KR20130126243A - Ｐａｋ 억제제를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PAK (p21-activated kinase)의 인플루엔자 바이러스 증식과 관련된 기능에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 PAK 억제제를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, PAK의 활성화가 인플루엔자 바이러스의 복제를 증가시키는데 영향을 미치며, 따라서 PAK의 발현 및 활성을 억제하는 경우, 인플루엔자 바이러스의 증식이 감소된다는 사실을 확인함으로써 PAK의 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염을 효과적으로 차단하여 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있다.

Description

ＰＡＫ 억제제를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition containing ＰＡＫ inhibitor for prevention and treatment of influenza viral diseases}

본 발명은 인플루엔자 바이러스 증식과 관련된 PAK (p21-activated kinase)의 신규 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 PAK 억제제를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물, 스크리닝 방법 및 IAV 감염의 진단방법에 관한 것이다.

A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus (IAV))는 오르쏘믹소바이러스 (Orthomyxoviridae) 과에 속하는 피막 바이러스(enveloped viruse)로서, 11개의 기능성 단백질을 암호화하는 8개의 단쇄(single-stranded) 바이러스 RNA 유전체 (genome)를 갖고 있다(R.A. Lamb, R.M. Krug, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, in: D.M. Knipe, P.M. Howley (Eds.), Fields Virology, Lippincott, Williams & Wilkins, 2001, pp. 1487-1531). IAV 감염은 사람을 포함한 여러 동물에서 급성 및 전염성 호흡기 질환을 일으킨다. 인플루엔자 바이러스 감염에 따라 이들의 증식을 억제할 수 있는 다양한 신호전달 경로들이 활성화된다(S. Ludwig, et al., Influenza-virus-induced signaling cascades: targets for antiviral therapy, Trends Mol Med. 9 (2003) 46-52). 하지만, IAVs는, 세포 mRNA가 아닌 바이러스 mRNA를 번역하여 결과적으로 RNA 합성기구로 전환시키는 방식으로, 숙주 세포의 신호전달 기구를 이용하는 기작들을 발달시켜 왔다(M. Gale Jr., et al., Translational control of viral gene expression in eukaryotes, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 (2000) 239-280). 위 경로에는 MAPK (mitogen-activated protein kinase)의 Raf/MEK/ERK 캐스케이드(cascade)가 포함된다(H. Marjuki, et al., Membrane accumulation of influenza A virus hemagglutinin triggers nuclear export of the viral genome via protein kinase C alpha-mediated activation of ERK signaling, J. Biol. Chem. 281 (2006) 16707-16715, S. Pleschka, et al., Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the Raf/MEK/ERK signalling cascade, Nat. Cell Biol. 3 (2001) 301-305).

한편, PAKs (p21-activated kinases)는 다양한 세포내 신호전달에 있어서 중요한 역할을 수행하는 진화적으로 보존된 세린/트레오닌 키나아제 (serine/threonine kinases) 패밀리에 속한다(G.M. Bokoch, Biology of the p21-activated kinases, Annu. Rev. Biochem. 72 (2003) 743-781). PAK 패밀리의 적어도 6개의 멤버들이 그들의 특징 및 구조에 의하여 두 개의 서브패밀리로 분류되었다(그룹 I: PAK1, 2, 및 3 및 그룹 II: PAK4, 5, 및 6)(Z.M. Jaffer, J. Chernoff, P21-activated kinases: three more join the Pak, Int. J. Biochem. Cell Biol. 34 (2002) 713-717). 일반적으로 PAKs은 GTP-결합 Cdc42 또는 Rac이 아미노-말단 p21-결합 도메인에 결합함으로써 활성화된다. 하지만, PAK 활성화는 다양한 막 응집(recruitment), 카스파아제 프로테아제(caspase proteases), 및 직접적 단백질 결합 및/또는 인산화와 같은 다양한 GTPase-독립적 생리적 신호 및 기작들에 의해 자극받을 수도 있다(G.M. Bokoch, Biology of the p21-activated kinases, Annu. Rev. Biochem. 72 (2003) 743-781).

그룹 I PAKs의 조절 및 세포 단백질 기능에 대해서는 잘 알려져 있는 편이다. 그룹 I PAKs에 의해 조절되는 대부분의 세포 기능들에는 세포 증식, 생존, 및 운동이 포함되며, 바이러스-숙주 관계에 다양한 영향을 미친다. 실제로, 여러 바이러스들이 바이러스 복제를 증가시키기 위하여 PAK 경로를 이용한다. 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 타입 2의 US3 유전자는 복제에 필수적인 숙주세포의 형태적 변화를 매개하는 PAK 상동체(homologue)를 암호화한다(T. Murata, et al., Expression of herpes simplex virus type 2 US3 affects the Cdc42/Rac pathway and attenuates c-Jun N-terminal kinase activation, Genes Cells 5 (2000) 1017-1027). HIV-1 (human immunodeficiency virus-1)의 accessory negative factor 단백질은 다중-단백질 신호전달 복합체를 형성하여, PAK을 활성화시키고 바이러스 감염성을 증가시키는 항세포사멸 기능과 관련된 세포 키나아제의 활성을 변화시킨다(M.F. Nunn, J.W. Marsh, Human immunodeficiency virus type 1 Nef associates with a member of the p21-activated kinase family, J. Virol. 70 (1996) 6157-6161, D. Wolf, et al., HIV-1 Nef associated PAK and PI3-kinases stimulate Akt-independent Bad-phosphorylation to induce anti-apoptotic signals, Nat. Med. 7 (2001) 1217-1224). 한편, 간암에서 PAK1은 C형 간염바이러스의 복제를 음성적으로 조절한다(H. Ishida, et al.. Lemon, P21-activated kinase 1 is activated through the mammalian target of rapamycin/p70 S6 kinase pathway and regulates the replication of hepatitis C virus in human hepatoma cells, J. Biol. Chem. 282(2007) 11836-11848.).

그 외에도 여러 바이러스들에서 PAK의 기능이 보고되고 있으나, 아직 인플루엔자 바이러스 감염 동안에 PAK1 활성의 잠재적인 역할에 대해서는 구체적으로 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 증식이 PAK1 인산화의 자극에 대응되며, 감염된 사람 폐 세포에서 PAK1 수준의 변화는 바이러스 증식에 영향을 미친다는 사실을 확인하였고, 나아가 인플루엔자 바이러스 복제 조절에 있어서 PAK1 자극과 Raf/MEK/ERK 경로 사이의 잠재적인 연관을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PAK (p21-activated kinase) 억제제를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 PAK를 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PAK를 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 PAK 억제제를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 PAK는 PAK1인 것이 바람직하다.

상기 PAK 억제제의 형태는 제한되지 않으며, 예를 들어 펩티드, 단백질, 핵산, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PAK1 억제제는 서열번호 1 및 2의 RNA들로 이루어진 siRNA 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 RNA들로 이루어진 siRNA 세트일 수 있으며, 바람직하게는 상기 두 세트가 함께 이중(duplex) siRNA 세트로 사용될 수 있다. 또한 그에 상응하는 shRNA 세트도 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PAK 억제제는 Raf/MEK/ERK 신호전달 경로를 조절함으로써 인플루엔자 바이러스의 감염을 억제하는 기작을 갖는 것일 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 감기, 독감, 인후염, 기관지염, 폐렴 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은, (a) A형 인플루엔자 바이러스에 감염된 시료를 준비하는 단계; (b) 상기 시료로부터 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; (c) 상기 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (d) 상기 후보물질을 처리한 시료로부터 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 (b)단계 및 (d)단계에서 측정한 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 비교하여 PAK1에 대한 후보물질의 영향을 판단하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b)단계 및 (d)단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 예측 및 진단방법은, (a) 생물학적 시료에 존재하는 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명에 의해 PAK 경로의 활성화가 인플루엔자 바이러스 복제에 영향을 미치며, PAK 불활성화에 의해 인플루엔자 바이러스 증식이 감소한다는 사실이 확인되었으므로, 본 발명에 따른 PAK 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염을 효과적으로 차단하여 그에 의한 질병을 예방 및 치료할 수 있다.

도 1은 A형 인플루엔자 바이러스 감염이 바이러스 복제에 관련된 PAK 인산화를 활성화시킨다는 것을 보여준다. (A) 사람 폐 상피 (A549) 세포에서 인플루엔자 WSN/33의 점진적인 복제. A549 세포들은 0.1 MOI (multiplicity of infection)로 감염되었다. MDCK 세포에서 감염 후 6, 12, 24, 36, 및 48-h (hpi)째 바이러스 적정을 수행하였다. (B) PAK1 활성화의 웨스턴 블랏 분석. 감염된 세포들을 유사한 시간 간격으로 배양하고, p-PAK1(Thr-423) 및 총 PAK1 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (C) 바이러스 투여량이 증가할수록 PAK 활성의 자극이 증가하였다. 세포들은 0.1, 1, 및 10 MOI의 WSN/33 바이러스로 감염되었다. PAK1 인산화는 24 hpi에서 준비한 용해물에서 조사하였다. (D) PAK1 과발현이 인플루엔자 바이러스 복제에 미치는 영향. 플라스미드 작제물(constructs) (PAK1-T423E, PAK1-K299R, 또는 빈 벡터)을 A549 세포에 트랜스펙션시키고, 24-h 후에감염시켰다(WSN/33; MOI, 0.1). 총 PAK1 또는 β-액틴 항체로 웨스턴 블랏을 수행하였다. (E) MDCK 세포에서 외래적으로 도입된 바이러스 성장을 적정을 통해 모니터하였다. 모든 바이러스 적정은 적어도 세 번의 독립적인 실험의 평균으로 나타냈으며, 표준편차를 표시하였다. [*p < 0.05, PAK1-T423E-도입(tansfected) 세포에서 수집한 상층액에서의 PAK1-K299R- 또는 빈 벡터-도입 시료에 대한 상대적인 바이러스 적정(Student’s t-test)].
도 2는 감염된 A549 세포에서 PAK1의 소멸에 따라 인플루엔자 바이러스 적정농도가 감소함을 보여준다. (A) PAK1-특이적 siRNAs (siRNA_PAK1a 및 siRNA_PAK1b) 또는 음성 대조군 siRNA (siRNA_Con)를 처리한 A549 세포에서 PAK1의 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다. 베타-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) 패널 (a) 단백질 밴드의 농도계 분석(densitometric analysis)을 통해 siRNA-처리 세포들에서의 PAK1 강도를 대조군(100%로 설정)에 대해 상대적으로 나타냈다. 단백질 밴드는 NIH Image J ver. 33.17 (*p < 0.05, based on a one-sample Student’s t-test)를 사용하여 정량하였다. 바(bar)는 적어도 세 번의 독립된 실험에 근거한 평균값의 표준편차를 나타낸다. (C) PAK1-억제 세포들에서 인플루엔자 WSN/33 바이러스(MOI = 2)의 성장 곡선이다. (D) PAK1-억제 A549 세포들의 생존율 측정. 세포들을 패널 (a)에서와 같이 처리하고, 트랜스펙션 24 및 48-h 후에 세포 생존율을 CCK-8 어세이로 측정하였다.
도 3은 PAK1이 인플루엔자 바이러스 증식의 Raf/MEK/ERK-의존적 조절에 기여한다는 사실을 보여준다. (A) A549 세포들을 WSN/33 바이러스(MOI = 2)로 감염시켰다. PAK1 (Thr-423) 및 ERK 1/2 (Thr-202/Tyr-204) 인산화는 정해진 시간 지점에서 준비한 세포 용해물의 웨스턴 블랏팅으로 결정하였다. 24-h에서 mock-감염 세포들을 준비하였다. (B) A549 세포에서 Myc-표지 바이러스 HA를 과발현시켰다. 단백질 활성(p-ERK 1/2 및 p-PAK1)은 트랜스펙션 12 및 24-h 후에 측정하였다. (C) 10 μM PAK18, PAK18 (R192A), U0126, 또는 0.4% (v/v) DMSO 존재 하에 바이러스 감염 세포에서 ERK 1/2 활성을 모니터하고, 12 및 24 hpi에서 준비한 용해물을 웨스턴 블랏팅하였다(p-ERK 1/2 또는 총 ERK 1/2). 단백질 밴드의 농도분석(아래 패널)은 NIH Image J ver. 33.17을 이용하여 정량하였다. (D) PAK1- 및 MEK/ERK-억제 세포들의 바이러스 성장 곡선을 MDCK 세포에서 적정하여 측정하였다.

PAKs은 광범위한 세포 신호전달 경로를 조절하는 작용을 하는데, 본 발명에서는 특히 PAK1 활성이 인플루엔자 바이러스 복제에 기여한다는 사실을 최초로 확인하였으며, 구조적(constitutively) 활성 PAK1 (PAK1-T423E)을 도입하거나 내생적(endogenous) PAK1을 siRNA에 의해 발현 억제시킨 결과, 인플루엔자 바이러스 증식을 억제한다는 사실을 확인하였다.

한편, PAK 활성은 GTPases의 Rho family, phosphatidylinositol 3-kinase와 같은 다양한 신호들에 의해 조절된다는 사실이 알려져 있지만 아직 바이러스 복제가 영향 받는 특정 단계나 단백질 활성의 방식은 밝혀지지 못한 상태이다.

이에 본 발명에서는 PAK, 특히 PAK1이 바이러스 복제에 미치는 영향을 조사하였는데, 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 인플루엔자 바이러스 WSN/33(H1N1)으로 감염시킨 A549 세포주를 대상으로 PAK1의 활성을 인산화 정도로 측정한 결과, 바이러스 감염 후 시간에 따라 PAK1의 인산화는 증가되는 것으로 나타났으며(도 1 참조), 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 PAK1의 활성이 인플루엔자 바이러스의 증식을 촉진하는 작용을 한다는 사실을 알 수 있었고, 나아가 PAK1의 활성을 억제한다면 인플루엔자 바이러스의 활성, 즉, 증식을 억제를 통해 감염을 예방할 수도 있을 것으로 추측할 수 있었다.

따라서 본 발명의 다른 일실시예에서는 PAK1에 특이적인 siRNA를 사용하여 PAK1의 발현을 저해할 경우, 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는지를 조사한 결과, PAK1에 특이적인 siRNA를 처리한 군이 PAK1의 유전자 발현을 저해하지 않은 군에 비해 인플루엔자 바이러스의 증식의 현저하게 억제되는 것으로 나타났다(도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 다른 일실시예를 통해서 PAK1과 MAPK 경로의 Raf/MEK/ERK 신호전달 캐스케이드(cascade) 사이의 잠재적인 연관성을 규명하였는데, 기본적인 세포내 프로세스들을 수행하기 위한 위 단백질들의 기능적 연관관계는 이미 잘 알려져 있다(A. Beeser, et al.(2005), E. R. Park, et al.(2007)). 하지만, IAV 감염 동안의 중요한 연관은 아직 잘 밝혀져 있지 않다는 점에 착안하여, 본 발명자들은, 배지 및 생체 내 실험에서 PAKs 1-3의 활성을 선택적으로 억제하는데 사용되는 PAK 선택적 억제 펩티드인 PAK18을 처리한 경우, 감염 바이러스의 적정농도(titer)를 감소시킬 뿐만 아니라 ERK 1/2 인산화를 상당히 억제한다는 사실을 확인하였다(도 3 참조).

또한, 일반적으로 MAPK 경로는 단백질 키나아제(kinase) C를 통해 IAVs의 효과적인 복제에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 PAK1 및 ERK 1/2 활성간의 연관이 HA 바이러스 단백질의 막 축적과 단독으로 관련되어 있는 것으로 보이지는 않으며, 이는 활성의 독립적인 모드를 나타낸다.

따라서 도 3의 결과를 통해 본 발명자들은 PAK 억제제가 Raf/MEK/ERK의 신호전달 경로를 조절함으로써 인플루엔자 바이러스의 증식 억제를 통해 바이러스 감염을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 PAK 억제제를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 질환의 예방, 치료용 조성물 및 치료 보조물질을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 상기 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 포함하는 의미로 사용되며, 상기 "치료"란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 포함하는 의미로 사용된다.

또한, 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스, C형 인플루엔자 바이러스가 될 수 있으나, 바람직하게는 A형 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 H1N1 바이러스일 수 있다.

또한, 상기 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발병할 수 있는 질병으로는 이에 제한되지는 않으나, 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴, 조류독감, 돼지독감, 염소독감 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물은 약학적 조성물일 수 있으며, 본 발명의 약학적 조성물은 PAK1에 특이적이거나 또는 발현 및 활성에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA, 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 단백질, 화합물 또는 천연추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 PAK1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 PAK1 mRNA에 상보적이고 PAK1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, PAK1 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 "siRNA”라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다.

또한, siRNA 말단 구조는 PAK1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 일실시예에서는 PAK1의 유전자 발현을 억제하기 위한 siRNA로서, 서열번호 1 및 2의 RNA 서열로 이루어진 siRNA 세트; 및 서열번호 3 및 4의 RNA 서열로 이루어진 siRNA 세트를 사용하였다.

siRNA의 세포내로의 도입은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 상기 PAK1 억제제로서 PAK1의 활성을 억제할 수 있는 PAK1에 특이적인 항체를 사용할 수도 있는데, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 “투여”란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기 “유효량”이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 인플루엔자 바이러스 감염의 발병 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료방법을 제공한다. 바람직하게 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴일 수 있다. 상기 "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 사람을 포함한 모든 동물을 의미한다.

또한, 본 발명은, (a) A형 인플루엔자 바이러스에 감염된 시료를 준비하는 단계; (b) 상기 시료로부터 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; (c) 상기 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (d) 상기 후보물질을 처리한 시료로부터 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 (b)단계 및 (d)단계에서 측정한 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 비교하여 PAK1에 대한 후보물질의 영향을 판단하는 단계를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

상기 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기“후보물질”은 PAK1 유전자의 발현양, PAK1 단백질의 양 또는 PAK1 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), 펩티드, 단백질 및 천연 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 후보물질이 처리된 세포 등의 시료에서 PAK1 유전자의 발현양, PAK1 단백질의 양 또는 PAK1 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, PAK1 유전자의 발현양, PAK1 단백질의 양 또는 PAK1 단백질의 활성이 억제되는 것이 관찰되면 상기 후보물질은 인플루엔자 감염 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 PAK1 유전자의 발현양, PAK1 단백질의 양 또는 PAK1 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험재료 및 방법

<1-1> 세포 및 바이러스

사람 폐 상피(A549) 세포를 항생제 및 10% 소 태아 혈청(FBS, GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA)이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 위 배양은 5% 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 37℃로 이루어졌다.

MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포는 5% FBS, 2 mM L-글루타민, 및 1.5 g/l 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 0.1 mM 비-필수 아미노산 및 1.0 mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate)을 함유한 Earle’s BSS가 포함된 EMEM 배지(Eagle’s minimal essential medium) (HyClone Lab., Inc., Logan, UT, USA)에서 배양하였다.

인플루엔자 H1N1 A/WSN/1933 (WSN/33) 바이러스는 37℃의 11일된 유정란 속에서 증식시켰다. 세포들을 1× PBS (phosphate-buffered saline)로 세척한 뒤 정해진 MOI (multiplicity of infection)로 감염시켰다. 기 설정된 시간 지점에서 상층액 및 세포들을 수거한 후, log₁₀ TCID₅₀/0.1 ml로 표시되는 바이러스 성장을 모니터하기 위해 MDCK 세포에서 TCID₅₀ (50% tissue culture infectious doses)을 계산함으로써 바이러스를 적정(endpoint virus titration)하였다(L. J. Reed, H. Muench, A simple method of estimating fifty percent endpoints, Am. J. Hyg. 27 (1938) 493-497).

<1-2> 항체 및 억제제

p-PAK1 (Thr-423), p-ERK 1/2 (Thr-202/Tyr-204), 및 총(total) ERK 1/2 항체들을 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 총 PAK1 항혈청은 대장균으로부터 분리하여 정제한 GST-PAK1으로 마우스를 면역시켜 만들었다. MEK/ERK 억제제 U0126, PAK18 억제제, 및 불활성 펩티드(PAK18-R192A)는 CalBiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. 세포에 PAK18 펩티드 및 U0126을 10 μM의 농도로 처리하고, DMSO를 0.4% (v/v)의 농도로 처리하였다. 화합물들은 감염 1시간 후(1 hpi)에 세포에 첨가하였다.

<1-3> 플라스미드 트랜스펙션 ( transfections ) 및 RNA 간섭( interference )

공지의 방법에 따라 PAK1 작제물(constructs) (T423E 및 K299R)을 myc 표지된 pCMV6 벡터에 클로닝하였다(E.Y. Shin, et al., Phosphorylation of p85 beta PIX, a Rac/Cdc42-specific guanine nucleotide exchange factor, via the Ras/ERK/PAK2 pathway is required for basic fibroblast growth factor-induced neurite outgrowth, J. Biol. Chem. 277 (2002) 44417-44430). A549 세포들을 6-웰 플레이트에 웰(well)당 3.5×10⁵ 세포의 농도로 접종하고, TransIT-LT1 (Mirus, Madison, WI, USA)을 생산자의 프로토콜에 따라 사용하여 각각의 플라스미드 3.5 ㎍으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 효율을 관찰하기 위하여, 세포들을 pCMV-β-gal (Clontech, Mountain View, CA, USA)과 함께 트랜스펙션시켰다. siRNA (small interfering RNA) 트랜스펙션은 Oligofectamine (Invitrogen)을 사용하여 생산자의 프로토콜에 따라 100 nM의 최종농도에서 수행하였다. PAK1을 표적으로 하는 이중(duplex) siRNAs [siRNA-PAK1a: 5'-GGAGAAAUUACGAAGCAUAUU-3'(서열번호 1) 및 5'-UAUGCUUCGUAAUUUCUCCUU-3'(서열번호 2); 및 siRNA-PAK1b: 5'-GGAGAAAUUACGAAGCAUAUU(AA)-3' (서열번호 3) 및 5'-AAUAUGCUUCGUAAUUUCUCC(UU)-3'(서열번호 4)] 및 확인된 음성 대조군 siRNA (5'-CCUACGCCAAUUUCGU-3')(서열번호 5)를 바이오니아사(Bioneer Inc.) (대전, 대한민국)로부터 구입하였다. 트랜스펙션 24시간 후에 처리 세포들을 WSN/33 바이러스로 감염시켰다.

<1-4> 웨스턴 블랏팅( Western blotting )

총 세포 단백질을 용해버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0.5% Nonidet P-40; 및 PBS 내 1×complete protease inhibitor cocktail)로 추출하였다. 용해물을 수거하고 22-gauge 바늘을 가진 1ml 주사기로 여러 번 흘려보내 균질화한 후, 12,000g로 5분간 원심분리하였다. 상층액의 총 단백질 함량을 브래드포드 어세이(Bradford assay)로 측정하였다(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 총 단백질(40㎍)을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)에 옮겼다. 0.1% Tween20 및 5% 스킴 밀크(skim milk)를 함유한 TBS (Tris-buffered saline) (0.1M Tris[pH7.6], 0.9% NaCl)로 차단(blocking)한 뒤, 대응되는 1차 항체로 막을 검출(probe)하고, 추가로 HRP (horseradish peroxidase) 항-토끼 IgG 또는 HRP-연결 항-마우스 IgG (Sigma, St. Louis,MO, USA)와 결합된 2차 항체와 함께 배양하였다. 단백질들은 ECL 웨스턴 블랏 검출 시약(Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용하여 시각화하고, Fujifilm LAS-3000 Imaging System (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)으로 관찰하였다.

< 실시예 2>

PAK1 활성화와 인플루엔자 바이러스 복제의 관련성

본 발명자들은 PAK1의 일반적인 역할을 알아보기 위하여, 바이러스 감염 시기 전체에 걸쳐 PAK1의 활성과 그것이 바이러스 복제에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 0.1 MOI에서 0.1% 혈청 존재 하에 A549 세포를 인플루엔자 WSN/33 (H1N1) 바이러스로 감염시켰다. 423 위치의 트레오닌(threonine) (T423)의 인산화를 통해 인식되는 PAK1 활성화를 조사하기 위하여 6, 12, 24, 36, 및 48 hpi (h post-infection)에서 세포 용해물을 준비하였다. 지정된 시간 간격에서 MDCK 세포의 감염 샘플을 적정한 결과 바이러스 복제가 점진적으로 증가함을 알 수 있었다(도 1A). 감염 이전에도 최소 수준의 PAK1 인산화를 볼 수 있는데, 이는 일반적인 자극을 나타낸다(도 1B). 하지만, 12 hpi 이후 PAK1 인산화는 더욱 명확해졌고, 36 hpi까지 점진적으로 증가하였다. 48 hpi에서 단백질 인산화의 감소가 나타났지만 이는 감염된 세포의 사멸 때문인 것으로 보이며, 위 결과는 PAK1 활성과 바이러스 복제 사이의 상관관계를 나타낸다. 반복되는 여러 복제 사이클 동안 나타나는 다른 신호전달 경로의 축적에 의한 부수적 효과들을 제거하기 위하여, WSN/33 바이러스의 MOIs (0.1-10)를 증가시켜 A549 세포들을 추가로 감염시켰다. 24 hpi에서 준비한 용해물의 웨스턴 면역블랏팅 결과 바이러스 투여량이 높아짐에 따라 PAK1 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 이는 위 활성화가 바이러스 감염과 관련되어 있다는 것을 의미한다(도 1C).

위 상관관계를 더욱 명확히 확인하기 위하여, A549 세포들을 구조적(constitutively) 활성 형태의 PAK1 (PAK1-T423E), 우성 음성(dominant negative) PAK1 (PAK1-K299R), 또는 빈 플라스미드 벡터로 트랜스펙션시키고, 24시간 후에 WSN/33 바이러스로 감염시켰다. 외부에서 도입된 PAK1의 수준은 서서히 증가한 반면, 대조군 벡터-감염 세포들은 표적 단백질에 대해 유의미한 변화를 나타내지 않았다(도 1D). 위 형질전환 세포들에 대한 바이러스 적정(titer) 결과, PAK1-T423E을 도입한 경우에만 24 hpi에서부터 적정농도가 (약 10배)더 높게 나타났다(도 1E). 대체로 36 및 48 hpi에서 더 높은 바이러스 적정(>10-fold difference, p < 0.05) 결과가 관찰되었다. 이러한 결과들은 PAK1 인산화가 인플루엔자 바이러스 복제와 관련되어 있다는 사실을 보여준다.

< 실시예 3>

PAK1 이 인플루엔자 바이러스 증식에 미치는 영향

본 발명자들은 PAK1이 인플루엔자 바이러스 증식 조절에 관여한다는 사실을 밝히기 위하여 추가적으로 siRNA-매개 PAK1 넉다운(knockdown) 실험을 수행하였다. PAK1 유전자의 서로 다른 지역을 표적화(targeting)하는 특이적 이중(duplex) siRNAs 두 세트(서열번호 1 내지 4) 및 음성 대조군 siRNA(서열번호 5)를 사용하여 A549 세포들을 트랜스펙션시켰다. 예상대로, PAK1-특이적 siRNAs만이 PAK 발현 수준을 감소시킬 수 있었다(50-70% 감소) (도 2A 및 B). 연속적으로 PAK1 넉다운에 따른 IAV 복제 변화를 관찰하기 위하여 WSN/33 바이러스 2 MOI로 세포들을 감염시켰다. 12 hpi까지 위 처리 세포들로부터 수거한 배양 배지에서 관찰된 바이러스 증가량에 유의미한 차이는 없었다(도 2C). 하지만, 24-h에서부터 PAK1-특이적 siRNAs 처리 세포의 바이러스 적정농도는 대조군에 비하여 약 100배의 감소를 나타냈다(p < 0.05) (도 2C). 위 결과들은 PAK1 감소가 인플루엔자 바이러스 증식을 상당히 지연시킨다는 것을 보여준다.

사람 간암종 A7 세포주에 대한 이전의 연구에서 PAK1 넉다운이 세포 생존율에 영향을 미친다는 결과가 보고되었으므로(H. Ishida, et al., P21-activated kinase 1 is activated through the mammalian target of rapamycin/p70 S6 kinase pathway and regulates the replication of hepatitis C virus in human hepatoma cells, J. Biol. Chem. 282(2007) 11836-11848), 본 발명자들은 감염 후 24 및 48시간째 Dojindo’s highly water-soluble tetrazolium salt를 이용한 세포 계수 키트(Dojindo Molecular Technologies, Inc, Shanghai, China)를 사용하여 세포독성을 측정하였다.

그 결과 살아있는 세포의 수는 실험한 양 시간 지점에서 비슷하였고, 이는 바이러스 적정농도 감소의 주된 원인이 바이러스 감염 이전 및 바이러스 감염 과정 동안의 세포 수의 차이 때문은 아니라는 점을 보여준다(도 2D). 따라서, PAK1 감소는 인플루엔자 바이러스 증식에 부정적인 영향을 나타내며, 이는 세포 생존의 억제에 의해서가 아니라 바이러스 복제 경로의 차단에 의한 것으로 보인다.

< 실시예 4>

PAK1 의 Raf / MEK / ERK 경로를 통한 인플루엔자 바이러스 조절

본 발명자들은 PAK1 활성과 관련된 잠재적인 호스트(host) 단백질을 동정하기 위한 실험을 수행하였다. PAK1 활성은 Raf1, MEK1, 및 ERK 자극과 관련되어 있으며(A. Beeser, et al., Role of group A p21-activated kinases in activation of extracellular-regulated kinase by growth factors, J. Biol. Chem. 280 (2005) 36609-36615, A. Chaudhary, et al., Phosphatidylinositol 3-kinase regulates Raf1 through Pak phosphorylation of serine 338, Curr. Biol. 10 (2000) 551-554, 및 E.R. Park, et al., MEK1 activation by PAK: a novel mechanism, Cell Signal. 19 (2007) 1488-1496), MAPK 경로에 있어서 Raf/MEK/ERK 캐스케이드(cascade)의 활성은 효율적인 인플루엔자 바이러스 복제를 위해 필요한 것으로 보인다(S. Ludwig, et al., Ringing the alarm bells: signalling and apoptosis in influenza virus infected cells, Cell Microbiol. 8 (2006) 375-386). 따라서, 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 감염 동안 PAK 및 ERK 사이의 기능적 연관을 조사하였다. p-ERK 1/2 (Thr-202/Tyr-204) 항체를 사용한 웨스턴 블랏팅 결과 WSN/33 바이러스-감염된 A549 세포에서 PAK1 자극에 따라 ERK 활성이 서서히 유도되는 것으로 나타났다(도 3A). 24-h에서 준비한 mock-감염 세포의 PAK1 및 ERK 1/2 모두에서 미세한 자극이 관찰되었고, 이는 기초 활성을 나타낸다. Marjuki et al.(H. Marjuki, et al., Membrane accumulation of influenza A virus hemagglutinin triggers nuclear export of the viral genome via protein kinase C alpha-mediated activation of ERK signaling, J. Biol. Chem. 281 (2006) 16707-16715)은 IAV hemagglutinin (HA)의 막 축적이 ERK 신호전달의 활성화를 매개한다는 것을 보고하였으므로, 본 발명자들은 Myc-표지 바이러스 HA의 외래적(exogenous) 과발현 이후에 PAK1 및 ERK 1/2 단백질 인산화를 조사하였다. 그 결과 HA 발현의 외래적 유도는 ERK1/2을 활성화시키기에는 충분하였으나 PAK1은 충분하지 않았으며, HA 트랜스펙션 12- 및 24-시간째 상대적으로 안정적인 활성을 나타냈다(도 3B). 그 후 세포-투과 펩티드 서열, R192A(P.A. Wender, et al., The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 13003-13008) 및 U0126 억제제에 각각 연결된 PAK 펩티드 유도체(PAK18, PAK의 보존적인 18 프롤린(proline)-rich 서열을 포함하는 활성 억제 펩티드)를 사용하여 PAK1 및 ERK 1/2 활성을 차단하였다. MEK/ERK 억제제 U0126은 ERK 1/2 인산화를 상당히 억제하였으며(p < 0.05) (도 3C), 이는 이전의 결과와 일치한다(S. Pleschka, et al., Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the Raf/MEK/ERK signalling cascade, Nat. Cell Biol. 3 (2001) 301-305). DMSO 처리에 비하여, PAK18 펩티드에 의한 ERK 1/2 인산화 억제는, U0126 억제보다 적은 수준이기는 하지만, 상당히 뚜렷하였다(12- 및 24-h에서 각각 76.3% vs. 70.5% 및 62.1% vs. 46% 감소). 반면에, PAK 불활성 펩티드(R192A)는 ERK 1/2 인산화를 감소시키지 못하였다.

추가로 상층액의 바이러스 적정 결과, 1 hpi에서 10μM로 세포 배양 배지에 첨가되었을 때 PAK18 펩티드가 바이러스 성장을 억제시켰다(도 3D). PAK18 억제 펩티드는 R192A 및 DMSO 처리군에 비하여 바이러스 증식량을 적어도 10배 감소시켰다. 이전의 결과와 일치되게(S. Pleschka, et al.(2001)), U0126 역시 DMSO-처리 세포에 비하여 배양 배지에서 감염 바이러스의 생산을 상당히 감소시켰다(~2-log 감소, p < 0.05).

위 결과들을 종합하면, PAK1 활성은, 바이러스 HA 축적과 무관하게, 인플루엔자 바이러스 증식의 Raf/MEK/ERK-의존적 조절에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> Composition containing PAK inhibitor for prevention and treatment of influenza viral diseases <130> pn1204-142 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-PAK1a_1 <400> 1 ggagaaauua cgaagcauau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-PAK1a_2 <400> 2 uaugcuucgu aauuucuccu u 21 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-PAK1b_1 <400> 3 ggagaaauua cgaagcauau uaa 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-PAK1b_2 <400> 4 aauaugcuuc guaauuucuc cuu 23 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control_siRNA <400> 5 ccuacgccaa uuucgu 16

Claims (8)

1. PAK (p21-activated kinase) 억제제를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 PAK는 PAK1인 것을 특징으로 하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 PAK1 억제제는 PAK1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 펩티드, 단백질, 핵산 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 PAK1 억제제는 서열번호 1 및 2의 RNA 서열로 이루어진 siRNA 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 RNA 서열로 이루어진 siRNA 세트인 것을 특징으로 하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
   상기 PAK 억제제는 Raf/MEK/ERK 신호전달 경로를 조절함으로써 인플루엔자 바이러스의 감염을 억제하는 것을 특징으로 하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물.
6. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
   상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 감기, 독감, 인후염, 기관지염 또는 폐렴인 것을 특징으로 하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물.
7. (a) A형 인플루엔자 바이러스에 감염된 시료를 준비하는 단계;
   (b) 상기 시료로부터 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계;
   (c) 상기 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
   (d) 상기 후보물질을 처리한 시료로부터 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
   (e) 상기 (b)단계 및 (d)단계에서 측정한 PAK1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 비교하여 PAK1에 대한 후보물질의 영향을 판단하는 단계를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료제를 스크리닝 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 (b)단계 및 (d)단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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