WO2011105424A1 - 樹状細胞免疫受容体刺激剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a ligand for a dendritic cell immunoreceptor (DCIR), an anti-DCIR antibody, and use thereof.
- DCIR dendritic cell immunoreceptor
- Dendritic cells are major antigen-presenting cells (APCs) and play a central role in the regulation of the immune system. Recently, several C-type lectin receptors (CLRs) have been characterized as expressed on the surface of dendritic cells. Type I CLR family members MMR (CD206) and DEC-205 (CD205) have multiple calcium-dependent extracellular carbohydrate recognition domains (CRDs) at their N-termini. A second family of CLRs expressed on dendritic cells are type II proteins with a unique CRD at the C-terminus, which are DC-SIGN (CD209), Langerin (CD207), CLEC-1, Dectin-1 ( ⁇ -GR), Dectin-2, DLEC, and DCIR.
- DC-SIGN CD209
- Langerin CD207
- CLEC-1 Dectin-1
- ⁇ -GR Dectin-2
- DLEC DLEC
- DCIR also called LLIR
- LLIR is a type II membrane protein expressed mainly on dendritic cells in humans and mice. This molecule has one sugar chain recognition domain (CRD) in the extracellular domain and a consensus ITIM in the intracellular domain. Since ITIM transmits an inhibitory signal into cells, it was suggested that mouse DCIR acts as an inhibitory receptor and regulates dendritic cell function.
- the inventors of the present invention have previously succeeded in producing a DCIR knockout mouse and reported that DCIR is involved in the development of arthritis and rheumatoid arthritis by studies using the mouse (Patent Document 1, Non-Patent Document). 1).
- an object of the present invention is to find a DCIR ligand, search for its stimulant and antagonist, and to apply it.
- KS-II keratan sulfate-II
- DCIR keratan sulfate-II
- KS-II regulates the function of osteoblasts and osteoclasts by binding to DCIR, and particularly strongly suppresses osteoclast formation and suppresses inflammation.
- antibodies against DCIR were further prepared and their actions were examined.
- anti-DCIR antibodies not only antibodies having a KS-II inhibitory DCIR antagonistic action, but also KS-II-like antibodies. It has been found that there is an antibody having a DCIR stimulating action.
- the anti-DCIR antibody having a DCIR stimulating action like KS-II has an excellent osteoclast-forming inhibitory action and TNF- ⁇ production inhibitory action, and is used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases accompanied by abnormal bone metabolism and inflammatory diseases. It was found useful and the present invention was completed.
- the present invention provides a dendritic cell immune receptor stimulant containing KS-II as an active ingredient.
- the present invention also relates to a dendritic cell immunoreceptor stimulator characterized by measuring the binding of a test substance to a dendritic cell immunoreceptor in the presence of KS-II or using KS-II as a control.
- the present invention provides a screening method for dendritic cell immune receptor antagonists.
- the present invention also provides an antibody against a dendritic cell immunoreceptor having a KS-II-like dendritic cell immunoreceptor stimulating action, and a medicament containing the same. Furthermore, the present invention provides an antibody against a dendritic cell immunoreceptor having a KS-II inhibitory dendritic cell immunoreceptor antagonistic action, and a medicament containing the same.
- the present invention also provides KS-II for use in stimulating dendritic cell immune receptors.
- the present invention also provides the use of KS-II for the production of dendritic cell immune receptor stimulants.
- the present invention also provides an antibody against a dendritic cell immunoreceptor having a stimulating action on a dendritic cell immunoreceptor like KS-II, which is used for preventing or treating a disease accompanied by abnormal bone metabolism or an inflammatory disease. It is to provide.
- the present invention also relates to an antibody against a dendritic cell immunoreceptor having a KS-II-like dendritic cell immunoreceptor stimulating action for producing a prophylactic or therapeutic agent for diseases associated with abnormal bone metabolism Is intended to provide the use of
- the present invention also provides an antibody against a dendritic cell immunoreceptor having a KS-II inhibitory dendritic cell immunoreceptor antagonism, which is used for cancer treatment or immunostimulation.
- the present invention also provides use of an antibody against a dendritic cell immunoreceptor having a KS-II inhibitory dendritic cell immune receptor antagonistic activity for the production of an anticancer agent or an immunostimulator. is there.
- the present invention also provides a method for stimulating dendritic cell immune receptors, characterized by administering KS-II.
- the present invention also provides a prophylactic treatment of a disease associated with abnormal bone metabolism or an inflammatory disease, characterized by administering an antibody against a dendritic cell immune receptor having a KS-II-like dendritic cell immune receptor stimulating action.
- a method is provided.
- the present invention also provides a method for preventing or treating cancer or immunostimulating, which comprises administering an antibody having a KS-II inhibitory dendritic cell immunoreceptor antagonistic action.
- KS-II was found to be a DCIR ligand, which has an osteoclast formation inhibitory action and the like, and is useful as a new medicine.
- antibodies having a KS-II-like action have a DCIR stimulating action and are useful as preventive and therapeutic agents for diseases associated with abnormal bone metabolism, inflammatory diseases, and the like.
- an antibody having a KS-II inhibitory action has a DCIR antagonistic action and is useful as an anticancer agent, an immunostimulant, and the like.
- FIG. 1 Schematic diagram showing the structure of a mouse Dcir site (wild-type allele), a Dcir targeting construct (targeting vector), and a predicted mutant Dcir gene (mutant allele) in the production of a Dcir ⁇ / ⁇ mouse. Exons are shown as black boxes.
- Neo Neomycin resistance gene
- DT Diphtheria toxin gene
- B BamHI site
- E EcoRI site.
- the black boxes labeled 5'probe and 3'probe in the figure indicate the binding positions of the 5'probe and 3'probe in Southern hybridization, respectively.
- B to (d) Southern blot hybridization analysis results of ES clones.
- MNC TRAP-positive multinucleated cells
- N 6
- c Absorption pit formation analysis. OC was cultured on dentin slices.
- d Quantitative measurement of absorption pit area. Data are representative of 3 or more separate experiments.
- f Semi-quantitative RT-PCR analysis of the major transcription factors (Nfatcl and Nfatc2) and OC markers (Acp5 and Cask) that control OC differentiation.
- Anti-GM-CSF antibody (5 ⁇ g / mL) was added to a medium containing M-CSF (10 ng / mL) and RANKL (100 ng / mL).
- KS-I cornea-derived KS-I
- KS-II cartilage-derived KS-II
- CS chondroitin sulfate
- DS dermatan sulfate
- LacNAc non-sulfated LacNAc.
- Data are mean ⁇ s. d. . f. Immunoblot analysis for ITIM phosphorylation and SHP-1 mobilization in pOC lysates after KS-II stimulation.
- Keratan sulfate is a sulfated glycosaminoglycan having a basic structure of Gal-GlcNAc in which N-acetylglucosamine (GlcNAc) is bound to galactose (Gal).
- Keratan sulfate includes KS-II, which is derived from bone and cartilage and binds to a protein with an O-glycoside bond, and KS-I, which is derived from the cornea and binds to a protein with an N-glycoside bond. Only II can be used.
- KS-I has no effect of the present invention.
- KS-II is known to be involved in inflammation and the like (Patent Document 1), but the relationship with DCIR was not known at all.
- KS-II has various structures depending on the number of Gal-GlcNAc repeats and the number of sulfate residues, and any of them can be used in the present invention. These KS-II may be derived from bone or cartilage, or commercially available.
- KS-II is a ligand of DCIR and exhibits various actions by binding to DCIR. That is, KS-II binds to DCIR, thereby inhibiting osteoblast maturation and bone matrix formation, and promoting osteopontin production. On the other hand, KS-II was also found to strongly suppress osteoclast formation by binding to DCIR. The action is due to inhibition of GM-CSF-dependent osteoclast precursor cell proliferation. KS-I is not a DCIR ligand. Therefore, KS-II is useful as a bone formation regulator, and is useful as a prophylactic / therapeutic agent for various bone diseases such as osteoporosis, Paget's disease of bone, and osteoarthritis.
- KS-II is a DCIR ligand
- screening for a DCIR stimulant or DCIR antagonist can be performed by measuring the binding of a test substance to DCIR in the presence of KS-II or using KS-II as a control. Is possible. More specifically, if the binding of KS-II and the test substance to DCIR is measured and compared with the binding of KS-II and DCIR, whether the test substance is a DCIR stimulator or antagonist. Can be judged.
- the measurement of the binding property to DCIR may be determined by the action of KS-II, such as osteoclast formation ability, action on TNF- ⁇ production, action on type I IFN production.
- Screening for DCIR stimulators or DCIR antagonists can be performed in vitro or in vivo. In the case of in vivo, it is preferable to determine by the osteoclast-forming ability, the effect on TNF- ⁇ production, and the effect on type I IFN production.
- the anti-DCIR antibody of the present invention includes an anti-DCIR antibody (anti-DCIR agonistic antibody) having a KS-II-like DCIR stimulating action and an anti-DCIR antibody (anti-DCIR antagonist) having a KS-II-inhibiting DCIR antagonistic action. Stick antibody).
- anti-DCIR antibody anti-DCIR agonistic antibody
- anti-DCIR antagonist anti-DCIR antibody
- Stick antibody anti-DCIR antagonist
- those having binding ability to DCIR are preferably equal to or higher than KS-II, and the binding ability is preferably 1.2 times or more, more preferably 2 times or more. Is more preferable, and a value five times higher is more preferable.
- the binding property may be measured directly by the binding property to DCIR, but may be measured using an activity such as osteoclast formation inhibitory activity or TNF- ⁇ production inhibitory activity as an index.
- the antibody having a DCIR stimulating action like KS-II in the present invention has an osteoclast formation inhibitory action and a TNF- ⁇ production inhibitory action, and the action is equivalent to or stronger than that of KS-II. Therefore, the KS-II-like anti-DCIR antibody is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases accompanied by abnormal bone metabolism such as bone resorbable diseases and inflammatory diseases. Examples of diseases associated with abnormal bone metabolism and inflammatory diseases include osteoporosis, Paget's disease, osteoarthritis, rheumatoid arthritis and the like. The effectiveness of a KS-II-like anti-DCIR antibody in these diseases can be confirmed using, for example, a collagen-induced arthritis model.
- antibodies having a KS-II inhibitory DCIR antagonistic activity those having a binding property to DCIR equal to or higher than that of KS-II are preferred, and the binding property is preferably 1.2 times or more, preferably 2 times. The above are more preferable, and those of 5 times or more are more preferable.
- an antibody having a KS-II inhibitory DCIR antagonistic action has a strong osteoclast formation promoting action and a TNF- ⁇ production promoting action. Therefore, the KS-II inhibitory anti-DCIR antibody is useful as an anticancer agent, an immunostimulant, and the like.
- the anti-DCIR antibodies of the present invention include monoclonal and polyclonal antibodies, as well as antibody variants and derivatives such as antibodies and T-cell receptor fragments that retain the ability to specifically bind to antigenic determinants.
- the type of the antibody of the present invention is not particularly limited, and for the purpose of reducing mouse antigen, human antibody, rat antibody, rabbit antibody, sheep antibody, camel antibody, avian antibody, etc.
- Artificially modified recombinant antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies can be used as appropriate.
- the recombinant antibody can be produced using a known method.
- a chimeric antibody is an antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable region and a human antibody heavy chain and light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region.
- a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, and is obtained by transplanting a complementarity determining region (CDR; complementarity determining region) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, to the complementarity determining region of a human antibody.
- CDR complementarity determining region
- FR framework region
- the obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding a human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP239400, International Patent Application Publication No. WO96). / 02576).
- a complementarity determining region that forms a favorable antigen binding site is selected.
- the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer). Res, 1993, 53, 851-856.).
- a method for obtaining a human antibody is also known.
- human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to form a desired human antibody having binding activity to the antigen.
- a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585).
- WO96 / 34096, WO96 / 33735 ).
- variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
- scFv single chain antibody
- the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared from the sequence to obtain a human antibody.
- these antibodies may be low molecular weight antibodies such as antibody fragments (fragments) or modified antibodies as long as the characteristics are not lost.
- specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, Diabody, and the like.
- genes encoding these antibody fragments are constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al.). al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A.,. Methods Enzymol.
- modified antibody an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
- PEG polyethylene glycol
- Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
- the antibody and antibody fragment of the present invention can be produced by any appropriate method, for example, in vivo, cultured cells, in vitro translation reaction, and recombinant DNA expression system.
- DCIR or a fragment thereof can be used as an immunogen to immunize by subcutaneous or intraperitoneal injection into any animal (mouse, rabbit, etc.) known to produce antibodies.
- Adjuvants may be used during immunization and such adjuvants are well known in the art.
- Polyclonal antibodies are obtained by isolating antisera containing antibodies from immunized animals and using methods well known in the art such as ELISA assay, Western blot analysis, or radioimmunoassay to detect antibodies with the desired specificity. It can be obtained by screening for the presence.
- Monoclonal antibodies can be obtained by excising spleen cells from an immunized animal and fusing them with myeloma cells to produce hybridoma cells that produce monoclonal antibodies.
- Hybridoma cells producing an antibody that recognizes the protein of interest or a fragment thereof are selected using methods well known in the art such as ELISA assay, Western blot analysis, or radioimmunoassay.
- a hybridoma that secretes the desired antibody is cloned, cultured under appropriate conditions, and the secreted antibody is recovered and purified using methods well known in the art, such as ion exchange columns, affinity chromatography, and the like. be able to.
- a human monoclonal antibody may be produced using a xenomous strain (Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23, 1999; Wells, Eek, Chem Biol 2000 Aug; 7 (8): R185-6. See).
- monoclonal antibodies based on phage display without immunization are currently being produced, and the antibodies of the present invention may be produced by any of these methods.
- the pharmaceutical of the present invention can be formulated by mixing, dissolving, granulating, tableting, emulsifying, encapsulating, lyophilizing, etc. with a pharmaceutically acceptable carrier well known in the art.
- KS-II or anti-DCIR antibody is used together with pharmaceutically acceptable solvents, excipients, binders, stabilizers, dispersants, etc., as well as tablets, pills, dragees, soft capsules, hard capsules. It can be formulated into dosage forms such as capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, slurries and the like.
- KS-II or anti-DCIR antibody for parenteral administration, KS-II or anti-DCIR antibody, together with pharmaceutically acceptable solvents, excipients, binders, stabilizers, dispersants, etc., for injection solutions, suspensions, emulsions, It can be formulated into dosage forms such as creams, ointments, inhalants, suppositories and the like.
- the therapeutic agents of the invention can be dissolved in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers such as Hanks's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer.
- the composition can take the form of a suspension, solution, emulsion, or the like in an oily or aqueous vehicle.
- KS-II or anti-DCIR antibody may be produced in powder form, and an aqueous solution or suspension may be prepared using sterilized water or the like before use.
- KS-II or anti-DCIR antibody can be powdered and made into a powder mixture with a suitable base such as lactose or starch.
- Suppository formulations can be prepared by mixing KS-II or anti-DCIR antibody with a conventional suppository base such as cocoa butter.
- the therapeutic agent of the present invention can be encapsulated in a polymer matrix or the like and formulated as a sustained release preparation.
- the dose of KS-II or anti-DCIR antibody varies depending on the patient's symptoms, administration route, body weight, age, etc., but is preferably 1 ⁇ g to 500 mg per day for adults, for example.
- Dcir Knockout mice Dcir ⁇ / ⁇ mice were generated by conventional gene targeting methods according to the procedure described in Nature Medicine, 2008, vol 14, no 2: 176-180.
- Dcir ⁇ / ⁇ mice were backcrossed with C57BL / 6J (SLC) for 8-9 generations prior to use in experiments.
- the deletion of the Dcir gene in mice was confirmed by genomic Southern blot analysis (FIG. 1e).
- Northern blot hybridization analysis confirmed the absence of Dcir mRNA expression in the spleen (FIG. 1f).
- the mouse bone phenotype was analyzed by the following method.
- Computed tomography The analysis of the thigh and joint by three-dimensional micro CT was performed using R_mCT (manufactured by Rigaku Mechatronics).
- analysis and quantification of the thigh by two-dimensional micro CT were performed using Scan Xmate-A090S (manufactured by Comscan Techno) and TRI / 2D-BON system (manufactured by Ratok System Engineering).
- analysis and quantification by the peripheral bone quantitative CT (PQCT) of the thigh were performed using an XCT Research SA + system (Stratec Meditechnik GmbH).
- Calcein (1.6 mg / kg body weight) was injected subcutaneously twice every 3 days for dynamic histomorphometry analysis. Four days after the first injection, the tibia was subdivided and fixed with 70% ethanol. A non-decalcified frozen section having a thickness of 5 ⁇ m was prepared using Leica CM3050S cryostat (manufactured by Leica Microsystems). Bone mineralization rate and bone formation rate were analyzed using Zeiss Axioskop and Osteoplan II (Carl Zeiss).
- mice The nose-anus length of mice was measured twice a week to generate a growth curve. Newborn mice were fixed with 100% ethanol for 4 days, then transferred to an acetone solution, washed 3 days later with water, 0.1% alizarin red S (manufactured by Sigma) / 1 part by weight of 95% ethanol, 0.3% Al Cyan blue 6GX (manufactured by Sigma) / 70% ethanol 1 part by weight, 100% acetic acid 1 part by weight and ethanol 17 parts by weight were stained for 10 days. After washing with 96% ethanol, the specimens were stored in 20% glycerol / 1% potassium hydroxide at room temperature until skeletal formation was clearly visible, then transferred to 100% glycerol for storage.
- Non-adherent bone marrow cells are seeded in well plates (5 ⁇ 10 5 cells / well in 24 well plates or 3 ⁇ 10 6 cells / well in 6 well plates) and 10% The cells were cultured in ⁇ -MEM (GIBCO) containing FCS (manufactured by Biowest) and 10 ng / mL M-CSF (manufactured by R & D Systems). Two days later, non-adherent cells (including lymphocytes) were washed away, and the remaining adherent cells were used as bone marrow-derived macrophages (BMM).
- osteoclast precursor cells were further cultured in the presence of 100 ng / mL soluble RANKL (manufactured by Peprotech or Oriental Yeast) and 10 ng / mL M-CSF to obtain osteoclasts. Three days later, osteoclasts were fixed in 10% neutral buffered formalin for 3 minutes and further stored in an ethanol / acetone mixture (50:50 v: v) for 1 minute, followed by TRAP staining solution (Naphthol AS-MX phosphorous).
- Acid salt 5 mg; N, N-dimethylformide 0.5 mL; fast red violet LB salt 30 mg; 50 mM sodium tartrate-containing 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0, 50 mL) at room temperature).
- TRAP positive multinucleated cells MNC; ⁇ 3 nuclei) were counted.
- osteoclasts were generated for 2 days in the presence of 30 ng / mL M-CSF and then treated with 30 ng / mL M-CSF and 150 ng / mL RANKL for an additional 3 days.
- the cells are collected using trypsin, the collected cells are seeded (1 ⁇ 10 5 cells / well in a 96-well plate), and 30 ng / mL M-CSF and 150 ng / mL RANKL are used on the dentin slice. Cultured for 2 days. Samples were sonicated in 1 molar NH 4 OH and stained with hematoxylin. TRAP-negative MNC and the area eroded by the absorption pits were observed and measured using Biorevo BZ-9000 (manufactured by Keyence).
- mouse GM-CSF enzyme immunoassay PerSeptive Biosystems
- recombinant GM-CSF Peprotech
- anti-mouse GM-CSF neutralizing antibody R & D Systems
- pOCs were seeded (1 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate), with 10 ng / mL M-CSF alone, or with M-CSF + 100 ng / mL RANKL or 20 ng / mL GM-CSF Cultured for 3 days. Cells were then exposed overnight with [ 3 H] TdR (0.5 ⁇ Ci / mL).
- primary osteoblasts 96-well plates in 2 ⁇ 10 4 cells / well, 24-well plates in 5 ⁇ 10 4 cells / well, or 6-well plates 2 ⁇ 10 5 cells / well
- the cells were cultured until confluent and replaced with a medium supplemented with 10 mM ⁇ -glycerophosphate and 50 ⁇ g / mL ascorbic acid.
- the medium was changed 3 times in 21 days.
- the osteoblasts cultured for 21 days were subjected to alizarin red staining, von Kossa staining, and alkaline phosphatase (ALP) staining.
- ALP alkaline phosphatase
- the reaction solution was removed, washed with PBS, dried, and photographed with BIOREVO (KEYENCE). (3) von Kossa staining After the osteoblasts cultured for 21 days were removed with ion-exchanged water, they were fixed with 3.7% formalin solution for 30 minutes. Thereafter, it was washed again with ion-exchanged water and reacted with a 5% silver nitrate solution (nacalai tesque) for 15 minutes under direct sunlight. To stop the reaction, 5% silver nitrate solution was removed, 5% sodium thiosulfate was added, and the mixture was allowed to stand for 2 minutes.
- BIOREVO BIOREVO
- BMC bone marrow cells
- RT-PCR analysis Semi-quantitative RT-PCR and real-time RT-PCR are basically modified with Nature Medicine, 2008, vol 14, no 2: 176-180 and Arthritis Res Ther, 2006, 8, This was carried out according to the method described in R100, 1-13.
- Total RNA was prepared by standard guanidinoacetic acid thiocyanate / phenol chloroform method or by using Sepasol-RNA I Super (Nacalai Tesque). The prepared RNA was reverse-transcribed using SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) to prepare cDNA.
- Semi-quantitative RT-PCR was performed using the cDNA prepared above as a template.
- the reaction solution was 20 ⁇ l per sample, 10 ⁇ PCR reaction buffer (Roche) 2 ⁇ l, dNTPs (Roche) 1.6 ⁇ l, primer listed in Table 1 0.4 ⁇ l, Taq DNA polymerase (Roche) 0.2 ⁇ l, template DNA 1 ⁇ l
- an amplification reaction was performed using iCycler (Bio-Rad).
- the reaction solution after PCR was separated by electrophoresis for 30 minutes at a constant voltage of 100 V using a 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide for 15 minutes (0.05 ⁇ g / mL), and then UV illuminator ( DNA fragments were detected with BAS-III).
- Real-time RT-PCR was performed using the primers shown in Table 1, the SYBR Green qPCR kit (manufactured by Invitrogen), and iCycler (manufactured by Bio-Rad).
- Phospho-p38 MAPK (Thr180 / Tyr182); p38 MAPK; Phospho-p44 / 42 MAPK (Thr202 / Tyr204); p44 / 42 MAPK (137F5); Phospho-SAPK / JNK (Thr183 / Tyr185: 81E11); SAPK / JNK (56G8); Phospho-Akt (Thr3O8; C31E5); Akt (pan) (C67E7); Phospho-NF- ⁇ B p65 (Ser536; 93H1); NF- ⁇ B p65 (C22B4); Phospho-PLC ⁇ 1 (Tyr783); PLC ⁇ 1; Phospho-PLC ⁇ 2 (Tyr759); PLC ⁇ 2; ⁇ -tubulin (Abcam); Phospho-Stat5 (Tyr694) (Cell Signaling Technology); Stat5 (C17) (Santa Cruz Biotechnology) Anti-rabbit IgG, HRP-Linked Antibody (Cell
- sugar chain and sugar chain binding assay A purified product of bovine articular cartilage-derived keratan sulfate (KS-II) is described in K. Yoshida (RIKEN) and A.I. Obtained from Tawaza (Hydrox Inc.). Other sugar chains (bovine cornea-derived keratan sulfate, whale joint-derived chondroitin sulfate A, pig skin-derived chondroitin sulfate (dermatan sulfate), and N-acetyllactosamine) were purchased from Seikagaku Biobusiness. The sugar chain binding assay was performed according to the method described in J Bio Chem, 2004, 279, 29043-29049.
- KS-II was diluted with 100 mM sodium acetate (pH 5.5) to a concentration of 2 mg / mL, and oxidized with 2 mM sodium metaperiodate for 1 hour on ice to obtain a reactive aldehyde group. After further dilution, KS-II was incubated overnight at 4 ° C. on a Covalent ELISA plate, after which KS-II was reduced with 0.3% sodium borohydride for 1.5 hours at room temperature. Covalently bound by The plate was washed and blocked with 2% bovine serum albumin (fraction V: Sigma) for 2 hours at 37 ° C.
- mDCIR Recombinant mouse DCIR
- mDCIR Recombinant mouse DCIR
- mDCIR was transformed into E. coli using the pGMT7 plasmid.
- mDCIR was incubated overnight at 4 ° C. on blocked plates expressed as inclusion bodies of E. coli BL21 (DE3) pLysS and refolded by standard dilution methods. Protein binding was detected using anti-DCIR antibody (mixture of 320507 and 320511: R & D Systems) and HRP-conjugated rat IgG (Zymed) in the presence of TMB substrate (Dako).
- WT wild type
- DCIR calcium marrow-derived osteoclasts
- OB primary osteoblasts
- FIG. 4 The expression of DCIR in mouse bone was then measured by PT-PCR.
- DCIR was expressed in bone marrow-derived osteoclasts (OC) and primary osteoblasts (OB), but not in primary chondrocytes (FIG. 4). This result also supports the involvement of Dcir in bone metabolism. Growth curves based on nasal-anal length and bone staining of newborn mice with alizarin blue and alizarin red showed that bone develops normally in Dcir ⁇ / ⁇ mice (FIG. 5). ).
- Osteosclerosis is observed in animals with chondrocyte, OC or OB abnormalities (Genes Dev, 1999, 13, 3037-3051).
- the bones of mice were examined by histomorphometry.
- the thickness of the proliferative layer in the proximal part of the tibial growth plate was not different between WT and KO mice, indicating that chondrocytes are normally formed in KO mice (FIGS. 2c and d).
- the number of TRAP positive OCs and OC surface area in trabecular bone were significantly increased in KO mice (FIGS. 2e, f).
- Nfatcl T cell activated nuclear factor 1
- Nfatc2 T cell activated nuclear factor 2
- OC differentiation from BMC is controlled by a signal transduction pathway activated by RANK and immunoreceptor tyrosine-based activation motivating adapter (ITAM possessing adapter) (Nature, 2004, 428, 758-763), these cells Signal transduction downstream of RANK was investigated.
- RANKL-induced activation of MAPK p38, ERK, JNK
- Akt and NF- ⁇ B all located downstream of TRAF6
- RANKL-induced adapter-dependent tyrosine phosphorylation of PLC ⁇ 1 and PLC ⁇ 2 Oxidation was also unchanged in WT and mature OC ( Figure 6g, h).
- Example 3 Identification of DCIR Ligand No ligand for DCIR has been reported so far. Therefore, the present inventors searched for a sugar chain that binds to DCIR using a public glycan array database in order to identify an in vivo DCIR ligand involved in osteoclast formation. As a result, a sugar chain having a sulfated galactose ⁇ 1-4 N-acetyl-D-glucosamine (N-acetyllactosamine or LacNAc) structure (FIG. 8a) was identified as a DCIR ligand.
- N-acetyllactosamine or LacNAc N-acetyllactosamine
- Sulfated poly-LacNAc is a proteoglycan sulfated glycosaminoglycan (GAG) in the interior of keratan sulfate (KS) mainly present in the cornea (N-linked KS-I) and articular cartilage (O-linked KS-II). ) A molecule that exists as a side chain. Therefore, when KS expression in mouse joints and bone marrow cells (BMC) was examined, it was confirmed that KS was expressed in these regions.
- GAG proteoglycan sulfated glycosaminoglycan
- OC differentiation was not affected by corneal KS-I, non-sulfated LacNAc, or other sulfated glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate (CS) or dermatan sulfate (DS) (FIG. 8e).
- CS chondroitin sulfate
- DS dermatan sulfate
- ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibitory activity
- KS-II is a DCIR-specific ligand and is involved in the inhibition of osteoclast formation through DCIR activation.
- Example 4 Role of Dcir in Osteoblast (OB) Formation The role of Dcir in osteoblast (OB) formation was investigated. Primary parietal OB proliferation was similar in both WT and Dcir ⁇ / ⁇ mice (FIG. 9). In OBs derived from calvarial bone, Dcir was expressed after induction of osteogenic differentiation by ⁇ -glycerophosphate and ascorbic acid, and its expression continued throughout the mineralization process (FIG. 10a). In Dcir ⁇ / ⁇ OB, calcium (FIG. 10b), calcium phosphate addition (FIG. 10c) and alkaline phosphatase (ALP) expression (FIG. 10d) were enhanced in the early stage of culture (day 14).
- Example 5 Production of Anti-DCIR Antibody (1) Production of DCIR-expressing cells An expression vector containing a Dcir gene is obtained by amplifying nucleotides 137 to 989 of a sequence containing a Dcir gene (NM_011999) by the PCR method, and a pcDNA3.1 + vector. 293T cells and COS7 cells were transduced using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After about 48 hours, the cells were collected and stored frozen. (2) Confirmation of DCIR expression The transient expression cells prepared in (1) were subjected to Western blot using an anti-DCIR antibody for DCIR-expressing cells and their wild strains, and the vicinity of 35 kDa predicted specifically for DCIR-expressing cells.
- Hybridomas were subjected to primary screening using Cell ELISA / flow cytometry (FCM).
- Cell ELISA Frozen stock cells (transfectants) were put to sleep, suspended in 0.5% BSA / 2 mM EDTA / PBS, and dispensed at 100 ⁇ L / well onto a plate for Cell ELISA (NUNC 249570 96V NW PS). . 1 ⁇ 10 7 cells were used per 96-well plate. After centrifugation at 2000 rpm and 4 ° C. for 2 minutes, the supernatant was discarded, and 50 ⁇ L / well of the culture supernatant collected in (4) was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
- Goat anti-mouse IgG-POD labeling (MBL product Code. 330) was added to Buffer (manufactured by MBL). (Diluted solution) was diluted 10,000 times and reacted at room temperature for 30 minutes. After washing three times, a chromogenic substrate was added to develop color for 5 to 10 minutes. Absorbance was measured at 450-620 nm.
- FCM Fluorescence-Coupled Device Reactivity with the DCIR-expressing cells obtained in (2) was confirmed by FCM for the culture supernatant of clones that could be positive in Cell ELISA.
- the culture supernatant stock solution was reacted with cells at room temperature for 30 minutes, washed twice, and then reacted with FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (MBL product IM-0819) at a dilution of 100 times for 30 minutes. After washing twice, it was suspended in 400 ⁇ l of buffer and measured with FC500 (Beckman Coulter). For washing and cell suspension buffer, 0.5 mM EDTA, 5% BSA PBS was used. In order to remove artifacts such as false positives, the reactivity was confirmed several times while performing subculture.
- Monocloning was performed on the hybridoma selected from the culture supernatant of the hybridoma judged positive in the primary screening of (5).
- Logarithmically growing hybridomas are collected after pipetting with a Pasteur pipette, diluted with medium, adjusted to a cell concentration of 1 to 32,000 cells per well, and seeded in a 96-well plate did. After confirming the formation of a single colony of the hybridoma (1-2 weeks later), the culture supernatant was collected from the well plate, and the activity was confirmed according to the method of (5).
- Example 6 Evaluation of Anti-DCIR Antibody The binding ability of the hybridoma-derived anti-DCIR antibody prepared in Example 4 to DCIR was evaluated. Since DCIR has been shown to be involved in the suppression of immune responses (Nature Medicine, 2008, vol 14, no 2: 176-180), the expression of tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ), an inflammatory cytokine, is suppressed. The DCIR binding ability of the antibody was evaluated based on the standard. The hybridoma prepared in Example 4 was cultured for 12 hours in a medium containing CpG (concentration 1 ⁇ M), and the culture supernatant was collected.
- CpG concentration 1 ⁇ M
- CpG ODN 1668 strain (Operon) was cultured in the same medium or the same medium further containing keratan sulfate (KS-II; 10 ng / mL), and the supernatant was collected.
- KS-II keratan sulfate
- cells were cultured in a CpG-free medium (NT).
- the amount of TNF- ⁇ produced in the supernatant was measured by ELISA. The results are shown in FIG.
- TNF- ⁇ production was induced by culturing the cells in a medium containing CpG (CpG). When NF-II, a native DCIR ligand, was added to the medium, TNF- ⁇ production was suppressed (CpG + KS).
- hybridoma-derived antibodies In a plurality of hybridoma culture supernatants, TNF- ⁇ production was suppressed more than when KS-II was added (3, 4, and 5 strains in FIG. 12). These hybridoma-derived antibodies have a higher DCIR binding ability than KS-II, which is a native DCIR ligand, and are useful as DCIR agonists that promote DCIR activity. On the other hand, in some hybridoma culture supernatants, TNF- ⁇ production was promoted more than when KS-II was added (1 and 2 strains in FIG. 12). These hybridoma-derived antibodies are useful as DCIR antagonists that suppress the activity of DCIR. Further, as shown in the above results, a substance capable of specifically activating or suppressing DCIR can be evaluated or selected using the action of KS-II, which is a native DCIR ligand, on DCIR as an index.
- Example 7 Effect of Anti-Dcir Antibody on Osteoclast Formation Furthermore, the effect of the above-described antibody on osteoclast formation was evaluated using the action of keratan sulfate as an index.
- Non-adherent bone marrow cells are seeded into well plates (1 ⁇ 10 5 cells / well in 96-well plates) and contain 10% FCS (Biowest) and 10 ng / mL M-CSF (R & D Systems) The cells were cultured in ⁇ -MEM (GIBCO). Two days later, non-adherent cells (including lymphocytes) were washed away, and the remaining adherent cells were used as bone marrow-derived macrophages (BMM).
- ⁇ -MEM ⁇ -MEM
- osteoclast precursor cells were further cultured in the presence of 100 ng / mL soluble RANKL (manufactured by Peprotech or Oriental Yeast) and 10 ng / mL M-CSF to obtain osteoclasts. Hybridoma supernatant (1/10 volume) or keratan sulfate (KS-II; 10 ng / mL) was added during the culture period. Three days later, the cells were collected, stained with TRAP, and the number of TRAP-positive osteoclasts (3 or more nuclei) was counted. Untreated cells served as controls (NT). The results are shown in FIG.
- DCIR agonists such as the antibodies derived from the hybridomas of the present invention have the effect of increasing bone mass by suppressing osteoclast differentiation, such as osteopenic diseases such as osteoporosis, fractures, etc. It has been shown to be useful in the treatment of bone disorders.
- DCIR antagonists such as antibodies derived from other hybridomas of the present invention also have an action of adjusting bone mass by promoting osteoclast differentiation, suggesting that they are useful in the treatment of various bone diseases.
- Test Example The effect on collagen-induced arthritis can be confirmed as follows. Materials and methods: Mouse C57BL / 6 (B6) (H-2 b ) Collagen-induced arthritis (CIA): Complete proint adjuvant (CFA) was obtained by adding 100 mg of M. tuberculosis, H37Ra; Difco Laboratories, Detroit, MI to 20 mL of IFA (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Prepare by crushing. The emulsion is prepared by dissolving 2 mg / mL chicken type II collagen (CII) (manufactured by Sigma) in 10 mM acetic acid at 4 ° C. overnight and mixing with an equal volume of CFA.
- CFA Complete proint adjuvant
- the mixture is emulsified using a syringe-syringe method.
- the CII solution and its CFA emulsion are always prepared fresh.
- Mice are injected intradermally with several 100 ⁇ l emulsions containing a total of 100 ⁇ g CII and 250 ⁇ g M. tuberculosis in several locations on the dorsal base near the tail. This injection is repeated for 21 days.
- Clinical evaluation of arthritis Animals are evaluated for redness and swelling of the limbs.
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Abstract
ＤＣＩＲのリガンドを見出し、その刺激剤及び拮抗剤を探索する。 ケラタン硫酸－ＩＩ（ＫＳ－ＩＩ）を有効成分とする樹状細胞免疫受容体刺激剤、ケラタン硫酸－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、ケラタン硫酸－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体。
Description
本発明は、樹状細胞免疫受容体（Ｄｅｎｄｒｉｃ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＤＣＩＲ）に対するリガンド、抗ＤＣＩＲ抗体及びそれらの利用に関する。
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｃ Ｃｅｌｌ：ＤＣ）は主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、免疫系の調節において中枢的な役割を担っている。近年、幾つかのＣ型レクチン受容体類（ＣＬＲ類）が樹状細胞の表面に発現されるとのキャラクタリゼーションがなされた。Ｉ型のＣＬＲ類メンバーであるＭＭＲ（ＣＤ２０６）及びＤＥＣ－２０５（ＣＤ２０５）は、そのＮ末端に複数のカルシウム依存性細胞外糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）を有する。樹状細胞上に発現するＣＬＲの第２のファミリーは、Ｃ末端に唯一のＣＲＤを持つＩＩ型タンパク質であり、それらはＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、Ｌａｎｇｅｒｉｎ（ＣＤ２０７）、ＣＬＥＣ－１、Ｄｅｃｔｉｎ－１（β－ＧＲ）、Ｄｅｃｔｉｎ－２、ＤＬＥＣ、及びＤＣＩＲを含む。
ＤＣＩＲはＬＬＩＲとも呼ばれ、ヒト及びマウスの主に樹状細胞上に発現するＩＩ型膜タンパク質である。この分子は細胞外ドメインに一つの糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）を持ち、細胞内ドメインにコンセンサスＩＴＩＭを持つ。ＩＴＩＭは細胞内に抑制的シグナルを伝達するので、マウスＤＣＩＲは抑制的な受容体として働き、樹状細胞機能を調節することが示唆された。
本発明者らは、先にＤＣＩＲノックアウトマウスの作製に成功し、当該マウスを用いた検討により、ＤＣＩＲが関節炎や関節リウマチの進展に関与していることを報告した（特許文献１、非特許文献１）。
本発明者らは、先にＤＣＩＲノックアウトマウスの作製に成功し、当該マウスを用いた検討により、ＤＣＩＲが関節炎や関節リウマチの進展に関与していることを報告した（特許文献１、非特許文献１）。
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．２，ｐ１７６－１８０，ＦＥＢＲＵＡＲＹ ２００８
しかしながら、ＤＣＩＲに対する内因性のリガンドは未だ発見されておらず、本来の意味でのＤＣＩＲの生体内での作用メカニズムは解明されていない。また、ＤＣＩＲ刺激剤やＤＣＩＲ拮抗剤も全く見出されていない。
従って、本発明の課題は、ＤＣＩＲのリガンドを見出し、その刺激剤及び拮抗剤を探索し、その応用を図ることにある。
そこで本発明者は、ＤＣＩＲのリガンドを見出すべく種々検討した結果、全く意外にもそのリガンドがケラタン硫酸－ＩＩ（ＫＳ－ＩＩ）であることを見出し、さらにＫＳ－ＩＩとＤＣＩＲとの結合による作用を検討したところ、ＫＳ－ＩＩはＤＣＩＲに結合することにより、骨芽細胞及び破骨細胞の機能を制御しており、特に破骨細胞形成を強く抑制しており、また炎症を抑制していることを見出した。これらの知見に基づき、さらに、ＤＣＩＲに対する抗体を作製し、その作用を検討したところ、抗ＤＣＩＲ抗体の中には、ＫＳ－ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗体だけでなく、ＫＳ－ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗体が存在することを見出した。また該ＫＳ－ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗ＤＣＩＲ抗体は優れた破骨細胞成形抑制作用、ＴＮＦ－α産生抑制作用を有し、骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患の予防治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ＫＳ－ＩＩを有効成分とする樹状細胞免疫受容体刺激剤を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩの存在下またはＫＳ－ＩＩを対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定することを特徴とする樹状細胞免疫受容体刺激剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩの存在下またはＫＳ－ＩＩを対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定することを特徴とする樹状細胞免疫受容体刺激剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、及びこれを含有する医薬を提供するものである。
さらに本発明は、ＫＳ－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、及びこれを含有する医薬を提供するものである。
さらに本発明は、ＫＳ－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、及びこれを含有する医薬を提供するものである。
また、本発明は、樹状細胞免疫受容体を刺激するために使用するＫＳ－ＩＩを提供するものである。
また、本発明は、樹状細胞免疫受容体刺激剤製造のための、ＫＳ－ＩＩの使用を提供するものである。
また、本発明は、樹状細胞免疫受容体刺激剤製造のための、ＫＳ－ＩＩの使用を提供するものである。
また、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患を予防又は治療するために使用する、ＫＳ－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患予防治療剤又は炎症性疾患予防治療剤製造のための、ＫＳ－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。
また、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患予防治療剤又は炎症性疾患予防治療剤製造のための、ＫＳ－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。
また本発明は、がん治療又は免疫賦活のために使用する、ＫＳ－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、抗がん剤又は免疫賦活剤製造のための、ＫＳ－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。
また、本発明は、抗がん剤又は免疫賦活剤製造のための、ＫＳ－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩを投与することを特徴とする樹状細胞免疫受容体の刺激方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を投与することを特徴とする骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する抗体を投与することを特徴とするがんの予防治療方法又は免疫賦活方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を投与することを特徴とする骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する抗体を投与することを特徴とするがんの予防治療方法又は免疫賦活方法を提供するものである。
本発明によれば、ＫＳ－ＩＩがＤＣＩＲのリガンドであることが見出され、これは破骨細胞の形成抑制作用等を有し、新たな医薬として有用である。また、抗ＤＣＩＲ抗体のうち、ＫＳ－ＩＩ様作用を有する抗体は、ＤＣＩＲ刺激作用を有し、骨代謝異常を伴う疾患、炎症性疾患等の予防治療剤として有用である。一方、ＫＳ－ＩＩ阻害作用を有する抗体は、ＤＣＩＲ拮抗作用を有し、抗がん剤、免疫賦活剤等として有用である。
本発明のＤＣＩＲ刺激剤の有効成分はＫＳ－ＩＩである。ケラタン硫酸は、ガラクトース（Ｇａｌ）にＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した、Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃの基本構造を有する硫酸化グリコサミノグリカンである。ケラタン硫酸には、骨や軟骨由来でＯ－グリコシド結合でタンパク質と結合するＫＳ－ＩＩと、角膜由来でＮ－グリコシド結合でタンパク質と結合するＫＳ－Ｉとが存在するが、本発明ではＫＳ－ＩＩのみが使用できる。ＫＳ－Ｉには本発明の作用はない。ＫＳ－ＩＩは、炎症等に関与することが知られている（特許文献１）が、ＤＣＩＲとの関係については全く知られていなかった。
ＫＳ－ＩＩには、Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃの繰り返し数及び硫酸残基数により種々の構造のものが存在するが、本発明ではいずれのものも使用できる。
これらのＫＳ－ＩＩは、骨や軟骨由来のもの、また市販のものを使用することができる。
これらのＫＳ－ＩＩは、骨や軟骨由来のもの、また市販のものを使用することができる。
後記実施例に示すように、ＫＳ－ＩＩは、ＤＣＩＲのリガンドであり、ＤＣＩＲに結合することにより種々の作用を示す。すなわち、ＫＳ－ＩＩはＤＣＩＲに結合することにより、骨芽細胞の成熟化と骨基質形成を阻害し、オステオポンチンの生産を促進する作用を有する。一方で、ＫＳ－ＩＩは、ＤＣＩＲに結合することにより、破骨細胞の形成を強力に抑制することも判明した。また、その作用はＧＭ－ＣＳＦ依存性の破骨前駆細胞の増殖を阻害することによるものである。なお、ＫＳ－ＩはＤＣＩＲのリガンドではない。
従って、ＫＳ－ＩＩは、骨形成調節剤として有用であり、種々の骨疾患、例えば骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎等の予防治療剤として有用である。
従って、ＫＳ－ＩＩは、骨形成調節剤として有用であり、種々の骨疾患、例えば骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎等の予防治療剤として有用である。
また、ＫＳ－ＩＩはＤＣＩＲのリガンドであるから、ＫＳ－ＩＩの存在下あるいはＫＳ－ＩＩを対照として、被検物質のＤＣＩＲへの結合性を測定すれば、ＤＣＩＲ刺激剤又はＤＣＩＲ拮抗剤のスクリーニングが可能である。より具体的には、ＫＳ－ＩＩ及び被検物質のＤＣＩＲへの結合性を測定し、ＫＳ－ＩＩとＤＣＩＲとの結合性と対比すれば、被検物質がＤＣＩＲの刺激剤か拮抗剤かが判定できる。ここでＤＣＩＲへの結合性の測定は、ＫＳ－ＩＩの作用、例えば破骨細胞形成能、ＴＮＦ－α産生に対する作用、Ｉ型ＩＦＮ産生に対する作用により判定してもよい。
ＤＣＩＲ刺激剤又はＤＣＩＲ拮抗剤のスクリーニングは、インビトロでもインビボでも行うことができる。インビボの場合には、破骨細胞形成能、ＴＮＦ－α産生に対する作用、Ｉ型ＩＦＮ産生に対する作用により判定するのが好ましい。
本発明の抗ＤＣＩＲ抗体には、ＫＳ－ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗ＤＣＩＲ抗体（抗ＤＣＩＲアゴニスティック抗体）と、ＫＳ－ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗ＤＣＩＲ抗体（抗ＤＣＩＲアンタゴニスティック抗体）とがある。
本発明において、ＫＳ－ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有するとは、ＫＳ－ＩＩと同様のＤＣＩＲ刺激作用を有すればよく、他の物質によりＤＣＩＲ刺激作用を有する場合も含まれる。
本発明において、ＫＳ－ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有するとは、ＫＳ－ＩＩと同様のＤＣＩＲ刺激作用を有すればよく、他の物質によりＤＣＩＲ刺激作用を有する場合も含まれる。
ＫＳ－ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗体のうち、ＤＣＩＲに対する結合性がＫＳ－ＩＩと同等またはそれよりも高いものが好ましく、当該結合性は１．２倍以上高いものが好ましく、２倍以上がより好ましく、５倍以上高いものがさらに好ましい。当該結合性は、ＤＣＩＲに対する結合性を直接測定してもよいが、破骨細胞形成抑制能、ＴＮＦ－α産生抑制作用などの活性を指標に測定してもよい。
本発明におけるＫＳ－ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗体は、破骨細胞形成抑制作用及びＴＮＦ－α産生阻害作用を有し、その作用はＫＳ－ＩＩと同等もしくはそれよりも強い。従ってＫＳ－ＩＩ様抗ＤＣＩＲ抗体は、骨吸収性疾患などの骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患等の予防治療剤として有用である。骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患の例としては、例えば、骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎、関節リウマチなどを挙げることができる。ＫＳ－ＩＩ様抗ＤＣＩＲ抗体が、これらの疾患に有効であることは、例えばコラーゲン誘発関節炎モデルを用いて確認することができる。
ＫＳ－ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗体のうち、ＤＣＩＲに対する結合性がＫＳ－ＩＩと同等もしくはそれよりも高いものが好ましく、当該結合性は１．２倍以上のものが好ましく、２倍以上のものがより好ましく、５倍以上のものがさらに好ましい。
ＫＳ－ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗体は、強い破骨細胞形成促進作用及びＴＮＦ－α産生促進作用を有する。従ってＫＳ－ＩＩ阻害性抗ＤＣＩＲ抗体は、抗がん剤、免疫賦活剤等として有用である。
本発明の抗ＤＣＩＲ抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ならびに抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体及びＴ－細胞レセプターフラグメント等の、抗体の変種及び誘導体が含まれる。
また、本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６．）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
また、これらの抗体は、その特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８－２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６－４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７－５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２－６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３－６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２－１３７参照）。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
本発明の抗体及び抗体フラグメントは、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、及び組換えＤＮＡ発現系により製造することができる。
モノクローナル抗体及びハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１－２１，１９８０）。ＤＣＩＲ又はそのフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下又は腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。
ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。
モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とする蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１－２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０００ Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５－６を参照）。また、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も現在行われており、本発明の抗体はこれらの方法のいずれで製造されてもかまわない。
本発明の医薬は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
経口投与用には、ＫＳ－ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
非経口投与用には、ＫＳ－ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、ＫＳ－ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、ＫＳ－ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、ＫＳ－ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
ＫＳ－ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ～５００ｍｇであるのが好ましい。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
（実験方法）
全ての動物実験は、東京大学医科学研究所動物使用委員会の承認を得、動物実験のための安全ガイドライン及び遺伝子複製実験のための倫理ガイドラインに従って行われた。
（実験方法）
全ての動物実験は、東京大学医科学研究所動物使用委員会の承認を得、動物実験のための安全ガイドライン及び遺伝子複製実験のための倫理ガイドラインに従って行われた。
１．Ｄｃｉｒノックアウト（ＫＯ）マウスの作製
Ｄｃｉｒ－／－（ＫＯ）マウスは、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０に記載される手順に従って、通常の遺伝子ターゲティング法によって作製した。
５’末端相同領域、ＢａｍＨＩサイト、ＥｃｏＲＩサイト、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、３’末端にネガティブセレクションのためのジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ）を含むターゲティングベクターを作製した。これを用いて、マウス由来ＥＳ細胞のＤｃｉｒ遺伝子のエキソン１及び２をＮｅｏで置換することにより、ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ）を含む細胞質領域及び膜貫通ドメインの大部分をコードするゲノム配列を欠損させた（図１ａ）。ＥＳクローンからの遺伝子をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ処理した後、サザンブロットハイブリダイゼーション解析によってスクリーニングし、５’プローブ（図１ｂ）、３’プローブ（図１ｃ）及びＮｅｏプローブ（図１ｄ）を用いて遺伝子の欠損を確認した。Ｄｃｉｒ欠損ＥＳクローンを用いてＤｃｉｒ＋／－マウスを作製し、Ｄｃｉｒ＋／－マウスの交配によりＤｃｉｒ－／－マウスを作製した。Ｄｃｉｒ－／－マウスは実験に用いる前に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ）と８～９世代戻し交配させた。
マウスにおけるＤｃｉｒ遺伝子の欠損は、ゲノムサザンブロット解析によって確認した（図１ｅ）。ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって脾臓におけるＤｃｉｒ ｍＲＮＡの発現が欠損していることを確認した（図１ｆ）。
Ｄｃｉｒ－／－（ＫＯ）マウスは、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０に記載される手順に従って、通常の遺伝子ターゲティング法によって作製した。
５’末端相同領域、ＢａｍＨＩサイト、ＥｃｏＲＩサイト、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、３’末端にネガティブセレクションのためのジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ）を含むターゲティングベクターを作製した。これを用いて、マウス由来ＥＳ細胞のＤｃｉｒ遺伝子のエキソン１及び２をＮｅｏで置換することにより、ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ）を含む細胞質領域及び膜貫通ドメインの大部分をコードするゲノム配列を欠損させた（図１ａ）。ＥＳクローンからの遺伝子をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ処理した後、サザンブロットハイブリダイゼーション解析によってスクリーニングし、５’プローブ（図１ｂ）、３’プローブ（図１ｃ）及びＮｅｏプローブ（図１ｄ）を用いて遺伝子の欠損を確認した。Ｄｃｉｒ欠損ＥＳクローンを用いてＤｃｉｒ＋／－マウスを作製し、Ｄｃｉｒ＋／－マウスの交配によりＤｃｉｒ－／－マウスを作製した。Ｄｃｉｒ－／－マウスは実験に用いる前に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ）と８～９世代戻し交配させた。
マウスにおけるＤｃｉｒ遺伝子の欠損は、ゲノムサザンブロット解析によって確認した（図１ｅ）。ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって脾臓におけるＤｃｉｒ ｍＲＮＡの発現が欠損していることを確認した（図１ｆ）。
２．骨表現型の解析
マウス骨表現型の解析は、以下の方法によって行った。
（１）コンピュータ断層撮影（ＣＴ）
、大腿部及び関節部の３次元マイクロＣＴによる解析は、Ｒ＿ｍＣＴ（理学メカトロニクス社製）を使用して行なった。また、大腿部の２次元マイクロＣＴによる解析及び定量化は、Ｓｃａｎ Ｘｍａｔｅ－Ａ０９０Ｓ（コムスキャンテクノ社製）及びＴＲＩ／２Ｄ－ＢＯＮシステム（ラトックシステムエンジニアリング社製）を使用して行なった。さらに、大腿部の末梢骨定量ＣＴ（ＰＱＣＴ）による解析及び定量化は、ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＡ＋システム（Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｚｉｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製）を用いて行なった。
マウス骨表現型の解析は、以下の方法によって行った。
（１）コンピュータ断層撮影（ＣＴ）
、大腿部及び関節部の３次元マイクロＣＴによる解析は、Ｒ＿ｍＣＴ（理学メカトロニクス社製）を使用して行なった。また、大腿部の２次元マイクロＣＴによる解析及び定量化は、Ｓｃａｎ Ｘｍａｔｅ－Ａ０９０Ｓ（コムスキャンテクノ社製）及びＴＲＩ／２Ｄ－ＢＯＮシステム（ラトックシステムエンジニアリング社製）を使用して行なった。さらに、大腿部の末梢骨定量ＣＴ（ＰＱＣＴ）による解析及び定量化は、ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＡ＋システム（Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｚｉｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製）を用いて行なった。
（２）組織学的検査
大腿部のＨＥ染色は、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０に記載されている方法に従って行なった。関節部はトルイジンブルー（ＴＢ）染色及びフォン・コッサ染色を行い、脛骨部はＴＢ及びＴＲＡＰ染色を行った。染色は、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、それを脱灰なしでグリコールメタクリル樹脂又はパラフィンで処理した後、３μｍ切片にスライスした。脛骨近位端における成長板及び骨梁の組織形態学的解析をＯｓｔｅｏｐｌａｎ ＩＩ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を使用して行なった。動的組織形態計測（Ｄｙｎａｍｉｃ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）のため、カルセイン（１．６ｍｇ／ｋｇ体重）を３日おきに２回皮下注射した。最初の注射から４日後、脛骨部を細分化し、７０％エタノールで固定した。５μｍ厚の非脱灰凍結切片をＬｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓ ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて作製した。骨石灰化速度及び骨形成速度は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ及びＯｓｔｅｏｐｌａｎ ＩＩ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を使用して解析した。
大腿部のＨＥ染色は、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０に記載されている方法に従って行なった。関節部はトルイジンブルー（ＴＢ）染色及びフォン・コッサ染色を行い、脛骨部はＴＢ及びＴＲＡＰ染色を行った。染色は、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、それを脱灰なしでグリコールメタクリル樹脂又はパラフィンで処理した後、３μｍ切片にスライスした。脛骨近位端における成長板及び骨梁の組織形態学的解析をＯｓｔｅｏｐｌａｎ ＩＩ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を使用して行なった。動的組織形態計測（Ｄｙｎａｍｉｃ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）のため、カルセイン（１．６ｍｇ／ｋｇ体重）を３日おきに２回皮下注射した。最初の注射から４日後、脛骨部を細分化し、７０％エタノールで固定した。５μｍ厚の非脱灰凍結切片をＬｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓ ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて作製した。骨石灰化速度及び骨形成速度は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ及びＯｓｔｅｏｐｌａｎ ＩＩ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を使用して解析した。
３．骨発達の解析
マウスの鼻－肛門（ｎａｓｏａｎａｌ）長を週２回測定し、成長曲線を作成した。新生マウスを１００％エタノールで４日間固定し、その後アセトン溶液に移し、３日後水で洗浄し、０．１％アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ社製）／９５％エタノール１重量部、０．３％アルシアンブルー６ＧＸ（Ｓｉｇｍａ社製）／７０％エタノール１重量部、１００％酢酸１重量、及びエタノール１７重量部からなる染色液で１０日間染色した。９６％エタノールで洗浄した後、骨格形成が明らかに視認できるまで標本を２０％グリセロール／１％水酸化カリウム中に室温で保存し、その後１００％グリセロールに移して保存した。
マウスの鼻－肛門（ｎａｓｏａｎａｌ）長を週２回測定し、成長曲線を作成した。新生マウスを１００％エタノールで４日間固定し、その後アセトン溶液に移し、３日後水で洗浄し、０．１％アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ社製）／９５％エタノール１重量部、０．３％アルシアンブルー６ＧＸ（Ｓｉｇｍａ社製）／７０％エタノール１重量部、１００％酢酸１重量、及びエタノール１７重量部からなる染色液で１０日間染色した。９６％エタノールで洗浄した後、骨格形成が明らかに視認できるまで標本を２０％グリセロール／１％水酸化カリウム中に室温で保存し、その後１００％グリセロールに移して保存した。
４．インビトロ破骨細胞形成及びピット形成アッセイ
非接着骨髄細胞をウェルプレート（２４ウェルプレート中５×１０５細胞／ウェル、又は６ウェルプレート中３×１０６細胞／ウェル）の中に播種し、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有するα－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。２日後、非接着細胞（リンパ球を含む）を洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＢＭＭ）として使用した。これらの破骨前駆細胞（ｐＯＣ）を１００ｎｇ／ｍＬ溶解性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製又はＯｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。３日後、破骨細胞を１０％中性緩衝ホルマリン中で３分間固定し、さらにエタノール／アセトン混合液（５０：５０ｖ：ｖ）中で１分間保存した後、ＴＲＡＰ染色液（Ｎａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ－ＭＸリン酸塩５ｍｇ；Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ ０．５ｍＬ；ｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ ＬＢ塩３０ｍｇ；５０ｍＭ酒石酸ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬ）中で室温でインキュベートした。ＴＲＡＰ陽性多核細胞（ＭＮＣ；≧３核））を計数した。
ピット形成アッセイにおいては、破骨細胞を３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦの存在下で２日間にわたって生成させ、その後、３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び１５０ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬによりさらに３日間処理した。その後、トリプシンを使って細胞を回収し、回収した細胞を播種し（９６ウェルプレート中１×１０５細胞／ウェル）、象牙質スライス上で３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び１５０ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬを用いて２日間培養した。試料を１モルＮＨ４ＯＨ中で超音波処理し、ヘマトキシリンで染色した。ＴＲＡＰ陰性ＭＮＣ、及び吸収ピットによって浸蝕された領域を、Ｂｉｏｒｅｖｏ ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を使って観測、測定した。
ＧＭ－ＣＳＦが破骨細胞形成に及ぼす影響を調べるため、ｍｏｕｓｅ ＧＭ－ＣＳＦ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、組換えＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、抗マウスＧＭ－ＣＳＦ中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。さらに増殖アッセイを行なうため、ｐＯＣを播種し（９６ウェルプレート中１×１０４細胞／ウェル）、１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦのみにより、又は、Ｍ－ＣＳＦ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬ若しくは２０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦにより３日間培養した。その後、細胞を［３Ｈ］ＴｄＲ（０．５μＣｉ／ｍＬ）で一晩曝露した。
非接着骨髄細胞をウェルプレート（２４ウェルプレート中５×１０５細胞／ウェル、又は６ウェルプレート中３×１０６細胞／ウェル）の中に播種し、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有するα－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。２日後、非接着細胞（リンパ球を含む）を洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＢＭＭ）として使用した。これらの破骨前駆細胞（ｐＯＣ）を１００ｎｇ／ｍＬ溶解性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製又はＯｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。３日後、破骨細胞を１０％中性緩衝ホルマリン中で３分間固定し、さらにエタノール／アセトン混合液（５０：５０ｖ：ｖ）中で１分間保存した後、ＴＲＡＰ染色液（Ｎａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ－ＭＸリン酸塩５ｍｇ；Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ ０．５ｍＬ；ｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ ＬＢ塩３０ｍｇ；５０ｍＭ酒石酸ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬ）中で室温でインキュベートした。ＴＲＡＰ陽性多核細胞（ＭＮＣ；≧３核））を計数した。
ピット形成アッセイにおいては、破骨細胞を３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦの存在下で２日間にわたって生成させ、その後、３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び１５０ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬによりさらに３日間処理した。その後、トリプシンを使って細胞を回収し、回収した細胞を播種し（９６ウェルプレート中１×１０５細胞／ウェル）、象牙質スライス上で３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び１５０ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬを用いて２日間培養した。試料を１モルＮＨ４ＯＨ中で超音波処理し、ヘマトキシリンで染色した。ＴＲＡＰ陰性ＭＮＣ、及び吸収ピットによって浸蝕された領域を、Ｂｉｏｒｅｖｏ ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を使って観測、測定した。
ＧＭ－ＣＳＦが破骨細胞形成に及ぼす影響を調べるため、ｍｏｕｓｅ ＧＭ－ＣＳＦ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、組換えＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、抗マウスＧＭ－ＣＳＦ中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。さらに増殖アッセイを行なうため、ｐＯＣを播種し（９６ウェルプレート中１×１０４細胞／ウェル）、１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦのみにより、又は、Ｍ－ＣＳＦ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬ若しくは２０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦにより３日間培養した。その後、細胞を［３Ｈ］ＴｄＲ（０．５μＣｉ／ｍＬ）で一晩曝露した。
５．骨芽細胞の分化及び石灰化の検出
（１）初代骨芽細胞の培養
初代骨芽細胞を新生マウスの頭蓋冠から単離した。頭蓋冠をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン及び２ｍｇ／ｍＬ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｐ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有するα－ＭＥＭ中、３７℃で２０分間消化した。上清を除去した後、細胞をさらに６０分間消化した。
骨形成を誘導するため、初代骨芽細胞（９６ウェルプレート中２×１０４細胞／ウェル、２４ウェルプレート中５×１０４細胞／ウェル、又は６ウェルプレート中２×１０５細胞／ウェル）をコンフルエントまで培養し、１０ｍＭ β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ 及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸を添加した培地に置き換えた。培地は２１日間で３回交換した。
２１日間培養した骨芽細胞の、アリザリンレッド染色、フォン・コッサ染色、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行った。
（２）アリザリンレッド染色
２１日間培養した骨芽細胞をＰＢＳで溶液を取り除いた後、３．７％ホルマリン溶液（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）にて１０分間固定した。その後ＰＢＳでもう１度洗い、ＡＬＰ染色液（０．１ｍｇ／ｍＬ Ｎａｐｈｔｏｌ ＡＳ－ＭＸ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、０．６ｍｇ／ｍＬアゾイックジアゾコンポーネント２０（ＴＧＩ）、５μＬ／ｍＬ Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ）、７．５ｍＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））にて２０分間反応させた。反応溶液を取り除きＰＢＳで洗った後、乾燥させＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影を行った。
（３）フォン・コッサ染色
２１日間培養した骨芽細胞をイオン交換水で溶液を取り除いた後、３．７％ホルマリン溶液にて３０分間固定した。その後イオン交換水でもう１度洗い、５％硝酸銀溶液（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を直射日光下１５分間反応させた。反応を停止させるため５％硝酸銀溶液を取り除き５％チオ硫酸ナトリウム（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加え２分間静置した。５％チオ硫酸ナトリウムをイオン交換水で洗浄し、乾燥させた後ＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影を行った。
（４）ＡＬＰ染色
初代骨芽細胞を９６ウェルプレートにて２１日間培養し、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用い測定を行った。培養細胞上清を回収し、原液及び１０倍希釈液をテンプレートとした。テンプレート５０μｌに反応基質溶液を加え、３７℃で１５分間反応させた。反応停止液５０μｌを加えて反応を停止させた後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ ＭＴＰ－３００（ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ）を用いＯＤ４０５にて活性の測定を行った。
（１）初代骨芽細胞の培養
初代骨芽細胞を新生マウスの頭蓋冠から単離した。頭蓋冠をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン及び２ｍｇ／ｍＬ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｐ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有するα－ＭＥＭ中、３７℃で２０分間消化した。上清を除去した後、細胞をさらに６０分間消化した。
骨形成を誘導するため、初代骨芽細胞（９６ウェルプレート中２×１０４細胞／ウェル、２４ウェルプレート中５×１０４細胞／ウェル、又は６ウェルプレート中２×１０５細胞／ウェル）をコンフルエントまで培養し、１０ｍＭ β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ 及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸を添加した培地に置き換えた。培地は２１日間で３回交換した。
２１日間培養した骨芽細胞の、アリザリンレッド染色、フォン・コッサ染色、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行った。
（２）アリザリンレッド染色
２１日間培養した骨芽細胞をＰＢＳで溶液を取り除いた後、３．７％ホルマリン溶液（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）にて１０分間固定した。その後ＰＢＳでもう１度洗い、ＡＬＰ染色液（０．１ｍｇ／ｍＬ Ｎａｐｈｔｏｌ ＡＳ－ＭＸ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、０．６ｍｇ／ｍＬアゾイックジアゾコンポーネント２０（ＴＧＩ）、５μＬ／ｍＬ Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ）、７．５ｍＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））にて２０分間反応させた。反応溶液を取り除きＰＢＳで洗った後、乾燥させＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影を行った。
（３）フォン・コッサ染色
２１日間培養した骨芽細胞をイオン交換水で溶液を取り除いた後、３．７％ホルマリン溶液にて３０分間固定した。その後イオン交換水でもう１度洗い、５％硝酸銀溶液（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を直射日光下１５分間反応させた。反応を停止させるため５％硝酸銀溶液を取り除き５％チオ硫酸ナトリウム（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加え２分間静置した。５％チオ硫酸ナトリウムをイオン交換水で洗浄し、乾燥させた後ＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影を行った。
（４）ＡＬＰ染色
初代骨芽細胞を９６ウェルプレートにて２１日間培養し、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用い測定を行った。培養細胞上清を回収し、原液及び１０倍希釈液をテンプレートとした。テンプレート５０μｌに反応基質溶液を加え、３７℃で１５分間反応させた。反応停止液５０μｌを加えて反応を停止させた後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ ＭＴＰ－３００（ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ）を用いＯＤ４０５にて活性の測定を行った。
６．初代骨芽細胞及び骨髄細胞（ＢＭＣ）の共培養
初代骨芽細胞及びＢＭＣ（それぞれ４８ウェルプレート中３×１０３細胞／ウェル、２×１０５細胞／ウェル）は、１０－３Ｍ １．２５（ＯＨ）２Ｄ３（Ｓｉｇｍａ社製）及び１０－７Ｍ ＰＧＥ２（Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）中で８日間培養した。培地は、２日ごとに交換した。ＴＲＡＰ染色を行ない、ＭＮＣを計数した。
初代骨芽細胞及びＢＭＣ（それぞれ４８ウェルプレート中３×１０３細胞／ウェル、２×１０５細胞／ウェル）は、１０－３Ｍ １．２５（ＯＨ）２Ｄ３（Ｓｉｇｍａ社製）及び１０－７Ｍ ＰＧＥ２（Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）中で８日間培養した。培地は、２日ごとに交換した。ＴＲＡＰ染色を行ない、ＭＮＣを計数した。
７．ＲＴ－ＰＣＲ解析
半定量ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、若干変更を加えたものの、基本的にはＮａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０及びＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ，２００６，８，Ｒ１００，１－１３に記載の方法に従って行った。トータルＲＮＡを標準的なグアニジノ酢酸チオシアン酸塩／フェノールクロロホルム法、又はＳｅｐａｓｏｌ－ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）を使用する方法によって調製した。調製したＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使って逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。
半定量的ＲＴ－ＰＣＲは、上記で調製したｃＤＮＡを鋳型として行った。反応液は１試料あたり２０μｌとし、１０×ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰｓ（Ｒｏｃｈｅ）１．６μｌ、表１に記載のプライマー０．４μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）０．２μｌ、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ １μｌとなるように調整した後、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて増幅反応を行った。ＰＣＲ後の反応溶液は、１．５％アガロースゲルを用いて、定電圧１００Ｖ、３０分間の電気泳動により分離し、１５分間（０．０５μｇ／ｍＬ）エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶイルミネ－ター（ＢＡＳ－ＩＩＩ）でＤＮＡ断片を検出した。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、表１に記載のプライマー、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して行った。
半定量ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、若干変更を加えたものの、基本的にはＮａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０及びＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ，２００６，８，Ｒ１００，１－１３に記載の方法に従って行った。トータルＲＮＡを標準的なグアニジノ酢酸チオシアン酸塩／フェノールクロロホルム法、又はＳｅｐａｓｏｌ－ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）を使用する方法によって調製した。調製したＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使って逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。
半定量的ＲＴ－ＰＣＲは、上記で調製したｃＤＮＡを鋳型として行った。反応液は１試料あたり２０μｌとし、１０×ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰｓ（Ｒｏｃｈｅ）１．６μｌ、表１に記載のプライマー０．４μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）０．２μｌ、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ １μｌとなるように調整した後、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて増幅反応を行った。ＰＣＲ後の反応溶液は、１．５％アガロースゲルを用いて、定電圧１００Ｖ、３０分間の電気泳動により分離し、１５分間（０．０５μｇ／ｍＬ）エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶイルミネ－ター（ＢＡＳ－ＩＩＩ）でＤＮＡ断片を検出した。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、表１に記載のプライマー、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して行った。
８．イムノブロット
（１）ウエスタンブロット
ウエスタンブロットは、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０に記載された方法に従って行った。ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）をメタノールで浸し、電気転写用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、１５ｍｇ／ｍＬ Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、２０％メタノール（Ｗａｋｏ）に移し変え、３０分程度浸透させて前処理を行った。ＴＲＡＮＳ－ＢＬＯＴＳＤ ＳＥＭＩ－ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、ゲル面積１ｃｍ２あたり２ｍＡで１時間通電し、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、一次抗体として以下のタンパクに特異的な抗体を使用して、ＰＶＤＦ膜をブロットした。
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）；
ｐ３８ ＭＡＰＫ；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）；
ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（１３７Ｆ５）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５：８１Ｅ１１）；
ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（５６Ｇ８）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｔｈｒ３Ｏ８；Ｃ３１Ｅ５）；
Ａｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｓｅｒ５３６；９３Ｈ１）；
ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｃ２２Ｂ４）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）；
ＰＬＣγ１；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＬＣγ２（Ｔｙｒ７５９）；
ＰＬＣγ２；β－ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
Ｓｔａｔ５（Ｃ１７）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
二次抗体には抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。膜を洗浄後、ＥＣＬ－Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて発光させ、ＦＬＡ－５０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）で解析を行った。
（２）免疫沈降分析
免疫沈降分析においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、マウスＤＣＩＲ特異抗体（３２０５１１：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｙｒ（４Ｇ１０：ミリポア社製）、及びＳＨＰ－１（ＨＧ２１３；Ｕｐｓｔａｔｅ）を使用した。また、ウサギＩｇＧ特異的ＨＲＰ－結合ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）又はラットＩｇＧ特異的ＨＲＰ－結合ポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を二次抗体として使用した。
（１）ウエスタンブロット
ウエスタンブロットは、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０に記載された方法に従って行った。ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）をメタノールで浸し、電気転写用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、１５ｍｇ／ｍＬ Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、２０％メタノール（Ｗａｋｏ）に移し変え、３０分程度浸透させて前処理を行った。ＴＲＡＮＳ－ＢＬＯＴＳＤ ＳＥＭＩ－ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、ゲル面積１ｃｍ２あたり２ｍＡで１時間通電し、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、一次抗体として以下のタンパクに特異的な抗体を使用して、ＰＶＤＦ膜をブロットした。
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）；
ｐ３８ ＭＡＰＫ；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）；
ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（１３７Ｆ５）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５：８１Ｅ１１）；
ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（５６Ｇ８）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｔｈｒ３Ｏ８；Ｃ３１Ｅ５）；
Ａｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｓｅｒ５３６；９３Ｈ１）；
ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｃ２２Ｂ４）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）；
ＰＬＣγ１；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＬＣγ２（Ｔｙｒ７５９）；
ＰＬＣγ２；β－ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
Ｓｔａｔ５（Ｃ１７）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
二次抗体には抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。膜を洗浄後、ＥＣＬ－Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて発光させ、ＦＬＡ－５０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）で解析を行った。
（２）免疫沈降分析
免疫沈降分析においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、マウスＤＣＩＲ特異抗体（３２０５１１：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｙｒ（４Ｇ１０：ミリポア社製）、及びＳＨＰ－１（ＨＧ２１３；Ｕｐｓｔａｔｅ）を使用した。また、ウサギＩｇＧ特異的ＨＲＰ－結合ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）又はラットＩｇＧ特異的ＨＲＰ－結合ポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を二次抗体として使用した。
９．糖鎖及び糖鎖結合アッセイ
牛関節軟骨由来ケラタン硫酸（ＫＳ－ＩＩ）精製物は、Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ（理研）及びＡ．Ｔａｗａｚａ（Ｈｙｄｒｏｘ Ｉｎｃ．）より入手した。他の糖鎖（牛角膜由来ケラタン硫酸、クジラ関節由来コンドロイチン硫酸Ａ、豚皮膚由来コンドロイチン硫酸（デルマタン硫酸）、及びＮ－ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）は、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｂｉｏｂｕｓｉｎｅｓｓ社より購入した。
糖鎖結合アッセイは、Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９，２９０４３－２９０４９に記載された方法に従って実施した。ＫＳ－ＩＩを１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）によって２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、氷上で１時間、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化を行ない、反応性アルデヒド基を得た。さらに希釈を行なった後、ＫＳ－ＩＩをＣｏｖａｌｉｎｋ ＥＬＩＳＡプレート上で４℃で一晩インキュベートし、その後、ＫＳ－ＩＩを室温で１．５時間、０．３％シアン化ホウ化水素ナトリウムによる還元反応によって共有結合させた。プレートを洗浄し、２％ウシ血清アルブミン（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）により３７℃で２時間ブロッキングした。細胞外ドメイン（９９～２３８番残基）を含む組み換えマウスＤＣＩＲ（ｍＤＣＩＲ）を、ｐＧＭＴ７プラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの封入体として発現させ、標準的希釈法によってリフォールドしたブロッキングしたプレートで、ｍＤＣＩＲを４℃で一晩インキュベートした。タンパク質の結合は、ＴＭＢ基質（Ｄａｋｏ社製）の存在下で抗ＤＣＩＲ抗体（３２０５０７及び３２０５１１の混合物：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＨＲＰ－結合ラットＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社製）を使用して検出した。
牛関節軟骨由来ケラタン硫酸（ＫＳ－ＩＩ）精製物は、Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ（理研）及びＡ．Ｔａｗａｚａ（Ｈｙｄｒｏｘ Ｉｎｃ．）より入手した。他の糖鎖（牛角膜由来ケラタン硫酸、クジラ関節由来コンドロイチン硫酸Ａ、豚皮膚由来コンドロイチン硫酸（デルマタン硫酸）、及びＮ－ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）は、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｂｉｏｂｕｓｉｎｅｓｓ社より購入した。
糖鎖結合アッセイは、Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９，２９０４３－２９０４９に記載された方法に従って実施した。ＫＳ－ＩＩを１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）によって２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、氷上で１時間、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化を行ない、反応性アルデヒド基を得た。さらに希釈を行なった後、ＫＳ－ＩＩをＣｏｖａｌｉｎｋ ＥＬＩＳＡプレート上で４℃で一晩インキュベートし、その後、ＫＳ－ＩＩを室温で１．５時間、０．３％シアン化ホウ化水素ナトリウムによる還元反応によって共有結合させた。プレートを洗浄し、２％ウシ血清アルブミン（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）により３７℃で２時間ブロッキングした。細胞外ドメイン（９９～２３８番残基）を含む組み換えマウスＤＣＩＲ（ｍＤＣＩＲ）を、ｐＧＭＴ７プラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの封入体として発現させ、標準的希釈法によってリフォールドしたブロッキングしたプレートで、ｍＤＣＩＲを４℃で一晩インキュベートした。タンパク質の結合は、ＴＭＢ基質（Ｄａｋｏ社製）の存在下で抗ＤＣＩＲ抗体（３２０５０７及び３２０５１１の混合物：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＨＲＰ－結合ラットＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社製）を使用して検出した。
実施例１ Ｄｃｉｒ－／－（ＫＯ）マウスにおける骨形成
Ｄｃｉｒ－／－（ＫＯ）マウスは、加齢に伴い、付着部炎に由来する硬直症ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｋｙｌｏｓｉｓを発症するとの報告があるが（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０）、硬直症状が未発症の若齢ＫＯマウス（８週齢）、及び硬直症状を示さない正常な高齢ＫＯマウス（１２月齢）の骨量を３次元マイクロＣＴ測定し、野生型と比較したところ、若齢ＫＯマウス、及び正常高齢ＫＯマウスの骨量は、野生型（ＷＴ）に比べて増加していた（図２ａ，ｂ及び図３）。従って、骨形成は、穏やかな骨硬化症を示すＤｃｉｒ－／－マウスにおいては促進されることが示された。
Ｄｃｉｒ－／－（ＫＯ）マウスは、加齢に伴い、付着部炎に由来する硬直症ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｋｙｌｏｓｉｓを発症するとの報告があるが（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０）、硬直症状が未発症の若齢ＫＯマウス（８週齢）、及び硬直症状を示さない正常な高齢ＫＯマウス（１２月齢）の骨量を３次元マイクロＣＴ測定し、野生型と比較したところ、若齢ＫＯマウス、及び正常高齢ＫＯマウスの骨量は、野生型（ＷＴ）に比べて増加していた（図２ａ，ｂ及び図３）。従って、骨形成は、穏やかな骨硬化症を示すＤｃｉｒ－／－マウスにおいては促進されることが示された。
次いで、マウスの骨におけるＤＣＩＲの発現をＰＴ－ＰＣＲにより測定した。ＤＣＩＲは、骨髄由来破骨細胞（ＯＣ）及び初代骨芽細胞（ＯＢ）において発現していたが、初代軟骨細胞では発現していなかった（図４）。この結果からも、Ｄｃｉｒの骨代謝への関与が支持される。鼻－肛門（ｎａｓｏａｎａｌ）長に基づく成長曲線、及びアリザリンブルー及びアリザリンレッドによる新生マウスの骨染色の結果からは、Ｄｃｉｒ－／－マウスにおいても骨は正常に発達することが示された（図５）。
骨硬化症は、軟骨細胞、ＯＣ又はＯＢの異常を有する動物において観察される（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１９９９，１３，３０３７－３０５１）。Ｄｃｉｒ－／－マウスにおける骨硬化症の原因を解明するため、組織形態計測によりマウスの骨を調べた。脛骨成長板近位部における増殖層の厚さは、ＷＴとＫＯマウスとで差がなかったことから、軟骨細胞はＫＯマウスにおいても正常に形成されることが示された（図２ｃ、ｄ）。
ＴＲＡＰ陽性ＯＣの数及び骨梁におけるＯＣ表面積は、ＫＯマウスにおいて有意に増加していた（図２ｅ、ｆ）。硬直変化を示さないＫＯマウスで骨形成が増加していたことを考慮すると、この結果は予想外である。
次に、これらのマウスにおける骨ターンオーバーを調べるため、生後８週のマウスにおいて新たに形成された骨を動的組織形態計測（Ｄｙｎａｍｉｃ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって計測した。すなわち、マウスに３日おきに２回カルセインを投与して骨を標識し、その間に形成された骨を測定した。ＫＯマウスの脛骨の形成速度及び石灰化は、ＷＴマウスと比較して高かった（図２ｇ、ｈ）。従って、Ｄｃｉｒ－／－マウスでは、破骨細胞骨吸収及び骨芽細胞による骨形成とがともに増進しており、骨ターンオーバーがより高まっていることが示された。Ｄｃｉｒ－／－マウスでは全体としては骨密度が増大していたことから、生理的条件下では骨吸収に対する影響よりも骨形成に対する効果が上回ると考えられる。
ＴＲＡＰ陽性ＯＣの数及び骨梁におけるＯＣ表面積は、ＫＯマウスにおいて有意に増加していた（図２ｅ、ｆ）。硬直変化を示さないＫＯマウスで骨形成が増加していたことを考慮すると、この結果は予想外である。
次に、これらのマウスにおける骨ターンオーバーを調べるため、生後８週のマウスにおいて新たに形成された骨を動的組織形態計測（Ｄｙｎａｍｉｃ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって計測した。すなわち、マウスに３日おきに２回カルセインを投与して骨を標識し、その間に形成された骨を測定した。ＫＯマウスの脛骨の形成速度及び石灰化は、ＷＴマウスと比較して高かった（図２ｇ、ｈ）。従って、Ｄｃｉｒ－／－マウスでは、破骨細胞骨吸収及び骨芽細胞による骨形成とがともに増進しており、骨ターンオーバーがより高まっていることが示された。Ｄｃｉｒ－／－マウスでは全体としては骨密度が増大していたことから、生理的条件下では骨吸収に対する影響よりも骨形成に対する効果が上回ると考えられる。
実施例２ 破骨細胞形成におけるＤＣＩＲの役割
上記の実験からは、Ｄｃｉｒ－／－マウスが破骨細胞（ＯＣ）を多く有していたことが示された。そこで、破骨細胞形成におけるＤＣＩＲの役割について調べた。ＷＴ及びＫＯマウス由来初代骨髄細胞（ＢＭＣ）を、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）及び核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）を用いた標準インビトロＯＣ分化系で培養し、ＯＣ分化を誘導した。その結果、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＣ培養物においては、ＴＲＡＰ陽性多核ＯＣへの分化が有意に増加した（図６ａ，ｂ）。多くのＫＯ由来ＯＣは多核であり、骨ページェット病患者の骨の表現型に似ていた。Ｄｃｉｒ－／－ＯＣのでは、骨吸収によってできた穴（ｐｉｔ）のサイズが拡大しており、Ｄｃｉｒ－／－ＯＣの骨吸収活性が大きく増強されたことが明らかとなった（図６ｃ，ｄ）。また、Ｄｃｉｒ－／－細胞を含む培地においてはＴＲＡＰ活性が上昇した（図６ｅ）。これらの結果から、ＤＣＩＲがＢＭＣからの成熟ＯＣの分化に関与していることが示された。
上記の実験からは、Ｄｃｉｒ－／－マウスが破骨細胞（ＯＣ）を多く有していたことが示された。そこで、破骨細胞形成におけるＤＣＩＲの役割について調べた。ＷＴ及びＫＯマウス由来初代骨髄細胞（ＢＭＣ）を、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）及び核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）を用いた標準インビトロＯＣ分化系で培養し、ＯＣ分化を誘導した。その結果、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＣ培養物においては、ＴＲＡＰ陽性多核ＯＣへの分化が有意に増加した（図６ａ，ｂ）。多くのＫＯ由来ＯＣは多核であり、骨ページェット病患者の骨の表現型に似ていた。Ｄｃｉｒ－／－ＯＣのでは、骨吸収によってできた穴（ｐｉｔ）のサイズが拡大しており、Ｄｃｉｒ－／－ＯＣの骨吸収活性が大きく増強されたことが明らかとなった（図６ｃ，ｄ）。また、Ｄｃｉｒ－／－細胞を含む培地においてはＴＲＡＰ活性が上昇した（図６ｅ）。これらの結果から、ＤＣＩＲがＢＭＣからの成熟ＯＣの分化に関与していることが示された。
次いで、ＤＣＩＲの多核ＯＣ形成に対する影響を評価するため、Ｄｃｉｒ－／－ＯＣにおけるＴ細胞活性化核因子１（Ｎｆａｔｃ１）とＴ細胞活性化核因子２（Ｎｆａｔｃ２）の発現量を調べた。Ｎｆａｔｃ １及びＮｆａｔｃ ２は、ともにＯＣ成熟のための主要な調節因子であり、Ａｃｐ５（ＴＲＡＰ）やＣｔｓｋ（カテプシンＫ）と同様に、ＯＣ特異的なマーカーである。Ｎｆａｔｃ １及びＮｆａｔｃ ２遺伝子の発現量は、野生型ＯＣと同等であった（図６ｆ）。従って、ＤＣＩＲはＮＦＡＴ発現に影響しないことが示された。
ＢＭＣからのＯＣ分化はＲＡＮＫ及びｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ（ＩＴＡＭ保有アダプタ）により活性化されるシグナル伝達経路により制御されることから（Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４２８，７５８－７６３）、これらの細胞におけるＲＡＮＫの下流のシグナル伝達について調べた。ＭＡＰＫ（ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫ）、Ａｋｔ及びＮＦ－κＢ（全てＴＲＡＦ６の下流に位置する）のＲＡＮＫＬ誘導性の活性化は正常であり、またＰＬＣγ１とＰＬＣγ２のＲＡＮＫＬ誘導性ＩＴＡＭ保有アダプタ依存性チロシンリン酸化も、ＷＴと成熟ＯＣにおいて変化がなかった（図６ｇ，ｈ）。これらのデータは、ＤＣＩＲがＯＣ前駆細胞（ｐＯＣ）からのＲＡＮＫＬ依存性のＯＣ分化に影響しないことを示す。
ＯＣ分化の初期段階におけるＤｃｉｒ欠損の影響をみるため、インビトロ培養２日後の、ＴＲＡＰ陽性単核ＯＣの数を計測した。単核ＯＣの数は、Ｍ－ＣＳＦで処理したＤｃｉｒ－／－ＢＭＣにおいて有意に増加し（図６ｉ，ｊ）、ＤＣＩＲが、ＯＣ分化の初期段階で機能していることが示された。一方、ＷＴとＤｃｉｒ－／－ｐＯＣをＭ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬとで処理した場合の増殖反応には差は見られなかった（図６ｋ）。この結果は、破骨細胞形成の主要シグナル伝達カスケードと考えられているＲＡＮＫＬ依存性シグナル伝達を阻害することなく、ＤＣＩＲがＯＣ形成をネガティブに制御することを示している。
ＯＣ分化の初期段階におけるＤｃｉｒ欠損の影響をみるため、インビトロ培養２日後の、ＴＲＡＰ陽性単核ＯＣの数を計測した。単核ＯＣの数は、Ｍ－ＣＳＦで処理したＤｃｉｒ－／－ＢＭＣにおいて有意に増加し（図６ｉ，ｊ）、ＤＣＩＲが、ＯＣ分化の初期段階で機能していることが示された。一方、ＷＴとＤｃｉｒ－／－ｐＯＣをＭ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬとで処理した場合の増殖反応には差は見られなかった（図６ｋ）。この結果は、破骨細胞形成の主要シグナル伝達カスケードと考えられているＲＡＮＫＬ依存性シグナル伝達を阻害することなく、ＤＣＩＲがＯＣ形成をネガティブに制御することを示している。
さらに、ＧＭ－ＣＳＦに対するｐＯＣの反応を調べた。従来の報告では、ＧＭ－ＣＳＦが骨髄細胞前駆体の樹状細胞への分化を促進することから、ＧＭ－ＣＳＦがＯＣの発現を抑制することが示されていた（Ｂｌｏｏｄ，２００１，９８，２５４４－２５５４）。しかし最近、ＧＭ－ＣＳＦが、特定の条件下で、ｐＯＣの分化、増殖、生存及び融合を促進することが報告された（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２００４，１９，１９０－１９９、Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００７，１３，６２－６９、Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００８，１４，８１－８７、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，１８３，３３９０－３３９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００８，３６７，８８１－８８７）。そこで、培養細胞を用いてＧＭ－ＣＳＦの破骨細胞形成に対する影響を調べた。
ＷＴ ｐＯＣではなくＤｃｉｒ－／－ｐＯＣの分化が、ＧＭ－ＣＳＦによって有意に上昇した（図７ａ）。ＧＭ－ＣＳＦ濃度は、ＷＴとＤｃｉｒ－／－マウスの培養物との間で変化がなかった（図７ｂ）。ＷＴ ＢＭＣと比較すると、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＣからのＯＣ分化は、０．１ｎｇ／ｍＬの組換えＧＭ－ＣＳＦ存在下で有意に上昇したが、１ｎｇ／ｍＬ以上では上昇が見られなかった（図７ｃ）。対照的に、抗ＧＭ－ＣＳＦ中和抗体による処理によって、Ｄｃｉｒ－／－マウスの破骨細胞形成は顕著に抑制された（図７ｄ）。また、ＧＭ－ＣＳＦ刺激後のＤｃｉｒ－／－ｐＯＣにおけるシグナル伝達因子と転写因子５（Ｓｔａｔ５）活性化因子のリン酸化について調べたところ、Ｄｃｉｒ－／－細胞のＧＭ－ＣＳＦ誘導型Ｓｔａｔ－５リン酸化が顕著にアップレギュレートされた（図７ｅ）。これらの結果からは、ＤＣＩＲはＧＭ－ＣＳＦシグナル伝達の阻害によってｐＯＣ増殖を抑制していることが示された。
ＷＴ ｐＯＣではなくＤｃｉｒ－／－ｐＯＣの分化が、ＧＭ－ＣＳＦによって有意に上昇した（図７ａ）。ＧＭ－ＣＳＦ濃度は、ＷＴとＤｃｉｒ－／－マウスの培養物との間で変化がなかった（図７ｂ）。ＷＴ ＢＭＣと比較すると、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＣからのＯＣ分化は、０．１ｎｇ／ｍＬの組換えＧＭ－ＣＳＦ存在下で有意に上昇したが、１ｎｇ／ｍＬ以上では上昇が見られなかった（図７ｃ）。対照的に、抗ＧＭ－ＣＳＦ中和抗体による処理によって、Ｄｃｉｒ－／－マウスの破骨細胞形成は顕著に抑制された（図７ｄ）。また、ＧＭ－ＣＳＦ刺激後のＤｃｉｒ－／－ｐＯＣにおけるシグナル伝達因子と転写因子５（Ｓｔａｔ５）活性化因子のリン酸化について調べたところ、Ｄｃｉｒ－／－細胞のＧＭ－ＣＳＦ誘導型Ｓｔａｔ－５リン酸化が顕著にアップレギュレートされた（図７ｅ）。これらの結果からは、ＤＣＩＲはＧＭ－ＣＳＦシグナル伝達の阻害によってｐＯＣ増殖を抑制していることが示された。
実施例３ ＤＣＩＲリガンドの同定
ＤＣＩＲのリガンドはこれまで報告されていなかった。そこで本発明者らは、破骨細胞形成に関与する生体内のＤＣＩＲリガンドを同定するため、公共のグリカンアレイデータベースを用いてＤＣＩＲに結合する糖鎖を検索した。その結果、ＤＣＩＲリガンドとして、硫酸化ガラクトースβ１－４ Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－アセチルラクトサミン又はＬａｃＮＡｃ）構造（図８ａ）を有する糖鎖が特定された。硫酸化ｐｏｌｙ－ＬａｃＮＡｃは、主に角膜（Ｎ結合型ＫＳ－Ｉ）や関節軟骨（Ｏ結合型ＫＳ－ＩＩ）に存在するケラタン硫酸（ＫＳ）の内部にプロテオグリカンの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖として存在する分子である。そこでマウスの関節や骨髄細胞（ＢＭＣ）おけるＫＳの発現を調べたところ、これらの領域でＫＳが発現されていることを確認した。また、ＤＣＩＲとＫＳとの結合をＥＬＩＳＡ法を利用した糖鎖結合アッセイにより調べた結果、組換えマウスＤＣＩＲはウシ関節軟骨由来のＫＳ－ＩＩと濃度依存的に結合することがわかった（図８ｂ）。
さらに、ＫＳのＯＣ分化への影響を、インビトロでＴＲＡＰ陽性ＯＣの数を計測することにより評価した。ＫＳ－ＩＩは、野生型（ＷＴ）骨髄細胞培養物におけるＯＣ形成を著しく阻害したが、Ｄｃｉｒ－／－の培養細胞では阻害しなかった（図８ｃ及びｄ）。ＯＣ分化は、角膜由来のＫＳ－Ｉ、非硫酸化ＬａｃＮＡｃ、又はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）やデルマタン硫酸（ＤＳ）といった他の硫酸化グリコサミノグリカンには影響を受けなかった（図８ｅ）。次に、ＤＣＩＲがＫＳにより活性化されることを確認するため、免疫沈降分析を行った。その結果、ＤＣＩＲにおけるｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ）のリン酸化、及びチロシンホスファターゼＳＨＰ－１動員は、ＫＳ－ＩＩによって濃度依存的に増加することが分かった（図８ｆ）。これらの結果は、ＫＳ－ＩＩがＤＣＩＲに特異的なリガンドであり、ＤＣＩＲの活性化を介して破骨細胞形成の阻害に関与していることを示している。
ＤＣＩＲのリガンドはこれまで報告されていなかった。そこで本発明者らは、破骨細胞形成に関与する生体内のＤＣＩＲリガンドを同定するため、公共のグリカンアレイデータベースを用いてＤＣＩＲに結合する糖鎖を検索した。その結果、ＤＣＩＲリガンドとして、硫酸化ガラクトースβ１－４ Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－アセチルラクトサミン又はＬａｃＮＡｃ）構造（図８ａ）を有する糖鎖が特定された。硫酸化ｐｏｌｙ－ＬａｃＮＡｃは、主に角膜（Ｎ結合型ＫＳ－Ｉ）や関節軟骨（Ｏ結合型ＫＳ－ＩＩ）に存在するケラタン硫酸（ＫＳ）の内部にプロテオグリカンの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖として存在する分子である。そこでマウスの関節や骨髄細胞（ＢＭＣ）おけるＫＳの発現を調べたところ、これらの領域でＫＳが発現されていることを確認した。また、ＤＣＩＲとＫＳとの結合をＥＬＩＳＡ法を利用した糖鎖結合アッセイにより調べた結果、組換えマウスＤＣＩＲはウシ関節軟骨由来のＫＳ－ＩＩと濃度依存的に結合することがわかった（図８ｂ）。
さらに、ＫＳのＯＣ分化への影響を、インビトロでＴＲＡＰ陽性ＯＣの数を計測することにより評価した。ＫＳ－ＩＩは、野生型（ＷＴ）骨髄細胞培養物におけるＯＣ形成を著しく阻害したが、Ｄｃｉｒ－／－の培養細胞では阻害しなかった（図８ｃ及びｄ）。ＯＣ分化は、角膜由来のＫＳ－Ｉ、非硫酸化ＬａｃＮＡｃ、又はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）やデルマタン硫酸（ＤＳ）といった他の硫酸化グリコサミノグリカンには影響を受けなかった（図８ｅ）。次に、ＤＣＩＲがＫＳにより活性化されることを確認するため、免疫沈降分析を行った。その結果、ＤＣＩＲにおけるｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ）のリン酸化、及びチロシンホスファターゼＳＨＰ－１動員は、ＫＳ－ＩＩによって濃度依存的に増加することが分かった（図８ｆ）。これらの結果は、ＫＳ－ＩＩがＤＣＩＲに特異的なリガンドであり、ＤＣＩＲの活性化を介して破骨細胞形成の阻害に関与していることを示している。
実施例４ 骨芽細胞（ＯＢ）形成におけるＤｃｉｒの役割
骨芽細胞（ＯＢ）形成におけるＤｃｉｒの役割を調べた。初代頭頂骨ＯＢの増殖は、ＷＴマウスにおいてもＤｃｉｒ－／－マウスにおいても同様であった（図９）。頭蓋冠骨由来のＯＢにおいて、Ｄｃｉｒは、β－グリセロリン酸とアスコルビン酸による骨形成分化の誘導後に発現し、その発現は石灰化過程の間中続いた（図１０ａ）。Ｄｃｉｒ－／－ＯＢにおいて、カルシウム（図１０ｂ）やリン酸カルシウム付加（図１０ｃ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）発現（図１０ｄ）は、培養初期（１４日）に亢進されていたことから、石灰化はＷＴのＯＢに比べＤｃｉｒ－／－ＯＢで促進されていることが分かった。これらの結果より、ＤＣＩＲが末端ＯＢ分化と石灰化基質形成に関与していることが示唆された。
Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＡＬＰといったＯＢマーカー、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、Ｉ型コラーゲン（ＣｏｌＩ）、オステオカルシンといった骨基質タンパク質をコードする遺伝子の発現量は、Ｄｃｉｒ－／－マウスで高かった（図１０ｅ）。また、骨吸収に必要なオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現量が、ＷＴの骨芽細胞に比べＤｃｉｒ－／－の骨芽細胞で顕著に低くなっていた。これらのデータにより、ＤＣＩＲが骨芽細胞の成熟化と骨基質形成を阻害し、ＯＰＮの生産を促進することで、骨形成を負に制御していることが示唆された。さらに、骨形成性培養物のアリザリンレッド染色及びＡＬＰ染色より、ＫＳ－ＩＩ存在下でＷＴのＯＢでは石灰化が抑制されたのに対し、Ｄｃｉｒ－／－ＯＢでは抑制がみられないことが分かった（図１０ｆ）。
骨芽細胞（ＯＢ）形成におけるＤｃｉｒの役割を調べた。初代頭頂骨ＯＢの増殖は、ＷＴマウスにおいてもＤｃｉｒ－／－マウスにおいても同様であった（図９）。頭蓋冠骨由来のＯＢにおいて、Ｄｃｉｒは、β－グリセロリン酸とアスコルビン酸による骨形成分化の誘導後に発現し、その発現は石灰化過程の間中続いた（図１０ａ）。Ｄｃｉｒ－／－ＯＢにおいて、カルシウム（図１０ｂ）やリン酸カルシウム付加（図１０ｃ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）発現（図１０ｄ）は、培養初期（１４日）に亢進されていたことから、石灰化はＷＴのＯＢに比べＤｃｉｒ－／－ＯＢで促進されていることが分かった。これらの結果より、ＤＣＩＲが末端ＯＢ分化と石灰化基質形成に関与していることが示唆された。
Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＡＬＰといったＯＢマーカー、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、Ｉ型コラーゲン（ＣｏｌＩ）、オステオカルシンといった骨基質タンパク質をコードする遺伝子の発現量は、Ｄｃｉｒ－／－マウスで高かった（図１０ｅ）。また、骨吸収に必要なオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現量が、ＷＴの骨芽細胞に比べＤｃｉｒ－／－の骨芽細胞で顕著に低くなっていた。これらのデータにより、ＤＣＩＲが骨芽細胞の成熟化と骨基質形成を阻害し、ＯＰＮの生産を促進することで、骨形成を負に制御していることが示唆された。さらに、骨形成性培養物のアリザリンレッド染色及びＡＬＰ染色より、ＫＳ－ＩＩ存在下でＷＴのＯＢでは石灰化が抑制されたのに対し、Ｄｃｉｒ－／－ＯＢでは抑制がみられないことが分かった（図１０ｆ）。
次に、破骨細胞形成の制御における骨芽細胞の役割を、Ｄｃｉｒ－／－マウス由来のＢＭＣとＯＢとの共培養系において調べた。Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＣとＷＴのＯＢの共培養物では、通常の破骨細胞形成がみられた（図１０ｇ，ｈ）。一方、ＷＴのＢＭＣとＤｃｉｒ－／－ＯＢの共培養物では、破骨細胞形成が大きく減少した（図１０ｇ，ｉ）。この結果より、ＤＣＩＲが骨芽細胞と破骨細胞との正常なカップリングに関与していることが示された。ＯＣ形成は、骨芽細胞由来のＲＡＮＫＬとオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）により制御されるので、Ｄｃｉｒ－／－ＯＢにおけるこれらの発現量を調べた。ＲＡＮＫＬの発現量には実質的な差はみられなかったが、ＯＰＧの発現量はＷＴのＯＢに比べてＤｃｉｒ－／－ＯＢで有意に増加し、変異骨芽細胞のＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ比を増加させた（図１０ｊ、図１１）。さらに、ＫＳ－ＩＩ処理は、ＷＴのＯＢでのみＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ比を減少させたことから（図１０ｋ，ｌ）、ＫＳ－ＩＩがＯＰＧの生産をＤＣＩＲ依存的に制御することが示された。従って、ＤＣＩＲは、ＯＰＧの発現を抑制することで破骨細胞形成を促進しているようである。また、ＤＣＩＲは破骨細胞だけでなく骨芽細胞でも機能し、生体の骨のターンオーバーを制御していると考えられる。
実施例５ 抗ＤＣＩＲ抗体の作製
（１）ＤＣＩＲ発現細胞の作製
Ｄｃｉｒ遺伝子を含む発現ベクターはＤｃｉｒ遺伝子を含む配列（ＮＭ＿０１１９９９）の１３７番目から９８９番目のヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターに挿入して調製し、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ７細胞に形質導入した。約４８時間後、細胞を回収し凍結保存した。
（２）ＤＣＩＲの発現確認
（１）で作製した一過性発現細胞について、抗ＤＣＩＲ抗体を用いたウエスタンブロットをＤＣＩＲ発現細胞及びその野生株について行い、ＤＣＩＲ発現細胞特異的に予想される３５ｋＤａ付近にバンドが検出できるか確認することにより、ＤＣＩＲの発現確認を行い、ＤＣＩＲ発現細胞株を取得した。
（３）マウスへのｆｏｏｔ ｐａｄ法による免疫
アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＲＥＵＮＤ）三菱化学ヤトロン ＲＭ６０６－１）とＰＢＳを混ぜたエマルジョンを、マウス（４匹）の片足の裏に免疫した。１週間後、（２）で得たＤＣＩＲ発現細胞株でマウスを免疫した。毎週１回、計５回の免疫を行った。
（１）ＤＣＩＲ発現細胞の作製
Ｄｃｉｒ遺伝子を含む発現ベクターはＤｃｉｒ遺伝子を含む配列（ＮＭ＿０１１９９９）の１３７番目から９８９番目のヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターに挿入して調製し、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ７細胞に形質導入した。約４８時間後、細胞を回収し凍結保存した。
（２）ＤＣＩＲの発現確認
（１）で作製した一過性発現細胞について、抗ＤＣＩＲ抗体を用いたウエスタンブロットをＤＣＩＲ発現細胞及びその野生株について行い、ＤＣＩＲ発現細胞特異的に予想される３５ｋＤａ付近にバンドが検出できるか確認することにより、ＤＣＩＲの発現確認を行い、ＤＣＩＲ発現細胞株を取得した。
（３）マウスへのｆｏｏｔ ｐａｄ法による免疫
アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＲＥＵＮＤ）三菱化学ヤトロン ＲＭ６０６－１）とＰＢＳを混ぜたエマルジョンを、マウス（４匹）の片足の裏に免疫した。１週間後、（２）で得たＤＣＩＲ発現細胞株でマウスを免疫した。毎週１回、計５回の免疫を行った。
（４）細胞融合
５回目の免疫の３日後に、免疫したマウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、その中から細胞を回収した。培養フラスコ（培地：１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ）でミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を増殖させ、細胞を回収した。回収したリンパ節由来細胞とミエローマ細胞を混和し、遠心した。ペレットにＰＥＧ（ＰＥＧ４０００：ＭＥＲＣＫ Ｃａｔ Ｎｏ １０９７２７０１００、ＲＰＭＩで等量希釈）を加え、細胞融合を行った。ＲＰＭＩ血清無添加培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ Ｎｏ Ｒ８７５８）で細胞を洗浄後、１５％ＦＢＳ－ＨＡＴ培地（ＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）：ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ Ｎｏ ２１０６０－０１７、初期の不安定なハイブリドーマをレスキューするためｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加）で懸濁し、９６ウェルプレート４枚に播種した。播種より３日後に培地を交換し、ハイブリドーマのコロニー形成が確認された後（２～３週間後）、ウェルプレートから培養上清を採取し、１次スクリーニングを行った。
５回目の免疫の３日後に、免疫したマウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、その中から細胞を回収した。培養フラスコ（培地：１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ）でミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を増殖させ、細胞を回収した。回収したリンパ節由来細胞とミエローマ細胞を混和し、遠心した。ペレットにＰＥＧ（ＰＥＧ４０００：ＭＥＲＣＫ Ｃａｔ Ｎｏ １０９７２７０１００、ＲＰＭＩで等量希釈）を加え、細胞融合を行った。ＲＰＭＩ血清無添加培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ Ｎｏ Ｒ８７５８）で細胞を洗浄後、１５％ＦＢＳ－ＨＡＴ培地（ＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）：ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ Ｎｏ ２１０６０－０１７、初期の不安定なハイブリドーマをレスキューするためｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加）で懸濁し、９６ウェルプレート４枚に播種した。播種より３日後に培地を交換し、ハイブリドーマのコロニー形成が確認された後（２～３週間後）、ウェルプレートから培養上清を採取し、１次スクリーニングを行った。
（５）ハイブリドーマの１次スクリーニング
Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ／フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）を用いてハイブリドーマを１次スクリーニングした。
Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ）凍結ストックの細胞（トランスフェクタント）を起眠させ、０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳに懸濁し、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ ２４９５７０ ９６Ｖ ＮＷ ＰＳ）に１００μＬ／ウェル分注した。９６ウェルプレート１枚あたり１×１０７個の細胞を使用した。２０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心後、上清を捨て、（４）で採取した培養上清を５０μＬ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで２回洗浄後（２０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心後、上清捨てる）、Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識（ＭＢＬ製品 Ｃｏｄｅ．３３０）をＢｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ製希釈液）で１０，０００倍希釈したものを加え、室温で３０分間反応させた。３回洗浄後、発色基質を加え５～１０分間発色させた。４５０－６２０ｎｍで吸光度測定を行った。
Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ／フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）を用いてハイブリドーマを１次スクリーニングした。
Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ）凍結ストックの細胞（トランスフェクタント）を起眠させ、０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳに懸濁し、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ ２４９５７０ ９６Ｖ ＮＷ ＰＳ）に１００μＬ／ウェル分注した。９６ウェルプレート１枚あたり１×１０７個の細胞を使用した。２０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心後、上清を捨て、（４）で採取した培養上清を５０μＬ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで２回洗浄後（２０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心後、上清捨てる）、Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識（ＭＢＬ製品 Ｃｏｄｅ．３３０）をＢｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ製希釈液）で１０，０００倍希釈したものを加え、室温で３０分間反応させた。３回洗浄後、発色基質を加え５～１０分間発色させた。４５０－６２０ｎｍで吸光度測定を行った。
ＦＣＭ）Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡで陽性の可能性のあるクローンの培養上精について、（２）で得たＤＣＩＲ発現細胞との反応性をＦＣＭにより確認した。培養上清原液を細胞と室温で３０分間反応させ、２回洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製品 ＩＭ－０８１９）を１００倍希釈で３０分間反応させた。２回洗浄後、４００μｌのｂｕｆｆｅｒで懸濁し、ＦＣ５００（ベックマンコールター）で測定した。洗浄及び細胞の懸濁Ｂｕｆｆｅｒは０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ＢＳＡ ＰＢＳを使用した。擬陽性等のアーティファクトを除くため、継代培養を行いながら何度か反応性を確認した。
（６）単クローン化
（５）の１次スクリーニングで陽性と判断されたハイブリドーマの培養上清から選択されたハイブリドーマに対して、単クローン化を行った。
対数増殖期のハイブリドーマをパスツールピペットでピペッティングした後採取し、培地で希釈後、１ウェルあたりの細胞数が１～３２，０００個になるように細胞濃度を調整し、９６ウェルプレートに播種した。ハイブリドーマのシングルコロニーの形成が確認された後（１～２週間後）、ウェルプレートから培養上清を採取し、（５）の方法に従って活性を確認した。
（７）単クローナル（アイソタイプ）の確認
培養上清をＰＢＳで１００倍希釈したものをディベロップメントチューブに滴下し、着色ラテックスビーズを再懸濁する。チューブにアイソタイプ用ストリップ（Ｉｓｏ Ｓｔｒｉｐ マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット：Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１－４９３－０２７）を浸漬し、５分後、特定のサブクラス部分に検出されたバンドを確認し、クローンを選択した。
（８）単クローン化ハイブリドーマの凍結
単クローン化されたハイブリドーマを９６ウェルプレート１穴から、４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレートまで継代培養した。１ウェルの細胞を遠心回収し、セルバンカー（十慈フィールド、Ｃａｔ Ｎｏ ＢＬＣ－１）５００μＬで懸濁し、ストックチューブ（ＳＵＭＩＬＯＮ、Ｃａｔ Ｎｏ ＭＳ－４６０１Ｗ）１本に入れ－８０℃で保存した。凍結時に回収した培養上清を最終評価培地として各１０ｍＬの作製を行った。最終評価用培養上清を提供し、目的の活性が保持されているかどうかを最終確認した。
（５）の１次スクリーニングで陽性と判断されたハイブリドーマの培養上清から選択されたハイブリドーマに対して、単クローン化を行った。
対数増殖期のハイブリドーマをパスツールピペットでピペッティングした後採取し、培地で希釈後、１ウェルあたりの細胞数が１～３２，０００個になるように細胞濃度を調整し、９６ウェルプレートに播種した。ハイブリドーマのシングルコロニーの形成が確認された後（１～２週間後）、ウェルプレートから培養上清を採取し、（５）の方法に従って活性を確認した。
（７）単クローナル（アイソタイプ）の確認
培養上清をＰＢＳで１００倍希釈したものをディベロップメントチューブに滴下し、着色ラテックスビーズを再懸濁する。チューブにアイソタイプ用ストリップ（Ｉｓｏ Ｓｔｒｉｐ マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット：Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１－４９３－０２７）を浸漬し、５分後、特定のサブクラス部分に検出されたバンドを確認し、クローンを選択した。
（８）単クローン化ハイブリドーマの凍結
単クローン化されたハイブリドーマを９６ウェルプレート１穴から、４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレートまで継代培養した。１ウェルの細胞を遠心回収し、セルバンカー（十慈フィールド、Ｃａｔ Ｎｏ ＢＬＣ－１）５００μＬで懸濁し、ストックチューブ（ＳＵＭＩＬＯＮ、Ｃａｔ Ｎｏ ＭＳ－４６０１Ｗ）１本に入れ－８０℃で保存した。凍結時に回収した培養上清を最終評価培地として各１０ｍＬの作製を行った。最終評価用培養上清を提供し、目的の活性が保持されているかどうかを最終確認した。
実施例６ 抗ＤＣＩＲ抗体の評価
実施例４で作製されたハイブリドーマ由来の抗ＤＣＩＲ抗体の、ＤＣＩＲに対する結合能を評価した。ＤＣＩＲは免疫反応の抑制に関与することが示されているため（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０）、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）の発現を基準に抗体のＤＣＩＲ結合能を評価した。
実施例４で作製したハイブリドーマをＣｐＧ（濃度１μＭ）を含む培地で１２時間培養し、培養上清を回収した。同様に、ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８株（オペロン社）を同じ培地、又はさらにケラタン硫酸（ＫＳ－ＩＩ；１０ｎｇ／ｍＬ）を含む同じ培地で培養し、上清を回収した。コントロールとしてＣｐＧ非含有培地で細胞を培養した（ＮＴ）。上清中のＴＮＦ－α産生量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
結果を図１２に示す。ＣｐＧ含有培地で細胞を培養することにより、ＴＮＦ－α産生が誘導された（ＣｐＧ）。ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩを培地に添加した場合、ＴＮＦ－α産生は抑制された（ＣｐＧ＋ＫＳ）。複数のハイブリドーマ培養上清において、ＫＳ－ＩＩ添加の場合よりもＴＮＦ－α産生が抑制された（図１２中の３、４、５株）。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩよりも高いＤＣＩＲ結合能を有しており、ＤＣＩＲの活性を促進するＤＣＩＲアゴニストとして有用である。一方、一部のハイブリドーマ培養上清においては、逆にＫＳ－ＩＩ添加の場合よりもＴＮＦ－α産生が促進された（図１２中の１、２株）。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、ＤＣＩＲの活性を抑制するＤＣＩＲアンタゴニストとして有用である。
また、上記結果に示されるように、ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩのＤＣＩＲに対する作用を指標として、ＤＣＩＲを特異的に活性化又は抑制することができる物質を評価又は選択することができる。
実施例４で作製されたハイブリドーマ由来の抗ＤＣＩＲ抗体の、ＤＣＩＲに対する結合能を評価した。ＤＣＩＲは免疫反応の抑制に関与することが示されているため（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ １４，ｎｏ ２：１７６－１８０）、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）の発現を基準に抗体のＤＣＩＲ結合能を評価した。
実施例４で作製したハイブリドーマをＣｐＧ（濃度１μＭ）を含む培地で１２時間培養し、培養上清を回収した。同様に、ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８株（オペロン社）を同じ培地、又はさらにケラタン硫酸（ＫＳ－ＩＩ；１０ｎｇ／ｍＬ）を含む同じ培地で培養し、上清を回収した。コントロールとしてＣｐＧ非含有培地で細胞を培養した（ＮＴ）。上清中のＴＮＦ－α産生量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
結果を図１２に示す。ＣｐＧ含有培地で細胞を培養することにより、ＴＮＦ－α産生が誘導された（ＣｐＧ）。ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩを培地に添加した場合、ＴＮＦ－α産生は抑制された（ＣｐＧ＋ＫＳ）。複数のハイブリドーマ培養上清において、ＫＳ－ＩＩ添加の場合よりもＴＮＦ－α産生が抑制された（図１２中の３、４、５株）。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩよりも高いＤＣＩＲ結合能を有しており、ＤＣＩＲの活性を促進するＤＣＩＲアゴニストとして有用である。一方、一部のハイブリドーマ培養上清においては、逆にＫＳ－ＩＩ添加の場合よりもＴＮＦ－α産生が促進された（図１２中の１、２株）。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、ＤＣＩＲの活性を抑制するＤＣＩＲアンタゴニストとして有用である。
また、上記結果に示されるように、ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩのＤＣＩＲに対する作用を指標として、ＤＣＩＲを特異的に活性化又は抑制することができる物質を評価又は選択することができる。
実施例７ 破骨細胞生成に対する抗Ｄｃｉｒ抗体の影響
さらに、ケラタン硫酸の作用を指標に、上記抗体の破骨細胞形成に対する作用を評価した。非接着骨髄細胞をウェルプレート（９６ウェルプレート中１×１０５細胞／ウェル）の中に播種し、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有するα－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。２日後、非接着細胞（リンパ球を含む）を洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＢＭＭ）として使用した。これらの破骨前駆細胞（ｐＯＣ）を１００ｎｇ／ｍＬ溶解性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製又はＯｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。培養期間中ハイブリドーマ上清（１０分の１量）又はケラタン硫酸（ＫＳ－ＩＩ；１０ｎｇ／ｍＬ）を加えた。３日後、細胞を回収し、ＴＲＡＰ染色を行い、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞（核数３個以上）の数を計測した。未処理細胞をコントロールとした（ＮＴ）。
結果を図１３に示す。ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩを添加した場合、破骨細胞への分化は抑制された（ＫＳ）。実施例５でケラタン硫酸よりも高いＤＣＩＲ結合能を示したハイブリドーマ上清（ＤＣＩＲアゴニスト（図１３中３、４、５株））は、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を抑制した。実施例５でＤＣＩＲアンタゴニスト活性を示したハイブリドーマ上清は（図１３中１、２株）、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を促進した。
これらの結果から、本発明のハイブリドーマ由来の抗体のようなＤＣＩＲアゴニストは、破骨細胞分化を抑制することにより骨量を増加させる作用を有し、骨粗鬆症等の骨減少性疾患、又は骨折などの骨の障害の治療に有用であることが示された。また、本発明の別のハイブリドーマ由来の抗体のようなＤＣＩＲアンタゴニストも、破骨細胞分化を促進することにより骨量を調整させる作用を有するので、各種骨疾患の治療に有用であることが示唆される。
さらに、ケラタン硫酸の作用を指標に、上記抗体の破骨細胞形成に対する作用を評価した。非接着骨髄細胞をウェルプレート（９６ウェルプレート中１×１０５細胞／ウェル）の中に播種し、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有するα－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。２日後、非接着細胞（リンパ球を含む）を洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＢＭＭ）として使用した。これらの破骨前駆細胞（ｐＯＣ）を１００ｎｇ／ｍＬ溶解性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製又はＯｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。培養期間中ハイブリドーマ上清（１０分の１量）又はケラタン硫酸（ＫＳ－ＩＩ；１０ｎｇ／ｍＬ）を加えた。３日後、細胞を回収し、ＴＲＡＰ染色を行い、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞（核数３個以上）の数を計測した。未処理細胞をコントロールとした（ＮＴ）。
結果を図１３に示す。ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ－ＩＩを添加した場合、破骨細胞への分化は抑制された（ＫＳ）。実施例５でケラタン硫酸よりも高いＤＣＩＲ結合能を示したハイブリドーマ上清（ＤＣＩＲアゴニスト（図１３中３、４、５株））は、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を抑制した。実施例５でＤＣＩＲアンタゴニスト活性を示したハイブリドーマ上清は（図１３中１、２株）、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を促進した。
これらの結果から、本発明のハイブリドーマ由来の抗体のようなＤＣＩＲアゴニストは、破骨細胞分化を抑制することにより骨量を増加させる作用を有し、骨粗鬆症等の骨減少性疾患、又は骨折などの骨の障害の治療に有用であることが示された。また、本発明の別のハイブリドーマ由来の抗体のようなＤＣＩＲアンタゴニストも、破骨細胞分化を促進することにより骨量を調整させる作用を有するので、各種骨疾患の治療に有用であることが示唆される。
試験例
コラーゲン誘発関節炎に対する効果は、以下のようにして確認することができる。
材料と方法：
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）（Ｈ－２ｂ）
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）：
完全プロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、２０ｍＬのＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に１００ｍｇの結核菌加熱死菌体（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を破砕して調製する。エマルジョンは、２ｍｇ／ｍＬチック（ｃｈｉｃｋ）ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍＭ酢酸に４℃で一晩溶解し、等容量のＣＦＡに混ぜて調製する。該混合物を、シリンジ－シリンジ法を用いて乳化させる。ＣＩＩ溶液及びそのＣＦＡエマルジョンは、常に新しいものを調製する。マウスは、尾部近傍の背基部の数か所に、総量で１００μｇのＣＩＩ及び２５０μｇの結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有１００μｌエマルジョンを皮内注射する。この注射を２１日間繰り返す。
関節炎の臨床的評価：
動物について、肢の赤みと腫れについて評価する。
コラーゲン誘発関節炎に対する効果は、以下のようにして確認することができる。
材料と方法：
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）（Ｈ－２ｂ）
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）：
完全プロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、２０ｍＬのＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に１００ｍｇの結核菌加熱死菌体（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を破砕して調製する。エマルジョンは、２ｍｇ／ｍＬチック（ｃｈｉｃｋ）ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍＭ酢酸に４℃で一晩溶解し、等容量のＣＦＡに混ぜて調製する。該混合物を、シリンジ－シリンジ法を用いて乳化させる。ＣＩＩ溶液及びそのＣＦＡエマルジョンは、常に新しいものを調製する。マウスは、尾部近傍の背基部の数か所に、総量で１００μｇのＣＩＩ及び２５０μｇの結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有１００μｌエマルジョンを皮内注射する。この注射を２１日間繰り返す。
関節炎の臨床的評価：
動物について、肢の赤みと腫れについて評価する。
Claims (18)
- ケラタン硫酸－ＩＩ（ＫＳ－ＩＩ）を有効成分とする樹状細胞免疫受容体刺激剤。
- ケラタン硫酸－ＩＩの存在下またはケラタン硫酸－ＩＩを対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定することを特徴とする樹状細胞免疫受容体刺激剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤のスクリーニング方法。
- ケラタン硫酸－ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体。
- モノクローナル抗体である請求項３記載の抗体。
- 破骨細胞産生抑制作用及びＴＮＦ－α産生抑制作用を有する請求項３又は４記載の抗体。
- 請求項３～５のいずれか１項記載の抗体を含有する医薬。
- 骨代謝異常を伴う疾患予防治療剤又は炎症性疾患予防治療剤から選ばれるものである請求項６記載の医薬。
- ケラタン硫酸－ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体。
- モノクローナル抗体である請求項８記載の抗体。
- 破骨細胞産生促進作用及びＴＮＦ－α産生促進作用を有する請求項８又は９記載の抗体。
- 請求項８～１０のいずれか１項記載の抗体を含有する医薬。
- 抗がん剤及び免疫賦活剤から選ばれるものである請求項１１記載の医薬。
- 樹状細胞免疫受容体を刺激するために使用するケラタン硫酸－ＩＩ（ＫＳ－ＩＩ）。
- 骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患を予防又は治療するために使用する請求項３～５のいずれか１項記載の抗体。
- がん治療又は免疫賦活のために使用する請求項８～１０のいずれか１項記載の抗体。
- ケラタン硫酸－ＩＩ（ＫＳ－ＩＩ）を投与することを特徴とする樹状細胞免疫受容体の刺激方法。
- 請求項３～５のいずれか１項記載の抗体を投与することを特徴とする骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療方法。
- 請求項８～１０のいずれか１項記載の抗体を投与することを特徴とするがん治療法又は免疫賦活方法。
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