-
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Scannen eines Objekts. Die Vorrichtung hat eine Fokussieroptik, die einen Beleuchtungslichtstrahl auf einen zu untersuchenden Bereich des Objekts fokussiert. Ferner betrifft die Erfindung ein Mikroskop, das nach Art eines Scanmikroskop, eines Laserscanmikroskops und/oder eines Konfokalmikroskops ausgebildet ist, und die Vorrichtung zum Scannen des Objekts umfasst.
-
Ein Scanmikroskop zum Untersuchen eines Objekts, insbesondere einer Probe, hat grundsätzlich mindestens eine Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl erzeugt. Der Beleuchtungslichtstrahl wird mit Hilfe einer Scaneinheit abgelenkt und nachfolgend mit Hilfe einer Fokussieroptik auf das Objekt fokussiert. Die Scaneinheit weist bei bekannten Scanmikroskopen zwei oder mehr Spiegel auf, die mit Hilfe von den Spiegeln zugeordneten Stellelementen verstellt werden können. Das Verstellen der Spiegel bewirkt, dass ein Fokusbereich, der beispielsweise punkt- oder linienförmig sein kann, auf oder in dem Objekt verschoben wird. Vorzugsweise wird beim Scannen des Objekts der Fokusbereich so innerhalb eines Scanfeldes verschoben, dass das gesamte Scanfeld optisch abgetastet werden kann. Von dem Objekt ausgehende Detektionsstrahlen, die beispielsweise durch Fluoreszenzeffekte in dem beleuchteten Bereich des Objekts entstehen, können dann auf eine Detektoreinheit gelenkt und mit deren Hilfe erfasst werden.
-
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Scannen eines Objekts und ein Mikroskop zu schaffen, die auf kostengünstige Weise eine große numerische Apertur und eine besonders hohe Auflösung ermöglichen.
-
Die Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
-
Die Erfindung zeichnet sich gemäß einem ersten Aspekt dadurch aus, dass zwischen der Fokussieroptik und einem Frontglas, das in Richtung des Beleuchtungslichtstrahls gesehen nach der Fokussieroptik angeordnet ist, ein internes Immersionsmedium angeordnet ist. Die Fokussieroptik ist mit einer Aktoranordnung gekoppelt, die die Fokussieroptik gemäß einem vorgegebenen Abtastmuster quer zu einer Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls in einer Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls bewegt.
-
Vorzugsweise erfolgt das Bewegen der Fokussieroptik in zwei unterschiedliche Richtungen innerhalb einer Ebene, insbesondere senkrecht zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls. Dies dient zum Abscannen eines vorgegebenen Scanfeldes auf oder innerhalb des Objekts. Bei dem Objekt handelt es sich vorzugsweise um eine Probe, insbesondere um eine Gewebeprobe.
-
Ohne das interne Immersionsmedium treten ab bestimmten Winkeln an der Grenzfläche Deckglas/Luft Totalreflexionen auf. Das interne Immersionsmedium ermöglicht, dass Lichtstrahlen von der Probe, insbesondere Detektionslichtstrahlen, auch unter sehr viel flacheren Winkeln in die Fokussieroptik, insbesondere eine Linse der Fokussieroptik eintreten können, als ohne internes Immersionsmedium. Gleichzeitig wird die numerische Apertur der gesamten Vorrichtung vergrößert. Als internes Immersionsmedium eignen sich Öl, Wasser oder Glycerin, oder Mischmedien, die zumindest eines der vorgenannten Medien enthalten.
-
Vorzugsweise ist der Zwischenraum zwischen der Fokussieroptik und dem Frontglas mit dem internen Immersionsmedium ausgefüllt, insbesondere vollständig ausgefüllt, so dass entlang des Strahlengangs des Beleuchtungslichts keine Übergänge von der Fokussieroptik zur Luft, vom Immersionsmedium zur Luft und/oder vom Frontglas zur Luft entstehen. Dies trägt dazu bei, dass die numerische Apertur und die Auflösung vorzugsweise besonders groß sind.
-
Ein Kriechen oder Zerfließen des Immersionsmediums kann vorteilhaft verhindert werden, indem das Immersionsmedium senkrecht zu dem Beleuchtungslichtstrahl von einer Membran begrenzt ist. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn das interne Immersionsmedium eine besonders niedrige Viskosität hat. Eine Oberfläche der Membran kann parallel zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls ausgerichtet sein, oder auch schräg zu dieser angeordnet oder gewölbt sein.
-
In einer vorteilhaften Ausgestaltung hat das interne Immersionsmedium eine vorgegebene Viskosität, die vorzugsweise besonders hoch oder besonders niedrig ist. Die besonders geringe Viskosität hat den Vorteil, dass durch das interne Immersionsmedium die Linsenbewegung nur geringfügig beeinflusst wird, was sich positiv auf die präzise Steuerbarkeit der bewegten Fokussieroptik auswirkt. Die besonders hohe Viskosität hat dagegen den Vorteil, dass auch bei einer besonders schnellen Bewegung der Fokussieroptik, beispielsweise im Bereich einer Resonanzfrequenz, verhindert wird, dass das interne Immersionsmedium aus dem Zwischenraum zwischen dem Frontglas und der Fokussieroptik tritt, insbesondere wenn keine Membran vorgesehen ist.
-
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weisen die Flächen des Frontglases und/oder der Fokussieroptik, die mit dem internen Immersionsmedium in Kontakt sind, eine vorgegebene Rauhigkeit auf. Die vorgegebene Rauhigkeit ist vorzugsweise besonders hoch oder besonders niedrig. Der Vorteil der besonders hohen Rauhigkeit, die einerseits nur mikroskopisch sein sollte, andererseits jedoch durch ein gezieltes Einbringen eines Profils in der entsprechenden Oberfläche erzielt werden kann, ist, dass das interne Immersionsmedium besonders gut an dem Frontglas bzw. der Oberfläche der Fokussieroptik haftet. Im Gegensatz dazu ist der Vorteil einer besonders glatten Oberfläche der Fokussieroptik bzw. des Frontglases, dass die Fokussieroptik und das Frontglas sehr dicht aneinander gebracht werden können. Dabei wird vorzugsweise ein Immersionsmedium mit sehr geringer Viskosität verwendet. Ist nämlich der Abstand zwischen der Fokussieroptik und dem Frontglas deutlich kleiner als die Wellenlänge des verwendeten Beleuchtungslichts, so hat der Brechungsindex des dazwischen liegenden Mediums, insbesondere des Immersionsmediums, nur einen geringen bis vernachlässigbaren Einfluss. Alternativ oder zusätzlich, insbesondere wenn der vorgenannte Abstand besonders klein ist, ist es vorteilhaft, wenn die Oberflächen des Frontglases oder der Fokussieroptik, die mit dem internen Immersionsmedium in Kontakt sind, gehärtet sind. Dadurch können Beschädigungen und/oder Verschleiß der sich relativ zueinander bewegenden Oberflächen vermieden werden. Im Gegensatz dazu können diese Oberflächen auch besonders weich ausgebildet sein, so dass bei einer ungewollten Berührung des Frontglases mit der Fokussieroptik keine Schäden entstehen.
-
Die Erfindung betrifft gemäß einem zweiten Aspekt ein Mikroskop nach Art eines Scanmikroskops, eines Laserscanmikroskops und/oder Konfokalmikroskops, das die Vorrichtung zum Scannen des Objekts umfasst.
-
Ferner betrifft die Erfindung gemäß einem dritten Aspekt ein Verfahren zum Scannen des Objekts. Dabei zeichnet sich die Erfindung dadurch aus, dass zwischen die Fokussieroptik und die Probe das Immersionsmedium so eingebracht wird, dass die Fokussieroptik und die Probe in Kontakt mit dem Immersionsmedium sind. Alternativ dazu kann die Probe von einem Deckglas abgedeckt sein und/oder die Fokussieroptik kann durch das Frontglas abgedeckt sein. Zwischen dem Frontglas und der Probe kann dann ein externes Immersionsmedium alternativ oder zusätzlich zu dem internen Immersionsmedium zwischen der Fokussieroptik und dem Frontglas vorgesehen sein. Das externe Immersionsmedium kann seiner Art nach dem internen Immersionsmedium entsprechen oder davon unterschiedlich sein. Die Oberflächen, die mit dem externen Immersionsmedium in direktem Kontakt sind können entsprechend den Oberflächen ausgebildet sein, die mit dem internen Immersionsmedium in direktem Kontakt sind.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind nachfolgend anhand von schematischen Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
-
1 eine erste Ausführungsform einer Vorrichtung zum Scannen eines Objekts mit einem internen Immersionsmedium,
-
2 die erste Ausführungsform der Vorrichtung zum Scannen eines Objekts mit einem Deckglas, dem internen Immersionsmedium und einem externen Immersionsmedium,
-
3 eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung zum Scannen des Objekts, und
-
4 die Vorrichtung zum Scannen eines Objekts in einem konfokalen Mikroskop,
-
5 eine dritte Ausführungsform der Vorrichtung mit dem externen Immersionsmedium.
-
Elemente gleicher Konstruktion oder Funktion sind figurenübergreifend mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet.
-
1 zeigt eine Scaneinheit 20 für ein Mikroskop, die auch als Vorrichtung zum Scannen eines Objekts bezeichnet werden kann. Die Scaneinheit 20 hat ein Gehäuse 22, das eine nicht dargestellte Beleuchtungsausnehmung hat, durch die ein Beleuchtungslichtstrahl 24 tritt. Der Beleuchtungslichtstrahl 24 wird beispielsweise durch einen Laser eines Mikroskops erzeugt und über eine oder mehrere optische Anordnungen, beispielsweise Spiegel und/oder eine oder mehrere Glasfasern zu der Scaneinheit 20 umgelenkt. Ein Trägerkörper 28 ist über ein Parallelfedergelenk 26 in einer Ebene beweglich aufgehängt. Der Trägerkörper 28 trägt eine Fokussieroptik 30, auf die der Beleuchtungslichtstrahl 24 gerichtet ist. Der in der Ebene bewegliche Trägerkörper 28 wird über eine elektromagnetisch arbeitende Aktoranordnung, die eine Spulenanordnung 34 und eine Spule 36 umfasst, senkrecht zu einer Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 bewegt, und zwar bezogen auf eine Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls 24.
-
In Richtung des Beleuchtungslichtstrahls 24 hinter der Fokussieroptik 30 ist die Scaneinheit 20 durch ein Frontglas 38 abgeschlossen. Zwischen dem Frontglas 38 und der Fokussieroptik 30 ist ein internes Immersionsmedium 40 angeordnet. Der Beleuchtungslichtstrahl 24 wird durch die Fokussieroptik 30 fokussiert und der fokussierte Beleuchtungslichtstrahl 42 ist auf ein Objekt, insbesondere eine Probe 44, die von einem Objektträger 46 getragen wird, gerichtet. In einem Beleuchtungsstrahlengang des Beleuchtungslichts 24 sind somit in Richtung des Beleuchtungslichts 24 gesehen nacheinander die Beleuchtungsausnehmung, die Fokussieroptik 30, das interne Immersionsmedium 40 und das Frontglas 38 angeordnet.
-
Die Referenzposition des Beleuchtungslichtstrahls 24 bezieht sich auf eine beliebige fest vorgegebene Position des Beleuchtungsstrahls 24, die bei dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel fest ist und nicht veränderlich ist. Falls jedoch der Beleuchtungslichtstrahl 24 selbst bewegt wird, beispielsweise durch Einkoppeln des Beleuchtungslichtstrahls in die Scaneinheit 20 mit Hilfe einer optisch leitenden Faser und durch ein Bewegen der optischen Faser alternativ oder zusätzlich zu dem Bewegen der Fokussieroptik (30), so wird durch eine fest vorgegebene Referenzposition der optischen Faser die Referenzposition der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 vorgegeben.
-
Das interne Immersionsmedium 40 trägt dazu bei, die numerische Apertur und die Auflösung, die mit Hilfe der Scaneinheit 20 erzielt werden können, zu maximieren. Somit können auch Detektionsstrahlen, die aufgrund von Reflexionen oder Fluoreszenzeffekten von der Probe ausgehen und die in einem besonders flachen Winkel aus der Probe austreten, erfasst werden. Dass der Winkel besonders flach ist, bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Winkel zwischen der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 und den Detektionsstrahlen nahezu 90° ist.
-
2 zeigt die Scaneinheit 20 gemäß 1, wobei die Probe 44 durch ein Deckglas 50 abgedeckt ist. Zwischen dem Frontglas 38 und dem Deckglas 50 ist ein externes Immersionsmedium 48 eingebracht. Alternativ dazu kann auf das externe Immersionsmedium 48 verzichtet werden.
-
3 zeigt die Scaneinheit gemäß 1, wobei das interne Immersionsmedium 40 in Richtung senkrecht zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 durch eine Membran 54 begrenzt ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Membran 54 parallel zu der Mittelachse des Beleuchtungslichtstrahls 24 ausgebildet. Alternativ dazu kann die Membran jedoch auch schräg zu der Mittelachse oder nach innen oder außen gewölbt ausgebildet sein. Die Membran 54 trägt dazu bei, dass das interne Immersionsmedium 40 nicht aufgrund seiner eigenen Eigenschaften und/oder aufgrund der Bewegung der Fokussieroptik aus dem Beleuchtungsstrahlengang kriecht, fließt oder geschleudert wird.
-
4 zeigt die Scaneinheit 20 in einem Mikroskop. Das Mikroskop umfasst eine Lichtquelle 60, die vorzugsweise als Laserlichtquelle ausgebildet ist. Die Lichtquelle 60 erzeugt den Beleuchtungslichtstrahl 24, der über einen Strahlteiler 62 hin zu der Scaneinheit 20 und insbesondere auf die Fokussieroptik 30 gerichtet ist. Von der Probe 44 ausgehende Detektionsstrahlen, insbesondere aufgrund von Fluoreszenzeffekten in der Probe 44 erzeugte Fluoreszenzlichtstrahlen durchdringen den Strahlteiler 62 und werden mit Hilfe einer Detektionslinse 66 auf eine Detektionsblende 68 fokussiert und von einem nicht dargestellten lichtempfindlichen Detektor erfasst. Das Mikroskop umfasst eine Vertikal-Aktoranordnung 70, die eine Vertikal-Spulenanordnung 72 und eine Vertikalspule 74 umfasst und die einen Vertikal-Trägerkörper 76 parallel zum Beleuchtungslichtstrahl und senkrecht zu der Ebene, in der die Fokussieroptik 30 beweglich ist, bewegt.
-
5 zeigt eine Ausführungsform der Scaneinheit 20, die kein Frontglas 38 aufweist. Bei dieser Ausführungsform wird das Immersionsmedium, insbesondere das externe Immersionsmedium 48 direkt zwischen die bewegliche Fokussieroptik 30 und die Probe 44 eingebracht. Zusätzlich können das Frontglas 38 und/oder das Deckglas 50 vorgesehen sein, wobei dann das externe Immersionsmedium 48 mit dem Frontglas 38 bzw. dem Deckglas 50 in direktem Kontakt ist. Ferner kann das externe Immersionsmedium 48 in den im Vorstehenden erläuterten Ausführungsbeispielen alternativ oder zusätzlich zu dem internen Immersionsmedium 40 angeordnet sein. Zum Scannen der Probe kann ein möglichst großer Abstand zwischen der Fokussieroptik 30 und dem Deckglas 50 dazu beitragen, dass die auftretenden Scherkräfte im externen Immersionsmedium 48 besonders gering sind und sich so lediglich vernachlässigbar auf die Steuerbarkeit der Fokussieroptik 30 auswirken.
-
Die Immersionsmedien umfassen vorzugsweise Öl, Wasser und/oder Glycerin. Dabei weisen die Immersionsmedien vorzugsweise eine möglichst geringe oder möglichst hohe Viskosität auf. Durch die Verwendung eines Immersionsmediums mit möglichst hoher Viskosität wird die Bewegung der Fokussieroptik 30 möglichst wenig beeinflusst. Dies trägt dazu bei, dass die Steuerung und/oder Regelung der Bewegung der Fokussieroptik 30 möglichst präzise erfolgen kann. Das Immersionsmedium mit hoher Viskosität wird bei dem internen Immersionsmedium 40 bevorzugt. Bei Verwendung des Immersionsmediums mit möglichst hoher Viskosität wird vorzugsweise die Membran 54 vorgesehen. Durch die Verwendung eines Immersionsmediums mit möglichst geringer Viskosität kann die Membran 54 eingespart werden, ohne dass bei der Bewegung der Fokussieroptik 30 das Immersionsmedium aus dem Beleuchtungsstrahlengang geschleudert wird. Ferner ist die Wahrscheinlichkeit des nachteiligen Auftretens von Luftblasen im Immersionsmedium verringert gegenüber dem Immersionsmedium mit hoher Viskosität. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Bewegung der Fokussieroptik 30 resonant und somit besonders schnell erfolgt. Das Immersionsmedium mit geringer Viskosität wird bei dem internen Immersionsmedium 40 bevorzugt.
-
Die Oberflächen der Fokussieroptik 30 und/oder des Frontglases 38, die mit dem internen Immersionsmedium 40 in direktem Kontakt sind, und/oder die Oberflächen der Fokussieroptik 30, des Frontglases 38 und/oder des Deckglases, die mit dem externen Immersionsmedium 48 in direktem Kontakt sind, weisen vorzugsweise eine besonders hohe oder besonders geringe Rauhigkeit auf. Eine besonders geringe Rauhigkeit, die beispielsweise durch Polieren der entsprechenden Oberfläche erzielt werden kann, ermöglicht, die Fokussieroptik 30 und das Frontglas 38 sehr dicht aneinander zu bringen, was dazu beiträgt, dass ein Brechungsindex des Immersionsmediums einen besonders geringen Einfluss auf die Eigenschaften des Mikroskops hat, insbesondere wenn der Abstand zwischen Fokussieroptik 30 und Frontglas 38 deutlich kleiner als die Wellenlänge des verwendeten Beleuchtungslichts ist. Im Gegensatz dazu trägt eine besonders raue Oberfläche, die beispielsweise durch Einbringen eines mikroskopischen Profils in die entsprechenden Oberflächen erreicht werden kann, dazu bei, dass das entsprechende Immersionsmedium besonders gut an der entsprechenden Oberfläche haftet.
-
Das Immersionsmedium hat vorzugsweise denselben Brechungsindex wie die Fokussieroptik 30 und das Frontglas 38. Darüber hinaus können die Oberflächen des Frontglases 30 bzw. der Fokussieroptik 30 gehärtet sein, um eine Beschädigung der sich zueinander bewegenden Flächen zu vermeiden. Alternativ dazu können die Oberflächen auch besonders weich ausgeführt sein, was bei einem unbeabsichtigten Kontakt der Oberflächen aneinander lediglich zur elastischen Deformation der entsprechenden Oberfläche und nicht zu einer Beschädigung führt.
-
Mikroskopieverfahren, bei denen die erfindungsgemäße Vorrichtung anwendbar ist, oder dabei auftretende zu beobachtende Effekte sind beispielsweise SRS (Stimulierter Raman-Streung), FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging), SHG (Second Harmonic Generation), FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), FREI (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) und FCS (Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie).
-
Die Erfindung ist nicht auf die angegebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Beispielsweise können die Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden. Beispielsweise kann die Vertikal-Aktoranordnung 70 auch in der Scaneinheit 20 angeordnet sein oder das Mikroskop kann ganz ohne die Vertikal-Aktoranordnung 70 ausgebildet sein. Ferner kann zum Scannen der Probe 44 anstatt der Fokussieroptik 30 der Beleuchtungslichtstrahl 24 bewegt werden, beispielsweise über eine optische Faser, deren der Fokussieroptik 30 zugewandtes Ende mit einer Aktoranordnung gekoppelt ist. Alternativ zu der elektromagnetisch arbeitenden Aktoranordnung kann auch eine andere Aktoranordnung vorgesehen sein, beispielsweise eine, die zumindest einen, vorzugsweise mehrere Piezoaktoren umfasst. Die Scaneinheit 20 kann ein fester Bestandteil des Mikroskops sein oder als Objektiv für ein herkömmliches Mikroskop mit oder ohne Scanfunktion ausgebildet sein, insbesondere auch als Teil eines Objektivrevolvers. Ferner kann die Scaneinheit mit einer äußeren Aktoranordnung gekoppelt sein, die eine Bewegung der Scaneinheit 20 über eine große Fläche ermöglicht. Bei dieser Ausführungsform wird der Beleuchtungslichtstrahl 24 vorzugsweise über die Lichtleitfaser eingekoppelt. Ferner kann die Scaneinheit 20 von einem Stativ, insbesondere einem Dreibein aufgenommen werden. Die Lichtquelle 60 kann ein Laser sein, der Licht einer oder mehrerer diskreter Wellenlängen oder breitbandiges Licht erzeugt. Alternativ zu dem Laser kann beispielsweise auch eine Quecksilberdampflampe vorgesehen sein. Zusätzlich oder alternativ zu dem externen Immersionsmedium kann die Fokussieroptik 30 auch eine vom Objekt aus gesehen nach innen gewölbte Linse umfassen.
-
Bezugszeichenliste
-
- 20
- Scaneinheit
- 22
- Gehäuse
- 24
- Beleuchtungslichtstrahl
- 26
- Parallel-Federgelenk
- 28
- Trägerkörper
- 30
- Fokussieroptik
- 34
- Spulenanordnung
- 36
- Spule
- 38
- Frontglas
- 40
- internes Immersionsmedium
- 42
- fokussierter Beleuchtungslichtstrahl
- 44
- Probe
- 46
- Objektträger
- 48
- externes Immersionsmedium
- 50
- Deckglas
- 52
- Objektschicht
- 54
- Membran
- 60
- Lichtquelle
- 62
- Strahlteiler
- 64
- Detektionslichtstrahl
- 66
- Detektionslinse
- 68
- Detektionsblende
- 70
- Vertikal-Aktoranordnung
- 72
- Vertikal-Spulenanordnung
- 74
- Vertikal-Spule
- 76
- Vertikal-Trägerkörper
