる。
　生体イメージングに用いる移植細胞として蛍光標識したＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞を用いた場合、これらの幹細胞が機能的な成熟細胞に分化しているかどうか、生体内で維持することができるか、癌化するかどうか等を経時的に解析することができる。このことは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を用いた再生医学研究や前臨床試験において有用である。
　また、移植する細胞は、組織単位で移植することもでき、そのような組織としては、例えば、腫瘍組織、皮膚組織、造血組織、肝臓組織、脳組織などが挙げられる。皮膚組織を移植することにより、発毛、育毛、脱毛、熱傷等の皮膚組織に関する研究を行うことができる。例えば、ヒト由来の皮膚組織を移植することにより、発毛剤、育毛剤、脱毛剤、熱傷治療剤等のスクリーニングに用いることもできる。
　移植細胞を用いた生体イメージングは、具体的には以下のような方法で行うことができる。但し、以下の方法は例示に過ぎず、本発明はこれに限定されるものではない。
　（ｉ）まず、移植細胞に蛍光タンパク質発現ベクターをトランスフェクトし、蛍光タンパク質発現細胞を単離する。
　（ｉｉ）次に、当該蛍光タンパク質発現細胞を、本発明の無毛免疫不全マウスに接種する。
　（ｉｉｉ）接種から一定期間経過後、蛍光検出機器を用いて移植細胞から発せられる蛍光を検出し、解析する。
　ここで、移植細胞へのトランスフェクトの方法は、例えば、電気穿孔法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等、公知の方法を用いることができる。また、蛍光タンパク質発現細胞の単離、培養方法についても公知の方法を用いることができる。
　移植に用いる細胞数は、癌細胞を用いる場合、１~１．０×１０９個、好ましくは１．０×１０４個~１．０×１０８個、より好ましくは１．０×１０６個~１．０×１０７個である。また、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用いる場合、１~１．０×１０９個、好ましくは１．０×１０４個~１．０×１０８個、より好ましくは１．０×１０６個~１．０×１０７個である。
　移植の経路及び場所は、静脈、皮下、皮内、脾臓内、肝臓内などが挙げられるが、移植細胞の種類又は研究目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、癌細胞の場合、マウスの両脇腹の皮下に移植することができる。
　移植細胞の接種から蛍光検出までの期間は、例えば１日~６０日の範囲で適宜設定することができる。
　本発明において、「原虫」とは、単細胞生物の中でも特に胞子虫類（Ｓｐｏｒｏｚｏａ）を指す。胞子虫類に属する原虫としては、マラリア原虫、トキソプラズマ、クリプトスポリジウム等が挙げられる。また、「細菌」としては、病原性大腸菌、黄色ブドウ球菌、結核菌、破傷風菌などが挙げられる。「ウイルス」としては、ヒトを宿主とするウイルス、例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ）、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは種特異的であるため、ＨＩＶやＨＳＶは通常マウスには感染しない。これに対し、本発明のマウスは、ヒト由来の細胞を生着させることができるため、生着したヒト由来細胞にこれらのウイルスを感染させることができる。従って、当該ヒト由来細胞及びウイルスの両者をそれぞれ蛍光標識することにより、ヒト由来細胞に対する上記ウイルスの挙動を生体イメージングにより確認することができる。また、例えば、ヒト由来血液細胞とマラリア原虫の両者をそれぞれ蛍光標識することにより、当該血液細胞に対するマラリア原虫の挙動を生体イメージングにより確認することも可能である。
　原虫、細菌、ウイルスの投与経路及び投与量は、上記の移植細胞の例に準じて、当業者であれば適宜設定することができる。
　生体外より励起光を照射し、投与された細胞等から生じる蛍光を検出する機器としては、例えば、Ｍａｅｓｔｒｏ（クラボウ社）、ＮｉｇｈｔＯＷＬ　ＩＩ（ベルトールドジャパン）、ＦｌｕｏｒＶｉｖｏ（インターメディカル社）などを用いることができる。
５．癌又は感染症のモデルマウスの製造方法
　本発明のマウスは、癌のモデルマウスとして用いることができる。このような癌のモデルマウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失した無毛の免疫不全マウスに、腫瘍細胞を移植することにより製造することができる。
　移植に用いられる腫瘍細胞の種類、細胞数並びに投与経路及び場所については「４．生体イメージング方法」に記載したものと同様である。
　本発明のマウスは、感染症モデルマウスとして用いることができる。このような感染症モデルマウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失した無毛の免疫不全マウスに、原虫、細菌及び／又はウイルスを感染させることにより製造することができる。
　本発明に使用される原虫、細菌及びウイルスついての説明は、上記「４．生体イメージング方法」に記載したものと同様である。また、上記の通り、ウイルスは種特異的であるため、ＨＩＶやＨＳＶは通常マウスには感染しない。これに対し、本発明のマウスは、ヒト由来の細胞を生着させることができるため、生着したヒト由来細胞にこれらのウイルスを感染させることができる。従って、本発明のマウスは、ヒト細胞に対するＨＩＶやＨＳＶの感染症モデルとして使用することができる。本発明の感染症モデルを作製するためのウイルスの投与量は、例えば、１．０~１．０×１０５ｐｆｕ／ｍｌの範囲内である。投与経路は、静脈、骨髄、肝臓、腹腔、皮下などを例示することができる。
　また、本発明のマウスは、ヒト由来の血液細胞を生着させることができるため、生着した血液細胞にマラリア原虫を感染させることができる。従って、本発明のマウスは、ヒト血液細胞に対するマラリア原虫の感染症モデルとして使用することができる。マラリア原虫の投与量及び投与経路は、上記ウイルスの例に準じて適宜設定することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
無毛免疫不全マウスの作製
（１）Ｒａｇ−２遺伝子及びＪａｋ３遺伝子の双方がノックアウトされたマウス（以下、「Ｒａｇ−２／Ｊａｋ３二重欠損マウス」又は「ＲＪマウス」とも称する。）の作製
　以下の実験手法及びプロトコールは、全て熊本大学動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に承認された方法により行った。
　まず、Ｒａｇ−２欠損（Ｒａｇ−２−／−）マウス及びＪａｋ３欠損（Ｊａｋ３−／−）マウスを熊本大学生命資源研究・支援センターから取得し、それぞれのマウスとＢａｌｂ／ｃマウスとを１０回戻し交配した。これにより、Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２−／−マウスとＢａｌｂ／ｃ　Ｊａｋ３−／−マウスを得た。
　次に、Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２−／−マウスとＢａｌｂ／ｃ　Ｊａｋ３−／−マウスとを交配することにより、Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２／Ｊａｋ３二重欠損（Ｂａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２−／−Ｊａｋ３−／−）マウスを得た。
（２）無毛のＢａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２／Ｊａｋ３二重欠損マウスの作製
　上記（１）で得たＢａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２／Ｊａｋ３二重欠損マウスと、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社）を交配することにより、無毛のＢａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２／Ｊａｋ３二重欠損マウス（Ｎｕｄｅ／ＲＪマウス）を得た。
（３）機能解析
（ｉ）Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の存在の有無についての検討
　上記のようにして作製したＮｕｄｅ／ＲＪマウスにおいて、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の存在の有無を、フローサイトメトリー法を用いて解析した。
　マウス脾臓細胞をＮｕｄｅ／ＲＪマウスから取得し、蛍光色素で標識した以下の抗体、すなわち、ＤＸ５−ＦＩＴＣ（ｐａｎ　ＮＫマーカー）、ｍＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒｂ）−ＰＥ、ｍＣＤ１９−ＡＰＣ及びｍＣＤ３−ＰＥ／Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）で染色し、ＬＳＲ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーにより解析し、マウスリンパ球を検出した。データは、解析ソフトウェアであるＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ、ＣＡ）を用いて解析した。
　その結果、本願発明のマウス（Ｎｕｄｅ−ＲＪ）の脾臓では、成熟したＢ細胞（ＣＤ１９陽性）、Ｔ細胞（ＣＤ３陽性）、ＮＫ細胞（ＤＸ５陽性、ＣＤ１２２陽性）が完全に欠損していることが明らかとなった（図１）。
（ｉｉ）移植細胞の生着性の検討
　次に、Ｎｕｄｅ／ＲＪマウスにおける移植細胞の生着性を検討した。対照としてヌード（Ｎｕｄｅ）マウスを用い、移植細胞としてヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２を用いた。
　Ｋ５６２細胞株は、ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ（筑波、日本）から取得した。当該細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の非働化牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０（和光純薬、日本）で培養した。
　１×１０６個のＫ５６２細胞を、１００μＬ　ＰＢＳ中で懸濁し、８~１０週齢のＢａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２−／−Ｊａｋ３−／−ヌードマウス（Ｎｕｄｅ／ＲＪマウス）及びＢａｌｂ／ｃ　Ｎｕｄｅマウスの両側皮下に移植した。移植から２週間後に、Ｋ５６２を移植したマウスを屠殺し、腫瘍を切除し、重量を測定した。
　その結果、本願発明マウスではヌードマウスよりも明らかに大きな腫瘍を形成していることが明らかとなった。
　この結果から、Ｎｕｄｅ／ＲＪマウスにおけるヒト癌細胞の生着性は、Ｎｕｄｅマウスと比較して顕著に高いことが示された（図２）。
　なお、実験群間で認められる統計的有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ　ｔ検定を用いて決定した。０．０５未満のＰ値を、有意差ありと判断した。
無毛免疫不全マウスにおける生体イメージング
（１）癌細胞の無毛免疫不全マウスへの移植
　移植細胞には、ヒト胆管癌細胞株であるＭ２１３を用いた。Ｍ２１３細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の非働化牛胎児血清（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ（和光純薬、日本）において培養した。
　次に、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ＣＡ）をＭ２１３細胞にトランスフェクトし、ｍＣｈｅｒｒｙ（励起波長：５８７ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ）で蛍光標識したＭ２１３細胞（Ｍ２１３−ｍＣｈｅｒｒｙ）を得た。ｍＣｈｅｒｒｙは、赤色の単量体蛍光タンパク質で動植物の持つ自家蛍光の影響を受けにくいため、生体（ｉｎ　ｖｉｖｏ）イメージングに適している。トランスフェクトは、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）とトランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて、試薬に添付された説明書に従って行った。トランスフェクト細胞（Ｍ２１３−ｍＣｈｅｒｒｙ）については、ネオマイシン（Ｇ４１８，Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ）含有培地において選択した後、限界希釈法を行い、安定株を単離した。
　５×１０６個のＭ２１３−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を、１００μＬ　ＰＢＳ中で懸濁し、８~１０週齢のＢａｌｂ／ｃ　Ｒａｇ−２−／−Ｊａｋ３−／−ヌードマウス（Ｎｕｄｅ／ＲＪマウス）の両脇腹の皮下に接種した。
（２）生体イメージング
　Ｎｕｄｅ／ＲＪマウスにＭ２１３−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を接種してから２１日目に、マエストロ機器（クラボウ社）を用いて、生体イメージングを行った。
　まず、すべての蛍光波長にてマウス全体のスキャンを行った。次に皮膚や腸管内の食物のスペクトラムを測定し、これらの蛍光スペクトラムをバックグラウンドとして差し引いた。ｍＣｈｅｒｒｙに特異的な蛍光スペクトラムを持つ部分を確認し、そのスペクトラムを示す部分を疑似カラー（赤紫色）にて表示した。
　その結果、腫瘍部分を赤紫色でイメージングすることができた（図３）。その大きさは左腫瘍が１０３６．８ｍｍ３（総シグナル８５８５７カウント）であり、右腫瘍が６７８．０ｍｍ３（総シグナルで４８６２１カウント）であった。
　この結果は、本発明の方法が移植細胞の生体イメージング方法として極めて有用であることを示すものである。
蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウスの作製及びイメージング
１．材料及び方法
　ＧＦＰマウス（Ｃ５７／ＢＬ６バック、大阪大学・岡部勝先生より供与）をＢａｌｂ／ｃマウスと１０世代交配し、緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス（Ｂａｌｂ／ｃ−ＧＦＰマウス）を樹立した。
　Ｂａｌｂ／ｃ−ＧＦＰマウスと、実施例１で作製した無毛の高度免疫不全マウス（Ｎｕｄｅ−Ｒａｇ−２欠損／Ｊａｋ３欠損マウス）（Ｎｕｄｅ−ＲＪマウス）とを交配してＢａｌｂ−ｃ　ＧＦＰ，Ｎｕｄｅ−ＲＪヘテロマウスを作製した。更に、このヘテロマウスとＮｕｄｅ−ＲＪマウスとを交配して、ＧＦＰ発現の高度免疫不全無毛マウス（Ｂａｌｂ／ｃ−ＧＦＰ−Ｎｕｄｅ−ＲＪマウス）（Ｎｕｄｅ−Ｒａｇ−２欠損／Ｊａｋ３欠損／ＧＦＰ発現）を樹立した。
　このＧＦＰ発現マウスに３７５ｎｍの光を照射して、生体イメージングを行った。
２．結果
　上記の方法により作製したマウスにおいて、ＧＦＰの発現が認められた（図４）。図４中、パネルａ、ｂは、ＧＦＰ発現Ｎｕｄｅ／ＲＪマウス及びＧＦＰを発現しないＮｕｄｅ／ＲＪマウスについて、それぞれ励起光（３７５ｎｍ）下、白色光下で観察した結果を示す。パネルａ及びｂにおいて、左側のマウスはＧＦＰ発現Ｎｕｄｅ／ＲＪマウスを示し、右側のマウスはＧＦＰを発現しないＮｕｄｅ／ＲＪマウスを示す。パネルｃ、ｄは、ＧＦＰ発現Ｎｕｄｅ／ＲＪマウスについて、それぞれ励起光下、白色光下で観察した結果を示す。
　また、ＧＦＰ発現Ｎｕｄｅ／ＲＪマウスから各種組織（脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、胃腸）を摘出し、これらの組織についてＧＦＰの発現の有無を確認した結果、全ての組織においてＧＦＰの発現が認められた（図５）。
　以上より、本実施例において、蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウスを作製することができた。
　本発明の蛍光タンパク質を発現する無毛免疫不全マウスは、全てのマウス細胞が緑色のＧＦＰ蛋白を発現するため、赤色蛍光蛋白質の遺伝子を導入した癌細胞を移植することにより癌細胞と宿主細胞を蛍光に基づき容易に識別できるという従来にない優れた特徴を有する。このため、従来困難であった癌細胞の組織への浸潤過程解析や癌組織における血管新生等を容易に解析することができる。
　本発明により、生体イメージングに適した無毛の高度免疫不全マウスを提供することができる。本発明のマウス及びこれを用いた方法は、癌研究や再生医学研究に特に有用である。

Claims (24)

  1. 　以下の（ａ）~（ｃ）の性質を有する免疫不全マウス。
    　（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損している
    　（ｂ）ＮＫ活性が消失している
    　（ｃ）無毛である
  2. 　以下の（ａ）~（ｃ）に記載のマウスから選択される二種類のマウスを交配させて得られるマウスに、さらに他の一種類のマウスを交配させることにより得られるマウスである、請求項１に記載のマウス。
    　（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損した免疫不全マウス
    　（ｂ）ＮＫ活性が消失した免疫不全マウス
    　（ｃ）無毛マウス
  3. 　Ｔ細胞及びＢ細胞の欠損は、Ｒａｇ−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子がノックアウトされたことによるものである、請求項１又は２に記載のマウス。
  4. 　Ｔ細胞及びＢ細胞の欠損は、Ｓｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有することによるものである、請求項１又は２に記載のマウス。
  5. 　ＮＫ活性の消失は、Ｊａｋ３遺伝子、共通γ鎖遺伝子及びβ２ミクログロブリン遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がノックアウトされたことによるものである、請求項１又は２に記載のマウス。
  6. 　無毛の性質は、ヌードマウス又はヘアレスマウスを交配させることにより得ることができる、請求項１に記載のマウス。
  7. 　無毛の性質は、ＦＯＸＮ１遺伝子がノックアウトされたことによるものである、請求項１に記載のマウス。
  8. 　無毛マウスがヌードマウス又はヘアレスマウスである、請求項２に記載のマウス。
  9. 　ＮＯＤマウス又はＢａｌｂ／ｃマウスと同系統の遺伝的背景を有する、請求項１に記載のマウス。
  10. 　蛍光タンパク質をコードする遺伝子がさらに導入され、蛍光を発する請求項１に記載のマウス。
  11. 　生体イメージングに使用するための、請求項１~１０のいずれか１項に記載のマウス。
  12. 　Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失した無毛の免疫不全マウスの製造方法であって、以下の（ａ）~（ｃ）に記載のマウスから選択される二種類のマウスを交配させて得られるマウスに、さらに他の一種類のマウスを交配させることを特徴とする、前記方法。
    　（ａ）Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損した免疫不全マウス
    　（ｂ）ＮＫ活性が消失した免疫不全マウス
    　（ｃ）無毛マウス
  13. 　前記（ａ）に記載のマウスは、Ｒａｇ−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子がノックアウトされたものである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記（ａ）に記載のマウスは、Ｓｃｉｄ遺伝子座にホモ接合型変異を有するものである、請求項１２に記載の方法。
  15. 　前記（ｂ）に記載のマウスは、Ｊａｋ３遺伝子、共通γ鎖遺伝子及びβ２ミクログロブリン遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がノックアウトされたものである、請求項１２に記載の方法。
  16. 　前記（ｃ）に記載のマウスがヌードマウス又はヘアレスマウスである、請求項１２に記載の方法。
  17. Ｔ細胞及びＢ細胞が欠損し、かつＮＫ活性が消失した無毛の免疫不全マウスであって蛍光を発するマウスの製造方法であって、請求項１~９のいずれか１項に記載のマウスに、さらに蛍光タンパク質をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスを交配することを特徴とする、前記方法。
  18. 　請求項１~１１のいずれか１項に記載のマウスに、蛍光標識した細胞、原虫、細菌及びウイルスからなる群から選択される少なくとも１種を投与し、生体外より励起光を照射し、投与された細胞、原虫、細菌及びウイルスからなる群から選択される少なくとも１種から生じる蛍光を検出することを含む、前記マウスにおける生体イメージング方法。
  19. 　蛍光標識が近赤外蛍光タンパク質によるものである、請求項１８に記載の方法。
  20. 　細胞が、ヒト由来の腫瘍細胞、幹細胞及び幹細胞から分化した正常細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１８に記載の方法。
  21. 　幹細胞から分化した正常細胞が、血液細胞、皮膚細胞、肝細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、腸管細胞、血管細胞、脂肪細胞、腎細胞、膵細胞及び生殖細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　請求項１０に記載のマウスを用いることを特徴とする生体イメージング方法。
  23. 　請求項１~１１のいずれか１項に記載のマウスに、腫瘍細胞を移植することを特徴とする、癌のモデルマウスの製造方法。
  24. 　請求項１~１１のいずれか１項に記載のマウスに、原虫、細菌及びウイルスからなる群から選択される少なくとも１種を感染させることを特徴とする、感染症モデルマウスの製造方法。
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