WO2011067133A2 - Selektive anreicherung nicht -methylierter nukleinsäuren - Google Patents

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WO2011067133A2
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • Methylation is a common chemical alteration of DNA in which methyl groups have been transferred to nucleobases, e.g. at the carbon 5 position of the pyrimidine ring of cytosine. This is usually done by special DNA memyltransferases, either de novo or to maintain an existing methylation pattern, for example in the replication of DNA.
  • nucleases whose specificity is e.g. by using new buffer conditions, modification (s), amino acid exchange (s) or other manipulations has been altered so that they can cut hemimethylated or fully methylated regions.
  • modification s
  • amino acid exchange s
  • Such enzymes are e.g. in Formenkov et al (2008) (Anal. Biochemistry 381: 135-141).
  • Non-isothermal amplification methods are, for example, the ligase chain reaction (LCR) and the polymerase chain reaction (PCR).
  • LCR ligase chain reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • random-primed sequence amplification methods These can be isothermal or not isothermal.
  • Examples of non-isothermal random-primed sequence amplification methods are random primed? CR methods such as primer extension preamplification (PCR) PCR, improved primer extension preamplification (PCR) PCR, degenerate oligonucleotide primer (PCR) PCR, adapter ligation PCR or methods such as OmniPlex® (sigma Aldrich) or GenomePlex® (Rubicon).
  • PCR primer extension preamplification
  • PCR improved primer extension preamplification
  • PCR degenerate oligonucleotide primer
  • adapter ligation PCR or methods such as OmniPlex® (sigma Aldrich) or GenomePlex® (Rubicon).
  • Phi 29-type DNA polymerases A known member of the Phi 29-type DNA polymerases is the DNA Polymerase from bacteriophage Phi 29. Other phi 29-type DNA polymerases are found, for example, in the phage Cp-1, PRD-1, Phi 15, Phi 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1. Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 and L 17.
  • Random primers for the amplification of the DNA i. a primer mixture comprising several different random sequence primers.
  • primers for amplifying the nucleic acid may be used.
  • degenerate and / or sequence-specific primers can also be used to amplify the DNA.
  • the primers used for amplification typically comprise 4 to 35 nucleotides, preferably between 5 to 25 nucleotides, more preferably 6 to 15 nucleotides.
  • the detection preferably comprises the quantification of at least one sequence section (locus) of the amplified DNA.
  • locus typically, several different loci detected simultaneously in a multiplex method and can be quantified thereby.
  • the quantification of the nucleic acid amplified in step (iii) preferably takes place via at least one known sequence region.
  • specific probe and / or sequence-specific primers can be used to quantify the at least one known sequence region.
  • Double-strand-specific fluorescent dyes and / or at least one specific probe can also be used for the quantification.
  • the quantity of certain sequence segments (loci) in a sample or on a DNA can be expressed, for example, as a threshold cycle (Thresholä cycle (C T )), if the quantification is carried out by means of real-time PCR.
  • the Cr value indicates in which cycle of the PCR the fluorescence values indicative of a particular sequence lie above the measurable threshold value and are therefore a measure of how much DNA of the particular sequence was originally in the sample: a low Gr value indicates to a larger initial amount of the particular DNA sequence in the sample than a higher Gr value, since fewer cycles of amplification were needed to detect this sequence in the sample.
  • this analysis serves primarily to establish the global metylation pattern and not to quantify the methylation level of defined sequences.
  • an analysis of the sequence representation can thus be carried out on the treatment of the DNA with the methylation-dependent nuclease and subsequent amplification.
  • the DNA polymerase used during a PCR or a quantitative (real-time) PCR (qRT-PCT) in the context of the method according to the invention is preferably a polymerase from a thermophilic organism or is a thermostable polymerase or is a polymerase selected from the group of Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase, Thermus acquaticus (Taq) DNA polymerase, Thermotoga maritima (Tma) DNA polymerase, Thermococcus litoralis (Tli) DNA polymerase, Pyococcus furiosus (Pfu) DNA polymerase, Pyrococcus woesei (Pwo ) DNA polymerase, Pyrococcus kodakaraensis OD DNA polymerase, Thermus filiformis (Tfi) DNA polymerase, Sulfolobus solfataricus Dpo4 DNA polymerase, Thermus pacificus (Tpac
  • the DNA is in particular genomic DNA.
  • Genomic DNA is understood as meaning a deoxyribonucleic acid which can be obtained from organisms and is partially methylated. The methylation may involve different bases and different positions.
  • the genomic DNA may have been obtained, for example, by lysis and / or purification from organisms.
  • the nucleic acid to be analyzed can be of different origin. It may for example be isolated from one or more organisms selected from the group comprising viruses, phages, bacteria, eukaryotes, plants, fungi and animals (eg mammals, in particular primates).
  • the nucleic acid can also be derived from cell organelles, for example.
  • the nucleic acid to be analyzed can be part of samples.
  • lysis is understood to mean a process which results in nucleic acids and / or proteins being released from a sample material into the environment. In this case, the structure of the sample material can be destroyed, e.g. the shell of the sample material are dissolved.
  • lysis also means that the nucleic acid can escape from the sample material through small openings, eg pores, etc.
  • a buffer for the amplification reaction e.g., containing buffer, dNTPs, and / or primers
  • a buffer for the endonucleolytic cleavage of methylated sequence segments by the methylation-dependent nuclease optionally a buffer for the endonucleolytic cleavage of methylated sequence segments by the methylation-dependent nuclease.
  • the present invention also relates to a kit for determining the global methylation pattern of a genomic DNA comprising
  • the DNA polymerase of the kits according to the invention is preferably a polymerase from a thermophilic organism or is a thermostable polymerase or is a polymerase selected from the group of Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase, Thermus acquaticus (Taq) DNA polymerase, Thermotoga maritima ( Tma) DNA polymerase, Thermococcus litoralis (Tli) DNA polymerase, Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA polymerase, Pyrococcus woesei (Pwo) DNA polymerase, Pyrococcus kodakaraensis KOD DNA polymerase, Thermus flliformis (Tfi.) DNA polymerase, Sulfolobus solfataricus Dpo4 DNA polymerase, Thermus pacificus (Tpac) DNA polymerase, Thermus eggertsonii (Teg) DNA polymerase, The
  • the methylation-dependent nuclease of the kits according to the invention is preferably selected from the group consisting of McrBC, McrA, DpnI, BisI, BlsI, Glal, Glul, Mall and PcsI.
  • McrBC and McrA particularly preferred is McrBC.
  • the methods and kits of the invention may be used for selective preparation, ie, selective enrichment, of unmethylated sequence segments of genomic DNA.
  • they can be used to analyze the global methylation pattern in genomic DNA be used.
  • FIGURE 1 Illustration of an exemplary embodiment of the method according to the invention: A genomic DNA (“gDNA”) consisting of unmethylated and methylated genome segments is shown, the methylated sites are labeled "m", a first step is nucleolytic Cleavage of the gDNA after recognition of the methylated Sequenzabsclmitte by the methylation-dependent nuclease McrBC. In a second step, the amplification of the cut DNA takes place. In this exemplary embodiment, a whole genome amplification (WGA) is performed. The flock of amplified DNA molecules is indicated (“WGA ampl. DNA”). From the central regions significantly more amplified DNA fragments are formed than from the marginal regions.
  • WGA ampl. DNA The flock of amplified DNA molecules is indicated (“WGA ampl. DNA”). From the central regions significantly more amplified DNA fragments are formed than from the marginal regions.
  • Genomic DNA (labeled as "gDNA”) consists of unmethylated and methylated genome segments, and the methylated sites in Figure 1 are marked with “m”.
  • a micelleolytic cleavage of the gDNA after recognition of the methylated sequence segments by a methylation-dependent nuclease (marked “McrBC” in the figure) is carried out, followed by amplification of the cleaved DNA in a second step -Amplification made (marked “WGA” in the picture).
  • the flock of amplified DNA molecules is indicated ("WGA ampl.DNA”).
  • the WGA Reactio was tested with REPLI-g Midi reagents according to the REPLI-g Midi protocol for purified DNA performed. WGA was carried out at 30 ° C for 8 h followed by inactivation for 5 min at 65 ° C. To measure the sequence representation after WGA, a real-time PCR analysis was performed. Here, three different genomic loci were analyzed. The primers for analysis are given in Table 1.
  • Table 3 Delta Cx values for loci a, b and c from Example 2

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Amplifikation von nicht-methylierten Sequenzen einer DNA umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer Probe umfassend eine DNA, die an mindestens einer Stelle methyliert ist, (ii) Behandlung der DNA in der Probe mit einer methylierungsabhängigen Nuklease, und (iii) Amplifikation der mit der methylierungsabhängigen Nuklease geschnittenen DNA. Weiterhin betrifft die Erfindung Kits zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren, Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur selektiven Präparation (selektive Anreicherung) von nicht-methylierten Sequenzabschnitten von genomischer DNA und zur Analyse des globalen Methylierangsmusters in genomischer DNA genutzt werden.

Description

SELEKTIVE ANREICHERUNG NICHT-METHYLIERTER NUKLEINSÄUREN Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biologie und Chemie, insbesondere der Molekularbiologie. Im Speziellen betrifft die Erfindung die Amplifikation von nicht- methylierten Bereichen von Nukleinsäuren sowie die Analyse von Methylierungsmustern in Nukleinsäuren.
Hintergrund der Erfindung
Methylierung ist eine häufig vorkommende chemische Veränderung der DNA, bei der Methylgruppen auf Nucleobasen übertragen wurden, z.B. an der Kohlenstoff- 5 -Position des Pyrimidinrings des Cytosins. Dies geschieht im Regelfall durch spezielle DNA- Memyltransferasen, entweder de novo oder zur Aufrechterhaltung eines bestehenden Methylierungsmusters etwa bei der Replikation von DNA.
DNA-Methylierung kann mehrere Funktionen haben: Zum Beispiel kann sie Prokaryoten dazu dienen, eigene DNA von fremder, eingeschleuster DNA zu unterscheiden. Zudem spielt sie unter anderem eine wichtige Rolle bei der Fehlerkorrektur während der DNA-Synthese in Prokaryoten, um zwischen dem ursprünglichen (Templat-)Strang und dem neu synthetisierten Strang zu unterscheiden. Viele Prokaryoten haben DNA-Methyltrans ferasen, die eigene DNA an oder in der Nähe von bestimmten Signalsequenzen methylieren. Fremde, unmethylierte DNA kann in diesen Organismen von speziellen methylierungs-sensitiven Restriktionsendonukleasen an oder in der nähe der Signalsequenzen geschnitten und somit abgebaut werden.
Neben den erwälinten methylierungs-sensitiven Endonukleasen, die nur nicht-methylierte Bereiche schneiden, gibt es auch methylierungsabhängige Endonukleasen, die nur an oder neben bestimmten methylierten Sequenzen schneiden.
In Eukaryoten bietet die Methylierung der DNA eine zusätzliche Informationsebene, so zum Beispiel um aktive von inaktiven Bereichen des Genoms zu unterscheiden. Insbesondere bei der differentiellen Genexpression spielen Methylierungsmuster eine besondere Rolle und sind daher auch relevant in der Entstehung von Tumoren.
Zur Aufklärung von Metliylierungsmustem in DNA sind dem Fachmann eine Reihe von Verfahren aus dem Stand der Technik bekannt: In der Bisulfit-Sequenzierung zum Beispiel wird zunächst die zu analysierende DNA mit Bisulfit umgesetzt, so dass die nicht- methylierten Cysteine in Uracil umgewandelt werden, gefolgt von einer Amplifikation mittels PCR sowie DNA-Sequenzierung. Aus den Sequenzunterschieden der Bisulfit-behandelten und nicht-Bisulfit-behandelten DNA kann auf das zugrundeliegende Methylierungsmuster geschlossen werden. Alternativ kann auch eine methylierungs-spezifische PCR {Methylation Specific PCR; MSP) zur Analyse der Bisulfit-behandelten DNA eingesetzt werden, wobei methylierungspezifische Primer eingesetzt werden, d.h. Primer, die komplementär zur unkonvertierten Sequenz sind. Alternativ zur Bisulfit-Methode können andere Verfahren, wie die methylierungsspezifische Restriktionsanalyse oder methylierte-DNA- Immunopräzipitation (methylated DNA immunoprecipitation; MeDIP) eingesetzt werden.
Diese Verfahren sind auf die Analyse der Methylierung von definierten Sequenzbereichen sowie der Quantifizierung des Methylierungsgrades von definierten Sequenzbereichen ausgerichtet.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren mit dem sich Aussagen über das globale Methylierungsmuster einer DNA treffen lassen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist also primär auf die Identifikation von Genomabschnitten, die methylierte Bereiche enthalten, ausgerichtet. In besonders bevorzugten Ausfülirungsformen ist die Erfindung auf die Identifikation von Genomabschnitten, die methylierte Bereiche enthalten, ausgerichtet und nicht auf die Feststellung von Methylierungszuständen bestimmter einzelner Basen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch eine selektive Präparation von nicht- methylierter DNA vorgenommen werden.
Das Verfahren besteht aus mehreren Teilschritten:
(1) DNA, vorzugsweise genomische DNA, wird mit einer metliylierungsabhängigen Nukleasen verdaut. (2) Die DNA wird nach dem Verdau mittels eines Amplifikationsverfahrens, vorzugsweise eines Random-primed Sequenz-Amplifikationsverfahrens vervielfältigt, so dass nur die nicht-methylierten DNA Abschnitte - also solche, die nicht geschnitten wurden - vervielfältigt werden können. Ergebnis der Amplifikation ist die vervielfältigte DNA ohne solche Abschnitte, die vorher durch die methy- lierungsabhängige Nuklease geschnitten wurden. Dementsprechend führt das Verfahren zu einer selektiven Anreicherung und Vervielfältigung von Sequenzschnitten, die nicht methyliert sind.
(3) Optional kann im Anschluss eine quantitative Analyse der Kopiezahl von Sequenzabschnitten in der verfahrensgemäß selektierten und amplifizierten DNA durchgeführt werden.
Letzteres kann der Analyse des Metliylierungsmusters einer DNA bzw. Teilabschnitten davon dienen, d.h. zu welchem Grad eine DNA oder ein definierter Teil davon ursprünglich methy- liert war.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist somit komplementär zu anderen Verfahren zur Analyse der Methylierung von Nukleinsäuren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei der Identifizierung von Genomabschnitte helfen, die methyliert sind. Das Verfahren erlaubt durch die Amplifikation der selektierten Sequenzen eine globale Methylierungsanalyse ohne die genaue Stelle der Methylierung kennen zu müssen. Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur selektiven Amplifikation von nicht- methylierten Sequenzen einer DNA umfassend die Schritte
(i) Bereitstellen einer Probe umfassend eine DNA, die an mindestens einer Stelle methyliert ist,
(ii) Behandlung der DNA in der Probe mit einer methylierungsabhängigen Nuklease, und
(iii) Amplifikation der mit der methylierungsabhängigen Nuklease geschnittenen DNA.
Die Schritte (ii) und (iii) können gleichzeitig (simultan) oder nacheinander durchgeführt werden.
Eine Nuklease ist ein Enzym, das hydrolytisch eine Nukleinsäure (z.B. genomische DNA) teilt. Dabei werden die Phosphodiesterbindungen hydrolytisch gespalten. Bevorzugt sind im Zusammenhang der Erfindung Endonukleasen. Eine Nuklease ist dann methylierungsabhän- gig, wenn das Enzym nur an methylierten Stellen binden kann oder nur methylierte Stellen spalten kann. Zu solchen methylierungsabhängigen Nukleasen gehören z.B. die Enzyme McrBC, McrA und MrrA. McrA schneidet m5CG-methylierte DNA, McrBC schneidet (A/G)m5C-methylierte DNA und MrrA schneidet m6N Adenin-methylierte DNA. Die methy- lierungsabhängige Nuklease ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus McrBC, McrA, Dpnl, BisI, Blsl, Glal, GM, Mall und Pcsl. Solche Nukleasen sind z.B. in Chmuzh et al. (2005) (BMC Microbiology 6:40i), Tarasova et al. (2008) (BMC Molecular Biology 9:7), Chernukhin et al. (2007a) (Ovchinnikov bulletin of biotechnology and physical and chemical biology V.3, o 1, pp 28-33) und Chernukhin et al. (2007b) (Ovc nnikov bul- letin of biotechnology and physical and chemical biology V.3, No 2, pp 13-17) beschrieben. Bevorzugte methylierungsabhängige Nukleasen im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind McrBC und McrA, besonders bevorzugt ist McrBC. McrBC ist kommerziell erhältlich, z.B. über New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA. Darüber hinaus können auch Homologe der genannten Nukleasen verwendet werden, z.B. die in Fukuda (2008) (Genome Biol. 9(11): 163) beschriebenen McrBC-homologen Enzymsysteme. Auch LlaJI wurde als McrBC-homolog beschrieben (O'Driscoll (2006), BMC Microbiology 2006, 6:40i). Weiterhin geeignet sind in besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Nukleasen, deren Spezifität z.B. durch Verwendung neuer Pufferbedingungen, Modifikation(en), Amino- säureaustausch(en) oder andere Manipulationen so verändert wurde, dass sie hemimethylierte oder komplett methylierte Bereiche schneiden können. Solche Enzyme sind z.B. in Formen- kov et al (2008) (Anal. Biochemistry 381: 135-141) beschrieben.
Alternativ kann auch einer methylierten Base durch eine DNA Glycosylase aus der DNA herausgeschnitten werden. Dies führt dazu, dass bei einer anschließenden Amplifikationsreaktion diese Stelle nicht amplifiziert werden kann. So kann zum Beispiel das 5-methyl-Cytosin durch eine 5-methyl-Cytosin DNA Glycosylase ausgeschnitten werden. Die Effizienz des Amplifikations Stopps an der abasischen Stelle kann durch eine entsprechende Lyase unterstützt werden, die an der abasischen Stelle das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA schneidet. Das Verfahren kann auch hier zu einem Strangbruch führen, z.B. durch die Verwendung von Enzymen (z.B. Lyasen) oder entsprechender Reaktionsbedingungen. Alle genannten Enzyme und Enzymsysteme können somit unter geeigneten Bedingungen als methylierungs abhängige Nukleasen im weiteren Sinne betrachtet werden, sofern sie die entsprechende Aktivität aufweisen. Die Amplifikation kann dabei grundsätzlich mittels isothermalen oder nicht-isothermalen Verfahren durchgeführt werden. Bekannte isothermale Amplifikationsverfahren sind z.B. Strand Displacement-A plifikation (SDA), Multiple Displacement-ßimpliUkaiian (MDA), i-o /i«g-Ci c/e-Ampliflkation (RCA), Loop mediated Isothermal Ämplification (LAMP), Transcription Mediated Ämplification (TMA), Helicase-dependent Ämplification (HDA), SMart-Ämplification Process (SMAP), Single-Primer-Isothermal-Ämplification (SPIA) . Bekannte nicht-isothermale Amplifikationsverfahren sind z.B. die Ligase-Kettenreaktion (LCR) sowie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Bevorzugt sind im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung Random-Primed Sequenz-Amplifikationsverfahren. Diese können isothermal oder nicht isothermal sein. Beispiele von nicht-isothermalen Random-Primed Sequenz- Amplifikationsverfahren sind Random primed-? CR- Verfahren wie PEP-PCR (primer extension preamplification-PCR), iPEP-PCR (improved primer extension preamplification-PCR), DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotid Primer - PCR), Adaptor- Ligation PCR oder Verfahren wie OmniPlex® (Sigma-Aldrich) oder GenomePlex® (Rubicon). Beispiele für bevorzugte isothermale Sequenz-Amplifikationsverfahren sind die Strand Displacement-Ree tionm zu denen z.B. die Strand-Displacement-Amplifikation (SDA) im engeren Sinne gehört sowie die Multiple Displacement-Amplifikation (MDA), die i?o/ mg"C rc/e-Amplifikation (RCA), Single-Primer-Isothermal-Ämplification (SPIA) sowie alle Unterformen dieser Reaktionen, wie Restriction-aided RCA (RCA-RCA), MDA mit nested Primern, lineare und exponentielle Strand-Displacement-Resktionen sowie Helicase- dependent Ämplification (HDA). Besonders bevorzugte Beispiele von isothermalen Random- Primed Sequenz- Amplifikationsverfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind MDA und RCA. All diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt (vgl. z.B. US 2005/0112639 AI, US 2005/0074804 AI, US 2005/0069939 AI und US 2005/0069938 AI, sowie Wang G. et al. (2004), Genome Res. Nov; 14(11):2357-2366; Milla M.A. et al. (1998), Biotechniques Mar;24(3):392-396; Nagamine K. et al. (2001), Clin Chern. 47(9): 1742- 1743; Lage J.M. et al. (2003), Genome Res.l3(2);294-307 und Vincent M. et al. (2004), EMBO Rep. 5(8):795-800). Unter einer Strand-Displacement-Reäküon wird hier jede Reaktion verstanden, bei der eine Polymerase verwendet wird, die eine Strand-Displacement Aktivität aufweist. Strand-Displacement-Aktivität einer Polymerase bedeutet, dass das eingesetzte Enzym dazu in der Lage ist, einen Nuklemsäure-Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzutrennen. DNA Polymerasen mit Strand-Displacement-Aktivität, die beispielsweise bei der RCA eingesetzt werden können, sind z.B. Holoenzyme oder Teile von Replikasen aus Viren, Prokaryoten, Eukaryoten, oder Archaeen, Phi 29-artige DNA-Polymerasen, die DNA-Polymerase Jenow exo- und die DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus mit der Bezeichnung Bst exo- .„exo-" bedeutet, dass das entsprechende Enzym keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist. Ein bekannter Vertreter der Phi 29-artigen DNA-Polymerasen ist die DNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen Phi 29. Andere Phi 29-artige DNA-Polymerasen kommen z.B. in den Phagen Cp-1, PRD-1, Phi 15, Phi 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1, Cp-5, Cp- 7, PR4, PR5, PR722 und L 17 vor. Weitere geeignete DNA-Polymerasen mit Strand- Displacement- Aktivität sind dem Fachmann bekannt. Alternativ werden unter DNA- Polymerasen mit Strand-Displacement-Aktwität auch solche DNA-Polymerasen ohne Strand- Displacement-Aktivität verstanden, wenn neben einer entsprechenden DNA-Polymerase ei- nen Katalysator verwendet wird, beispielsweise ein Protein oder ein Ribozym, welcher die Trennung eines DNA-Doppelstrangs oder die Stabilisierung von DNA-Einzelsträngen ermöglicht. Zu diesen Proteinen gehören z.B. die Helicasen, SSB-Proteine und Rekombinationsproteine, die als Bestandteil größerer Enzymkomplexe wie z.B. Replikasen enthalten sein können. In diesem Falle erzeugt man mit Komponenten zusätzlich zu der Polymerase eine Poly- merase mit Strand-Displacement-Aktivität. Die Polymerasen mit Strand-Displacement Aktivität können hitzelabil oder hitzestabil sein. hi einer bestimmten Ausfulirungsform ist die zur Amplifikation verwendete Polymerase mit Strand-Displacement-Aktivität eine Phi 29-ähnlichen Polymerase, vorzugsweise eine Polymerase aus einem Phagen ausgewählt aus einer Gruppe von Phagen umfassend Phi 29, Cp-1, PRD-1, Phi 15, Phi 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 und L 17. Besonders Bevorzugt ist die Verwendung der Polymerase aus dem Phagen Phi 29. Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass auch die Verwendung von Mischungen von zwei oder mehr Polymerasen mit Strand-Displacement-Aktivität möglich ist. Weiter kann auch eine oder mehrere Polymerasen mit Strand-Displacement-Aktivität mit einer oder mehreren Polymerasen ohne Strand-Displacement-Aktivität kombiniert werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind MDA und RCA bevorzugte Amplifikations- verfahren. Bevorzugt ist es weiterhin eine Amplifikation des ganzen Genoms durchzuführen {WJiole Genome Amplification (WGA)). WGA bedeutet, dass die Templat-DNA grundsätzlich im wesentlichen vollständig amplifiziert werden soll, wobei allerdings erfindungsgemäß nur der nicht-methylierte Teil des Genoms amplifiziert werden soll.
Die Erfindung betrifft in bevorzugten Ausfuhrungsformen somit die Amplifikation von genomischer DNA. Die DNA- Amplifikation wird erfindungsgemäß vorzugsweise in einem Random Primed Se- quenz-Amplifikationverfahren (RPSA) durchgeführt, d.h. das Priming der Amplifikations- reaktionen erfolgt zufällig, z.B. über Primer mit zufallig ausgewählter Sequenz {Random Primer). Unter einer Random-Primed Sequeriz-Amplifikations verfahren wird vor dem Hintergrand der vorliegenden Erfindung die Amplifikation der genomischen DNA verstanden, wo- bei die verwendeten Primer in zufälliger Weise an die - vorzugsweise genomische - DNA binden. Die Zufälligkeit der Primerbindung an die - vorzugsweise genomische - DNA kann durch verschiedene Möglichkeiten hergestellt werden: Es können Random Primer zur Amplifikation eingesetzt werden. Random Primer haben z.B. für einen Hexamer-Primer die Sequenz NNNNNN, wobei N für ein beliebiges Nukleotid steht. Dadurch können Random Pri- mer alle möglichen Sequenzen enthalten.
Alternativ können auch Primer mit degenerierte Sequenzen eingesetzt werden. Diese Primer können z.B. bestimmte Sequenzmotive beinhalten, wobei an einigen Positionen des Primers zufällige Sequenzen eingestreut sind.
Es können auch Primer mit einer bestimmten Sequenz eingesetzt werden, wobei sichergestellt werden muss, dass diese Primer häufig genug an die Ziel-DNA binden. Dies kann z.B. dadurch sichergestellt werden, dass diese Primer entweder kurz sind oder die Primerbindungs- bedingungen so eingestellt werden, dass eine unspezifische Bindung erlaubt wird.
Bei einer RPSA wird ein Großteil einer genomischen Nukleinsäure amplifiziert. Wenn mehre- re verschiedene genomischen Nukleinsäuren als Template-Nukleinsäure vorliegen, können die Reaktionsbedingungen so gewählt sein, dass alle genomischen Nukleinsäuren, nur eine genomische Nukleinsäure, aber mindestens ein komplexer Teil der genomischen Nukleinsäure der Template-Nukleinsäure amplifiziert wird. Die Komplexität des amplifizierten Teils der genomischen Nukleinsäure ist zwischen 10.000 und 100.000 nt, besonders bevorzugt 100.000 bis 1.000.000, in einer anderen besonders bevorzugten Ausfühnmgsform größer 1.000.000 nt. Beispiele für RP SA- Verfahren sind Multiple-Displacement-AmpliSk&üon (MDA), Rolling- Circle-Amplification (RCA), Random-primed PCR Methoden wie Degenerate Oligonucleoti- de Primer - PCR (DOP-PCR) und Primer extension preamplification PCR (PEP-PCR). Ande- re geeignete PCR- Verfahren fügen zum Beispiel an DNA-Fragmente, die z.B. durch Schneiden der DNA mit Restriktionsendonukleasen oder durch Ultraschallbehandlung entstanden sind, Primerbindungsstellen an. Weitere geeignete PCR-Verfahren verwenden in einem ersten Schritt Primer, die durch ihr 3 '-Ende eine zufällige Primerbindung verursachen mit ihrem 5'- Ende jedoch eine spezifische Primerbindungstelle einführen. Im Anschluss findet eine PCR mit den Primern statt, die an spezifischen Primerbindungsstelle hybridisieren. Auch dieses Prinzip kann in einer erfindungs gemäßen RPSA durchgeführt werden.
In einer besonderen Ausfül rungsform der Erfindung erfolgt also nach Behandlung der DNA in einer Probe eine RPSA zur Amplifikation der an den Methylierungs stellen geschnittenen DNA. Vorzugsweise wird in dieser Ausfülirungsform keine Ligationsreaktion nach der Restriktion mit der methylierungsabhängigen Nuklease und vor der RPSA durchgeführt.
Polymerasen sind Enzyme, welche die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen einzelnen Nukleotiden innerhalb eines Nukleinsäurestrangs katalysieren (z.B. DNA- und RNA- Polymerasen). Neben hitzelabilen Polymerasen können auch nicht-hitzelabile Polymerasen verwendet werden. Besonders bevorzugt sind alle hitzelabilen und nicht-hitzelabil en Polymerasen, die bei den gewählten Versuchsbedingungen eine Strand-Displ cement-Aktivität zeigen. Entsprechende Polymerasen sind kommerziell erhältlich und dem Fachmann bekannt. Unter einer Amplifikation einer Nukleinsäure wird die Vermehrung des Templates um mindestens den Faktor 2 oder mehr verstanden. Hierzu kann die Nukleinsäure linear oder exponentiell vermehrt werden. Eine lineare Amplifikation erreicht man beispielsweise mittels RCA in Gegenwart von Primern, die auf dem Target Circle nur mit einer spezifischen Sequenz hybridisieren. Eine exponentielle Amplifikation erreicht man beispielsweise über RCA mit Primern, wobei die Primer mit mindestens 2 Bindestellen auf dem Target Circle hybridisieren oder aber mit mindestens einer Bindestelle auf dem Target Circle und mmdestens einer Bindestelle auf dem komplementären Strang hybridisieren. Weitere lineare und exponentielle für die vorliegende Erfindung geeignete Amplifikationsverfahren sind dem Fachmann geläufig, wie z.B. MDA oder PCR. Unter einer isothermalen Reaktion wird erfindungsgemäß eine Reaktion verstanden, die bei nur einer Temperatur durchgeführt wird. Wird die Reaktion vor Beginn (z.B. auf Eis) oder nach Ablauf der Reaktion (z.B. zur Inaktivierung von Reaktionskomponenten oder Enzymen) auf eine andere Temperatur gebracht, wird die Reaktion immer noch isothermal genannt, solange die eigentliche Reaktion bei einer konstanten Temperatur durchgeführt wird. Eine Temperatur wird auch dann als konstant verstanden, wenn die Schwankung der Temperatur +/- 10°C, vorzugsweise +/- 5°C, nicht überschreitet. Unter Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül verstanden, das als Startstelle für ein Enzym mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität dient. Dieser Primer kann ein Protein, eine Nukleinsäure oder ein anderes Molekül sein, das sich dem Fachmann als Polymerase-Startstelle geeignet erweist. Dieses Molekül kann durch intermolekulare aber auch durch intramolekulare Wechselwirkung als Startstelle dienen. Im Falle von Nukleinsäure-Primern müssen diese nicht, können aber über ihre gesamte Länge mit der Template-Nukleinsäure hybridisieren. Bevorzugt sind Nukleinsäure-Primer, insbesondere Oligonucleotide.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Random-Primern für die Amplifikation der DNA, d.h. ein Primergemisch umfassend mehrere unterschiedliche Primer zufälliger Sequenz.
Es können neben Random-Primern auch andere Primer zur Amplifikation der Nukleinsäure(n) zur Anwendung kommen. Wie erwähnt können auch degenerierte und/oder sequenzspezifische Primer zu Amplifikation der DNA verwendet werden.
Die zur Amplifikation verwendeten Primer umfassen typischerweise 4 bis 35 Nukleotide, bevorzugt zwischen 5 bis 25 Nukleotide, besonders bevorzugt 6 bis 15 Nukleotide.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den zusätzlichen Schritt
(iv) Detektion mindestens eines Sequenzabschnittes der amplifizierten DNA.
Die Detektion umfasst dabei vorzugsweise die Quantifizierung mindestens eines Sequenzabschnitts (Locus) der amplifizierten DNA. Typischerweise werden mehrere verschiedene Loci gleichzeitig in einem Multiplex- Verfahren detektiert und können dadurch quantifiziert werden. D.h. in Schritt (iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise die Quantifizierung der in Schritt (iii) amplifizierten Nukleinsäure über mindestens einen bekannten Sequenzbereich. Zur Quantifizierung des mindestens einen bekannten Sequenzbereich können z.B. spezifische Sonde und/oder sequenzspezifische Primer verwendet werden. Zur Quantifizierung kömien ebenfalls Doppelstrang-spezifische Fluoreszenzfarbstoffe und/oder mindestens eine spezifische Sonde verwendet werden.
Dabei kann die Quantifizierung der DNA mit einem Hybridisierungs-vermittelten oder einem Sequenzierverfahren erfolgen. Zu den, dem Fachmann bekannten Hybridisierungs- vermittelten Verfahren, gehören beispielsweise quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Real-time PCR, Strand Displacement Amplifikation (SDA), Transcription Mediated Amplification (TMA), Helicase-dependent Amplification (HDA), Recombinase Polymerase Amplification (RP A), Loop~mediated Isothermal Amplification (LAMP), SMart-Amplification Process (SMAP), oder auch Microarray-basierte Verfahren (z.B. Affymetrix, Illumma, Agilent). Microarray-basierte Verfahren (kurz: Microarray-Verfahren) sind bevorzugte Hybridisierungs-vermittelte Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Unter Microarray-Verfahren versteht man Verfahren, bei denen 10 oder mehr Nukleinsäuresequenzen parallel an Oberflächen nachgewiesen werden. Diese Oberflächen tragen in der Regel Nukleinsäure Sequenzen, die zum Nachweis von 10 oder mehr Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Die an den Oberflächen immobilisierten Sequenzen müssen nicht notwendigerweise Nukleinsäuren sein, sondern können zum Beispiel auch modifizierte Nukleinsäuren oder auch PNAs sein, aber auch andere Moleküle kommen in Frage. Als Oberflächen kommen in Microarray Verfahren insbesondere gelcrümmte oder planare Oberflächen verschiedener Materialien zum Einsatz. Zu den DNA- Sequenzierverfahren gehören beispielsweise Pyrosequencing (Biotage AB, 454 Life Sciences (Roche), Solexa® (Illumina® Inc.) oder SOLiD Sequencing (Applied Biosystems). Dem Fachmann sind weitere geeignete Quantifizierungsverfahren bekannt. Besonders bevorzugt ist es, dass die Detektion von einem oder mehreren Sequenzabschnitten der amplifizierten DNA mittels einer quantitativen real-time PCR durchgeführt wird.
Weiterhin ist es besonders bevorzugt, dass die Detektion von einem oder mehreren Sequenzabsclinitten der amplifizierten DNA mittels eines Microarray- Verfahrens durchgeführt wird. Besonders bevorzugt ist ebenfalls, dass die Detektion von einem oder mehreren Sequenzabschnitten der amplifizierten DNA mittels eines Sequenzierverfahrens durchgeführt wird. In einer besonderen Ausfülirungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Quantität von einem oder mehreren Sequenzabschnitten der DNA in der mit der methylierangsabhängigen Nuklease behandelten Probe mit der Quantität dieses oder dieser Sequenzabschnitte der DNA in einer Kontrollprobe verglichen, die nicht mit einer methylierangsabhängigen Nuklease behandelt wurde.
Die Quantität bestimmter Sequenzabschnitte (Loci) in einer Probe bzw. auf einer DNA kann beispielsweise als Schwellenwert-Zyklus (Thresholä cycle (CT)) ausgedrückt werden, wenn die Quantifizierung mittels real-time PCR durchgeführt wird. Der Cr-Wert gibt dabei an, in welchem Zyklus der PCR die jeweils für eine bestimmte Sequenz indikativen Fluoreszenzwerte oberhalb des messbaren Schwellenwertes liegen und sind daher ein Maß dafür, wie viel DNA der bestimmten Sequenz ursprünglich in der Probe war: Ein niedriger Gr Wert deutet auf eine größere ursprüngliche Menge der bestimmten DNA-Sequenz in der Probe hin als ein höherer Gr-Wert, da weniger Amplifikations-Zyklen nötig waren, um die diese Sequenz in der Probe zu detektieren. Kennt man die Effizienz eines bestimmten Amplifikationssysterns, so kann man durch Vergleich mit Standardwerten aus einem Cx-Wert auf die ursprünglich vorhandene Menge der bestimmten DNA-Sequenz in der Probe rückrechnen. Die Cr-Werte nach Behandlung der Probe mit der methylierangsabhängigen Nuklease können beispielsweise mit entsprechenden Werten ohne Behandlung der Probe mit der methylierangsabhängigen Nuklease verglichen werden. Dies kann etwa durch das Bilden der Differenz („Delta-Gr") von cT unbehand,;lt - CT behandeIt geschehen. Je kleiner diese Differenz ist, desto größer ist die Distanz der entsprechenden DNA-Sequenz zu einer Methylierangsstelle. Anders ausgedrückt: Je näher ein Sequenzabschnitt an einer Methylierangs stelle in der DNA liegt, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren von der methylierangsabhängigen Nuklease geschnitten wird, desto weniger effizient wird dieser Sequenzabschnitt amplifiziert werden. Im Extremfall ist eine Amplifikation des betroffenen Sequenzabschnitts überhaupt nicht möglich, insbesondere, wenn dieser Sequenzabschnitt selbst methyliert war und daher von der metliylierungsabhängigen Nuklease geschnitten wird. Um die Vergleichbarkeit der Mengen bestimmter DNA-Sequenzabschnitte aus mit der methylierungsabhängigen Nuklease behandelten und unbehandelten Proben zu gewährleisten, sollten die Bedingungen, unter denen Amplifikation und Quantifizierung bzw. Detektion stattfinden, jeweils möglichst identisch sein. D.h. es ist vorteilhaft, das erfindungsgemäße Verfahren parallel auch ohne den Zusatz der methylierungsabhängigen Nuklease zur Probe durchzuführen, also ohne den Schritt (ii).
Wie erwähnt entstehen durch das erfindungsgemäße Verfahren mehr Amplifikate aus den zentralen Bereichen eines mittels der methylierungsabhängigen Nuklease geschnittenen DNA-Fragmentes als aus den randständigen Bereichen. Die genaue Position der methylierten Stelle(n), d.h. der Schnittstellen, muss nicht unbedingt bekannt sein. Wählt man nun einen beliebigen Sequenzbereich zur Analyse aus, so kann man selbst dann eine Aussage über die Methylierang machen, wenn der analysierte Sequenzbereich nur in der Nähe der methylierten Stelle Hegt. Eine solche Analyse kann keine Angabe darüber machen, wie stark eine bestimmte Stelle methyliert ist. Es kann mit einer solchen Analyse also keine Aussage darüber getroffen werden, ob eine Sequenz im Genom zu z.B. einem gewissen Anteil methyliert ist, sondern nur angegeben werden, ob es in der Umgebung der analysierten Sequenz generell methylierte Regionen gibt. Daher dient diese Analyse vornehmlich der Feststellung des globalen Metliylierungsmusters und nicht der Quantifizierung des Methylierangsgrades definierter Sequenzen. In besonderen Ausführungsfonnen des erfindungsgemäßen Verfahren kann sich somit an die Behandlung der DNA mit der methylierungsabhängigen Nuklease und anschließender Amplifikation eine Analyse der Sequenzrepräsentation durchgeführt werden. Die DNA-Polymerase, die während einer PCR oder einer quantitativen (Real-Time) PCR (qRT-PCT) im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist vorzugsweise eine Polymerase aus einem thermophilen Organismus oder ist eine thermostabile Polymerase oder ist eine Polymerase ausgewählt aus der Gruppe von Thermus thermo-philus (Tth) DNA Polymerase, Thermus acquaticus (Taq) DNA Polymerase, Thermotoga maritima (Tma) DNA Polymerase, Thermococcus litoralis (Tli) DNA Polymerase, Py ococcus furiosus (Pfu) DNA Polymerase, Pyrococcus woesei (Pwo) DNA Polymerase, Pyrococcus kodakaraensis OD DNA Polymerase, Thermus filiformis (Tfi) DNA Polymerase, Sulfolobus solfataricus Dpo4 DNA Polymerase, Thermus pacificus (Tpac) DNA Polymerase, Thermus eggertsonii (Teg) DNA Polymerase, Thermus brocldanus (Tbr) und Thermus flavus (Tfl) DNA Polymerase. In der qRT-PCR können fluoreszenzmarkierte Primer und/oder Sonden verwendet werden, z.B. LightCycler-Sonden (Roche), TaqMan Sonden (Roche), Molecular beacons, Scorpion- Primer, Sunrise-Primer, LUX-Primer oder Amplifluor-Primer. Sonden und/oder Primer können z.B. kovalent oder nicht-kovalent gebundene Fluoreszenzfarb Stoffe beispielsweise Fluoresceimsothiocyanate FITC), 6-Carboxyfiuorescein (FAM), Xanthen, Rhodamine, ,6- Carboxy-2',4',7'54,7-hexachlorofluorescein (HEX), 6-Carboxy-4',5'-dichloro-2',7'- dimethodyfiuorescein (JOE), N,N,N'5N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), 6- Carboxy-X-rhodamine (ROX), 5-Carboxyrhodamine-6G (R6G5), 6-carboxyrhodamine-6G (RG6), Rhodamine 1 10; Coumarine, wie Umbelliferone, Benzimide, wie Hoechst 33258; Phenanthridine, wie Texas Red, Ethidiumbromide, Acridinfarbstoffe, Carbazolfarbstoffe, Phenoxazinefarbstoffe, Po hyrinfarbstoffeJ Polymethinfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe, wie Cy3, Cy5, Cy7, SYBR-Green, BODIPY-Farbstoffe, Quinolinfarbstoffe und Alexa Farbstoffe enthalten.
Dem Fachmann ist bekannt, dass in qRT-PCR auch unabhängig von Primern und Sonden, Doppelstrang-spezifische Fluoreszenzfarbstoffe, z.B. Ethidiumbromid, SYBR Green, PicoGreen, RiboGreen etc. verwendet werden können. Dem Fachmann sind die geeigneten Bedingungen für eine quantitative PCR. Dies betrifft z.B. das Primer-Design, die Wahl von geeigneten Prozessierungstemperaturen (Denaturierung, Primer Annealing, Elongation), die Zahl der PCR-Zyklen, die Pufferbedingungen.
Die DNA ist im Kontext der vorliegenden Erfindung insbesondere genomische DNA. Unter genomischer DNA wird eine Deoxyribonukleinsäure verstanden, die aus Organismen gewonnen werden kann und teilweise methyliert vorliegt. Die Methylierung kann unterschiedliche Basen und unterschiedliche Positionen betreffen. Die genomische DNA kann z.B. durch Lyse und/oder Reinigung aus Organismen gewonnen worden sein. Die zu analysierende Nukleinsäure kann unterschiedlichen Ursprungs sein. Sie kann z.B. aus einem oder mehreren Organismen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Viren, Phagen, Bakterien, Eukaryoten, Pflanzen, Pilze und Tiere (z.B. Säugetiere, insbesondere Primaten) isoliert worden sein. Die Nukleinsäure kann z.B. auch aus Zellorganellen stammen. Weiter kann die zu analysierende Nukleinsäure Bestandteil von Proben sein. Solche Proben können ebenfalls unterschiedlicher Herkunft sein. So betrifft das erfindungsgemäße Verfahren auch die Analyse von Nukleinsäuren, die in Proben aus Körperflüssigkeiten, Umweltproben oder Nahrungsmittelproben enthalten sind. Unter Organismen versteht man im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung jegliche Form von organischen Hüllen, die Nukleinsäuren enthalten. Dazu gehören z.B. Viren, Pha- gen, prokaryotische und eukaryotische Zellen, Zellverbände oder ganze Organismen. Diese Organismen können lebend oder tot eingesetzt werden. Diese Organismen können in Lösung, pelletiert oder auch mit festen Phasen assoziiert oder gebunden sein. Unter„Organismen" können auch mehrere Organismen derselben Art, mehrere Organismen unterschiedler Arten oder auch ein Organismus in Einzahl gemeint sein.
Wie erwähnt, kann im erfindungs emäßen Verfahren auch eine Lyse des die Nukleinsäure enthaltenden Organismus, Zelle oder Gewebe vor der Amplifikation nötig sein. Unter dem Begriff Lyse wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Prozess verstanden, der dazu führt, dass Nukleinsäuren und/oder Proteine aus einem Probenmaterial heraus in die Umgebung abgegeben werden. Dabei kann die Struktur des Probenmaterials zerstört werden, z.B. die Hülle des Probenmaterials aufgelöst werden. Unter dem Begriff„Lyse" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch verstanden, dass die Nukleinsäure aus dem Probenmaterial durch kleine Öffnungen, z.B. Poren etc. in der Hülle des Probenmaterials austreten können, ohne dass dabei die Struktur der Probenmaterials zu zerstören. Beispielsweise können durch Lysereagenzien Poren erzeugt werden. Des Weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „Lyse" zu verstehen, dass Nukleinsäuren und/oder Proteine vom Probenmaterial, das schon strukturell zerstört erscheinen oder kleine Öffnungen aufweisen, durch die Verwendung eines Additivs herausgespült werden können. Durch die Lyse wird ein Lysat erzeugt. Das Lysat kann Probenmaterial verschiedener oder eines einzelnen Organismus, verschiedener oder einer einzelner Zelle oder verschiedener oder eines einzelnen Gewebes enthalten. Unter Reinigung von DNA wird verstanden, dass die DNA von anderen Umgebungsstoffen getrennt wird. Das bedeutet, dass die Probe nach Reinigung der DNA weniger komplex in Bezug auf ihre Inlialtsstoffe ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur selektiven Anreicherung von nicht- metliyliertem Sequenzabsclinitten von genomischer DNA, umfassend
- eine DNA-Polymerase,
~ einer methylierangsabhängige Nuklease
- optional; einen Puffer für die Amplifikationsreaktion (z.B. enthaltend Puffersubstanz, dNTPs und/oder Primer)
- optional: einen Puffer für die endonucleolytische Spaltung von methylierten Sequenzabschnitten durch die methylierungsabhängige Nuklease.
Weiterliin betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Kit zur Bestimmung des globalen Methylierungsmusters einer genomischen DNA, umfassend
- eine DNA-Polymerase,
- einer methylierungsabhängige Nuklease
- optional: einen Puffer für die Amplifikationsreaktion (z.B. enthaltend Puffersubstanz, dNTPs und/oder Primer)
- optional: einen Puffer für die endonucleolytische Spaltung von methylierten
Sequenzabschnitten durch die methylierungsabhängige Nuklease.
Die DNA-Polymerase der erfindungsgemäßen Kits ist vorzugsweise eine Polymerase aus einem thermophilen Organismus oder ist eine thermostabile Polymerase oder ist eine Polymerase ausgewählt aus der Gruppe von Thermus thermo-philus (Tth) DNA Polymerase, Thermus acquaticus (Taq) DNA Polymerase, Thermotoga maritima (Tma) DNA Polymerase, Thermococcus litoralis (Tli) DNA Polymerase, Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA Polymerase, Pyrococcus woesei (Pwo) DNA Polymerase, Pyrococcus kodakaraensis KOD DNA Polymerase, Thermus flliformis (Tfi.) DNA Polymerase, Sulfolobus solfataricus Dpo4 DNA Polymerase, Thermus pacificus (Tpac) DNA Polymerase, Thermus eggertsonii (Teg) DNA Polymerase, Thermus brockianus (Tbr) und Tiiermus flavus (Tfl) DNA Polymerase.
Die methylierungsabhängige Nuklease der erfindungsgemäßen Kits ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus McrBC, McrA, Dpnl, BisI, Blsl, Glal, Glul, Mall und Pcsl. Bevorzugt sind McrBC und McrA, besonders bevorzugt ist McrBC.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits können z.B. zur selektiven Präparation, d.h. selektiven Anreicherung, von nicht-methylierten Sequenzabsclinitten von genomischer DNA. Außerdem können sie zur Analyse des globalen Methylierungsmusters in genomischer DNA verwendet werden.
Beschreibung der Zeichnungen Abbildung 1: Illustration einer beispielhaften Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens: Gezeigt ist eine genomische DNA („gDNA") bestehend aus nicht-methylierten und methylierten Genomabschnitten. Die methylierten Stellen sind mit„m" gekennzeichnet, hi einem ersten Schritt erfolgt eine nukleolytische Spaltung der gDNA nach Erkennung der methylierten Sequenzabsclmitte durch die methylierungsabhängige Nuklease McrBC. In einem zweiten Schritt erfolgt die Amplifikation der geschnitten DNA. In dieser beispielhaften Ausführung wird eine Whole-Genome-Amplification (WGA) vorgenommen. Die Schar von amplifizierten DNA Molekülen ist angegeben („WGA ampl. DNA"). Aus den zentralen Bereichen entstehen deutlich mehr Amplifikate geschnittene DNA Fragmentes als aus den randständigen Bereichen.
Beispiele
Beispiel 1: Beispielhafte Ausführung des Verfahren
Eine genomische DNA (als„gDNA" gekennzeichnet) besteht aus nicht-methylierten und methylierten Genomabschnitten. Die methylierten Stellen sind in Abbildung 1 mit„m" gekennzeichnet. In einem ersten Schritt erfolgt eine mikleolytische Spaltung der gDNA nach Erkennung der methylierten Sequenzabschnitte durch eine methylierungsabhängige Nuklease (in der Abbildung mit„McrBC" gekennzeichnet). In einem zweiten Schritt erfolgt die Amplifikation der geschnittenen DNA. In dieser beispielhaften Ausfülirung wird eine Whole- Genome-Amplification vorgenommen (in der Abbildung mit„WGA" gekennzeichnet). Die Schar von amplifizierten DNA Molekülen ist angegeben („WGA ampl.DNA"). Man kann deutlich erkennen, dass mehr Arnplifikate entstehen aus den zentralen Bereichen eines geschnittenen DNA Fragmentes als aus den randständigen Bereichen. Dies führt zu dem Vorteil, dass die genaue Position der methylierten Stelle nicht unbedingt bekannt sein muss. Wählt man nun einen Bereich beliebigen Sequenzbereich zur Analyse aus, so kann man selbst dann eine Aussage über die Methylierung machen, wenn der analysierte Sequenzbereich nur in der Nähe der methylierten Stelle liegt. Eine solche Analyse kann keine Angabe darüber machen, wie stark eine bestimmte Stelle methyliert ist (es kann also keine Aussage darüber getroffen werden, ob eine Sequenz im Genom zu z.B. 35% methyliert ist), sondern gibt lediglich an, ob es in der Umgebung der analysierten Sequenz generell methylierte Regionen gibt. Daher dient diese Analyse vorzugsweise der Feststellung des globalen Methylierungsmusters . Beispiel 2 : Beispiel zur Bestimmung der Methylierung in genomischen Regionen
Versuchsbeschreibung: Genomische DNA wurde mittels des QIAamp Kits (QIAGEN) aus HepG2 Zellen isoliert. 1 μg der DNA wurde in einen Ansatz mit McrBC Enzym überführt: Dieser Ansatz („+McrBC Ansatz") enthielt 1 μg DNA, 0,5 U/μΙ McrBC(NEB), lxNEB2 Buffer (NEB), 100 ng/μΐ BSA und 1 mM GTP. Ein weiterer Ansatz („-McrBC Ansatz") enthielt die gleichen Komponenten, jedoch kein McrBC Enzym. Beide Ansätze wurden für 2 h bei 37°C inkubiert gefolgt von einer Inaktivierung bei 65°C für 20 min. Anschließend wurden den Ansätzen 10 ng für eine WGA Reaktionen entnommen. Die WGA Reaktio wurde mit REPLI-g Midi Reagenzien nach dem REPLI-g Midi Protokoll für gereinigte DNA vorgenommen. Die WGA erfolgte für 8 h bei 30°C gefolgt von einer Inaktivierung von 5 min bei 65°C. Um die Sequenzrepräsentanz nach erfolgter WGA zu messen wurde eine Real-time PCR Analyse durchgeführt. Hier wurden drei verschiedene genomische Loci analysiert. Die Primer für die Analyse sind in der Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1 : Verwendete Primer für die Loci a, b und c aus Beispiel 2
Figure imgf000019_0001
Für die Real-time PCR wurden QuantiTect Sybr Green Reagenzien (QIAGEN) und 10 ng der jeweiligen WGA DNA in einer 20 μΐ PCR Reaktion verwendet. Die Primerkonzentration in den Analysen lag bei 0,4 μΜ. Die Threshold-Cycle (Cp-Werte) wurden aufgenommen und sind in der untenstehenden Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2: Bestimmte Threshold- Werte für (CT- Werte) für die Loci a, b und c aus Beispiel 2
Zieht man den Mittelwert aus WGA 3und 4 von dem Mittelwert aus WGA 1 und 2 ab, so erhält man den Sequenzrepräsentanzunterschied Delta-Cr (Tabelle 3).
Tabelle 3: Delta-Cx- Werte für die Loci a, b und c aus Beispiel 2
Locus a Locus b Locus c
Delta-Gr 7,55 7,48 -0,52 Ergebnis: In Tabelle 2 kann man erkennen, dass die Gr- Werte (Locus a und Locus b) für die WGA Reaktionen 3 und 4 („+ McrBC Ansätze") höher sind als für die WGA Reaktionen 1 und 2 („- McrBC Ansätze"). Die höheren Cr- Werte (deutlich auch durch die Delta-Cr Werte) zeigen eine geringere Sequenzrepräsentanz an. Das bedeutet, dass Locus a und Locus b in einer geringeren Konzentration in der WGA 3 und 4 enthalten sind als in der WGA 1 und 2. Eine geringere Konzentration von Locus a und Locus b in WGA 3 und WGA 4 zeigt, dass das McrBC-Enzym in der Nähe dieser Loci die DNA hydrolytisch geschnitten hat. Da McrBC nur dann schneidet, wenn die Erkennungsstellen des Enzyms in der DNA methyliert sind, kann gefolgert werden, dass die DNA in der Nähe der Loci a und b methyliert war.
Anders ist die Situation bei Locus c: Die C-r-Werte sind in den WGA Reaktionen 1-4 vergleichbar. Daraus kann gefolgert werden, dass in der Nähe des Locus c keine methylierten Sequenzen zu finden sind. Beispiel 3: Beispiel zur Bestimmung der Methylierung in genomischen Regionen bei verschiedenen genomischen DNAs
Versuchsbeschreibung: Genomische DNA wurde mittels des QIAarnp Kits (QIAGEN) aus HepG2 Zellen und aus dem Blut vier verschiedener Probanden (Bl bis B4) isoliert. 1 μg der DNA wurde in einen Ansatz mit McrBC Enzym überführt: Dieser Ansatz („+McrBC Ansatz") enthielt 1 μg DNA, 0,5 U/μΙ McrBC (NEB), lxNEB2 Buffer (NEB), 100 ng μΐ BSA und 1 mM GTP. Ein weiterer Ansatz („-McrBC Ansatz") enthielt die gleichen Komponenten, jedoch kein McrBC Enzym. Beide Ansätze wurden für 2 h bei 37°C inkubiert gefolgt von einer Inaktivierung bei 65°C für 20 min. Anschließend wurden den Ansätzen 10 ng für eine WGA Reaktionen entnommen. Die WGA Reaktion wurde mit REPLI-g Midi Reagenzien nach dem REPLI-g Midi Protokoll für gereinigte DNA vorgenommen. Die WGA erfolgte für 8 h bei 30°C gefolgt von einer Inaktivierung von 5 min bei 65°C. Um die Sequenzrepräsentanz nach erfolgter WGA zu messen wurde eine Real-time PCR Analyse durchgeführt. Hier wurden drei verschiedene genomische Loci analysiert. Die Primer für die Analyse sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4: Verwendete Prirner für die Loci a bis g aus Beispiel 3
Figure imgf000021_0001
Für die Real-time PCR wurden QuantiTect Sybr Green Reagenzien (QIAGEN) und 10 ng der jeweiligen WGA DNA in einer 20 μΐ PCR Reaktion verwendet. Die Primerkonzentration in den Analysen lag bei 0,4 μΜ. Die Threshold-Cycle (Cj-Werte) wurden aufgenommen und sind in der untenstehenden Tabelle 5 wiedergegeben.
Zieht man die CT- Werte, die aus den WGA Reaktionen mit vorheriger McrBC Behandlung der genomischen DNA gewonnen wurden, von den Cr-Werten ab, die aus den WGA Reaktionen ohne vorheriger McrBC Behandlung der DNA gewonnen wurden, erhält man den Delta-Cr Wert. Der Delta-Ct Wert ist ein Maß dafür wie stark sich die Repräsentanz der untersuchten Loci zwischen den +McrBC Ansätzen und den -McrBC Ansätzen unterscheidet. Ein sehr hoher Delta-CT Wert zeigt an, dass die Repräsentanz in den +McrBC Ansätzen gegenüber den -McrBC Ansätzen deutlich abgenommen hat. Tabelle 5: Delta-Cx-Werte für die Loci a bis g aus Beispiel 3
Figure imgf000022_0001
Ergebnis: Aus der Tabelle der Delta-CT Werte kann man erkennen, dass die Delta-Gr Wert sich ähneln, wenn Bl bis B4 verglichen werden. So liegen die Delta-Cr Werte bei Locus b zwischen 2,5 und 3,5. Dagegen ist bei der genomischen DNA von HepG2 Zellen der Delta-Cj Wert von Locus b deutlich verschieden von den Delta-Cj Werten des Blutes der Spender Bl bis B4. Dies deutet auf ein anderes Methylierungsmuster bei HepG2 Zellen gegenüber den Blut der Probanden Bl bis B4 hin. Bei Locus f findet sich bei HepG2 Zellen ein niedrigerer Delta-Cx Wert als im Blut, was auf eine stärkere Methylierung am Ort oder in der Nähe des Locus f im Blut hinweißt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur selektiven Amplifikation von nicht-methylierten Sequenzen einer DNA umfassend die Schritte
(i) Bereitstellen einer Probe umfassend eine DNA, die an mindestens einer
Stelle methyliert ist,
(ii) Behandlung der DNA in der Probe mit einer methylierungsabhängigen Nuklease, und
(iii) Random Primed Sequenz-Amplifikation der mit der methylierungsabhängigen Nuklease geschnittenen DNA.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikation isothermal ausgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifikation mittels Strand Displacement Amplifikation durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifikation mittels Random primed-? CR durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 4, umfassend den zusätzlichen Schritt
(iv) Detektion mindestens eines Sequenzabschnittes der amplifizierten DNA.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Detektion die Quantifizierung mindestens eines Sequenzabschnitts der amplifizierten DNA umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Detektion von einem oder mehreren Sequenzabschnitten der amplifizierten DNA durch ein Hybridisierungs-vermittelten Verfahren durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Detektion von einem oder mehreren Sequenzabschnitten der amplifizierten DNA mittels einer quantitativen real-time PCR durchgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Detektion von einem oder mehreren Sequenzabschnitten der amplifizierten DNA mittels eines Microarray-basierten Verfahrens durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Detektion von einem oder mehreren Sequenzabschnitten der amplifizierten DNA mittels eines Sequenzierungsverfahrens durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, wobei die Quantität von einem oder mehreren Sequenzabsclinitten der DNA in der mit der methylierungs abhängigen Nuklease behandelten Probe mit der Quantität dieses oder dieser Sequenzabsclmitte der DNA in einer Kontrollprobe verglichen wird, die nicht mit einer rnethylierungsabhängigen Nuklease behandelt wurde.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die methylierungsabhängige Nuklease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus McrBC, McrA, Dpnl, BisI, Blsl, Glal, GM, Mall und Pcsl.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Schritte (ii) und (iii) simultan durchgeführt werden.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die DNA genomische DNA ist.
15. Kit zur selektiven Anreicherung von nicht-methyliertem Sequenzabsclinitten von genomischer DNA, umfassend
- eine DNA-Polymer ase,
- einer methylierungsabhängige Nuklease,
- optional: einen Puffer für die Amplifikationsreaktion (z.B. enthaltend Puffersubstanz, dNTPs und/oder Primer), und
optional: einen Puffer für die endonucleolytische Spaltung von methylierten Sequenzabschnitten durch die methylierungsabhängige Nuklease.
16. Kit zur Bestimmung des globalen Methylierungsmusters einer genomischen DNA, umfassend
- eine DNA-Polymerase,
- einer methylierungs abhängige Nuklease,
- optional: einen Puffer für die Amplifikationsreaktion (z.B. enthaltend Puffersubstanz, dNTPs und/oder Primer), und
optional: einen Puffer für die endonucleolytische Spaltung von methylierten Sequenzabschnitten durch die methylierungsabhängige Nuklease.
17. Verwendung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder des Kits nach Anspruch 15 zur selektiven Präparation (selektive Anreicherung) von nicht- methylierten Sequenzabschnitten von genomischer DNA.
18. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder des Kits nach Anspruch 16 zur Analyse des globalen Metliylierangsmusters in genomischer DNA.
PCT/EP2010/068006 2009-12-04 2010-11-23 Selektive anreicherung nicht -methylierter nukleinsäuren WO2011067133A2 (de)

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