JP2007502620A - 癌細胞を検出し、癌治療をモニターする方法 - Google Patents
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Abstract
シンドビスウイルスベクターを全身に送達することにより、哺乳動物の体内で癌細胞を同定し、抗癌治療をモニターする方法が本明細書で開示される。このベクターは、マウスの皮下、腹腔内、膵臓内、または肺で増殖する腫瘍細胞を特異的に標的とし、それを同定することができる。こうした知見から、比較的安全で血流を通して体中の腫瘍細胞を特異的に標的とすることができるシンドビスベクター系の注目すべき特異性が実証される。
Description
本出願は、2003年8月19日出願の米国特許仮出願第60/496486号の優先権を主張するものである。この先願を参照により本明細書に組み込む。
米国政府は、米国保健社会福祉省、国立衛生研究所の国立癌研究所から公衆衛生局助成金番号CA22247およびCA68498として、ならびに米国陸軍助成金番号OC000111として受けた資金援助に基づき本発明に対して何らかの権利を有する。
全身に送達することができ、特異的な抗腫瘍標的能力を有し、併せて原発性および転移性の腫瘍細胞の死滅を誘発する能力を有するベクターが利用できることにより、癌の遺伝子治療が成功する可能性は増大するはずである。アルファウイルスのプロトタイプであるシンドビスウイルスに基づくベクター（元々哺乳動物細胞への効率的なin vitro遺伝子導入のために開発されたものである1）は、所望の性質を有するように思われる2。いくつかの要素がこのベクターの潜在的な可能性に寄与している。第一に、自然では、シンドビスウイルスは、蚊刺により哺乳動物に伝達される3。感染後、このウイルスは、血液中で比較的長い半生を過ごし、続いて脳を含めて身体のすべての器官に拡散する4,5。シンドビスウイルスに基づく遺伝子導入用ベクターは、血液によって運ばれる性質を保持しており、この性質により全身に投与するのに適したものになっている。第二に、シンドビスウイルス感染に対する哺乳動物細胞上の表面受容体は、67kDaの高親和性ラミニン受容体(LAMR)として同定されている6,7。LAMRは、ヒトの多数の癌において有意に発現量が増えることが分かっている8〜15。LAMRのより高い発現は、様々な癌の侵襲性および悪性度の増大に関係している16,17。また、正常細胞とは対照的に、癌細胞上のLAMRの大多数は、ラミニンによって占有されていない可能性がある18,19。正常細胞と比べて腫瘍細胞ではLAMRが空いているレベルが高いので、腫瘍細胞に優先的に感染する機会がシンドビスウイルスベクターに与えられるように思われる。第三に、シンドビスウイルスによる感染は、哺乳動物細胞において高いアポトーシス誘発性がある20〜23。したがって、このベクター自体、感染した腫瘍細胞を除去するのに十分なアポトーシス誘発性がある。
癌治療の通常のモニター方法には、コンピュータ断層撮影(CT)、磁気共鳴撮影(MRI)、および陽電子放射(PET)が含まれる。CTは、X線の使用を必要とし、妊娠中の患者には適してない。MRIは、正常組織と腫瘍組織との間での、血流量(blood-flood)などの生理的環境の微妙な差を検出する。その感度および特異性を増強するために、癌治療をモニターするためのMRIは、腫瘍細胞を特異的に標的としない造影剤の使用を必要とする。さらに、CTおよびMRIはどちらも、in vivoで微細な腫瘍を検出することができない。癌治療をモニターするためには、体内に放出された放射能を検出するPETの方が、CTおよびMRIに比べて感度が優れている。最新のPET技術では、腫瘍細胞において増大するグルコースの移動およびグリコリド活性を利用し、PETイメージングのために放射性グルコース同族体、18F-フルオロ-2-デオキシグルコース(FDG)を使用する。FDGは、より高い解糖系活性を有する細胞内で代謝および蓄積され、PETシグナルを生成する。しかし、脳の灰白質など正常細胞型にもより高い解糖系活性を有するものがあるため、こうした領域で癌治療をモニターするのにPETを使用することは適当ではない。
米国特許仮出願第60/496486号
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Yaghoubiら(Gene Therapy 8:1072-1080 (2001))
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E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」
したがって、当技術分野で必要なのは、体内または哺乳動物において癌細胞を検出し、抗癌治療をモニターするための、前記の欠点を克服した改良された方法である。
腹腔内(i.p.)注射によるものであれ静脈内(i.v.)注射によるものであれ全身に送達されるシンドビスウイルスベクターが、SCIDマウスの肺、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)、または膵臓内で増殖する腫瘍を標的とするという予想外の発見を本明細書で開示する。
一態様では、本発明は、哺乳動物において抗癌治療をモニターする方法を提供するものであり、この方法は、検出可能な標識をコードしている遺伝子を含むシンドビスウイルスを、このような処置を必要とする哺乳動物に診断上有効な量で投与すること、および前記哺乳動物体内の癌細胞の量を測定することを含み、癌細胞の量は、前記癌細胞によって産生される標識の量に比例する。
さらなる一態様は、本発明は、哺乳動物体内で癌細胞を同定する方法を提供するものであり、この方法は、検出可能な標識をコードしている遺伝子を含むシンドビスウイルスを、このような処置を必要とする哺乳動物に診断上有効な量で投与すること、および前記標識をアッセイすることを含み、前記細胞は、前記標識を発現すると癌細胞である。
さらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物の体内で癌細胞の量を測定する方法を対象とするものであり、この方法は、(a)検出可能な標識をコードしている遺伝子を含むシンドビスウイルスを、このような処置を必要とする哺乳動物に診断上有効な量で投与する工程と、(b)前記標識の量を測定する工程とを含み、前記哺乳動物体内の癌細胞の量は前記標識の量に比例する。
本発明の上記その他の態様は、特許請求の範囲および図面のこの記載に照らせば当分野の技術者には明らかであろう。
（定義）
用語「約(about)」または「およそ(approximately)」は、当分野の技術者によって求められる特定の値の許容される誤差範囲内にあることを意味する。この誤差範囲は、部分的には、値を測定し、または求める方法、すなわち測定システムの限界に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の実施による1以内または1を超えた標準偏差にあることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の20%以下、好ましくは10%以下、より好ましくは5%以下、さらにはより好ましくは1%以下の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系または生物学的過程に関して、この用語は、ある値の1桁高い値まで、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。本願明細書および特許請求の範囲に特定の値を記載する場合、別段の記述がない限り、用語「約」が特定の値の許容される範囲内を意味するものと想定すべきである。
用語「約(about)」または「およそ(approximately)」は、当分野の技術者によって求められる特定の値の許容される誤差範囲内にあることを意味する。この誤差範囲は、部分的には、値を測定し、または求める方法、すなわち測定システムの限界に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の実施による1以内または1を超えた標準偏差にあることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の20%以下、好ましくは10%以下、より好ましくは5%以下、さらにはより好ましくは1%以下の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系または生物学的過程に関して、この用語は、ある値の1桁高い値まで、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。本願明細書および特許請求の範囲に特定の値を記載する場合、別段の記述がない限り、用語「約」が特定の値の許容される範囲内を意味するものと想定すべきである。
「癌治療をモニターする方法」は、本明細書では、抗癌治療の前に、抗癌治療中に、または抗癌治療の後に、患者体内の癌細胞の相対的な量を求めるものとして定義される。
in vivo診断とは、対象の体内の癌細胞により特異的に生成される標識分子の検出を可能にするin vivoイメージング法をいう。このような方法には、磁気共鳴撮影(MRI)、陽電子放射断層撮影(PET)、および単一光子放射型断層撮影(SPECT)が含まれる。
「抗癌治療」は、本明細書では、当分野の技術者に知られている、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科手術、およびそれらの組合せなどとして定義される。
本発明による方法を使用して、あらゆる種類の腫瘍および転移を同定しその治療をモニターすることができる。特定の一実施形態では、本発明による方法は、固形腫瘍を同定しその治療をモニターするために使用される。その非限定的な例は、肝癌、黒色腫、類表皮癌、膵癌、脳悪性腫瘍(神経芽腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、星細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫など)、乳癌、肺癌(肺小細胞癌や肺非小細胞癌など)、卵巣腺癌、結腸癌、前立腺癌、膀胱癌、および腎癌である。
本発明によれば、治療用化合物(すなわちシンドビスウイルス)を本発明の薬剤組成物中に配合して、非経口的に、経粘膜的に、例えば、経口的に、経鼻的に、または経直腸的に、あるいは経皮的に導入することができる。投与は、例えば静脈内注射により、またそれだけには限らないが、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与、および頭蓋内投与も含めて、非経口的であることが好ましい。
本発明によれば、本発明の診断用化合物を、対象のすべての癌細胞を標識する(に感染させる)のに有効な量で投与する。診断上有効な投与量は以下の通りである：好ましい一実施形態では、哺乳動物に対するシンドビスベクターの診断上有効な投与量は、レシピエントの体重1kgあたり約109〜約1012CFU、好ましくはレシピエントの体重1kgあたり約1010〜約1011CFUの幅広い範囲内になる。これは、言い換えると、ヒト患者が約1010CFU〜約1012CFU、好ましくは約1010〜約1011CFUの幅広い範囲で受け取るということになる。より少ない投与量を使用すると有意なモニター効果が得られるため、好ましい別の実施形態では、シンドビスベクターの診断上有効な投与量は、レシピエントの体重1kgあたり約106〜約109CFU、好ましくはレシピエントの体重1kgあたり約107〜約108CFUの幅広い範囲にあるであろう。正確な量は、モニターする疾患の状態の重篤度と、対象の食生活の改善の実施、体重、年齢、性別など他の要素、ならびに当分野の技術者による標準的な優れた医療行為によって容易に決定することができるその他の基準に依存する。
本発明の診断用媒体(diagnostic agent)、すなわちシンドビスウイルスは、血液によって運ばれるウイルスに基づくものであり、したがって、モニターするためには静脈内投与が好ましい。しかし、卵巣癌など、腹腔全体に広がるいくつかの特殊な癌については、疾患の大部分がそこに集中しているため腹腔内注射が好ましい。
本発明は、シンドビスウイルスによって認識される受容体と、この分子が癌において果たす役割との関係に基づく。シンドビスウイルス感染に対する哺乳動物細胞の受容体は、細胞外マトリックスとの細胞間相互作用を媒介するグリコシル化膜タンパク質である、67kDaの高親和性ラミニン受容体(LAMR)として同定されている16。LAMRの発現は、ヒトの数種の癌において上方制御される；より高レベルになると、侵襲性および転移の性向が高まるなど癌細胞の増殖に有利になる18,19。したがって、本発明によれば、LAMRは、シンドビスベクターに対する「腫瘍特異的」受容体として働く。
好ましい一実施形態では、本発明を診断用の手段として使用して、哺乳動物細胞の癌細胞を同定することができる。この場合、対象に、検出可能な標識を含むシンドビスベクターを診断上有効な量(上記の通り)で投与し、標識を含む細胞をアッセイする。シンドビスベクターは、高親和性ラミニン受容体を有する細胞、すなわち癌細胞だけに標識を送達する。
イメージングは、癌細胞に送達された検出可能な標識により生成される光子数に言い換えることができ、これらは生きたままの腫瘍細胞の量に比例していることを本発明者らは発見した。したがって、本発明を使用して、以下の通りに抗癌治療をモニターすることができる。処置を開始する前に、患者らに検出可能な標識を含むシンドビスベクターを診断上有効な量で投与することができ、この値を、治療が完了した後に検出可能な標識を含むシンドビスウイルスを診断上有効な量で投与することによって得られる値と比較することができる。このようにして、腫瘍の死滅の程度を決定することができる。
好ましい別の実施形態では、患者に検出可能な標識を含むシンドビスベクターを診断上有効な量で投与し、生成される標識の量を求める。生きている腫瘍細胞だけが標識を含むので、治療は、標識が極微量でしか検出されなくなるまで続ける。
主に腫瘍の縮小に対するウイルスの効果により、また腫瘍の死滅が起こったことを示す免疫組織化学的検査により、腫瘍がin vivoでシンドビスベクターの標的となることがこれまで示されている。こうした研究は、労力がかかり、動物の屠殺を必要とし、その上ベクターが実際に、すべての腫瘍細胞を、また腫瘍細胞だけを捕らえたかどうかを常に決定できるとは限らない。
本発明を実施することから得られた驚くべき予想外の結果がいくつかある。
(1)イメージングによって実施することができる腫瘍ターゲッティングの感度および実証の容易さは、予想を越えている。シンドビスベクターによるターゲッティングにより、実質的にすべての腫瘍細胞および転移病巣をイメージングすることができる。正常細胞は標的とならない。シンドビスベクターが診断の目的で使用することができると最初に示唆されたのはこの感度のためであり、これはこれまで考えられなかったものである。
(2)さらに、イメージングは光子数に言い換えることができ、これらは、生きたままの腫瘍細胞の量に比例している。これまでは、動物を屠殺しないと腫瘍の死滅の程度を求めることができなかったので、必要な程度をおそらく越えて動物にシンドビスベクターを処置していた。したがって、シグナルの減退が、腫瘍の死滅が起こり、生きている腫瘍細胞の数が減少したことを示唆するので、イメージングにより処置の期間が短縮できることがよく分かった。
(3)イメージングは、血液レベルに基づいてどのくらいの期間処置を実施すべきかどうかを評価することしかできない薬力学試験よりも優れている。それよりも、イメージングは、通常実施することが非常に困難な組織の薬力学試験に匹敵する。イメージングは、生きている患者の腫瘍細胞自体の実際の薬物量を測定することに匹敵する。ベクターは自己増幅するため、イメージングは、組織の薬力学試験よりも実施がずっと容易であり、組織の生検を必要としないことになる。
(4)例えば化学療法のため腫瘍量(tumor load)が減少するにつれて、大部分の腫瘍細胞を特異的に標的とすることができるようなシンドビスベクターから発生するシグナルが減少するので、シンドビスベクターによるイメージングを使用して、シンドビスベクター以外による処置をモニターすることができる。
シンドビスウイルスベクターは遺伝子導入用ベクターであるため、シンドビスウイルス中に組み込まれた遺伝マーカーを使用して癌細胞を標識する。細胞「標識」は、通常は、例えば抗体の化学的結合を使用した細胞表面の現象として考えられるので、この遺伝マーカーを使用した標識は本発明の独特の概念である。本発明によれば、細胞を内部で標識する。生きている腫瘍をモニターおよび標識するのに有用な遺伝子には、それだけには限らないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)遺伝子[Iijima, Y.、Ohno, K.、K. Sawai、B. LevinおよびD. Meruelo、「Cell-specific targeting of a thymidine kinase ganciclovir gene therapy system using a recombinant Sindbis virus vector」、International J. Cancer, 80:110-118, 1999]、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子[Cormack, B. P.ら(1966)、「FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)」、Gene 173:33-38]、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)遺伝子[de Wet, J.R.ら(1987)、「Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells」、Mol. Cell Biol. 7 (2), 725-737]、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ(Riuc)遺伝子[Lorenz, W.W.ら(1991)、「Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reinformis luciferase」、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4438-4442]、ドーパミン2受容体(D2R)遺伝子が含まれる。生きている動物におけるレポーター遺伝子としてのD2R遺伝子の使用は、MacLarenら(Gene Therapy 6:785-791 (1999))およびYaghoubiら(Gene Therapy 8:1072-1080 (2001))で開示されている。Bredenbeek P.J.ら(1993)(「Sindbis virus expression vectors: packaging of RNA replicons by using defective helper RNAs」、J. Virol.; 67(11):6439-46)に記載の通り、当分野の技術者に周知の技法を使用して、こうした遺伝子をシンドビスベクター中に組み込むことができる。
本発明で使用するシンドビスベクターは、Invitrogen社(米国カリフォルニア州Carlsbad)から市販されている。このベクターは、BHK細胞(ATCC(American Type Collection米国基準菌株保存機構)から入手可能、米国バージニア州Manassas)で増殖させ力価測定することができる。
本発明の遺伝マーカーを発現する細胞を以下の通り同定することができる：HSV-tk遺伝子については、対象に、放射性標識した9-(4-[18F]フルオロ-3-ヒドロキシメチルブチル)グアニン(FHBG)(PET Imaging Science Center、南カリフォルニア大学から市販されている)をレシピエントの体重1kgあたり約6000μCiで静脈内投与することができる。腫瘍細胞におけるHSV-tk活性の発現の結果、放射性標識したFHBGが蓄積し、その発現を陽電子放射断層撮影(PET)によってモニターすることができる。組織切片の蛍光顕微鏡による検査により、GFPを発現する腫瘍細胞をin vivoでモニターすることができる。冷却電荷結合素子(CCD)カメラ(Xenogen社、米国カリフォルニア州Alamendaから市販されている)により、FlucまたはRlucを発現する腫瘍細胞の組織切片をin vivoでモニターすることができる。D2R活性は、3-(2-[18F]フルオロエチル)スピペロン([18F]FESP)を投与することによって同定し、PETによってモニターすることができる。
本発明の診断用化合物を疾患または障害に対する有効な診断用モニターとして投与した対象は、ヒトであることが好ましいが、臨床試験、スクリーニング、または活性実験の場面では実験動物を含めたどんな動物でもよい。したがって、当分野の技術者によって容易に理解することができるように、本発明の方法および組成物は、決してそれだけには限らないが、ネコまたはイヌ対象などの家畜(domestic animal)、それだけには限らないがウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタ対象などの家畜(farm animal)、野生動物(野生にいるものであれ動物園にいるものであれ)、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなどの研究動物、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽類などの鳥類の種を含めて、任意の動物、特に哺乳動物への投与に、すなわち獣医学的用途に特に適している。
本発明の診断用化合物を薬剤組成物中に配合する場合、これを製薬上許容される担体または賦形剤と混合することができる。用語「製薬上許容される」とは、「一般に安全とみなされる」、例えば、生理的に許容可能であり、通常、ヒトに投与した場合、アレルギー反応、または異常亢進や浮動性めまいなど類似の有害反応を生じない化合物および組成物を指す。好ましくは、本明細書では、用語「製薬上許容される」は、動物、より具体的にはヒトでの使用が、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって認可されていること、あるいは米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。用語「担体」とは、化合物とともに投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような製剤用担体は、水、ならびにラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、石油、植物もしくは合成由来のものを含めた油などの無菌の液体とすることができる。水または水性食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセリンの水溶液を担体として、特に注射剤用に使用することが好ましい。あるいは、担体は、それだけには限らないが、1種または複数の結合剤(圧縮丸剤用)、封入剤、矯味剤、および着色剤を含めた固形剤型の担体とすることができる。適当な製剤用担体は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
シンドビスウイルスは、血液によって運ばれるウイルスである。したがって、このウイルスに基づく遺伝子治療用ベクターの方が、血流中で移動するようになされていない他のウイルスベクターよりも有利である。主として、この性質が、シンドビスウイルスベクターが腹腔内注射または静脈内注射による全身投与により、皮下(図1)、腹腔内(図3)、膵臓内(図4)、または肺(図5)で増殖する腫瘍を標的としこれに感染するという結果の基となっている。したがって、血液によって運ばれるというこのシンドビスウイルスベクターの性質により、癌治療をモニターできる能力がもたらされる。
複製可能型(replication competent)シンドビスウイルスは、皮膚、結合組織、および筋肉に感染する4。さらに、このウイルスはまた、幼若マウスで脳炎を引き起こす26。しかし、この感染は、成体マウスでは無症状で、毒性がない。11日齢の離乳マウスの末梢組織に接種した、神経適応型(neuroadapted)シンドビスウイルス株は、局所で複製され、血流により中枢神経系(CNS)に広がる。本発明では、特異的に神経適応されてない野生型ウイルス(AR339株)に由来する複製欠損型(replication-defective)シンドビスベクターを使用する。おそらくこの理由で、数回のベクター処置後の注射部位(1つまたは複数)での低レベルのシグナルを除いて、CNSまたは他の正常組織からの実質的な生物発光シグナルは観察されなかった。また、本発明のベクターの注射の後、副作用の徴候は何もなかった。腫瘍増殖およびそれに伴う全症候を除いて、実験期間中すべてのマウスが健常であったように見えた。
本明細書で示す通り、適切なレポーター遺伝子を有するシンドビスベクターは、転移した腫瘍の全身での検出に有用である。シンドビスベクターのこの潜在能力は、ヒト進行卵巣癌の症例と同じように腫瘍播種を示し転移が腹腔全体に広がっている進行卵巣癌のマウスモデルで実証された(図4b)。
以下で示すように、進行卵巣癌は、SCIDマウスにおいてヒトES-2卵巣癌細胞の腹腔内注射により誘発することができる。2×106個のES-2細胞の腹腔内注射の5日後、腹腔内全体にわたって転移した微小なES-2腫瘍が容易に検出された(図4)。腫瘍による腹水症の発症に加えて、腫瘍は、腹腔内で攻撃的に増殖し、さらに肝臓、肺、腎臓に、および場合によっては脳に転移する。未処置のマウスは重篤な肝不全を発症し、これがおそらく急速に伸びた高い死亡率が見られる原因である。
全身化学療法に加えて、外科手術は患者にとってこの疾患の通常の治療法である。しかし、腫瘍の完全摘出は、特に大部分の進行症例では技術的に不可能である。したがって、外科処置の目標は、正確な診断および最適の腫瘍縮小(optimal cytoreduction)である。本願明細書では、シンドビスベクターにより、進行卵巣癌の動物において転移した微小な腫瘍を早期に検出できることが実証された。
本発明を以下の実施例で説明する。それらの実施例はその範囲に限定することなく本発明をさらに説明するためのものである。
下記の実施例1〜5では以下の材料および方法を使用した。
（細胞およびベクターの調製）
BHK (Baby hamster kidneyベビーハムスター腎臓)細胞およびBHKSINLuc2細胞をAmerican Type Culture Collection (ATCC米国基準菌株保存機構、米国バージニア州Manassas)から入手し、5%のウシ胎仔血清(FBS)、100μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(Mediatech社製、米国バージニア州Herndon)、および0.5μg/mLのアンホテリシンB (Mediatech社製)を補充したαMEM (minimum essential alpha-modified mediaα改変最小必須培地、JRH Bioscience社製、米国カンザス州Lenexa)中で維持した。BHKSINLuc細胞はBHK細胞に由来し、この細胞に、マウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下にある欠損型ルシフェラーゼレプリコンを載せたプラスミドを安定にトランスフェクトする24。
BHK (Baby hamster kidneyベビーハムスター腎臓)細胞およびBHKSINLuc2細胞をAmerican Type Culture Collection (ATCC米国基準菌株保存機構、米国バージニア州Manassas)から入手し、5%のウシ胎仔血清(FBS)、100μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(Mediatech社製、米国バージニア州Herndon)、および0.5μg/mLのアンホテリシンB (Mediatech社製)を補充したαMEM (minimum essential alpha-modified mediaα改変最小必須培地、JRH Bioscience社製、米国カンザス州Lenexa)中で維持した。BHKSINLuc細胞はBHK細胞に由来し、この細胞に、マウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下にある欠損型ルシフェラーゼレプリコンを載せたプラスミドを安定にトランスフェクトする24。
以下に記載する通りSinRep/Lucベクターを生成した。簡単に言えば、SinRep/LucレプリコンまたはDHBBヘルパーRNAを載せたプラスミドをXho IおよびNot Iでそれぞれ直鎖状にした。mMESSAGE mMACHINE (商標)RNA転写キット(SP6 version、Ambion社製、米国テキサス州Austin)を使用して、この直鎖状DNAをin vitro転写反応に供してキャップ構造を持つmRNA転写物を生成した。以前に記載の通り2、ヘルパーRNAおよびレプリコンRNA (それぞれ20μLのin vitro転写反応混合物)をどちらもエレクトロポレーション法によりBHK細胞中に導入した。エレクトロポレーションを施した細胞を、5%FBSを含有する10mLのαMEM中で、37℃で12時間インキュベートした。次いで、この培地を、FBSを含まない10mLのOpti-MEM I培地(GIBCO-BRL社製)で置き換えた。24時間後、培養上清を採取し、-80℃で保存した。以前に記載した通り2、SinRep/Lucベクターの力価を求めた。
（動物モデル）
すべての実験でTaconic社(米国ニューヨーク州Germantown)から入手した6〜8週齢の雌の重症複合免疫不全マウス(C.B-17-SCID系統)を使用した。NIHおよび研究所のガイドラインに従ってすべての動物実験を実施した。
すべての実験でTaconic社(米国ニューヨーク州Germantown)から入手した6〜8週齢の雌の重症複合免疫不全マウス(C.B-17-SCID系統)を使用した。NIHおよび研究所のガイドラインに従ってすべての動物実験を実施した。
皮下腫瘍を誘発するために、1×106BHK細胞をC.B-17-SCIDマウスの下腹部の右側に皮下注射した。12日後、BHK細胞腫瘍が少なくとも500mm3のサイズに達したとき、このマウスを対照群(n=5)およびSinRep/Luc群(n=5)に無作為に分け、その日に処置を開始した(1日目)。SinRep/Luc群には、107〜108CFUのSinRep/Lucベクターを含む0.5mLのOpti-MEM Iからなる腹腔内注射剤を下腹部の左側に毎日処置した。対照群のマウスには0.5mLのOpti-MEM Iを処置した。IVISシステムを使用して、マウスにおける生物発光を5日目、10日目および15日目にモニターした(下記参照)。式: (縦、mm)×(横、mm)×(高さ、mm)を用いて、キャリパでBHK細胞腫瘍のサイズを毎日求めた。以前に記載の通り2、GraphPad Prism version 3.0a for Macintosh (GraphPad Software社製、米国カリフォルニア州San Diego)を使用した二元配置ANOVAにより腫瘍サイズデータを解析した。
膵臓内腫瘍を誘発するために、C.B-17-SCIDマウスを麻酔し、続いて21ゲージのシリンジを使用して1×106個のBHK細胞またはBHKSINLuc2細胞を膵臓内注射した。シンドビスウイルスまたはシンドビスベクターを感染させると、BHKSINLuc2細胞はルシフェラーゼ活性を生じる。腫瘍接種の8日後、0.5mLのSinRep/LucベクターまたはSinRep/LacZベクター(約107CFU)を、BHK細胞またはBHKSINLuc細胞をそれぞれ有するマウスに腹腔内注射した。翌日、IVIS (登録商標)システムを使用して、このマウスを生物発光についてモニターした(下記で説明)。イメージングの翌日、マウスを安楽死させて写真撮影により腫瘍増殖を記録した。
肺腫瘍を得るために、1×106個のBHK細胞を尾静脈内注射した。7日後、マウスに0.5mLのSinRep/Lucベクター(約107CFU)を2日連続で尾静脈内注射した。実験マウスと並行して、対照マウスにはBHK細胞を接種せず、SinRep/Lucベクターを処置した。翌日、IVISイメージングシステムを使用して、実験マウスおよび対照マウスの体内のルシフェラーゼ活性をモニターした。イメージングの翌日、マウスを安楽死させ、写真撮影により腫瘍増殖を記録した。
進行卵巣癌モデルを確立するために、10%FBSを補充した0.5mLのDMEM (Dulbecco's modified Eagle mediumダルベッコ改変イーグル培地)中の2×106個のES-2細胞をC.B-17-SLIDマウスに腹腔内注射した。シンドビスベクターの腫瘍特異的感染について判定するために、ES-2細胞の接種の5日後、マウスにSinRep/Lucの腹腔内注射を1回処置し、IVIS (登録商標)イメージングシステムを使用して、腫瘍細胞のin vivo生物発光を測定した。早期の疾患進行について判定するために、マウスに1×106個のES-2/Luc細胞を腹腔内注射し、ES-2/Luc細胞の接種の5日後、IVIS (登録商標)イメージングシステムを用いてこのマウスをモニターした。
（IVIS (登録商標)生物発光イメージング）
極低温で冷却したIVIS (登録商標)システム(Xenogen社製、米国カリフォルニア州Alameda)をLivingImage取得解析ソフトウェア(Xenogen社製)と一緒に使用して、マウスにおける生物発光シグナルを検出した。各マウスにPBS中の15mg/mLカブトムシルシフェリン(カリウム塩、Promega社製、米国ウィスコンシン州Madison) 0.3mLを腹腔内注射した。5分後、0.3mLのアベルチン(5%第三アミルアルコール中の1.25%の2,2,2-トリブロモエタノール)を用いてマウスに麻酔を行った。イメージングシステムでは、まず暗照明のチャンバー内で写真撮影し、続いて発光画像を取得した。疑似カラーオーバーレイ画像は、活性ルシフェラーゼによって生成された光子数の空間分布を表す。皮下BHK細胞の腫瘍から取得した発光画像には2画素のビニングで1分の積分時間を使用し、肺腫瘍については5分を使用した。皮下BHK細胞の腫瘍モデルのために、LivingImageソフトウェア(Xenogen社製)を使用して、SinRep/Luc処置後の腫瘍からの(光子数で表した)全生物発光シグナルを積分した。
極低温で冷却したIVIS (登録商標)システム(Xenogen社製、米国カリフォルニア州Alameda)をLivingImage取得解析ソフトウェア(Xenogen社製)と一緒に使用して、マウスにおける生物発光シグナルを検出した。各マウスにPBS中の15mg/mLカブトムシルシフェリン(カリウム塩、Promega社製、米国ウィスコンシン州Madison) 0.3mLを腹腔内注射した。5分後、0.3mLのアベルチン(5%第三アミルアルコール中の1.25%の2,2,2-トリブロモエタノール)を用いてマウスに麻酔を行った。イメージングシステムでは、まず暗照明のチャンバー内で写真撮影し、続いて発光画像を取得した。疑似カラーオーバーレイ画像は、活性ルシフェラーゼによって生成された光子数の空間分布を表す。皮下BHK細胞の腫瘍から取得した発光画像には2画素のビニングで1分の積分時間を使用し、肺腫瘍については5分を使用した。皮下BHK細胞の腫瘍モデルのために、LivingImageソフトウェア(Xenogen社製)を使用して、SinRep/Luc処置後の腫瘍からの(光子数で表した)全生物発光シグナルを積分した。
（組織分析）
マウスから組織を摘出し、10%中性緩衝ホルマリン中で少なくとも12時間固定し、次いでパラフィン中に包埋した。切片を調製して静電気を帯びたスライドグラス上に移し、次いで60℃で一晩乾熱処理した。この切片をキシレン中で3回洗浄し脱パラフィン化した後、一連の段階的なエタノール(100%、90%、および70%)で元に戻し、次いでヘマトキシリン-エオジン染色を行った。
マウスから組織を摘出し、10%中性緩衝ホルマリン中で少なくとも12時間固定し、次いでパラフィン中に包埋した。切片を調製して静電気を帯びたスライドグラス上に移し、次いで60℃で一晩乾熱処理した。この切片をキシレン中で3回洗浄し脱パラフィン化した後、一連の段階的なエタノール(100%、90%、および70%)で元に戻し、次いでヘマトキシリン-エオジン染色を行った。
(実施例1：SinRep/Lucウイルスベクターは皮下(s.c.) BHK腫瘍に特異的に感染し、その増殖を抑制する)
シンドビスウイルスベクターが全身に送達され、特異的に感染することが潜在的に可能であるかどうかを試験するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を載せたSinRep/Lucウイルスベクターを、皮下BHK腫瘍を有するSCIDマウスに毎日腹腔内(i.p.)注射した(図1)。腫瘍がおよそ500mm3になったとき、SinRep/Lucベクターの毎日の腹腔内注射を開始し(1日目)、5日目、10日目および15日目に、IVIS (登録商標)システムを使用してマウスにおける生物発光をモニターした。腫瘍を有する対照マウスには、SinRep/Luc処置を施さなかった。5日目に腫瘍特異的な生物発光が観察され、これは10日目まで存続し、15日目に有意に低下した(P=0.0004、スチューデントt検定、図1a)。対照マウスの皮下BHK腫瘍では、SinRep/Lucを処置した腫瘍(約107個の光子数)と比べて非常に低いバックグラウンドの生物発光シグナル(約103個の光子数)が生成した。10日目までに、シンドビスベクターの実質的な治療効果は、処置した腫瘍と対照の腫瘍とのサイズの違いによって立証される通り明白になった(図1b)。腫瘍細胞に対する特異性は、処置マウスの他の領域で実質的な生物発光シグナルがなかったことによって実証された。一部の実験では、10日目以降に、特に多回注射の後、生物発光シグナルがベクターの注射部位でも低レベルで観察されたが、これは、一部のベクターがこうした部位に残留したことが原因である(データは図示せず)。腫瘍サイズの二元配置ANOVA分析により、SinRep/Lucベクターの処置で皮下腫瘍増殖が完全に阻害されることが分かる(P<0.0001、図1bおよび図1c)。
シンドビスウイルスベクターが全身に送達され、特異的に感染することが潜在的に可能であるかどうかを試験するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を載せたSinRep/Lucウイルスベクターを、皮下BHK腫瘍を有するSCIDマウスに毎日腹腔内(i.p.)注射した(図1)。腫瘍がおよそ500mm3になったとき、SinRep/Lucベクターの毎日の腹腔内注射を開始し(1日目)、5日目、10日目および15日目に、IVIS (登録商標)システムを使用してマウスにおける生物発光をモニターした。腫瘍を有する対照マウスには、SinRep/Luc処置を施さなかった。5日目に腫瘍特異的な生物発光が観察され、これは10日目まで存続し、15日目に有意に低下した(P=0.0004、スチューデントt検定、図1a)。対照マウスの皮下BHK腫瘍では、SinRep/Lucを処置した腫瘍(約107個の光子数)と比べて非常に低いバックグラウンドの生物発光シグナル(約103個の光子数)が生成した。10日目までに、シンドビスベクターの実質的な治療効果は、処置した腫瘍と対照の腫瘍とのサイズの違いによって立証される通り明白になった(図1b)。腫瘍細胞に対する特異性は、処置マウスの他の領域で実質的な生物発光シグナルがなかったことによって実証された。一部の実験では、10日目以降に、特に多回注射の後、生物発光シグナルがベクターの注射部位でも低レベルで観察されたが、これは、一部のベクターがこうした部位に残留したことが原因である(データは図示せず)。腫瘍サイズの二元配置ANOVA分析により、SinRep/Lucベクターの処置で皮下腫瘍増殖が完全に阻害されることが分かる(P<0.0001、図1bおよび図1c)。
15日目までに処置したすべての腫瘍で増殖を停止し、生物発光をほとんど示さなくなったため、生物発光シグナルの減少が、シンドビスベクターが媒介したアポトーシスによって誘発された腫瘍壊死の結果として起こったかどうかを検討した。組織病理学的検査によりこれが事実であることが実証された；すなわち、採取した腫瘍切片のヘマトキシリン-エオジン染色により、サイズの違いに加えて、処置した腫瘍の方が対照の未処置の腫瘍よりも壊死領域が大きな割合を占めていることが示された(図1d)。さらに、処置した腫瘍の大多数は、腫瘍が生存可能なまさに外縁を除いて均一に壊死した(図1e)。それとは対照的に、対照腫瘍の壊死領域は、正常な腫瘍に伴う低酸素症や栄養不良などの現象から予想されるようにそれよりサイズが小さく、形が不規則である(図1e)。さらに、免疫染色法による以前のデータから、シンドビスベクターを感染させた皮下腫瘍は、処置の3〜4週間以内に完全に退縮し、腫瘍の壊死は、血管系の領域に関連する、アポトーシス誘発性感染の結果であることが示唆されている8。
(実施例2：シンドビスウイルスベクターは腹腔内(i.p.)および膵臓内のBHK腫瘍に特異的に感染する)
シンドビスベクターが他の場所で増殖したBHK腫瘍に特異的に感染することができるかどうかを判定するため、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する欠損型シンドビスレプリコンRNAを安定に転写する、BHK細胞由来の特別な系統、BHKSINLuc2を用いて膵臓内腫瘍を確立した31。この細胞系統は、シンドビスウイルスの感染に応答してルシフェラーゼ活性を発現するので、BHKSINLuc2腫瘍を、ベクター感染の生物レポーター(biological reporter)として使用した。1×106個のBHKSINLuc2細胞の膵臓内接種の結果、8日目以降に膵臓にほぼ限定して腫瘍が生じた。細菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を載せたシンドビスベクターSinRep/LacZの単回腹腔内注射により、膵臓内のBHKSINLuc2腫瘍への特異的な感染が生じ、ルシフェラーゼ活性が誘発された(図2a、上パネル)。SinRep/LacZを処置しなかった、膵臓にBHKSINLuc2腫瘍を有する対照マウスは、その膵臓において生物発光シグナルを示さなかった。対照の膵臓および処置した膵臓における腫瘍の存在をイメージング後の剖検によって確認した(図2a、下パネル)。
シンドビスベクターが他の場所で増殖したBHK腫瘍に特異的に感染することができるかどうかを判定するため、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する欠損型シンドビスレプリコンRNAを安定に転写する、BHK細胞由来の特別な系統、BHKSINLuc2を用いて膵臓内腫瘍を確立した31。この細胞系統は、シンドビスウイルスの感染に応答してルシフェラーゼ活性を発現するので、BHKSINLuc2腫瘍を、ベクター感染の生物レポーター(biological reporter)として使用した。1×106個のBHKSINLuc2細胞の膵臓内接種の結果、8日目以降に膵臓にほぼ限定して腫瘍が生じた。細菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を載せたシンドビスベクターSinRep/LacZの単回腹腔内注射により、膵臓内のBHKSINLuc2腫瘍への特異的な感染が生じ、ルシフェラーゼ活性が誘発された(図2a、上パネル)。SinRep/LacZを処置しなかった、膵臓にBHKSINLuc2腫瘍を有する対照マウスは、その膵臓において生物発光シグナルを示さなかった。対照の膵臓および処置した膵臓における腫瘍の存在をイメージング後の剖検によって確認した(図2a、下パネル)。
IVIS (登録商標)イメージングシステムにより、ウイルス感染事象をin vivoで追跡することができるようになり、このシステムは、シンドビスベクターの注目すべき標的能力をまさに反映している。これは、イメージングした動物の免疫組織化学分析を使用して、膵臓腫瘍に特異的にベクターが感染したかどうかを検討することにより、さらに十分に理解することができる(図b)。膵臓の腫瘍浸潤が広範囲にわたることはその組織切片から明白である(図2b、左下パネル、組織切片のより明るい領域は腫瘍細胞からなる)。細菌のβ-ガラクトシダーゼをコードしているシンドビスベクター(SinRep/LacZ)を全身へ単回投与した後、膵臓の腫瘍領域のみが、著しくβ-ガラクトシダーゼ特異的抗体で染色され、ベクターの感染の結果としてほとんどすべての腫瘍細胞でβ-ガラクトシダーゼ染色に陽性を示す(図2b、右下パネル、茶色の領域)。シンドビスベクターの感染領域がスライド上の腫瘍領域と重なり得ることは明白である。ほぼ完全な腫瘍感染を高倍率でさらに明瞭に視覚化する(図2c、下パネル)。こうした免疫組織化学的検査による写真は、なぜシンドビスベクターが腫瘍を根絶するのに有効であるかを説明している。それらのベクターは、正常細胞に影響を与えることなくほとんどすべての腫瘍細胞に感染し、これを壊死させる。
(実施例3：シンドビスベクターは腹腔内転移腫瘍に特異的に感染した)
別の一連の実験では、1×106個のBHK細胞をSCIDマウスの膵臓内に接種した。膵臓内BHK腫瘍は、BHKSINLuc2腫瘍よりも速く増殖し、腹腔全体にわたる転移をもたらした(図3)。BHK細胞の接種の8日後、マウスへのSinRep/Lucベクターの単回腹腔内注射により、横隔膜、膵臓、腸間膜、および腹膜での腫瘍成長(図3b)に伴う相当な特異的生物発光シグナル(図3a)が誘発された。バックグランドの生物発光シグナルは、SinRep/Lucベクターの単回腹腔内注射を施した腫瘍なしの対照マウスの腹腔では極微量であった(図3a)。
別の一連の実験では、1×106個のBHK細胞をSCIDマウスの膵臓内に接種した。膵臓内BHK腫瘍は、BHKSINLuc2腫瘍よりも速く増殖し、腹腔全体にわたる転移をもたらした(図3)。BHK細胞の接種の8日後、マウスへのSinRep/Lucベクターの単回腹腔内注射により、横隔膜、膵臓、腸間膜、および腹膜での腫瘍成長(図3b)に伴う相当な特異的生物発光シグナル(図3a)が誘発された。バックグランドの生物発光シグナルは、SinRep/Lucベクターの単回腹腔内注射を施した腫瘍なしの対照マウスの腹腔では極微量であった(図3a)。
こうした結果から、単回腹腔内送達したシンドビスベクターは、腹腔全体にわたって転移したBHK腫瘍に特異的に感染できることが示唆される。したがって、シンドビスベクターは全身に送達されるが、ヒトの進行卵巣癌で観察される典型的な症状である、腹腔全体にわたって転移した微小な腫瘍を検出するための強力なツールとして働くことができる。
(実施例4：SinRep/Lucベクターは腹腔内腫瘍の微小転移を特異的に検出する)
この結果をさらに検討するために、マウスの確立した進行卵巣癌モデルにおいて、シンドビスベクターが微視的な腫瘍に特異的に感染できるかどうかを試験した。これは、ヒトのES-2卵巣癌細胞の腹腔内接種によって実施される。2×106個のES-2細胞の腹腔内接種の5日後、離れたところにある少数の小さな(約2mm)腫瘍クラスターを除いて、腹腔において肉眼で見えるほどの大きな腫瘍増殖は見られなかった。しかし、微視的な腫瘍の転移は、網、腸間膜、および横隔膜においてこの疾患の進行の早期段階で容易に検出することができる(図4a)。ES-2細胞の転移を進行性疾患の早期段階で検出するために、ベクター感染なしでルシフェラーゼ遺伝子を安定に発現するES-2細胞系統、ES-2/Lucを生成した。IVIS (登録商標)イメージングシステムを用いて判定すると、1×106個のES-2/Luc細胞の腹腔内注射により、接種の5日後にES-2細胞の注射と同じパターンの疾患の進行が誘発された(図4b)。しかし、マウスの肉眼的検査および顕微鏡検査と比べると、ES-2/Luc細胞を用いると、腫瘍増殖のより早期の検出が可能となり、試験動物の屠殺の必要無くこのような検出の実施が可能となった。この疾患の早期段階で、ES-2細胞による癌を有するマウスに、SinRep/Lucベクターを単回腹腔内注射することにより、ES-2/Luc細胞を注射したマウスで見られたシグナルに匹敵する、網、腸間膜、および横隔膜における生物発光シグナルの検出が可能となった(図4b)。
この結果をさらに検討するために、マウスの確立した進行卵巣癌モデルにおいて、シンドビスベクターが微視的な腫瘍に特異的に感染できるかどうかを試験した。これは、ヒトのES-2卵巣癌細胞の腹腔内接種によって実施される。2×106個のES-2細胞の腹腔内接種の5日後、離れたところにある少数の小さな(約2mm)腫瘍クラスターを除いて、腹腔において肉眼で見えるほどの大きな腫瘍増殖は見られなかった。しかし、微視的な腫瘍の転移は、網、腸間膜、および横隔膜においてこの疾患の進行の早期段階で容易に検出することができる(図4a)。ES-2細胞の転移を進行性疾患の早期段階で検出するために、ベクター感染なしでルシフェラーゼ遺伝子を安定に発現するES-2細胞系統、ES-2/Lucを生成した。IVIS (登録商標)イメージングシステムを用いて判定すると、1×106個のES-2/Luc細胞の腹腔内注射により、接種の5日後にES-2細胞の注射と同じパターンの疾患の進行が誘発された(図4b)。しかし、マウスの肉眼的検査および顕微鏡検査と比べると、ES-2/Luc細胞を用いると、腫瘍増殖のより早期の検出が可能となり、試験動物の屠殺の必要無くこのような検出の実施が可能となった。この疾患の早期段階で、ES-2細胞による癌を有するマウスに、SinRep/Lucベクターを単回腹腔内注射することにより、ES-2/Luc細胞を注射したマウスで見られたシグナルに匹敵する、網、腸間膜、および横隔膜における生物発光シグナルの検出が可能となった(図4b)。
この観察により、シンドビスベクターが腹腔の微視的な腫瘍を標的とし、これに感染できること、ならびにこのベクターをこのように使用して微小転移を同定できることが実証された。様々な腫瘍に対するシンドビスベクターのこの注目すべき特異性があるので、こうしたベクターは、イメージングに適した様々なレポーター遺伝子組み合わせた場合32、微小転移を同定するためのツールとして働くというこれまで認めらなかった潜在的可能性を有する。
イメージングの後、この進行卵巣癌モデルにおけるこのベクターの治療効果を調査した。予想された通り、マウスにシンドビスベクターを進行卵巣癌の早期段階で毎日処置することにより、この疾患の主要な臨床徴候であり生存期間を延長させる(平均生存期間:未処置の対照=18日目、SinRep/LacZ=25日目、P<0.0001)、腹水症発症の阻害によって判定すると、疾患の進行が有意に抑制された(図4c)。ES-2腫瘍の接種の約18日後、未処置のマウスの約'80%は、この疾患で死亡し、重篤な腹水症を伴う、腸、網、および横隔膜への多数の腫瘍転移を示す(図4c)。20日目までに、約'5%の未処置のマウスが死亡する。
それとは対照的に、シンドビスベクターを処置したマウスでは最初の19日間に腹水症は見られない(図4c)。23日目までは、SinRep/LacZベクターを処置したマウスにおいて肝腫瘍の増殖の開始が観察されなかった。ただし、処置マウスにおける腫瘍増殖は有意に遅延し抑制されるが、根絶することはない。進行卵巣癌のこの非常に攻撃的なモデルでは、処置したものであれ未処置のものであれ、最終的にすべてのマウスがこの疾患のため死亡する。
(実施例5：SinRep/Lucは血流を介して肺転移腫瘍に感染した)
血液によって運ばれるシンドビスベクターにより、転移腫瘍を全身で検出できるかどうかをさらに確認するため、IVIS (登録商標)イメージングシステムを使用して、ベクターが肺で誘発された腫瘍を特異的に標的とするかどうかを判定した。1×106個のBHK細胞の静脈内注射の結果、肺において腫瘍細胞の増殖がもたらされる(図5)。接種の7日後、動物が呼吸困難など腫瘍に関係する症状を示すと、SinRep/Lucベクターを2日間連続で静脈内注射した。また、腫瘍なしの対照マウスにも2日間連続でSinRep/Lucベクターの処置を施した。SinRep/Lucベクターの2回目の処置の翌日、BHK注射マウスの胸部で相当な生物発光シグナルが観察されたが、対照のマウスでは観察されなかった(図5a)。イメージングの後、剖検(図5b)および組織分析(図5c)により、BHK注射マウスでの肺転移および腫瘍増殖が確認された。
[参考文献１]
血液によって運ばれるシンドビスベクターにより、転移腫瘍を全身で検出できるかどうかをさらに確認するため、IVIS (登録商標)イメージングシステムを使用して、ベクターが肺で誘発された腫瘍を特異的に標的とするかどうかを判定した。1×106個のBHK細胞の静脈内注射の結果、肺において腫瘍細胞の増殖がもたらされる(図5)。接種の7日後、動物が呼吸困難など腫瘍に関係する症状を示すと、SinRep/Lucベクターを2日間連続で静脈内注射した。また、腫瘍なしの対照マウスにも2日間連続でSinRep/Lucベクターの処置を施した。SinRep/Lucベクターの2回目の処置の翌日、BHK注射マウスの胸部で相当な生物発光シグナルが観察されたが、対照のマウスでは観察されなかった(図5a)。イメージングの後、剖検(図5b)および組織分析(図5c)により、BHK注射マウスでの肺転移および腫瘍増殖が確認された。
[参考文献１]
下記の実施例6〜11では以下の材料および方法を使用した。
（細胞系統）
ES-2細胞をAmerican Type Culture Collection (ATCC、米国バージニア州Manassas)から入手し、10%FBSを補充したマッコイ(McCoy's) 5A培地(Mediatech社製、米国バージニア州Herndon)中で培養した。ES-2/Fluc細胞は、以前に記載の通り(3)、プラスミドpIRES2-Fluc/EGFPを安定にトランスフェクションしたES-2系統に由来する。ヒトラミニン受容体前駆体(LRP)転写物の5'-CCAGAUCCAGGCAGCCUUC-3'を標的とするヘアピンsiRNA配列を、オンラインのインサートデザインツール(www.ambion.com、Ambion社製、米国テキサス州Austin)を使用して設計し、pSilencer (商標) 2.1-U6 hygroプラスミド(Ambion社製)のBamH I部位に連結させた。siRNA発現カセットを、Pvu II制限酵素を使用してpSilencer (商標) 2.1-U6 hygroプラスミドから切り出し、pIRES2-Fluc/EGFPプラスミドのAfl II部位に挿入しサブクローニングした。このプラスミドをpIRES2-Fluc/EGFP/αLRPと名付け、次いでES-2細胞中に安定にトランスフェクトして、ES-2/Fluc/αLRP細胞系統を生成した。マウス卵巣のMOSEC細胞系統(クローンID8)は、米国カンザスシティーのカンザス大学医学センター(University of Kansas Medical Center)のKatherine F. Roby博士から頂いたものであるが、これを、4%FBSおよび1×ITS (インスリン-トランスフェリン-セレニウム、Mediatech社製)を補充したDMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)中で維持した。
ES-2細胞をAmerican Type Culture Collection (ATCC、米国バージニア州Manassas)から入手し、10%FBSを補充したマッコイ(McCoy's) 5A培地(Mediatech社製、米国バージニア州Herndon)中で培養した。ES-2/Fluc細胞は、以前に記載の通り(3)、プラスミドpIRES2-Fluc/EGFPを安定にトランスフェクションしたES-2系統に由来する。ヒトラミニン受容体前駆体(LRP)転写物の5'-CCAGAUCCAGGCAGCCUUC-3'を標的とするヘアピンsiRNA配列を、オンラインのインサートデザインツール(www.ambion.com、Ambion社製、米国テキサス州Austin)を使用して設計し、pSilencer (商標) 2.1-U6 hygroプラスミド(Ambion社製)のBamH I部位に連結させた。siRNA発現カセットを、Pvu II制限酵素を使用してpSilencer (商標) 2.1-U6 hygroプラスミドから切り出し、pIRES2-Fluc/EGFPプラスミドのAfl II部位に挿入しサブクローニングした。このプラスミドをpIRES2-Fluc/EGFP/αLRPと名付け、次いでES-2細胞中に安定にトランスフェクトして、ES-2/Fluc/αLRP細胞系統を生成した。マウス卵巣のMOSEC細胞系統(クローンID8)は、米国カンザスシティーのカンザス大学医学センター(University of Kansas Medical Center)のKatherine F. Roby博士から頂いたものであるが、これを、4%FBSおよび1×ITS (インスリン-トランスフェリン-セレニウム、Mediatech社製)を補充したDMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)中で維持した。
（シンドビスベクターの作製）
以前に記載の通り(3)、レプリコンRNA (SinRep5)およびヘルパーRNA (DH-BB)をどちらもエレクトロポレーションによりBHK細胞中に導入することにより、様々なシンドビスベクターを作製した。phRL-CMVプラスミド(Promega社製、米国ウィスコンシン州Madison)からウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)遺伝子を切り出し、SinRep5プラスミド(Invitrogen社製、米国カリフォルニア州San Diego)のXba I部位に挿入してSindbis/Rlucベクターを作製した。類似の手順を実施して、pORF-mIL-15プラスミド(InvivoGen社製)から得られたマウスIL-15遺伝子を載せたSindbis/IL-15ベクターを生成した。
以前に記載の通り(3)、レプリコンRNA (SinRep5)およびヘルパーRNA (DH-BB)をどちらもエレクトロポレーションによりBHK細胞中に導入することにより、様々なシンドビスベクターを作製した。phRL-CMVプラスミド(Promega社製、米国ウィスコンシン州Madison)からウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)遺伝子を切り出し、SinRep5プラスミド(Invitrogen社製、米国カリフォルニア州San Diego)のXba I部位に挿入してSindbis/Rlucベクターを作製した。類似の手順を実施して、pORF-mIL-15プラスミド(InvivoGen社製)から得られたマウスIL-15遺伝子を載せたSindbis/IL-15ベクターを生成した。
（β-ガラクトシダーゼ活性の検査）
12ウェルプレート上で、3×105個のES-2/Fluc細胞またはES-2/Fluc/αLRP細胞にSindbis/LacZベクターを感染多重度(MOI)100、10、または1で感染させた。室温での接種の1時間後、細胞をPBSで洗浄し、αMEM/5%FBS中で培養した。その翌日、細胞を200μLのM-PER (登録商標)溶解緩衝液(Pierce Biotechnology社製、米国イリノイ州Rockford)で溶解した。50μLの細胞ライセートを50μLのAll-in-One Beta-Galactosidase Assay Reagent(β-ガラクトシダーゼ分析試薬一式、Pierce Biotechnology社製)中に添加し、室温で5分間インキュベートした後、405nmで読み取った。設定した各MOIについて3つの独立した検査を実施し、感染させたES-2/Fluc細胞と比べた活性の百分率としてデータを示した。
12ウェルプレート上で、3×105個のES-2/Fluc細胞またはES-2/Fluc/αLRP細胞にSindbis/LacZベクターを感染多重度(MOI)100、10、または1で感染させた。室温での接種の1時間後、細胞をPBSで洗浄し、αMEM/5%FBS中で培養した。その翌日、細胞を200μLのM-PER (登録商標)溶解緩衝液(Pierce Biotechnology社製、米国イリノイ州Rockford)で溶解した。50μLの細胞ライセートを50μLのAll-in-One Beta-Galactosidase Assay Reagent(β-ガラクトシダーゼ分析試薬一式、Pierce Biotechnology社製)中に添加し、室温で5分間インキュベートした後、405nmで読み取った。設定した各MOIについて3つの独立した検査を実施し、感染させたES-2/Fluc細胞と比べた活性の百分率としてデータを示した。
（動物モデル）
5日目に、C.B-17-SCIDマウス(雌、6〜8週齢、Taconic社製、米国ニューヨーク州Germantown)に、0.5mLのマッコイ5A培地中の2×106個のES-2細胞を腹腔内注射した。以前に記載の通り(3)、0日目にES-2接種マウスおよび腫瘍なしの対照マウスのどちらにもSindbis/Flucベクターを単回処置し、その翌日(1日目)にIVIS (登録商標)システム100シリーズ(Xenogen社製、米国カリフォルニア州Alameda)を使用してその生物発光シグナルをモニターした。2日目に一部のマウスにSindbis/Flucベクターの2回目の腹腔内処置を施し、3日目に再びIVIS (登録商標)イメージングを実施した。
5日目に、C.B-17-SCIDマウス(雌、6〜8週齢、Taconic社製、米国ニューヨーク州Germantown)に、0.5mLのマッコイ5A培地中の2×106個のES-2細胞を腹腔内注射した。以前に記載の通り(3)、0日目にES-2接種マウスおよび腫瘍なしの対照マウスのどちらにもSindbis/Flucベクターを単回処置し、その翌日(1日目)にIVIS (登録商標)システム100シリーズ(Xenogen社製、米国カリフォルニア州Alameda)を使用してその生物発光シグナルをモニターした。2日目に一部のマウスにSindbis/Flucベクターの2回目の腹腔内処置を施し、3日目に再びIVIS (登録商標)イメージングを実施した。
共存実験では、0日目にSCIDマウスに1.5×106個のES-2/Fluc細胞を腹腔内接種し、5日目にSindbis/Rlucベクター(0.5mLのOptiMEM I中で約107PFU)の単回腹腔内処置を施した。その翌日(6日目)に、0.3mLの0.2mg/mLセレンテラジン(Biotium社製、米国カリフォルニア州Hayward)の腹腔内注射により、麻酔したマウスのRluc活性を求め、続いてIVIS (登録商標)イメージングを5分間実施した。Rlucによって生成された生物発光は短寿命であり、30分以内に次第に消滅していった(19)。30分後、同じマウスに0.3mLの15mg/mL D-ルシフェリン(Biotium社製)を腹腔内注射し、Fluc活性についての2回目のIVIS (登録商標)イメージングを実施した。LIVING IMAGE (登録商標)ソフトウェア(Xenogen社製)を使用して、イメージングデータをグリッド化し、各ボックス領域でその総生物発光シグナルを積分した。
1×107個のマウスMOSEC細胞をC57BL/6マウス(雌、6〜8週齢、Taconic社製、米国ニューヨーク州Germantown)に注射して、進行卵巣癌を誘発させた(18)。接種の4週間後、マウスにSindbis/Flucを腹腔内処置し、その翌日IVIS (登録商標)システムを使用してイメージングした。並行して、腫瘍なしの対照マウスにSinRep/Flucを処置し、これをイメージングした。Sindbis/FlucがMOSEC転移を特異的に標的とすることを視覚化するため、腫瘍接種の7週間後、腫瘍を有するマウスに腹腔内処置を施し、その翌日イメージングした。NIHおよび研究所のガイドラインに従ってすべての動物実験を実施した。
（組織切片およびスライド調製）
以前に記載の通り(3)、組織切片のヘマトキシリン-エオジン染色を実施した。LAMR検出のために、ホルマリン固定しパラフィン包埋した組織上で免疫組織化学的検査を実施した。組織切片(厚さ5μm)を調製して帯電したスライドグラス上に移し、40℃で2時間乾熱処理した。これらの切片を脱パラフィン化し、リン酸緩衝生理食塩水中で元に戻した。1mM EDTA (pH=8)緩衝溶液中で10分間煮沸して抗原検索を実施した。組織切片をウサギポリクローナル一次抗体AB711 (100倍希釈、Abcam社製、英国ケンブリッジ)と一緒に室温で一晩インキュベートした。250倍希釈の二次抗体を有するアルカリホスファターゼ系(VECTASTAIN (登録商標) ABC-APキット、Vector laboratories社製、米国カリフォルニア州Burlingame)を使用して検出を実施し、切片を室温で30分間インキュベートした。ヘマトキシリンを対比染色として使用した。
以前に記載の通り(3)、組織切片のヘマトキシリン-エオジン染色を実施した。LAMR検出のために、ホルマリン固定しパラフィン包埋した組織上で免疫組織化学的検査を実施した。組織切片(厚さ5μm)を調製して帯電したスライドグラス上に移し、40℃で2時間乾熱処理した。これらの切片を脱パラフィン化し、リン酸緩衝生理食塩水中で元に戻した。1mM EDTA (pH=8)緩衝溶液中で10分間煮沸して抗原検索を実施した。組織切片をウサギポリクローナル一次抗体AB711 (100倍希釈、Abcam社製、英国ケンブリッジ)と一緒に室温で一晩インキュベートした。250倍希釈の二次抗体を有するアルカリホスファターゼ系(VECTASTAIN (登録商標) ABC-APキット、Vector laboratories社製、米国カリフォルニア州Burlingame)を使用して検出を実施し、切片を室温で30分間インキュベートした。ヘマトキシリンを対比染色として使用した。
（リアルタイムRT-PCR）
ES-2/Fluc細胞またはES-2/Fluc/αLRP細胞から採取した1000ng、500ng、または250ngの細胞全RNAを、15unitのTHERMOSCRIPT(商標)RNAse H- Reverse Transcriptase (Invitrogen社製)を含む20μLの反応混合液中で42℃で1時間かけてcDNAに逆転写(RT)させた。iCycler iQリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad社製、米国カリフォルニア州Hercules)において、リアルタイム定量PCRを、4μLの逆転写産物、反応緩衝液(1×)、dNTP (各200μM)、ヒトGAPDHプライマーまたはLAMRプライマー(各0.5μM)、1UのTaqポリメラーゼ(Fisher Scientific社製、米国ペンシルベニア州Pittsburgh)、フルオレセイン(100nM)、および1μLのSYBR Green I (10,000倍希釈液を75,000倍(v/v)にまで希釈)を含む20μLの反応混合液中で実施した。95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分の温度サイクルを40サイクル実施した。使用したプライマーの配列は以下の通りであった。
hLAMRフォワードプライマー(エキソン2上): 5'-CTCAAGAGGACCTGGGAGAAGC-3'
hLAMRリバースプライマー(エキソン3上): 5'-TGGCAGCAGCAAACTTCAGC-3'
hGAPDHフォワードプライマー: 5'-CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3'
hGAPDHリバースプライマー: 5'-CCTTGACGGTGCCATGGAATTTGC-3'
ES-2/Fluc細胞またはES-2/Fluc/αLRP細胞から採取した1000ng、500ng、または250ngの細胞全RNAを、15unitのTHERMOSCRIPT(商標)RNAse H- Reverse Transcriptase (Invitrogen社製)を含む20μLの反応混合液中で42℃で1時間かけてcDNAに逆転写(RT)させた。iCycler iQリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad社製、米国カリフォルニア州Hercules)において、リアルタイム定量PCRを、4μLの逆転写産物、反応緩衝液(1×)、dNTP (各200μM)、ヒトGAPDHプライマーまたはLAMRプライマー(各0.5μM)、1UのTaqポリメラーゼ(Fisher Scientific社製、米国ペンシルベニア州Pittsburgh)、フルオレセイン(100nM)、および1μLのSYBR Green I (10,000倍希釈液を75,000倍(v/v)にまで希釈)を含む20μLの反応混合液中で実施した。95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分の温度サイクルを40サイクル実施した。使用したプライマーの配列は以下の通りであった。
hLAMRフォワードプライマー(エキソン2上): 5'-CTCAAGAGGACCTGGGAGAAGC-3'
hLAMRリバースプライマー(エキソン3上): 5'-TGGCAGCAGCAAACTTCAGC-3'
hGAPDHフォワードプライマー: 5'-CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3'
hGAPDHリバースプライマー: 5'-CCTTGACGGTGCCATGGAATTTGC-3'
比較分析のためhGAPDHをハウスキーピング遺伝子として選択した。GAPDH内部対照と比べたLAMRの発現量変化(fold change)をfold change=2Δ(ΔC T )(式中、ΔCT=CT(laminin receptor)-CT(GAPDH)、およびΔ(ΔCT)=ΔCT(ES-2/Fluc/αLRP)-ΔCT(ES-2/Fluc))によって求めた。CTは、蛍光データ収集のため84℃で求めた閾値サイクルである。
（結果）
(実施例6：シンドビスベクターは腹腔全体にわたるES-2転移を特異的に標的とする)
Fluc遺伝子を載せたSindbis/Flucの腹腔内注射(0日目)により、SCIDマウスにおけるES-2転移の特異的感染/検出が可能となった。ES-2接種マウスでは、膵臓/網、腸および腹膜脂肪に相当する領域でかなりのベクター感染が観察された(図6A、右パネル)。腫瘍なしの一部の対照マウスの下腹部で低レベルのSindbis/Fluc感染が観察された(図6A、左パネル)。腹膜の摘出後、一連の別のIVIS (登録商標)イメージングを実施して、対象マウスおよびES-2接種マウスの両方におけるベクター感染の正確な位置を調査した(図6B、1日目)。
(実施例6：シンドビスベクターは腹腔全体にわたるES-2転移を特異的に標的とする)
Fluc遺伝子を載せたSindbis/Flucの腹腔内注射(0日目)により、SCIDマウスにおけるES-2転移の特異的感染/検出が可能となった。ES-2接種マウスでは、膵臓/網、腸および腹膜脂肪に相当する領域でかなりのベクター感染が観察された(図6A、右パネル)。腫瘍なしの一部の対照マウスの下腹部で低レベルのSindbis/Fluc感染が観察された(図6A、左パネル)。腹膜の摘出後、一連の別のIVIS (登録商標)イメージングを実施して、対象マウスおよびES-2接種マウスの両方におけるベクター感染の正確な位置を調査した(図6B、1日目)。
シンドビスベクターの反復投与により腫瘍なしのマウスで感染が蓄積されるかどうかを判定するため、2日目に、2回目の投与としてSindbis/Flucベクターを対象マウスおよびES-2接種マウスのどちらにも腹腔内注射し、3日目にIVIS (登録商標)イメージングを実施した。興味深いことに、2回目のSindbis/Fluc注射を施した対照マウスでは腹腔でIVIS (登録商標)シグナルが検出されなかったが、ES-2接種マウスでは腫瘍転移でのベクター感染のシグナルは高いままであった(図6B、3日目)。腹膜脂肪、腹膜、横隔膜、膵臓、および腸などいくつかの組織/器官における腫瘍転移に特異的なベクター感染を組織学的検査によって確認した(図6C、(ES-2接種3日目に)図6Bの同じマウスから摘出した器官)。最初の処置後の脂肪組織で観察された一時的なバックグラウンドシグナルを除いて、腫瘍なしの対照マウスでは、腹腔でベクター感染のシグナルは観察されなかった。0日目にSindbis/Flucの単回処置を施したES-2接種マウスでは、2回処置したマウスと比べて、3日目に腫瘍での生物発光シグナルが低下した(データは図示せず)。2回処置のマウスで生物発光シグナルが増加したことから、ベクターの単回処置では広がった腹腔内転移を検出することができるが、転移性の同じ移植片内のすべての腫瘍細胞に感染するには十分でないことが示唆された。シンドビスウイルスによる癌治療の成功には、良好な治療効果を得るために反復処置が必要である。
膵臓、網、腸間膜、および腹膜を含めて腹腔のいくつかの組織内での腫瘍転移の存在を疾患進行の早期段階で組織学的検査によって確認した(図6D)。また、腫瘍接種の4週間後、肺においてもES-2腫瘍の微小転移が観察された(図6D)。胸部の縦隔リンパ節で腫瘍の存在が観察されたので(データは図示せず)、肺の微小転移はリンパ経路を経由して確立され得る。
腫瘍細胞へのシンドビスウイルス感染の程度および特異性を確立するため、腫瘍細胞およびベクターからの生物発光シグナルを独立に測定するイメージング検査を実施した。ES-2/Fluc細胞はホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するので、IVIS (登録商標)イメージング用に、ウミシイタケの種Renilla renifomisからクローニングした異なるルシフェラーゼ(Rluc)の遺伝子を載せたシンドビスベクターSindbis/Rlucを生成した。ホタルルシフェラーゼではD-ルシフェリンを使用するが、ウミシイタケルシフェラーゼではセレンテラジンを使用して生物発光を生成する；2種のルシフェラーゼは、基質特異性が高く、交差反応しない(19)。IVIS (登録商標)システムを使用して、基質を変えることによりRluc活性(図7、左)およびFluc活性(図7、右)をin vivoで別々に測定した。定量分析のために、LIVING IMAGE (登録商標)ソフトウェアを使用して、同じ動物のSindbis/RlucおよびES-2/Flucから生成された生物発光シグナルを定量した。RlucシグナルおよびFlucシグナルのイメージをグリッド化し(12×8=96ボックス領域)、対応する領域を統計上の相関関係について分析した。非常に有意な相関関係が確立された(P<0.0001)。したがって、データ分析から、シンドビスベクターの単回腹腔内送達により腹腔全体にわたって転移した腫瘍細胞への効率的な感染がもたらされることが示唆される。
シンドビスウイルスは感染した哺乳動物細胞で細胞変性効果を誘発し、それはアポトーシスを誘発できることから生じるものであることが知られている(4〜7)。シンドビスウイルスの感染の後、ES-2細胞内におけるカスパーゼ-3活性の増加が観察された(データは図示せず)。したがって、ES-2/Flucモデルの転移卵巣癌に対する、様々な遺伝子を載せたシンドビスベクターの効果を比較した。3種の異なるベクター、細菌ガラクトシダーゼ遺伝子を載せたSindbis/LacZ、マウスIL-12遺伝子を載せたSindbis/IL-12、マウスIL-15遺伝子を載せたSindbis/IL-15を試験した。IL-12およびIL-15は、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性化により抗腫瘍活性を誘発することが知られている(20, 21)。0日目に、全てのSCIDマウスに1.5×106個のES-2細胞を腹腔内接種し、毎日の処置は1日目に開始した。対照マウスにはベクター処置を施さなかった。1日目、5日目、13日目、および20日目にIVIS (登録商標)イメージングにより全身の総光子数を求めて、ES-2/Fluc転移の疾患進行を判定した(図8A) (3)。抗腫瘍性サイトカイン遺伝子なしでも、Sindbis/LacZベクターにより、未処置の対照マウスと比べて疾患進行が有意に抑制された(図8B、二元配置ANOVA: P<0.0001)。IL-12およびIL-15サイトカイン遺伝子により、Sindbis/LacZを処置したマウスと比べて、シンドビスベクターの抗腫瘍活性がさらに増強された(図8B、二元配置ANOVA: Sindbis/IL-12ではP=0.0081、Sindbis/IL-15ではP=0.0026)。5日以内に、Sindbis/IL-12処置により、腫瘍量が平均してその11分の1未満に減少し、約140,000個の腫瘍細胞になった (図8B)。これは、未処置のマウスと比べると95%以上減少したことを示す（光子数の増加により5日目までに細胞の数が平均して1.9倍に増加し、約3×106個の腫瘍細胞になった）。こうした結果から、特異的感染/検出に加えて、ベクターの反復処置により、腫瘍増殖がおそらくアポトーシスの誘発を介して抑制されることが示唆される。さらに、ベクター系中に抗腫瘍遺伝子を組み込むことにより腫瘍に対する効果がさらに増強される。
(実施例7：シンドビスベクターは同系の動物モデルでマウスのMOSEC卵巣癌転移を特異的に標的とする)
上記の進行卵巣癌モデルは、進行性疾患を急速に発症したSCIDマウスへのヒトES-2細胞の接種により確立された。このモデルでは、腫瘍特異的感染がシンドビスベクターのヒト細胞に対する優先的な親和性によって起こる可能性を除外することはできない。さらに、SCIDマウスは免疫系が完全ではないので、このモデルでは腫瘍細胞へのシンドビスベクターの送達およびターゲッティングに対する潜在的に可能な免疫応答の影響は評価されない。C57BL/6免疫応答性マウスにおいて以前に確立された同系の卵巣癌モデル(18)を使用した。C57BL/6マウスへのMOSEC細胞の腹腔内接種により、SCIDマウスへのES-2細胞の腹腔内注射によって誘発される場合と類似の疾患が誘発されるが、MOSEC細胞の方が動物においてゆっくりと増殖する。MOSECの腹腔内接種の4週間後、マウスにSindbis/Flucの単回腹腔内処置を施した。また、腫瘍なしの対照マウスにもSindbis/Flucの処置を施した。ES-2/FlucによるSCIDモデルでの場合と同様に、接種マウスの腹腔内に広がった転移を示す相当な生物発光シグナルが観察された(図9A)。対照マウスでは腹膜脂肪において低いバックグランドのシグナルが観察されることがあったが、通常有意な生物発光シグナルは観察されなかった。腫瘍転移での特異的感染を視覚化するため、MOSEC腫瘍を7週間有するC57BL/6マウスを使用した。この後の時点で腹水症が見られ(図9B、左パネル)、剖検の際には広範囲にわたる腫瘍転移が視覚的に観察された(図9B、右下パネル)。Sindbis/Flucベクターを単回腹腔内注射した場合、全身のイメージングにより生物発光シグナルが腫瘍接種の4週間後に処置したマウスより低いことが示された。これはおそらく、発光シグナルの励起およびそれに続く検出を減少させる重篤な腹水症の発症によって起こり、投与したベクターは、ずっと広い領域に感染するはずであり、したがって集中することはない。Sindbis/Flucベクターが、腹腔内の大部分のMOSEC転移を特異的に標的とすることが実証された(図9B、右上パネル)。さらに、このベクターは、ES-2モデルと同様にいくつかの組織の転移に効率的に感染することができた(図9C)。組織学的検査によりこうした組織における腫瘍転移を確認した(図9D)。
上記の進行卵巣癌モデルは、進行性疾患を急速に発症したSCIDマウスへのヒトES-2細胞の接種により確立された。このモデルでは、腫瘍特異的感染がシンドビスベクターのヒト細胞に対する優先的な親和性によって起こる可能性を除外することはできない。さらに、SCIDマウスは免疫系が完全ではないので、このモデルでは腫瘍細胞へのシンドビスベクターの送達およびターゲッティングに対する潜在的に可能な免疫応答の影響は評価されない。C57BL/6免疫応答性マウスにおいて以前に確立された同系の卵巣癌モデル(18)を使用した。C57BL/6マウスへのMOSEC細胞の腹腔内接種により、SCIDマウスへのES-2細胞の腹腔内注射によって誘発される場合と類似の疾患が誘発されるが、MOSEC細胞の方が動物においてゆっくりと増殖する。MOSECの腹腔内接種の4週間後、マウスにSindbis/Flucの単回腹腔内処置を施した。また、腫瘍なしの対照マウスにもSindbis/Flucの処置を施した。ES-2/FlucによるSCIDモデルでの場合と同様に、接種マウスの腹腔内に広がった転移を示す相当な生物発光シグナルが観察された(図9A)。対照マウスでは腹膜脂肪において低いバックグランドのシグナルが観察されることがあったが、通常有意な生物発光シグナルは観察されなかった。腫瘍転移での特異的感染を視覚化するため、MOSEC腫瘍を7週間有するC57BL/6マウスを使用した。この後の時点で腹水症が見られ(図9B、左パネル)、剖検の際には広範囲にわたる腫瘍転移が視覚的に観察された(図9B、右下パネル)。Sindbis/Flucベクターを単回腹腔内注射した場合、全身のイメージングにより生物発光シグナルが腫瘍接種の4週間後に処置したマウスより低いことが示された。これはおそらく、発光シグナルの励起およびそれに続く検出を減少させる重篤な腹水症の発症によって起こり、投与したベクターは、ずっと広い領域に感染するはずであり、したがって集中することはない。Sindbis/Flucベクターが、腹腔内の大部分のMOSEC転移を特異的に標的とすることが実証された(図9B、右上パネル)。さらに、このベクターは、ES-2モデルと同様にいくつかの組織の転移に効率的に感染することができた(図9C)。組織学的検査によりこうした組織における腫瘍転移を確認した(図9D)。
特異的な検出に加えて、シンドビスベクターにより疾患の進行が抑制された。Sindbis/Flucを処置したマウスでは、処置の2週間後腹水症の発症率が低くなる(腫瘍接種の7週間後)。その時までに、Sindbis/Fluc処置マウスでは8例のうち1例でしか重篤な腹水症が発症しなかったのと比べて、未処置の対照マウスでは7例のうち5例で発症した(図10A)。さらに、腹水症となった処置マウスは、症状がかなり軽かった。疾患の抑制は、シンドビス処置マウスにおける生存期間の有意な延長にも反映された(図10B)。
(実施例8：LAMRの発現レベルはシンドビスベクターの感染性と相関関係がある)
LAMRは、哺乳動物細胞へのシンドビスベクターの感染に対する細胞表面受容体として同定されている(8, 9)。このことが、LAMRの発現に差があるのでシンドビスベクターは正常細胞よりも腫瘍に優先的に感染するという仮説と適合するかどうかを立証するため、ラミニン受容体前駆体(LRP)に特異的な抗体を用いて腫瘍切片の免疫組織化学的染色を実施した。ES-2/Fluc腫瘍では、LAMRが正常組織よりも高レベルで発現する(図11A)。同様に、MOSEC転移、ならびにやはりシンドビスベクターの標的となった(3)、MSV-RGR/p15+/-トランスジェニックマウスの自然発生腫瘍においてもLAMRのより高レベルでの発現が観察された(図11A)。
LAMRは、哺乳動物細胞へのシンドビスベクターの感染に対する細胞表面受容体として同定されている(8, 9)。このことが、LAMRの発現に差があるのでシンドビスベクターは正常細胞よりも腫瘍に優先的に感染するという仮説と適合するかどうかを立証するため、ラミニン受容体前駆体(LRP)に特異的な抗体を用いて腫瘍切片の免疫組織化学的染色を実施した。ES-2/Fluc腫瘍では、LAMRが正常組織よりも高レベルで発現する(図11A)。同様に、MOSEC転移、ならびにやはりシンドビスベクターの標的となった(3)、MSV-RGR/p15+/-トランスジェニックマウスの自然発生腫瘍においてもLAMRのより高レベルでの発現が観察された(図11A)。
LAMRの発現とシンドビスベクターの感染との相関関係をさらに調査するため、ES-2/Fluc細胞の場合と同様にFlucを発現するプラスミド主鎖に加え、LRPメッセンジャーに特異的なsiRNAを安定に発現する、ES-2に由来する細胞系統ES-2/Fluc/αLRPを生成した。リアルタイムRT-PCRを実施して、ES-2/Fluc細胞およびES-2/Fluc/αLRP細胞におけるLAMRの発現レベルを求めた。内部対照として働く、ヒトGAPDHのmRNAに特異的な一対のプライマーを含めた。この結果から、ES-2/Fluc/αLRP細胞におけるLAMRの発現レベルは、ES-2/Fluc細胞に比べてその約40%であることが示される(図11B)。この2つの細胞系統へのシンドビスベクターの感染性を判定するため、ES-2/Fluc細胞およびES-2/Fluc/αLRP細胞にSindbis/LacZベクターを100、10、および1のMOIで感染させた。仮説の通り、LAMRの発現がより少ないES-2/Fluc/αLRP細胞では、ES-2/Fluc細胞と比べてシンドビスベクターによる感染がより少ない(図11C)。こうしたデータから、ES-2細胞へのシンドビスの感染性は、LAMRの発現レベルと相関関係があり、LAMRがシンドビスの感染に対する哺乳動物受容体であることを示した以前の報告と合致することが示唆される(8, 9)。
（考察）
上記の実施例6〜11では、シンドビスウイルスベクターにより腹腔内の微視的および巨視的な腫瘍転移に特異的に感染しそれを検出できることが実証された。腫瘍検出のためのシンドビスウイルス遺伝子治療用ベクターの利点は、このベクターがその導入遺伝子マーカーの過剰発現によりシグナルが著しく増幅され得ることである。腫瘍細胞が存在する場所はマウスと比べてヒトの方が潜在的に深いため、ルシフェラーゼの発現はヒトのこのような細胞をイメージングするのに適していない可能性があるが、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ(HSV1-tk)およびドーパミン2受容体(D2R)の遺伝子などの他のさらなる組織貫通型レポーター遺伝子を、陽電子放射断層撮影(PET)を使用した腫瘍検出のためにシンドビスベクター中に組み込むことができる(22)。
上記の実施例6〜11では、シンドビスウイルスベクターにより腹腔内の微視的および巨視的な腫瘍転移に特異的に感染しそれを検出できることが実証された。腫瘍検出のためのシンドビスウイルス遺伝子治療用ベクターの利点は、このベクターがその導入遺伝子マーカーの過剰発現によりシグナルが著しく増幅され得ることである。腫瘍細胞が存在する場所はマウスと比べてヒトの方が潜在的に深いため、ルシフェラーゼの発現はヒトのこのような細胞をイメージングするのに適していない可能性があるが、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ(HSV1-tk)およびドーパミン2受容体(D2R)の遺伝子などの他のさらなる組織貫通型レポーター遺伝子を、陽電子放射断層撮影(PET)を使用した腫瘍検出のためにシンドビスベクター中に組み込むことができる(22)。
腫瘍細胞を特異的に検出するために、ウイルスベクター系では、感染に対する腫瘍特異的受容体か、あるいは腫瘍細胞におけるレポーター導入遺伝子発現のための腫瘍特異的プロモーターの使用のどちらかが必要とされている。一般に、遺伝子活性化用の腫瘍特異的プロモーターを使用したベクターは、少量の標的腫瘍細胞だけによって取り込まれ発現される。それとは対照的に、シンドビスウイルスに基づくベクターは、遍在的に発現し腫瘍細胞と正常細胞の間で示差的に発現するレポーターを介して感染するので、こうしたベクターにより、効率的な腫瘍ターゲッティング、およびウイルスプロモーターを使用した強い導入遺伝子発現が実現される。シンドビスベクターは標的細胞に感染すると、導入遺伝子を急速かつ大規模に増幅させる。したがって、シンドビスベクターは、全身投与により腫瘍細胞のより速くより高感度の検出をもたらす。さらに、これまでの導入遺伝子発現の生化学的分析(2)に加え、このイメージングデータから、シンドビスベクターはマウスでの全身送達により肝臓または他の器官に感染せず、したがって転移腫瘍の増殖を抑制することができるシンドビスベクターを比較的高用量で使用できるようになることが示唆される。
シンドビスウイルスに対する細胞表面受容体は、細胞外マトリックスとの細胞間相互作用を媒介するグリコシル化膜タンパク質である、高親和性LAMRとして同定されており(8)、(正常細胞と比べて)大部分の腫瘍では過剰発現され空いている(23-26)。いくつかの報告では、ヒト腫瘍細胞上のLAMRがより高レベルになると、より攻撃的な侵襲性および転移拡散など増殖に有利になる(10〜14)。また、この偶然事象により、シンドビスウイルスが付着し感染する、正常細胞および腫瘍細胞の表面上の示差的マーカーももたらされる。
卵巣癌細胞ではこの受容体が高レベルで発現することが示されているので、LAMRは卵巣癌細胞上の魅力的な標的である(15-17)。進行卵巣癌モデルでは、ES-2/Fluc細胞およびMOSEC細胞はどちらもLAMRを正常組織よりも高レベルで発現し(図11A)、シンドビスベクターで特異的に感染させることができる(図6および図10)。やはりシンドビスベクターの標的となった(3)、MSV-RGR/p15+/-トランスジェニックマウスの自然発生腫瘍でも、より高レベルでの類似のLAMR発現が観察された。腹腔内では、腹水中の腫瘍細胞上の大部分のLAMRは、リガンドであるラミニンに占有されておらず、したがってシンドビスベクター感染の理想的な標的として働く可能性が高い。本研究でシンドビスベクターの処置により腹水症の形成が抑制されたという結果はこの見方を支持している。
LAMRの正確な構成はまだ知られていないが、LAMRの必須の一成分は37-kDaラミニン受容体前駆体(LRP)として同定されている(27)。LRPは、翻訳後に修飾され、他のグリコシル化タンパク質とヘテロ二量体を形成した後(28)、細胞表面に移動すると考えられている。その適当なパートナーの1つは、へパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)である(29)。これは、いくつかの研究室ではLAMRがプリオンタンパク質の標的でもあると同定されていること(29〜34)に留意することが重要である。例えば、Hundtら(29)は、プリオンタンパク質がこのLAMRの2つの部位に結合することを示している。この結合部位のうちの一方は、最適に結合するかどうかがHSPG分子のへパラン硫酸アームの有無に依存するが、他方の結合部位はへパラン硫酸とは無関係に機能するように思われる。
へパラン硫酸は細胞へのシンドビスベクターの付着においてある役割を果たしていることが提唱されている(35)。しかし、へパラン硫酸との相互作用により感染効率が増強されるが、この相互作用は感染に必要ではない(35)。したがって、シンドビスベクターは、LRPおよびへパラン硫酸の両方との相互作用を介して腫瘍細胞に感染することができる。
本明細書で提示したデータから、シンドビスベクターの腫瘍特異性は、ヒト細胞とマウス細胞で親和性が異なることが原因である可能性は低いことが示唆される。このベクターは、SCIDマウスにおけるヒトES-2/Fluc細胞の場合(図6)と同様に、マウスMOSEC卵巣癌細胞を特異的に感染/検出することができる(図9)。さらに、シンドビスベクターは、MSV-RGR/p15+/-トランスジェニックマウスの自然発生腫瘍に特異的に感染することもできる(3)。後者のモデルにはヒト細胞は関与しないので、シンドビスベクターの特異的感染は、LAMRの発現レベルなど正常細胞と腫瘍細胞との根本的な違いが原因である可能性が高い。
シンドビスベクターの感染により、細胞障害性の導入遺伝子なしでもin vitro (4〜7)およびin vivo (2)でアポトーシスが誘発される。感染細胞に対して細胞障害性があるにもかかわらず、実験動物におけるシンドビスベクターの全身送達は観察可能な罹患率を示さない。
ほとんどの場合、野生型の複製可能なシンドビスウイルスが血流に進入した後、ウイルス力価はすべての器官において高レベルに達する(36, 37)。しかし、野生型ウイルスでは、軽微な自己限定性疾患(通常、持続期間がわずか1週間で、軽度の総合的症状のみを伴う)を伴う(36, 37)。すべてのベクターを作製するのに使用するシンドビスの実験系統は、血流を通してすべての器官に到達する能力を維持しているものの、ヒトにおいてどんな疾患も、またはどんな有害な結果も生じさせないことが示されている(36, 37)。その理由の1つは、使用したすべてのベクターが複製欠損型であることである。すなわち、こうしたベクターは細胞に感染した後、他の細胞に伝播することはできない。それらのベクターはほぼすべての標的細胞に感染することができるが、複製せず組込みが起こらないことから非常に安全である。
腫瘍なしのマウスでは、最初のベクター腹腔内処置の後、腹膜脂肪においてベクター感染が非常に低レベルで観察された(図7)。理由についてはさらに調査する必要があるが、この低レベルの感染はその後のベクター処置の後に消失した(図7)。すなわち、シンドビスベクターの2回目の注射後、正常マウスで感染は検出できない。それとは対照的に、特異的な腫瘍感染は処置の過程中持続する。こうした現象が免疫不全のSCIDマウスで起こるため、正常脂肪組織におけるベクター感染の減少は、I型インターフェロン(IFN-I)の生成など、ベクターの二次感染から周囲の正常組織を守る、他の先天性の抗ウイルス応答が原因である可能性がある。いくつかの研究では、腫瘍形成中に、正常細胞と比べて腫瘍細胞は発達してインターフェロン刺激に対する応答が低くなることが示唆されている(38)。したがって、最初のベクター感染の後、正常な脂肪組織を二次感染から守るためにIFN-Iの生成が誘発される可能性が高い。一方、腫瘍は、IFN-I応答を示さないことが多いが、さらにシンドビスベクターの二次感染にさらされ、最終的にベクターの細胞障害性のため死滅する。この点で、IFN-Iの応答性の違いによりシンドビスベクターに腫瘍細胞に対する別のレベルの特異性がもたらされ得る。
本研究はすべて複製欠損型ベクターを用いて実施した。複製可能なベクター系を使用すると抗腫瘍作用を増強させることができると主張することは妥当である。しかし、理論に縛られることを望まないが、シンドビスベクターではこれは必要ないであろうと考えられる。むしろ、追加の研究、すなわちシンドビスベクターと他の作用物質との組合せにより、卵巣腫瘍細胞の完全な根絶を達成することができるプロトコルの開発が可能となるかもしれない。シンドビスベクターは、遺伝子治療に使用するのに複製可能型ウイルスよりも安全性の上で決定的に有利である。
結論として、攻撃的なマウス卵巣癌モデルでは、シンドビスベクターにより癌の遺伝子治療の2つの主要な治療目標、すなわち原発腫瘍細胞および転移腫瘍細胞の特異的検出、ならびに効率的な腫瘍抑制を達成することができる。
[参考文献２]
[参考文献２]
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載の実施形態以外の本発明の様々な変更形態は、上記の説明および添付の図面から当分野の技術者に明らかであろう。このような実施形態は、添付の特許請求の範囲に含まれるものである。
すべての値は近似値であり、説明のために提供するものであることをさらに理解されたい。
特許、特許出願、刊行物、製品説明書、およびプロトコルを、本願明細書を通じて引用するが、あらゆる目的のため参照によりその開示全体を本明細書に組み込む。
Claims (22)
- 哺乳動物において抗癌治療をモニターする方法であって、検出可能な標識をコードしている遺伝子を含むシンドビスウイルスを、このような処置を必要とする哺乳動物に診断上有効な量で投与すること、および前記哺乳動物体内の癌細胞の量を測定することを含み、癌細胞の量が前記癌細胞によって産生される標識の量に比例する方法。
- 前記シンドビスウイルスベクターを、前記抗癌治療の前に、抗癌治療とほぼ同時に、または抗癌治療の後に投与する、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子が、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ドーパミン2受容体、緑色蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼ、およびウミシイタケルシフェラーゼから選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記シンドビスウイルスベクターが複製欠損型ベクターである、請求項1に記載の方法。
- 前記標識を検出する手段を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な標識がヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子であり、前記標識を検出する前記手段が放射性標識した2'-フルオロ-2'-デオキシ-1-β-D-アルビノフラノシル-5-ヨードウラシル(FIAU)である、請求項5に記載の方法。
- 前記手段を陽電子放射断層撮影によって同定する、請求項6に記載の方法。
- 前記標識が緑色蛍光タンパク質であり、前記標識を、(a)前記癌細胞の組織切片を得ること、および(b)前記組織切片を蛍光顕微鏡で検査することによって検出する、請求項4に記載の方法。
- 前記標識がホタルもしくはウミシイタケのルシフェラーゼであり、前記標識を冷却電荷結合素子カメラによって検出する、請求項4に記載の方法。
- 前記シンドビスウイルスを前記抗癌治療の後に投与する、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物体内で癌細胞を同定する方法であって、検出可能な標識をコードしている遺伝子を含むシンドビスウイルスを、このような処置を必要とする哺乳動物に診断上有効な量で投与すること、および前記標識をアッセイすることを含み、前記細胞が前記標識を発現するならば前記細胞が癌細胞である方法。
- 前記検出可能な標識をコードしている前記遺伝子が、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼ、およびウミシイタケルシフェラーゼから選択される、請求項11に記載の方法。
- 抗癌治療剤を前記哺乳動物に投与する前に、前記癌細胞を同定する、請求項12に記載の方法。
- 抗癌治療剤の投与後に、前記癌細胞を同定する、請求項12に記載の方法。
- 前記標識を検出する手段を投与することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 哺乳動物の体内で癌細胞の量を測定する方法であって、(a)検出可能な標識をコードしている遺伝子を含むシンドビスウイルスを、このような処置を必要とする哺乳動物に診断上有効な量で投与する工程、および(b)前記検出可能な標識の量を測定する工程を含み、前記哺乳動物体内の癌細胞の量が前記標識の量に比例する方法。
- 前記遺伝子が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、ドーパミン2受容体、緑色蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼ、およびウミシイタケルシフェラーゼから選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記標識を検出する手段を投与することをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記検出可能な標識がヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子であり、前記標識を検出する前記手段が放射性標識した2'-フルオロ-2'-デオキシ-1-β-D-アルビノフラノシル-5-ヨードウラシル(FIAU)である、請求項18に記載の方法。
- 前記手段を陽電子放射断層撮影によって同定する、請求項19に記載の方法。
- 前記標識が緑色蛍光タンパク質であり、前記標識を、(a)前記癌細胞の組織切片を得ること、および(b)前記組織切片を蛍光顕微鏡で検査することによって検出する、請求項17に記載の方法。
- 前記標識がホタルもしくはウミシイタケのルシフェラーゼであり、前記標識を冷却電荷結合素子カメラによって検出する、請求項17に記載の方法。
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