WO2011098557A1 - Vorrichtung und verfahren zum scannen eines objekts und mikroskop - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zum scannen eines objekts und mikroskop Download PDF

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WO2011098557A1
WO2011098557A1 PCT/EP2011/052031 EP2011052031W WO2011098557A1 WO 2011098557 A1 WO2011098557 A1 WO 2011098557A1 EP 2011052031 W EP2011052031 W EP 2011052031W WO 2011098557 A1 WO2011098557 A1 WO 2011098557A1
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WO
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focusing optics
immersion medium
light beam
illumination light
front glass
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PCT/EP2011/052031
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English (en)
French (fr)
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Volker Seyfried
Bernd Widzgowski
Holger Birk
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/33—Immersion oils, or microscope systems or objectives for use with immersion fluids
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages

Definitions

  • the invention relates to an apparatus and a method for scanning an object.
  • the device has focusing optics which focus an illumination light beam onto a region of the object to be examined.
  • the invention relates to a microscope which is designed in the manner of a scanning microscope, a laser scanning microscope and / or a confocal microscope and comprises the device for scanning the object.
  • a scanning microscope for examining an object basically has at least one light source which generates an illuminating light beam.
  • the illumination light beam is deflected by means of a scanning unit and subsequently focused on the object with the aid of focusing optics.
  • the scanning unit has in known scanning microscopes on two or more mirrors, which can be adjusted by means of the mirrors associated with adjusting elements. Adjusting the mirrors causes a focus area, which may be, for example, point or line-shaped, to be moved on or in the object.
  • the focus area is shifted within a scan field so that the entire scan field can be optically scanned.
  • Dectection triggers emanating from the object which are produced, for example, by fluorescence f ects in the illuminated area of the object, can then be directed to a detector unit and detected with their aid.
  • DE 10 2004 042 913 A1 describes an apparatus for scanning an object, in which a carriage drive a lens lens synchronously with a moved to a stage. During the movement of the stage, the optical scanning takes place.
  • DE 10 2004 059 778 A 1 describes a projection objective for immersion lithography, in which a front glass is used to protect the focusing optics. Between the focusing optics and the front glass, an internal immersion medium is arranged.
  • the invention is characterized in that an internal immersion medium is arranged between the focusing optics and a front glass, which, viewed in the direction of the illuminating light beam, is arranged after the focusing optics.
  • the focusing optics is coupled to an actuator arrangement which moves the focusing optics in a reference position of the illumination light beam transversely to a center axis of the illumination light beam according to a predetermined scanning pattern.
  • the movement of the focusing optics in two different directions within a plane, in particular perpendicular to the central axis of the illumination light beam. This is used to scan a given scan field on or within the object.
  • the object is preferably a sample, in particular a tissue sample.
  • the internal immersion medium makes it possible for light beams from the sample, in particular detection light beams, to enter the focusing optics, in particular a lens of the focusing optics, even at much shallower angles than without an internal imeamterm e d i u m. At the same time, the numerical aperture of the entire device is increased.
  • Suitable internal immersion medium are oil, water or glycerol, or mixed media containing at least one of the aforementioned media.
  • the intermediate space between the focusing lens and the front glass is filled with the internal immersion medium, in particular completely filled, so that no transitions from the focusing optics to the air, from the immersion medium to the air and / or from the front glass to the air occur along the beam path of the illumination light.
  • This contributes to the numerical aperture and resolution preferably being particularly large.
  • Creeping or deliquescence of the immersion medium can be advantageously prevented by the ionization medium perpendicular to the illumination light beam being delimited by a membrane. This is particularly advantageous when the internal immersion medium is a particularly low Viscosity has.
  • a surface of the membrane may be aligned parallel to the central axis of the illumination light beam, or may also be arranged obliquely to it or curved.
  • the internal immersion medium has a predetermined viscosity, which is preferably particularly high or particularly low.
  • the particularly low viscosity has the advantage that the lens movement is only slightly influenced by the internal immersion medium, which has a positive effect on the precise controllability of the moving focusing optics.
  • the particularly high viscosity has the advantage that even with a particularly fast movement of the focusing optics, for example in the region of a resonant frequency, it is prevented that the internal insulating medium escapes from the intermediate space between the front glass and the focusing optics, in particular if no membrane is provided ,
  • the surfaces of the front glass and / or the focusing optics, which are in contact with the internal immersion medium have a predetermined roughness.
  • the predetermined roughness is preferably particularly high or particularly low.
  • the advantage of the particularly high roughness which on the one hand should only be microscopic, but on the other hand can be achieved by a targeted introduction of a profile in the corresponding surface, is that the internal immersion medium adheres particularly well to the front glass or the surface of the focusing optics.
  • the advantage of a particularly smooth surface of the focusing optics or the front glass is that the focusing optics and the front glass can be brought very close to each other. In this case, an immersion medium with very low viscosity is preferably used.
  • the refractive index of the intermediate medium in particular of the immersion medium, has only a small to negligible influence.
  • the surfaces of the front glass or the focusing optics which are in contact with the internal insulating medium are hardened. As a result, damage and / or wear of the relatively moving surfaces can be avoided. In contrast, these surfaces may also be designed to be particularly soft, so that no damage occurs in the case of unwanted contact of the front glass with the focusing optics.
  • the invention relates to a microscope such as a scanning microscope, a laser microscope and / or confocal microscope, which comprises the device for scanning the object.
  • a microscope such as a scanning microscope, a laser microscope and / or confocal microscope, which comprises the device for scanning the object.
  • the invention according to a third aspect relates to a method for scanning the object.
  • the invention is characterized in that between the focusing optics and the sample, the immersion medium is introduced so that the focusing optics and the sample are in contact with the immersion medium.
  • the sample may be covered by a cover glass and / or the focusing optics may be covered by the front glass.
  • An external insulating medium may then be provided between the front glass and the sample alternatively or in addition to the internal immersion medium between the focusing optics and the front glass.
  • the external immersion medium may be of the type or different from the internal immersion medium.
  • the surfaces covered with the external immersion medium to be in direct contact may be formed corresponding to the surfaces which are in direct contact with the internal immersion medium.
  • FIG. 1 shows a first embodiment of a device for scanning an object with an internal immersion medium
  • Figure 2 shows the first imple mentation of the device for
  • Figure 3 shows a second embodiment of the device for scanning the object
  • FIG. 4 shows the device for scanning an object in a confocal microscope
  • Figure 5 shows a third embodiment of the device with the external immersion medium.
  • FIG. 1 shows a scanning unit 20 for a microscope, which can also be referred to as an apparatus for scanning an object.
  • the scanning unit 20 has a housing 22 which has an illumination recess, not shown, through which an illumination light beam 24 passes.
  • the illumination light beam 24 is generated, for example, by a laser of a microscope and deflected via one or more optical arrangements, for example mirrors and / or one or more optical fibers, to the scanning unit 20.
  • a carrier body 28 is suspended in a plane via a parallel spring joint 26 in a plane.
  • the carrier body 28 carries a focusing optics 30, on which the illumination light beam 24 is directed.
  • the in-plane support body 28 is moved perpendicularly to a center axis of the illumination light beam 24 via an electromagnetically operating actuator assembly comprising a coil assembly 34 and a coil 36, with respect to a reference position of the illumination light beam 24.
  • the scanning unit 20 In the direction of the illumination light beam 24 behind the focusing optics 30, the scanning unit 20 is closed by a front glass 38. Between the front glass 38 and the focusing optics 30, an internal immersion medium 40 is arranged.
  • the illumination light beam 24 is focused by the focusing optics 30 and the focused illumination light beam 42 is directed to an object, particularly a sample 44 carried by a slide 46.
  • the illumination recess, the focusing optics 30, the internal imbraser wheel 40 and the front glass 38 are thus successively arranged in the direction of the illumination light 24.
  • the reference position of the illumination light beam 24 refers to any fixed predetermined position of the illumination beam 24, the at the embodiment shown in Figure 1 is fixed and is not changeable. However, if the illuminating light beam 24 itself is moved, for example, by coupling the illuminating beam 1 into the scanning unit 20 by means of an optically conductive fiber and by moving the optical fiber alternatively or in addition to moving the focusing optics (FIG. 30), the reference position of the central axis of the illumination light beam 24 is predetermined by a fixed reference position of the optical fiber.
  • the internal im me n s m e d i u m 40 helps to maximize the numerical aperture and resolution that can be achieved with the aid of the scanning unit 20.
  • detection beams which emanate from the sample due to reflections or fluorescence effects and which emerge from the sample at a particularly shallow angle can also be detected. That the angle is particularly flat in this context means that the angle between the central axis of the illumination light beam 24 and the detection beams is nearly 90 °.
  • FIG. 2 shows the scanning unit 20 according to FIG. 1, the sample 44 being covered by a cover glass 50. Between the front glass 38 and the
  • Cover glass 50 is an external immersion medium 48 introduced.
  • the external im m er s on m e d i u m 48 may be omitted.
  • FIG. 3 shows the scanning unit according to FIG. 1, wherein the internal immersion medium 40 is delimited in the direction perpendicular to the center axis of the illumination light beam 24 by a membrane 54.
  • the diaphragm 54 is formed parallel to the center axis of the illumination light beam 24.
  • the membrane may also be inclined relative to the central axis or inwardly or outwardly. be formed. The membrane 54 helps prevent the internal immersion medium 40 from creeping, flowing, or hurling from the clutter beam path due to its own characteristics and / or movement of the focusing optics.
  • FIG. 4 shows the scanning unit 20 in a microscope.
  • the microscope comprises a light source 60, which is preferably designed as a laser light source.
  • the light source 60 generates the illumination light beam 24, which is directed via a beam splitter 62 to the scanning unit 20 and in particular to the focusing optics 30.
  • Fluorescent effects emanating from the sample 44 penetrate the beam splitter 62 and are focused by means of a detection lens 66 onto a detection aperture 68 and detected by a light-sensitive detector (not shown) ,
  • the microscope comprises a vertical actuator assembly 70 comprising a vertical coil assembly 72 and a vertical coil 74 and which moves a vertical support body 76 parallel to the illuminating light beam and perpendicular to the plane in which the focusing optics 30 is movable.
  • FIG. 5 shows an embodiment of the scanning unit 20 which has no front glass 38.
  • the immersion medium in particular the external insulating medium 48
  • the front glass 38 and / or the cover glass 50 may be provided, in which case the external insulating member 48 is in direct contact with the front glass 38 or the cover glass 50.
  • the external immersion medium 48 may alternatively or in addition to the internal immersion medium 40. be ordered. For scanning the sample, the greatest possible distance between the focusing optics 30 and the cover glass 50 can contribute to the shearing forces occurring in the external immersion medium 48 being particularly low and thus only negligibly influencing the controllability of the focusing optics 30.
  • the immersion media preferably comprise oil, water and / or glycerol.
  • the immersion media preferably have the lowest or highest possible viscosity.
  • the high viscosity immersion medium is preferred in the internal immersion medium 40.
  • the membrane 54 is preferably provided. By using an immersion medium with the lowest possible viscosity, the membrane 54 can be saved, without the imager being thrown out of the illumination beam path during the movement of the focusing optics 30.
  • the likelihood of adverse effects of air bubbles in the immersion medium is reduced over the high viscosity immersion medium. This is particularly advantageous when the movement of the focusing optics 30 is resonant and thus very fast.
  • the low viscosity immersion medium is preferred in the internal immersion medium 40.
  • the surfaces of the focusing optics 30 and / or the front glass 38, which are in direct contact with the internal immersion medium 40, and / or the surfaces of the focusing optics 30 of the front glass 38 and / or the cover glass, which are in direct contact with the external immersion medium 48, preferably have a particularly high or very low roughness.
  • a particularly low roughness which can be achieved for example by polishing the corresponding surface, makes it possible to bring the focusing optics 30 and the front glass 38 very close together, which contributes to a refractive index of the immersion medium having a particularly small influence on the properties of the microscope , Especially when the distance between the focusing optics 30 and front glass 38 is significantly smaller than the wavelength of the illumination light used.
  • a particularly rough surface which can be achieved, for example, by introducing a microscopic profile into the corresponding surfaces, contributes to the fact that the corresponding immersion medium adheres particularly well to the corresponding surface.
  • the immersion medium preferably has the same refractive index as the focusing optics 30 and the front glass 38.
  • the surfaces of the front glass 30 and the focusing optics 30 may be hardened in order to avoid damage to the mutually moving surfaces.
  • the surfaces may also be made particularly soft, which in the event of unintentional contact of the surfaces with one another only leads to elastic deformation of the corresponding surface and not to damage.
  • Microscopy methods in which the device according to the invention can be used or the effects which are to be observed are, for example, SRS (Stimulated Raman Scattering), FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging), SHG (Second Harmony Generation), FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), FR ET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) and FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy).
  • SRS Stimulated Raman Scattering
  • FLIM Fluorescence Lifetime Imaging
  • SHG Second Harmony Generation
  • FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching
  • FR ET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • the invention is not limited to the specified embodiments.
  • the embodiments may be combined.
  • the vertical actuator assembly 70 may also be arranged in the scanning unit 20 or the microscope may be formed entirely without the vertical actuator assembly 70.
  • the illumination light beam 24 can be moved for scanning the sample 44, for example via an optical fiber whose end facing the focusing optics 30 is coupled to an actuator arrangement.
  • the electromagnetically operating actuator arrangement it is also possible to provide another actuator arrangement, for example one comprising at least one, preferably a plurality of piezoactuators.
  • the scanning unit 20 may be a fixed component of the microscope or designed as an objective for a conventional microscope with or without a scanning function, in particular also as part of an objective revolver.
  • the scanning unit can be coupled to an outer actuator arrangement, which enables a movement of the scanning unit 20 over a large area.
  • the illumination light beam 24 is preferably coupled via the optical fiber.
  • the scanning unit 20 can be received by a tripod, in particular a tripod.
  • the light source 60 may be a laser that generates light of one or more discrete wavelengths or broadband light.
  • a mercury vapor lamp may also be provided.
  • the focusing optics 30 can also comprise a lens curved inwards as viewed from the object. LIST OF REFERENCE NUMBERS

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Abstract

Eine Vorrichtung zum Scannen eines Objekts hat eine Fokussieroptik (30), die einen Beleuchtungslichtstrahl (24) auf einen zu untersuchenden Bereich des Objekts fokussiert. Eine Aktoranordnung ist mit der Fokussieroptik (30) gekoppelt und bewegt die Fokussieroptik (30) gemäß einem vorgegebenen Abtastmuster quer zu einer Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls (24) in einer Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls (24). Ein Frontglas (38) ist in Richtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) gesehen nach der Fokussieroptik (30) angeordnet. Ein internes Immersionsmedium (40) ist zwischen der Fokussieroptik (30) und dem Frontglas (38) angeordnet. Zwischen dem Frontglas (38) und dem Objekt kann ein externes Immersionsmedium (48) eingebracht werden.

Description

Vorrichtung und Verfahren zum Scannen eines Objekts und Mikroskop
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Scannen eines Objekts. Die Vorrichtung hat eine Fokussieroptik, die einen Beleuchtungslichtstrahl auf einen zu untersuchenden Bereich des Objekts fokussiert. Ferner betri fft die Erfindung ein Mikroskop, das nach Art eines Scanmikroskop, eines Laserscanmikroskops und/oder eines Konfokalmikroskops ausgebildet ist, und die Vorrichtung zum Scannen des Objekts umfasst.
Ein Scanmikroskop zum Untersuchen eines Objekts, insbesondere einer Probe, hat grundsätzlich mindestens eine Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl erzeugt. Der Beleuchtungslichtstrahl wird mit Hilfe einer Scaneinheit abgelenkt und nachfolgend mit Hilfe einer Fokussieroptik auf das Objekt fokussiert. Die Scaneinheit weist bei bekannten Scanmikroskopen zwei oder mehr Spiegel auf, die mit Hilfe von den Spiegeln zugeordneten Stellelementen verstellt werden können. Das Verstellen der Spiegel bewirkt, dass ein Fokusbereich, der beispielsweise punkt- oder linienförmig sein kann, auf oder in dem Objekt verschoben wird. Vorzugsweise wird beim Scannen des Objekts der Fokusbereich so innerhalb eines Scan fel des verschoben, dass das gesamte Scanfeld optisch abgetastet werden kann. Von dem Objekt ausgehende D etekti on s s tr ah l en , die beispielsweise durch Fluoreszenz e f f e k t e in dem beleuchteten Bereich des Objekts entstehen, können dann auf eine Detektoreinheit gelenkt und mit deren Hilfe erfasst werden.
DE 10 2004 042 913 AI beschreibt eine Vorrichtung zum Scannen eines Objektes, bei der ein Schlittenantrieb eine Objektiv linse synchron mit ei- nem Objekttisch bewegt. Während der Bewegung des Objekttisches erfolgt das optische Abtasten.
DE 10 2004 059 778 A 1 beschreibt ein Projektionsobjektiv für Immer- sions-Lithografie, bei dem ein Frontglas zum Schutz der Fokussieroptik verwendet wird. Zwischen der Fokussieroptik und dem Frontglas ist ein internes Immersionsmedium angeordnet.
Aus der DE 1 0 1 52 609 A 1 ist es bekannt, ein Objektiv eines Scan- Mikroskops quer zur optischen Achse zu bewegen. Eine Bewegung quer zur Richtung eines Aufl icht- Beleuchtungs licht stra hls findet nicht statt.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Scannen eines Objekts und ein Mikroskop zu schaffen, die auf kostengünstige Weise eine große numerische Apertur und eine besonders hohe Auflösung ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die Erfindung zeichnet sich gemäß einem ersten Aspekt dadurch aus, dass zwischen der Fokussieroptik und einem Frontglas, das in Richtung des B e l e u c h t u n g s l i c h t s t r a h l s gesehen nach der Fokussieroptik angeordnet ist, ein internes Immersionsmedium angeordnet ist. Die Fokussieroptik ist mit einer Aktoranordnung gekoppelt, die die Fokussieroptik gemäß einem vorgegebenen Abtastmuster quer zu einer Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls in einer Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls bewegt. Vorzugsweise erfolgt das Bewegen der Fokussieroptik in zwei unterschiedliche Richtungen innerhalb einer Ebene, insbesondere senkrecht zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls. Dies dient zum Abscannen eines vorgegebenen Scanfeldes auf oder innerhalb des Objekts. Bei dem Objekt handelt es sich vorzugsweise um eine Probe, insbesondere um eine Gewebeprobe.
Ohne das interne Immersionsmedium treten ab bestimmten Winkeln an der Grenzfläche Deckglas/Luft Totalreflexionen auf. Das interne Immersionsmedium ermöglicht, dass Lichtstrahlen von der Probe, insbesondere Detektionslichtstrahlen, auch unter sehr viel flacheren Winkeln in die Fokussieroptik, insbesondere eine Linse der Fokussieroptik eintreten können, als ohne internes I m m e r s i o n s m e d i u m . Gleichzeitig wird die numerische Apertur der gesamten Vorrichtung vergrößert. Als internes Immersionsmedium eignen sich Öl, Wasser oder Glycerin, oder Mischmedien, die zumindest eines der vorgenannten Medien enthalten.
Vorzugsweise ist der Zwischenraum zwischen der Fokussieroptik und dem Frontglas mit dem internen Immersionsmedium ausgefüllt, insbesondere vollständig ausgefüllt, so dass entlang des Strahlengangs des Beleuchtungslichts keine Übergänge von der Fokussieroptik zur Luft, vom Immersionsmedium zur Luft und/oder vom Frontglas zur Luft entstehen. Dies trägt dazu bei, dass die numerische Apertur und die Auflösung vorzugsweise besonders groß sind.
Ein Kriechen oder Zerfließen des Immersionsmediums kann vorteilhaft verhindert werden, indem das I m m e r s i o n s m e d i u m senkrecht zu dem Beleuchtung s l i c h t s t r a h l von einer Membran begrenzt ist. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn das interne Immersionsmedium eine besonders niedrige Viskosität hat. Eine Oberfläche der Membran kann parallel zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls ausgerichtet sein, oder auch schräg zu dieser angeordnet oder gewölbt sein.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung hat das interne Immersionsmedium eine vorgegebene Viskosität, die vorzugsweise besonders hoch oder besonders niedrig ist. Die besonders geringe Viskosität hat den Vorteil, dass durch das interne Immersionsmedium die Linsenbewegung nur geringfügig beeinflusst wird, was sich positiv auf die präzise Steuerbarkeit der bewegten Fokussieroptik auswirkt. Die besonders hohe Viskosität hat dagegen den Vorteil, dass auch bei einer besonders schnellen Bewegung der Fokussieroptik, beispielsweise im Bereich einer Resonanzfrequenz, verhindert wird, dass das interne I m m e r s i o n s m e d i u m aus dem Zwischenraum zwischen dem Frontglas und der Fokussieroptik tritt, insbesondere wenn keine Membran vorgesehen ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weisen die Flächen des Frontglases und/oder der Fokussieroptik, die mit dem internen Immersionsmedium in Kontakt sind, eine vorgegebene Rauhigkeit auf. Die vorgegebene Rauhigkeit ist vorzugsweise besonders hoch oder besonders niedrig. Der Vortei l der besonders hohen Rauhigkeit, die einerseits nur mikroskopisch sein sollte, andererseits jedoch durch ein gezieltes Einbringen eines Profils in der entsprechenden Oberfläche erzielt werden kann, ist, dass das interne Immersionsmedium besonders gut an dem Frontglas bzw. der Oberfläche der Fokussieroptik haftet. Im Gegensatz dazu ist der Vorteil einer besonders glatten Oberfläche der Fokussieroptik bzw. des Frontglases, dass die Fokussieroptik und das Frontglas sehr dicht aneinander gebracht werden können. Dabei wird vorzugsweise ein Immersionsmedium mit sehr geringer Viskosität verwendet. Ist nämlich der Abstand zwi- sehen der Fokussieroptik und dem Frontglas deutlich kleiner als die Wellenlänge des verwendeten Beleuchtungslichts, so hat der Brechungsindex des dazwischen liegenden Mediums, insbesondere des Immersionsmediums, nur einen geringen bis vernachlässigbaren Einfluss. Alternativ oder zusätzlich, insbesondere wenn der vorgenannte Abstand besonders klein ist, ist es vorteilhaft, wenn die Oberflächen des Frontglases oder der Fokussieroptik, die mit dem internen I m m e r s i o n s m e d i u m in Kontakt sind, gehärtet sind. Dadurch können Beschädigungen und/oder Verschleiß der sich relativ zueinander bewegenden Oberflächen vermieden werden. Im Gegensatz dazu können diese Oberflächen auch besonders weich ausgebildet sein, so dass bei einer ungewollten Berührung des Frontglases mit der Fokussieroptik keine Schäden entstehen.
Die Erfindung betrifft gemäß einem zweiten Aspekt ein Mikroskop nach Art eines Scanmikroskops, eines L as ers ca nm i kr o s ko p s und/oder Konfo- kalmikroskops, das die Vorrichtung zum Scannen des Objekts umfasst.
Ferner betrifft die Erfindung gemäß einem dritten Aspekt ein Verfahren zum Scannen des Objekts. Dabei zeichnet sich die Erfindung dadurch aus, dass zwischen die Fokussieroptik und die Probe das Immersionsmedium so eingebracht wird, dass die Fokussieroptik und die Probe in Kontakt mit dem Immersionsmedium sind. Alternativ dazu kann die Probe von einem Deckglas abgedeckt sein und/oder die Fokussieroptik kann durch das Frontglas abgedeckt sein. Zwischen dem Frontglas und der Probe kann dann ein externes I m m e r s i o n s m e d i u m alternativ oder zusätzlich zu dem internen Immersionsmedium zwischen der Fokussieroptik und dem Frontglas vorgesehen sein. Das externe Immersionsmedium kann seiner Art nach dem internen Immersionsmedium entsprechen oder davon unterschiedlich sein. Die Oberflächen, die mit dem externen Immersionsmedi- um in direktem Kontakt sind können entsprechend den Oberflächen ausgebildet sein, die mit dem internen Immersionsmedium in direktem Kontakt sind.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind nachfolgend anhand von schematischen Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 eine erste Au s führungs form einer Vorrichtung zum Scannen eines Objekts mit einem internen Immersionsmedium,
Figur 2 die erste Aus führungs form der Vorrichtung zum
Scannen eines Objekts mit einem Deckglas, dem internen Immersionsmedium und einem externen Immersionsmedium,
Figur 3 eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung zum Scannen des Objekts, und
Figur 4 die Vorrichtung zum Scannen eines Objekts in einem konf okalen Mikroskop,
Figur 5 eine dritte Ausführungsform der Vorrichtung mit dem externen Immersionsmedium.
Elemente gleicher Konstruktion oder Funktion sind fi gu re n ü b ergr e i fen d mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet. Figur 1 zeigt eine Scaneinheit 20 für ein Mikroskop, die auch als Vorrichtung zum Scannen eines Objekts bezeichnet werden kann. Die Scaneinheit 20 hat ein Gehäuse 22, das eine nicht dargestellte Beleuchtungsausneh- mung hat, durch die ein Beleuchtungslichtstrahl 24 tritt . Der Beleuchtungslichtstrahl 24 wird beispielsweise durch einen Laser eines Mikroskops erzeugt und über eine oder mehrere optische Anordnungen, beispielsweise Spiegel und/oder eine oder mehrere Glasfasern zu der Scaneinheit 20 umgelenkt. Ein Trägerkörper 28 ist über ein Parallelfedergelenk 26 in einer Ebene beweglich aufgehängt. Der Trägerkörper 28 trägt eine Fokussieroptik 30, auf die der Beleuchtungslichtstrahl 24 gerichtet ist. Der in der Ebene bewegliche Trägerkörper 28 wird über eine elektromagnetisch arbeitende Aktoranordnung, die eine Spulenanordnung 34 und eine Spule 36 umfasst, senkrecht zu einer Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 bewegt, und zwar bezogen auf eine Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls 24.
In Richtung des Beleuchtungslichtstrahls 24 hinter der Fokussieroptik 30 ist die Scaneinheit 20 durch ein Frontglas 38 abgeschlossen. Zwischen dem Frontglas 38 und der Fokussieroptik 30 ist ein internes Immersionsmedium 40 angeordnet. Der Beleuchtungslichtstrahl 24 wird durch die Fokussieroptik 30 fokussiert und der fokussiertc Beleuchtungslichtstrahl 42 ist auf ein Objekt, insbesondere eine Probe 44, die von einem Objektträger 46 getragen wird, gerichtet. In einem Beleuchtungsstrahlengang des Beleuchtungslichts 24 sind somit in Richtung des Beleuchtungslichts 24 gesehen nacheinander die Beleuchtungsausnehmung, die Fokussieroptik 30, das interne I m m e r s i o n s m e d i u m 40 und das Frontglas 38 angeordnet.
Die Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls 24 bezieht sich auf eine beliebige fest vorgegebene Position des Beleuchtungsstrahls 24, die bei dem in Figur 1 dargestellten Ausführungsbeispiel fest ist und nicht veränderlich ist. Falls jedoch der Beleuchtungslichtstrahl 24 selbst bewegt wird, beispielsweise durch Einkoppeln des B e leuchtu ngs 1 i cht strahl s in die Scaneinheit 20 mit Hilfe einer optisch leitenden Faser und durch ein Bewegen der optischen Faser alternativ oder zusätzlich zu dem Bewegen der Fokus- sieroptik (30), so wird durch eine fest vorgegebene Referenzposition der optischen Faser die Referenzposition der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 vorgegeben.
Das interne I m m er s i o n s m e d i u m 40 trägt dazu bei, die numerische Apertur und die Auflösung, die mit Hilfe der Scaneinheit 20 erzielt werden können, zu maximieren. Somit können auch Detektionsstrahlen, die aufgrund von Reflexionen oder Fluoreszenzeffekten von der Probe ausgehen und die in einem besonders flachen Winkel aus der Probe austreten, erfasst werden. Dass der Winkel besonders flach ist, bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Winkel zwischen der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 und den Detektionsstrahlen nahezu 90° ist.
Figur 2 zeigt die Scaneinheit 20 gemäß Figur 1 , wobei die Probe 44 durch ein Deckglas 50 abgedeckt ist. Zwischen dem Frontglas 38 und dem
Deckglas 50 ist ein externes Immersionsmedium 48 eingebracht. Alternativ dazu kann auf das externe I m m er s i on s m e d i u m 48 verzichtet werden.
Figur 3 zeigt die Scaneinheit gemäß Figur 1 , wobei das interne Immersionsmedium 40 in Richtung senkrecht zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 durch eine Membran 54 begrenzt ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Membran 54 parallel zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 ausgebildet. Alternativ dazu kann die Membran jedoch auch schräg zu der Mittelachse oder nach innen oder außen ge- wölbt ausgebildet sein. Die Membran 54 trägt dazu bei, dass das interne Immersionsmedium 40 nicht aufgrund seiner eigenen Eigenschaften und/oder aufgrund der Bewegung der Fokussieroptik aus dem Bclcuch- tungsstrahlengang kriecht, fließt oder geschleudert wird.
Figur 4 zeigt die Scaneinheit 20 in einem Mikroskop. Das Mikroskop um- fasst eine Lichtquelle 60, die vorzugsweise als Laserlichtquelle ausgebildet ist. Die Lichtquelle 60 erzeugt den Beleuchtungslichtstrahl 24, der über einen Strahlteiler 62 hin zu der Scaneinheit 20 und insbesondere auf die Fokussieroptik 30 gerichtet ist. Von der Probe 44 ausgehende Detekti- onsstrahlen, insbesondere aufgrund von Fluoreszenzeffekten in der Probe 44 erzeugte F l u oreszenzl icht s trah l en durchdringen den Strahlteiler 62 und werden mit Hilfe einer Detektionslinse 66 auf eine Detektionsblende 68 fokussiert und von einem nicht dargestellten lichtempfindlichen Detektor erfasst. Das Mikroskop um fasst eine Vertikal-Aktoranordnung 70, die eine Vertikal-Spulenanordnung 72 und eine Vertikalspule 74 um fasst und die einen Vertikal-Trägerkörper 76 parallel zum Beleuchtungslichtstrahl und senkrecht zu der Ebene, in der die Fokussieroptik 30 beweglich ist, bewegt.
Figur 5 zeigt eine Ausführungsform der Scaneinheit 20, die kein Frontglas 38 aufweist. Bei dieser Ausführungsform wird das Immersionsmedium, insbesondere das externe I mm e r s i o n s m e d i u m 48 direkt zwischen die bewegliche Fokussieroptik 30 und die Probe 44 eingebracht. Zusätzlich können das Frontglas 38 und/oder das Deckglas 50 vorgesehen sein, wobei dann das externe I m m er s i on sm ed i u m 48 mit dem Frontglas 38 bzw. dem Deckglas 50 in direktem Kontakt ist. Ferner kann das externe Immersionsmedium 48 in den im Vorstehenden erläuterten Ausführungsbeispielen alternativ oder zusätzlich zu dem internen Immersionsmedium 40 an- geordnet sein. Zum Scannen der Probe kann ein möglichst großer Abstand zwischen der Fokussieroptik 30 und dem Deckglas 50 dazu beitragen, dass die auftretenden Scherkräfte im externen Immersionsmedium 48 besonders gering sind und sich so lediglich vernachlässigbar auf die Steuerbarkeit der Fokussieroptik 30 auswirken.
Die Immersionsmedien umfassen vorzugsweise Öl, Wasser und/oder Gly- cerin. Dabei weisen die Immersionsmedien vorzugsweise eine möglichst geringe oder möglichst hohe Viskosität auf. Durch die Verwendung eines Immersionsmediums mit möglichst hoher Viskosität wird die Bewegung der Fokussieroptik 30 möglichst wenig beeinflusst. Dies trägt dazu bei, dass die Steuerung und/oder Regelung der Bewegung der Fokussieroptik 30 möglichst präzise erfolgen kann. Das Immersionsmedium mit hoher Viskosität wird bei dem internen Immersionsmedium 40 bevorzugt. Bei Verwendung des Immersionsmediums mit möglichst hoher Viskosität wird vorzugsweise die Membran 54 vorgesehen. Durch die Verwendung eines Immersionsmediums mit möglichst geringer Viskosität kann die Membran 54 eingespart werden, ohne dass bei der Bewegung der Fokussieroptik 30 das I m m e r s i o n s m e d i u m aus dem Beleuchtungsstrahlengang geschleudert wird. Ferner ist die Wahrscheinlichkeit des nachteiligen Auftretens von Luftblasen im Immersionsmedium verringert gegenüber dem Immersionsmedium mit hoher Viskosität. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Bewegung der Fokussieroptik 30 resonant und somit besonders schnell erfolgt. Das Immersionsmedium mit geringer Viskosität wird bei dem internen Immersionsmedium 40 bevorzugt.
Die Oberflächen der Fokussieroptik 30 und/oder des Frontglases 38, die mit dem internen Immersionsmedium 40 in direktem Kontakt sind, und/oder die Oberflächen der Fokussieroptik 30. des Frontglases 38 und/oder des Deckglases, die mit dem externen Immersionsmedium 48 in direktem Kontakt sind, weisen vorzugsweise eine besonders hohe oder besonders geringe Rauhigkeit auf. Eine besonders geringe Rauhigkeit, die beispielsweise durch Polieren der entsprechenden Oberfläche erzielt werden kann, ermöglicht, die Fokussieroptik 30 und das Frontglas 38 sehr dicht aneinander zu bringen, was dazu beiträgt, dass ein Brechungsindex des Immersionsmediums einen besonders geringen Einfluss auf die Eigenschaften des Mikroskops hat, insbesondere wenn der Abstand zwischen Fokussieroptik 30 und Frontglas 38 deutlich kleiner als die Wellenlänge des verwendeten Beleuchtungslichts ist. Im Gegensatz dazu trägt eine besonders raue Oberfläche, die beispielsweise durch Einbringen eines mikroskopischen Profils in die entsprechenden Oberflächen erreicht werden kann, dazu bei, dass das entsprechende Immersionsmedium besonders gut an der entsprechenden Oberfläche haftet.
Das Immersionsmedium hat vorzugsweise denselben Brechungsindex wie die Fokussieroptik 30 und das Frontglas 38. Darüber hinaus können die Oberflächen des Frontglases 30 bzw. der Fokussieroptik 30 gehärtet sein, um eine Beschädigung der sich zueinander bewegenden Flächen zu vermeiden. Alternativ dazu können die Oberflächen auch besonders weich ausgeführt sein, was bei einem unbeabsichtigten Kontakt der Oberflächen aneinander lediglich zur elastischen Deformation der entsprechenden Oberfläche und nicht zu einer Beschädigung führt.
Mikroskopieverfahren, bei denen die erfindungsgemäße Vorrichtung anwendbar ist, oder dabei auftretende zu beobachtende Effekte sind beispielsweise SRS (Stimulierter Raman-Streuung), FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging), SHG (Second Harmonie Generation), FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), FR E T (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) und FCS (Fluoreszenz-Korrelations- Spektroskopie).
Die Erfindung ist nicht auf die angegebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Beispielsweise können die Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden. Beispielsweise kann die Vertikal-Aktoranordnung 70 auch in der Scaneinheit 20 angeordnet sein oder das Mikroskop kann ganz ohne die Vertikal-Aktoranordnung 70 ausgebildet sein. Ferner kann zum Scannen der Probe 44 anstatt der Fokussieroptik 30 der Beleuchtungslichtstrahl 24 bewegt werden, beispielsweise über eine optische Faser, deren der Fokussieroptik 30 zugewandtes Ende mit einer Aktoranordnung gekoppelt ist. Alternativ zu der elektromagnetisch arbeitenden Aktoranordnung kann auch eine andere Aktoranordnung vorgesehen sein, beispielsweise eine, die zumindest einen, vorzugsweise mehrere Piezoaktoren umfasst. Die Scaneinheit 20 kann ein fester Bestandtei l des Mikroskops sein oder als Objektiv für ein herkömmliches Mikroskop mit oder ohne Scanfunktion ausgebildet sein, insbesondere auch als Teil eines Objektivrevolvers. Ferner kann die Scaneinheit mit einer äußeren Aktoranordnung gekoppelt sein, die eine Bewegung der Scaneinheit 20 über eine große Fläche ermöglicht. Bei dieser Ausführungsform wird der Beleuchtungslichtstrahl 24 vorzugsweise über die Lichtleitfaser eingekoppelt. Ferner kann die Scaneinheit 20 von einem Stativ, insbesondere einem Dreibein aufgenommen werden. Die Lichtquelle 60 kann ein Laser sein, der Licht einer oder mehrerer diskreter Wellenlängen oder breitbandiges Licht erzeugt. Alternativ zu dem Laser kann beispielsweise auch eine Quecksilberdampflampe vorgesehen sein. Zusätzlich oder alternativ zu dem externen Immersionsmedium kann die Fokussieroptik 30 auch eine vom Objekt aus gesehen nach innen gewölbte Linse umfassen. Bezugszeichenliste:
20 Scaneinheit
22 Gehäuse
24 Beleuchtungslichtstrahl
26 Parallel-Federgelenk
28 Trägerkörper
30 Fokussieroptik
34 Spulenanordnung
36 Spule
38 Frontglas
40 internes Immersionsmedium
42 fokussierter Beleuchtungslichtstrahl
44 Probe
46 Objektträger
48 externes I mmers i onsmed i u m
50 Deckglas
52 Objektschicht
54 Membran
60 Lichtquelle
62 Strahlteiler
64 Detektionslichtstrahl
66 Detektionslinse
68 Detektionsblende
70 Vertikal-Aktoranordnung
72 Vertikal-Spulenanordnung
74 Vertikal-Spule
76 Vert i ka 1 -Träger körper

Claims

Ansprüche
1 . Vorrichtung zum Scannen eines Objekts,
mit einer Fokussieroptik (30), die einen Beleuchtungslichtstrahl (24 ) auf einen zu untersuchenden Bereich des Objekts fokussiert,
einer Aktoranordnung, die mit der Fokussieroptik (30) gekoppelt ist und die die Fokussieroptik (30) gemäß einem vorgegebenen Abtastmuster quer zu einer Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls (24) in einer Referenzposition des B e l eu cht u n gs l i ch t stra h l s (24) bewegt,
einem Frontglas (38), das in Richtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) gesehen nach der Fokussieroptik (30) angeordnet ist,
und mit einem internen Immersionsmedium (40), das zwischen der Fokussieroptik (30) und dem Frontglas (38) angeordnet ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 . bei der ein Zwischenraum zwischen der Fokussieroptik ( 30) und dem Frontglas (38) mit dem internen Immersionsmedium (40) ausgefüllt ist.
3. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das interne Immersionsmedium (40 ) in Richtung senkrecht zu dem Beleuchtungslichtstrahl (24) durch eine Membran (54) begrenzt ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das interne Immersionsmedium (40) eine vorgegebene Viskosität hat.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das interne Immersionsmedium (40) in gelartigem Zustand vorliegt.
6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das interne Immersionsmedium (40) den gleichen oder näherungsweise den gleichen Brechungsindex wie die Fokussieroptik (30) und/oder das Frontglas (38) hat.
7. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der die Flächen des Frontglases ( 38) und/oder der Fokussieroptik (30), die mit dem internen Immersionsmedium (40) in Kontakt sind, eine vorgegebene Rauhigkeit aufweisen.
8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der die Flächen des Frontglases (38) und/oder der Fokussieroptik (30), die mit dem internen Immersionsmedium (40) in Kontakt sind, gehärtet sind.
9. Mikroskop nach Art eines Scanmikroskops, eines Laserscanmikroskops und/oder Konfokalmikroskops, das die Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche umfasst.
10. Verfahren zum Scannen eines Objekts,
bei dem mit einer Fokussieroptik (30) ein B eleu cht ungs l i chtstrah l (24) auf einen zu untersuchenden Bereich des Objekts fokussiert wird,
mit Hilfe einer Aktoranordnung die Fokussieroptik (30) gemäß einem vorgegebenen Abtastmuster quer zu einer Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls (24) in einer Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls (24) bewegt wird,
und bei dem in Richtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) gesehen zwischen der Fokussieroptik (30) und dem Objekt ein Immersionsmedium (40, 48) eingebracht wird.
1 1 . Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem in Richtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) gesehen zwischen dem Immersionsmedium (40, 48) und dem Objekt ein Deckglas angeordnet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 1 1 ,
bei dem in Richtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) gesehen nach der Fokussieroptik (30) ein Frontglas (38) angeordnet ist und bei dem zwischen dem Frontglas (38) und dem Objekt ein externes Immersionsmedi- um (48) eingebracht wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12,
bei dem in Richtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) gesehen zwischen der Fokussieroptik (30) und dem Frontglas (38) ein internes Immersionsmedium (40) eingebracht wird.
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