DE102012004264A1

DE102012004264A1 - Verwendung von Guanidiniumformiat als Chaotropikum

Info

Publication number: DE102012004264A1
Application number: DE102012004264A
Authority: DE
Inventors: Hans-Peter Krimmer; Bernd Schulz; Christian Lange
Original assignee: Alzchem AG
Current assignee: Alzchem Trostberg GmbH
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2013-09-05
Anticipated expiration: 2032-03-03
Also published as: DE102012004264B4; WO2013128018A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verwendung von Guanidiniumformiat zur Aufreinigung und Renaturierung von Proteinen, ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von Proteinen, insbesondere von rekombinanten Proteinen aus inclusion bodies.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Guanidiniumformiat zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von Proteinen sowie ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von Proteinen, insbesondere von rekombinanten Proteinen aus inclusion bodies.
Die durch äußere Einflüsse hervorgerufene Veränderung von Proteinstrukturen, insbesondere der Sekundär- oder Tertiärstruktur oder auch der Quartärstruktur eines Proteins, erfolgt, ohne dass sich die Reihenfolge der Aminosäuren (Primärstruktur) ändert. Der Vorgang kann reversibel (umkehrbar) oder irreversibel (unumkehrbar) sein. Die Umkehrung der Denaturierung wird auch Renaturierung genannt (H.-D. Jakube, H. Jeschkeit, Aminosäuren, Petpide, Proteine 1982, 402 ff).
Der Proteinrenaturierung kommt in der Biotechnologie eine große Bedeutung zu. Aufgrund der Entwicklungen in der Molekularbiologie ist es möglich, Proteine rekombinant in Wirtsorganismen zu produzieren. Hierbei fallen die rekombinanten Proteine allerdings häufig als biologisch inaktive Aggregate an, den sogenannten ”inclusion bodies”. Das in den inclusion bodies enthaltene Protein muss anschließend durch Renaturierung in-vitro in die biologisch aktive Form überführt werden. Diese Renaturierung ist ein sehr komplexer strukturbiologischer Prozess, der häufig nur in sehr geringen Ausbeuten an nativem Protein mündet. Bereits Steigerungen von wenigen Prozent in der Ausbeute an renaturiertem Protein stellen daher eine wesentliche Verbesserung und einen wirtschaftlichen Vorteil dar.
Bei der in-vitro-Faltung von inclusion body Proteinen beobachtet man meist eine kinetische Konkurrenz zwischen der korrekten Faltung und unproduktiven Nebenreaktionen wie Fehlfaltung und Aggregation. Die Aggregationsprozesse beruhen meist auf hydrophoben Wechselwirkungen der weitgehend entfalteten Polypeptidketten oder nichtnativer, partiell gefalteter Intermediate. Unabhängig von ihrer molekularen Ursache weisen diese Aggregationsprozesse eine Reaktionsordnung von > 2 auf. Dementsprechend erhöht sich die Geschwindigkeit der unproduktiven Aggregationsreaktionen bei Erhöhung der Konzentration der entfalteten Polypeptidkette. Da die korrekten Faltungsprozesse meist durch Reaktionen erster Ordnung bestimmt werden, bedeutet dies, dass die Aggregationsreaktionen bei Erhöhung der Konzentration an denaturiertem Protein über die korrekte Faltung dominieren. Aus diesem Grund werden in-vitro-Faltungsreaktionen meist bei sehr niedriger Proteinkonzentration durchgeführt.
Zusätzlich müssen physikalische Parameter wie pH-Wert, Ionenstärke, Redoxsystem und Temperatur für die Renaturierung von Proteinen optimiert werden. Allerdings führt auch dies häufig nicht zu dem gewünschten Erfolg.
Weiterhin ist schon seit langem bekannt, dass Zusätze wie Harnstoff oder Guanidiniumchlorid in nicht denaturierender Konzentration einen positiven Einfluss auf die Faltungseffizienz haben können. Als Alternative zu Guanidiniumchlorid oder Harnstoff wurden auch andere chaotrope Substanzen wie Alkylharnstoff oder organische Cosolvenzien wie beispielsweise Carbonsäureamide oder alkylierte Amine bei in-vitro-Faltungsprozessen verwendet.
Trotz einer Vielzahl von in der Literatur angegebenen Protokollen zur Renaturierung von Proteinen ist die industrielle Nutzung dieser Technik noch nicht weit vorangeschritten. Die Gründe hierfür liegen sowohl in den technischen als auch biochemischen Schwierigkeiten. Da auch unter optimalen Bedingungen die Renaturierung von Proteinen nur bei sehr niedrigen Proteinkonzentrationen möglich ist, erfordert eine industrielle Produktion die Aufarbeitung sehr großer Renaturierungsvolumen. Darüber hinaus ist auch unter optimierten Bedingungen die Renaturierungseffizienz vieler Proteine nur gering.
Aufgabe der Erfindung ist daher das Auffinden von Substanzen, die die Effizienz der Proteinfaltung in-vitro steigern und ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Proteine effektiv und in größerer Ausbeute als bisher renaturiert werden können.
Erfindungsgemäß werden diese Aufgaben gelöst durch die Verwendung von Guanidiniumformiat zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von Proteinen, insbesondere von rekombinanten Proteinen aus inclusion bodies, sowie durch ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von Proteinen, insbesondere von rekombinanten Proteinen aus inclusion bodies, bei dem die zu behandelnden Proteine mit einem flüssigen Medium, welches Guanidiniumformiat umfasst, in Kontakt gebracht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden.
Guanidiniumformiat ist ein Salz der Ameisensäure mit der Summenformel C₂H₇O₂N₃ und kann durch die folgende Formel (I) beschrieben werden:
Unter Renaturierung von Proteinen wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Gewinnung oder Wiederherstellung der biologischen Aktivität und/oder der weitgehend korrekten Faltung von Proteinen angesehen. Hiergegen ist unter einer Aufreinigung gemäß der vorliegenden Erfindung, das Auslösen von Peptiden oder Proteinbruchstücken aus dem zu isolierenden inclusion bodies oder biologisch aktiven Protein zu verstehen.
Weiterhin sind erfindungsgemäß unter dem Begriff Proteine Kondensationsprodukte von Aminosäuren zu verstehen, die mehr als 50 Aminosäuren, insbesondere mehr als 100 Aminosäuren umfassen. Somit grenzen sich erfindungsgemäße Proteine von Polypeptiden ab, die Kondensationsprodukte von Aminosäuren mit etwa 10 bis 49, insbesondere 10 bis 99 Aminosäuren sind, wobei der Übergang zwischen den beiden Begriffen in der Literatur als fließend angesehen wird.
Überraschender Weise konnte bei Untersuchungen festgestellt werden, dass Guanidiniumformiat als Renaturierungsmittel zur Renaturierung von Proteinen eingesetzt werden kann. Dabei hat sich weiterhin überraschend herausgestellt, dass beim Einsatz von Guanidiniumformiat als Renaturierungsmittel im Vergleich zu Guanidiniumchlorid, das seit geraumer Zeit für denselben Zweck eingesetzt wird, eine deutlich höhere Rückfaltungsausbeute erzielt werden kann. Dies ist umso überraschender, als dass Formiate sowohl in der organischen als auch in der biochemischen Synthese als Carbonylierungsreagenzien bekannt sind. Bei dem Einsatz von Guanidiniumformiat als Renaturierungsmittel sind diese Nebenreaktionen jedoch nicht zu beobachten. Daher ist Guanidiniumformiat uneingeschränkt als Solubilisierungsmittel und Additiv für die Renaturierung einsetzbar. Insbesondere konnten diese Effekte für die Rückfaltung des rekombinanten Plasminogenaktivators r-PA aus inclusion bodies gezeigt werden. Somit ist insbesondere auch die Verwendung von Guanidiniumformiat zur Aufreinigung und/oder zur Renaturierung von rekombinaten Proteinen aus inclusion bodies Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Hervorzuheben ist jedoch, dass die hier beschrieben Verwendung uneingeschränkt für die Renaturierung eines jeden Proteins eingesetzt werden kann.
Zudem hat sich gezeigt, dass Guanidiniumformiat eine weniger korrosive Alternative im Vergleich zu Guanidiniumchlorid ist.
Gemäß einer Weiterbildung ist auch ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder zur Renaturierung von Proteinen, insbesondere von rekombinanten Proteinen aus inclusion bodies, Gegenstand der vorliegenden Erfindung. In diesem Verfahren werden die zu behandelnden Proteine mit einem flüssigen Medium, welches Guanidiniumformiat umfasst, in Kontakt gebracht. Das Verfahren beruht auf dem überraschenden Effekt, dass Guanidiniumformiat im direkten Vergleich zu Guanidiniumchlorid eine deutlich höhere Rückfaltung der Proteine ermöglicht. Mit einer etwa doppelt so hohen maximalen Rückfaltungsausbeute bei einer anderthalbfach höheren Konzentration gegenüber Guanidiniumchlorid stellt Guanidiniumformiat unter den untersuchten Versuchbedingungen ein effektives faltungsverbesserndes Agens dar.
Insbesondere können in diesem Verfahren nachfolgend genannte Proteine renaturiert werden: Proteasen, bevorzugt Serin-Proteasen, Cystein-Proteasen, Metallo-Proteasen, Protease-inhibitoren, DNA-bindenden Proteinen, bevorzugt Transkriptionsfaktoren, virale Proteine, Phosphatasen, Proteinkinasen, Proteinen der Immunglobulin-Superfamilie, Wachstumsfaktoren, bevorzugt epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Erythropoetin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und IGF II), Interleukin-2 (IL-2), Nervenwachstumsfaktor (NGF), transformierender Wachstumsfaktor-ss (TGF-ss) und Thrombocyten-Wachstumsfaktor (PDGF), Lysozym, rekombinante Plasminogenaktivator (r-PA), alpha-Glucosidase sowie von diesen Proteinen abgeleitete Proteine und Fragmente. Besonders bevorzugt können in diesem Verfahren Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und IGF II), Lysozym, rekombinante Plasminogenaktivator (r-PA), alpha-Glucosidase sowie von diesen Proteinen abgeleitete Proteine und Fragmente renaturiert werden. Hervorzuheben ist jedoch, dass das Verfahren für eine Vielzahl an Proteinen eingesetzt werden kann, so dass die hier aufgeführte Liste als nicht einschränkend gelesen werden muss.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können zur Renaturierung insbesondere als flüssiges Medium wässrige Lösungen von Guanidiniumformiat oder flüssige Renaturierungsmedien umfassend neben Guanidiniumformiat weitere bekannte Renaturierungssubstanzen oder die Renaturierung unterstützende Substanzen, wie insbesondere Harnstoff, L-Arginin, alkylierte Amine oder Carbonsäureamide, eingesetzt werden. Dabei kann erfindungsgemäß insbesondere auch vorhergesehen sein, dass das flüssige Medium weiterhin ein für die zu behandelnden Proteine geeignetes Puffersystem umfasst.
Als Puffersystem können gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere Tris, HEPES, Mes, Mops, Acetat, Glycin und/oder Phosphat eingesetzt werden. Weiterhin bevorzugt kann dabei unabhängig oder gleichzeitig die Pufferkonzentration in dem flüssigen Medium 10 bis 1000 mM, insbesondere 10 bis 500 mM, insbesondere 10 bis 200 mM und ganz besonders bevorzugt 10 bis 100 mM, betragen und/oder der pH-Wert des Puffersystems auf pH 5 bis 11, insbesondere auf pH 6 bis 11 und ganz besonders auf pH 7 bis 10 eingestellt werden. Für r-PA beträgt der pH-Wert bei der Renaturierung vorzugsweise etwa 10,5. Für andere zu renaturierende Proteine können die Pufferzusammensetzungsparameter individuell angepasst und optimiert werden, so dass eine maximale Ausbeute an renaturiertem Protein erhalten wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Aufreinigung und/oder zur Renaturierung von Proteinen erfolgt das Inkontaktbringen der zu renaturierenden bzw. zu behandelnden Proteine mit dem flüssigen Medium bevorzugt, indem das zu behandelnde Protein mit dem flüssigen Medium verdünnt, dialysiert und/oder diafiltriert wird. Grundsätzlich sollte bei einer Renaturierung eine Umpufferung des denaturierten Proteins in den Renaturierungspuffer gewährleistet sein.
Beim Inkontaktbringen, insbesondere bei der Renaturierung, beträgt die Proteinkonzentration des zu behandelnden Proteins bevorzugt 5 bis 500 μg/ml, bevorzugt 10 bis 100 μg/ml, weiterhin bevorzugt 50 bis 100 μg/ml. Diese Werte können von einem Fachmann für das jeweilige zu renaturierende bzw. zu behandelnde Protein an die Löslichkeitseigenschaften des Proteins angepasst werden. Gleichzeitig oder unabhängig hiervon kann die Molarität des Guanidiniumformiates 0,25 bis 10 M, insbesondere 0,25 bis 8 M und ganz besonders bevorzugt 0,25 bis 5 M (bezogen auf das flüssige Medium) betragen.
Die Renaturierungsdauer beträgt üblicherweise bevorzugt 1 bis 100 Stunden, weiterhin bevorzugt 1 bis 50 Stunden, und ganz besonders bevorzugt 2 bis 20 Stunden, wobei gleichzeitig oder unabhängig hiervon eine Temperatur von 0 bis 37°C, bevorzugt 5 bis 15°C einzustellen sind, da bei höheren Temperaturen die Aggregationsreaktionen zunehmen.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele verdeutlichen die Vorteile der vorliegenden Erfindung. Hierbei wird auf die folgenden Abbildungen Bezug genommen:
1: Lösliches Protein im Überstand der Solubilisierung von IFN inclusion bodies durch die angegebenen Konzentrationen an Denaturierungsmittel.
2: Solubilisierung von IFN inclusion bodies mit unterschiedlichen Konzentrationen GuHForm und GuHCl. Abgebildet ist ein Coomassiegefärbtes 15% SDS-Gel; alle Proben wurden in reduzierendem Probenpuffer aufgetragen. (1) LMW (Fermentas), (2) 4 M GuHForm, (3) 6 M GuHForm, (4) 8 M GuHForm, (5) 10 M GuHForm und (6) 6 M GuHCl.
3: Lösliches Protein im Überstand der Solubilisierung von Aggregaten des Proteins r-PA durch 8 M GuHForm bei den angegebenen pH-Werten. Die dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten aus Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung. Die durchgezogene Kontrolllinie zeigt das Ergebnis der Solubilisierung in 6 M GuHCl, pH 7,4. Die gepunkteten Linien geben die Standardabweichung der Dreifachbestimmung an.
4: Inclusion body-Präparation. Abgebildet ist ein Coomassie-gefärbtes 15% SDS-Gel; alle Proben wurden in reduzierendem Probenpuffer aufgetragen. (1) LMW (Fermentas), (2) natives r-PA (Roche Diagnostics), (3) solubilisierte inclusion bodies.
5: Vergleich der Rückfaltungsausbeuten in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen an Denaturierungsmittel.
1) Verwendete Substanzen
a. Modellproteine

Lysozym aus Hühnereiweiß (HEWL), Merck KGaA Interferon α2β (IFN), inclusion bodies, Dr. Ehab El-Dabaa Mohamed Sabry Rekombinanter Plasminogenaktivator (r-PA), BM06.022, Roche Diagnostics GmbH

b. Guanidiniumsalze (NIGU Chemie, Waldkraiburg)

Guanidiniumsalz Abkürzung

Guanidiniumchlorid GuHCl

Guanidiniumformiat GuHForm
2) Allgemeine Versuchsvorschriften

[1] Lange, C. and Rudolph, R. 2005. Production of recombinant proteins for therapy, diagnostics and industrial research by in-vitro folding. In Protein folding handbook (eds. T. Kiefhaber and J. Buchner), pp. 1245–1280. Wiley, Weinheim, Germany.
[2] Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (72): 248–254.
[3] Arnold, U. and Ulbrich-Hofmann, R. 1999. Quantitative protein precipitation from guanidine hydrochloride-containing solutions by sodium desoxycholate/trichloroacetic acid. Anal. Biochem. (271): 197–199.

3) Guanidiniumformiat als Agens für die Solubilisierung von inclusion bodies
a. Versuchsaufbau
Für die Solubilisierungsexperimente wurden in E. coli produzierte inclusion bodies des Proteins Interferon α2β (IFN) nach dem Protokoll aus Lange und Rudolph [1] isoliert. Aliquots von je 50 mg inclusion bodies wurden in jeweils 5 ml Solubilisierungspuffer (0,1 M Tris/HCl; 100 mM DTT; 1 mM EDTA; pH 8,0) mit unterschiedlichen Konzentrationen GuHForm bzw. GuHCl unter Rühren für 2 h bei 25°C solubilisiert. Im Anschluss daran wurde ungelöstes Material sedimentiert und die Proteinkonzentration im Überstand nach der Methode von Bradford [2] bestimmt (1). Die Ansätze wurden für 24 h gegen 2 × 1 L 8 M GuHCl dialysiert. Das enthaltene Protein wurde nach Arnold und Ulbrich-Hofmann [3] für die Analyse mit Natriumdesoxycholat gefällt. Je Ansatz wurden 13 μg Protein auf ein 15% SDS-Gel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt (2).
b. Ergebnis
Die Proteinkonzentrationen in den löslichen Überstanden der verschiedenen Solubilisierungsansätze wurden bestimmt (1). Im Gegensatz zu den Ansätzen mit 10 M GuHForm bzw. 6 M GuHCl waren bei GuHForm-Konzentrationen unterhalb von 8 M nur geringe Konzentrationen an gelöstem Protein nachweisbar.
Die Zusammensetzung der in den unterschiedlichen Solubilisierungsansätzen gewonnenen Proteinlösungen wurde mittels SDS-Gelelektrophorese analysiert (2). Dafür wurden jeweils identische Proteinmengen aufgetragen. Auffällig ist dabei der Unterschied der Ansätze, die 4 M und 6 M GuHForm enthielten, zu den anderen Solubilisierungsansätzen. Bei diesen GuHForm-Konzentrationen wurden bevorzugt E. coli-Proteine solubilisiert, die vermutlich lose mit dem inclusion body-Material assoziiert vorlagen, während ab einer Konzentration von 8 M das überexprimierte Protein IFN effektiv in Lösung überführt werden konnte.
GuHForm ist ein schwächeres Denaturierungs- und Solubilisierungsmittel als GuHCl. Dennoch weisen GuHForm-Lösungen im Konzentrationsbereich ab 8 M eine ähnlich hohe Solubilisierungseffizienz wie 6 M GuHCl auf. Bei niedrigeren GuHForm-Konzentrationen lösen sich bevorzugt verunreinigende Proteine aus dem Wirtsorganismus, die mit den inclusion bodies assoziiert sind. Damit ist GuHForm auch zur Vorbehandlung von inclusion body-Präparationen geeignet.
4) pH-Abhängige Solubilisierung von r-PA mit Guanidiniumformiat
a. Versuchsaufbau
Für die Solubilisierungsexperimente wurde reduziertes und denaturiertes r-PA aus seiner Lagerlösung durch Dialyse gegen 0,1 M Tris/HCl pH 8,0 in Aggregate überführt. Die entstandenen Aggregate wurden per Ultraschall resuspendiert, aliquotiert und durch Zentrifugation vom Überstand getrennt. Anschließend wurden die Pellets in 8 M GuHForm in Kombinationspuffern aus je 20 mM Citronensäure, Phosphorsäure und Borsäure, die mit NaOH auf die angegebenen pH-Werte eingestellt worden waren, inkubiert. Dafür wurden 50 μl GuHForm-Lösung auf 10 mg Proteinaggregate (Feuchtgewicht) eingesetzt. Die Inkubation erfolgte bei 22°C für 48 h. Im Anschluss daran wurde ungelöstes Material sedimentiert und die Proteinkonzentration im Überstand nach der Methode von Bradford bestimmt (3).
b. Ergebnis
Die Proteinkonzentrationen in den löslichen Überstanden der verschiedenen Solubilisierungsansätze wurden bestimmt (3). Die Effizienz der Solubilisierung von denaturiertem r-PA durch 8 M GuHForm zeigte ein breites Optimum bei physiologischen pH-Werten zwischen pH 6 und pH 8.
5) Einfluss von Guanidiniumformiat auf die Rückfaltung von r-PA aus inclusion bodies
a. Versuchsaufbau
Für diesen Versuch wurde r-PA rekombinant in E. coli überexprimiert. Die entstandenen, das Protein enthaltenden inclusion bodies wurden nach Lange und Rudolph [1] isoliert (3). Zur Gewinnung des Proteins wurden 100 mg inclusion bodies in 10 ml Solubilisierungspuffer (6 M GuHCl; 0,1 M Tris/HCl; 100 mM DTT; 1 mM EDTA; pH 8,0) unter Rühren für 2 h bei RT solubilisiert. Anschließend wurde der pH-Wert mit HCl auf einen Wert von 3 abgesenkt. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt. Durch wiederholte Dialyse des Überstandes gegen 0,5 L 4 M GuHCl, 10 mM HCl wurde DTT vollständig aus den Proben entfernt. Die Renaturierung von r-PA erfolgte in 1 ml entgastem Renaturierungspuffer (0,1 M Tris/HCl; 1 mM EDTA; 7 mM GSH; 0,7 mM GSSG; pH 8,5) sowie der entsprechenden Konzentration an Additiv (GuHForm oder GuHCl). Nach Zugabe des denaturierten Proteins wurden die Ansätze über Nacht bei RT inkubiert und im Anschluss daran die Aktivität des nativen r-PA bestimmt (4). Die Endkonzentration an Protein im Rückfaltungsansatz betrug 43,5 μg mL^–1. Für die Bestimmung der Ausbeute wurde das rückgefaltete Protein ohne weitere Behandlung mit einer nominellen Endkonzentration von 3,35 μg mL^–1 im Aktivitätsassay eingesetzt. Für diesen Assay kam das chromogene Substrat Chromozym t-PA der Firma Roche Diagnostics zum Einsatz. Das Prinzip des Nachweises beruht auf der hydrolytischen Spaltung des Substrats durch r-PA. Die Änderung der Konzentration des dabei freigesetzten 4-Nitroanilins kann dann durch Messung der optischen Extinktion bei 405 nm verfolgt werden. Die Aktivität wurde aus der Anfangssteigung dieses optischen Signals ermittelt. Natives r-PA der Firma Roche Diagnostics diente als Referenz.
b. Ergebnis
Mit 4 ist die Proteinzusammensetzung des solubilisierten inclusion body-Materials dargestellt. Die Proteinkonzentration in der Lösung betrug 2,18 mg mL^–1. Dieses Material, das hauptsächlich reduziert-denaturiertes r-PA enthielt, wurde ohne weitere Reinigung für die folgenden Renaturierungsversuche eingesetzt (5).
Bei einer GuHCl-Konzentration von 1 M wurde eine maximale Rückfaltungsausbeute von etwa 0,7% erhalten. Damit wurden etwa 5% der unter idealen Bedingungen – mit reinem r-PA in Gegenwart von 1 M Argininhydrochlorid – erreichbaren Ausbeuten erzielt. In Gegenwart von 1,5 M GuHForm wurde mit etwa 1,5% eine doppelt so hohe maximale Ausbeute erzielt.
Mit einer etwa doppelt so hohen maximalen Rückfaltungsausbeute bei einer anderthalbfach höheren Konzentration gegenüber GuHCl stellt GuHForm unter den untersuchten Versuchbedingungen ein moderat effektives faltungsverbesserndes Agens dar. GuHForm ist ein weniger stark denaturierendes Agens als GuHCl und vermag aus diesem Grund das Protein im Rückfaltungsansatz gegen Aggregation zu stabilisieren, ohne die Stabilität des nativen Zustandes stark zu beeinträhtigen. Bei Rückfaltungen kann demnach – unabhängig von den sonst im Reaktionsansatz eingestellten Bedingungen – eine größere Menge dieses Denaturierungsmittels toleriert werden als von GuHCl. Guanidiniumformiat als Denaturierungsmittel ist damit voll kompatibel mit den bei der Proteinproduktion auf die Solubilisierung aus inclusion bodies folgenden Rückfaltungs- und Reinigungsprozessen.
6) Chemische Stabilität denaturierter Proteine in Guanidiniumformiat
a. Versuchsaufbau
Für die Untersuchung der chemischen Stabilität von Proteinen in GuHForm enthaltenden Lösungen wurden 0,1 mg mL^–1 Lysozym bzw. rPA in Puffern inkubiert, die jeweils 10 M GuHForm und 1 mM EDTA sowie je 25 mM Natriumcitratpuffer, Tris/HCl bzw. Natriumcarbonatpuffer enthielten. Die Puffer waren auf pH 7 (Citrat), pH 8 (Tris) bzw. pH 10 (Carbonat) eingestellt worden. Die Proben mit den gelösten denaturierten Proteinen wurden anschließend bei 4°C bzw. Raumtemperatur inkubiert. Nach zweiwöchiger Inkubation wurden zur Entfernung des GuHForm je 10 μL der Proben (entsprechend 1 μg Protein) mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, die sichtbaren Banden ausgeschnitten und die Proteine aus der Gelmatrix heraus tryptisch verdaut. Die entstandenen Fragmente wurden mittels ESI-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
b. Ergebnis
Für die detektierbaren Fragmente der untersuchten Proteine konnten keine Abweichungen von den erwarteten molekularen Massen nachgewiesen werden. Insbesondere eine als wahrscheinlichste Modifikation zu erwartende Carbonylierung durch das anwesende Formiat wurde in keinem Fall beobachtet Eine Entstehung von Nebenprodukten durch chemische Modifikation der eingesetzten Proteine in GuHForm-Lösungen wurde bei pH-Werten zwischen 7 und 10 nicht beobachtet.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

H.-D. Jakube, H. Jeschkeit, Aminosäuren, Petpide, Proteine 1982, 402 ff [0002]
Lange, C. and Rudolph, R. 2005. Production of recombinant proteins for therapy, diagnostics and industrial research by in-vitro folding. In Protein folding handbook (eds. T. Kiefhaber and J. Buchner), pp. 1245–1280. Wiley, Weinheim, Germany [0029]
Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (72): 248–254 [0029]
Arnold, U. and Ulbrich-Hofmann, R. 1999. Quantitative protein precipitation from guanidine hydrochloride-containing solutions by sodium desoxycholate/trichloroacetic acid. Anal. Biochem. (271): 197–199 [0029]

Claims

Verwendung von Guanidiniumformiat zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von Proteinen.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von rekombinanten Proteinen aus inclusion bodies.
Verfahren zur Aufreinigung und/oder Renaturierung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die zu behandelnden Proteine mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht werden, das Guanidiniumformiat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als flüssiges Medium eine wässrige Lösung verwendet wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass als flüssiges Medium ein flüssiges Renaturierungsmedium eingesetzt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Medium weiterhin ein für die zu behandelnden Proteine geeignetes Puffersystem umfasst.
Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffersystem Tris, HEPES, Mes, Mops, Acetat, Glycin und/oder Phosphat eingesetzt werden.
Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferkonzentration in dem flüssigen Medium 10 bis 1000 mM beträgt und/oder der pH-Wert des Puffersystems 5 bis 11 beträgt.
Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen erfolgt, indem das zu behandelnde Protein mit dem flüssigen Medium verdünnt, dialysiert und/oder diafiltriert wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinkonzentration des zu behandelnden Proteins beim Inkontaktbringen 5 bis 500 μg/ml und/oder die Molarität an Guanidiniumformiat 0,25 bis 5 M (bezogen auf das flüssige Medium) beträgt.
Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen der zu renaturierenden Proteine mit dem Renaturierungsmedium für 1 bis 100 Stunden erfolgt.
Renaturiertes Protein, hergestellt nach einem Verfahren der Ansprüche 3 bis 11.