WO2011125860A1 - ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法 - Google Patents

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laminin
activity
protein
stem cells
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保田　尚孝
宗弘 山田
由葵子 竹谷
賀也 富盛
かおる 森
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オリエンタル酵母工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing cells in a system containing laminin 5.
  • Laminin is an extracellular matrix protein that is mainly localized in the basement membrane of various tissues and plays an important role in maintaining tissue structure and controlling cell function (Matrix Biol., 18: 19-28, 1999; Dev. Dyn., 218: 213-234, 2000).
  • laminin is a heterotrimeric molecule in which ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain are linked by disulfide bonds, respectively, and has a characteristic cross structure. Each chain consists of multiple domains, and domains I and II form a triple helix.
  • ⁇ chains ⁇ 1 to ⁇ 5
  • 3 types of ⁇ chains ⁇ 1 to ⁇ 3
  • 3 types of ⁇ chains ⁇ 1 to ⁇ 3
  • each laminin isoform has a unique site and function, mainly through cell membrane receptor integrins, cell adhesion, proliferation, movement, differentiation, etc. (Dev. Dyn. 218, 213-234, 2000; Physiol. Rev. 85, 979-1000, 2005).
  • the ⁇ 2 chain exists mainly in muscles and nerve tissues, whereas the ⁇ 3 chain exists mainly in skin tissues.
  • Each function is also different, and the ⁇ 2 chain gene abnormality causes muscular dystrophy, whereas the ⁇ 3 chain gene abnormality causes a serious symptom of junctional epidermolysis bullosa (Dev. Dyn. 218, 213-234). 2000). It also shows a completely different function in in vitro experiments.
  • Laminin 2 and laminin 4 having an ⁇ 2 chain as a constituent chain show little adhesion activity to mesenchymal stem cells, whereas laminin 5 having an ⁇ 3 chain as a constituent chain shows a very strong adhesive activity (Stem Cell. 24, 2346-2354, 2006).
  • the ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains constituting each laminin isoform are different, the functions and activities are completely different.
  • Table 1 shows 15 laminin molecular species and their subunit structures.
  • Laminin molecules associate with each other at the triple-stranded amino (N) terminal portion (short arm) or associate with other matrix molecules to construct a basement membrane.
  • N triple-stranded amino
  • LG1-LG5 domain homologous globular domains
  • C carboxy
  • Laminin 5 (also referred to as kalinin, epiligrin, nisin, and radosine) is one of laminin isoforms consisting of ⁇ 3 chain, ⁇ 3 chain, and ⁇ 2 chain, and has been discovered by multiple research institutions with different circumstances (J. Cell Biol 114, 567-576, 1991; Cell 65, 599-610, 1991; J. Invest Dermatol. 101, 738-743, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 11767-11717, 1993).
  • Laminin 5 has been reported to exhibit strong cell adhesion activity, cell dispersion activity, cell proliferation activity and the like for various cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 11767-11717, 1993; Biochem. 116, 862-869, 1994; J. Cell Biol. 125, 205-214, 1994; Mol. Biol. Cell. 16, 881-890, 2005; Stem Cell. 24, 2346-2354, 2006).
  • International publication WO2007 / 023875 describes a mesenchymal stem cell culture technique using laminin-5.
  • the object of the present invention is to provide a technique for increasing the activity of laminin 5 in a method for culturing cells in a system containing laminin 5.
  • the present inventors have conceived the present invention by finding that various activities of laminin 5 increase when a specific polypeptide is used together with laminin 5 in a method of culturing cells in a system containing laminin 5.
  • the present invention includes the following embodiments as preferred embodiments.
  • [Aspect 1] In a method of culturing cells in a system containing laminin 5, Serum, serum albumin, prealbumin, immunoglobulin, ⁇ -globulin, ⁇ -globulin, ⁇ 1-antitrypsin ( ⁇ 1-AT), heptoglobin (Hp), ⁇ 2-macroglobulin ( ⁇ 2-M), ⁇ -fetoprotein (AFP) ), Transferrin, retinol binding protein (RBP) or blood protein other than extracellular matrix protein which is adiponectin, and a polypeptide selected from the group consisting of gelatin and a protein belonging to the tumor necrosis factor (TNF) family, peptone In a culture system.
  • TNF tumor necrosis factor
  • Aspect 2 The method according to aspect 1, wherein the protein belonging to the tumor necrosis factor (TNF) family is a receptor activator NF (B ligand (RANKL)).
  • RNKL receptor activator NF
  • the peptone is selected from the group consisting of cottonseed-derived peptone, soybean-derived peptone, wheat-derived peptone and pea-derived peptone.
  • the cell culture container is treated with laminin 5 after being treated with the polypeptide, or simultaneously with the polypeptide and laminin.
  • any one of aspects 1 to 4, wherein the activity of laminin 5 on cells is selected from the group consisting of cell adhesion activity, cell dispersion activity, wound healing activity, growth promoting activity, undifferentiation maintenance activity and pluripotency maintenance activity
  • the cells are selected from the group consisting of pluripotent stem cells, tissue stem cells, somatic cells, germ cells, and sarcoma cells.
  • the pluripotent stem cells are selected from embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, embryonic germ cells, or germ stem cells;
  • the tissue stem cells are selected from mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, neural stem cells, skin stem cells, or hematopoietic stem cells; or Somatic cells are hepatocytes, pancreatic cells, muscle cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, adipocytes, skin cells, fibroblasts, pancreatic cells, kidney cells, lung cells, or lymphocytes Selected from erythrocytes, leukocytes, monocytes, macrophages or megakaryocyte blood cells, The method according to embodiment 6.
  • [Aspect 13] The composition of embodiment 12, further comprising laminin 5.
  • [Aspect 14] Serum, serum albumin, prealbumin, immunoglobulin, ⁇ -globulin, ⁇ -globulin, ⁇ 1-antitrypsin ( ⁇ 1-AT), heptoglobin (Hp), ⁇ 2-macroglobulin ( ⁇ 2-M), ⁇ -fetoprotein (AFP) ), Transferrin, retinol binding protein (RBP) or blood protein other than extracellular matrix protein which is adiponectin, and a polypeptide selected from the group consisting of gelatin and a protein belonging to the tumor necrosis factor (TNF) family, peptone
  • TNF tumor necrosis factor
  • laminin 5 and a specific polypeptide are used in combination to select from the group consisting of cell adhesion activity, cell dispersion activity, wound healing activity, growth promoting activity, undifferentiation maintenance activity and pluripotency maintenance activity. , The activity of laminin 5 on cells is increased.
  • FIG. 1 is a diagram in which purified recombinant human laminin 5 is electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the right lane in FIG. 1 shows the result of electrophoresis of 1 ⁇ g of recombinant human laminin 5.
  • FIG. 2 is a graph showing the effects of recombinant human laminin 5 (0.25 ⁇ g / ml) and various blood proteins on cell adhesion activity against BRL cells.
  • FIGS. 2A-D show the results for each concentration (0-800 ⁇ g / ml) shown in the figures for human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA), human serum (HS) and IgG, respectively.
  • FIG. 3 shows the results of examining the optimum concentration of HSA that increases the cell adhesion activity of recombinant human laminin 5 to BRL cells at each concentration (0-2 ⁇ g / ml) indicated on the horizontal axis.
  • rHSA recombinant HSA
  • FIG. 5 shows the effects of gelatin (Gel), sRANKL, and peptone (Pep) that increase the cell adhesion activity of recombinant human laminin 5 to BRL cells at each concentration (0-2 ⁇ g / ml) indicated on the horizontal axis. The results are shown.
  • FIG. 6 shows the results of examining the effect of each concentration of Pep on the horizontal axis (0-2 ⁇ g / ml) at each concentration of Pep that increases the cell adhesion activity of recombinant human laminin 5 to BRL cells.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of examining whether recombinant human laminin 5 (0.25 ⁇ g / ml) and various saccharides have an effect on cell adhesion activity to BRL cells.
  • FIG. 7A-D show the results for each concentration (0-10 ⁇ g / ml) shown in the figures for xylose (Xyl), trehalose (Tre), mannose (Man) and lactose (Lac), respectively.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of examining whether recombinant human laminin 5 (0.25 ⁇ g / ml) and various sugars affect cell adhesion activity against BRL cells at higher concentrations.
  • FIG. 8A shows the results for 100 ⁇ g / ml Tre and Man.
  • FIG. 8B shows the results for 100 ⁇ g / ml Xyl and Lac.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of examining whether recombinant human laminin 5 (0.25 ⁇ g / ml) and various amino acids have an effect on cell adhesion activity against BRL cells.
  • FIG. 9A Black diamond mark, recombinant human laminin 5 only (control) White square mark, recombinant human laminin 5 + HSA 10 ⁇ g / ml White triangle mark, recombinant human laminin 5 + glycine (Gly) 10 ⁇ g / ml Light triangle, recombinant human laminin 5 + Gly 100 ⁇ g / ml Black triangle mark, recombinant human laminin 5 + Gly 1000 ⁇ g / ml FIG.
  • FIG. 10 is a diagram showing a synergistic effect on the cell adhesion activity of recombinant human laminin 5 when two kinds of blood proteins are used. Each blood protein shown on the horizontal axis was used at the indicated concentration.
  • FIG. 11 shows the results of studying the order of processing the cell incubator. Recombinant human laminin 5 was used at a concentration (0-2 ⁇ g / ml) indicated on the horizontal axis.
  • FIG. 12 shows the results of examining the optimum concentration of recombinant HSA (rHSA) that increases the cell adhesion activity of recombinant human laminin 5 to HT1080 cells at each concentration (0-2 ⁇ g / ml) indicated on the horizontal axis. Show.
  • FIG. Black diamond mark, recombinant human laminin 5 only (control) White square mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 0.78125 ⁇ g / ml White triangle mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 3.125 ⁇ g / ml X, recombinant human laminin 5 + rHSA 12.5 ⁇ g / ml
  • FIG. Black diamond mark, recombinant human laminin 5 only (control) White square mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 0.78125 ⁇ g / ml White triangle mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 3.125 ⁇ g / ml X, recombinant human laminin 5 + rHSA 12.5 ⁇ g / ml
  • FIG. 13 shows the results of recombinant HSA (rHSA) that increases the cell adhesion activity of recombinant human laminin 5 to human mesenchymal stem cells (hMSC) cells at each concentration (0-2 ⁇ g / ml) indicated on the horizontal axis. The result of examining the appropriate concentration is shown.
  • rHSA recombinant HSA
  • FIG. Black diamond mark, recombinant human laminin 5 only (control) White square mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 0.78125 ⁇ g / ml White triangle mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 3.125 ⁇ g / ml X, recombinant human laminin 5 + rHSA 12.5 ⁇ g / ml
  • FIG. Black diamond mark, recombinant human laminin 5 only (control) White square mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 0.78125 ⁇ g / ml White triangle mark, recombinant human laminin 5 + rHSA 3.125 ⁇ g / ml X, recombinant human laminin 5 + rHSA 12.5 ⁇ g / ml
  • FIG. 14 shows the results of examining the optimum concentration of recombinant HSA (rHSA) that increases the cell adhesion activity of recombinant human laminin 5 to EB3 cells at each concentration (0-16 ⁇ g / ml) indicated on the horizontal axis. Show.
  • FIG. 15 is a photograph showing cell morphology after adhesion analysis of EB3 cells when rHSA (12.5 ⁇ g / ml) was added to recombinant human laminin 5 at each concentration shown in the figure. The left side is when rHSA is not used (control), and the right side is when rHSA is used.
  • FIG. 15 is a photograph showing cell morphology after adhesion analysis of EB3 cells when rHSA (12.5 ⁇ g / ml) was added to recombinant human laminin 5 at each concentration shown in the figure. The left side is when rHSA is not used (control), and the right side is when rHSA is used.
  • FIG. 15 is a photograph showing cell morphology after adhesion analysis of EB3 cells when rHSA (12.5 ⁇ g / ml) was added to recombinant human laminin 5 at each concentration shown in the figure. The left side is when rHSA is not used (control), and the
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of examining whether HSA has an effect of increasing cell adhesion activity in the same manner as laminin 5 against other laminin isoforms other than human laminin 5.
  • concentration indicated on the horizontal axis was used.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of examining whether or not rHSA has an increasing effect on cell adhesion activity similar to laminin 5 against other extracellular matrix proteins other than human laminin 5 and laminin isoforms.
  • Vitronectin Vn / SIGMA
  • laminin 2 Lm2 / Millipore
  • FIG. 18 shows the results of examining the activity-increasing effect of rHSA (10 ⁇ g / ml) on the cell dispersion activity of recombinant human laminin 5 at each concentration (0-0.2 ⁇ g / ml) indicated on the horizontal axis on BRL cells. . It was observed that the activity increasing effect by rHSA was particularly remarkable when the concentration of rLm5 was 0.02 ⁇ g / ml.
  • FIG. 19 is a photograph showing the results of examining the activity increasing effect of rHSA (10 ⁇ g / ml) on the cell dispersion activity of recombinant human laminin 5 at various concentrations (0-0.2 ⁇ g / ml) on BRL cells.
  • FIG. 19 is a photograph showing the results of examining the activity increasing effect of rHSA (10 ⁇ g / ml) on the cell dispersion activity of recombinant human laminin 5 at various concentrations (0-0.2 ⁇ g /
  • FIG. 20 shows the results of examining the activity-increasing effect of rHSA (10 ⁇ g / ml) on the wound healing activity of recombinant human laminin 5 at each concentration (0-0.1 g / ml) indicated on the horizontal axis against BRL cells. . It was observed that the activity increasing effect by rHSA was particularly remarkable when the concentration of rLM5 was 0.0125-0.05 ⁇ g / ml.
  • FIG. 21 is a photograph showing the results of examining the effect of increasing the activity of rHSA (10 ⁇ g / ml) on the wound healing activity of recombinant human laminin 5 at various concentrations (0-0.1 g / ml) on BRL cells.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of examining the activity increasing effect of rHSA (10 ⁇ g / ml) on the proliferation activity of recombinant human laminin 5 on hMBC cells.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of examining the activity increasing effect of rHSA (10 ⁇ g / ml) on the proliferation activity of recombinant human laminin 5 on EB3 cells.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of examining the activity increasing effect of rHSA in the case of using various cell support materials for the proliferation activity of recombinant human laminin 5 on EB3 cells.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of detecting undifferentiated markers for S + G and K + L (0.05 ⁇ g / ml) + H (12.5 ⁇ g / ml) in which proliferation was observed in FIG.
  • the present invention relates to a method for culturing cells in a system containing laminin 5.
  • the method of the present invention is a method for culturing cells in a system containing laminin 5, Serum, serum albumin, prealbumin, immunoglobulin, ⁇ -globulin, ⁇ -globulin, ⁇ 1-antitrypsin ( ⁇ 1-AT), heptoglobin (Hp), ⁇ 2-macroglobulin ( ⁇ 2-M), ⁇ -fetoprotein (AFP) ), Transferrin, retinol binding protein (RBP) or blood protein other than extracellular matrix protein which is adiponectin, and a polypeptide selected from the group consisting of gelatin and a protein belonging to the tumor necrosis factor (TNF) family, peptone In the culture system.
  • TNF tumor necrosis factor
  • Laminin 5 The method of the present invention is characterized by culturing pluripotent stem cells in a system containing laminin 5 when culturing pluripotent stem cells.
  • Laminin 5 has been reported to exhibit strong adhesion activity against many cell types compared to various extracellular matrix proteins including other laminin isoforms (J. Biochem. 116, 862-869, 1994, J. Cell Biol. 125, 205-214, 1994, Mol Biol Cell. 16, 881-890, 2005).
  • laminin 5 is a laminin molecule composed of an ⁇ 3 chain, a ⁇ 3 chain, and a ⁇ 2 chain, and plays a central role in the binding of the epidermis to the dermis and is preferential to the integrin ⁇ 3 ⁇ 1 in most cells. However, some cells also bind to integrins ⁇ 6 ⁇ 1 and ⁇ 6 ⁇ 4. It has been elucidated that the ⁇ 3G2A sequence of the ⁇ 3 chain G2 domain in Laminin 5 (RERFNISTPAFRGCMKNLKKTS) and the KRD sequence of the G3 domain are the main binding sites for integrins.
  • Laminin 5 is secreted as a trimer and then undergoes limited degradation by protease to remove the G4 and G5 domains at the C-terminus of the ⁇ 3 chain, converting from 190 kDa (non-cleavable) to 160 kDa (cleaved). It is known that Laminin 5 isolated by the usual method does not have G4 and G5 domains. Such ⁇ 3-chain-cut laminin 5 is known to have higher cell adhesion promoting activity, exercise promoting activity, and nerve regeneration promoting activity than non-cleavable laminin 5 (J. Biol. Chem., 280). (2005), 14370-14377).
  • the laminin 5 of the present invention is not particularly limited, and may be a non-cleavable type that contains the G4 and G5 domains, or may be a cleaved type in which the entire G4 and G5 domains or a part thereof is removed. .
  • the laminin 5 protein may be a natural type or a modified type in which one or more amino acid residues are modified while retaining its biological activity, particularly cell adhesion promoting activity. Moreover, as long as the laminin 5 protein in this invention has the characteristics described in this specification, the origin, a manufacturing method, etc. are not limited. That is, the laminin 5 protein of the present invention may be a naturally occurring protein, a protein expressed from a recombinant DNA by genetic engineering techniques, or a chemically synthesized protein.
  • laminin 5 protein is not particularly limited, but is preferably derived from human.
  • human-derived laminin 5 it is preferable to use human-derived laminin 5 in order to avoid the use of materials derived from other animals.
  • SEQ ID NOs: 1-6 in the sequence listing in this specification show the base sequence and amino acid sequence of ⁇ 3 chain, ⁇ 3 chain and ⁇ 2 chain of human laminin 5.
  • the laminin 5 protein used in the present invention is preferably an ⁇ 3 chain (amino acid residue) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, or substituted in this sequence. Group No. 1-No. 1713) (J. Biol. Chem. 269, 22779-22787, 1994), the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or one or more amino acids in this sequence deleted, added or substituted ⁇ 3 chain (amino acid residues No. 1 to No. 1170) (J. Biol. Chem.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or 1 in this sequence It has an amino acid sequence in which more or more amino acids are deleted, added, or substituted It is a protein consisting of each subunit of ⁇ 2 chain (amino acid residues No. 1 to No. 1193) (J. Cell. Biol. 119, 679-693, 1992).
  • ⁇ 3 chain globular domain (G1-G5 domain) is amino acid residue No. 1 of SEQ ID NO: 1, respectively. 794-No. 970, no. 971-No. 1139, no. 1140-No. 1353, no. 1354-No. 1529 and no. 1530-No. 1713.
  • Each chain of laminin 5 may have an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added, or substituted in the amino acid sequence represented by the corresponding SEQ ID NO.
  • a protein having an amino acid sequence homologous to such a natural protein can also be used in the present invention.
  • the number of amino acids that can be changed is not limited in the amino acid sequences of ⁇ 3 chain, ⁇ 3 chain, and ⁇ 2 chain, but preferably 1 to 300 amino acid residues, 1 to 200 amino acid residues, and 1 to 150 amino acid residues.
  • amino acid residues 1 to 120 amino acid residues, 1 to 100 amino acid residues, 1 to 80 amino acid residues, 1 to 50 amino acid residues, 1 to 30 amino acid residues, 1 to 20 amino acid residues, 1 to 15 amino acid residues 1 to 10 amino acid residues and 1 to 5 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues that can be modified by a known site-directed mutagenesis method for example, 1 to 10 amino acid residues, 1 to 5 amino acid residues is more preferable.
  • substitutions include replacing an amino acid with a residue having similar physicochemical properties, eg, one fatty acid residue (Ile, Val, Leu or Ala) with another, or a basic residue Substitution is included between Lys and Arg, acidic residues Glu and Asp, amide residues Gln and Asn, hydroxyl residues Ser and Tyr, or aromatic residues Phe and Tyr.
  • laminin 5 used in the present invention has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 2, 4, 6. It may also be a protein that can promote cell adhesion activity.
  • Identities are calculated by dividing the number of identical residues by the total number of residues in a known sequence or domain of a known sequence and multiplying by 100.
  • Computer programs for determining sequence identity using standard parameters include, for example, Gapped BLAST PSI-BLAST (Nucleic Acids Res. 25, 3389-340, 1997), BLAST (J. Mol. Biol. 215). : 403-410, 1990), and Smith-Waterman (J. Mol. Biol. 147: 195-197, 1981) are available.
  • the default settings of these programs are used, but these settings may be changed as desired.
  • the laminin 5 protein in the present invention has the characteristics described in the present specification, its origin, production method and the like are not limited. That is, the laminin 5 protein of the present invention may be a culture supernatant of human or animal cells that secrete laminin 5, or a natural laminin 5 protein purified therefrom. However, laminin 5 can be effectively produced as a recombinant protein by expressing each subunit using recombinant DNA technology known in the art. However, it is particularly preferred to obtain laminin 5 as a human recombinant protein in the sense of avoiding unnecessary animal factors.
  • nucleic acid residue No. 1 of SEQ ID NO: 1 encoding the ⁇ 3 chain of laminin 5.
  • 1-No. A DNA sequence comprising 5139, the nucleic acid residue No. 3 of SEQ ID NO: 3 encoding the ⁇ 3 chain; 121-No. 3630 and nucleic acid residue No. 5 of SEQ ID NO: 5 encoding the ⁇ 2 chain.
  • 118-No. Primers can be designed based on the base sequence of 3696, and can be produced by amplifying a target sequence by polymerase chain reaction (PCR) using an appropriate cDNA library as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a DNA encoding each chain gene of laminin 5 is incorporated into an appropriate vector, and this is introduced into either a eukaryotic or prokaryotic cell using an expression vector that can be expressed in each host.
  • the desired protein can be obtained by expressing the chain.
  • Host cells that can be used to express laminin 5 are not particularly limited, and prokaryotic host cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic hosts such as yeast, fungi, insect cells, and mammalian cells. Can be mentioned.
  • a vector constructed to express laminin 5 is introduced into the above host cell by transformation, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, particle gun technology, calcium phosphate precipitation, direct microinjection, etc. Can do.
  • a laminin-5 protein can be obtained by growing a cell containing the vector in an appropriate medium to produce the laminin-5 protein used in the present invention and purifying it from the cell or the medium. Purification can be performed using size exclusion chromatography, HPLC, ion exchange chromatography, immunoaffinity chromatography, and the like.
  • Laminin 5 is described in detail in JP-A No. 2001-172196, and is incorporated herein.
  • laminin is a heterotrimeric molecule in which ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain are linked by disulfide bonds, respectively, and has a characteristic cross structure. Each chain consists of multiple domains, and domains I and II form a triple helix.
  • laminin molecules Prior to this application, at least 15 laminin molecules were identified by different combinations of 5 types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 5), 3 types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 3), and 3 types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 3). It has been suggested that there are actually several times as many types.
  • Laminin 1 which is a typical laminin, is a heterotrimeric molecule composed of ⁇ 1, ⁇ 1, and ⁇ 1, and laminin 5 used in the present application is composed of ⁇ 3, ⁇ 3, and ⁇ 2.
  • laminin 5 used in the present application is composed of ⁇ 3, ⁇ 3, and ⁇ 2.
  • the homology of the polypeptide chain of laminin 1 and laminin 5 is analyzed with software such as Genetyx, the homology between ⁇ 1 and ⁇ 3 is 42%, the homology between ⁇ 1 and ⁇ 3 is 41%, and the homology between ⁇ 1 and ⁇ 2 is 54%.
  • laminin 1 and laminin 5 are respectively ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ encoded by three different genes ( ⁇ 1, ⁇ 1, ⁇ 1) and ( ⁇ 3, ⁇ 3, ⁇ 2).
  • vitronectin which is another extracellular matrix
  • laminin 2 which is another laminin isoform
  • Polypeptides The present invention is characterized in that various Lm5 activities are increased by using a specific polypeptide in cell culture in a cell culture system containing Lm5.
  • Polypeptides include serum, serum albumin, prealbumin, immunoglobulin, ⁇ -globulin, ⁇ -globulin, ⁇ 1-antitrypsin ( ⁇ 1-AT), heptoglobin (Hp), ⁇ 2-macroglobulin ( ⁇ 2-M), ⁇ -Selected from the group consisting of blood proteins other than extracellular matrix proteins which are fetoprotein (AFP), transferrin, retinol binding protein (RBP) or adiponectin, as well as gelatin, a protein belonging to the tumor necrosis factor (TNF) family, peptone Is done.
  • AFP fetoprotein
  • RBP retinol binding protein
  • TNF tumor necrosis factor
  • blood protein in the present invention, blood protein, more preferably blood protein other than extracellular matrix protein, is used together with laminin-5 protein.
  • the blood protein is preferably serum, serum albumin, prealbumin, immunoglobulin, ⁇ -globulin, ⁇ -globulin, ⁇ 1-antitrypsin ( ⁇ 1-AT), heptoglobin (Hp), ⁇ 2-macroglobulin ( ⁇ 2-M ), ⁇ -fetoprotein (AFP), transferrin, retinol binding protein (RBP) or adiponectin.
  • ⁇ 1-AT heptoglobin
  • Hp heptoglobin
  • ⁇ 2-M ⁇ 2-macroglobulin
  • AFP transferrin
  • RBP retinol binding protein
  • adiponectin adiponectin
  • Extracellular matrix is a substance that fills the extracellular space and at the same time has a skeletal role (eg animal cartilage and bone), a role of scaffold in cell adhesion (eg basement membrane and fibronectin), cell proliferation It plays the role of holding and providing factors (eg, cell growth factor FGF that binds to heparan sulfate). It can be said that many of the individual cells constituting a multicellular organism live in a bed or nest of an extracellular matrix. Conspicuous components in the extracellular matrix of vertebrates including humans are glycoproteins (partially cell adhesion molecules) such as collagen, proteoglycan, fibronectin and laminin. “Extracellular matrix protein” means a protein constituting such an extracellular matrix.
  • blood protein other than extracellular matrix protein means a protein other than extracellular matrix protein involved in cell adhesion among blood proteins. These are all known proteins and can be appropriately obtained by those skilled in the art.
  • Bood proteins other than extracellular matrix proteins are not limited, but preferably human serum albumin (available from HSA / eg, Nacalai), recombinant human serum albumin (rHSA / eg, from SIGMA) Available), or bovine serum albumin (BSA / available from SIGMA, for example).
  • human serum albumin available from HSA / eg, Nacalai
  • rHSA / eg, from SIGMA recombinant human serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • the “blood protein other than extracellular matrix protein” may alternatively be an immunoglobulin.
  • Immunoglobulins are well known to those skilled in the art and include IgG, IgA, IgM, IgD, IgE and the like.
  • human immunoglobulin IgG / for example, available from Oriental Yeast Co., Ltd. can be used.
  • Gelatin Gelatin is extracted by applying heat to collagen, which is the main component of connective tissue such as animal skin, bones, and tendons, and contains protein as the main component.
  • TNF Tumor necrosis factor
  • TNF Tumor necrosis factor
  • LT lymphphotoxin
  • the “protein belonging to the TNF family” includes at least 19 kinds of molecules such as receptor activator NFkB ligand (RANKL), Fas ligand, CD40 ligand and the like.
  • a receptor activator NF B ligand (RANKL)
  • B ligand B ligand
  • Peptone “Peptone” is obtained by degrading a protein with a proteolytic enzyme. In vivo, proteins are digested by pepsin in the stomach into peptone, and further digested to amino acids by pancreatic juice secreted by the pancreas and intestinal juice secreted by the jejunum.
  • Peptone as a nutrient source of this medium is a protein hydrolyzed to amino acids and low molecular weight peptides.
  • protein from milk milk casein
  • protes such as pancreatin extracted from porcine pancreas are used
  • peptone is preferably derived from a plant.
  • it is selected from the group consisting of cottonseed-derived peptone, soybean-derived peptone, wheat-derived peptone and pea-derived peptone.
  • Cells The type and origin of cells cultured in the method of the present invention are not particularly limited.
  • the pluripotent stem cells are selected from embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, embryonic germ cells, or germ stem cells.
  • the tissue stem cells are selected from mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, neural stem cells, skin stem cells, or hematopoietic stem cells.
  • the somatic cells are hepatocytes, pancreatic cells, muscle cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, adipocytes, skin cells, fibroblasts, pancreatic cells, kidney cells, lung cells, or , Lymphocytes, erythrocytes, leukocytes, monocytes, macrophages or megakaryocyte blood cells.
  • the biological species from which the cells are derived is not particularly limited. Preferably, it is derived from mammals such as mice, rats, humans, monkeys, pigs, dogs, sheep, goats, and birds such as chickens. More preferably, it is derived from a species selected from the group consisting of mouse, rat and human.
  • pluripotent stem cell is intended to be a generic term for stem cells having the ability to differentiate into cells of any tissue (differentiation pluripotency). In the examples described later in this specification, examination is performed using ES cells (EB3 cells).
  • ES cells EB3 cells
  • pluripotent stem cells that can be used in the method of the present invention are not limited to embryonic stem cells, but also mammalian cells. Examples include all pluripotent stem cells having traits similar to embryonic stem cells derived from adult organ and tissue cells, bone marrow cells, blood cells, and embryonic and fetal cells.
  • embryonic stem cells traits similar to embryonic stem cells are specific to embryonic stem cells, such as the expression of genes specific to embryonic stem cells and the ability to differentiate into all germ layers of endoderm, mesoderm, and ectoderm. It can be defined with cell biological properties.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • GS cells germ stem cells
  • ES cells and iPS cells are preferred as the pluripotent stem cells in the present invention.
  • iPS cells are particularly preferred for reasons such as no ethical problems.
  • Any known pluripotent stem cell can be used.
  • the pluripotent stem cell described in International Publication WO2009 / 123349 (PCT / JP2009 / 057041) can be used.
  • tissue stem cell means a stem cell that has the ability to differentiate into various cell types (differentiated pluripotency) although the cell line that can be differentiated is limited to a specific tissue. For example, hematopoietic stem cells in the bone marrow become blood cells, and neural stem cells differentiate into nerve cells. In addition, there are various types such as liver stem cells that make the liver and skin stem cells that become skin tissue.
  • Somatic cells refers to cells other than germ cells among the cells constituting multicellular organisms. In sexual reproduction, it is not passed on to the next generation. In the present specification, it means various cells other than “pluripotent stem cells” and “tissue stem cells”.
  • system containing laminin 5 cells are cultured in a system containing laminin 5.
  • the “system containing laminin 5” means that laminin 5 is included in some form in the cell culture system, and its mode is not particularly limited.
  • the “cell culture container” is not particularly limited, and any material and container of any shape that is sterilized to prevent bacterial contamination and suitable for culturing cells is used. be able to.
  • Examples of such culture containers include culture dishes, culture flasks, culture petri dishes, 96-well, 48-well, 12-well, 6-well, 4-well, etc., commonly used in this technical field. Examples thereof include, but are not limited to, plates and culture bottles.
  • laminin 5 and a polypeptide are used in cell culture.
  • the surface of the cell culture vessel is subjected to a treatment such as immobilizing (coating) laminin 5 and the polypeptide.
  • a treatment such as immobilizing (coating) laminin 5 and the polypeptide.
  • a processing technique for immobilizing laminin on the surface of a culture container is known in the art, and those skilled in the art will employ any culture container according to the purpose of the present invention and treat the container with laminin 5 and polypeptide.
  • the container can be used for culturing cells by the method of the present invention.
  • the amount of laminin 5 used for processing the cell culture container is not particularly limited. Preferably, good results are obtained when treated with a laminin 5 solution of 0.01 ⁇ g / ml or more, preferably 0.1 to 15 ⁇ g / ml, more preferably 0.1 ⁇ g / ml-2 ⁇ g / ml.
  • the culture container may be treated with laminin 5 by applying laminin 5 to the inner surface of the culture container and then drying.
  • a culture medium generally used for culturing cells such as GMEM (GIBCO) and DMEM is placed in a culture container treated with laminin 5, and pluripotent stem cells are added to the culture medium.
  • the cells are then cultured under known appropriate culture conditions, such as, but not limited to, 37 ° C., 5% carbon dioxide gas layer conditions.
  • the cell culture vessel is preferably treated (coated) with laminin 5 and polypeptide.
  • the order in which the cell culture vessel is treated is not particularly limited, but is preferably treated with laminin 5 after treating with the polypeptide or simultaneously with the polypeptide and laminin.
  • the present invention also provides a composition for coating a cell culture container or a cell culture container coating agent comprising the aforementioned polypeptide.
  • the composition or agent of the present invention may contain laminin 5 simultaneously with the polypeptide.
  • the present invention further provides a kit comprising a cell culture medium containing the aforementioned polypeptide.
  • a kit comprising a cell culture medium comprising the aforementioned polypeptide and laminin 5 is also provided.
  • the kit of the present invention may further contain a precoat culture dish, a precoat culture plate, and the like.
  • the present invention and the composition, agent and kit can be used in a method for culturing cells in a system containing laminin 5.
  • the amount of polypeptide used is not particularly limited. Those skilled in the art can appropriately select an appropriate amount depending on factors such as the type of polypeptide used.
  • the polypeptide is used at a concentration between 1 ⁇ g / ml and 200 ⁇ g / ml when using blood proteins such as HSA, BSA, HS, IgG in Example 1. It has proved particularly preferred when used at a concentration between 3.125 ⁇ g / ml and 12.5 ⁇ g / ml.
  • laminin 5 showed an effect of increasing cell activity when used at a higher concentration, preferably 15.6 ⁇ g / ml to 1000 ⁇ g / ml.
  • two or more polypeptides are included in the cell culture system.
  • rHSA and IgG are used in combination as polypeptides, even when the concentrations are low enough (0.25 ⁇ g / ml) that they cannot be confirmed when each is used alone, both are used together.
  • RHSA 10 ⁇ g / ml the same strong adhesive activity increasing effect was observed. Therefore, it is considered that a synergistic effect is obtained instead of an additive effect by using two or more kinds of polypeptides together.
  • laminin 5 protein various activities exhibited by laminin 5 protein in cell culture are increased in combination with a polypeptide.
  • the effects of laminin 5 protein include, but are not limited to, cell adhesion activity, cell dispersion activity, wound healing activity, growth promoting activity, undifferentiation maintenance activity and pluripotency maintenance activity.
  • Cell adhesion activity means the effect of adhering cells.
  • HSA HSA in combination with rLm5 (0.125 ⁇ g / ml)
  • an adhesive activity equivalent to rLm5 (2 ⁇ g / ml) was obtained.
  • the adhesive activity equivalent to rLm5 (2 ⁇ g / ml) was obtained by using HSA in combination with rLm5 (0.5 ⁇ g / ml). Therefore, the use of the polypeptide in the present invention preferably increases the cell adhesion activity by 1.2 times or more, more preferably by 4 times or more, and most preferably by 8 times or more, compared with the case where the polypeptide is not used.
  • Cell dispersal activity means the effect of dispersing cells.
  • the use of the polypeptide preferably increases the cell dispersion activity more than twice as compared to the case where the polypeptide is not used.
  • “Wound healing activity” means the effect of healing a wound. That is, by applying laminin 5 or the like to a portion where the cell has been physically damaged due to trauma, for example, laminin 5 or the like is applied to allow the cell to migrate from around to the applied portion. The effect of healing the wound can be confirmed by, for example, measuring the width of the wound after a certain period of time (for example, after 16 hours) after being damaged. In Example 5, the wound healing rate increased from 60% to 80% by using a polypeptide (rHSA) in addition to human laminin 5.
  • rHSA polypeptide
  • “Proliferation promoting activity” means an effect of promoting cell proliferation.
  • the effect of cell proliferation can be confirmed by measuring the number of cells after a certain period of time has passed since the cells were run.
  • Undifferentiated maintenance activity means that when the cells to be cultured are undifferentiated cells such as pluripotent stem cells and tissue stem cells, the undifferentiated state is maintained. When these cells are cultured with laminin 5, the differentiation of the cells does not proceed and the undifferentiated state is maintained. In the present invention, it was confirmed that the undifferentiated state was maintained even when laminin 5 and the polypeptide were used in combination (Example 7, FIG. 25). For example, by measuring an undifferentiated marker such as Sox2, Nanog, Oct4, it is possible to evaluate whether tissue stem cells are differentiated during culture.
  • an undifferentiated marker such as Sox2, Nanog, Oct4
  • the “pluripotency maintenance activity” means to maintain the pluripotency when the cultured cell is a pluripotent cell, for example, a pluripotent stem cell.
  • pluripotency is maintained even when laminin 5 and a polypeptide are used in combination.
  • Example 1 Preparation of Recombinant Human Laminin 5 (rLm5)
  • recombinant human laminin 5 protein was prepared according to a known method.
  • a serum-free culture supernatant collected from human fetal kidney cell line HEK293 (Lm5-HEK293) into which cDNAs of ⁇ 3 chain (SEQ ID NO: 1), ⁇ 3 chain (SEQ ID NO: 3), and ⁇ 2 chain (SEQ ID NO: 3) were introduced was 4 ° C. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 5 minutes.
  • the human fetal kidney cell line HEK293 is described in J. Org. Biochem. 132, 607-612 (2002). Subsequently, it was applied to Heparin Sepharose CL-6B (GE healthcare) and eluted.
  • the rLm5-containing fraction was passed through an antibody column in which a mouse anti-Lm- ⁇ 3 (anti-laminin ⁇ 3) monoclonal antibody (BG5) was covalently bound to Protein A Sepharose CL-6B (GE healthcare), and then eluted.
  • the monoclonal antibody BG5 is an antibody prepared by the present inventors according to a known monoclonal antibody production method using a laminin ⁇ 3B chain N-terminal fragment as an antigen.
  • FIG. 1 shows a photograph of the result of SDS polyacrylamide gel electrophoresis for purified rLm5.
  • the purity of the purified rLm5 was about 98%.
  • RLm5 prepared in this way was used in the following examples.
  • Example 2 Cell Adhesion Assay This example shows the results of an adhesion assay when various additives are added to rLm5 and rLm5.
  • rat liver cell line BRL
  • mouse ES cell line EB3
  • human sarcoma cell line HT1080
  • human mesenchymal stem cell hMSC
  • BRL was provided by Department of Genome Systems Science, graduate School of Life Nanosystem Science, Yokohama City University.
  • EB3 was provided by the Department of Stem Cell Control, Department of Molecular Medicine, Department of Future Medical Development, graduate School of Medicine, Osaka University.
  • HT1080 was obtained from RIKEN BioResource Center (RCB1956).
  • hMSC was obtained from LONZA.
  • BRL is DMEM / F12 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS)
  • EB3 is 10% FBS
  • 0.1 mM non-essential amino acid (Gibco) 1 mM sodium pyruvate (Gibco)
  • 1000 U / ml ESGRO Millipore
  • 10-4 M 2-mercaptoethanol (WAKO) added GMEM (GIBCO)
  • HT1080 used 10% FBS added MEM (SIGMA), and hMSC MSCGM (LONZA).
  • a serum-free medium obtained by removing serum from these media was used.
  • a 96-well plate (Corning) was treated with rLm5 prepared at a concentration of 37 ° C. for 2 hours or overnight at 4 ° C., the treated surface was washed with PBS ( ⁇ ), and then washed with 1.2% BSA (SIGMA) solution at 37 ° C. The blocking treatment was performed for 1 hour.
  • Treatment with rLm5 is optionally performed with human serum albumin (HSA / Nacalai), recombinant human serum albumin (rHSA / SIGMA), human serum (HS / OYC), bovine serum albumin (BSA / SIGMA), human immunoglobulin (IgG / OYC), bovine gelatin (Gl / SIGMA), recombinant human receptor activator of NF- ⁇ B ligand (sRANKL / OYC), cottonseed-derived peptone (Pep / DMV), glycine (Gly / Nacalai), arginine (Arg / Nacala ), Trehalose (Tre / SIGMA), xylose (Xyl / Wako), mannose (Man / Wako), and lactose (Lac / Wako).
  • HSA / Nacalai human serum albumin
  • rHSA / SIGMA recombinant human serum albumin
  • FIGS. 2 to 11 show the results of the adhesion assay using BRL
  • FIG. 12 shows the results of the adhesion assay using HT1080
  • FIG. 13 shows the results of the adhesion assay using hMSC
  • FIGS. 14 and 15 use EB3. The result of an adhesion assay is shown.
  • the adhesion activity of rLm5 can be increased for various cells by treatment with a polypeptide or a peptide.
  • the polypeptide concentration at the time of combination is optimal from 3.125 to 12.5 ⁇ g / ml, and the method of combination may not be simultaneous, and sufficient rLm5 activity can be obtained by pretreatment. It turns out that it can be raised.
  • Example 3 Examination of activity increasing action in other extracellular matrix protein and laminin isoform
  • human vitronectin Vn / SIGMA
  • human laminin 2 Lm2 / Millipore
  • the assay was performed according to the method described in Example 2.
  • FIG. 16 shows the results of an adhesion assay when 10 ⁇ g / ml HSA is used in combination with FIG. 17 and 10 ⁇ g / ml rHSA is used in combination.
  • no activity-increasing action by using HSA or rHSA in combination with rNm5 was observed with Vn or Lm2. From the above, it was found that the activity-increasing action is not a phenomenon that occurs in all extracellular matrix proteins, and is not a common phenomenon that occurs in any isoform, even laminin.
  • Example 4 Cell dispersion assay using BRL cells
  • BRL was provided by the Department of Genome System Science, graduate School of Life Nanosystem Science, Yokohama City University.
  • BRL cells were cultured and grown using DMEM / F12 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). However, in the cell dispersion assay, DMEM / F12 medium supplemented with 1% FBS was used.
  • FBS fetal bovine serum
  • a 24-well plate (Nunc) was treated with rLm5 prepared at a concentration at 4 ° C. overnight, and the treated surface was washed with PBS ( ⁇ ), followed by blocking with 1% BSA (SIGMA) solution at 37 ° C. for 1 hour. .
  • the rLm5 treatment was performed by mixing rHSA as necessary. After washing the rLm5-treated surface with PBS ( ⁇ ), the cells were washed with 1% FBS medium, seeded at 7000 cells / well, and then seeded at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air under aerobic conditions. Time culture was performed.
  • the cells with weak adhesion were suspended from the plate surface by shaking lightly with a vortex mixer, and the cells were removed by percoll treatment. Adhered cells were fixed with 25% glutaraldehyde, and pictures of three random fields were taken to count the number of single cells.
  • Example 5 Wound healing assay using BRL cells
  • BRL was provided by the Department of Genome System Science, graduate School of Life Nanosystem Science, Yokohama City University.
  • BRL was cultured and grown using DMEM / F12 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • a medium supplemented with a serum-free medium obtained by removing serum from the medium was used in addition to the above medium.
  • Cells were seeded on a 24-well plate (Nunc) at 160000 cells / well in 10% FBS medium, and cultured for 3 hours at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air. After culturing, the adherent cell population in each well was washed twice with a serum-free medium in which a fixed width was scratched using a blue chip and serum was removed. Each well was treated with rLm5 adjusted in serum-free medium at 37 ° C. for 1 hour. The rLm5 treatment was performed by mixing rHSA as necessary. After the rLm5 treatment, the treated surface was washed twice with a serum-free medium excluding serum, and a serum-free medium was added.
  • FIG. 20 shows the results of the wound healing rate obtained. When rHSA was added to Lm5, a significant increase in wound healing activity was observed.
  • Example 6 Proliferation Assay Using Human Mesenchymal Stem Cells This example shows the results of a proliferation assay using hMSC when various cell support materials are used.
  • medium (P) supplemented with 5% Panexin (PAN-biotech) and medium (P + F) supplemented with 5% Panexin and 1 ng / ml bFGF (Wako Pure Chemical) were used instead of 10% FBS.
  • a maintenance medium (Serum) containing 10% FBS was also used.
  • a 6-well plate (NUNC) treated with various extracellular matrix proteins whose concentrations were adjusted was seeded with 38400 cells / well of hMSC replaced with each medium. The cells were cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air for 10 days, and after 3 days, 7 days, and 10 days, the cells were collected by enzyme treatment, and the number of cells was counted with a hemocytometer. .
  • the cell support material was prepared by adding 10 ⁇ g / ml rHSA to 1 mg / ml rLm5, 0.2 ⁇ g / ml rLm5, 0.2 ⁇ g / ml rLm5, respectively.
  • FIG. 22 shows the results of examining the influence of hMSC on proliferation under each culture condition.
  • rHSA was added to 0.2 ⁇ g / ml rLm5
  • a significant increase in cell proliferation was observed.
  • polypeptides including rHSA is active not only for cell adhesion activity, cell dispersion activity, and wound healing activity, but also for proliferation promoting activity of mesenchymal stem cells already reported as rLm5 activity. A rising action was observed. From this, it was predicted that the combined use of polypeptides including rHSA can increase all the activities of rLm5.
  • Example 7 Proliferation Assay Using EB3
  • the results of a proliferation assay using EB3 when rLm5 is used as a cell support material are shown.
  • a maintenance medium for EB3 As a maintenance medium for EB3, a medium (KSR-GMEM) supplemented with 10% Knockout TM serum replacement additive (KSR) (Invitrogen) was used instead of the growth medium 10% FBS described in Example 2.
  • KSR-GMEM a medium supplemented with 10% Knockout TM serum replacement additive
  • FBS FBS described in Example 2.
  • EB3 was seeded at 43000 cells / well in a 12-well plate (NUNC) treated with various extracellular matrix proteins whose concentrations were adjusted. After culturing at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air for 2 days, cells were collected by enzyme treatment, and the number of cells was counted with a hemocytometer.
  • EB3 was seeded at 43,000 cells / well in a 12-well plate treated with rLm5 adjusted in concentration. By repeating this operation, the proliferation effect of rLm5 under each condition for EB3 was compared.
  • rLm5 was obtained by adding 3.125 ⁇ g / ml rHSA to 2 ⁇ g / ml (L (2)), 0.2 ⁇ g / ml (L (0.2)), 0.2 ⁇ g / ml rLm5 (L (0 .2) + H (3.125)) and 0.2 ⁇ g / ml rLm5 plus 12.5 ⁇ g / ml rHSA (L (0.2) + H (12.5)).
  • FIG. 23 shows the results of calculating how many times the theoretical growth finally occurred when EB3 was passaged 5 times under each culture condition. From the results of FIG. 23, in the experimental group in which rHSA was added to 0.2 ⁇ g / ml rLm5 compared to 0.2 ⁇ g / ml rLm5 alone, cell proliferation about 3 times was observed, and 2 ⁇ g / ml rLm5 was used. It was equivalent to the case.
  • Example 8 Proliferation assay using EB3 and detection of undifferentiated marker
  • the results of proliferation assay using EB3 and the results of detection of undifferentiated markers by RT-PCR when various cell support materials are used are shown. .
  • the number of cells seeded in the proliferation assay of EB3 and the passage interval were the same as in Example 7.
  • the growth medium (S) and KSR-GMEM (K) described in Example 2 were used for the growth assay.
  • various extracellular matrix proteins treated in a 12-well plate were 1 mg / ml Gl, 0.05 ⁇ g / ml rLm5 (L0.05), 0.05 ⁇ g / ml rLm5 and 12.5 ⁇ g / ml rHSA. What was added (L0.05 + H12.5) was used.
  • FIG. 24 shows the result of calculating how many times the theoretical growth finally occurred when EB3 was passaged three times under each culture condition. From the results shown in FIG. 24, growth was stopped in the middle only with 0.05 ⁇ g / ml rLm5, whereas growth was observed in the experimental group in which rHSA was added to 0.05 ⁇ g / ml rLm5.
  • the denaturation reaction of each gene was performed at 94 ° C. for 30 seconds, the annealing reaction for 30 seconds, and the extension reaction at 72 ° C. for 20 seconds.
  • the annealing reaction was performed at a temperature of 61 ° C for Oct4 and 54 ° C for Sox2 and Nanog.
  • FIG. 25 shows the results of detection of undifferentiated markers by RT-PCR. From the result of FIG. 25, it was found that three undifferentiated markers were expressed in K + L (0.05) + H (12.5) as in S + Gl. This suggests that EB3 maintains undifferentiated properties even when rHSA is used in combination with rLm5.

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Abstract

　本発明は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法を提供することを目的とする。　本発明の方法は、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドを培養系に含むことを特徴とする。

Description

ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法
　本発明は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に関する。
　ラミニンは様々な組織の基底膜に主として局在し、組織構造の維持及び細胞機能の制御において重要な役割を果たす細胞外マトリックスタンパク質である（Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，１８：１９－２８，１９９９；Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３－２３４，２０００）。
　ラミニンの構造としては、α鎖、β鎖、γ鎖がそれぞれジスルフィド結合で連結されたヘテロ３量体分子であり、特徴的な十字架構造をとる。各鎖は複数のドメインからなり、ドメインＩおよびＩＩはトリプルへリックスを形成している。本出願前に、ラミニン分子は５種類のα鎖（α１ないしα５）、３種類のβ鎖（β１ないしβ３）、３種類のγ鎖（γ１ないしγ３）の異なる組み合わせによって、少なくとも１５種類が同定されており、実際にはその数倍の種類が存在することが示唆されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ．，　９７，９１－９８，　２００６；Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８,２１３－２３４，２０００；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：６５１７－６５２８，２０００；Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｖ．８５，９７９－１０００，２００５）。これらα、β、γ鎖はそれぞれ異なる遺伝子によってコードされており、それぞれのラミニンアイソフォームは特有の存在部位や機能があり、主に細胞膜受容体インテグリンを介して細胞接着、増殖、運動、分化などを調節している（Ｄｅｖ.Ｄｙｎ．２１８，　２１３－２３４，２０００；Ｐｈｙｓｉｏｌ.  Ｒｅｖ．８５，９７９－１０００，２００５）。
　例えば、生体内ではα２鎖は筋肉や神経組織を中心に存在しているのに対して、α３鎖は皮膚組織を中心に存在している。それぞれの機能も異なり、α２鎖の遺伝子異常は筋ジストロフィーを引き起こすのに対して、α３鎖の遺伝子異常は接合部型表皮水疱症という重篤な症状を引き起こす（Ｄｅｖ.Ｄｙｎ．２１８，　２１３－２３４，２０００）。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験においても、全く異なる機能を示す。α２鎖を構成鎖として持つラミニン２やラミニン４は間葉系幹細胞に対して接着活性をほとんど示さないのに対して、α３鎖を構成鎖として持つラミニン５は非常に強い接着活性を示す（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２４，２３４６－２３５４，２００６）。このように各ラミニンアイソフォームを構成するα、β、γ鎖が異なると機能や活性も全く異なってくる。
　表１に１５種類のラミニン分子種とそのサブユニット構成を示す。
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　ラミニン分子は、３本鎖のアミノ（Ｎ）末端部分（短腕）で互いに会合したり、他のマトリックス分子と会合して、基底膜を構築する。一方、α鎖のカルボキシ（Ｃ）末端には５つの相同な球状ドメイン（Ｇ１―Ｇ５ドメインまたはＬＧ１―ＬＧ５）が存在し、主にこの部分でインテグリンやその他のリセプターと結合する。
　ラミニン５
　ラミニン５（カリニン、エピリグリン、ナイセイン、ラドシンとも呼ばれる）はα３鎖、β３鎖、γ２鎖からなるラミニンアイソフォームの一つであり、複数の研究機関で別々の経緯で発見された（Ｊ.  Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１４，　５６７－５７６，１９９１；Ｃｅｌｌ　６５，５９９－６１０，１９９１；Ｊ.  Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１，７３８－７４３，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７－１１７７１，１９９３）。
　ラミニン５は各種細胞に対して強い細胞接着活性、細胞分散活性、細胞増殖活性等を示すことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７－１１７７１，１９９３；Ｊ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２－８６９，１９９４；Ｊ.  Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１２５，２０５－２１４，１９９４；Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.Ｃｅｌｌ．１６，８８１－８９０，２００５；Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２４，２３４６－２３５４，２００６）。国際公開ＷＯ２００７／０２３８７５は、ラミニン５を利用した間葉系幹細胞の培養技術を記載している。
　しかしながら、各種細胞の培養においてラミニン５の種々の活性を一般に上昇させる効率的な方法は、本願発明前には得られていなかった。
国際公開ＷＯ２００７／０２３８７５ 国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９
Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，１８：１９－２８，１９９９ Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３－２３４，２０００ Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ．，　９７，９１－９８，　２００６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：６　５１７－６５２８，２０００ Ｐｈｙｓｉｏｌ.  Ｒｅｖ．８５，９７９－１０００，２００５ Ｊ.  Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１４，　５６７－５７６，１９９１ Ｃｅｌｌ．６５，５９９－６１０，１９９１ Ｊ.  Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１，　７３８－７４３，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７－１１７７１，１９９３ Ｊ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２－８６９，１９９４ Ｊ.  Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１２５，２０５－２１４，１９９４ Ｍｏｌ.  Ｂｉｏｌ.  Ｃｅｌｌ．１６，８８１－８９０，２００５ Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２４，２３４６－２３５４，２００６ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：ｐ．２８８－２９２，１９９４ Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１１２，　１－１０，　１９９９ Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　３１０，　２５６－２６９，　２００５ Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１１９，　３２０６－３２１８，　２００６
　本発明は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、ラミニン５の活性を上昇させる技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、特定のポリペプチドをラミニン５とともに併用するとラミニン５の様々な活性が上昇することを見いだし本発明を想到した。
　本発明は、好ましい態様として以下の態様を含む。
［態様１］
　ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、
　血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドを培養系に含むことを特徴とする前記方法。
［態様２］
　腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質が、受容体活性化因子ＮＦ(Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）である、態様１に記載の方法。
［態様３］
　ペプトンが、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトン及びエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様４］
　細胞培養容器を、ポリペプチドで処理した後にラミニン５で処理する、あるいは、ポリペプチドとラミニンで同時に処理する、態様１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
　細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性からなる群から選択される、ラミニン５の細胞に対する活性が上昇する、態様１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］
　細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
　多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択され；
　組織幹細胞が、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択され；あるいは、
　体細胞が、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される、
態様６に記載の方法。
［態様８］
　細胞が、マウス、ラット及びヒトからなる群から選択される種に由来する、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
　ポリペプチドを１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
　ポリペプチドを３．１２５μｇ／ｍｌないし１２．５μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
　２種類以上のポリペプチドを細胞培養系に含ませる、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
　血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド
を含む、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用するための組成物。
［態様１３］
　さらにラミニン５を含む、態様１２に記載の組成物。
［態様１４］
　血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド
を含む、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用するための、キット。
［態様１５］
　さらにラミニン５を含む、態様１４に記載のキット。
　本発明において、ラミニン５と特定のポリペプチドを併用することにより、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性からなる群から選択される、ラミニン５の細胞に対する活性が上昇する。
図１は、精製した組換えヒトラミニン５をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した図である。なお図１の右レーンが、１μｇの組換えヒトラミニン５を電気泳動した結果である。 図２は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々の血中タンパク質が、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に及ぼす効果を示した図である。図２Ａ－Ｄは、各々ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清（ＨＳ）およびＩｇＧの図に示した各濃度（０－８００μｇ／ｍｌ）の結果を示す。 図３は、横軸に示した各濃度（０－２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、ＨＳＡの至適濃度を調べた結果を示す。
　図３Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　０．７８１２５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　３．１２５μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　図３Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　５０μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　２００μｇ／ｍｌ
図４は、横軸に示した各濃度（０－２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
　図４Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　０．７８１２５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　３．１２５μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　図４Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　５０μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　２００μｇ／ｍｌ
図５は、横軸に示した各濃度（０－２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、ゼラチン（Ｇｅｌ）、ｓＲＡＮＫＬおよびペプトン（Ｐｅｐ）の効果を調べた結果を示す。
　図５Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋Ｇｅｌ　１０μｇ／ｍｌ
　図５Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｓＲＡＮＫＬ　５０μｇ／ｍｌ
　図５Ｃ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ　１０μｇ／ｍｌ
図６は、横軸に示した各濃度（０－２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、Ｐｅｐの各濃度における効果を調べた結果を示す。
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ
　白菱形印、　組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ　１５．６μｇ／ｍｌ
　黒四角印、　組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ　６２．５μｇ／ｍｌ
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ　２５０μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ　１０００μｇ／ｍｌ
図７は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々の糖類が、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に効果を及ぼすかを調べた結果を示した図である。図７Ａ－Ｄは、各々キシロース（Ｘｙｌ）、トレハロース（Ｔｒｅ）、マンノース（Ｍａｎ）およびラクトース（Ｌａｃ）の図に示した各濃度（０－１０μｇ／ｍｌ）の結果を示す。 図８は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々の糖類がより高濃度において、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に影響を及ぼすかを調べた結果を示した図である。図８Ａは、１００μｇ／ｍｌのＴｒｅおよびＭａｎの結果を示す。図８Ｂは、１００μｇ／ｍｌのＸｙｌおよびＬａｃの結果を示す。 図９は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々のアミノ酸が、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に効果を及ぼすかを調べた結果を示した図である。
　図９Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋グリシン（Ｇｌｙ）　１０μｇ／ｍｌ
　薄黒三角印、　組換えヒトラミニン５＋Ｇｌｙ　１００μｇ／ｍｌ
　黒三角印、　組換えヒトラミニン５＋Ｇｌｙ　１０００μｇ／ｍｌ
　図９Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋アルギニン（Ａｒｇ）　１０μｇ／ｍｌ
　薄黒三角印、　組換えヒトラミニン５＋Ａｒｇ　１００μｇ／ｍｌ
　黒三角印、　組換えヒトラミニン５＋Ａｒｇ　１０００μｇ／ｍｌ
図１０は、２種類の血中タンパク質を用いた場合の、組換えヒトラミニン５の細胞接着活性に及ぼす相乗効果を示した図である。横軸に示した各血中タンパク質を各々示した濃度で使用した。 図１１は、細胞培養器を処理する順番を検討した結果を示す。組換えヒトラミニン５は、横軸に示した濃度（０－２μｇ／ｍｌ）使用した。
　黒菱形印、　ｒＬｍ５のみ
　白四角印、　細胞培養プレートをｒＨＳＡで処理した後にｒＬｍ５で処理（ｒＨＳＡ→ｒＬｍ５）
　白三角印、　細胞培養プレートをｒＨＳＡとｒＬｍ５で同時に処理（ｒＬｍ５＋ｒＨＳＡ）
　バツ印、　細胞培養プレートをｒＬｍ５で処理した後にｒＨＳＡで処理（ｒＬｍ５→ｒＨＳＡ）
図１２は、横軸に示した各濃度（０－２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＨＴ１０８０細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
　図１２Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　０．７８１２５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　３．１２５μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　図１２Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　５０μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　２００μｇ／ｍｌ
図１３は、横軸に示した各濃度（０－２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
　図１３Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　０．７８１２５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　３．１２５μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　図１３Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　５０μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　２００μｇ／ｍｌ
図１４は、横軸に示した各濃度（０－１６μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＥＢ３細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
　図１４Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　０．７８１２５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　３．１２５μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　図１４Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白四角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　白三角印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　５０μｇ／ｍｌ
　バツ印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　２００μｇ／ｍｌ
図１５は、図に示した各濃度の組換えヒトラミニン５に、ｒＨＳＡ（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加した場合の、ＥＢ３細胞の接着分析後の細胞形態を示す写真である。左側がｒＨＳＡを使用しない場合（対照）、右側がｒＨＳＡを使用した場合である。 図１６は、ＨＳＡがヒトラミニン５以外の他のラミニンアイソフォームに対しても、ラミニン５と同様に細胞接着活性上昇効果が認められるかを調べた結果を示した図である。ラミニン５（０－２μｇ／ｍｌ）は各々横軸に示した濃度を用いた。
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白菱形印、　組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
図１７は、ｒＨＳＡがヒトラミニン５以外の他の細胞外マトリックスタンパク質やラミニンアイソフォームに対しても、ラミニン５と同様に細胞接着活性に対する上昇効果が認められるかを調べた結果を示した図である。他の細胞外マトリックスタンパク質としてビトロネクチン（Ｖｎ／ＳＩＧＭＡ）、他のラミニンアイソフォームとしてラミニン２（Ｌｍ２／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。ラミニン５（０－２μｇ／ｍｌ）およびビトロネクチン（０－３２μｇ／ｍｌ）、Ｌｍ２(０－３２μｇ／ｍｌ)は各々横軸に示した濃度を用いた。
　図１７Ａ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白菱形印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
　黒丸印、　Ｖｎのみ（対照）
　白丸印、　Ｖｎ＋ｒＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
　図１７Ｂ
　黒菱形印、　組換えヒトラミニン５のみ（対照）
　白菱形印、　組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
　黒四角印、　Ｌｍ２のみ（対照）
　白四角印、　Ｌｍ２＋ｒＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
図１８は、横軸に示した各濃度（０－０．２μｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞分散活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示す。ｒＬｍ５の濃度が０．０２μｇ／ｍｌの際に特にｒＨＳＡによる活性の上昇効果が著しいことが観察された。 図１９は、各濃度（０－０．２μｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞分散活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した写真である。 図２０は、横軸に示した各濃度（０－０．１ｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する創傷治癒活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示す。ｒＬＭ５の濃度が０．０１２５－０．０５μｇ／ｍｌの際に特にｒＨＳＡによる活性の上昇効果が著しいことが観察された。 図２１は、各濃度（０－０．１ｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する創傷治癒活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した写真である。 図２２は、組換えヒトラミニン５のｈＭＢＣ細胞に対する増殖活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した図である。
　バツ印、　血清のみ　コートなし
　白四角印、　Ｐａｎｅｘｉｎ添加（Ｐ）
　黒三角印、　Ｐ／ｒＬｍ５　１μｇ／ｍｌ
　白三角印、　Ｐ＋Ｆ（ｂＦＧＦ）／コートなし
　白丸印、　Ｐ＋Ｆ／ｒＬｍ５　１μｇ／ｍｌ
　白菱形印、　Ｐ＋Ｆ／ｒＬｍ５　０．２μｇ／ｍｌ
　黒四角印、　Ｐ＋Ｆ／ｒＬｍ５　０．２μｇ／ｍｌ＋ｒＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌ
図２３は、組換えヒトラミニン５のＥＢ３細胞に対する増殖活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した図である。
　白菱形印、　Ｌｍ５（２μｇ／ｍｌ）
　黒四角印、　Ｌｍ５（０．２μｇ／ｍｌ）＋ｒＨＳＡ　１２．５μｇ／ｍｌ
　薄黒四角印、　Ｌｍ５（０．２μｇ／ｍｌ）＋ｒＨＳＡ　３．１２５μｇ／ｍｌ
　白四角印、　Ｌｍ５（０．２μｇ／ｍｌ）
図２４は、組換えヒトラミニン５のＥＢ３細胞に対する増殖活性について、各種細胞支持材料を用いた場合における、ｒＨＳＡの活性上昇効果を調べた結果を示した図である。
　黒丸印、　増殖培地（Ｓ）＋ウシゼラチン（Ｇ）
　黒四角印、　ＫＳＲ－ＧＭＥＭ（Ｋ）＋Ｌｍ５（Ｌ）（０．０５μｇ／ｍｌ）＋ｒＨＳＡ（Ｈ）　１２．５μｇ／ｍｌ）
　白四角印、　ＫＳＲ－ＧＭＥＭ（Ｋ）＋Ｌｍ５（Ｌ）（０．０５μｇ／ｍｌ）
図２５は、図２４で増殖の認められたＳ＋Ｇ及びＫ＋Ｌ（０．０５μｇ／ｍｌ）＋Ｈ（１２．５μｇ／ｍｌ）について、未分化マーカーの検出を行った結果を示した図である。
　本発明は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に関する。
　本発明の方法は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、
　血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドを培養系に含むことを特徴とする。
　ラミニン５
　本発明の方法は、多能性幹細胞の培養にあたり、ラミニン５を含んだ系で該多能性幹細胞を培養することを、最も顕著な特徴とする。
　ラミニン５は、多くの細胞種に対して、他のラミニンアイソフォームを含めた各種細胞外マトリックスタンパク質と比べて強い接着活性を示すことが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２－８６９，１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１２５，２０５－２１４，１９９４、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌｌ．１６，８８１－８９０，２００５）。
　表１に示されるようにラミニン５は、α３鎖、β３鎖、γ２鎖からなるラミニン分子であり、表皮の真皮への結合に中心的な役割を果たしており、殆どの細胞においてインテグリンα３β１に優先的に結合するが、細胞によってはインテグリンα６β１、α６β４にも結合する。ラミニン５におけるα３鎖Ｇ２ドメインのα３Ｇ２Ａ配列（ＲＥＲＦＮＩＳＴＰＡＦＲＧＣＭＫＮＬＫＫＴＳ）やＧ３ドメインのＫＲＤ配列がインテグリンに対する主要な結合部位であることが解明されている。
　またラミニン５は３量体として分泌された後、プロテアーゼによる限定分解を受けてα３鎖のＣ末端に存在するＧ４およびＧ５ドメインが除去され、１９０ｋＤａ（非切断型）から１６０ｋＤａ（切断型）へ変換されることが知られている。通常の方法で単離されるラミニン５にはＧ４、Ｇ５ドメインが存在しない。このようなα３鎖切断型ラミニン５は非切断型ラミニン５に比べて高い細胞接着促進活性、運動促進活性、および神経再生促進活性を有することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（２００５），１４３７０―１４３７７）。
　本発明のラミニン５は、特に限定されず、Ｇ４及びＧ５ドメインを含むままの非切断型であってもよく、あるいはＧ４及びＧ５ドメイン全体あるいはその一部が除去された切断型であってもよい。
　また、ラミニン５タンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性保持したまま１又はそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。また、本発明におけるラミニン５タンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明のラミニン５タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
　ラミニン５タンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。再生医療の材料を得る目的などでヒト多能性幹細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるという意味で、ヒト由来のラミニン５を用いることが好適である。
　本明細書中の配列表の配列番号１－６は、ヒトラミニン５のα３鎖、β３鎖及びγ２鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。本発明で使用するラミニン５タンパク質は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するα３鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１７１３）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９, ２２７７９―２２７８７, １９９４）、配列番号４のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するβ３鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１１７０）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９, １１０７３―１１０８０、１９９４）、及び配列番号６のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するγ２鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１１９３）（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９,６７９―６９３、１９９２）の各サブユニットからなるタンパク質である。
　α３鎖の球状ドメイン（Ｇ１―Ｇ５ドメイン）はそれぞれ、配列番号１のアミノ酸残基Ｎｏ．７９４―Ｎｏ．９７０、Ｎｏ．９７１―Ｎｏ．１１３９、Ｎｏ．１１４０―Ｎｏ．１３５３、Ｎｏ．１３５４―Ｎｏ．１５２９およびＮｏ．１５３０―Ｎｏ．１７１３に相当する。
　ラミニン５の各鎖は、対応する配列番号で示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような天然のタンパク質と相同なアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明において使用可能である。変更可能なアミノ酸数は、α３鎖、β３鎖及びγ２鎖の各アミノ酸配列において、限定されるわけではないが、好ましくは１ないし３００アミノ酸残基、１ないし２００アミノ酸残基、１ないし１５０アミノ酸残基、１ないし１２０アミノ酸残基、１ないし１００アミノ酸残基、１ないし８０アミノ酸残基、１ないし５０アミノ酸残基、１ないし３０アミノ酸残基、１ないし２０アミノ酸残基、１ないし１５アミノ酸残基、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基である。公知の部位特異的突然変異法で修飾可能な数のアミノ酸残基、例えば、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基がより好ましい。
　アミノ酸の保存的置換を行って元の機能を保持しているタンパク質またはポリペプチドを得ることができることは、当技術分野においてよく知られている。そのような置換には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、１つの脂肪酸残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）を別なもので、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で置換することが含まれる。
　また、本発明で用いるラミニン５は、配列番号２、４、６に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、かつ細胞接着活性を促進することができるタンパク質であってもよい。
　同一性は、同一である残基の数を、既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り、１００を乗ずることにより計算する。標準的なパラメーターを用いて配列の同一性を決定するためのコンピュータープログラムは、例えば、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ＰＳＩ―ＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５, ３３８９―３４０, １９９７）、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３―４１０, １９９０）、およびＳｍｉｔｈ―Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５―１９７, １９８１）が利用可能である。好ましくは、これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが、所望によりこれらの設定を変更してもよい。
　本発明におけるラミニン５タンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明のラミニン５タンパク質は、ラミニン５を分泌するヒト或いは動物細胞の培養液上清、あるいはそこから精製した天然型ラミニン５タンパク質であってもよい。しかしラミニン５は、当該技術分野において知られる組換えＤＮＡ技術を用いて各サブユニットを発現させることにより遺伝子組換えタンパク質として効果的に製造することができる。しかし不必要な動物性の因子を避けるという意味から、ラミニン５をヒト組換えタンパク質として得ることは特に好ましい。
　ラミニン５のα３鎖をコードする、配列番号１の核酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．５１３９を含むＤＮＡ配列、β３鎖をコードする配列番号３の核酸残基Ｎｏ．１２１―Ｎｏ．３６３０及びγ２鎖をコードする配列番号５の核酸残基Ｎｏ．１１８―Ｎｏ．３６９６の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適切なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。このようなＰＣＲ手法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、“ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，１９９０に記載されている。
　ラミニン５の各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、適当なベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに、各々の宿主で発現可能な発現ベクターを用いて導入し、それぞれの鎖を発現させることにより所望のタンパク質を得ることができる。ラミニン５を発現させるために用いることができる宿主細胞は特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核宿主細胞、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。
　ラミニン５を発現するように構築したベクターを、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等により、上記の宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて、本発明で使用するラミニン５タンパク質を産生させ、細胞または培地から精製することにより、ラミニン５タンパク質を得ることができる。精製はサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
　ラミニン５については、特開２００１―１７２１９６に詳細な記載があり、本明細書中に援用する。
　ラミニンの構造としては、α鎖、β鎖、γ鎖がそれぞれジスルフィド結合で連結されたヘテロ３量体分子であり、特徴的な十字架構造をとる。各鎖は複数のドメインからなり、ドメインＩおよびＩＩはトリプルへリックスを形成している。本出願前に、ラミニン分子は５種類のα鎖（α１ないしα５）、３種類のβ鎖（β１ないしβ３）、３種類のγ鎖（γ１ないしγ３）の異なる組み合わせによって、少なくとも１５種類が同定されており、実際にはその数倍の種類が存在することが示唆されている。代表的なラミニンであるラミニン１はα１、β１、γ１で構成されるヘテロ３量体分子であり、本出願にて用いているラミニンであるラミニン５はα３、β３、γ２で構成される。例えば、ラミニン１とラミニン５のポリペプチド鎖の相同性をＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウエアーで解析するとα１とα３の相同性は４２％、β１とβ３の相同性は４１％、γ１とγ２の相同性は５４％である。したがって、同じラミニンという名前がついていても、ラミニン１とラミニン５はそれぞれ（α１、β１、γ１）と（α３、β３、γ２）という全く異なる３つの遺伝子によってコードされたα鎖、β鎖、γ鎖から構成され、また同じα鎖の中でもそれぞれ異なる２つの遺伝子でコードされるα１とα３の相同性はたかだか４２％であり、ラミニン１とラミニン５は異なった性質を示すと考えられている。
　実施例３の中で示したように、他の細胞外マトリックスであるビトロネクチン、他のラミニンアイソフォームであるラミニン２は、ＨＳＡによる活性上昇作用は認められなかった。（図１７）。以上のことから、活性上昇作用は細胞外マトリックスタンパク質全般に起こる現象ではなく、さらにラミニンであってもどのアイソフォームでも起こる共通の現象でないことが分かった。
　ポリペプチド
　本発明は、細胞培養において、Ｌｍ５を含む細胞培養系において、特定のポリペプチドを併せて使用することにより、種々のＬｍ５の活性を上昇させることを特徴とする。
　ポリペプチドは、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択される。
　１）血中タンパク質
　本発明においては、好ましくは、血中タンパク質、より好ましくは、細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質をラミニン５タンパク質とともに使用する。
　血中タンパク質は、好ましくは血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンから選択される。これらはいずれも細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質である。
　「細胞外マトリックス」とは、細胞外の空間を充填する物質であると同時に骨格的役割（例：動物の軟骨や骨）、細胞接着における足場の役割（例：基底膜やフィブロネクチン）、細胞増殖因子などの保持・提供する役割（例：ヘパラン硫酸に結合する細胞増殖因子FGF）などを担う。多細胞生物を構成する個々の細胞の多くは細胞外マトリックスのベッドあるいは巣に埋もれて生活しているとも言える。ヒトを含めた脊椎動物の細胞外マトリックスに顕著な成分は、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンやラミニンといった糖タンパク質（一部は細胞接着分子）である。「細胞外マトリックスタンパク質」とは、このような細胞外マトリックスを構成するタンパク質を意味する。
　本発明における、「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」とは、血中タンパク質のうちでも、細胞接着等に関与する細胞外マトリックスタンパク質以外のものを意味する。これらは、いずれも公知のタンパク質であり当業者は適宜入手することが可能である。
　「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」は、限定されるわけではないが、好ましくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ／例えば、Ｎａｃａｌａｉより入手可能）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡより入手可能）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡより入手可能）である。
　「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」は、あるいは、免疫グロブリンであってもよい。免疫グロブリンは当業者に周知であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが含まれる。例えば、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ／例えば、オリエンタル酵母工業株式会社より入手可能）を使用することができる。
　２）ゼラチン
　ゼラチンとは、動物の皮膚や骨、腱などの結合組織の主成分であるコラーゲンに熱を加えて抽出したもので、タンパク質を主成分とする。
　３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質
　「腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）」は、サイトカインの一種であり、狭義にはＴＮＦはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β（リンホトキシン（ＬＴ）－α）およびＬＴ－βの３種類である。「ＴＮＦファミリーに属するタンパク質」には、受容体活性化因子ＮＦkＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド等の少なくとも１９種類以上の分子が含まれる。
　本発明において、「ＴＮＦファミリーに属するタンパク質」の例として、好ましくは、受容体活性化因子ＮＦ(Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）が使用されうる。
　４）ペプトン
　「ペプトン」とは、タンパク質をタンパク質分解酵素で分解したものである。生体内ではタンパク質が胃でペプシンにより消化されてペプトンとなり、膵臓で分泌される膵液や空腸で分泌される腸液によりさらにアミノ酸まで消化される。
　微生物の栄養源として適しているため、培地においてしばしば添加される。この培地栄養源としてのペプトンは、蛋白質をアミノ酸および低分子量のペプチドまで加水分解したもので、一般には牛乳の蛋白質（ミルクカゼイン）を酵素分解（豚の膵臓から抽出したパンクレアチンなどのプロテアーゼを使用）したものが一般的に使用されている。
　限定されるわけではないが、ペプトンは好ましくは植物由来のものが使用される。例えば、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトン及びエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される。
　実施例１に示されるように、アミノ酸単体では、ラミニン５の活性を上昇させるという本発明の効果は得られなかった。よって、本発明において、「ペプトン」は、アミノ酸単体まで消化されたものは含まない。
　細胞
　本発明の方法において培養される細胞の種類、由来は特に限定されない。
　好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される。限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択される。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
　細胞が由来する生物種も特に限定されない。好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳類、並びに、ニワトリなどの鳥類などに由来する。より好ましくは、マウス、ラット及びヒトからなる群から選択される種に由来する。
　本発明において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。本明細書において後述する実施例ではＥＳ細胞（ＥＢ３細胞）を用いて検討を行っているが、本発明の方法に使用できる多能性幹細胞には、胚性幹細胞のみに限らず、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、更には胚や胎児の細胞等に由来する、胚性幹細胞に類似した形質を有する全ての多能性幹細胞が含まれる。この場合、胚性幹細胞と類似の形質とは、胚性幹細胞特異的な遺伝子の発現や内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての胚葉への分化能を有するといった、胚性幹細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。
　限定されるわけではないが、本発明の方法で増殖させることができる細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等が挙げられる。なお本発明における多能性幹細胞として、ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞が好ましい。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
　「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。
　「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。本明細書においては、「多能性幹細胞」、「組織幹細胞」以外の種々の細胞を意味する。
　ラミニン５を含んだ系
　本発明においては、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する。本発明で「ラミニン５を含んだ系」とは、細胞の培養システム中に何らかの形でラミニン５を含むことを意味するものであり、その態様は特に限定されない。
　本発明において、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養するのに、ラミニン５で処理した、特にラミニン５でコーティングした培養容器を用いることが好適な態様である。
　本発明において「細胞培養容器」とは、は特に限定されるものではなく、細菌の混入を防ぐために滅菌処理され、かつ細胞を培養するのに適した任意の材料、任意の形状の容器を用いることができる。そのような培養容器の例として、本技術分野で一般的に用いられている培養用ディッシュ、培養用フラスコ、培養用シャーレ、９６ウェル、４８ウェル、１２ウェル、６ウェル、４ウェル等の培養用プレート、培養用ボトルなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
　本発明においては、細胞培養においてラミニン５及びポリペプチドを使用することを特徴とする。好ましくは、細胞培養容器の表面にラミニン５及びポリペプチドを固相化する（コーティングする）などの処理を施す。培養容器の表面にラミニンを固相化する処理技術は本技術分野で公知であり、当業者は本発明の目的に応じて任意の培養容器を採用して該容器をラミニン５及びポリペプチドで処理し、該容器を本発明の方法で細胞を培養するのに用いることができる。
　細胞培養容器の処理に使用されるラミニン５の量は特に限定されない。好ましくは、０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１～１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１μｇ／ｍｌ－２μｇ／ｍｌのラミニン５溶液で処理した場合、良好な結果が得られる。
　　本発明の一態様において、培養容器の内部表面にラミニン５を塗布した後に乾燥するなどして培養容器をラミニン５で処理してもよい。ラミニン５処理した培養容器にＧＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）やＤＭＥＭなどの細胞の培養に一般的に使用される培地を入れ、その培地中に多能性幹細胞を添加する。次いで、公知の適切な培養条件下、例えば限定するわけではないが３７℃、５％二酸化炭素気層条件下などで細胞の培養を行う。
　本願発明では、好ましくは、細胞培養容器をラミニン５及びポリペプチドで処理する（コーティングする）。細胞培養器を処理する順番は特に限定されないが、好ましくは、ポリペプチドで処理した後にラミニン５で処理する、あるいは、ポリペプチドとラミニンで同時に処理する。
　よって、本発明は前述のポリペプチドを含む、細胞培養容器コーティング用の組成物、又は細胞培養容器コーティング剤も提供する。本発明の組成物又は剤は、ポリペプチドとともにラミニン５を同時に含んでもよい。本願発明はさらに、前述のポリペプチドを含む細胞培養用培地を含む、キットも提供する。前述のポリペプチド及びラミニン５を含む細胞培養用培地を含む、キットも提供される。本発明のキットは、上記細胞培養用培地の他に、さらに、プレコート培養ディッシュ、プレコート培養プレート等を含んでもよい。
　本発明と組成物、剤及びキットは、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用することができる。
　ポリペプチドの使用量
　本発明において、ポリペプチドの使用量は特に限定されない。当業者は使用するポリペプチドの種類等に要素に応じて適切な量を適宜選択することが可能である。
　限定されるわけではないが、好ましくは、ポリペプチドは１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、実施例１において、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ＨＳ、ＩｇＧなどの血中タンパク質を用いた場合、３．１２５μｇ／ｍｌないし１２．５μｇ／ｍｌの間の濃度で使用すると特に好ましいことが明らかにされた。また、綿実由来ペプトンを使用した場合、より高濃度、好ましくは１５．６μｇ／ｍｌないし１０００μｇ／ｍｌで使用すると、ラミニン５の細胞活性上昇効果を示すことが認められた。
　ポリペプチドの併用
　本発明の好ましい１態様において、２種類以上のポリペプチドを細胞培養系に含ませる。実施例１において、ポリペプチドとしてｒＨＳＡとＩｇＧを併用すると、各々を単独で使用した場合では大きな効果が確認できないくらいの低濃度（０．２５μｇ／ｍｌ）であっても、両者を併用することにより、ｒＨＳＡ　１０μｇ／ｍｌを使用した場合と同程度の強い接着活性上昇効果が認められた。よって２種以上のポリペプチドの併用により相加効果ではなく、相乗効果が得られると考えられる。
　本発明の効果
　本発明において、ラミニン５タンパク質が細胞培養において奏する種々の活性が、ポリペプチドとの併用において上昇される。限定されるわけではないが、ラミニン５タンパク質の効果としては、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性が含まれる。
　「細胞接着活性」とは、細胞を接着させる効果を意味する。図２、図３及び図４において、ｒＬｍ５（０．１２５μｇ／ｍｌ）にＨＳＡを併用することで、ｒＬｍ５（２μｇ／ｍｌ）と同等の接着活性が得られた。また、同様に、図１３において、よりｒＬｍ５（０．５μｇ／ｍｌ）にＨＳＡを併用することで、ｒＬｍ５（２μｇ／ｍｌ）と同等の接着活性が得られた。よって、本願発明においてポリペプチドの使用により、ポリペプチドを使用しない場合と比較して好ましくは、細胞接着活性が１．２倍以上、より好ましくは４倍以上、もっとも好ましくは８倍以上上昇する。
　「細胞分散活性」とは、細胞を分散させる効果を意味する。本願発明においてポリペプチドの使用により、ポリペプチドを使用しない場合と比較して好ましくは、細胞分散活性が２倍以上上昇する。
　「創傷治癒活性」とは、傷を治癒する効果を意味する。即ち、物理的に外傷を受けて細胞がいなくなった部分に、例えばラミニン５などを塗布することで、塗布した部分に周りから細胞を遊走させてくる活性である。傷を治癒する効果は、例えば、損傷を受けてから一定時間（例えば１６時間経過後）の傷の幅を測定することによって治癒率を確認することが可能である。実施例５では、ヒトラミニン５に加えてポリペプチド（ｒＨＳＡ）を併用することにより傷の治癒率が６０％から８０％に上昇した。
　「増殖促進活性」とは、細胞の増殖を促進させる効果を意味する。例えば、細胞行ってから一定期間経過後の細胞数を測定することによって、細胞増殖の効果を確認することが可能である。
　「未分化維持活性」とは、培養される細胞が未分化の細胞、例えば、多能性幹細胞、組織幹細胞の場合、その未分化の状態を維持することを意味する。ラミニン５でこれらの細胞を培養する場合、細胞の分化は進まず、未分化の状態が維持される。本発明において、ラミニン５とポリペプチドを併用した場合も未分化の状態が維持されることが確認された（実施例７、図２５）。例えばＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４などの未分化マーカーを測定することにより、培養中に組織幹細胞が分化していないか評価することができる。
　「多能性維持活性」とは、培養される細胞が多能性を有する細胞、例えば、多能性幹細胞の場合、その多能性を維持することを意味する。本発明において、ラミニン５とポリペプチドを併用した場合も、多能性が維持される。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例１　組換えヒトラミニン５（ｒＬｍ５）の調製
　本実施例では、公知の方法に従って組み換えヒトラミニン５タンパク質を調製した。
　α３鎖（配列番号１）、β３鎖（配列番号３）、γ２鎖（配列番号３）のｃＤＮＡを導入したヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（Ｌｍ５－ＨＥＫ２９３）から回収した無血清培養上清を４℃、３０００ｒｐｍで５分遠心した。ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６０７－６１２（２００２）に従って得た。次いで、Ｈｅｐａｒｉｎ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、溶出した。マウス抗Ｌｍ－α３（抗ラミニンα３）モノクローナル抗体（ＢＧ５）をＰｒｏｔｅｉｎＡ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させた抗体カラムにｒＬｍ５含有画分を通し、次いで溶出した。なお、モノクローナル抗体ＢＧ５はラミニンα３Ｂ鎖Ｎ末端断片を抗原として公知のモノクローナル抗体作成方法に従って、本発明者らが作製した抗体である。
　１μｇの精製ｒＬｍ５を還元条件にて変性した後、５－２０％ゲルを用いＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にてα３鎖、β３鎖、γ２鎖のサイズ、純度を確認したところ、それぞれ１６０ｋＤａ、１３５ｋＤａ、１０５ｋＤａのバンドが確認できた。図１に精製ｒＬｍ５についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果の写真を示す。ＣＳ－Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて解析した結果、精製ｒＬｍ５の純度は約９８％であった。このようにして調製したｒＬｍ５を以下の実施例において使用した。
　実施例２　細胞接着アッセイ
　本実施例では、各種細胞に対するｒＬｍ５およびｒＬｍ５に添加物を加えた際の接着アッセイの結果を示す。
　細胞はラット肝細胞株（ＢＲＬ）、マウスＥＳ細胞株（ＥＢ３）、ヒト肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の４種類を用いた。ＢＲＬは横浜市立大学大学院　生命ナノシステム科学研究科　ゲノムシステム科学専攻から提供を受けた。ＥＢ３は、大阪大学医学系研究科　未来医療開発専攻Ｇ６　分子治療学講座　幹細胞制御分野から提供を受けた。ＨＴ１０８０は理化学研究所バイオリソースセンターより入手した（ＲＣＢ１９５６）。ｈＭＳＣはロンザ社（ＬＯＮＺＡ）より入手した。
　各種細胞は以下の培地を用いて培養・増殖させた。ＢＲＬは１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＥＢ３は１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１０００Ｕ／ｍｌ　ＥＳＧＲＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び１０-4Ｍ　２－メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）を添加したＧＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、ＨＴ１０８０は１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、ｈＭＳＣはＭＳＣＧＭ（ＬＯＮＺＡ）を用いた。ただし、接着アッセイではこれらの培地から血清を除いた無血清培地を用いた。
　濃度調製したｒＬｍ５で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を３７℃で２時間または４℃で一晩処理し、ＰＢＳ（－）で処理表面を洗浄後、１．２％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液にて３７℃で１時間ブロッキング処理を行った。必要に応じてｒＬｍ５の処理はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ／Ｎａｃａｌａｉ）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ／ＳＩＧＭＡ）、ヒト血清（ＨＳ／ＯＹＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ／ＳＩＧＭＡ）、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ／ＯＹＣ）、ウシゼラチン（Ｇｌ／ＳＩＧＭＡ）、組換えヒトＲｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－κＢ　Ｌｉｇａｎｄ（ｓＲＡＮＫＬ／ＯＹＣ）、綿実由来ペプトン（Ｐｅｐ／ＤＭＶ）、グリシン（Ｇｌｙ／Ｎａｃａｌａｉ）、アルギニン（Ａｒｇ／Ｎａｃａｌａｉ）、トレハロース（Ｔｒｅ／ＳＩＧＭＡ）、キシロース（Ｘｙｌ／Ｗａｋｏ）、マンノース（Ｍａｎ／Ｗａｋｏ）、ラクトース（Ｌａｃ／Ｗａｋｏ）を混ぜて処理を行った。各種細胞は血清を添加しない無血清培地にて洗浄後、２００００個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で１時間培養を行った。ただし、ＥＢ３は３００００個／ウェルで播種した。培養後、ボルテックスミキサーで軽く震動させて接着の弱い細胞をプレート表面から浮遊させ、パーコール（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）処理にて該細胞を除いた。接着した細胞を２５％グルタルアルデヒド（Ｎａｃａｌａｉ）で固定し、２．５％クリスタルバイオレット（Ｎａｃａｌａｉ）にて染色してＯＤ５９５を測定することで様々な条件でのｒＬｍ５の接着活性を評価した。
　図２～１１にＢＲＬを用いた接着アッセイの結果を、図１２にＨＴ１０８０を用いた接着アッセイの結果を、図１３にｈＭＳＣを用いた接着アッセイの結果を、図１４、１５にＥＢ３を用いた接着アッセイの結果を示す。
　０．２５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にて処理する際にＨＳＡ、ＢＳＡ、ＨＳ、ＩｇＧを併用すると併用しない時と比較して接着活性の上昇が認められた。このことから血中タンパク質にｒＬｍ５の接着活性を上昇させる効果があることが分かった（図２）。ＨＳＡの至適濃度を検討するため、０～２００μｇ／ｍｌのＨＳＡを併用したところ、３．１２５～１２．５μｇ／ｍｌに至適濃度があることが分かった（図３）。さらに、この活性上昇作用を示す物質を特定するために０～２００μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用したところ、ＨＳＡと同じく３．１２５～１２．５μｇ／ｍｌに至適濃度があることが分かった。このことから、活性上昇作用を示す物質は天然型タンパク質に含まれる不純物等ではないことが分かった（図４）。
　次にＨＳＡ、ＢＳＡ、ＨＳ、ＩｇＧなどの血中タンパク質以外のタンパク質でも同様の作用があるかをＧｌ、ｓＲＡＮＫＬ、Ｐｅｐで検討したところ、それぞれの物質にて作用に多少の違いは認められたが、ＨＳＡのような接着活性上昇作用が認められた（図５）。Ｐｅｐにおける活性上昇作用はわずかであったが、より広範囲で濃度（０～１０００μｇ／ｍｌ）を検討したところ、高濃度で強い活性上昇作用を示すことが分かった（図６）。以上のことからポリペプチド、或いはペプチドであれば活性上昇作用を示すことが分かった。
　次に糖類を検討した。０．２５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にＸｙｌ、Ｍａｎ、Ｌａｃ、Ｔｒｅを併用したところ、ポリペプチド、或いはペプチドのような活性上昇作用は認められなかった（図７）。より高濃度（１００μｇ／ｍｌ）で併用してもＨＳＡのような強い活性上昇作用は認められなかった（図８）。
　次にアミノ酸を検討した。ｒＬｍ５に０～１０００μｇ／ｍｌのＧｌｙ、Ａｒｇを併用したところ、糖類と同様にｒＨＳＡのような強い活性上昇作用は認められなかった（図９）。Ａｒｇについては活性減少が認められた。
　以上のことから、糖類やアミノ酸のような低分子では活性上昇作用は示さないことが分かった。
　次に複数のタンパク質の併用を検討した。０．１２５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に０．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡのみ、或いは０．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧのみを併用した時には、１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用した時に比べて接着活性は低かったが、０．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡと０．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧを組み合わせて併用したところ、１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用した時と同等の接着活性を示した（図１０）。このことから複数種のタンパク質を組み合わせてもｒＬｍ５の接着活性を上昇させ得ることが分かった。
　次に併用方法について１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを用いて検討した。ｒＨＳＡにて処理した後にｒＬｍ５で処理した場合（ｒＨＳＡ→ｒＬｍ５）、これまでと同様にｒＨＳＡとｒＬｍ５を同時に処理した場合（ｒＬｍ５＋ｒＨＳＡ）、ｒＬｍ５で処理した後にｒＨＳＡで処理した場合（ｒＬｍ５→ｒＨＳＡ）を比較検討した。その結果、前処理と同時は接着活性上昇作用を示すのに対して、後処理では接着活性上昇作用を示さないことが分かった（図１１）。
　次にＢＲＬ以外の細胞においても同様の活性上昇作用が認められるかをＨＴ１０８０、ｈＭＳＣ、ＥＢ３を用いて検討した。検討では０～２００μｇ／ｍｌのｒＨＳＡの併用を検討した。その結果、細胞種によって活性上昇作用に多少の違いは認めらたが、全ての細胞で活性の上昇が認められ、さらにＢＲＬと同様に３．１２５～１２．５μｇ／ｍｌに至適濃度があることが分かった（図１２～１４）。ＥＢ３について接着アッセイ後の細胞形態を図１５に示す。
　以上のことから、ポリペプチド、或いはペプチドを併用して処理することで、様々な細胞に対してｒＬｍ５の接着活性を上昇させられることが分かった。また、併用の際のポリペプチド濃度は３．１２５～１２．５μｇ／ｍｌが至適であり、併用方法としては同時でなくても良く、事前に処理しておくだけで十分にｒＬｍ５の活性を上昇させることが出来ることが分かった。
　実施例３　他の細胞外マトリックスタンパク質やラミニンアイソフォームにおける活性上昇作用の検討
　本実施例では、ヒトビトロネクチン（Ｖｎ／ＳＩＧＭＡ）、ヒトラミニン２（Ｌｍ２／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、他の細胞外マトリックスタンパク質やラミニンアイソフォームにもｒＬｍ５と同様の活性上昇作用が認められるかをラット肝細胞株（ＢＲＬ）を用いた接着アッセイにて検討した結果を示す。アッセイは実施例２記載の方法に準じて行った。
　図１６に１０μｇ／ｍｌのＨＳＡを、図の１７に１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用した際の接着アッセイの結果を示す。その結果、ｒＬｍ５のようにＨＳＡやｒＨＳＡを併用することによる活性上昇作用は、ＶｎやＬｍ２では一切認められなかった。以上のことから、活性上昇作用は細胞外マトリックスタンパク質全般に起こる現象ではなく、さらにラミニンであってもどのアイソフォームでも起こる共通の現象ではないことが分かった。
　実施例４　ＢＲＬ細胞を用いた細胞分散アッセイ
　本実施例では、ラット肝細胞株（ＢＲＬ）細胞に対するｒＬｍ５およびｒＬｍ５に添加物を加えた際の細胞分散アッセイの結果を示す。ＢＲＬは横浜市立大学大学院　生命ナノシステム科学研究科　ゲノムシステム科学専攻から提供を受けた。
　ＢＲＬ細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて培養・増殖させた。ただし、細胞分散アッセイでは1％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ/Ｆ１２培地を用いた。
　濃度調製したｒＬｍ５で２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩処理し、ＰＢＳ（－）で処理表面を洗浄後、１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液にて３７℃で１時間ブロッキング処理を行った。必要に応じてｒＬｍ５の処理はｒＨＳＡを混ぜて行った。ｒＬｍ５処理表面をＰＢＳ（－）にて洗浄後、細胞を１％ＦＢＳ培地にて洗浄し、７０００個／ウェルで播種の後に３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で４０時間培養を行った。培養後、ボルテックスミキサーで軽く震動させて接着の弱い細胞をプレート表面から浮遊させ、パーコール処理にて該細胞を除いた。接着した細胞を２５％グルタルアルデヒドで固定し、ランダムな３視野の写真を撮り、単一細胞数を数えた。
　図１８および１９に細胞分散アッセイの結果を示す。Ｌｍ５が低濃度（０．０２μｇ）の際にｒＨＳＡを加えた場合は有意に細胞分散活性の上昇が認められた。
　以上のことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用は細胞接着活性だけでなく、ｒＬｍ５の活性としてすでに報告されている細胞分散活性についても活性上昇作用が認められた。
　実施例５　ＢＲＬ細胞を用いた創傷治癒アッセイ
　本実施例では、ラット肝細胞株（ＢＲＬ）細胞に対するｒＬｍ５およびｒＬｍ５に添加物を加えた際の創傷治癒アッセイの結果を示す。ＢＲＬは横浜市立大学大学院　生命ナノシステム科学研究科　ゲノムシステム科学専攻から提供を受けた。
　ＢＲＬは１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて培養・増殖させた。ただし、創傷治癒アッセイでは前記培地の他に培地から血清を除いた無血清培地を添加した培地を用いた。
　２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に細胞を１０％ＦＢＳ培地にて１６００００個/ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で３時間培養を行った。培養後各ウェルの接着細胞集団にブルーチップを用いて一定幅の傷をつけ血清を除いた無血清培地にて２回洗浄を行った。無血清培地にて濃度調製したｒＬｍ５で各ウェルを３７℃で1時間処理した。必要に応じてｒＬｍ５の処理はｒＨＳＡを混ぜて行った。ｒＬｍ５処理後、血清を除いた無血清培地で処理表面を2回洗浄し、無血清培地を添加した。また顕微鏡にて観察し、傷をつけた付近の写真を撮影した。その後無血清培地にて３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で１６時間培養を行い、同一部位付近の写真を撮影し（図２１）、傷の治り具合を開始時の傷と１６時間後の傷の幅を測定し、創傷治癒率を計算した。
　図２０に得られた創傷治癒率の結果を示す。Ｌｍ５にｒＨＳＡを加えた場合は有意に創傷治癒活性の上昇が認められた。
　以上のことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用は細胞接着活性や細胞分散活性だけでなく、ｒＬｍ５の活性としてすでに報告されている創傷治癒活性についても活性上昇作用が認められた。
　実施例６　ヒト間葉系幹細胞を用いた増殖アッセイ
　本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるｈＭＳＣを用いた増殖アッセイの結果を示す。
　増殖アッセイでは１０％ＦＢＳの代わりに、５％Ｐａｎｅｘｉｎ（ＰＡＮ－ｂｉｏｔｅｃｈ社）を添加した培地（Ｐ）と５％Ｐａｎｅｘｉｎ及び１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加した培地（Ｐ＋Ｆ）を用いた。また比較のため、１０％ＦＢＳを含有する維持培地（Ｓｅｒｕｍ）も用いた。濃度調製した各種細胞外マトリックスタンパク質にて処理した６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に、各培地に置き換えたｈＭＳＣを３８４００個／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で１０日間培養し、３日後、７日後、１０日後にそれぞれ酵素処理により細胞を回収し、血球計算盤にて細胞数を計測した。
　細胞支持材料は、１ｍｇ／ｍｌのｒＬｍ５、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したものにそれぞれ調製した。
　図２２に、各培養条件下でｈＭＳＣの増殖に対する影響を検討した結果を示す。０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に対して、ｒＨＳＡを添加した場合、有意に細胞増殖の上昇が認められた。
　以上のことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用は細胞接着活性や細胞分散活性、創傷治癒活性だけでなく、ｒＬｍ５の活性としてすでに報告されている間葉系幹細胞の増殖促進活性についても活性上昇作用が認められた。このことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用はｒＬｍ５の持つ活性の全てについて上昇させることが出来ることが予想された。
　実施例７　ＥＢ３を用いた増殖アッセイ
　本実施例では、ｒＬｍ５を細胞支持材料として用いた場合におけるＥＢ３を用いた増殖アッセイの結果を示す。
　ＥＢ３の維持培地は実施例２に記載の増殖培地の１０％ＦＢＳの代わりに、１０％ノックアウトTM血清代替添加物（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した培地（ＫＳＲ－ＧＭＥＭ）を用いた。濃度調製した各種細胞外マトリックスタンパク質にて処理した１２ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に、ＥＢ３を４３０００個／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で２日間培養後、酵素処理により細胞を回収し、血球計算盤にて細胞数を計測した。
　再び、濃度調製したｒＬｍ５にて処理した１２ウェルプレートにＥＢ３を４３０００個／ウェルで播種した。この操作を繰り返すことで、ＥＢ３に対する各条件でのｒＬｍ５の増殖効果を比較した。ｒＬｍ５は、２μｇ／ｍｌ（Ｌ（２））、０．２μｇ／ｍｌ（Ｌ（０．２））、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に３．１２５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したもの（Ｌ（０．２）＋Ｈ（３．１２５））、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に１２．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したもの（Ｌ（０．２）＋Ｈ（１２．５））にそれぞれ調製した。
　図２３に、各培養条件下でＥＢ３を５回継代した際に最終的に理論上何倍に増殖したかを算出した結果を示す。図２３の結果から、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５のみに比べて０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にｒＨＳＡを加えた実験区では約３倍の細胞増殖が認められ、２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５を用いた場合と同等であった。
　以上のことから、マウスＥＳ細胞の増殖においてもｒＨＳＡの併用効果が認められた。
　実施例８　ＥＢ３を用いた増殖アッセイと未分化マーカーの検出
　本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるＥＢ３を用いた増殖アッセイの結果とＲＴ－ＰＣＲによる未分化マーカーの検出結果を示す。
　ＥＢ３の増殖アッセイにて播種した細胞数および継代間隔は実施例７と同様に行った。増殖アッセイに用いた培地は実施例２に記載の増殖培地（Ｓ）とＫＳＲ－ＧＭＥＭ(Ｋ)を用いた。また、１２ウェルプレートを処理した各種細胞外マトリックスタンパク質は、１ｍｇ／ｍｌのＧｌ、０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５（Ｌ０．０５）、０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に１２．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したもの（Ｌ０．０５＋Ｈ１２．５）を用いた。
　図２４に、各培養条件下でＥＢ３を３回継代した際に最終的に理論上何倍に増殖したかを算出した結果を示す。図２４の結果から、０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５のみでは途中で増殖が止まってしまったのに対して０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にｒＨＳＡを加えた実験区では増殖が認められた。
　次に、増殖の認められたＳ＋Ｇ、Ｋ＋Ｌ（０．０５）＋Ｈ（１２．５）についてマウスＥＳ細胞の未分化マーカーとして知られるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇの遺伝子に関してＲＴ－ＰＣＲにて未分化マーカーの検出を行った。なお、Ｓ＋Ｇの条件よりマウスＥＳ細胞の未分化維持因子として知られるＬＩＦを除いた状態で同様の期間維持した実験区を陰性の対照区（Ｓ（ＬＩＦ－）＋Ｇｌ）として設定した。
　ＲＮＡは３回継代培養したＥＢ３からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出後、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型として表２に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各遺伝子の変性反応は９４℃　３０秒、アニーリング反応は３０秒、伸長反応は７２℃　２０秒で行った。アニーリング反応はＯｃｔ４は６１℃、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇは５４℃の温度で行った。
　図２５にＲＴ－ＰＣＲにて未分化マーカーを検出した結果を示す。図２５の結果より、Ｓ＋Ｇｌと同様にＫ＋Ｌ（０．０５）＋Ｈ（１２．５）では３つの未分化マーカーを発現していることが分かった。このことから、ｒＬｍ５にｒＨＳＡを併用した場合でもＥＢ３は未分化性を維持していることが示唆された。
　以上のことから、ｒＬｍ５とｒＨＳＡとの併用は増殖において効果があるだけでなく、維持されたマウスＥＳ細胞は未分化性を正常に維持していることが示唆された。
＜配列番号１＞
　配列番号１は、ヒトラミニンα３鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
　配列番号２は、ヒトラミニンα３鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
　配列番号３は、ヒトラミニンβ３鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
　配列番号４は、ヒトラミニンβ３鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
　配列番号５は、ヒトラミニンγ２鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
　配列番号６は、ヒトラミニンγ２鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７－１４＞
　配列番号７－１４は、ＥＢ３細胞における未分化マーカー検出のための、ＲＴ－ＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す。

Claims (15)

  1. 　ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、
    　血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドを培養系に含むことを特徴とする前記方法。
  2. 　腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質が、受容体活性化因子ＮＦ(Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 　ペプトンが、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトン及びエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 　細胞培養容器を、ポリペプチドで処理した後にラミニン５で処理する、あるいは、ポリペプチドとラミニンで同時に処理する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性からなる群から選択される、ラミニン５の細胞に対する活性が上昇する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択され；
    　組織幹細胞が、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択され；あるいは、
    　体細胞が、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される、
    請求項６に記載の方法。
  8. 　細胞が、マウス、ラット及びヒトからなる群から選択される種に由来する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　ポリペプチドを１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　ポリペプチドを３．１２５μｇ／ｍｌないし１２．５μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　２種類以上のポリペプチドを細胞培養系に含ませる、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド
    を含む、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用するための組成物。
  13. 　さらにラミニン５を含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 　血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α－グロブリン、β－グロブリン、α１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２－マクログロブリン（α２－Ｍ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド
    を含む、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用するための、キット。
  15. 　さらにラミニン５を含む、請求項１４に記載のキット。
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