JP2022117381A - アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 - Google Patents
アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022117381A JP2022117381A JP2021068028A JP2021068028A JP2022117381A JP 2022117381 A JP2022117381 A JP 2022117381A JP 2021068028 A JP2021068028 A JP 2021068028A JP 2021068028 A JP2021068028 A JP 2021068028A JP 2022117381 A JP2022117381 A JP 2022117381A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ace2
- tmprss2
- foxo1
- composition
- inhibitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 title claims description 4
- 101150054399 ace2 gene Proteins 0.000 title description 4
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 15
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 claims abstract 3
- MOMCHYGXXYBDCD-UHFFFAOYSA-N AS1842856 Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C(N)C(F)=C1NC1CCCCC1 MOMCHYGXXYBDCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 16
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 108090000852 Forkhead Transcription Factors Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004315 Forkhead Transcription Factors Human genes 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 108010009306 Forkhead Box Protein O1 Proteins 0.000 abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 101710081844 Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000009561 Forkhead Box Protein O1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 101001062354 Xenopus tropicalis Forkhead box protein A2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 150000001789 chalcones Chemical class 0.000 description 1
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229930013686 lignan Natural products 0.000 description 1
- 235000009408 lignans Nutrition 0.000 description 1
- 150000005692 lignans Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- -1 pH adjusters Substances 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
【課題】アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物を提供すること。【解決手段】アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、前記組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。【選択図】なし
Description
本開示は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ， ｓｅｒｉｎｅ ２）の発現を抑制するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤に関する。
２０１９年の終わりから人への感染が始まったとされる新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）による感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は世界中で猛威を振るい、その治療薬並びにウイルスに対するワクチンの研究開発が各国で盛んに行われている。ＣＯＶＩＤ－１９は発症するとサイトカインストームと呼ばれる過剰な炎症反応が引き起こされ、当初は異常な肺炎症状を引き起こすことにより死に至らしめると考えられていた。その後、肺のみならず、血管、脳神経系、肝臓、腎臓など全身に症状が見られることが明らかになりつつある。これまでの研究成果から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は全ての細胞に感染するというより、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）を細胞表面に発現している細胞に特異的に感染することが示唆されている。さらに最近ではＴＭＰＲＳＳ２（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ， Ｓｅｒｉｎｅ２）というタンパク質分解酵素によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の表面にあるスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）が切断されることでさらに感染力が高まる、などの報告も相次いでいる。非特許文献１では、これまでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に関する知見に関してまとめられている。
ＡＣＥ２の遺伝子発現制御に関して、これまでにフォークヘッド型転写因子ＦｏｘＡファミリーが、ＡＣＥ２遺伝子のプロモーター領域に結合してｍＲＮＡの転写を促進するという文献報告（非特許文献２）はあった。そして、その文献で、ＦｏｘＡファミリーに近いファミリー分子であるＦｏｘＯ１に関しても検討しており、ＦｏｘＯ１はＡＣＥ２遺伝子のプロモーター領域に結合することはできるが、ＦｏｘＯ１の過剰発現でＡＣＥ２のｍＲＮＡの転写は有意に促進されない、という結果を報告している。しかし、この文献ではＦｏｘＯ１の過剰発現自体が成功しているかの検証はなされておらず、さらにＲＮＡ干渉法やノックアウト、阻害剤などでＦｏｘＡ２、ＦｏｘＯ１の必要性に関して検討もされておらず、ＦｏｘＡ２やＦｏｘＯ１がどこまでＡＣＥ２のｍＲＮＡ発現に影響するかについては依然不明のままであった。
https://www.nature.com/articles/d41586-020-00502-w
J Endocr Soc. 2017 Apr 1;1(4):370-384.（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29082356/）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の感染拡大に伴い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する治療法及び予防法が全世界で期待されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２はＡＣＥ２を介して感染することは広く知られており、このＡＣＥ２に対する中和抗体の作成などが急ピッチで進められているものの、いまだ実用化に至ってはいない。そこで、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療・予防にも関係する、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）を抑制するための組成物を提供することを目的とする。
発明者が鋭意検討したところ、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１の阻害剤を加えるだけで、ＡＣＥ２並びにＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ量を減少させることが明らかになり、ＦｏｘＯ１がＡＣＥ２並びにＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子発現の誘導に関連し、ＦｏｘＯ１を阻害することでＡＣＥ２並びにＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することを明らかにした。
さらに、上述のＡＣＥ２の発現量の減少が、新型コロナウィルスのスパイクタンパク質の細胞内の取り込みの減少につながることを見出した。
本開示の発明は、上記知見に基づいて完成され、一側面において、以下の発明を包含する。
（発明１）
アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。
（発明２）
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、発明１の組成物。
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8又はＣＨ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2、又はＣＨ3であり、
ｎは、１－１１である。
｝
（発明３）
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、発明１の組成物。
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１－１１である。
｝
（発明４）
前記阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である、発明１の組成物。
（発明５）
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を治療するための組成物である、発明１～４いずれか１つに記載の組成物。
（発明６）
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を予防するための組成物である、発明１～４いずれか１つに記載の組成物。
（発明７）
ＦｏｘＯ１阻害剤を有効成分として含むコロナウィルス感染症の予防剤または治療剤。
（発明８）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である発明７の予防剤または治療剤。
（発明１）
アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。
（発明２）
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、発明１の組成物。
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8又はＣＨ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2、又はＣＨ3であり、
ｎは、１－１１である。
｝
（発明３）
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、発明１の組成物。
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１－１１である。
｝
（発明４）
前記阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である、発明１の組成物。
（発明５）
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を治療するための組成物である、発明１～４いずれか１つに記載の組成物。
（発明６）
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を予防するための組成物である、発明１～４いずれか１つに記載の組成物。
（発明７）
ＦｏｘＯ１阻害剤を有効成分として含むコロナウィルス感染症の予防剤または治療剤。
（発明８）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である発明７の予防剤または治療剤。
本開示の組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む。これによって、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を減少させることができる。
以下、本開示の発明を実施するための具体的な実施形態について説明する。以下の説明は、発明の理解を促進するためのものである。即ち、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
１． 定義
本明細書で記載される用語「アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現量を抑制するため」は、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２に関する特定の疾患を改善するという目的を包含する。更には、当該用語は、治療目的に限定されない。例えば、当該用語は、特定の疾患を有さないとしても、その疾患を発症することを予防する目的を包含する。
２．フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態においては、こうした組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む。当該阻害剤により、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
本明細書で記載される用語「アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現量を抑制するため」は、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２に関する特定の疾患を改善するという目的を包含する。更には、当該用語は、治療目的に限定されない。例えば、当該用語は、特定の疾患を有さないとしても、その疾患を発症することを予防する目的を包含する。
２．フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態においては、こうした組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む。当該阻害剤により、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
また、本明細書で記載される「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、ＦｏｘＯ１の転写因子としての作用を抑制する阻害剤を意味する。従って、本明細書で記載される「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤を含むことができ、更には、ＦｏｘＯ１の上流のシグナル経路に作用してＦｏｘＯ１の転写因子としての作用を抑制する剤を含むことができる。好ましい「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤である。
好ましい実施形態において、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の例として、以下の式で表される化合物又はその塩が挙げられる。
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8又はＣＨ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2又はＣＨ3であり、
ｎは、１－１１である。
｝
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8又はＣＨ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2又はＣＨ3であり、
ｎは、１－１１である。
｝
更に、好ましい実施形態において、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の例として、以下の式で表される化合物又はその塩が挙げられる。
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１－１１である。
｝
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１－１１である。
｝
上記式で表される化合物又はその塩の具体例として、ＡＳ１８４２８５６（ＣＡＳ Ｎｏ． ８３６６２０－４８－５）が挙げられる。
ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の更なる例として、上述したＡＳ１８４２８５６（ＣＡＳ Ｎｏ． ８３６６２０－４８－５）などのキノロン誘導体に加えて、ＫＩＳ－１５４、カルコン類、トリテルペン類、フラボン類、モノテルペノイド類、リグナン類、クマリン類、及びフィトケミカル類からなるＦＯＸＯ１活性阻害剤（再表2018/079715）などが挙げられる。
また、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の具体例として、ＡＳ１７０８７２７等も利用可能である。
好ましくは、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である。
ＦｏｘＯ１は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写を促す転写因子として作用する。従って、ＦｏｘＯ１の作用を阻害することで、これらの遺伝子の発現を抑制することができる。これによって、ウイルスがスパイクタンパク質を利用して細胞内に取り込まれることを低減することができる。
３．用途
一実施形態において、本開示の組成物は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２が関与する疾患の治療及び／又は予防に利用することができる。具体的には、これらが関与する感染症の治療及び／又は予防に利用することができる。感染症の例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２などのウイルスによる感染症が挙げられる。好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による感染症（ＣＯＶＩＤ１９）である。これらのウイルスは、ヒト細胞のＡＣＥ２受容体に、自身のスパイクタンパク質を結合させ、これを足掛かりとして細胞内に侵入する。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、ヒト細胞の表面のＡＣＥ２と結合した後、ヒト細胞のＴＭＰＲＳＳ２の酵素処理によって、細胞内への侵入効率が増強される。従って、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することで、こうしたウイルスによる細胞の侵入を抑制することができる。これによって感染を抑制することができる。
一実施形態において、本開示の組成物は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２が関与する疾患の治療及び／又は予防に利用することができる。具体的には、これらが関与する感染症の治療及び／又は予防に利用することができる。感染症の例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２などのウイルスによる感染症が挙げられる。好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による感染症（ＣＯＶＩＤ１９）である。これらのウイルスは、ヒト細胞のＡＣＥ２受容体に、自身のスパイクタンパク質を結合させ、これを足掛かりとして細胞内に侵入する。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、ヒト細胞の表面のＡＣＥ２と結合した後、ヒト細胞のＴＭＰＲＳＳ２の酵素処理によって、細胞内への侵入効率が増強される。従って、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することで、こうしたウイルスによる細胞の侵入を抑制することができる。これによって感染を抑制することができる。
こうしたアプローチのメリットは、ウイルス側の変異による影響を受けにくい点にある。一般にＳＡＲＳ－ＣＶ２をはじめとするＲＮＡ型ウイルスは、変異を起こしやすい。そして、ウイルス表面のタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）は、ワクチンのターゲットとされるものの、このタンパク質に変異が起こることにより、ワクチンによる効果が回避されてしまう問題があった。しかし、このアプローチでは、変異による直接的な影響は受けにくいという点で、有利である。
また、特筆すべきは、本開示の組成物は、感染の治療のみならず、感染の予防にも寄与することができる。例えば、感染の治療には、抗炎症作用などに基づいたアプローチがあるが、こうしたアプローチは、感染が起こった後での対処法となるため、予防には寄与できない。しかし、本開示の組成物は、いったん感染が起こってウイルスが増殖した後でも、他の細胞への更なる感染を防ぐという意味では、治療薬としても寄与できる。しかし、それだけではなく、感染する前の状態であっても、予め投与することで、ウイルスが感染する際の足掛かりとなる遺伝子の発現を抑制することで、細胞への感染を防ぐという意味で予防薬としても寄与できる。
従って、一実施形態において、本開示の組成物は、投与形態に応じて、適切な追加成分を配合してもよい。例えば、本開示の組成物は、医薬品に一般的に含まれる成分を含んでもよい。当該成分の例として、保存料、防腐剤、香料、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、防カビ剤などが挙げられる。
さらに、本開示の組成物ＡＳ１８４２８５６は、マウスを用いた動物実験において経口投与による効果が確認されている。従って、一実施形態において、本開示の組成物は、錠剤化、経口用カプセル封入、などの加工をしてもよい。
４．実施例
４－１．実施例１（ＨｅｐＧ２細胞の培養）
ＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＨＢ－８０６５）から購入した。当該細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）の血清培地を用いて継代・維持した。
４－２．実施例２（ＦｏｘＯ１阻害剤の効果）
ＨｅｐＧ２細胞を１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３６）の各ウェルに５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６～２４時間）、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を複数の濃度で添加（１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）し、又はその溶媒として用いたＤＭＳＯをコントロールとして加え、１日（約２４時間）培養した。培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｚ６０１２）を用いてＨｅｐＧ２細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ； Ｔａｋａｒａ， ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ Ｓｙｂｒ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ； ＴＯＹＯＢＯ， ＱＰＳ－２０１Ｘ５）を行った。
４－１．実施例１（ＨｅｐＧ２細胞の培養）
ＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＨＢ－８０６５）から購入した。当該細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）の血清培地を用いて継代・維持した。
４－２．実施例２（ＦｏｘＯ１阻害剤の効果）
ＨｅｐＧ２細胞を１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３６）の各ウェルに５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６～２４時間）、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を複数の濃度で添加（１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）し、又はその溶媒として用いたＤＭＳＯをコントロールとして加え、１日（約２４時間）培養した。培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｚ６０１２）を用いてＨｅｐＧ２細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ； Ｔａｋａｒａ， ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ Ｓｙｂｒ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ； ＴＯＹＯＢＯ， ＱＰＳ－２０１Ｘ５）を行った。
ｃＤＮＡ合成のためのミクスチャは以下の組成に従って調製した。
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ μｌ（最終濃度 １ ｘ）
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５００ ｎｇ
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ 合計１０ μｌに調整
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ μｌ（最終濃度 １ ｘ）
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５００ ｎｇ
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ 合計１０ μｌに調整
上記ミクスチャを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＶｅｒｉｔｉ ９６ ｗｅｌｌ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、以下の条件で処理した。
３７℃ １５分
↓
８５℃ ５秒
↓
４℃ ∞
３７℃ １５分
↓
８５℃ ５秒
↓
４℃ ∞
合成したｃＤＮＡ（１０ μｌ）は９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０ ＋ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて１０倍に希釈した。当該希釈物を、定量ＰＣＲに供した。
４－３．実施例３（ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子発現の解析）
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １０μｌ
５ｍＭ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ０．４μｌ
５ｍＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ０．４μｌ
Ｈ2Ｏ ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈） １ μｌ
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １０μｌ
５ｍＭ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ０．４μｌ
５ｍＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ０．４μｌ
Ｈ2Ｏ ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈） １ μｌ
上記混合物を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＣＦＸ－Ｃｏｎｎｅｃｔを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲサイクルの条件は以下の通りであった。
１．９５℃ １分 （初期変性）
２．９５℃ １５秒 （変性）
３．６０℃ ３０秒 （伸長）
（２－３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５ ℃ ～ ９５ ℃まで０．５ ℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
１．９５℃ １分 （初期変性）
２．９５℃ １５秒 （変性）
３．６０℃ ３０秒 （伸長）
（２－３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５ ℃ ～ ９５ ℃まで０．５ ℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
上記サイクルにて、ＰＣＲ産物の検出を行い、併せて、Ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅによるＰＣＲ産物の単一性の確認を行った。
内部標準（すべての細胞・条件において同じ発現をしているハウスキーピング遺伝子）として、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
全てのプライマーは株式会社ファスマックから購入した（逆相カラム精製グレード）。
各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、ＦｏｘＯ１阻害剤で処理をしていないコントロール条件（ＤＭＳＯ処理）での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅによって確認した。
各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、ＦｏｘＯ１阻害剤で処理をしていないコントロール条件（ＤＭＳＯ処理）での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅによって確認した。
結果を図１に示す。コントロールのＤＭＳＯ処理と比較すると、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を加えると、その濃度依存的にＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現が減少することが観察された（多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法））。この結果は、ＦｏｘＯ１がＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現に必要であることを示している。
４－４．実施例４（スパイクタンパク質の細胞内への取り込みへの影響）
次に、ＦｏｘＯ１阻害剤によるＡＣＥ２の発現抑制が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２とホスト細胞の結合及び細胞内への取り込みを阻害できるか検討した。この目的で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質のＳ１の中でＡＣＥ２に結合するために必要十分な領域ＲＢＤ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、Ｒ３１９～Ｆ５４１）にマウスＩｇＧのＦｃ領域が融合されたリコンビナントタンパク質ＲＢＤ－ｍＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０５Ｈ２）を準備した。実験の模式図を図２に示す。
次に、ＦｏｘＯ１阻害剤によるＡＣＥ２の発現抑制が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２とホスト細胞の結合及び細胞内への取り込みを阻害できるか検討した。この目的で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質のＳ１の中でＡＣＥ２に結合するために必要十分な領域ＲＢＤ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、Ｒ３１９～Ｆ５４１）にマウスＩｇＧのＦｃ領域が融合されたリコンビナントタンパク質ＲＢＤ－ｍＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０５Ｈ２）を準備した。実験の模式図を図２に示す。
ＨｅｐＧ２細胞を６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ； Ｃｏｒｎｉｎｇ， ３３３５）の各ウェルに１００，０００個を播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６～２４時間）、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を１μＭの濃度で添加、又はその溶媒として用いたＤＭＳＯをコントロールとして加え、３日間培養した（約７２時間）。培養後、最終濃度が１００ｎＭとなるようにＲＢＤ－ｍＦｃ、またはコントロールとして何も融合していないマウスＩｇＧ由来Ｆｃ領域（ｍＦｃ；Ａｂｃａｍ，ａｂ１７９９８２）を添加し、さらに３時間培養した。その後、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄後、剥離し細胞を回収した。回収した細胞は４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（富士フィルム和光純薬、１６３－２０４１１５）で１５分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳ（－）で洗浄し、マウスＩｇＧを認識する抗体にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光色素が共有結合した二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７１５－５４５－１５０）で細胞表面や細胞内に取り込まれたｍＦｃを染色し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＦＣ５００）を用いて一細胞あたりのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光強度を測定し、定量した。解析にはＫａｌｕｚａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２．１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。典型的な細胞の写真は、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ、ＢＸ－７００）を用いて撮影した。
結果を図３に示す。まず、Ｓ１及びＲＢＤがＨｅｐＧ２細胞に取り込まれ得るのか、免疫染色法及び蛍光顕微鏡を用いて観察した。コントロールのｍＦｃを添加した場合には、全くほとんど蛍光シグナルが検出されなかったのに対し、ＲＢＤ－ｍＦｃは５０％近くの細胞で観察された。これらの結果から、ＨｅｐＧ２細胞はＲＢＤを取り込むことが示唆された。
次に、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を用いて、あらかじめＡＣＥ２の発現を抑制した時、取り込まれるＲＢＤの量が抑制されるかフローサイトメトリーを用いて検討した。蛍光強度の違いを図４に示す。まず、ネガティブコントロールであるｍＦｃを添加した際の細胞の示す蛍光強度は、ＡＣＥ２を介さずにｍＦｃのみで取り込まれてしまったもの、二次抗体が非特異的に結合してしまったもの、及び細胞のもつ自家蛍光、の３つに由来し、これはバックグラウンドシグナルと考えられる。従って、ｍＦｃでの蛍光強度を引くことで、より正確に取り込まれたＲＢＤ由来のシグナルの差を正確に比較することが可能になる。すると、コントロールのＤＭＳＯを添加した際のＲＢＤの蛍光シグナルと比較すると、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６で予め処理することで、ＲＢＤ由来の蛍光シグナルの強度が有意に減少した（Ｔ検定；ｐ＜０．０００５）。すなわち、この結果はＦｏｘＯ１阻害剤によってＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みが抑制されたことを示しており、ＦｏｘＯ１阻害剤によるＡＣＥ２等のｍＲＮＡ発現量の抑制が、ＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みを抑制できるレベルまで抑えていることを示唆している。
さらに、この結果はＦｏｘＯ１阻害剤によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２がホスト細胞に結合し感染する（取り込まれる）ことが抑制されることを示唆している。
また、こうした効果は、ＡＳ１８４２８５６の化学構造をある程度改変したとしても同様の効果が得られると考えられる。例えば、ＡＳ１８４２８５６のフルオロ基の部分は、他のハロゲン基に変えても同様の効果が得られると考えられる。また、ＡＳ１８４２８５６の水素部分は例えばメチル基に変えても同様の効果が得られると考えられる。ＡＳ１８４２８５６の（＝Ｏ）の部分は同族元素Ｓに変えても同様の効果が得られると考えられる。また、エチル基部分は、炭素数が１個増減したアルキル基でも同様の効果が得られると考えられる。アミノ基部分は、同程度のサイズであるメチル基に変えたとしても同様の効果が得られると考えられる。
以上の実験結果から示される、一実施形態における本開示の作用機序を図５にまとめる。ＦｏｘＯ１阻害剤は、細胞に作用して、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の発現を抑制する。これによって、細胞表面のＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の量が減少する。そして、ウイルス表面に存在するスパイクタンパク質とＡＣＥ２との結合が阻害される。また、ＴＭＰＲＳＳ２によるウイルスの細胞内への侵入の促進効果も抑制される。
以上、具体的な実施形態について説明してきた。上記実施形態は、具体例に過ぎず、本発明は上記実施形態に限定されない。例えば、上述の実施形態の１つに開示された技術的特徴は、他の実施形態に適用することができる。また、特記しない限り、特定の方法については、一部の工程を他の工程の順序と入れ替えることも可能であり、特定の２つの工程の間に更なる工程を追加してもよい。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって規定される。
Claims (8)
- アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。 - 前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、請求項１の組成物。
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8又はＣＨ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2、又はＣＨ3であり、
ｎは、１－１１である。
｝ - 前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、請求項１の組成物。
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ－Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１－１１である。
｝ - 前記阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である、請求項１の組成物。
- 新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を治療するための組成物である、請求項１～４いずれか１項に記載の組成物。
- 新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を予防するための組成物である、請求項１～４いずれか１項に記載の組成物。
- ＦｏｘＯ１阻害剤を有効成分として含むコロナウィルス感染症の予防剤または治療剤。
- 前記ＦｏｘＯ１阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である請求項７の予防剤または治療剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021013858 | 2021-01-29 | ||
| JP2021013858 | 2021-01-29 | ||
| JP2021017835A JP6906127B1 (ja) | 2021-01-29 | 2021-02-05 | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021017835A Division JP6906127B1 (ja) | 2021-01-29 | 2021-02-05 | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022117381A true JP2022117381A (ja) | 2022-08-10 |
Family
ID=76918265
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021017835A Active JP6906127B1 (ja) | 2021-01-29 | 2021-02-05 | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 |
| JP2021068028A Pending JP2022117381A (ja) | 2021-01-29 | 2021-04-13 | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021017835A Active JP6906127B1 (ja) | 2021-01-29 | 2021-02-05 | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP6906127B1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117999099A (zh) * | 2021-01-29 | 2024-05-07 | 仿生技术支持有限公司 | 用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2表达的组合物 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016065055A (ja) * | 2014-09-19 | 2016-04-28 | 国立大学法人金沢大学 | 骨髄性白血病の治療剤 |
| WO2020169707A1 (en) * | 2019-02-21 | 2020-08-27 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Foxo1 inhibitor for use in the treatment of latent virus infection |
-
2021
- 2021-02-05 JP JP2021017835A patent/JP6906127B1/ja active Active
- 2021-04-13 JP JP2021068028A patent/JP2022117381A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2022117366A (ja) | 2022-08-10 |
| JP6906127B1 (ja) | 2021-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xu et al. | HIV-1 Tat protein increases the permeability of brain endothelial cells by both inhibiting occludin expression and cleaving occludin via matrix metalloproteinase-9 | |
| Kohio et al. | Glycolytic control of vacuolar-type ATPase activity: a mechanism to regulate influenza viral infection | |
| RU2736499C1 (ru) | Специфические ингибиторы гексокиназы-2 для применения при остром повреждении центральной нервной системы | |
| US10993975B2 (en) | Zika virus treatment of CD24-positive tumors and diseases associated with abnormal T cell activation and treating or preventing Zika virus infections | |
| US20230301967A1 (en) | Methods and compositions for the treatment of retinopathy and other ocular diseases | |
| JP2022117381A (ja) | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／若しくはｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤 | |
| BR112020009907A2 (pt) | composições e métodos para melhorar produção, crescimento, disseminação, ou eficácia oncolítica e imunoterapêutica de vírus sensíveis a interferon | |
| AU2007328872A1 (en) | Potentiation of cellular immunity using histone deacetylase (HDAC) inhibitors | |
| CA3210278A1 (en) | Compositions and methods for viral sensitization | |
| AU2022258682A1 (en) | Isoquinoline derivatives for use as antiviral and antitumour agents | |
| Gao et al. | Cryptoporic acid E from Cryptoporus volvatus inhibits influenza virus replication in vitro | |
| Alfajaro et al. | Feline calicivirus-and murine norovirus-induced COX-2/PGE2 signaling pathway has proviral effects | |
| EP4074314A1 (en) | Isoquinoline derivatives for use as antiviral and antitumour agents | |
| JP2022136956A (ja) | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／又はｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物 | |
| JP6986263B2 (ja) | 抗ウイルス薬 | |
| EP2691091A1 (fr) | Utilisation de l'epigallocatechine gallate comme agent antiviral contre les infections par le virus de l'hépatite c | |
| Tung et al. | Total control of fat cells from adipogenesis to apoptosis using a xanthene analog | |
| WO2022163852A1 (ja) | アンジオテンシン転換酵素２（ａｃｅ２）及び／又はｔｍｐｒｓｓ２発現を阻害するための組成物 | |
| JP2023518208A (ja) | Ｐｉ４ｋ阻害物質の抗コロナウイルス効果および応用 | |
| US20210244716A1 (en) | Vemurafenib and salts thereof for use in the treatment of enteroviral infections | |
| KR20220128402A (ko) | D형 간염 바이러스에 의한 감염을 치료하기 위한 fxr 작용제의 용도 | |
| US20200149049A1 (en) | Methods and compositions relating to anti-calcification | |
| TW201934543A (zh) | 以鋅結合劑為基礎的ｅｂｎａ１專一性化合物 | |
| Dezhbord et al. | Novel role of MHC class II transactivator in hepatitis B virus replication and viral counteraction | |
| WO2011126071A1 (ja) | ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤、ならびにウイルスの感染を抑制および／または感染症を治療する方法 |