WO2011126071A1 - ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法 - Google Patents

ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2011126071A1
WO2011126071A1 PCT/JP2011/058804 JP2011058804W WO2011126071A1 WO 2011126071 A1 WO2011126071 A1 WO 2011126071A1 JP 2011058804 W JP2011058804 W JP 2011058804W WO 2011126071 A1 WO2011126071 A1 WO 2011126071A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
group
infection
viral infection
calcium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2011/058804
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雄介 大場
忠昭 宮崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hokkaido University NUC
Original Assignee
Hokkaido University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hokkaido University NUC filed Critical Hokkaido University NUC
Publication of WO2011126071A1 publication Critical patent/WO2011126071A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4422—1,4-Dihydropyridines, e.g. nifedipine, nicardipine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/554—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having at least one nitrogen and one sulfur as ring hetero atoms, e.g. clothiapine, diltiazem
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/80—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/84—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/90—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D281/00—Heterocyclic compounds containing rings of more than six members having one nitrogen atom and one sulfur atom as the only ring hetero atoms
    • C07D281/02—Seven-membered rings
    • C07D281/04—Seven-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 4
    • C07D281/08—Seven-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 4 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D281/10—Seven-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 4 condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • “suppressing infection” is used interchangeably with “preventing infection”, “preventing infection”, and “inhibiting infection”.
  • endocytosis is a general term for a method in which cells generally take in substances from the outside world into cells by vesicle formation and fusion. Endocytosis depends on the type and size of the substance to be taken in and the cellular equipment involved, depending on clathrin-independent endocytosis, clathrin-dependent endocytosis, macropinocytosis, caveolae-dependent endocytosis, It is classified into cholesterol-dependent endocytosis and dynamin-2-dependent endocytosis.
  • virus infection suppression and / or infectious disease therapeutic agent according to the present invention and the method for suppressing virus infection and / or treating infection will be described based on examples. Note that the technical scope of the present invention is not limited to the features shown by these examples.
  • PR8 virus was inoculated in the control group, the BB group, the NB group, and the BN group by the method described in Example 1 (3).
  • PR8 virus-containing medium supplemented with BAPTA-AM (Sigma) at 25 ⁇ mol / L was used.
  • PCR reaction solution composition dNTP 200 ⁇ mol / L, forward primer 300 nmol / L, reverse primer 300 nmol / L, template DNA 100 ng, MgCl 2 1.5 mmol / L, 1 ⁇ Expand High Fidelity Reaction buffer, Expand High Fidelity Enzyme mL / 52 mL PCR reaction conditions: after 2 minutes of reaction at 94 ° C., 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds, followed by 5 minutes at 72 ° C. Went.
  • Example (4) Detection with anti-hemagglutinin antibody and anti-calcium channel antibody
  • the liquids a, b, c, d and e of Example (4) were removed, and the washing buffer of Example (1) was added. Washed by shaking for 30 minutes at ° C. This washing operation was performed 3 times in total.
  • the average mRNA relative expression level of PR8 virus nucleoprotein is 1 time in the control group, about 0.75 times in the amlodipine group, about 0.4 times in the verapamil group, and in the diltiazem group. It was about 0.45 times. Further, in comparison with the control group, the verapamil group and the diltiazem group were significantly different.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Nitrogen- Or Sulfur-Containing Heterocyclic Ring Compounds With Rings Of Six Or More Members (AREA)

Abstract

【課題】　亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなくウイルスの感染を抑制することができる、ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法を提供する。 【解決手段】　細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を有効成分とし、細胞内へのウイルスの取り込みを抑制する。本発明に係るウイルス感染抑制および感染症治療剤によれば、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなく、広範囲のウイルス株に対して長期的に、感染を抑制することまたはウイルス感染症を治療することができる。

Description

ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法
　本発明は、ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法に関し、特に、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を用いるウイルス感染抑制および感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法に関する。
　ウイルスとは、細胞を構成単位とせずにＤＮＡかＲＮＡのいずれかをゲノムとして有し、宿主細胞内だけで増殖する微小構造体であり、宿主細胞内の代謝系を利用して増殖する。その際、病原体としてふるまうことがあり、ウイルスが増殖した結果として宿主に惹起される疾病をウイルス感染症という。ウイルス感染症には、例えば、ライノウイルスによる感冒、インフルエンザウイルスによるインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルスによる後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）、単純ヘルペスウイルスによる単純ヘルペス、腫瘍ウイルスによる癌など、さまざまなものがある。
　ウイルスの感染には、I「細胞表面への吸着」、II「細胞内への侵入」、III「脱殻」、IV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」、V「ウイルス部品の集合」、VI「細胞からの放出」の、I～VIのステップがある。従って、従来、これらのステップを攻撃対象として、種々のウイルス感染症の治療剤やウイルス感染予防・阻害剤の研究開発がされている。
　例えば、ウイルス感染予防・阻害剤やウイルス感染症治療剤として代表的であるワクチンは、弱毒化または不活化したウイルスを宿主に取り込ませて免疫を獲得させ、これを利用することで、上記ステップのうち、I「細胞表面の吸着」、II「細胞内への侵入」、あるいはVI「感染細胞からの放出」ステップを対象としている。また、特開２００８－２５３１８８号公報に開示されているＤＮａｓｅＸタンパク質は、ウイルス遺伝子の宿主への取り込みを抑制することで、特開２００７－１６０４４号公報に開示されているペプチドは、レトロウイルスのインテグラーゼを阻害することで、それぞれIV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」ステップを攻撃する（特許文献１および特許文献２）。
　一方、インフルエンザは、代表的なウイルス感染症として知られている。インフルエンザの治療剤、インフルエンザウイルス感染予防・阻害剤としては、例えば、インフルエンザ表面に存在する酵素ノイラミターゼの働きを阻害することによりVI「感染細胞からの放出」ステップを攻撃するオセルタミビル（商品名タミフル；ロシュ社）やザナミビル（商品名リレンザ；グラクソ・スミスクライン社）の他、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を阻害することによりIII「脱殻」ステップを攻撃するアマンタジン（商品名シンメトレル；ノバルティスファーマ社）を挙げることができる。また、国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレットには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに親和性の高いペプチドが開示されており、I「細胞表面への吸着」およびII「細胞内への侵入」ステップを対象としている（特許文献３）。
特開２００８－２５３１８８号公報 特開２００７－１６０４４号公報 国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレット
　しかしながら、特許文献１に開示されたウイルス感染予防・阻害剤は、外来遺伝子の分解を促進することが示されているものの、実際のウイルス感染を阻害するか否かは確かめられておらず、ウイルス感染阻害効果は不明である。また、ワクチン、レトロウイルス感染阻害剤（特許文献２）、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、インフルエンザ予防・治療剤（特許文献３）は、いずれもウイルス本体に由来するタンパク質を標的としているため、亜型への効果が期待できず、また、変異体の出現により耐性獲得が生じやすいという問題点を抱えている。例えば、現在日本で使用されている季節性インフルエンザに対するワクチンは、先行するオーストラリアでの流行株の情報に基づき、日本で流行すると予想された株に対するワクチンが作製されるため、毎年不安定であるうえ、この予測が外れた場合や変異体が生じた場合には、対応が困難となる。
　本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなくウイルスの感染を抑制することができる、ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法を提供することを目的としている。
　本発明者らは、宿主細胞におけるカルシウムイオンを標的として、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質やカルシウムイオンとキレートを形成する物質を用いることで、細胞内へのウイルスの取り込みを抑制して感染を抑制ないし感染症を治療することができることを見出し、下記の各発明を完成した。
（１）細胞内へのウイルスの取り込みを抑制するウイルス感染抑制および／または感染症治療剤であって、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を有効成分とするウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
（２）細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質がウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制する物質である、（１）に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
（３）ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制する物質がアムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムからなる群から選択される１または２以上の物質である、（２）に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
（４）カルシウムイオンとキレートを形成する物質がグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）および／またはＢＡＰＴＡ－ＡＭである、（１）から（３）のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
（５）ウイルスがエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、（１）から（４）のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
（６）エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスからなる群から選択される１または２以上のエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、（５）に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
（７）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１）から（６）のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
（８）ウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法であって、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を用いて細胞内へのウイルスの取り込みを抑制する工程を有する、前記方法。
　本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法によれば、エンドサイトーシスなどの宿主側の機構を抑制して、細胞内へのウイルスの取り込みを抑制することができることから、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなく、広範囲のウイルス株に対して長期的に、感染を抑制することまたはウイルス感染症を治療することができる。また、本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤は、市販のインフルエンザ薬と比較して非常に高いウイルス感染抑制効果を有する。
ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、ＬＹ２９４００２を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ２９４００２群）、ＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）およびオセルタミビルを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（オセルタミビル群）の、それぞれのウイルス感染率を示すグラフである。 ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、アムロジピンを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（アムロジピン群）、ベラパミルを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ベラパミル群）、ジルチアゼムを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ジルチアゼム群）およびＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）の、それぞれのウイルス感染率を示すグラフである。コントロール群に対して有意差検定を行って得られたｐ値をグラフ上部に示す。 ＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加した培地でＭＤＣＫ細胞群を培養した時間とＰＲ８ウイルスの接種時間との関係を示す模式図（左図）およびその場合のウイルス感染率を示すグラフ（右図）である。図中、白色帯はＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加していない培地にてＭＤＣＫ細胞群を培養した時間帯を、黒色帯はＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加した培地にてＭＤＣＫ細胞群を培養した時間帯を、それぞれ示す。 ＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＣｏｓ１細胞における、インフルエンザウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光により、Ｒａｂ７タンパク質をＥＣＦＰの蛍光によりそれぞれ検出した結果を示す図（左図）およびＣｏｓ１細胞１細胞あたりの「ＥＣＦＰの蛍光とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光との重複を示す顆粒数」を示すグラフ（右図）である。 ＢＡＰＴＡ－ＡＭおよびジルチアゼムをそれぞれ添加してデキストランまたはトランスフェリンを取り込ませたＭＤＣＫ細胞群における、ＭＤＣＫ細胞１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度をデキストランまたはトランスフェリンの取り込み量に換算して表したグラフである。各グラフ中の横線は中央値を示す。 「ＹＦＰの蛍光／ＥＣＦＰの蛍光」の割合を測定することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（コントロール群）、ＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）およびＥＧＴＡを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＥＧＴＡ群）における活性化Ｒａｓタンパク質濃度を測定した結果を示す図である。図中、ＰＲ８ウイルス含有培地を細胞に添加した時間を０分として示す。 野生型ＭＥＦ細胞群（陰性コントロール群）、ＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（陽性コントロール群）、ＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）およびＥＧＴＡを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＥＧＴＡ群）について、ＧＳＴ－Ｒａｆ－ＲＢＤタンパク質を用いてプルダウンアッセイを行って得られた溶出液中の、それぞれのＲａｓタンパク質をイムノブロッティングにより検出した結果を示す図である。 カルシウムチャネルタンパク質のα１サブユニットに対する抗体を用いた免疫沈降物を吸着させたメンブレンについて、カルシウムチャネル阻害剤による処理およびＰＲ８ウイルスの添加のいずれも行わずに抗ヘマグルチニン抗体で検出した結果（ａ）、カルシウムチャネル阻害剤による処理を行わずにＰＲ８ウイルスを添加した後、抗ヘマグルチニン抗体で検出した結果（ｂ）、ジルチアゼムにより処理してＰＲ８ウイルスを添加した後、抗ヘマグルチニン抗体で検出した結果（ｃ）、ベラパミルにより処理してＰＲ８ウイルスを添加した後、抗ヘマグルチニン抗体で検出した結果（ｄ）、ならびにカルシウムチャネル阻害剤による処理およびＰＲ８ウイルスの添加のいずれも行わずに抗カルシウムチャネル抗体で検出した結果（ｅ）をそれぞれ示す図である。 カルシウムチャネル阻害剤を含まないＰＢＳを投与したマウス（コントロール群）、アムロジピンを含むＰＢＳを投与したマウス（アムロジピン群）、ベラパミルを含むＰＢＳを投与したマウス（ベラパミル群）、およびジルチアゼムを含むＰＢＳを投与したマウス（ジルチアゼム群）にＰＲ８ウイルスを経鼻投与した後、肺を採取して定量ＰＣＲを行い、ＰＲ８ウイルス核タンパク質ｍＲＮＡの相対発現量を測定した結果を示す図である。図中の＊は、コントロール群に対して有意差検定を行い、統計的に有意であるとの結果が得られたことを示す（ｐ＜０．０５）。
　以下、本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法について詳細に説明する。本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤は、細胞内へのウイルスの取り込みを抑制するウイルス感染抑制および／または感染症治療剤であって、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を有効成分とする。
　本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤は、細胞内へのウイルスの取り込みを抑制する。ウイルスが細胞内へ侵入するに際し、まず、カルシウムチャネルと相互作用することなどにより細胞内へのカルシウムイオンの流入を促すとともにエンドサイトーシスを促進させ、こうして促進されたエンドサイトーシスによってウイルスが細胞内へ侵入する（ウイルス侵入機構）との発明者らの知見に、本発明は基づくものである。
　上述のウイルス侵入機構に対し、本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤は、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制することや、細胞内または細胞外においてカルシウムイオンとキレートを形成して細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を抑制することにより、細胞内へのウイルスの取り込みを抑制する。
　本発明において、細胞内とは生体膜によって仕切られた内部のことをいう。一般に、細胞内へのカルシウムイオンの流入は種々の経路を介しておこる。例えば、Ｌ型カルシウムチャネル、Ｐ型／Ｑ型カルシウムチャネル、Ｎ型カルシウムチャネル、Ｒ型カルシウムチャネル、Ｔ型カルシウムチャネルなどの細胞膜に存在する電位依存性カルシウムチャネルを含む電位依存性陽イオンチャネルや、イノシトール三リン酸受容体、リアノジン受容体、容量依存性カルシウムチャネルなどのリガンド依存性カルシウムチャネルの他、５－ＨＴ３受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体やα－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メソオキサゾール－４－プロピオン酸（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体などを含むリガンド依存性陽イオンチャネルが開口して、細胞外から細胞内へカルシウムイオンが流入する経路を挙げることができる。カルシウムチャネルにおけるサブユニットとしては、例えば、α１サブユニット、α２サブユニット、βサブユニット、γサブユニット、δサブユニットなどを挙げることができる。また、細胞内が細胞質をいう場合は、上述の経路の他、小胞体や筋小胞体など、カルシウム貯蔵部位として機能する細胞小器官の生体膜上に存在する電位依存性カルシウムチャネルやリガンド依存性カルシウムチャネルが開口して、細胞小器官の内部から細胞質へカルシウムイオンが流入する経路を挙げることができる。その他、カルシウムナトリウム交換体による流入経路、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルからの流入経路などを挙げることができる。なお、本発明において「カルシウムチャネル」は、これらのカルシウムイオンの流入経路においてチャネルとして機能するものをいう。
　本発明に係る細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質は、上述の流入経路からのカルシウムイオンの流入を阻害する物質を含め、その作用機構にかかわらず、結果として細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制するものであれば特に限定されない。そのような物質としては、例えば、ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制する物質やカルシウムイオン特異的結合タンパク質、カルシウムチャネルの開口を阻害する物質（カルシウムチャネル阻害剤、カルシウム拮抗剤、カルシウムチャネル遮断剤）、ＫＢ－Ｒ７９４３などのカルシウムナトリウム交換体のカルシウムイオン流入作用を阻害する物質などを挙げることができ、ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制する物質を好適に用いることができる。
　本発明において、ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制する物質としては、例えば、ヘマグルチニンなどのウイルスのカルシウムチャネル相互作用部位に結合する物質や、カルシウムチャネルのウイルス相互作用部位に結合する物質、カルシウムチャネル阻害剤などを挙げることができる。なお、本発明において「相互作用」は、「接触」、「結合」、「融合」、「接着」、「付着」、「密着」と交換可能に用いられる。
　本発明において、カルシウムチャネル阻害剤としては、例えば、ジヒドロピリジン誘導体、フェニルアルキルアミン誘導体、ベンゾチアゼピン誘導体、ジフェニルピペラジン誘導体などを挙げることができ、より詳細には、例えば、アムロジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニカルジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、ベプリジル、バルプロ酸、ガバペンチン、シルニジピン、アラニゾピン、エホニジピン、ニソルジピン、ニソルニジピン、ニトレンジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、バルニジピン、フェロジピン、ベニジピン、マニジピン、カルシセプチン、コノトキシン、アガトキシン、ＦＴＸ、フルナリジン、オクタノール、カルシクルジン、タイカトキシン、２，３－Ｄｉｏｘｏ－６－ｎｉｔｒｏ－１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｆ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ－７－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＮＢＱＸ）、６－シアノ－７－ニトロキノキサリン－２，３－ジオン（ＣＮＱＸ）、６，７－Ｄｉｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ－２，３－ｄｉｏｎｅ（ＤＮＱＸ）、ジゾシルピン、Ｄ－（－）－２－Ａｍｉｎｏ－５－ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｄ－ＡＰ５）などを挙げることができ、アムロジピンやベラパミル、ジルチアゼムを好適に用いることができる。
　本発明においてカルシウムイオンとキレートを形成する物質は、キレート剤として機能する物質であれば、細胞膜透過性の有無を問わず用いることができる。また、カルシウムイオンに対する選択性が高くて専らカルシウムイオンとキレートを形成する物質でもよく、カルシウムイオンに対する選択性が低く、カルシウムイオンの他、カルシウムイオン以外の物質ともキレートを形成する物質でもよい。そのような物質としては、例えば、ＢＡＰＴＡ－ＡＭ｛Ｏ，Ｏ’－Ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ｔｅｔｒａａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ｝、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１，３－ジアミノ２－ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ－ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、トランス－シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、カルボキシメチルポリエチレンイミン、クラウンエーテルなどのポリマーキレート剤、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、エチレンジアミンコハク酸（ＥＤＤＳ）およびこれらの塩などのアミノカルボン酸系キレート剤、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、ホスホノブタントリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）などのホスホン酸系キレート剤、グルコン酸、ヘプトグルコン酸、クエン酸やシュウ酸およびこれらの塩などのカルボン酸系キレート剤、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメル、エデト酸トリエンチンなどを挙げることができ、これらから選択される１種または２種以上を用いることができ、ＢＡＰＴＡ－ＡＭやＥＧＴＡを好適に用いることができる。
　感染を抑制するか否かは、ＪＢＣ、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年や、ＮＣＢ、第３巻、第３０１頁、２００１年、あるいはＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年などに従い、感染率を算出することにより評価することができる他、例えば、ウイルス株の感染価を指標として評価することができる。感染価とは、一般的に感染性の微生物を含む検体を培養細胞に等量ずつ接種した時、感染率５０％を与えるようなその検体の量をいい、「ＴＣＩＤ５０（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」で表される。
　なお、本発明において「感染を抑制する」は、「感染を予防する」、「感染を阻止する」、「感染を阻害する」と交換可能に用いられる。
　本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤は、個体または細胞とウイルスとが接触する以前、接触中または接触直後のみならず、個体または細胞とウイルスとが接触して長時間経過した後に投与することにより、ウイルス感染を抑制し、あるいは感染症を治療することができる。
　対象となるウイルスとしては、例えば、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、パラミクソウイルスなどの膜融合により感染可能なウイルス、バクテリオファージなどの核酸注入により感染可能なウイルス、インフルエンザウイルスなどのエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスを挙げることができるが、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスが好ましい。また、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのうち、クラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスからなる群から選択される１または２以上のエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスがより好ましい。そのようなウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、シミアン－ウイルス４０、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヘルペスウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｂ（ＣＶＢ）、イネ萎縮ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどを挙げることができる。
　ここで、エンドサイトーシスとは、一般に、細胞が外界からの物質を細胞膜の小胞化と融合により内部に取り込む方式の総称である。エンドサイトーシスは、取り込む物質の種類や大きさ、関与する細胞装置の違いにより、クラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、カベオラ依存性エンドサイトーシス、コレステロール依存性エンドサイトーシス、ダイナミン－２依存性エンドサイトーシスなどに分類されている。
　また、エンドサイトーシスは、細胞膜に存在する受容体タンパク質への刺激により生じるか否かにより、受容体依存性エンドサイトーシスおよび受容体非依存性エンドサイトーシスにも分類可能である。この場合、前者には上述の分類でいうクラスリン依存性エンドサイトーシスやカベオラ依存性エンドサイトーシスなどに相当するエンドサイトーシスが含まれ、後者には上述の分類でいうクラスリン非依存性エンドサイトーシスやマクロピノサイトーシスに相当する、食作用（ファゴサイトーシス）や飲作用（ピノサイトーシス）などが含まれる。
　すなわち、本発明において「エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、クラスリン非依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、クラスリン依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、マクロピノサイトーシスにより感染可能なウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、ダイナミン－２依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスが包含される。
　なお、本発明者らは以前に、宿主細胞におけるｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質とＰｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とが複合体を形成し、エンドソーム上に存在することで、クラスリンに依存しないエンドサイトーシス（クラスリン依存性エンドサイトーシスを除いたエンドサイトーシス；すなわちクラスリン非依存性エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、カベオラ依存性エンドサイトーシス、コレステロール依存性エンドサイトーシス、ダイナミン－２依存性エンドサイトーシスなど）によってウイルスが感染することを見出している（ＰＣＴ／２０１０／０６８０１０）が、本発明に係るウイルスの感染抑制および／または感染症治療剤は、ウイルス接種に伴うＲａｓタンパク質の活性化をも抑制することができることから、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが複合体を形成することによるウイルス感染メカニズムよりも上流にあるメカニズムを阻害するものである。なお、ＰＣＴ／２０１０／０６８０１０の内容は、本明細書に包含される。
　本発明に係るウイルスの感染抑制および／または感染症治療剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
　次に、本発明に係るウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法は、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を用いて細胞内へのウイルスの取り込みを抑制する工程を有する。なお、本発明に係るウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法において、上述した本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
　以下、本発明に係るウイルスの感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
＜実施例１＞カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞におけるインフルエンザウイルス感染率の検討
　Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤であるＬＹ２９４００２、カルシウムイオンキレート剤であるＢＡＰＴＡ－ＡＭおよび市販のインフルエンザ薬であるオセルタミビルをそれぞれ添加してインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
（１）カルシウムイオンキレート剤による前処理
　Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞群を４群に分け、それぞれコントロール群、ＬＹ２９４００２群、ＢＡＰＴＡ群およびオセルタミビル群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群およびオセルタミビル群について、ＰＢＳで洗浄した後、ＢＡＰＴＡ群には細胞膜透過性のカルシウムイオンキレート剤であるＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地；シグマ社）を、オセルタミビル群には市販のインフルエンザ薬であるオセルタミビル（Ｒｏｃｈｅ社）１００μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を添加して、それぞれ３７℃で３０分間培養した。
（２）ウイルスの調製
　北海道大学の高田礼人氏より供与されたインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）を、ニワトリ卵１０日胚（ホクレン中央種鶏場）の漿尿膜へ接種して、３７℃にて４８時間培養して増殖させた。
（３）ＭＤＣＫ細胞群へのウイルス接種
　本実施例（２）のＰＲ８ウイルスを、重複感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）=１となるようｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ培地）（インビトロジェン社）に加えてＰＲ８ウイルス含有培地を調製した。さらに、各群に添加するＰＲ８ウイルス含有培地に、下記に示す試薬をそれぞれ添加した。
　コントロール群：無添加
　ＬＹ２９４００２群：ＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）
　５０μｍｏｌ／Ｌ（培地中濃度）
　ＢＡＰＴＡ群：ＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）
　２５μｍｏｌ／Ｌ（培地中濃度）
　オセルタミビル群：オセルタミビル（Ｒｏｃｈｅ社）
　１００μｍｏｌ／Ｌ（培地中濃度）
　続いて、本実施例（１）の各群をＰＢＳで洗浄した後、上記の試薬を含むＰＲ８ウイルス含有培地を添加し、３５℃にて１時間培養することによりインフルエンザウイルス接種を行った。
（４）ウイルス接種後の培養
　本実施例（３）の各群をＰＢＳで洗浄した後、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加し、３５℃にて２日間培養した。ただし、ＬＹ２９４００２群、ＢＡＰＴＡ群およびオセルタミビル群について、本実施例（３）のウイルス接種時と同じ試薬を同じ濃度となるようそれぞれ添加した。
（５）プラークアッセイによるウイルス感染率の検定
　本実施例（４）の培養上清を、新たなＭＤＣＫ細胞群にそれぞれ添加した後、１時間培養した。続いて、培養上清を除去し、Ｂａｃｔ－ａｇａｒ１％（ｖ／ｖ）およびトリプシン５μｇ／ｍＬを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加して３５℃にて２日間培養した後、出現したプラークを数えた。この結果をもとに、ＰＲ８ウイルスの各群におけるウイルス感染率を求めた｛ＪＢＣ、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年；ＮＣＢ、第３巻、第３０１頁、２００１年；ＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年｝。その結果を図１に示す。
　図１に示すように、ＬＹ２９４００２群、ＢＡＰＴＡ群およびオセルタミビル群のウイルス感染率は、コントロール群に比較して、それぞれ約１／５、約１／１００および約１／１０であり、ＢＡＰＴＡ群が最も顕著にウイルス感染率が低下した。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理すると、ウイルス感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
＜実施例２＞カルシウムチャネル阻害剤により処理した細胞におけるウイルス感染率の検討
　カルシウムチャネルを阻害することにより細胞内へのカルシウムイオン流入を抑制する試薬であるアムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムをそれぞれ添加してインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
　まず、ＭＤＣＫ細胞群を５群に分け、それぞれコントロール群、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群とした。続いてアムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群について、アムロジピン（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）、ベラパミル（シグマ社）５０μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）、ジルチアゼム（シグマ社）１００μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）およびＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を用いて、実施例１（１）に記載の方法によりそれぞれ前処理を行った。
　続いて、コントロール群、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した後、実施例１（４）に記載の方法により培養した。ただし、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群について、ＰＲ８ウイルス含有培地および接種後の培養に用いた培地には、前処理時と同じ試薬を同じ濃度となるよう添加し、接種後の培養時間は２日間に代えて２３時間とした。
　続いて、実施例１（５）に記載の方法によりプラークアッセイを行い、ウイルス感染率を求めた。その結果を図２に示す。
　図２に示すように、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群のウイルス感染率は、いずれもコントロール群に比較して顕著に低下した。以上より、カルシウムチャネル阻害剤で処理することにより、ウイルス感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
＜実施例３＞カルシウムイオンキレート剤による処理時間とウイルス接種時間との関係の検討
　カルシウムイオンキレート剤を添加した培地で培養した時間が異なる細胞におけるウイルス感染率を求め、カルシウムイオンキレート剤による処理時間とウイルス接種時間との関係を調べた。
　まず、ＭＤＣＫ細胞群を４群に分け、それぞれコントロール群、Ｂ－Ｂ群、Ｎ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群とした。続いて、Ｂ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群について、ＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を用いて、実施例１（１）に記載の方法により前処理を行った。
　次に、コントロール群、Ｂ－Ｂ群、Ｎ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、Ｂ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群については、ＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）を２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加したＰＲ８ウイルス含有培地を用いた。
　その後、実施例１（４）に記載の方法により培養した。ただし、培養時間は２日間に代えて２３時間とし、培養時間が３時間を経過した時点で培地を同じ組成の新しいものに交換した。また、Ｂ－Ｂ群、Ｎ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群の培地に、下記のとおりＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）を２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。
Ｂ－Ｂ群：０時間～３時間　　添加
　　　　　３時間～２３時間　添加
Ｎ－Ｂ群：０時間～３時間　　添加せず
　　　　　３時間～２３時間　添加
Ｂ－Ｎ群：０時間～３時間　　添加
　　　　　３時間～２３時間　添加せず
　ＢＡＰＴＡ－ＡＭを培地に添加した時間についての模式図を図３左図に示す。また、実施例１（５）に記載の方法によりプラークアッセイを行い、ウイルス感染率を求めた結果を図３右図に示す。
　図３右図に示すように、Ｂ－Ｂ群、Ｎ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群のウイルス感染率は、いずれもコントロール群に比べて低下した。また、ウイルス感染率の低下はＢ－Ｂ群が最も顕著であり、Ｎ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群は同程度であった。
　以上より、Ｂ－Ｎ群でウイルス感染率が低下したことから、ウイルス接種と同時およびウイルス接種前後数時間の間にカルシウムイオンキレート剤により処理すると、ウイルス感染を抑制できることが明らかになった。また、Ｎ－Ｂ群でウイルス感染率が低下することから、ウイルス接種後数時間から数十時間の間にカルシウムイオンキレート剤により処理すると、ウイルス感染を抑制できることが明らかになった。さらに、Ｂ－Ｂ群において、Ｎ－Ｂ群およびＢ－Ｎ群に比較してウイルス感染率の低下が大きいことから、ウイルス接種前からウイルス接種後数十時間の間に継続してカルシウムイオンキレート剤により処理すると、ウイルス感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
＜実施例４＞カルシウムイオンキレート剤により処理した細胞におけるインフルエンザウイルス核タンパク質の存在箇所の観察
　インフルエンザウイルス核タンパク質および後期エンドソームマーカータンパク質を免疫抗体染色および蛍光標識により可視化し、ＢＡＰＴＡ－ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種した細胞において、これらのタンパク質が存在する箇所を調べた。
（１）発現ベクターの調製
　後期エンドソームに局在することが知られているＲａｂ７タンパク質のコード領域（配列番号１）が挿入された発現ベクターｐＥＧＦＰ－Ｃ１－Ｒａｂ７は東京大学の坪井貴司氏から供与された。また、強化青緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）のコード領域（配列番号２）が挿入された発現ベクターｐＣＡＧＧＳ－ＥＣＦＰは、京都大学の松田道行氏から供与された。
　ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－Ｒａｂ７を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社）を用いてＰＣＲを行い、Ｒａｂ７のコード領域を増幅して単離した。ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
　フォワードプライマー；５’－ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧ－３’（配列番号３）
　リバースプライマー　；５’－ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４）
　ＰＣＲ反応溶液組成；ｄＮＴＰ　２００μｍｏｌ／Ｌ、フォワードプライマー　３００ｎｍｏｌ／Ｌ、リバースプライマー　３００ｎｍｏｌ／Ｌ、鋳型ＤＮＡ　１００ｎｇ、ＭｇＣｌ２　１．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１×Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｒｅａｃｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ　５２Ｕ／ｍＬ
　ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
　得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した後、制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、前記発現ベクターｐＣＡＧＧＳ－ＥＣＦＰのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ－ＥＣＦＰ－Ｒａｂ７を得た。
（２）一次抗体の調製
　インフルエンザウイルス核タンパク質（インフルエンザウイルスＮＰ）に対する抗体である抗インフルエンザウイルスＮＰマウスモノクローナル抗体は北海道大学の高田礼人氏より供与された。
（３）Ｃｏｓ１細胞への発現ベクターの導入
　アフリカミドリザル腎由来のＣｏｓ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ－１６５０）に、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（１）の発現ベクターｐＣＡＧＧＳ－ＥＣＦＰ－Ｒａｂ７を導入し、胎児牛血清（ＦＢＳ；Ｃａｎｓｅｒａ社）１０ｖ／ｖ％を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）で、３７℃、ＣＯ２５％を含む加湿環境下にて２４時間培養した。
（４）カルシウムイオンキレート剤による前処理およびウイルス接種
　本実施例（３）のＣｏｓ１細胞群を２群に分け、それぞれコントロール群およびＢＡＰＴＡ群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群について、ＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を用いて、実施例１（１）に記載の方法により前処理を行った。
　次に、コントロール群およびＢＡＰＴＡ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、接種時間は１時間に代えて２時間とした。また、ＢＡＰＴＡ群については、ＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）を２５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加したＰＲ８ウイルス含有培地を用いた。
（５）免疫蛍光染色
　本実施例（４）のコントロール群およびＢＡＰＴＡ群をＰＢＳで洗浄後、パラホルムアルデヒドを３％含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温で１５分間固定した後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を０．１％含むＰＢＳを用いて室温で４分間透過処理した後、ＰＢＳで洗浄した。次に、抗体の非特異的結合を抑えるために、ウシ血清アルブミンを１％含むＰＢＳを用いて３０分間ブロッキングを行った後、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００およびウシ血清アルブミンをそれぞれ０．０５％および０．１％含むＰＢＳで洗浄した。その後、本実施例（２）の抗インフルエンザウイルスＮＰ抗体をＰＢＳで５００倍希釈した溶液に４℃にて一晩曝し、一次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）をＰＢＳで２５０倍希釈した溶液に室温にて１時間曝して、二次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。
（６）蛍光顕微鏡による観察
　共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ‐１０００（オリンパス社）を用いて、本実施例（３）のコントロール群およびＢＡＰＴＡ群におけるＥＣＦＰの蛍光およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光を検出した。その結果を図４左図に示す。また、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて各群の１０個から２０個の細胞について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光とＥＣＦＰの蛍光との重複を示す顆粒数を測定し、１細胞あたりの平均値を求めてグラフに表した。その結果を図４右図に示す。
　図４左図および右図に示すように、ＢＡＰＴＡ群では、コントロール群に比較してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光とＥＣＦＰの蛍光との重複を示す顆粒が顕著に少なかった。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理すると、ウイルスＮＰの後期エンドソームへの取り込みが抑制されることが明らかになった。すなわち、カルシウムイオンキレート剤により、エンドサイトーシスによる細胞内へのウイルスの取り込みを抑制できることが明らかになった。
＜実施例５＞カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞およびカルシウムチャネル阻害剤で処理した細胞におけるエンドサイトーシス機能の検討
　トランスフェリンおよびデキストランを、カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞およびカルシウムチャネル阻害剤で処理した細胞に取り込ませ、それらの取り込み量を調べた。
（１）カルシウムイオンキレート剤およびカルシウムチャネル阻害剤による前処理
　ＭＤＣＫ細胞群を３群に分け、それぞれコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群について、ＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）およびジルチアゼム（シグマ社）１００μｍｏｌ／Ｌμｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）をそれぞれ用いて、実施例１（２）に記載の方法により前処理を行った。
（２）エンドサイトーシス機能の評価
　本実施例（１）のコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群をそれぞれ２つに分け、そのうち一方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を結合した分子量１００００のデキストランを、他方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を結合したトランスフェリン（インビトロジェン社）を、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう培地に添加して、３７℃、ＣＯ２５％を含む加湿環境下で３０分間培養した。続いて、ＰＢＳを用いて各群の細胞を洗浄し、３％ＰＦＡを用いて室温で１５分間固定した後、再度ＰＢＳを用いて各群の細胞を洗浄した。その後、実施例４（６）に記載の方法により蛍光観察を行い、各群における２０個から３０個の細胞について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度を測定し、デキストランの取り込み量およびトランスフェリンの取り込み量に換算して、グラフに表した。その結果を図５に示す。
　図５に示すように、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群では、デキストランおよびトランスフェリンのいずれについても、コントロール群に比較して取り込み量が低下した。分子量１００００のデキストランは、主にマクロピノサイトーシスおよびクラスリン非依存性エンドサイトーシスにより、またトランスフェリンは主にクラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれると考えられることから、カルシウムイオンキレート剤またはカルシウムチャネル阻害剤で処理すると、クラスリン非依存性のエンドサイトーシス、クラスリン依存性のエンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスが抑制されることが明らかになった。すなわち、カルシウムイオンキレート剤やカルシウムチャネル阻害剤により、エンドサイトーシスを抑制できることが明らかになった。
　カルシウムイオンキレート剤についての以上の結果｛カルシウムイオンキレート剤によりウイルス感染を抑制できること（実施例１および実施例３）、カルシウムイオンキレート剤によりウイルス核タンパク質の後期エンドソームへの取り込みを抑制できること（実施例４）、および、カルシウムイオンキレート剤によりエンドサイトーシスを抑制できること（本実施例）｝から、カルシウムイオンキレート剤を用いて、エンドサイトーシスによる細胞内へのウイルスの取り込みを抑制してウイルス感染を抑制できることが明らかになった。
　また、カルシウムチャネル阻害剤についての以上の結果｛カルシウムチャネル阻害剤によりウイルス感染を抑制できること（実施例２）、および、カルシウムチャネル阻害剤によりエンドサイトーシスを抑制できること（本実施例）｝から、カルシウムチャネル阻害剤を用いて、エンドサイトーシスによる細胞内へのウイルスの取り込みを抑制してウイルス感染を抑制できることが明らかになった。
＜実施例６＞カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞における、Ｒａｓタンパク質活性化の検討
　カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞における、ウイルス接種に伴う活性化Ｒａｓタンパク質の濃度変化を、ＦＲＥＴの原理に基づく蛍光観察およびプルダウンアッセイにより調べた。
（１）ＦＲＥＴによる活性化Ｒａｓタンパク質の検出
［１－１］野生型ＭＥＦ細胞群の調製
　野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Ｊｃｌ；日本クレア）からマウス胎児繊維芽（Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）細胞群を既報に従って調製し｛Ｓａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８７巻、第５４５５号、第１０４０－１０４６頁、２０００年｝、実施例４（２）に記載の環境下で培養した。
［１－２］発現ベクターの調製
　ＦＲＥＴの原理に基づいて設計されたＲａｉｃｈｕ－Ｒａｓタンパク質のコード領域（配列番号５）が挿入された発現ベクターｐＲａｉｃｈｕ－１４６Ｘは、京都大学の松田道行氏から供与された。Ｒａｉｃｈｕ－Ｒａｓタンパク質は、Ｒａｓタンパク質とＲａｓタンパク質に結合することが知られている因子であるＲａｆタンパク質のＲＢＤとが連結され、さらに、Ｒａｓタンパク質とＲＢＤとがＹＦＰとＣＦＰとで挟まれた構造を持つ。よって、波長４４０ｎｍで励起すると、Ｒａｓタンパク質がＧＤＰ結合型の場合はＣＦＰの蛍光を発し、Ｒａｓタンパク質がＧＴＰ結合型の場合はＹＦＰの蛍光を発する。
［１－３］野生型ＭＥＦ細胞への発現ベクターの導入
　本実施例（１）の野生型ＭＥＦ細胞に、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（１）［１－２］の発現ベクターｐＲａｉｃｈｕ－１４６Ｘを導入した。その後、実施例４（２）に記載の環境下で培養した。
［１－４］カルシウムイオンキレート剤による前処理
　本実施例（１）［１－３］の野生型ＭＥＦ細胞群を３群に分け、それぞれコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群には細胞膜透過性のカルシウムイオンキレート剤であるＢＡＰＴＡ－ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地を、ＥＧＴＡ群には細胞膜非透過性のカルシウムイオンキレート剤であるＥＧＴＡ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地をそれぞれ用いて、実施例１（１）に記載の方法により前処理を行った。
［１－５］インフルエンザウイルス接種および蛍光観察
　既報（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ 第４１１巻、第１０６５－１０６８頁、２００１年／Ｏｈｂａ Ｙ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２２巻、第４号、第８５９－８６９頁、２００３年）に従い、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて観察しながら、本実施例（１）［１－４］のコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群に、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種して、約５０分間蛍光観察した。代表的な１細胞の結果を図６に示す。
　図６に示すように、コントロール群ではＰＲ８ウイルス接種後にＹＦＰ／ＣＦＰの蛍光強度比が経時的に増加した。一方、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群では、ＹＦＰ／ＣＦＰの蛍光強度比はほとんど増加しなかった。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理することにより、ウイルス接種に伴うＲａｓタンパク質の活性化が抑制されることが明らかになった。すなわち、カルシウムイオンキレート剤により、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによる細胞内へのウイルスの取り込みが抑制できることが示唆された（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６８０１０）。
（２）プルダウンアッセイによる活性化Ｒａｓタンパク質の検出
［２－１］ＧＳＴ融合タンパク質およびｌｙｓｉｓ緩衝液の調製
　北里大学の服部成介氏から供与された、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とｃ－Ｒａｆ１のＲＢＤとの融合タンパク質（ＧＳＴ－Ｒａｆ－ＲＢＤタンパク質）のコード領域が挿入された発現ベクターｐＧＥＸ－Ｒａｆ－ＲＢＤを、常法に従い大腸菌で発現させて精製ＧＳＴ－Ｒａｆ－ＲＢＤタンパク質を得た。また、以下の組成からなるｌｙｓｉｓ緩衝液を調製した。
　ｌｙｓｉｓ緩衝液の組成
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）　　　　　５０ｍＭ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　 　　　５ｍＭ
Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０ 　　　　　　　　　　　１％（ｖ／ｖ）
ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ　 ０．５％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１％（ｗ／ｖ）
Ｎａ３ＶＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ
［２－２］野生型ＭＥＦ細胞群の調製、カルシウムイオンキレート剤による前処理およびウイルス接種
　本実施例（１）［１－１］に記載の方法により調製した野生型ＭＥＦ細胞群を４群に分け、それぞれ陰性コントロール群、陽性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群について、本実施例（１）［１－４］に記載の方法により前処理を行った。次に、陽性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、ＰＲ８ウイルス含有培地における培養時間を１時間に代えて０．５時間とした。
［２－３］プルダウンアッセイ
　プルダウンアッセイは、既報｛Ｆｒａｎｋｅ Ｂ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ． 第１６巻、第２５２－２５９頁、１９９７年；Ｉｎｕｚｕｋａ Ｔ．ら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ． 第３７９巻、第５１０－５１３頁、２００９年；Ｏｈｂａ、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２０巻、第１３号、第３３３３－３３４１頁、２００１年｝に従い行った。具体的には、本実施例（２）［２－２］の陰性コントロール群、陽性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群に、本実施例（２）［２－１］のｌｙｓｉｓ緩衝液を添加して細胞を溶解した。続いて、遠心分離を行って上清を回収した。各群の上清を２つに分け、そのうち一方は細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液として取り置いた。他方に、本実施例（２）［２－１］の精製ＧＳＴ－Ｒａｆ－ＲＢＤタンパク質を添加して３０分間反応させた後、グルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ；ＧＥヘルスケア社）を添加して反応させた。続いて、遠心分離を行って上清を除去し、本実施例（２）［２－１］のｌｙｓｉｓ緩衝液を用いて沈殿物を２回洗浄した後、溶出液を加えてビーズに結合したタンパク質を溶出させ、各群のプルダウンアッセイ液を得た。
［２－４］イムノブロッティングによるＲａｓタンパク質の検出
　本実施例（２）［２－３］の各群の細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液およびプルダウンアッセイ液について、常法に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。続いて、分離したタンパク質を、イミュン－ブロットＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）に吸着させた。
 　次に、一次抗体として抗Ｒａｓマウスモノクローナル抗体｛Ａｎｔｉ－Ｐａｎ－Ｒａｓ（Ａｂ－３）；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社｝とＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）とを用いて、付属の使用書に従い抗原抗体反応を行った後、ＬＡＳ－１０００ＵＶ ｍｉｎｉ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（富士フィルム社）を用いてシグナルを検出した。その結果を図７に示す。
　図７に示すように、陽性コントロール群では、プルダウンアッセイ液において細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液と同程度の強いシグナルが検出された一方で、陰性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群ではいずれも、各群の細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液に比べて弱いシグナルが検出された。また、細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液におけるシグナル強度に各群間の差はほとんど見られなかった。
　抗Ｒａｓマウスモノクローナル抗体はＧＴＰ結合型Ｒａｓタンパク質およびＧＤＰ結合型Ｒａｓタンパク質のいずれにも結合することから、細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液におけるシグナルは細胞中の総Ｒａｓタンパク質の存在量を表す。一方、Ｒａｆ－ＲＢＤに結合するのはＧＴＰ結合型Ｒａｓタンパク質であり、ＧＤＰ結合型Ｒａｓタンパク質は結合しないことから、プルダウンアッセイ液におけるシグナルは、活性化Ｒａｓタンパク質の存在量を表す。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理することにより、ウイルス接種に伴うＲａｓタンパク質の活性化が抑制されることが明らかになった。また、カルシウムイオンキレート剤は、細胞膜透過性の有無にかかわらず、細胞内におけるＲａｓタンパク質活性化の抑制効果を有することが明らかになった。すなわち、カルシウムイオンキレート剤により、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによる細胞内へのウイルスの取り込みが抑制できることが示唆された（ＰＣＴ／２０１０／０６８０１０）。
＜実施例７＞ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用の検討
　カルシウムチャネルタンパク質のα１サブユニットに対する抗体を用いた免疫沈降物をブロットしたメンブレンをカルシウムチャネル阻害剤により処理し、インフルエンザウイルスを添加した後、抗ヘマグルチニン抗体で検出することにより、ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用に対するカルシウムチャネル阻害剤の効果を検討した。
（１）バッファーの調製
　蒸留水に下記の試薬を下記の終濃度となるよう溶解することにより、免疫沈降用バッファー、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー、ブロッキングバッファーおよび洗浄用バッファーを調製した。
　免疫沈降用バッファー
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００　　　　　　　　　　 １％（ｖ／ｖ）
ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　　 １ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　　 １ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎａ３ＶＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｍｏｌ／Ｌ
フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）　１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ／ｍＬ
Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ／ｍＬ
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｇｌｙｃｅｒｏｌ　　　　　　　　　　１０％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ　　　　　　　　　　　　　　　　４％（ｗ／ｖ）
ブロモフェノールブルー　　　　　０．０１％（ｗ／ｖ）
２－メルカプトエタノール　　　　　　　５％
　ブロッキングバッファー
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　　　　　　１％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｗｅｅｎ２０　　　　　　　　　　０．０５％（ｖ／ｖ）
ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　 １ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮｉＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　 １ｍｍｏｌ／Ｌ
　洗浄用バッファー
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　　　　　　１％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｗｅｅｎ２０　　　　　　　　　　０．０５％（ｖ／ｖ）
ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　 １ｍｍｏｌ／Ｌ
（２）免疫沈降およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞を直径１０ｃｍの培養皿８枚に播種してＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃でコンフルエントとなるまで培養した。
　続いて、培地を除去してＰＢＳで２回洗浄した後、本実施例（１）の免疫沈降用バッファー４ｍＬを添加して細胞を溶解した後、４℃で１時間静置した。次に、４℃、１５，０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離した後、上清４ｍＬを回収して細胞溶解液とした。電位依存性カルシウムチャネルのα１サブユニットを認識するウサギポリクローナル抗体である、抗カルシウムチャネル抗体（Ａｎｔｉ－Ｃａｖ ｐａｎα１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、ＡＣＣ－００４；Ａｌｏｍｏｎｅ社）１μｇを細胞溶解液に加え、４℃で１時間インキュベートした。続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥヘルスケア社）を８０μＬ加えて４℃で１時間インキュベートした後、遠心分離を行って上清を除去し、免疫沈降物を得た。
　本実施例（１）の免疫沈降用バッファーを用いて免疫沈降物を３回洗浄した後、本実施例（１）のＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー６０μＬを加え、６５℃で１０分熱処理を行った。氷冷した後、８％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルの５つのウェルに１０μＬずつアプライし、常法に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。続いて、分離したタンパク質を、イミュン－ブロットＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）に吸着させた。このメンブレンをレーンごとに切断して５つに分け、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅとした。
（３）カルシウムチャネル阻害剤による前処理
　本実施例（１）のブロッキングバッファーに、ジメチルスルホキシドを０．１％（ｖ／ｖ）となるように添加したもの、ジメチルスルホキシドを０．１％（ｖ／ｖ）およびジルチアゼムを２００μｍｏｌ／Ｌとなるように添加したもの、ならびにジメチルスルホキシドを０．１％（ｖ／ｖ）およびベラパミルを５０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加したものを準備し、それぞれ、ジメチルスルホキシド溶液、ジルチアゼム溶液およびベラパミル溶液とした。
　本実施例（２）のａおよびｂをジメチルスルホキシド溶液に、ｃをジルチアゼム溶液に、ｄをベラパミル溶液に、ｅを本実施例（１）のブロッキングバッファーにそれぞれ浸漬して、４℃で１６時間インキュベートした。
（４）メンブレンへのウイルスの添加
　本実施例（３）のｂ、ｃおよびｄに、実施例１（２）のＰＲ８ウイルスを３×１０６ＰＦＵずつ加えた後、４℃で６時間インキュベートした。本実施例（３）のａおよびｅにはＰＲ８ウイルスを加えずに、４℃で６時間インキュベートした。
（５）抗ヘマグルチニン抗体および抗カルシウムチャネル抗体による検出
　本実施例（４）のａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅの液体を除去して、本実施例（１）の洗浄用バッファーを加え、４℃で３０分間振とうすることにより洗浄した。この洗浄操作は計３回行った。
　続いて、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質を認識するマウスモノクローナル抗体である、北海道大学の高田礼人氏から供与された抗ヘマグルチニン抗体をブロッキングバッファーに１０００倍希釈となるよう加えて、これをＨＡ抗体溶液とした。また、電位依存性カルシウムチャネルのα１サブユニットのうちタイプ１．２を認識するウサギポリクローナル抗体である、抗カルシウムチャネル抗体（Ａｎｔｉ－Ｃａｖ１．２，ＡＣＣ－００３，Ａｌｏｍｏｎｅ社）をブロッキングバッファーに１０００倍希釈となるよう加えて、これをＣａ２＋チャネル抗体溶液とした。ａ、ｂ、ｃおよびｄには、ＨＡ抗体溶液を、ｅにはＣａ２＋チャネル抗体溶液をそれぞれ加えて、４℃で１２時間インキュベートすることにより一次抗体による抗原抗体反応を行った。
　続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）をブロッキングバッファーに５０００倍希釈となるよう加えて、これを二次抗体溶液とした。ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅについて、本実施例（１）の洗浄用バッファーを用いて上記と同様の洗浄操作を計３回行った後、二次抗体溶液を添加し、４℃で４時間インキュベートすることにより二次抗体による抗原抗体反応を行った。その後、実施例（１）の洗浄用バッファーを用いて上記と同様の洗浄操作を計３回行った後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて１分間発色反応を行った後、ＬＡＳ－１０００ＵＶ ｍｉｎｉ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（富士フィルム社）を用いて発光シグナルを検出した。その結果を図８に示す。
　図８に示すように、ｅにおいて、２５０ｋＤａのバンドに強いシグナルが検出された。この結果から、２５０ｋＤａのバンドがカルシウムチャネルタンパク質のα１サブユニットを示すものであることが確認された。
　また、２５０ｋＤａのバンドについて、ａとｂとを比較すると、ｂではａよりも強いシグナルが検出された。以上より、ウイルスヘマグルチニンタンパク質はカルシウムチャネルタンパク質と相互作用することが明らかになった。
　また、２５０ｋＤａのバンドについて、ｂ、ｃおよびｄを比較すると、ｃおよびｄではｂよりも弱いシグナルが検出され、かつｃではｄよりも弱いシグナルが検出された。以上より、カルシウムチャネル阻害剤で処理すると、ウイルスヘマグルチニンタンパク質とカルシウムチャネルタンパク質との相互作用が抑制されることが明らかになった。すなわち、カルシウムチャネル阻害剤は、ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制できることが明らかになった。
　これらの結果から、カルシウムチャネル阻害剤は、ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制することにより、カルシウムチャネルからのカルシウムイオンの流入、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇およびエンドサイトーシスを抑制して、ウイルス感染を抑制できることが示唆された。
＜実施例８＞カルシウムチャネル阻害剤を投与したマウスにおけるウイルス核タンパク質のｍＲＮＡ発現量の検討
　カルシウムチャネル阻害剤を投与したマウスにＰＲ８ウイルスを接種した後、肺を採取して定量ＰＣＲを行い、ウイルス核タンパク質のｍＲＮＡ発現量を調べた。マウスの取扱は、北海道大学動物実験に関する規程に従い行った。また、マウスの飼育は陰圧のインキュベーター内で行い、飼育温度は２３℃とし、飼育期間中、水および餌は自由摂取させた。
（１）カルシウムチャネル阻害剤の投与
　６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎｊｃｌマウス（日本クレア社）２４頭を６頭ずつ４群に分け、コントロール群、アムロジピン群、ベラパミル群およびジルチアゼム群とした。コントロール群にはＰＢＳを、アムロジピン群にはカルシウムチャネル阻害剤であるアムロジピンを溶解したＰＢＳを、ベラパミル群にはカルシウムチャネル阻害剤であるベラパミルを溶解したＰＢＳを、ジルチアゼム群にはカルシウムチャネル阻害剤であるジルチアゼムを溶解したＰＢＳを、それぞれ１００μＬずつ、１日１回、経口ゾンデを用いて投与して、４日間飼育した。アムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムの１日あたりの投与量は下記のとおりとした。
コントロール群　；（ＰＢＳのみ）
アムロジピン群　；アムロジピン
　　　　　　　　　マウス個体の体重（ｋｇ）×　２．５ｍｇ量
ベラパミル群　　；ベラパミル
　　　　　　　　　マウス個体の体重（ｋｇ）×　　１０ｍｇ量
ジルチアゼム群　；ジルチアゼム
　　　　　　　　　マウス個体の体重（ｋｇ）×　　１０ｍｇ量
（２）マウスへのウイルス接種およびウイルス接種後の飼育
　実施例１（２）のＰＲ８ウイルスを１×１０３ＰＦＵ／５０μＬとなるようＰＢＳに加えることによりウイルス溶液を調製した。本実施例（１）の各群について、飼育４日目のカルシウム阻害剤投与後に、イソフルランを吸入させて麻酔した後、ウイルス溶液を１個体につき５０μＬずつ経鼻投与した。その後、１日間飼育した。
（３）ＲＮＡの抽出
　本実施例（２）の各群のマウスを頚椎脱臼により安楽死させた後、肺を採取した。採取した肺全量を、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に浸漬し、直径１ｍｍのジルコニアビーズ（ＺＢ－１０，ＴＯＭＹ社）５００個および直径５．５ｍｍのステンレスビーズ（ＳＵＢ－５５，ＴＯＭＹ社）１個を加えて、破砕装置Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ－１００Ｒ（ＴＯＭＹ社）を用いて、４℃で３０秒間、２回の破砕処理を行い、破砕液を得た。破砕液にクロロホルム２００μＬを加えて転倒混和した後、４℃、１２，０００×ｇの条件下で、１０分間遠心分離を行った。上清を回収して等量のイソプロパノールを加え、室温で１０分間静置した。続いて、４℃、１２，０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離を行い、上清を除去して沈殿物を８０％（ｖ／ｖ）エタノールでリンスした。沈殿物を風乾した後、滅菌水に溶解して、これをＲＮＡ溶液とした。ＲＮＡ溶液から適量を分取し、分光光度計を用いて波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、濃度を測定した。測定結果に基づき、滅菌水を用いて希釈することによりＲＮＡ溶液の濃度を１μｇ／μＬに調整した。
（４）ウイルス核タンパク質のｍＲＮＡ発現量の定量
［４－１］ｃＤＮＡの作製
　本実施例（３）のＲＮＡ溶液を鋳型ＲＮＡとして、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ －α－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作製した。逆転写反応溶液組成および逆転写反応条件は下記のとおりである。なお、逆転写反応を行う前に、鋳型ＲＮＡについて、６５℃で５分間熱処理を行った。
　逆転写反応溶液組成；鋳型ＲＮＡ　５μＬ（５μｇ）、Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ　１μＬ（２５ｐｍｏｌ）、５×ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ　２μＬ、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ　１μＬ、脱イオン蒸留水　適量（反応液総量を２０μＬとする量）
　逆転写反応条件；３０℃で１０分、４２℃で６０分、９９℃で５分の各反応を１サイクル行った。
［４－２］定量ＰＣＲ
　本実施例（４）［４－１］のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、ＰＲ８ウイルス核タンパク質（ＰＲ８ウイルスＮＰ）およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）について、Ｍｘ３０００ｐ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ （ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、付属の使用書に従い、定量ＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨのサイクル数を基準として、ＰＲ８ウイルス核タンパク質のｍＲＮＡ相対発現量を測定した。定量ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
　定量ＰＣＲに用いたプライマー
　ＰＲ８ウイルスＮＰ（フォワードプライマー）；５’－ＧＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＡＣＧＡＴ－３’（配列番号６）
　ＰＲ８ウイルスＮＰ（リバースプライマー）　；５’－ＡＧＡＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴ－３’（配列番号７）
　ＧＡＰＤＨ（フォワードプライマー）；５’－ ＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣ－３’（配列番号８）
　ＧＡＰＤＨ（リバースプライマー）　；５’－ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号９）
　ＰＣＲ反応溶液組成；ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ　６．２５μＬ、フォワードプライマー　０．２５μＬ、リバースプライマー　０．２５μＬ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ＩＩ　０．２５μＬ、脱イオン蒸留水　４．５μＬ、鋳型ＤＮＡ　１μＬ
　ＰＣＲ反応条件；９５℃で１０秒の反応の後、９５℃で５秒、６０℃で３０秒の各反応を４０サイクル行った。
　測定したｍＲＮＡ相対発現量について、各群で平均値および標準偏差を算出した。また、アムロジピン群、ベラパミル群およびジルチアゼム群における結果について、コントロール群における結果との間で有意差検定を行った。その結果を図９に示す。
　図９に示すように、ＰＲ８ウイルス核タンパク質のｍＲＮＡ相対発現量の平均値は、コントロール群では１倍であり、アムロジピン群では約０．７５倍、ベラパミル群では約０．４倍、ジルチアゼム群では約０．４５倍であった。また、コントロール群との比較において、ベラパミル群およびジルチアゼム群は有意差があった。
　これらの結果から、カルシウムチャネル阻害剤を投与した場合は、それを投与しない場合と比較して、ＰＲ８ウイルスを接種したマウスの肺におけるＰＲ８ウイルス核タンパク質のｍＲＮＡ発現量が減少することが明らかになった。すなわち、カルシウムチャネル阻害剤を投与することにより、ウイルス感染を抑制できることが明らかになった。

Claims (8)

  1. 　細胞内へのウイルスの取り込みを抑制するウイルス感染抑制および／または感染症治療剤であって、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を有効成分とするウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
  2. 　細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質がウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制する物質である、請求項１に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
  3. 　ウイルスとカルシウムチャネルとの相互作用を抑制する物質がアムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムからなる群から選択される１または２以上の物質である、請求項２に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
  4. 　カルシウムイオンとキレートを形成する物質がグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）および／またはＢＡＰＴＡ－ＡＭである、請求項１から請求項３のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
  5. 　ウイルスがエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
  6. 　エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスからなる群から選択される１または２以上のエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、請求項５に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
  7. 　ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１から請求項６のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
  8. 　ウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法であって、細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質および／またはカルシウムイオンとキレートを形成する物質を用いて細胞内へのウイルスの取り込みを抑制する工程を有する、前記方法。
PCT/JP2011/058804 2010-04-09 2011-04-07 ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法 Ceased WO2011126071A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010090745A JP2013139391A (ja) 2010-04-09 2010-04-09 ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤
JP2010-090745 2010-04-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011126071A1 true WO2011126071A1 (ja) 2011-10-13

Family

ID=44763006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/058804 Ceased WO2011126071A1 (ja) 2010-04-09 2011-04-07 ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2013139391A (ja)
WO (1) WO2011126071A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016146836A2 (fr) 2015-03-19 2016-09-22 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nouvelles compositions antivirales pour le traitement de la grippe
WO2019224489A1 (fr) 2018-05-23 2019-11-28 Universite Claude Bernard Lyon 1 Diltiazem pour son utilisation dans le traitement des infections microbiennes
JP2022082095A (ja) * 2020-11-20 2022-06-01 学校法人日本医科大学 ネコ伝染性腹膜炎の治療薬
US12594280B2 (en) 2015-03-19 2026-04-07 Universite Claude Bernard Lyon 1 Antiviral compositions for treating the flu

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003512325A (ja) * 1999-10-19 2003-04-02 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 感冒およびインフルエンザ様症状の予防並びに治療用組成物、並びにそれらの使用方法
US20060264510A1 (en) * 2000-05-19 2006-11-23 Bio-Defense Nutritionals Antiviral methods and compositions
JP2007533667A (ja) * 2004-04-22 2007-11-22 ハワード ジェイ． スミス アンド アソシエイツ ピーティーワイ エルティーディー 肝臓疾患の支持療法
JP2008538354A (ja) * 2005-04-08 2008-10-23 キメリクス，インコーポレイテッド ウイルス感染症およびその他の内科疾患を治療するための化合物、組成物および方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003512325A (ja) * 1999-10-19 2003-04-02 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 感冒およびインフルエンザ様症状の予防並びに治療用組成物、並びにそれらの使用方法
US20060264510A1 (en) * 2000-05-19 2006-11-23 Bio-Defense Nutritionals Antiviral methods and compositions
JP2007533667A (ja) * 2004-04-22 2007-11-22 ハワード ジェイ． スミス アンド アソシエイツ ピーティーワイ エルティーディー 肝臓疾患の支持療法
JP2008538354A (ja) * 2005-04-08 2008-10-23 キメリクス，インコーポレイテッド ウイルス感染症およびその他の内科疾患を治療するための化合物、組成物および方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLOAD, P.A. ET AL.: "The inhibition of the RNA polymerase activity of influenza virus A by pyrophosphate analogues", NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 11, no. 16, 1983, pages 5621 - 5628 *
NUGENT, K.M. ET AL.: "Verapamil inhibits influenza A virus replication", ARCHIVES OF VIROLOGY, vol. 81, 1984, pages 163 - 170 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016146836A2 (fr) 2015-03-19 2016-09-22 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nouvelles compositions antivirales pour le traitement de la grippe
FR3033701A1 (fr) * 2015-03-19 2016-09-23 Univ Claude Bernard Lyon Nouvelles compositions antivirales pour le traitement de la grippe
WO2016146836A3 (fr) * 2015-03-19 2016-11-03 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nouvelles compositions antivirales pour le traitement de la grippe
CN107743402A (zh) * 2015-03-19 2018-02-27 里昂第大学 用于治疗流感的新型抗病毒组合物
JP2018508587A (ja) * 2015-03-19 2018-03-29 ウニベルシテ クロード ベルナール リヨン １ インフルエンザを治療するための新規抗ウイルス性組成物
US12594280B2 (en) 2015-03-19 2026-04-07 Universite Claude Bernard Lyon 1 Antiviral compositions for treating the flu
US11351180B2 (en) 2015-03-19 2022-06-07 Universite Claude Bernard Lyon 1 Antiviral compositions for treating the flu
CN113876781A (zh) * 2015-03-19 2022-01-04 里昂第一大学 用于治疗流感的新型抗病毒组合物
JP2021525250A (ja) * 2018-05-23 2021-09-24 ウニベルシテ クロード ベルナール リヨン １ 微生物感染の治療における使用のためのジルチアゼム
CN112789046A (zh) * 2018-05-23 2021-05-11 里昂第一大学 地尔硫卓用于治疗微生物感染
FR3081325A1 (fr) * 2018-05-23 2019-11-29 Universite Claude Bernard Lyon 1 Diltiazem pour son utilisation dans le traitement des infections microbiennes
JP7412353B2 (ja) 2018-05-23 2024-01-12 ウニベルシテ クロード ベルナール リヨン １ 微生物感染の治療における使用のためのジルチアゼム
CN112789046B (zh) * 2018-05-23 2024-02-20 里昂第一大学 地尔硫卓用于治疗微生物感染
US12285433B2 (en) 2018-05-23 2025-04-29 Universite Claude Bernard Lyon 1 Diltiazem for use in the treatment of microbial infections
WO2019224489A1 (fr) 2018-05-23 2019-11-28 Universite Claude Bernard Lyon 1 Diltiazem pour son utilisation dans le traitement des infections microbiennes
JP2022082095A (ja) * 2020-11-20 2022-06-01 学校法人日本医科大学 ネコ伝染性腹膜炎の治療薬
JP7688886B2 (ja) 2020-11-20 2025-06-05 学校法人日本医科大学 ネコ伝染性腹膜炎の治療薬

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013139391A (ja) 2013-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110325187B (zh) N-氨基甲酰亚胺基-5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-2-萘甲酰胺在制备治疗流感的药物中的用途
Kohio et al. Glycolytic control of vacuolar-type ATPase activity: a mechanism to regulate influenza viral infection
Vanderlinden et al. Novel inhibitors of influenza virus fusion: structure-activity relationship and interaction with the viral hemagglutinin
CN102791734B (zh) 源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体
Chan et al. Hemagglutinin of influenza A virus binds specifically to cell surface nucleolin and plays a role in virus internalization
Conzelmann et al. An enzyme-based immunodetection assay to quantify SARS-CoV-2 infection
CN104011077B (zh) 从人b细胞产生的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子
CN107002086B (zh) 流感a病毒变体
US10801077B2 (en) Influenza A virus variants
Hussein et al. Identification of entry inhibitors with 4-aminopiperidine scaffold targeting group 1 influenza A virus
US20140121237A1 (en) Methods for Inhibiting Virus Replication
WO2011126071A1 (ja) ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法
US8894997B2 (en) Monoclonal antibodies to influenza H1N1 virus uses thereof
KR20210146992A (ko) 인플루엔자 바이러스 전염을 예방하기 위한 화합물 및 방법
CN114224896A (zh) 病毒感染症的预防和早期治疗用组合物
Jeon et al. Inhibition of KIF20A suppresses the replication of influenza A virus by inhibiting viral entry
Kozawa et al. The crucial role of intercellular calcium wave propagation triggered by influenza A virus in promoting infection
Si et al. Entry properties and entry inhibitors of a human H7N9 influenza virus
Carta et al. Prostaglandin A1 inhibits avian influenza virus replication at a postentry level: Effect on virus protein synthesis and NF-κB activity
WO2017162704A1 (en) Inhibitors of fpr2, compositions and uses thereof for modulating influenza virus replication
Hao et al. Lysosome-targeting live attenuated influenza vaccines elicit robust and broad immunity in mice
US20200101086A1 (en) Use of ouabain antagonists to inhibit viral infection
Zhou et al. TNK2/ACK1 Strengthen Influenza A Virus Infection by Blocking Viral Matrix 2 Protein (M2) into Lysosome to Degradation
KR20130126243A (ko) Ｐａｋ 억제제를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물
US9783482B2 (en) Antiviral compositions directed against the influenza virus nucleoprotein

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11765971

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11765971

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP