CN115141247A - 用于蛋白质的二硫键重构试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于蛋白质的二硫键重构试剂，包括氧化还原试剂本体和氧化还原试剂本体；所述氧化还原试剂本体包含二硫键氧化剂本体和二硫键还原剂本体；所述二硫键氧化剂本体为胱氨酸及胱胺中的至少一种；所述二硫键还原剂本体为半胱氨酸及半胱胺中的任意一种或二者的组合；所述二硫键氧化剂本体的浓度与二硫键还原剂本体的浓度之比为1:1～1:10；所述二硫键还原剂本体浓度为1～10mM。本发明提供的用于蛋白质的二硫键重构试剂采用胱氨酸、胱胺、半胱氨酸及半胱胺等溶剂，使得二硫键重构试剂在具备基本功能的前提下还能做到价格便宜，在大规模生产中也可以加入，因此在研发阶段进入生产阶段不需要重新摸索重折叠技术。

Description

用于蛋白质的二硫键重构试剂

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种用于蛋白质的二硫键重构试剂。

背景技术

基因工程技术用于目的蛋白的表达体系有多种。其中，大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，大肠杆菌由于遗传背景相对清楚、使用安全、易操作、表达量大、生产成本低、周期短，以及有大量可供选择的克隆或表达载体，使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。一般在大肠杆菌表达的蛋白产量很高，但是在细胞内聚集的重组蛋白通常以包涵体形式存在，形成一些缺乏生物学活性、错误折叠的不溶聚合物。现在我们已经知道包涵体中的变性蛋白具有与活性蛋白相同的一级结构，其缺乏生物学活性，是由于错误折叠而没有形成正确的高级结构所导致的。

蛋白质的高级结构由一级结构决定的学说最初是由Anfinsen于1954年提出的，这也是后来大家熟知的变性蛋白重折叠获得活性蛋白的理论基础。尽管Anfinsen的工作奠定了蛋白质折叠的热力学基础，他也因此获得了1972年的诺贝尔化学奖，但是蛋白质折叠是相当复杂的。到现在为止，我们仍然不能根据一个蛋白质的一级结构推断出它的三维结构。同时，还必须注意到，蛋白质在体外的折叠比在细胞内的折叠要慢得多。

对于某些蛋白来说，蛋白的多肽之间的二硫键形成是正确的蛋白装配和结构的一个关键方面。不仅如此，很多情况下，形成正确的二硫键也是蛋白重折叠的限速步骤。但是，这不是绝对的，因为形成正确的二硫键往往需要在一定正确的结构基础之上，而很多情况下，比如说脯氨酸的增加会大大增加重折叠的时间。目前，形成二硫键的方法包括加入氧化还原试剂、通入氧气及加入铜离子促进氧化。其中加入氧化还原试剂主要用于科研或者小批量蛋白的重折叠；通入氧气和加入铜离子促进氧化主要用于大批量蛋白的生产。其中，加入氧化还原试剂优势明显，原因是蛋白质在氧化剂与还原剂作用下不断氧化形成二硫键的同时还原形成巯基，这个过程称为二硫键重构。在二硫键重构的过程中，由于错误折叠的蛋白质无法形成稳定的二硫键而有利于其结构重新排布和折叠，直至形成正确的高级结构，而这种正确的高级结构中的二硫键即使被打断也会瞬间重新形成，促进了蛋白质的重新折叠。相比较之下，通入氧气及加入铜离子促进氧化虽然经济上具有较大优势，但是其缺点也是很明显的，如不能对二硫键进行重构、蛋白重折叠效率低、需要配合昂贵的仪器使用及实验室制备与生产之间放大不方便使研发费用增加。

目前，我们没有发现市场上有专门用于蛋白质的二硫键重构试剂。但是现有的文献或专利中有提到一些蛋白质重折叠的方法，这些方法中提到的氧化还原试剂一般包括氧化剂和还原剂；氧化剂一般为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽(GSH)。其中氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽由于价格昂贵，一般只用于实验室制备少量蛋白，二硫苏糖醇(DTT)及β-巯基乙醇由于其还原性太高，并不利于作为还原试剂。因此，寻找一种具有类似氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽的二硫键重构能力，同时具有价格便宜、无毒、容易保存的氧化还原试剂成为重组蛋白大批量复性的瓶颈。

发明内容

基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种用于蛋白质的二硫键重构试剂。

本发明申请提供的用于蛋白质的二硫键重构试剂，包括氧化还原试剂本体和氧化还原试剂本体；所述氧化还原试剂本体包含二硫键氧化剂本体和二硫键还原剂本体；所述二硫键氧化剂本体为胱氨酸及胱胺中的任意一种或多种；所述二硫键还原剂本体为半胱氨酸及半胱胺中的一种或二者的组合；所述二硫键氧化剂本体的浓度与二硫键还原剂本体的浓度之比为1:1～1:10；所述二硫键还原剂本体浓度为1～10mM。

在其中一个实施例中，所述二硫键氧化剂本体为胱胺；所述二硫键还原剂本体为半胱胺。

在其中一个实施例中，所述二硫键氧化剂本体为胱氨酸；所述二硫键还原剂本体为半胱氨酸。

在其中一个实施例中，所述二硫键氧化剂本体浓度与二硫键还原剂本体浓度之比为1:1至1:3之间。

在其中一个实施例中，所述二硫键氧化剂本体浓度与二硫键还原剂本体浓度之比为1:2。

在其中一个实施例中，所述二硫键还原剂本体浓度为1～4mM。

在其中一个实施例中，所述二硫键还原剂本体浓度为4mM。

本发明的实施例中提供的技术方案带来如下有益技术效果：

本发明提供的用于蛋白质的二硫键重构试剂采用胱氨酸、胱胺、半胱氨酸及半胱胺等溶剂，使得二硫键重构试剂在具备基本功能的前提下还能做到价格便宜，在大规模生产中也可以加入，因此在研发阶段进入生产阶段不需要重新摸索重折叠技术。

本申请附加的方面和优点将在后续部分中给出，并将从后续的描述中详细得到理解，或通过对本发明的具体实施了解到。

附图说明

图1为本发明一实施例中变性鸡卵清溶菌酶及变性鸡干扰素α处理前后电泳分析的结果对比图；其中，Lane M:maker；Lane 1:未诱导表达鸡干扰素α样品；Lane 2:诱导表达鸡干扰素α样品；Lane 3:鸡干扰素α样品裂解后沉淀样品；Lane 4:鸡干扰素α样品裂解后上清样品；Lane 5:尿素洗涤包涵体离心沉淀样品；Lane 6:尿素洗涤包涵体离心上清样品；Lane 7:尿素溶解的变性鸡干扰素α样品；Lane 8:尿素溶解的变性鸡卵清溶菌酶样品；

图2为本发明一实施例中鸡干扰素α及鸡卵清溶菌酶在添加二硫键重构试剂的复性液中复性前后电泳分析的结果对比图；其中，Lane M:maker；Lane 1:尿素溶解的变性鸡干扰素α样品；Lane 2:鸡干扰素α复性后纯化的样品非变性电泳；Lane 3：尿素溶解的变性鸡卵清溶菌酶样品；Lane 4：鸡卵清溶菌酶复性后的样品非变性电泳；

图3为本发明一实施例中Cys和不同氧化剂本体浓度对鸡干扰素α氧化复性产率的影响对比图，其中(a)为1mM Cys，(b)为2mM Cys，(c)为4mM Cys，(d)为10mM Cys，氧化剂类型：(●)GSSG，(■)胱氨酸，(▲)胱胺；

图4为本发明一实施例中Cys和不同氧化剂本体浓度对鸡卵清溶菌酶氧化复性产率的影响对比图，其中(a)1mM Cys，(b)2mM Cys，(c)4mM Cys，(d)10mM Cys。氧化剂类型：(●)GSSG，(■)胱氨酸，(▲)胱胺。

图5为本发明一实施例中不同还原剂本体对鸡干扰素α氧化复性产率的影响对比图，其中还原剂类型：(●)半胱氨酸，(■)还原性谷胱甘肽，(▲)半胱胺。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的可能的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文已经通过附图描述的实施例。通过参考附图描述的实施例是示例性的，用于使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面，而不能解释为对本发明的限制。此外，如果已知技术的详细描述对于示出的本发明的特征是非必要技术的，则可能将这些技术细节予以省略。

相关领域的技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本申请的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。

为了克服现有的氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽价格昂贵且不方便存储的特点，本申请采用到半胱氨酸(Cys)，由于半胱氨酸与蛋白质本身二硫键成键氨基酸相同，发明人推测其还原电势更加有利于蛋白质本身二硫键的重构。相应的，发明人根据半胱氨酸想到了其氧化剂胱氨酸(cystine)。意料之外的是胱氨酸，其溶于稀酸和碱液，极难溶于水。胱氨酸的低溶解度导致其工作浓度很低，只适合作为部分蛋白质的二硫键重构试剂。

为了克服胱氨酸这种意料不到的缺点，发明人从寻找胱氨酸衍生物的思路出发想到了胱胺(cystamine)及半胱胺(cysteamine)。这种思路较为常用，如十二烷基磺酸钠(SDS)作为表面活性剂非常常见，但是关于胱胺的应用非常少，作为氧化试剂来替代氧化型谷胱甘肽更是少见，少有的一些用半胱胺及胱胺的例子也只处于研究阶段，或者应用于不同的领域。

下面以具体地实施例对本发明的技术方案以及该技术方案如何解决上述的技术问题进行详细说明。

术语“二硫键氧化剂本体”是指具有二硫键氧化能力的一类物质；“二硫键还原剂本体”是指具有二硫键还原能力的一类物质。在本发明中“二硫键氧化剂本体”指的是胱氨酸及胱氨酸其它形式衍生物，胱胺及胱胺其它形式衍生物如胱胺二盐酸盐；“二硫键还原剂本体”指的是半胱氨酸及半胱氨酸其它形式衍生物，半胱胺及半胱胺其它形式衍生物。

如本文所述，术语“二硫键成键氨基酸”是指含有巯基的氨基酸。在本发明中“二硫键成键氨基酸”指的是半胱氨酸。

如本文所述，术语“二硫键重构”是指蛋白质中的二硫键成键氨基酸在二硫键氧化剂本体及二硫键还原剂本体的双重作用下，新的二硫键不断形成，旧的二硫键不断被打断的过程称为二硫键重构。

本发明申请提供的用于蛋白质的二硫键重构试剂，包括氧化还原试剂本体和氧化还原试剂本体；氧化还原试剂本体包含二硫键氧化剂本体和二硫键还原剂本体；二硫键氧化剂本体为胱氨酸及胱胺中的任意一种或多种；二硫键还原剂本体为半胱氨酸及半胱胺中的一种或二者的组合；二硫键氧化剂本体的浓度与二硫键还原剂本体的浓度之比为1:1～1:10；二硫键还原剂本体浓度为1～10mM。

半胱胺/胱胺及半胱氨酸/胱氨酸具有与氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)类似的作用。下一步，我们以鸡干扰素、溶菌酶作为研究对象，分别检测了氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱氨及半胱氨酸和半胱胺混合物/胱氨酸和胱氨混合物的重折叠效率。本发明以此为基础配置了一种用于蛋白质的二硫键重构试剂，方便了蛋白质重折叠的研究。特别是，由于本发明的二硫键重构试剂价格便宜，在大规模生产中也可以加入，因此在研发阶段进入生产阶段不需要重新摸索重折叠技术。

可选的，在本申请的一个实施例中，二硫键氧化剂本体为胱胺；二硫键还原剂本体为半胱胺。可选的，二硫键氧化剂本体为胱氨酸；二硫键还原剂本体为半胱氨酸。

可选的，在本申请的一个实施例中，二硫键氧化剂本体浓度与二硫键还原剂本体浓度之比为1:1至1:3之间。可选的，在一个具体的实现方式中，二硫键氧化剂本体浓度与二硫键还原剂本体浓度之比为1:2。

可选的，在本申请的一个实施例中，二硫键还原剂本体浓度为1～4mM。具体地，在其中一个实施方式中，二硫键还原剂本体浓度为4mM。

本发明提供的用于蛋白质的二硫键重构试剂采用胱氨酸、胱胺、半胱氨酸及半胱胺等溶剂，使得二硫键重构试剂在具备基本功能的前提下还能做到价格便宜，在大规模生产中也可以加入，因此在研发阶段进入生产阶段不需要重新摸索重折叠技术。

以下是具体实施例：

变性蛋白的制备

实验试剂：溶菌酶购自Sigma，其来源于鸡蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。鸡干扰素α为本实验室自制，鸡干扰素α基因由擎科生物合成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。二硫苏糖醇(DTT)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)、半胱胺、胱胺、L-半胱氨酸及L-胱氨酸均属于分析纯；其它化学试剂包括三羟基氨基甲烷(Tris)、尿素、硫酸钠等购自国药集团化学试剂有限公司均属于分析纯试剂。

实验试剂的配制：⑴0.5M DTT配制：称取3.09g DTT，加入到50mL塑料离心管内；加40mL的0.01M的NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌；适量分成小份后，-20℃保存。⑵0.5M氧化型谷胱甘肽(GSSG)配制：称取6.13g GSSG，加入到50mL塑料离心管内；加20mL的0.01M的PB(pH7.4)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌；适量分成小份后，-20℃保存。⑶1M还原型谷胱甘肽(GSH)配制：称取6.14g GSH，加入到50mL塑料离心管内；加20mL的0.01M的PB(pH7.4)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌；适量分成小份后，-20℃保存。⑷0.5ML-胱氨酸配制：称取2.40g GSSG，加入到50mL塑料离心管内；加20mL的1M盐酸溶液，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌；适量分成小份后，-20℃保存。⑸1M L-半胱氨酸配制：称取2.42gGSH，加入到50mL塑料离心管内；加20mL的去离子水，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌；适量分成小份后，-20℃保存。⑹0.4M胱胺配制：称取1.80g胱胺二盐酸盐，加入到50mL塑料离心管内；加20mL的去离子水，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌；适量分成小份后，-20℃保存。⑺1M半胱胺配制：称取1.54g半胱胺，加入到50mL塑料离心管内；加20mL的去离子水，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌；适量分成小份后，-20℃保存。

变性鸡卵清溶菌酶的制备：变性缓冲液为8M尿素，50mM Tris-HCl，pH值为8.0，1mMEDTA，2mM DTT，50mM Na₂SO₄。用变性缓冲液配制20mg/mL的变性鸡卵清溶菌酶溶液，将配制好的变性鸡卵清溶菌酶溶液放置37℃温育1h彻底变性。

变性鸡干扰素α的制备：将构建好的鸡干扰素α质粒在大肠杆菌中表达获得包涵体，将包涵体按照常规处理后，用变性缓冲液配制5mg/mL的鸡干扰素α溶液。变性缓冲液为8M尿素，50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，0.5mM DTT，50mM Na₂SO₄。变性鸡干扰素α的制备方法为本领域技术人员公知的常规方法：其所用载体为pet-30a；所用宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。所用技术主要包括：质粒构建、重组子筛选、蛋白表达、包涵体洗涤等。

变性鸡卵清溶菌酶及变性鸡干扰素α的制备，实验结果如图1所示。由图可知，鸡干扰素α的理论分子量18.9KD，符合电泳结果；鸡卵清溶菌酶的理论分子量在14.7KD，符合电泳结果。

鸡卵清溶菌酶及鸡干扰素α的复性

复性方法如下：

鸡卵清溶菌酶的复性：在获得变性鸡卵清溶菌酶之后，通过将变性鸡卵清溶菌酶快速稀释20倍到复性液中开始复性，最终蛋白质浓度为1mg/mL。复性操作在25℃进行，静置24h复性完成。复性液由基础复性液加入二硫键重构试剂配制而成。基础复性液为50mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，50mM Na₂SO₄，2M尿素。需要注意的是胱氨酸保存液中含有盐酸。其次，尿素的溶液现配现用。鸡干扰素α的复性：在获得变性鸡干扰素α之后，通过将变性鸡干扰素α快速稀释50倍到复性液中开始复性，最终蛋白质浓度为0.1mg/mL。复性操作在25℃进行，静置24h复性完成。复性液由基础复性液加入二硫键重构试剂配制而成。基础复性液为50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，50mM Na₂SO₄，2M尿素。需要注意的是胱氨酸保存液中含有盐酸。其次，尿素的溶液现配现用。

复性的实验结果如图2所示：鸡干扰素α复性和鸡卵清溶菌酶复性的样品均为非变性凝胶电泳；由图2可知，鸡干扰素α及鸡卵清溶菌酶复性后均在箭头处形成微弱条带，箭头部分对应的分子量分别为35KDa及25KDa上下，恰好对应鸡干扰素α及鸡卵清溶菌酶的二聚体37.8KDa及29.4KDa。二聚体是复性过程中形成的变性蛋白，较少的二聚体表明蛋白复性较好。

氧化还原试剂本体浓度对鸡卵清溶菌酶及鸡干扰素α氧化复性产率的影响。鸡干扰素α最终复性溶液为：0.1mg/mL鸡干扰素α，50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，50mMNa₂SO₄，2M尿素，25℃，及(a)1mM Cys，(b)2mM Cys，(c)4mM Cys，(d)10mM Cys。实验结果如图3所示，在还原剂本体浓度为1至4mM的情况下，随着氧化剂本体浓度的增加蛋白复性产率逐渐增加，当氧化剂本体浓度超过0.5mM后溶菌酶的复性率不再随氧化剂本体浓度发生变化。当还原剂本体浓度增加至10mM的情况下，需要更高的氧化剂本体浓度来优化产量，从而使氧化剂/还原剂浓度的最佳比率稍有变化。并且最佳配比的范围更窄。鸡卵清溶菌酶最终复性溶液为：1mg/mL鸡卵清溶菌酶，50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，50mM Na₂SO₄，2M尿素，25℃，及(a)1mM Cys，(b)2mM Cys，(c)4mM Cys，(d)10mM Cys。实验结果如图4所示，鸡卵清溶菌酶与鸡干扰素α的复性情况基本相同。

此外，在鸡干扰素α最终复性溶液为：0.1mg/mL鸡干扰素α，50mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0，50mM Na₂SO₄，2M尿素，25℃，4mM[Cys/GSH/cysteamine]，0.4-4mM GSSG的情况下，我们检测了不同还原剂本体对鸡干扰素α氧化复性产率的影响。由图5可知，Cys、GSH及cysteamine作为还原剂本体的作用基本相似。

鸡卵清溶菌酶及鸡干扰素α的活性测定

鸡卵清溶菌酶的活性测定：以微球菌为检测对象，首先用pH值6.2，200mM磷酸盐缓冲液配置微球菌溶液，调节其在450nm处的吸光度为1.3，然后取2.5ml菌液，加入500μl溶菌酶溶液，测定反应液在450nm下的吸光度变化，通过吸光度值的降低速率来计算溶菌酶的活性。采用复性率(Yield)来直接衡量不同条件下溶菌酶的复性效果，复性率的定义如下：Yield＝复性液中的溶菌酶总活力/变性前该样品中溶菌酶总活力×100％。

干扰素活性测定原理：根据重组鸡干扰素α可以保护鸡成纤维细胞(DF-1)免受水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)的侵害作用的原理，以干扰素抑制病毒致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)现象作为检测其活性的方法。即以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位(或称效价)，常以国际单位(IU)表示，并用国家标准品校正结果。该结果经用结晶紫染料对存活DF-1细胞染色，然后用脱色液脱色后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果，按Reed-Munch法计算出所测定干扰素的生物学活性。

干扰素活性测定方法：参照《中国兽药典》三部中“细胞单层制备法”中“鸡成纤维细胞(DF-1)单层的制备”方法进行制备鸡成纤维细胞，用完全培养液配制成每1mL含5.0×105～6.0×105个细胞的细胞悬液。DF-1细胞在培养条件下呈贴壁生长状态。常规下细胞按1:2～1:4传代，每周2～3次，于营养液中生长。具体操作简述为：将长满单层细胞瓶内培养液弃去，用PBS洗2次后消化和收集细胞，将5.0×105-6.0×105个细胞的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时。将配制完成的检测溶液移入接种DF-1细胞的培养板中，每孔加入100μl。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(VesicularStomatitis Virus，VSV)(-70℃保存)用攻毒培养液稀释至约100TCID50，每孔100μl。于37℃、5％二氧化碳培养24小时。

第1号孔为细胞对照，不加干扰素保护，也不加病毒攻击。

第2号孔为病毒对照，不加干扰素保护，加病毒攻击。

第3号孔为空白对照，加干扰素溶剂，加病毒攻击。

第4号孔为实验组，加干扰素保护，加病毒攻击。

第5号孔为阳性对照，加抗病毒试剂，加病毒攻击。

结果显示：使用本发明的二硫键重构试剂与对照GSSG/GSH进行复性后的鸡干扰素α对DF-1均具有良好的保护能力，其活性均为5.0×105IU/mg。补充说明，鸡干扰素α的复性率(Yield)计算如下：Yield＝复性后纯化所得鸡干扰素α总质量/复性前溶液中的鸡干扰素α总质量×100％。

本技术领域技术人员可以理解，本申请中已经讨论过的各种操作、方法、流程中的步骤、措施、方案可以被交替、更改、组合或删除。进一步地，具有本申请中已经讨论过的各种操作、方法、流程中的其他步骤、措施、方案也可以被交替、更改、重排、分解、组合或删除。进一步地，现有技术中的具有与本申请中公开的各种操作、方法、流程中的步骤、措施、方案也可以被交替、更改、重排、分解、组合或删除。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

在本说明书的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

应该理解的是，虽然附图的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示，但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明，这些步骤的执行并没有严格的顺序限制，其可以以其他的顺序执行。而且，附图的流程图中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段，这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成，而是可以在不同的时刻执行，其执行顺序也不必然是依次进行，而是可以与其他步骤或者其他步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。

以上所述仅是本申请的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于蛋白质的二硫键重构试剂，其特征在于，包括氧化还原试剂本体和氧化还原试剂本体；所述氧化还原试剂本体包含二硫键氧化剂本体和二硫键还原剂本体；所述二硫键氧化剂本体为胱氨酸及胱胺中的任意一种或多种；所述二硫键还原剂本体为半胱氨酸及半胱胺中的一种或二者的组合；所述二硫键氧化剂本体的浓度与二硫键还原剂本体的浓度之比为1:1～1:10；所述二硫键还原剂本体浓度为1～10mM。

2.根据权利要求1所述的用于蛋白质的二硫键重构试剂，其特征在于，所述二硫键氧化剂本体为胱胺；所述二硫键还原剂本体为半胱胺。

3.根据权利要求1所述的用于蛋白质的二硫键重构试剂，其特征在于，所述二硫键氧化剂本体为胱氨酸；所述二硫键还原剂本体为半胱氨酸。

4.根据权利要求1所述的用于蛋白质的二硫键重构试剂，其特征在于，所述二硫键氧化剂本体浓度与二硫键还原剂本体浓度之比为1:1至1:3之间。

5.根据权利要求4所述的用于蛋白质的二硫键重构试剂，其特征在于，所述二硫键氧化剂本体浓度与二硫键还原剂本体浓度之比为1:2。

6.根据权利要求1所述的用于蛋白质的二硫键重构试剂，其特征在于，所述二硫键还原剂本体浓度为1～4mM。

7.根据权利要求6所述的用于蛋白质的二硫键重构试剂，其特征在于，所述二硫键还原剂本体浓度为4mM。

Images