WO2011131736A1 - Verfahren zur herstellung von rekombinantem thrombin - Google Patents

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WO2011131736A1
WO2011131736A1 PCT/EP2011/056359 EP2011056359W WO2011131736A1 WO 2011131736 A1 WO2011131736 A1 WO 2011131736A1 EP 2011056359 W EP2011056359 W EP 2011056359W WO 2011131736 A1 WO2011131736 A1 WO 2011131736A1
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WO
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thrombin
derivative
folded
folding
prathrombin
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PCT/EP2011/056359
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Andreas Anton
Arndt Dietrich
Jochen Koetter
Joerg Schaeffner
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Scil Proteins Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)

Definitions

  • the invention relates to processes for the production of folded bowelthrombin and thrombin from inclusion bodies.
  • the invention also provides solutions containing folded proteins which can be produced according to the method of the invention.
  • the central enzymes of the blood coagulation cascade are serine proteases, which are synthesized in the liver as slightly larger inactive precursors, so-called zymogens. Among them is prothrombin, the inactive precursor of thrombin, which is also referred to as factor II. Thrombin plays a central role in the blood coagulation cascade and fibrinolysis.
  • the central function of blood clotting makes thrombin interesting for use in human medicine. It has long been used as a drug, for example, to close wounds as quickly as possible (Zymogenetics, Inc. "Annual Report on Form 10-K For the Year Ended December 31, 2003" 2003; Nakajima et al Ann. Thorac Surg : 1793-1794).
  • thrombin is also involved in many other processes. For example, it initiates the termination of prothrombin activation and the initiation of fibrinolysis (Esmon & Jackson Journal of Biological Chemistry, 1974 249 (24): 7791-7797). Furthermore, various studies have shown that thrombin is involved in embryogenesis, carcinogenesis, regulation of vascular pressure, Alzheimer's disease, and wound healing processes (Grand et al Biochemical Journal, 1996 313 (2): 353-368, Tsopanoglou & Maragoudakis Journal of Biological Chemistry 1999 274 (34): 23969-23976), because of its high polyfunctionality, thrombin is a very interesting drug for medical and biotechnological applications. onsproteinen and thus used for the removal of cleaning and assay tags (Jenny et al., Protein Expression and Purification, 2003 31 (1): 1-11.).
  • Thrombin is assigned to the class of serine proteases because of its homology to other proteases such as chymotrypsin, trypsin and elastase.
  • the serine proteases share a common mechanism of catalysis.
  • the active site of the serine proteases is characterized by the typical catalytic triad of serine-histidine aspartate.
  • Thrombin consists of two chains, the A and B chains, which are linked by a disulfide bridge. The shorter A chain of thrombin shows no similarities with the pancreatic enzymes trypsin, chymotrypsin and elastase.
  • thrombin also consists essentially of two six-stranded ⁇ -sheets, each rolled into a barrel-like structure. The V-shaped A chain runs in a notched by the larger B-chain notch on the opposite side of the active site.
  • the associated zymogen prothrombin (72 kDa) consists of a Gla domain, 2 Kringeldomänen and an A and a B chain (Hiller 2003, Doctoral Thesis of the University of Bielefeld, Butenas & Mann Biochemistry, Moscow, Russian Federation, 2002, 67 (1): 3-12).
  • the two A and B chains are linked by a disulfide bridge in the active protein.
  • Prothrombin is cleaved between Arg 2 7i-Thr 2 72 and between Arg 32 o-He 32 i by the prothrombinase complex. This will remove the N-terminus and separate the A and B chains.
  • recombinant thrombin r / i-thrombin
  • the risk of transmission of infectious diseases such as HIV and hepatitis B can be reduced to a minimum.
  • an immune response in humans is hardly to be expected, since it is an active substance which has very similar features to the body's own thrombin.
  • a considerable cost reduction compared to conventional processes is to be expected, since in high cell density fermentation processes, as a rule, very high product yields can be achieved.
  • thrombin in eukaryotic and prokaryotic cells
  • recovery of thrombin is from the inactive precursor molecule prethrombin-2, which after a first chromatographic purification step is activated by the metalloprotease ecarin (Russo et al, 1997, Protein Expr. Purif., 10 (2): 214 Yonemura et al, 2004, J. Biochem. (Tokyo), 135 (5): 577-82; Soejima et al, Journal of Biochemistry, 2001, 130 (2): 269-277).
  • ZymoGenetics Inc. has developed a production process for rh-thrombin in eukaryotic CHO cells, starting with prethrombin-1 as a precursor molecule.
  • JP 2002 306163 discloses a process for producing folded thrombin.
  • the method includes expression in E. coli, recovery of inclusion bodies, and solubilization in solubilization buffer.
  • Detergents e.g. Tween, Brij, or Triton used.
  • the invention is in particular the object of developing a process for the production of thrombin and prathombin, which is easy to carry out and achieves a high yield.
  • the process should make it possible to produce folded lessnessthrombin and thrombin in high yields and in high purity.
  • the method should preferably use a prokaryotic expression system.
  • the invention relates to a process for producing folded bowelthrombin or a derivative thereof, wherein inclusion bodies containing unfolded yogthrombin or a derivative thereof are solubilized in a solubilization buffer containing at least one chaotropic compound and at least one organic disulfide compound.
  • Pre-thrombin-2 is preferably used.
  • the protein has 309 amino acids and a molecular weight of 35,485.5 Da.
  • the amino acid sequence is shown in FIG.
  • the human prathrombin can be cleaved to a-thrombin which has 295 AS and a molecular weight of 33810.7 Da.
  • the sequence and the A and B chains are shown in FIG.
  • Derivatives of lessnessthrombin can also be used according to the invention. These are derivatives in which the processed form has a thrombin-like activity, in particular protease activity.
  • the derivatives of prethrombin are corresponding precursor polypeptides from which the active thrombin derivatives can be obtained by proteolytic cleavage.
  • the derivatives are in particular those which can be obtained by amino acid mutation, deletion or insertion, or by chemical modification of the polypeptide.
  • the derivatives have a sequence identity to the wild-type protein of greater than 80%, greater than 90%, or greater than 95%.
  • the derivatives have at least one cysteine per polypeptide chain, but preferably all the natural cysteines.
  • inclusion bodies are solubilized.
  • Inclusion bodies (IB) are accumulations of mostly defective or incompletely folded proteins. They form inside cells, such as bacterial cells, such as E. coli, with excessive expression of recombinant proteins.
  • the inclusion bodies used according to the invention preferably contain the folded lessnessthrombin in high purity. This means that they have at least 60, at least 70, at least 80 or at least 90% by weight of prethrombin (based on the total amount of protein).
  • the solubilization buffer contains a disulfide compound.
  • the disulfide compound is capable of forming mixed disulfides with thiol groups (-SH) of cysteines of the polypeptides in the inclusion bodies.
  • the disulfide is added to the solution.
  • the disulfide does not refer to proteins that are contained in the inclusion bodies and that may contain disulfide bonds.
  • the disulfide is not a true peptide.
  • the disulfide is a low molecular weight compound.
  • the molecular weight is, for example, lower than 2000 g / mol or as 1000 g / mol.
  • the disulfide is used, for example, in a concentration of 5 mM to 1 M, in particular 10 mM to 0.5 M.
  • the disulfide compound is glutathione disulfide.
  • Glutathione also ⁇ -L-glutamyl-L-cysteinylglycine, is a pseudotripeptide formed from the three amino acids glutamic acid, cysteine and glycine.
  • GSH is present in the cytoplasm of both prokaryotes and eukaryotes and participates in the formation of disulfide bonds. It is in equilibrium with the dimer GSSG, which has a disulfide bridge.
  • Glutathione reacts in a disulfide exchange reaction with cysteines R-SH and R'-SH of two polypeptides or of a single polypeptide: R-SH + GSSG RSSG + GSH.
  • the RSSG is called a mixed disulfide. It is reacted with another cysteine of a polypeptide, resulting in a disulfide bridge between two cysteines:
  • GSH reduced form
  • the solubilization buffer contains at least one chaotropic substance.
  • Chaotropic refers to chemical substances that dissolve ordered hydrogen bonds in water. By breaking the hydrogen bonds, the chaotropic substances disturb the water structure and cause disorder (increase in entropy). The cause of this is that the formation of the necessary for solvation H 2 0-cage structures is prevented.
  • amino acids they reduce hydrophobic effects and have a denaturing effect on proteins, since a driving force of protein folding is the assembly of the hydrophobic amino acids in the water.
  • any substance which exerts the hydrophobic effect in the solubilization buffer and thus has a denaturing effect on the proteins can be used as the chotropotropic substance.
  • Chaotropic substances are generally salts or low molecular weight compounds such as urea. Chaotropic substances are distinctly different from detergents since they have no hydrophobic radical, such as an alkyl radical, in the molecule. In general, the chaotropic effect is accompanied by an improvement in the solubility of the protein, in this case praethrombin.
  • the chaotropic compound is selected from guanidinium salts, in particular guanidinium hydrochloride and guanidinium thiocyanate, iodides, barium salts, thiocyanates, urea and perchlorates.
  • the chaotropic compounds are used in conventional amounts.
  • 4-8 M guanidinium hydrochloride or 4-9 M urea can be used.
  • the solubilization buffer is a Tris buffer.
  • the reagent capable of forming mixed disulfides with the -SH groups of the protein in the inclusion bodies is GSSG and the chaotropic substance is guanidinium hydrochloride.
  • the solubilization buffer may contain other conventional additives, for example EDTA or salts.
  • the pH of the solubilization buffer is, for example, between 6 and 11, preferably between 7 and 10.
  • the solubilization is preferably mechanically supported, for example by conventional homogenization equipment or by means of ultrasound. After solubilization, remaining solids are preferably removed. The supernatant contains the solubilized prathrombin.
  • the inclusion bodies were obtained by recombinant expression of prethrombin in prokaryotic cells.
  • the prokaryotic host cell is a bacterium, preferably E. coli.
  • the bacterium is E. coli JM108 (DSMZ 5585, 3.3.2006), preferably transformed with a plasmid derived from pSCIL008.
  • excess disulfide compound is removed. The removal of the reagent is preferably carried out with a method for buffer exchange, ie via dialysis, chromatography or tangential flow filtration.
  • the solubilized prathrombin is renatured in a renaturation buffer comprising at least one reducing agent, at least one folding assistant and divalent cations.
  • the solubilizate is added to the folding batch in several fractions or continuously over several days.
  • the solubilizate is added in a "pulse renaturation" by rapid dilution to the solubilizate. In this case, for example, 6 pulses can be performed at intervals of 24 hours. The number of pulses is adjusted so that the concentration of unfolded protein does not become too high after the addition of the solubilization mixture, otherwise aggregates are obtained.
  • each pulse about 0.1 g / 1 protein is newly transferred to the folding batch (based on the protein concentration in the folding batch after addition of the solubilizate).
  • a final protein concentration of 0.6 g / 1 can be achieved.
  • the reducing agent is an organic monosulfide.
  • GSH glutathione
  • the folding assistant is selected from arginine and glycerol.
  • Folding assistants Such compounds are known to the person skilled in the art and they can support the folding in different ways Arginine is believed to destabilize misfolded intermediates so that they can be re-formatted (from a thermodynamic dead end) are at least partially unfolded and thus again properly foldable are.
  • Glycerol normally stabilizes proteins.
  • folding aids are compounds which, in the process according to the invention, increase the absolute yield of folded prethrombin by more than 5%, in particular by more than 10 or more than 20% (based on the total amount of prethrombin used for the folding), compared with a method without the use of the folding helper.
  • the renaturation buffer contains divalent cations. Preference is given to the use of calcium salts, in particular calcium chloride.
  • the renaturation buffer is preferably a Tris buffer.
  • the method for the production of folded prathrombin or a derivative thereof comprises the following steps: inclusion bodies, the unfolded prethrombin or a Derivatives thereof are solubilized in a solubilization buffer containing at least one chaotropic compound, and at least one organic disulfide compound, and the solubilized prathrombin or derivative thereof is then renatured in a renaturation buffer containing at least one reducing agent, at least one folding aid and divalent cations wherein both the solubilization buffer and the renaturation buffer contain no detergent.
  • the solubilization buffer and / or the renaturation buffer consequently have no detergent. It has been found according to the invention that the use of detergents for the solubilization and / or folding of lessnessthrombin is not required. This is advantageous because certain detergents are relatively aggressive chemical substances which may not be present in pharmaceutical products or only in small amounts and thus have to be removed consuming. The method according to the invention is therefore advantageous over the method of Soe- jima et. al., 2001, in which such aggressive detergents (Triton X-100 or Brij-58) are used to fold the protein.
  • Triton X-100 or Brij-58 Triton X-100 or Brij-58
  • the preferred absence of detergents does not only affect the above-mentioned solubilization and renaturation spuff, but all the reagents and process steps used. In other words, no detergents are used in the entire preparation process according to the invention, the preparation process is thus detergent-free. This concerns both aspects, both the production of folded prathrombin and the production of thrombin from this folded prathrombin.
  • renaturation yields of up to 25%, based on the total prethrombin in the inclusion bodies, could be achieved.
  • a renaturation yield of at least 10% or at least 20% is achieved.
  • the final protein concentration may be, for example, 0.6 g / l. It is preferably between 0.1 and 2 g / l, in particular higher than 0.3 g / l, in order to avoid large folding volumes in the production.
  • chromatographic purification in particular by means of hydrophobic interaction chromatography, is particularly advantageous for further purification.
  • a column for example, a Phenylsepharose HP GE Healthcare can be used.
  • the HIC chromatography is preferably carried out in the presence of ammonium sulfate, preferably at a concentration of 1.15 M in the high salt buffer. It was found, that under these conditions, product yields of 70 to 95% can be achieved with a step gradient elution.
  • the purification is not done by hirudin-based affinity chromatography.
  • preference is given to no purification step with hirudin-based affinity chromatography.
  • the renatured prethrombin is preferably converted into thrombin by enzymatic proteolysis, in particular with a small venom protease, preferably ecarin.
  • the serine protease ecarin cleaves the peptide bond between the A and B chains at the position arginine 320 and isoleucine 321 of prathrombin-2.
  • From the resulting thrombin is by autocatalytic cleavage of its own N-terminus ⁇ -thrombin.
  • thrombin is thus obtained as an intermediate and a-thrombin as the final product with sufficient incubation time.
  • thrombin In the case of incomplete autocatalytic cleavage, a mixture of thrombin and thrombin is obtained. In the following, the term "thrombin” also stands for this mixture.
  • proteases which have a functionality similar to ecarin. The protease is preferably used in a concentration of less than 2 U / ml, preferably less than 1 U / ml or less than 0.5 U / ml.
  • the thrombin and / or ⁇ -thrombin is purified by chromatography after proteolysis.
  • the purification is carried out by hydrophobic interaction chromatography (HIC).
  • HIC hydrophobic interaction chromatography
  • IEX ion exchange chromatography
  • the invention it is preferred according to the invention to purify the folded bowelthrombin after renaturation and the thrombin after the proteolytic cleavage of the prethrombin by means of HIC.
  • the purification of cleaved bowelthrombin in aqueous solution or of thrombin or cc-thrombin in aqueous solution by HIC offers advantages which are not limited to the present special process for the production of folded lessnessthrombin from inclusion bodies having the features of claim 1.
  • the invention therefore also generally relates to the purification of aqueous solutions containing folded prethrombin or thrombin or cc-thrombin by means of HIC.
  • a further chromatographic purification step is carried out.
  • IEX ion exchange chromatography
  • the method according to the invention comprises the following steps: a) Expression of recombinant bowelthrombin in prokaryotic cells and isolation of the yogthrombin-containing inclusion bodies b) mixing the inclusion bodies with a suitable solubilization buffer comprising at least one chaotropic substance and a disulfide compound which can form mixed disulfides with the -SH groups of the protein in the inclusion bodies,
  • renaturation in a suitable detergent-free buffer containing at least one reducing agent, a folding assistant and divalent cations, e) purification of the renatured praethrombin,
  • the inclusion bodies are mixed in a ratio of 1: 4 to 1:19 (1 g IB paste + 4 ml solubilization buffer) with a suitable buffer having a pH in the neutral basic range, containing 10 mM. 0.5 M GSSG, 4-8 M guanidinium hydrochloride (GuaHCl) and 0.1-10 mM EDTA.
  • step b) the mixture of inclusion bodies in the ratio of 1: 9 with a suitable buffer having a pH in the neutral-slightly basic range, containing 0.1 M GSSG, 5 M guanidine hydrochloride (GuaHCl) and 1mM EDTA.
  • a suitable buffer having a pH in the neutral-slightly basic range containing 0.1 M GSSG, 5 M guanidine hydrochloride (GuaHCl) and 1mM EDTA.
  • step c) the removal of excess reagent to form mixed disulfides is achieved by buffer changes in 3-8 M, preferably 5 M, guanidine hydrochloride at acidic pH (pH 3.0).
  • the pulse renaturation in step d) with 0.01-1.0 g / 1 protein (based on the protein concentration in the folding batch per pulse) in a suitable detergent-free buffer with neutral slightly basic pH containing 0.1-3 mM GSH, 0.1-2 M arginine, 0.001 - IM CaCl 2 , 0.1-50 mM EDTA and 1-40% glycerol.
  • step d) is accomplished by rapidly diluting 0.1 g / l solubilisate in a suitable detergent-free neutral pH slightly alkaline buffer containing 0.75 mM GSH, 1 M arginine, 50 mM CaCl 2 , 1 mM EDTA and 20% glycerol, wherein the protein concentration in the folding batch per pulse increases by 0.1 g / 1 and 6 pulses are performed with an interval of 24 h.
  • the present invention describes a novel prokaryotic process for the production of thrombin on an industrial scale, in which the yield of prethrombin is increased by a multiple and thus significantly reduces the cost and the cost compared to known methods.
  • the increased yield is achieved in particular by new solubilization and renaturation processes.
  • FIG. 1 shows the purity of prethrombin-2 after renaturation in the SDS-PAGE gel.
  • the renaturation of lessnessthrombin-2 was carried out in the pulse renaturation process up to a final protein concentration of 0.6 g / l. Renaturation yields of up to 25% were achieved. Shown is the renaturation approach in Coomassie stained SDS-PAGE gel.
  • For 2 shows the purification of ⁇ -thrombin via hydrophobic interaction chromatography (Toyopearl Butyl-650S).
  • the filtered ecarin cleavage (4.5 ml + 4.5 ml high salt buffer: 2 M ammonium sulphate, 50 mM phosphate buffer pH 6.0) was purified via a 4 ml HIC column (Tricorn 5/200). The equilibration was carried out with 50% high salt buffer and the linear gradient elution over 20 CV to 50 mM phosphate buffer pH 6.0.
  • Figure 3 shows the amino acid sequence, structure and important properties of prathrombin-2.
  • Figure 4 shows the amino acid sequence, structure and important properties of alpha-thrombin.
  • Example 1 Expression of r / i-prathrombin-2
  • the bacterial host E. coli JM108 which is used for the expression of r / i-prathrombin-2 (DSMZ 5585; Fthi ⁇ (lac-proAB) end Al gyrA96 relAl phx hsdRll supE44 recA), is proline auxotrophic by the use of the plasmid designated pSCIL048 is abolished.
  • the plasmid pSCIL048 is based on the plasmid pSCIL008 (see WO05061716). The strain can not synthesize thiamine (Vieira & Messing, 1982 Gene Oct; 19 (3): 259-68).
  • Pre-thrombin-2 is expressed under the control of the tac promoter located on pSCIL048.
  • the vector pSCIL048 used here is a high copy plasmid with a kanamycin resistance. Expression occurs in defined mineral salt medium and is induced by the addition of IPTG.
  • the lessnessthrombin-2 is deposited in the form of inclusion bodies (IBs) in the cytosol.
  • Biomass production was at 37 ° C. The aim of this fermentation was to extract product and biomass for subsequent process steps. To control overexpression of the target protein during the fermentation process, samples were analyzed before and after induction by SDS-PAGE. A biomass specific increase in protein concentration could be observed up to 3 h after induction.
  • Example 2 Cell Disruption and Inclusion Bodies (IB) Preparation
  • the expression of the target protein lessnessthrombin-2 took place in the form of IBs.
  • the cell digestion and the IB preparation were carried out according to standard protocols and can be carried out on a laboratory scale up to a processing of about 200 g of biomass.
  • the IBs were added at a ratio of 1 g IB paste + 9 ml solubilization buffer with 5 M GuaHCl; 0.1M Tris-HCl; 1mM EDTA; Homogenize 0.1 M GSSG pH 8.5 and solubilise at RT for 3 h. After a centrifugation step at 50,000 ⁇ g for 30 min, a recapitulation step in 5 M GuaHCl, 1 mM HCl pH 3.0 to separate free GSSG / GSH mixture.
  • a buffering step was performed in 5M GuaHCl (3-8M), 1mM HCl pH 3.0 (acidic pH is important if the solubilizate is not added directly to the folding mixture is) for the separation of free GSSG / GSH mixture.
  • the pulse renaturation was carried out by rapidly diluting the solubilizate in the folding buffer 1 M arginine, 50 mM Tris, 50 mM CaCl 2 , 1 mM EDTA, 20% glycerol, 0.75 mM GSH pH 8.5, preferably up to 6 pulses in one time interval of 24 h were set. Per pulse, 0.1 g / l of protein were newly transferred to the folding mixture (based on the protein concentration in the folding mixture after addition of the solubilizate). In the folding tank, a final protein concentration was determined. tion of 0.6 g / 1 achieved.
  • FIG. 1 shows the purity of the product after renaturation. Renaturation yields of 25, based on the amount of solubilisate introduced into the folding batch, were achieved by this process.
  • the filtered ecarin cleavage was used as a starting material for the chromatographic purification.
  • the main goal of the purification was the depletion of uncleaved prathrombin-2 and the autocatalytic fission products of a-thrombin.
  • Prethrombin-2 is more than 95% pure at the time of ecarin cleavage.
  • they were enriched by incubation of the cleavage approaches for a further 24 h at 37 ° C.
  • thrombin derivatives by ion exchange chromatography was difficult because they have almost identical pI values (pI ⁇ 9).
  • pI ⁇ 9 The pI values of ⁇ -thrombin and its autolysis products were determined experimentally by 2D gel electrophoresis. In addition to cation exchange materials, therefore, hydrophobic interaction chromatography materials were tested.
  • FIG. 2 shows the chromatogram of a purification over a 4 ml HIC column (Toyopearl Butyl-650S).
  • 4.5 ml of the filtered ecarin cleavage were diluted 1: 1 with high salt buffer (2 M ammonium sulphate, 50 mM phosphate buffer pH 6.0) prior to application to the column.
  • the elution was carried out by means of a linear gradient (start with 50% high salt buffer) on 50 mM phosphate buffer pH 6.0 over 20 CV.
  • PMSF was added immediately after chromatography to the main fractions to a final concentration of 1 mM to inhibit further autolysis.
  • the yield of ⁇ -thrombin in the main peak is 65% (determined with UV 2 8o) -
  • the product yields of native prathromonom-2 described in the literature are between 25 and 200 mg / l of fermentation medium in eukaryotic expression systems (Russo et al., 1997, Yonemura et al., 2004).
  • the yields of native prathrombin-2 achieved according to the invention are 400 mg / l of fermentation medium. Yields of a-thrombin of 200 mg / l fermentation medium with an rp-HPLC purity of at least 95% are achieved.
  • the prokaryotic expression system used is easier to establish than known eukaryotic methods.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Präthrombin, wobei Einschlusskörperchen, die nicht gefaltetes Präthrombin oder ein Derivat davon enthalten, in einem Solubilisierungspuffer solubilisiert werden, der mindestens eine chaotrope Verbindung und mindestens eine organische Disulfidverbindung enthält. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Thrombin und α-Thrombin sowie Derivaten davon. Gegenstand der Erfindung sind auch Lösungen, die gefaltete Proteine enthalten, welche gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar sind.

Description

Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Thrombin
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Präthrombin und Thrombin aus Einschlusskörperchen. Gegenstand der Erfindung sind auch Lösungen, enthaltend gefaltete Proteine, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar sind.
Stand der Technik Die zentralen Enzyme der Blutgerinnungskaskade sind Serinproteasen, die in der Leber als etwas größere inaktive Vorstufen, sogenannte Zymogene, synthetisiert werden. Zu ihnen zählt Prothrombin, die inaktive Vorstufe von Thrombin, welches auch als Faktor II bezeichnet wird. Thrombin spielt eine zentrale Rolle in der Blutgerinnungskaskade und der Fibrinolyse. Die zentrale Funktion bei der Blutge- rinnung macht Thrombin für die Anwendung in der humanen Medizin interessant. Es wird als Medikament seit langem angewendet, um beispielsweise Wunden möglichst schnell zu verschließen (Zymogenetics, Inc. "Annual Report on Form 10-K For the Year Ended December 31, 2003" 2003; Nakajima et al Ann. Thorac. Surg. 2005 79: 1793-1794).
Daneben ist Thrombin auch an vielen weiteren Prozessen beteiligt. So initiiert es zum Beispiel den Abbruch der Prothrombinaktivierung und den Start der Fibrinolyse (Esmon & Jackson Journal of Biological Chemistry. 1974 249(24): 7791- 7797). Des Weiteren haben verschiedene Untersuchungen gezeigt, dass Thrombin an der Embryogenese, der Kanzerogenese, der Regulierung des Gefäßdruckes, der Alzheimererkrankung und an Wundheilungsprozessen beteiligt ist (Grand et al Biochemical Journal." 1996 313(2): 353-368; Tsopanoglou & Maragoudakis Journal of Biological Chemistry. 1999 274(34): 23969-23976). Auf Grund seiner hohen Polyfunktionalität ist Thrombin ein sehr interessanter Wirkstoff für medi- zinische und biotechnologische Anwendungen. Es wird zur Spaltung von Fusi- onsproteinen und somit zur Entfernung von Reinigungs- und Assaytags eingesetzt (Jenny et al., Protein Expression and Purification, 2003 31(1): 1-11.).
Thrombin wird aufgrund seiner Homologie zu anderen Proteasen wie Chy- motrypsin, Trypsin und Elastase der Klasse der Serinproteasen zugeordnet. Den Serinproteasen ist ein gleicher Katalysemechanismus gemeinsam. Das aktive Zentrum der Serinproteasen ist durch die für sie typische katalytische Triade Se- rin-Histidin-Aspartat charakterisiert. Thrombin besteht aus zwei Ketten, die A- und die B-Kette, die über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die kürzere A-Kette des Thrombins zeigt keine Gemeinsamkeiten mit den Pankreasenzymen Trypsin, Chymotrypsin und Elastase. Die B-Kette dieser Serinproteasen, die drei weitere intramolekulare Disulfidbrücken aufweist, unterscheidet sich dagegen kaum (Bode et al. Protein Science. 1992 1(4): 426-471. Stubbs & Bode Thrombosis Research. 1993 69(1): 1-58 Stubbs& Bode Trends Biochem Sei. 1995 Jan; 20(l):23-8. Review. Erratum in: Trends Biochem Sei 1995 Mar; 20(3): 131). Wie alle Serinproteasen besteht auch das Thrombin im wesentlichem aus zwei sechsträngigen ß-Faltblättern, die jeweils zu einer fassartigen Struktur zusammengerollt sind. Die V-förmige A-Kette verläuft in einer durch die größere B-Kette ausgesparten Kerbe auf der dem aktiven Zentrum gegenüberliegenden Seite.
Das zugehörige Zymogen Prothrombin (72 kDa) besteht aus einer Gla-Domäne, 2 Kringeldomänen und einer A- und einer B-Kette (Hiller 2003, Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Universität Bielefeld, Butenas & Mann Biochemistry, Moscow, Russian Federation, 2002, 67(1): 3-12). Die beiden A- und B-Ketten sind im aktiven Protein über eine Disulfidbrücke verbunden. Durch den Prothrombinasekomplex wird Prothrombin zwischen Arg27i-Thr272 sowie zwischen Arg32o-He32i gespalten. Dadurch wird der N- Terminus entfernt und die A- und B-Kette voneinander getrennt. Je nach Reihenfolge dieser Aktivierung entstehen unterschiedliche Zwischenprodukte, Mei- zothrombin und Präthrombin-2 (Rösing et al. Journal of Biological Chemistry, 1986 261: 4224-4228.). Die Verwendung von rekombinantem Thrombin (r/i-Thrombin) als Wirkstoff stellt eine sinnvolle Alternative zu den sich derzeit auf dem Markt befindlichen Produkten dar, welche aus bovinem und humanem Blutplasma gewonnen werden. Zum einen kann mit dem Einsatz von r/i-Thrombin das Risiko der Übertragung von Infektionskrankheiten wie beispielsweise HIV und Hepatitis B auf ein Minimum reduziert werden. Zum anderen ist mit einer Immunantwort beim Menschen kaum zu rechnen, da es sich um einen Wirkstoff handelt, welcher sehr ähnliche Merkmale zum körpereigenen -Thrombin aufweist. Weiterhin ist bei der rekombinanten Herstellung mit einer erheblichen Kostenreduktion im Vergleich zu her- kömmlichen Prozessen zu rechnen, da in Hochzelldichtefermentationsprozessen in der Regel sehr hohe Produktausbeuten erreicht werden können.
In der Literatur sind verschiedene Verfahren zur rekombinanten Herstellung von -Thrombin in eukaryontischen und prokaryotischen Zellen beschrieben. In den meisten Verfahren erfolgt die Gewinnung von -Thrombin aus dem inaktiven Vorläufermolekül Präthrombin-2, welches nach einem ersten chromatographischen Reinigungsschritt, durch die Metalloprotease Ecarin aktiviert wird (Russo et al, 1997, Protein Expr. Purif., 10(2):214-25; Yonemura et al, 2004, J. Biochem. (Tokyo), 135(5):577-82; Soejima et al, Journal of Biochemistry, 2001, 130(2): 269-277). Beispielsweise hat ZymoGenetics Inc. ein Herstellungsverfahren für rh- Thrombin in eukaryontischen CHO-Zellen entwickelt, wobei von Präthrombin- 1 als Vorläufermolekül ausgegangen wird.
Die Herstellung von rekombinanten Proteinen in Säugerzellen erfordert in der Regel hohe Kosten, Zeit und liefert moderate Produktausbeuten. In den bekannten eukaryontischen Fermentationsprozessen werden Produktausbeuten von 25 bis 140 mg/1 Fermentationsmedium erreicht. Das Zielprotein Präthrombin-2 wird dabei in das Medium sezerniert (Russo et al. 1997, Yonemura et al. 2004). Zur Verbesserung dieser kritischen Parameter stellt die Herstellung in Prokaryo- ten eine Alternative dar. Soejima et al., 2001 offenbaren ein Verfahrung zur Expression von Präthrombin-2 in Escherichia coli (E. coli) mit anschließenden Schritten zur Solubilisierung und Faltung. Es werden nur geringe Produktausbeuten an gefaltetem nativem Präthrombin-2 erreicht. Im Vergleich zu den Ausbeuten, die in eukaryontischen Expressionssystemen erreicht werden, erweist sich der von Soejima et al. 2001 beschriebene Prozess als nachteilig. In dem von Soejima et al., 2001 beschriebenen Verfahren werden Detergentien wie Triton X-100 oder Brij-58 eingesetzt.
JP 2002 306163 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Throm- bin. Das Verfahren schließt die Expression in E. coli, die Gewinnung der Einschlußkörperchen sowie deren Solubilisierung in Solubilisierungspuffer ein. Es werden weiterhin Detergentien, wie z.B. Tween, Brij, oder Triton verwendet.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Präthrombin und Thrombin bereitzustellen, das die oben beschriebenen Nachteile überwindet. Der Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Thrombin und Präthrombin zu entwickeln, das einfach durchführbar ist und eine hohe Ausbeute erzielt.
Dabei soll es das Verfahren ermöglichen, gefaltetes Präthrombin und Thrombin in hohen Ausbeuten und in hoher Reinheit herzustellen. Das Verfahren soll bevorzugt ein prokaryotisches Expressions System nutzen.
Gegenstand der Erfindung: Überraschenderweise wird die Aufgabe durch Verfahren gemäß den Patentansprüchen gelöst. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Präthrombin oder einem Derivat davon, wobei Einschlusskörperchen, die nicht gefaltetes Präthrombin oder ein Derivat davon enthalten, in einem Solubilisie- rungspuffer solubilisiert werden, der mindestens eine chaotrope Verbindung und mindestens eine organische Disulfidverbindung enthält.
Das erfindungs gemäße Verfahren dient zur Herstellung und Reinigung von menschlichem Präthrombin. Bevorzugt wird Präthrombin-2 eingesetzt. Das Protein weist 309 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 35485,5 Da auf. Die Aminosäuresequenz ist in Figur 3 gezeigt. Das humane Präthrombin kann zu a- Thrombin gespalten werden, das 295 AS und ein Molekulargewicht von 33810,7 Da aufweist. Die Sequenz und die A- und B-Kette sind in Figur 4 gezeigt.
Erfindungsgemäß können auch Derivate von Präthrombin eingesetzt werden. Da- bei handelt es sich um Derivate, bei denen die prozessierte Form eine thrombi- nähnliche Aktivität, insbesondere Proteaseaktivität, aufweisen. Die Derivate von Präthrombin sind entsprechende Vorläufer-Polypeptide, aus denen durch proteolytische Spaltung die aktiven Thrombin-Derivate erhalten werden können. Die Derivate sind insbesondere solche, die durch Aminosäuremutation, -deletion oder - Insertion erhalten werden können, oder durch chemische Modifizierung des Polypeptids. Bevorzugt weisen die Derivate eine Sequenzidentität zum Wildtyp- Protein von mehr als 80%, mehr als 90% oder mehr als 95% auf. Die Derivate weisen mindestens ein Cystein pro Polypeptidkette auf, bevorzugt jedoch alle na- tiven Cysteine. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Ver- fahren allgemein auch mit Derivaten von Präthrombin durchführbar ist. Nach der Faltung und Abspaltung von Präpeptiden werden die entsprechenden Derivate von Thrombin oder -Thrombin erhalten. Daher betreffen Ausführungen, die nachfolgend zu dem Verfahren gemacht werden und bei denen auf Präthrombin, Thrombin und -Thrombin Bezug genommen wird, gleichermaßen die Derivate dieser Polypeptide. Bei den nachfolgenden allgemeinen Erläuterungen kann also der Begriff "Präthrombin" mit "Präthrombin oder Derivaten von Präthrombin" gleichgesetzt werden. Dies gilt gleichermaßen für Thrombin und -Thrombin.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Einschlusskörperchen solubili- siert. Einschlusskörperchen (Inclusion Bodies, IB) sind Ansammlungen von zumeist fehlerhaft oder unvollständig gefalteten Proteinen. Sie bilden sich im Inneren von Zellen, beispielsweise Bakterienzellen, wie E. coli, bei übermäßiger Expression rekombinanter Proteine. Bevorzugt enthalten die erfindungs gemäß eingesetzten Einschlusskörperchen das gefaltete Präthrombin in hoher Reinheit. Dies bedeutet, dass sie mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80 oder mindestens 90 Gew.- Präthrombin (bezogen auf die Gesamtmenge Protein) aufweisen.
In dem Solubilisierungspuffer ist eine Disulfidverbindung enthalten. Die Disul- fidverbindung ist in der Lage, mit Thiolgruppen (-SH) von Cysteinen der Poly- peptide in den Einschlusskörperchen gemischte Disulfide zu bilden. Das Disulfid wird der Lösung zugesetzt. Mit dem Disulfid werden nicht Proteine bezeichnet, die in den Einschlusskörpern enthalten sind und die möglicherweise Disulfidbrü- cken enthalten. Bevorzugt ist das Disulfid nicht ein echtes Peptid. Bevorzugt ist das Disulfid eine niedermolekulare Verbindung. Das Molekulargewicht ist bei- spielsweise niedriger als 2000 g/Mol oder als 1000 g/Mol. Das Disulfid wird beispielsweise in einer Konzentration von 5 mM bis 1 M, insbesondere 10 mM bis 0,5 M, eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Disulfidverbindung Glutathion-Disulfid. Glutathion (GSH), auch γ-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin, ist ein Pseudotripeptid, das aus den drei Aminosäuren Glutaminsäure, Cystein und Glycin gebildet wird. GSH ist im Cytoplasma von sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten vorhanden und an der Ausbildung von Disulfidbrücken beteiligt. Es liegt in einem Gleichgewicht mit dem Dimer GSSG vor, das eine Disulfidbrücke aufweist. Glutathion reagiert in einer Disulfidaustauschreaktion mit Cysteinen R- SH und R'-SH von zwei Polypeptiden oder von einem einzigen Polypeptid: R-SH + GSSG R-S-S-G + GSH.
Das RSSG bezeichnet man als gemischtes Disulfid. Es wird mit einem weiteren Cystein eines Polypeptides umgesetzt, so dass im Ergebnis eine Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinen erhalten wird:
R-S-S-G + HS-R' -»· R-S-S-R' + GSH.
Im Cytosol wird Glutathion enzymatisch in reduzierter Form gehalten (GSH). Man spricht daher von "reduzierenden Bedingungen" im Cytosol. In dem Solubi- lisierungspuffer werden Bedingungen eingestellt, so dass die enthaltene Disulfid- verbindung die Ausbildung von Disulfidbrücken gemäß den oben beschriebenen Reaktionen katalysiert. Das GSSG wird beispielsweise in einer Konzentration von 10 mM bis 0,5 M eingesetzt.
In dem Solubilisierungspuffer ist mindestens eine chaotrope Substanz enthalten. Als chaotrop werden chemische Substanzen bezeichnet, die geordnete Wasserstoffbrückenbindungen in Wasser auflösen. Indem die Wasserstoffbrückenbindungen aufgebrochen werden, stören die chaotropen Substanzen die Was- serstruktur und sorgen für Unordnung (Zunahme der Entropie). Die Ursache dessen ist, dass die Bildung der zur Solvatisierung notwendigen H20-Käfigstrukturen verhindert wird. Bei Aminosäuren vermindern sie hydrophobe Effekte und wirken denaturierend auf Proteine, da eine treibende Kraft der Proteinfaltung die Zusammenlagerung der hydrophoben Aminosäuren im Wasser ist. Allgemein ist als cha- otrope Substanz jede Substanz einsetzbar, die in dem Solubilisierungspuffer den hydrophoben Effekt ausübt und somit auf die Proteine denaturierend wirkt. Chaotrope Substanzen sind im allgemeinen Salze oder niedermolekulare Verbindungen wie Harnstoff. Chaotrope Substanzen sind deutlich von Detergentien unterschieden, da sie keinen hydrophoben Rest, wie einen Alkylrest, im Molekül auf- weisen. Allgemein geht die chaotrope Wirkung mit der Verbesserung der Löslichkeit des Proteins, hier des Präthrombins, einher. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die chaotrope Verbindung ausgewählt aus Guanidiniumsalzen, insbesondere Guanidiniumhydrochlorid und Guanidiniumthiocyanat, Jodiden, Bariumsalzen, Thiocyanaten, Harnstoff und Perchloraten.
Die chaotropen Verbindungen werden in üblichen Mengen eingesetzt. Beispielsweise können 4-8 M Guanidiniumhydrochlorid oder 4-9 M Harnstoff eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Solubilisierungspuf- fer ein Tris-Puffer. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in das Reagens, welches mit den -SH Gruppen des Proteins in den Einschlusskörperchen gemischte Disulfide bilden kann, GSSG und die chaotrope Substanz ist Guanidiniumhydrochlorid.
Der Solubilisierungspuffer kann weitere übliche Zusätze enthalten, beispielsweise EDTA oder Salze. Der pH-Wert des Solubilisierungspuffers liegt beispielsweise zwischen 6 und 11, bevorzugt zwischen 7 und 10. Die Solubilisierung wird bevorzugt mechanisch unterstützt, beispielsweise mit üblichen Homogenisierungsgerä- ten oder mittels Ultraschall. Nach dem Solubilisieren werden bevorzugt verbliebene Feststoffe abgetrennt. In dem Überstand ist das solubilisierte Präthrombin enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden die Einschlusskör- perchen durch rekombinante Expression von Präthrombin in prokaryotischen Zellen erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die proka- ryotische Wirtszelle ein Bakterium, bevorzugt E. coli. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Bakterium E. coli JM108 (DSMZ 5585; 3.3.2006), bevorzugt transformiert mit einem aus pSCIL008 hervorgehenden Plasmid. Bevorzugt wird nach der Solubilisierung überschüssige Disulfidverbindung entfernt. Die Entfernung des Reagens erfolgt bevorzugt mit einer Methode zum Pufferaustausch, also über Dialyse, Chromatographie oder Tangential Fluss Filtration.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das solubilisierte Präthrombin in einem Renaturierungspuffer renaturiert, der mindestens ein Reduktionsmittel, mindestens einen Faltungshelfer und divalente Kationen aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Solubilisat in meh- reren Fraktionen oder kontinuierlich über mehrere Tage zum Faltungsansatz gegeben. Bevorzugt wird das Solubilisat in einer "Pulsrenaturierung" durch schnelles Verdünnen zu dem Solubilisat gegeben. Dabei können beispielsweise 6 Pulse im zeitlichen Abstand von 24 Stunden durchgeführt werden. Die Zahl der Pulse wird so eingestellt, dass die Konzentration an noch nicht gefaltetem Protein nach der Zugabe des Solubilisierungsansatzes nicht zu hoch wird, da sonst Aggregate erhalten werden. Beispielsweise werden mit jedem Puls etwa 0,1 g/1 Protein neu in den Faltungsansatz überführt (bezogen auf die Proteinkonzentration im Faltungsansatz nach Zugabe des Solubilisats). So kann im Faltungsansatz eine Proteinendkonzentration von 0,6 g/1 erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Reduktionsmittel ein organisches Monosulfid. Bevorzugt ist dabei der Einsatz von Glutathion (GSH). Es kann auch ein Gemisch aus GSH/GSSG eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Faltungshelfer ausgewählt aus Arginin und Glycerin. Als„Faltungshelfer" sind allgemein Verbindungen einsetzbar, welche die Faltung von Proteinen fördern. Solche Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. Sie können die Faltung auf unterschiedliche Weise unterstützen. Von Arginin wird angenommen, dass es falsch gefaltete In- termediate destabilisiert, so dass diese wieder (aus einer thermodynamischen Sackgasse) zumindest teilweise entfaltet werden und damit wieder richtig faltbar sind. Glycerin stabilisiert dagegen normalerweise Proteine. Als Faltungshelfer sind insbesondere Verbindungen geeignet, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die absolute Ausbeute von gefaltetem Präthrombin um mehr als 5%, insbesondere um mehr als 10 oder um mehr als 20% (bezogen auf die Gesamtmenge des zur Faltung eingesetztes Präthrombins) erhöhen, verglichen mit einem Verfahren ohne Einsatz des Faltungshelfers.
Der Renaturierungspuffer enthält divalente Kationen. Bevorzugt ist der Einsatz von Calciumsalzen, insbesondere Calciumchlorid. Der Renaturierungspuffer ist bevorzugt ein Tris-Puffer.
Die Renaturierung erfolgt bevorzugt bei einem pH-Wert zwischen 6 und 12, insbesondere zwischen 7 und 11. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Präthrombin oder einem Derivat davon, folgende Schritte: Ein- schlusskörperchen, die nicht gefaltetes Präthrombin oder ein Derivat davon enthalten, werden in einem Solubilisierungspuffer solubilisiert, der mindestens eine chaotrope Verbindung, und mindestens eine organische Disulfidverbindung ent- hält, und das solubilisierte Präthrombin oder Derivat davon wird dann in einem Renaturierungspuffer renaturiert, der mindestens ein Reduktionsmittel, mindestens einen Faltungshelfer und divalente Kationen aufweist, wobei sowohl der Solubilisierungspuffer als auch der Renaturierungspuffer kein Detergens enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der Solubilisie- rungspuffer und/oder der Renaturierungspuffer folglich kein Detergens auf. Es wurde erfindungs gemäß gefunden, dass der Einsatz von Detergenzien zur Solubi- lisierung und/oder Faltung von Präthrombin nicht erforderlich ist. Dies ist vorteilhaft, da bestimmte Detergenzien vergleichsweise aggressive chemische Substanzen sind, die in pharmazeutischen Produkten nicht oder nur in geringen Mengen enthalten sein dürfen und somit aufwändig entfernt werden müssen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher vorteilhaft gegenüber dem Verfahren von Soe- jima et. al., 2001, bei dem zur Faltung des Proteins solche aggressiven Detergen- zien (Triton X-100 oder Brij-58) eingesetzt werden.
Die bevorzugte Abwesenheit von Detergentien betrifft nicht nur die oben ange- sprochenen Solubilisierungs- und Renaturierung spuff er, sondern alle eingesetzten Reagentien und Verfahrensschritte. Mit anderen Worten werden im gesamten erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren keine Detergentien verwendet, das Herstellungsverfahren ist somit Detergentien-frei. Dies betrifft beide Aspekte, sowohl die Herstellung von gefaltetem Präthrombin als auch die Herstellung von Throm- bin aus diesem gefaltenen Präthrombin.
Mit dem erfindungs gemäßen Verfahren werden überraschend hohe Renaturie- rungsausbeuten erreicht. Beispielsweise konnten Renaturierungsausbeuten bis zu 25%, bezogen auf das gesamte Präthrombin in den Einschlusskörperchen, erreicht werden. Bevorzugt wird eine Renaturierungsausbeute von mindestens 10% oder mindestens 20% erreicht. Die Proteinendkonzentration kann beispielsweise bei 0,6 g/1 liegen. Sie liegt bevorzugt zwischen 0,1 und 2 g/1, insbesondere höher als 0,3 g/1, um große Faltungsvolumen in der Produktion zu vermeiden. Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der Solubilisierung und anschließenden Renaturierung wird eine wässrige Lösung von gefaltetem Präthrombin erhalten. Das gefaltete Präthrombin kann anschließend durch bekannte Verfahren weiter aufgereinigt werden. Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass für die weitere Aufreinigung eine chromatographische Reinigung, insbesondere mittels hydrophober Interaktions- Chromatographie, besonders vorteilhaft ist. Als Säule kann beispielsweise eine Phenylsepharose HP von GE Healthcare eingesetzt werden. Die HIC- Chromatographie erfolgt bevorzugt in Gegenwart von Ammoniumsulfat, bevor- zugt bei einer Konzentration von 1,15 M im Hochsalzpuffer. Es wurde gefunden, dass unter diesen Bedingungen Produktausbeuten von 70 bis 95% bei einer Elution mittels Stufengradient erzielt werden können.
Bevorzugt erfolgt die Reinigung nicht durch Hirudin-basierte Affinitätschroma- tographie. Bevorzugt erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kein Reinigungsschritt mit Hirudin-basierter Affinitätschromatographie.
Bevorzugt wird das renaturierte Präthrombin durch enzymatische Proteolyse, insbesondere mit einer Small Venom Protease, bevorzugt Ecarin, zu Thrombin um- gesetzt. Die Serinprotease Ecarin spaltet die Peptidbindung zwischen der A- und B-Kette an der Position Arginin 320 und Isoleucin 321 von Präthrombin-2. Aus dem so entstandenen Thrombin wird durch autokatalytische Abspaltung des eigenen N-Terminus α-Thrombin. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also bei ausreichender Inkubationszeit Thrombin als Zwischenprodukt und a- Thrombin als Endprodukt erhalten. Bei nicht vollständiger autokatalytischer Spaltung wird ein Gemisch von Thrombin und -Thrombin erhalten. Nachfolgend steht der Begriff "Thrombin" auch für dieses Gemisch. Zur proteolytischen Spaltung können auch Proteasen eingesetzt werden, die eine ähnliche Funktionalität wie Ecarin aufweisen. Bevorzugt wird die Protease in einer Konzentration von weniger als 2 U/ml, bevorzugt weniger als 1 U/ml oder weniger als 0,5 U/ml eingesetzt.
Bevorzugt wird das Thrombin und/oder α-Thrombin nach der Proteolyse chromatographisch gereinigt. Bevorzugt erfolgt die Reinigung durch Hydrophobe Inte- raktions-Chromatographie (HIC). Als kritisch hat sich während der Prozessführung die durch α-Thrombin verursachte Ausbildung von Autolyseprodukten erwiesen, welche nach Aktivierung von Präthrombin-2 spontan bei längerer Lagerung entstehen können. Die Abreicherung dieser produktbezogenen Verunreinigungen mittels Ionenaustauscherchromatographie (IEX) erwies sich als schwierig, da die pl- Werte von α-Thrombin und seiner Autolyseprodukte nahezu identisch sind. Verwendete man stattdessen eine Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), so konnten deutlich günstigere Abreicherungseffekte beobachtet werden. Somit ist es erfindungsgemäß bevorzugt, das gefaltete Präthrombin nach der Renaturierung und das Thrombin nach der proteolytischen Spaltung des Präthrom- bins mittels HIC zu reinigen. Allgemein bietet die Aufreinigung von gespaltetem Präthrombin in wässriger Lösung oder von Thrombin bzw. cc-Thrombin in wäss- riger Lösung durch HIC Vorteile, die nicht auf das vorliegende spezielle Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Präthrombin aus Einschlusskörpern mit den Merkmalen von Anspruch 1 beschränkt sind. Gegenstand der Erfindung ist daher auch allgemein die Reinigung von wässrigen Lösungen, enthaltend gefaltetes Präthrombin oder Thrombin bzw. cc-Thrombin mittels HIC.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird neben der Reinigung des erhaltenen Thrombins mittels HIC ein weiterer chromatographischer Reinigungsschritt durchgeführt. Vorzugsweise wird Ionenaustauscherchromatographie (IEX) eingesetzt. Dadurch kann der Gehalt an Endotoxinen, an DNA und an Host cell Proteinen (HCP) auf ein Minimum reduziert werden.
Am Ende der Prozessführung könnte eine Diafiltration mit sich anschließender Konzentrierung des Wirkstoffes stehen. Es können jedoch auch andere bekannte Methoden eingesetzt werden, um die Reinheit und Konzentration des Thrombins zusätzlich zu erhöhen.
Untersuchungen zur Lagerstabilität von α-Thrombin haben gezeigt, dass die Zugabe von Aminosäuren und Salz die Autolyse unterdrücken und gleichzeitig die Stabilität von α-Thrombin über mindestens 3 Monate bei 4°C gewährleisten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte: a) Expression von rekombinantem Präthrombin in prokaryotischen Zellen und Isolierung der Präthrombin-haltigen Einschlusskörperchen b) Mischung der Einschlusskörperchen mit einem geeigneten Solubilisie- rungspuffer, enthaltend zumindest eine chaotrope Substanz und eine Disulfid- verbindung, die mit den -SH Gruppen des Proteins in den Einschlusskörperchen gemischte Disulfide bilden kann,
c) Entfernung von überschüssigem Disulfid,
d) Renaturierung in einem geeigneten Detergenz-freien Puffer, enthaltend mindestens ein Reduktionsmittel, einen Faltungshelfer und divalente Kationen, e) Reinigung des renaturierten Präthrombins,
f) Spaltung in die aktive Form und
g) Isolierung und Reinigung des Thrombins und/oder cc-Thrombins.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt in Schritt b) die Mischung der Einschlusskörperchen im Verhältnis von 1:4 bis 1: 19 (1 g IB Paste+ 4 ml Solubilisierungspuffer) mit einem geeigneten Puffer mit pH im neutral- basischem Bereich, enthaltend 10 mM - 0,5 M GSSG, 4-8 M Guanidinium- hydrochlorid (GuaHCl) und 0,1-10 mM EDTA.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in Schritt b) die Mischung der Einschlusskörperchen im Verhältnis von 1 :9 mit einem geeigneten Puffer mit pH im neutral-leicht basischem Bereich, enthaltend 0,1 M GSSG, 5 M Guanidin-hydrochlorid (GuaHCl) und 1 mM EDTA.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt c) die Entfernung von überschüssigem Reagens zur Bildung von gemischten Disulfiden durch Pufferwechsel in 3-8 M, bevorzugt 5 M, Guanidin-hydrochlorid bei saurem pH (pH 3,0) erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Pulsrenaturierung in Schritt d) mit 0,01 - 1,0 g/1 Protein (bezogen auf die Proteinkonzentration im Faltungsansatz pro Puls) in einem geeigneten Detergenz-freien Puffer mit neutral- leicht basischem pH, enthaltend 0,1-3 mM GSH, 0,1-2 M Arginin, 0,001 - IM CaCl2, 0,1-50 mM EDTA und 1-40% Glycerin, durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Schritt d) durch schnelles Verdünnen von 0,1 g/1 Solubilisat in einem geeigneten Detergenz-freien Puffer mit neutral-leicht basischem pH, enthaltend 0,75 mM GSH, 1 M Arginin, 50 mM CaCl2, 1 mM EDTA und 20 % Glycerin, durchgeführt, wobei die Proteinkonzentration im Faltungsansatz pro Puls um 0,1 g /1 steigt und 6 Pulse mit einem Abstand von jeweils 24 h durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neuartiges prokaryotisches Verfahren zur Herstellung von Thrombin im industriellen Maßstab, bei dem die Ausbeute an Präthrombin um ein Vielfaches erhöht ist und somit den Aufwand und die Kosten gegenüber bekannten Verfahren deutlich verringert. Die erhöhte Ausbeute wird insbesondere durch neue Solubilisierungs- und Renaturierungsverfahren erreicht.
Figuren:
Figur 1: zeigt die Reinheit von Präthrombin-2 nach der Renaturierung im SDS- PAGE Gel. Die Renaturierung von Präthrombin-2 erfolgte im Pulsrenaturierungs- verfahren bis zu einer Proteinendkonzentration von 0,6 g/1. Es wurden Renaturie- rungsausbeuten bis zu 25 % erreicht. Dargestellt ist der Renaturierungsansatz im Coomassie gefärbten SDS-PAGE Gel. Fi ur 2: zeigt die Reinigung von α-Thrombin über Hydrophobe Interaktions- Chromatographie (Toyopearl Butyl-650S). Die filtrierte Ecarinspaltung (4,5 ml + 4,5 ml Hochsalzpuffer: 2 M Ammoniumsulphat, 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0) wurden über eine 4 ml HIC Säule (Tricorn 5/200) gereinigt. Die Äquilibrierung erfolgte mit 50 % Hochsalzpuffer und die Elution mittels linearem Gradienten über 20 CV auf 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0. Figur 3: zeigt die Aminosäuresequenz, die Struktur und wichtige Eigenschaften von Präthrombin-2.
Figur 4: zeigt die Aminosäuresequenz, die Struktur und wichtige Eigen- Schäften von alpha-Thrombin.
Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Expression von r/i-Präthrombin-2
Der bakterielle Wirt E. coli JM108, der zur Expression von r/i-Präthrombin-2 verwendet wird (DSMZ 5585; F thi Δ (lac-proAB) end AI gyrA96 relAl phx hsdRll supE44 recA), ist Prolin-auxotroph, was durch den Einsatz von dem Plasmid mit der Bezeichnung pSCIL048 aufgehoben wird. Das Plasmid pSCIL048 basiert auf dem Plasmid pSCIL008 (siehe WO05061716). Der Stamm kann kein Thiamin synthetisieren (Vieira & Messing, 1982 Gene. Oct;19(3):259- 68). Präthrombin-2 wird unter Kontrolle des tac-Promotors, der auf pSCIL048 lokalisiert ist, exprimiert. Der hier verwendete Vektor pSCIL048 ist ein high copy Plasmid mit einer Kanamycin Resistenz. Die Expression erfolgt in definiertem Mineralsalzmedium und wird durch die Zugabe von IPTG induziert. Das Präthrombin-2 wird in Form von Einschlusskörpern (IBs) im Cytosol abgelagert.
Die Biomasseproduktion erfolgte bei 37°C. Das Ziel dieser Fermentation bestand in der Gewinnung von Produkt und Biomasse für nachfolgende Prozessschritte. Zur Kontrolle der Überexpression des Zielproteins während des Fermentationsprozesses wurden Proben vor und nach Induktion mittels SDS-PAGE analysiert. Eine biomassespezifische Zunahme der Proteinkonzentration konnte bis zu 3 h nach Induktion beobachtet werden. Beispiel 2: Zellaufschluss und Einschlusskörperchen (IB, Inclusion Bodies) Präparation
Die Expression des Zielproteins Präthrombin-2 erfolgte in Form von IBs. Der Zellaufschluss sowie die IB Präparation erfolgten nach Standardprotokollen und sind im Labormaßstab bis zu einer Aufarbeitung von ca. 200 g Biomasse durchführbar.
Beispiel 3: Solubilisierung und Renaturierung
Im erfindungsgemäßen optimierten Renaturierung sprotokoll erfolgte die Rückfal- tung auf Basis von gemischten Disulfiden.
Zur Herstellung der gemischten Disulfide wurden die IBs in einem Verhältnis von 1 g IB Paste + 9 ml Solubilisierungspuffer mit 5 M GuaHCl; 0,1 M Tris-HCl; 1 mM EDTA; 0, 1 M GSSG pH 8,5 homogenisiert und für 3 h bei RT solubilisiert. Nach einem Zentrifugations schritt bei 50.000 x g über 30 min erfolgte ein Umpuf- ferungs schritt in 5 M GuaHCl, 1 mM HCl pH 3,0 zur Abtrennung von freiem GSSG- / GSH-Gemisch.
Nach einem Zentrifugationsschritt bei 50.000 x g über 30 min (optional) erfolgte ein Umpufferungsschritt in 5 M GuaHCl (3-8 M), 1 mM HCl pH 3,0 (saurer pH ist wichtig, wenn das Solubilisat nicht direkt im Anschluss in den Faltungsansatz gegeben wird) zur Abtrennung von freiem GSSG- / GSH-Gemisch.
Die Pulsrenaturierung erfolgte durch schnelles Verdünnen des Solubilisates in dem Faltungspuffer 1 M Arginin, 50 mM Tris, 50 mM CaCl2, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin, 0,75 mM GSH pH 8,5, wobei bevorzugt bis zu 6 Pulse in einem zeitlichen Abstand von 24 h gesetzt wurden. Je Puls wurden 0,1 g/1 Protein neu in den Faltungsansatz überführt (bezogen auf die Proteinkonzentration im Faltungsansatz nach Zugabe des Solubilisats). Im Faltungstank wurde eine Proteinendkonzentra- tion von 0,6 g/1 erreicht.
In Figur 1 ist die Reinheit des Produktes nach der Renaturierung dargestellt. Mit diesem Verfahren wurden Renaturierungsausbeuten von 25 , bezogen auf die in den Faltungsansatz eingetragene Menge an Solubilisat, erreicht.
Beispiel 4: Reinigung von Präthrombin-2
Da bei Austausch mittels Diafiltration relativ hohe Ausbeuteverluste auftraten, wurde stattdessen Ammoniumsulfat zugegeben (bevorzugt 1,15 M Endkonzentration) Der Fällungsniederschlag wurde mittels Zentrifugation abgetrennt und der Überstand auf eine HIC-Säule aufgetragen, (bevorzugt Phenyl Sepharose HP,GE Healthcare), um Präthrombin dann im gewünschten Puffer zu eluieren. Beispiel 5: Aktivierung von Präthrombin
Die Aktivierung von Präthrombin-2 zu α-Thrombin erfolgte mit der Serinprotease Ecarin, welche spezifisch die Peptidbindung zwischen A und B Kette (Arg 20- üe 21) des Präthrombin-2 spaltet. Aus dem so entstandenen Thrombin wird durch autokatalytische Abspaltung des eigenen N-Terminus α-Thrombin. Die Spaltungsbedingungen wurden so gewählt, dass eine maximale Spaltungsausbeute bei möglichst geringem Ecarinbedarf erreicht wird. Dabei wurden mit 1 U Ecarin 2000 μg Präthrombin-2 (0,5 - 0,8 mg/ml) in 24 h bei 37 °C und 600 rpm im Schüttelinkubator gespalten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 25 mM abgestoppt. Nach der Spaltung wurde präzipitiertes Protein beobachtet, deshalb wurde die Lösung vor der chromatographischen Aufreinigung filtriert (0,2 μιη). Die Spaltungsausbeute lag, je nach Menge des Präzipitates, zwischen 70 % und 90 %. Beispiel 6: Reinigung von q-Thrombin
Als Ausgangsmaterial für die chromatographische Aufreinigung wurde die filtrierte Ecarinspaltung verwendet. Das Ziel der Aufreinigung war neben der Ab- trennung von Wirtszellproteinen vor allem die Abreicherung von ungespaltenem Präthrombin-2 und der autokatalytischen Spaltprodukte von a-Thrombin. Präthrombin-2 liegt zum Zeitpunkt der Ecarinspaltung in einer Reinheit von mehr als 95 % vor. Um die Abreicherung der Spaltprodukte besser untersuchen zu können, wurden diese durch Inkubation der Spaltungsansätze für weitere 24 h bei 37 °C angereichert.
Die Abtrennung der Thrombinderivate mittels Ionenaustauschchromatographie gestaltete sich schwierig, da sie nahezu identische pl Werte (pl~9) aufweisen. Die pl-Werte von α-Thrombin und seiner Autolyseprodukte wurden mittels 2D- Gelelektrophorese experimentell bestimmt. Neben Kationenaustauschmaterialien wurden daher hydrophobe Interaktionschromatographie-Materialien getestet.
In Figur 2 ist das Chromatogramm einer Aufreinigung über eine 4 ml HIC Säule (Toyopearl Butyl-650S) gezeigt. Dazu wurden 4,5 ml der filtrierten Ecarinspal- tung vor dem Auftrag auf die Säule 1: 1 mit Hochsalzpuffer (2 M Ammonium- sulphat, 50 mM Phosphatpuffer pH 6.0) verdünnt. Die Elution erfolgte mittels eines linearen Gradienten (Start mit 50 % Hochsalzpuffer) auf 50 mM Phosphatpuffer pH 6.0 über 20 CV. Um das Ergebnis der Aufreinigung zu untersuchen, wurde direkt nach der Chromatographie zu den Hauptfraktionen PMSF bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, um eine weitere Autolyse zu inhibieren. Insgesamt liegt die Ausbeute an α-Thrombin im Hauptpeak bei 65 % (bestimmt mit UV28o)-
Ergebnis:
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von r/i-Thrombin in E. coli werden die in der Literatur beschriebenen Ausbeuten deutlich übertroffen. So liegen die in der Literatur beschriebenen Produktausbeuten an nativem Präthrom- bin-2 in eukaryontischen Expressions Systemen zwischen 25 und 200mg/l Fermentationsmedium (Russo et al. 1997, Yonemura et al. 2004).
Die erfindungsgemäß erreichten Ausbeuten an nativem Präthrombin-2 liegen dagegen bei 400 mg/1 Fermentationsmedium. Es werden Ausbeuten an a-Thrombin von 200 mg/1 Fermentationsmedium mit einer rp-HPLC Reinheit von mindestens 95 % erreicht. Zudem ist das eingesetzte prokaryotische Expressionssystem einfacher zu etablieren als bekannte eukaryotische Verfahren.
In dem von Soejima et al. 2001 beschriebenen prokaryotischen Verfahren werden Faltungsausbeuten an nativem Präthrombin-2 nach Renaturierung von 4 - 7 % erreicht. Im erfindungsgemäß eingereichten Verfahren wurden dagegen 25% Fal- tungsausbeute erhalten. Außerdem wurde das Volumen des verwendeten Faltungsansatzes verringert (Erhöhung der Proteinkonzentration in der Faltung).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von gefaltetem Präthrombin oder einem Derivat davon, wobei Einschlusskörperchen, die nicht gefaltetes Präthrombin oder ein Derivat davon enthalten, in einem Solubilisierungspuffer solubilisiert werden, der mindestens eine chaotrope Verbindung, und mindestens eine organische Disulfidverbindung enthält, und das solubilisierte Präthrombin oder Derivat davon dann in einem Renaturierung spuff er renaturiert wird, der mindestens ein Reduktionsmittel, mindestens einen Faltungshelfer und divalente Kationen aufweist, wobei sowohl der Solubilisierungspuffer als auch der Renaturie- rungspuffer kein Detergens enthalten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Disulfidverbindung Glutathion- Disulfid ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die chaotrope Verbindung ausgewählt ist aus Guanidiniumsalzen, insbesondere Guanidiniumhydrochlorid und Guanidiniumthiocyanat, Jodiden, Bariumsalzen, Thiocyanaten, Harnstoff und Perchloraten.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Einschlusskörperchen durch rekombinante Expression von Präthrombin oder einem Derivat davon in prokaryotischen Zellen erhalten wurden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel ein organisches Mo- nosulfid ist.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Faltungshelfer ausgewählt ist aus Arginin und Glycerin.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Faltung in einem Puls Renaturierungsverfahren durchgeführt wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das renaturierte Präthrombin oder Derivat chromatographisch gereinigt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Reinigung durch Hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC) erfolgt
10. Verfahren zur Herstellung von Thrombin und/oder -Thrombin oder einem Derivat davon, wobei das gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 hergestellte renaturierte Präthrombin durch enzymatische Proteolyse, insbesondere mit Eca- rin, zu Thrombin und/oder α-Thrombin oder dem Derivat davon umgesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Thrombin und/oder α-Thrombin oder Derivat davon nach der Proteolyse chromatographisch gereinigt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Reinigung durch Hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC) erfolgt.
13. Lösung enthaltend gefaltetes Präthrombin, gefaltetes Thrombin und/oder gefaltetes α-Thrombin, oder ein Derivat davon, erhältlich nach einem Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche.
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