WO2011059355A1 - Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов - Google Patents
Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов Download PDFInfo
- Publication number
- WO2011059355A1 WO2011059355A1 PCT/RU2009/000621 RU2009000621W WO2011059355A1 WO 2011059355 A1 WO2011059355 A1 WO 2011059355A1 RU 2009000621 W RU2009000621 W RU 2009000621W WO 2011059355 A1 WO2011059355 A1 WO 2011059355A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- mitochondria
- compound
- targeted
- antioxidant
- compounds
- Prior art date
Links
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 45
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 219
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 92
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 82
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 77
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 53
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 45
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 31
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 31
- 230000003244 pro-oxidative effect Effects 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 26
- -1 keto, amino Chemical group 0.000 claims description 25
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 24
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 23
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 21
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 21
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 18
- AIACLXROWHONEE-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(C)C(=O)C=CC1=O AIACLXROWHONEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 16
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 12
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 11
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 claims description 11
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- QWBBPBRQALCEIZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylphenol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1C QWBBPBRQALCEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 10
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 150000002902 organometallic compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 9
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 4
- 230000002468 redox effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000421 anti-necrotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 claims description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 claims description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 claims description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- 150000003505 terpenes Chemical group 0.000 claims 9
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims 3
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 claims 2
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 claims 2
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 2
- SONIYNNDYGIJDZ-UHFFFAOYSA-N [O-]C(CCCCCCCCCC[P+](C1=CC=CC=C1)(C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)=O Chemical compound [O-]C(CCCCCCCCCC[P+](C1=CC=CC=C1)(C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)=O SONIYNNDYGIJDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 49
- GVZFUVXPTPGOQT-UHFFFAOYSA-M mitoq Chemical compound CS([O-])(=O)=O.O=C1C(OC)=C(OC)C(=O)C(CCCCCCCCCC[P+](C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1C GVZFUVXPTPGOQT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 23
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 13
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 13
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 12
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 9
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940093265 berberine Drugs 0.000 description 8
- QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N berberine Natural products COc1ccc2C=C3N(Cc2c1OC)C=Cc4cc5OCOc5cc34 QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 229960004905 gramicidin Drugs 0.000 description 8
- ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N gramicidina Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N 0.000 description 8
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CMSYDJVRTHCWFP-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphane;hydrobromide Chemical compound Br.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CMSYDJVRTHCWFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000015782 Electron Transport Complex III Human genes 0.000 description 7
- 108010024882 Electron Transport Complex III Proteins 0.000 description 7
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 7
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 6
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QUCQEUCGKKTEBI-UHFFFAOYSA-N palmatine Chemical compound COC1=CC=C2C=C(C3=C(C=C(C(=C3)OC)OC)CC3)[N+]3=CC2=C1OC QUCQEUCGKKTEBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241001302161 Ceriodaphnia Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PTPHDVKWAYIFRX-UHFFFAOYSA-N Palmatine Natural products C1C2=C(OC)C(OC)=CC=C2C=C2N1CCC1=C2C=C(OC)C(OC)=C1 PTPHDVKWAYIFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004260 Potassium ascorbate Substances 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 4
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 4
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 4
- IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N phthalocyanine Chemical compound N1C(N=C2C3=CC=CC=C3C(N=C3C4=CC=CC=C4C(=N4)N3)=N2)=C(C=CC=C2)C2=C1N=C1C2=CC=CC=C2C4=N1 IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019275 potassium ascorbate Nutrition 0.000 description 4
- 229940017794 potassium ascorbate Drugs 0.000 description 4
- CONVKSGEGAVTMB-RXSVEWSESA-M potassium-L-ascorbate Chemical compound [K+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] CONVKSGEGAVTMB-RXSVEWSESA-M 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 4
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 3
- 239000003810 Jones reagent Substances 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 3
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000004151 quinonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N Carbonyl Cyanide para-Trifluoromethoxyphenylhydrazone Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(NN=C(C#N)C#N)C=C1 BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- JSQFXMIMWAKJQJ-UHFFFAOYSA-N [9-(2-carboxyphenyl)-6-(ethylamino)xanthen-3-ylidene]-diethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(NCC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O JSQFXMIMWAKJQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 2
- 150000001649 bromium compounds Chemical class 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical class C* 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 125000000687 hydroquinonyl group Chemical group C1(O)=C(C=C(O)C=C1)* 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000008811 mitochondrial respiratory chain Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000007903 penetration ability Effects 0.000 description 2
- FKUYMLZIRPABFK-IQSNHBBHSA-N plastoquinone-9 Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC1=CC(=O)C(C)=C(C)C1=O FKUYMLZIRPABFK-IQSNHBBHSA-N 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000004059 quinone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N rotenone Natural products O1C2=C3CC(C(C)=C)OC3=CC=C2C(=O)C2C1COC1=C2C=C(OC)C(OC)=C1 JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940080817 rotenone Drugs 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 125000002298 terpene group Chemical group 0.000 description 2
- USFPINLPPFWTJW-UHFFFAOYSA-N tetraphenylphosphonium Chemical compound C1=CC=CC=C1[P+](C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 USFPINLPPFWTJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-O triphenylphosphanium Chemical compound C1=CC=CC=C1[PH+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- OHBQPCCCRFSCAX-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=C(OC)C=C1 OHBQPCCCRFSCAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFUDULLGKXSPPH-UHFFFAOYSA-N 10-(4,5-dimethyl-3,6-dioxocyclohexa-1,4-dien-1-yl)decyl-triphenylphosphanium Chemical compound O=C1C(C)=C(C)C(=O)C(CCCCCCCCCC[P+](C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 ZFUDULLGKXSPPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUDGNRWYNOEIKF-UHFFFAOYSA-N 11-bromo-undecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCBr IUDGNRWYNOEIKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXEZTIWVRVSYOK-UHFFFAOYSA-N 2-(3,6-diacetyloxy-2,7-dichloro-9h-xanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound C1=2C=C(Cl)C(OC(=O)C)=CC=2OC2=CC(OC(C)=O)=C(Cl)C=C2C1C1=CC=CC=C1C(O)=O PXEZTIWVRVSYOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRIBMENBGGCKPD-UHFFFAOYSA-N 3-(2,3-dimethoxyphenyl)prop-2-enal Chemical compound COC1=CC=CC(C=CC=O)=C1OC FRIBMENBGGCKPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- PVNIQBQSYATKKL-UHFFFAOYSA-N Glycerol trihexadecanoate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PVNIQBQSYATKKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100390735 Mus musculus Figla gene Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241001148064 Photorhabdus luminescens Species 0.000 description 1
- FKUYMLZIRPABFK-UHFFFAOYSA-N Plastoquinone 9 Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCC1=CC(=O)C(C)=C(C)C1=O FKUYMLZIRPABFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001302210 Sida <water flea> Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-1,1-dioxo-3-(pyridin-2-ylcarbamoyl)-1$l^{6},2-benzothiazin-4-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JISRTQBQFQMSLG-UHFFFAOYSA-M acid berberine sulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O.C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 JISRTQBQFQMSLG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HUVXQFBFIFIDDU-UHFFFAOYSA-N aluminum phthalocyanine Chemical class [Al+3].C12=CC=CC=C2C(N=C2[N-]C(C3=CC=CC=C32)=N2)=NC1=NC([C]1C=CC=CC1=1)=NC=1N=C1[C]3C=CC=CC3=C2[N-]1 HUVXQFBFIFIDDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 150000003836 berberines Chemical group 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical class [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- DIOQZVSQGTUSAI-NJFSPNSNSA-N decane Chemical group CCCCCCCCC[14CH3] DIOQZVSQGTUSAI-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- LUKKCEVNUJBTRF-UHFFFAOYSA-N decyl(triphenyl)phosphanium Chemical compound C=1C=CC=CC=1[P+](C=1C=CC=CC=1)(CCCCCCCCCC)C1=CC=CC=C1 LUKKCEVNUJBTRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- BXJGUBZTZWCMEX-UHFFFAOYSA-N dimethylhydroquinone Natural products CC1=C(C)C(O)=CC=C1O BXJGUBZTZWCMEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002013 dioxins Chemical class 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 230000000967 entomopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012259 ether extract Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101150053330 grpE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000012623 in vivo measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDCHPLOFQATIDS-UHFFFAOYSA-N methyl 2-bromoacetate Chemical compound COC(=O)CBr YDCHPLOFQATIDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N methyl methanesulfonate Chemical compound COS(C)(=O)=O MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000001451 organic peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- TYPBXRFGTISSFB-UHFFFAOYSA-M potassium;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 TYPBXRFGTISSFB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 101150033650 soxS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000012991 uterine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C50/00—Quinones
- C07C50/02—Quinones with monocyclic quinoid structure
- C07C50/04—Benzoquinones, i.e. C6H4O2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/12—Ketones
- A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C46/00—Preparation of quinones
- C07C46/02—Preparation of quinones by oxidation giving rise to quinoid structures
- C07C46/06—Preparation of quinones by oxidation giving rise to quinoid structures of at least one hydroxy group on a six-membered aromatic ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C50/00—Quinones
- C07C50/10—Quinones the quinoid structure being part of a condensed ring system containing two rings
- C07C50/12—Naphthoquinones, i.e. C10H6O2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B47/00—Porphines; Azaporphines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B69/00—Dyes not provided for by a single group of this subclass
- C09B69/001—Dyes containing an onium group attached to the dye skeleton via a bridge
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
- G01N33/5079—Mitochondria
Definitions
- This invention relates to the field of pharmaceuticals, medicine, and, in particular, relates to the production and use of pharmaceutical substances based on mitochondria-targeted compounds.
- composition - a substance prepared for use as part of a medicinal product and meeting the requirements of the pharmacopeia.
- Skulachev's ions are lipophilic cations and anions that can penetrate through mitochondrial membranes.
- Mitochondria-targeted antioxidants are compounds that can targetedly penetrate mitochondria and have antioxidant activity.
- the present invention is devoted to the production of pharmaceutical substances based on mitochondria-targeted antioxidants (MAAs), the design and selection of certain MAAs that are best suited to clinical tasks.
- MAAs mitochondria-targeted antioxidants
- the invention relates to MAAs, which are compounds consisting of an antioxidant attached via a linker group to a lipophilic cation (“Skulachev’s ion”).
- SAkulachev’s ion a lipophilic cation
- A is an effector group
- L is a linker group
- n is an integer of 1 to 20
- B is the addressing group that provides targeted delivery of the entire compound to the mitochondria.
- A may be an antioxidant of the general formula (II)
- Ri and R 2 are the same or different substituents representing lower alkyl or lower alkoxy
- L linker link, which is: a) either a simple or branched hydrocarbon chain, optionally containing one or more double or triple bonds, or an ester, or ester, or CS, or SS, or a peptide bond; and optionally substituted with one or more substituents, preferably being alkyl, alkoxy, halogen, keto, amino;
- Z is a pharmaceutically acceptable anion
- Sk + in the composition "B” can also be a lipophilic metal-organic compound, in particular a lipophilic metalloporphyrin, preferably having the structure:
- Me + means a metal ion, preferably Mn, Fe, Co, Cu, Mg OR Zn. Examples of structures of biologically active compounds related to the general formula (I) are shown in the diagram below.
- the corresponding compounds of formula (I) will be mitochondria-targeted prooxidants.
- Another aspect of the present invention is a method for constructing and / or selecting a particular mitochondria-targeted compound.
- P1 is the position responsible for the stability and biological activity of the compound. If there is no substituent for this carbon atom, then such a substance as effective as an antioxidant, but somewhat unstable. An example of this is SkQl, 10 times more active antioxidant than MitoQ. However, the presence of a methyl group in MitoQ at position P1 makes it more stable compared to SkQl.
- the stability of the substance may also be affected by the composition of the Linker. For example, the stability of a compound can be altered by introducing an ester linkage, peptide, sulfide or other reactive sites into Link.
- Positions ⁇ 2 and ⁇ are responsible for the regulation of interaction with the respiratory chain of mitochondria. If one of these carbon atoms does not have a substituent, then such a substance may not be restored by the respiratory chain of mitochondria, due to which the compound turns into a prooxidant. The same effect can be achieved if one or both substituents in this position in their structure do not allow the respiratory chain to restore and / or oxidize the corresponding compound.
- Substituents at the same positions P2 and RE may affect the ratio of the prooxidant and antioxidant properties of the compound.
- the presence of oxygen atoms in the P2 and PZ positions can lead to the formation of an internal hydrogen bond with the OH atom of the quinol group in the reduced or partially reduced (quinolic or semiquinone) antioxidant forms.
- Such a hydrogen bond can impede the oxidation of the OH group in the reaction with free radicals and reactive oxygen species, which sharply reduces the antioxidant properties of the substance compared to the compound in which there are no oxygen in P2 and RE (for example, there are methyl groups). This can explain the difference in these properties between SkQl and MitoQ.
- P4 is the position responsible for the penetration of a biologically active substance.
- the ability to penetrate mitochondria depends on the charge and hydrophobicity of the compound.
- experiments on artificial membranes show that compounds with triphenylphosphonium at position P4 have less penetrating power than substances where a more hydrophobic cation, the residue of rhodamine G, is located in this position.
- Link is an element of the structure that is also capable of fundamentally affecting the properties of the entire compound.
- the penetration of a compound can be influenced by the length and composition of the linker link Link (Fig. 2). Reducing the length of the linker and increasing its hydrophilic TM will reduce the penetration of the entire compound.
- modifying the composition of the Link link you can change the stability of the connection - the introduction of ester bonds, peptide bonds, and other bonds with less stability than the C — C bond can make the whole compound vulnerable to cellular enzymes such as esterases, peptidases.
- changing the length of this element you can change the position of the hydrophobic part of the molecule (antioxidant residue) inside the bilayer membrane, which is an important factor determining the possibility of interaction of the whole compound with the respiratory chain of mitochondria.
- one aspect of the present invention is a method for creating structures (design) of mitochondria-targeted compounds with predicted biological activity.
- Biological activity is understood as the effect on biological systems and their models (i.e. artificial cell-free systems, subcellular fractions and organelles, cells, tissue and organ sections, or the whole organism), which includes an antioxidant effect, a prooxidant effect, uncoupling effect on mitochondria, and a change in properties biological membranes, regulatory action through various messengers at various levels (regulation of gene expression, protein activity, regulation of the hormonal profile of the body, etc.).
- Another aspect of this invention is a combinatorial library of mitochondria-targeted compounds and methods for searching and selecting promising compounds from this library.
- a library is a set of compounds of the general formula (I), objectively capable of targeted accumulation in mitochondria.
- Compounds for the library can be synthesized, including on the basis of a common part, which is a lipophilic cation, connected to a linker (part of a linker) carrying an “activated” residue, for example, halogen, through which the variable part of the compound is attached.
- a library of mitochondria-targeted compounds can be obtained by attaching to the lipophilic cation a library of unaddressed low molecular weight compounds.
- an aspect of the invention is a testing method (including if the method is automated or semi-automated) of biological activity library compounds in order to select compounds with the desired activity. This method includes the following steps:
- Another aspect of the present invention is a set of test methods used to test the biological activity of new mitochondria-targeted compounds of general formula (I). Moreover, the tested compounds can be studied both individually and as part of combinatorial libraries.
- This set of test methods includes the following methods: ) in vitro testing of the redox properties and stability of the compounds of the general formula (I);
- Specific activity in this case is understood as the ability to activate or suppress certain metabolic pathways, which, in turn, can be manifested in the activation of certain genes at the level of transcription, mRNA stability or translation, at the level of protein modifications, including phosphorylation or dephosphorylation, proteolysis glycosylation, carbonylation and other methods of changing the activity of proteins or protein complexes; activation or suppression of metabolic pathways can also manifest itself in a change in other physiological parameters of the cell, such as: a change in the rate of respiration, a change in the rate of production of certain metabolites, a change in the rate of consumption of certain substrates, a change in the membrane potential on the outer membrane, on the mitochondrial membrane or membranes of other organelles, change the ionic conductivity of one or more of the above membranes, a change in the concentration of certain ions, including a change in pH in the cell cytoplasm or in other cell compartments, a change in the intracellular transport of biomolecules,
- aspects of the present invention are each of the above tests used to study the properties of new compounds of general formula (I), including to predict the prospects of such compounds.
- perspective is understood as the perspective of practical application of these compounds in medicine, biotechnology, and cosmetology.
- Another aspect of the present invention is a methodology for interpreting the results obtained during testing of compounds of the general formula (I) in order to predict the prospects for the practical use of candidate compounds in medicine, biotechnology, cosmetology and in order to select the most promising compounds.
- the main element of this methodology is the comparison of the test results of candidate compounds with the test results of the SkQl compound, which are given in the "experimental examples” section.
- SkQl data therefore, can be considered as a “starting point”, a benchmark, a standard for predicting the effectiveness of other compounds of general formula (I), since SkQl is a fairly effective biologically active compound and can be used in medicine, biotechnology, cosmetology ( see patent applications PCT7RU2006 / 000394, PCT / RU2006 / 000546, PCT / RU2006 / 000547 and other publications on SkQl).
- the compounds MitoVitE and DMMQ are a kind of “negative” benchmarks, and when selecting the most promising antioxidant compounds, those compounds that are similar in biological activity to them should be avoided (starting from the level of mitochondrial testing). Also a negative benchmark is the substance MitoQ.
- “Application window” is, the difference between the minimum concentration (dose) of a substance already exhibiting antioxidant properties and the minimum concentration (dose) of a substance exhibiting prooxidant properties. Obviously, exceeding the last concentration (dose) is extremely undesirable in the practical use of the substance and can significantly limit the possibility of such use.
- Methods for evaluating the “application window” at different levels are given in the experimental examples section. A pair of SkQl - MitoQ compounds can serve as a good benchmark for assessing the prospects of the tested compounds, since SkQ l has a sufficient “application window”, while MitoQ does not.
- tests 1, 2,3 from the Test methods section 1) based on the results of testing the properties of substances in vitro (tests 1, 2,3 from the Test methods section), antioxidant and prooxidant properties of the tested compounds; this allows us to predict their applicability in areas where the use of a prooxidant or antioxidant is beneficial; in vitro tests also determine the ability of candidate compounds to penetrate biological membranes, and therefore predict the bioavailability of compounds, their ability to overcome various barriers in the body (for example, blood-brain), as well as their stability;
- the compound should have greater stability, but less pronounced antioxidant properties compared to SkQl. Perhaps the use in plant biotechnology, mycology and microbiology. SkQ4:
- SkQB l the formula of which is given below
- SkQB l the formula of which is given below
- SkQB Berberine-based SkQBs
- L is a linker link with a length of 1 to 50 links, which is:
- L is a decane residue
- the right side of the compound formula is the berberine residue attached to one of the linker L via one of its constituent atoms.
- the compound can be carried out via ⁇ - ⁇ , ⁇ - ⁇ , CN, CS bonds, including ester bond, peptide bond, disulfide bond communication.
- Including attachment can be carried out in the form of an ether bond, replacing one of the methoxy groups of berberine.
- palmatine can be used instead of berberine.
- SkQBl berberine and palmatine
- One of the aspects of the present invention is the parameters of regulatory documentation, which allows the use in pharmaceutical practice of a pharmaceutical substance based on MAA and, in particular, including the following indicators:
- IR spectrometry The infrared spectrum of the substance, taken by the method of impaired total internal reflection, must have a coincidence of the absorption bands with the absorption bands of the applied spectrum according to the position and intensity of the bands.
- the well-known quinone-containing mitochondria-targeted compounds including substances SkQl, SkQRl, MitoQ and others (see above), exist mainly in one oxidized (quinone) form.
- the oxidized form is able to partially recover in the quinolic form (see Fig. 12).
- the main impurity the content of which can reach 5-8% or more, is the reduced form of MAA. Isolation and detailed study of this form is an intractable task due to its high chemical lability and a tendency to complex redox transitions.
- Method 2 The use of a "molecular trap" for the reduced form of MAA in the form of an agent in a non-polar solvent that acts as an effective oxidation inducer or competitive quinone substituent in the quinone-quinol equilibrium.
- Another aspect of the present invention is a method for producing MAA in a form acceptable for pharmaceutical substances, and comprising Method 1 and / or Method 2.
- an aspect of the present invention is an improved method for the synthesis of quinone-based MAAs.
- the improved technique allows for the industrial production (synthesis) of MAA from cheaper and more affordable components, in particular in the case of the synthesis of plastoquinonyl decyl tripheniphosphonium (PDTF) bromide and other plastoquinone derivatives, it allows using not dimethyl hydroquinone but 2,3-dimethyl phenol as the starting material.
- the synthesis includes the following stages:
- Figure 1 The ability of compounds of General formula (I) to oxidize under the influence of oxygen (A) or superoxide (B) formed in the reaction of xanthine oxidase with xanthine.
- Figure 2 Comparison of the ability of compounds corresponding to structure (I) to penetrate through a bilayer membrane and form a membrane potential. For comparison, the black line shows the calculated indices for a perfectly penetrating monocation (according to the Nernst equation).
- Fig. 3 Testing of the protective or damaging effect of mitochondria-targeted compounds on membrane proteins on a model of an artificial membrane containing gramicidin channels. Damage to the gramicidin channels was stimulated by photoactivation of the phthalocyanine photosensitizer (A) or a mixture of FeS04, ascorbate and tert-butyl hydroperoxide (B).
- A phthalocyanine photosensitizer
- B tert-butyl hydroperoxide
- Figure 5 The ability of mitochondria to reduce or oxidize SkQl depending on the activity of the components of the respiratory chain.
- SkQl protects mitochondria under oxidative stress caused by a mixture of iron sulfate with potassium ascorbate.
- SkQl and MitoQ protects cells from death caused by H 2 0 2 (300 ⁇ M). Cells were incubated with SkQl or MitoQ for 7 days, after which they were seated for the experiment.
- Fig. 8 Short incubation of HeLa cells with SkQRl (2 hours) reduces the level of oxidative stress in the cells caused by H 2 0 2 (300 ⁇ M). Cytofluometry data (A) based on which the number of cells with a low level of oxidative stress (B) was calculated. The calculations were performed based on data from 7 experiments. The data were calculated relative to the group of control cells lying on the diagram in the low fluorescence region DCF DA (50% of the population), this group of cells was taken as 100% and indicators for each exposure were calculated relative to them.
- FIG. 10 Induction of luminescence of E. coli MG1655 pLUX :: PsoxS in the presence of hydrogen peroxide (100 ⁇ M) and paraquat (S ⁇ cauliflower ⁇ ).
- FIG. 11 Induction of the soxS promoter with hydrogen peroxide (500 ⁇ M) and paraquat (100 ⁇ M) in the presence of SkQ 1 (10 ⁇ M).
- FIG. 12 The balance of the quinone and quinol forms of mitochondria-targeted antioxidants.
- R is a linker group connected to a lipophilic ion (“Skulachev’s ion”).
- FIG. 13 Scheme of an improved method for the synthesis of mitochondria-targeted antioxidant PDTF.
- test The results of experiments (tests) are also starting points for assessing the potential of new compounds developed (or selected from combinatorial libraries) by specialists in this field, using this invention to search for new mitochondria-targeted compounds.
- the experimental examples are called “tests” because they are methods for testing new compounds.
- the first step in the selection of compounds corresponding to structure (I) is to test their redox properties. It is at this stage that substances with desired pro- or antioxidant properties can be selected.
- the easiest way to select compounds with potentially antioxidant properties is to test their ability to oxidize under the influence of oxygen or superoxide formed in the reaction of xanthine with xanthine oxidase.
- the time stability of the reduced forms of SkQl and MitoQ was studied by analyzing the absolute absorption spectra of these compounds in the range from 240 to 310 nm obtained using a Pye Unicam SP1 100 double-beam spectrophotometer, England.
- SkQl is less inclined to spontaneously interact with oxygen and form radicals, which potentially indicates its lower toxicity to the cell.
- the compounds were not oxidized by oxygen, but by superoxide, resulting from the reaction of xanthioxidase with xanthine, SkQl was oxidized much more efficiently than MitoQ (Fig. 16). This may serve as an indication that SkQl is more active as an antioxidant and its reduced (active) form is more resistant to spontaneous oxidation by atmospheric oxygen than MitoQ and has a greater affinity for superoxide radicals.
- the bilayer membrane separates two chambers filled with an aqueous solution; the analyte is added to one of them. If a charged substance is able to penetrate through a bilayer membrane, then it quickly diffuses from a chamber with a high concentration to a chamber with a low concentration of a substance, and a potential difference is formed on the membrane.
- a 10-fold concentration gradient allows the formation of a potential of 60 mV (according to the Nernst equation).
- EPZ Testing the protective or damaging effect of mitochondria-targeted compounds on membrane proteins on a model of an artificial membrane containing gramicidin channels.
- damage to the gramicidin channels can be caused by starting the Fanton reaction in the system, which results in the formation of a highly active hydroxyl oxygen radical (the Fanton reaction is triggered by a mixture of FeS04, ascorbate and tert-butyl hydroperoxide).
- the Fanton reaction is triggered by a mixture of FeS04, ascorbate and tert-butyl hydroperoxide.
- the compounds SkQl, SkQ3, and MitoQ As can be seen from the data shown in the figure, photoactivation of phthalocyanine with a short flash of light leads to a strong decrease in membrane conductivity due to damage to the gramicidin channels of the bilayer membrane.
- the method we used to test the antioxidant ability of the compounds synthesized by us is highly effective and allows us not only to evaluate the antioxidant activity of the compounds, but also to determine the specificity of the compound for specific active forms of oxygen. As a reference substance for this method, it would be correct to use SkQl as the most effective compound exhibiting antioxidant activity to a wide range of reactive oxygen species.
- SkQl is a lipophilic cation (octanol: water distribution for SkQl is 20,000: 1)
- octanol water distribution for SkQl is 20,000: 1
- SkQl we use a less lipophilic SkQ5
- the level of non-volatile accumulation decreases markedly.
- This technique allows us to study the efficiency of accumulation of compounds of the general formula (I) in mitochondria, the dependence of their accumulation rate on the functional state of mitochondria, and also to predict the potential bioavailability of the studied compounds.
- a key advantage of the mitochondria-targeted antioxidants proposed in the framework of this invention is their ability to recover by the respiratory chain of mitochondria.
- To study the possibility of reducing the compounds of general formula (I) by the mitochondrial respiratory chain we measured the rate of change in the ratio of the oxidized and reduced forms of the compounds in the presence of respiration substrates in the rat mitochondrial excretion medium. Measurements were performed in the presence of mitochondria.
- Experiments have shown that SkQl is able to be restored by the respiratory chain of mitochondria.
- the use of various oxidation substrates showed that SkQl is able to be reduced both by complex I (mitochondria energized, glutamate with malate) and complex II (succinate oxidation substrate) (Fig. 5a).
- this technique allows us to study the ability of compounds of general formula (I) to be restored by the respiratory chain of mitochondria, in addition, on the basis of the data obtained, pro- or antioxidant properties of the tested compounds can be predicted.
- Oxidative stress in these cases can be induced in various ways: tert-butyl hydroperoxide, Cumene hydroperoxide, hydrogen peroxide, xanthine / xanthine oxidase, a mixture of iron sulfate with potassium ascorbate, etc.
- tert-butyl hydroperoxide Cumene hydroperoxide
- hydrogen peroxide xanthine / xanthine oxidase
- a mixture of iron sulfate with potassium ascorbate etc.
- we used a mixture of iron sulfate with potassium ascorbate we used.
- mitochondria form a certain amount of H 2 0 2 , which under physiological conditions is not dangerous, since they are quickly utilized by various antioxidant systems.
- ferrous sulfate to a medium containing mitochondria in combination with potassium ascorbate causes a reaction of iron with ⁇ 2 0 2 (Fenton reaction) which results in the formation of a highly reactive hydroxyl radical (Fe 2+ + ⁇ 2 0 2 - * ⁇ Fe 3+ + ⁇ + ⁇ ).
- the hydroxyl radical interacts with unsaturated membrane fatty acids and stimulates their free radical oxidation, ultimately leading to the accumulation of malondialdehyde.
- Such a model is well suited for studying the effectiveness of various antioxidants, including compounds of the general formula (I).
- the figure 6 shows the results of testing the antioxidant action of SkQl.
- the method of quantitative measurement of malondialdehyde allows a high degree of confidence to predict the pro- or antioxidant properties of the studied compounds, as well as to test their effective concentration.
- Dye at a concentration of 1 ⁇ g / ml was added at the end of the incubation to live or fixed cells for 30 minutes.
- fluorescent dye propidium iodide (PI) was added to unfixed cells at a concentration of 2 ⁇ g / ml. The percentage of apoptotic and necrotic cells was determined by counting the number cells with a fragmented nucleus; and cells permeable to propidium iodide, respectively.
- SkQl and MitoQ increase the resistance of cells to H 2 0 2 only if the cells are incubated for 5-7 days.
- SkQl and MitoQ being mitochondria-targeted antioxidants, exert their effect in extremely low concentrations. So, SkQl shows its protective effect already at a concentration of 0.2 nm (Fig.7). As can be seen in figure 7, SkQl much more effectively protects cells from death compared to MitoQ, i.e. SkQl is a more effective antioxidant.
- SkQ l and MitoQ Like any antioxidants, SkQ l and MitoQ have limit concentrations above which their prooxidant activity is manifested, so when the concentration of SkQ 1 and MitoQ is above 0.5 mkM, their prooxidant effect is manifested, which leads to the stimulation of cell death caused by H 2 0 2 .
- the methods described above make it possible to determine the ability of the compounds of general formula (I) to protect cells from death caused by oxidative stress. In addition, these methods can help predict the therapeutic dosages and time of administration of drugs based on the compounds of general formula (I).
- a method for determining oxidative stress in an E. coli cell was developed.
- a biosensor system based on luxAB genes encoding bacterial luciferase was created to study the effect of penetrating ions on the oxidative stress of a bacterial cell.
- Luciferases are currently widely used in works on molecular genetics (reporter genes), in biochemical analyzes (for example, determination of trace amounts of ATP), in genetic engineering works (selection), in biotechnology and ecology (biosensors), etc.
- the mechanism of the inhibitory effect of toxic substances on the metabolism of the cell mainly on the respiratory chain, is used, which indirectly affects the luciferase reaction, causing a decrease in the intensity of bioluminescence of the cell suspension.
- the second group of techniques based on the induction (enhancement) of bioluminescence of cells under the influence of a toxicant includes various options for using specific regulatory elements produced by bacteria in the course of evolution and specifically reacting to the presence of one or another chemical substance in the environment.
- This group of biosensors is characterized by both specificity and high sensitivity, because It is determined by the peculiarity of the interaction of a protein receptor (repressor or activator) with a chemical compound.
- regulatory systems that specifically respond to toxicants acting on: 1) cell membranes, 2) proteins, 3) the chromosome (DNA), and 4) induce oxidative stress in the cell can be distinguished.
- bacteria have regulatory systems that specifically respond to heavy metals and arsenic ions.
- the grpE promoter can be used: P grp E- This promoter in the bacterial genome is located in front of the heat shock genes and is activated only when modified cells appear in the cell denatured proteins.
- the SOS promoter P rc A is used as the biosensor for DNA-tropic agents (mitomycin C, methyl methanesulfonate, dioxins, as well as ultraviolet and ionizing radiation).
- the SOS promoter P rc A is used as the biosensor for DNA-tropic agents (mitomycin C, methyl methanesulfonate, dioxins, as well as ultraviolet and ionizing radiation).
- LexA protein is a repressor.
- the promoter P geC A is activated only upon the induction of damage in the genome, i.e., in DNA molecules.
- sox s-Promoter Pkato OxyR activator
- promoters used in our developed method were obtained from the bacterial genome Escherichia coli K12 MG1655 using the PCR method using special, synthesized primers.
- mitochondria-directed antioxidants of the general formula (I), in particular SkQl and MitoQ appear to have high specificity for biosensors that are somehow related to oxidative stress, since they have quinone derivatives in their structure and accumulate with high efficiency in charged membranes. Therefore, it seems optimal to use pLUX :: PkatG and pLUX :: PsoxS biosensors. Fixation of DNA damage during oxidative stress and the influence of penetrating ions on this process is possible using the pLUX :: PrecA biosensor. pLUX :: PgrpE and pLUX :: Plac biosensors are likely to be used as positive and negative controls.
- figure 10 shows the ability of H 2 0 2 and paraquat to induce bioluminescence of the biosensor.
- Induction of luminescence of E. coli MG1655 pLUX :: PkatG in the presence of H 2 0 2 becomes noticeable within 15 minutes and reaches maximum values per hour (Fig. 10A).
- the ratio of the luminescence intensity of the control cells to the induced ones is at optimal concentrations of H 2 0 2 1/80.
- coli MG1655 pLUX PsoxS in the presence of paraquat becomes noticeable within 15-20 minutes and reaches its maximum value in two hours (Fig. 10B).
- the ratio of the luminescence intensity of the control cells to the induced ones is 1/100 at optimal paraquat concentrations.
- EP6 Testing the biological activity of the compounds of general formula (I) in vivo in animals and plants.
- phase of the toxic effect In quantitative assessments of the effect of chemical agents on test objects in a chronic mode, a phenomenon called the "phase" of the toxic effect is manifested. the alternation of inhibition and stimulation of the activity of a biological function or the development of a structural element under the action of potentially toxic substances. As a result, many potential toxicants at certain concentrations can have a temporary stimulating effect on individual functions and on the test object as a whole. Thus, an important criterion for the beneficial effect of drugs is the total lifespan of organisms, because in this case, we can eliminate the danger of getting into the favorable phase of the drug, which is actually toxic.
- the obtained results indicate the ability of SkQl to exert a beneficial effect on the life of small invertebrates, which is expressed in an increase in their life expectancy.
- concentrations of the compound having a beneficial effect on the body were selected, which can be used in experiments on testing the biological activity of the studied drugs of general formula (I) in higher animals.
- EP7 A method for purifying a mnogochondrial-targeted antioxidant using a "molecular trap"
- the initial technical product PDTF (5 g) after preliminary purification on silica gel in the ethanol-chloroform system (1: 9) has a purity of about 85%.
- the content of the reduced form is 8%.
- the purity of the drug is about 92%.
- the content of the reduced form is 6%.
- a comparative qualitative reaction to the bromides of the starting and purified product shows the conservation of bromine ion after chromatographic purification.
- Analytical HPLC on a Ci 8 column, 250x4.6 mm in a system of 0.05% trifluoroacetic acid in 65% acetonitrile in water also demonstrates approximately the same intensity of the bromine ion peak (at the beginning of the chromatogram) for the initial and purified products.
- the chromatogram of the target product clearly shows a decrease in the content of the reduced form.
- the purity of the resulting product is about 97%.
- the proportion of the reduced form is not more than 1.0%.
- This cleaning method is convenient as a final stage before dosed bottling of a concentrated solution of a preparation, drying and storage.
- the purity of the main fraction is not less than 98%.
- the proportion of the reduced form is 0.8-0.9%.
- Drug concentration may reach 150-200 mg / ml. With such a solution, it is convenient to perform metered filling and drying of the finished substance.
- the synthesis includes the following stages:
- Compound 1 was prepared starting from berberine bisulfate (5), which was reduced with sodium borohydride in pyridine for 30 minutes at room temperature, and after crystallization from water in 91% yield, compound 6.
- Compound 6 was alkylated with bromoacetic acid methyl ester (1 hour, 100 ° C) followed by reduction of the intermediate with sodium borohydride (30 min, room temperature) to form compound 7, which was isolated by extraction with ether from an aqueous solution (80% yield) and saponified with a 1% hydro-methanol hydro sida lithium at reflux for 1.5 h to form compound 8. The yield was 8 after crystallization from 61% water.
- Compound 8 was converted to cesium salt, which was condensed with a pre-synthesized derivative of 2,3-dimethyl-1,4-benzoquinone 9 at 60 ° C for 48 hours.
- Compound 10 was oxidized with ⁇ -bromosuccinimide (NBS) in a methylene chloride solution for 1 hour, after removing the excess NBS by washing the organic phase with water and drying it, the mixture was evaporated and the final substance 1 was precipitated with ether.
- Compound 1 was purified by HPLC (C 18) in an acetonitrile gradient containing 0.05% TFA in 0.05% aqueous TFA from 30 to 80%. The total yield after the last two stages was 50%.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к областям фармацевтики, медицины, и, в частности, касается получения и использования фармацевтических субстанций на основе митохондриально-адресованных соединений. Изобретение раскрывает способы синтеза, очистки и хранения митохондриально-адресованных антиоксидантов, позволяющих получать эти вещества в виде и качестве, соответствующим требованиям, предъявляемым к действующим веществам лекарственных препаратов - фармацевтическим субстанциям. Также изобретение раскрывает методы конструирования и отбора новых митохондриально-адресованных антиоксидантов с заданными свойствами.
Description
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СУБСТАНЦИИ НА ОСНОВЕ МИТОХОНДРИАЛЬНО- АДРЕСОВАННЫХ АНТИОКСИДАНТОВ
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к областям фармацевтики, медицины, и, в частности, касается получения и использования фармацевтических субстанций на основе митохондриально-адресованных соединений.
Уровень техники
Опубликованные к настоящему моменту данные убедительно демонстрируют перспективность применения в медицине нового класса биологически активных веществ (см. Skualchev V.P. (2005), ШВМВ Life., 57:305-10; Skulachev V.P. (2007) Biochemistry (Mosc)., 72: 1385-96; Antonenko Yu.N. et al. (2008), Biochemistry (Mosc).,73: 1273-87, Skulachev V.P. et al., (2009), Biochim Biophys Acta., 1787:437-61, Smith R.A. et al., (2008), Ann. N. Y. Acad. Sci., 1 147: 105-11, также см. WO2007046729, WO2009005386, US 6331532, ЕР 1047701, ЕР 1534720) - митохондриально-адресованных антиоксидантов (МАА) на основе «ионов Скулачева» (термин введен Green D.E. , "The electromechanochemical model for energy coupling in mitochondria", 1974, Biochem. Biophys. Acta., 346:27-78).
Однако в приведенных выше источниках раскрываются результаты изучения МАА в лабораторных условиях - in vitro или на животных моделях. При этом, для того, чтобы какое-либо соединение могло быть применено в качестве действующего вещества лекарственного средства (т.н. фармацевтической субстанции), оно должно соответствовать определенным требованиям, а именно:
1. Полностью соответствовать требованиям, предъявляемым национальными регулирующими органами их нормативной документацией, обобщенным в соответствующий фармакопейных статьях, основными из которых являются: подлинность, содержание посторонних примесей, содержание тяжелых металлов, содержание воды, содержание остаточных органических растворителей, стерильность, метод количественного определения, способ упаковки, маркировки и транспортировки.
2. Сохранять в течение всего срока годности в пределах заложенных в нормативной документации показателям, а также фармацевтическую активность.
Особое внимание должно быть обращено как на общее содержание посторонних примесей, так и на содержание одиночных примесей. В частности, одиночные примеси, которые не могут быть индивидуально выделены и всесторонне охарактеризованы, не должны составлять значительной доли (в большинстве случаев - более 1%) от общего содержания примесей.
Другим существенным затруднением для практического применения МАА в качестве фармацевтических субстанций является тот факт, что в описаниях изобретений, связанных с МАА (см. выше), раскрыто большое количество соединений, заявляемых в качестве митохондриально-адресованных антиоксидантов. Однако результаты экспериментов (см. например Antonenko Yu.N. et al. (2008), Biochemistry (Mosc).,73: 1273- 87), включая клинические испытания, показывают, что раскрытые соединения, являясь митохондриально-адресованными, обладают разной (иногда даже противоположной) биологической активностью. В связи с этим, по-прежнему актуальной остается разработка методов конструирования биологически активного вещества, обладающего вполне определенными, предварительно заданными, свойствами, необходимыми в зависимости от конкретного применения данного соединения. Также актуальным остается предсказание свойств и биологической активности (в первую очередь - клинической активности) МАА на основе «ионов Скулачева».
Определения
Фармацевтическая субстанция - вещество, подготовленное к применению в составе лекарственного средства и отвечающее требованиям фармакопеи.
Ионы Скулачева - липофильные катионы и анионы, способные проникать сквозь мембраны митохондрий.
Митохондриально-адресовнные антиоксиданты (МАА) - соединения, способные адресно проникать в митохондрии и обладающие антиоксидантной активностью.
Раскрытие изобретения
Ниже приведены аспекты изобретения:
I. Настоящее изобретение посвящено получению фармацевтических субстанций на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов (МАА), конструированию и выбору определенных МАА, наилучшим способом соответствующих клиническим
задачам. В частности, изобретение касается МАА, представляющих собой соединения, состоящие из антиоксиданта, присоединенного через линкерную группу к липофильному катиону («иону Скулачева»). Рассматриваемые МАА могут быть представлены общей формулой (I), приведенной ниже
Общая формула (I): соединения структуры
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии.
При этом «А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (II)
(П)
и/или его восстановленная форма
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
и/или его восстановленную форму
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z"
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме.
в) Кроме того, Sk+ в составе «В» также может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
SkQl (пластохинонилдецилтрифенилфосфония (ПДТФ) бромид)
В некоторых случаях в рамках настоящего изобретения целесообразно применение соединений формулы (I), в которых в качестве эффекторной группы А применяются прооксиданты, в частности, дезметоксиубихинон или ионол, представленные структурами:
Соответствующие соединения формулы (I) будут являться митохондриально- адресованными прооксидантами.
II. Методы и подходы для селекции
Другим аспектом настоящего изобретения является способ конструирования и/или выбора конкретного митохондриально-адресованного соединения.
П.а Метод конструирования новых митохондриальных антиоксидантов
Изучение химических, физико-химических и биологических свойств указанных выше соединений позволило предложить новый подход для конструирования соединений, относящихся к классу соединений (I). С использованием предложенной модели становится возможным дизайн структуры новых митохондриально-адресованных антиоксидантов с заранее заданными свойствами.
Схема конструирования соединений, описывающая в общем виде предлагаемую модель конструирования заданных соединений по изобретению, приведена на схеме ниже Схема модели конструирования новых митохондриально-адресованных антиоксидантов
где:
Р1 - позиция, отвечающая за стабильность и биологическую активность соединения. Если при этом атоме углерода нет заместителя, то такое вещество
максимально эффективно как антиоксидант, но несколько нестабильно. Примером этого является SkQl , в 10 раз более активный антиоксидант, чем MitoQ. Однако, наличие у MitoQ в позиции Р1 метильной группы делает его более стабильным по сравнению с SkQl. Также на стабильность вещества может влиять состав линкера «Link». Например, стабильность соединения может быть изменена при введении в Link сложноэфирной связи, пептидной, сульфидной или других реакционно-способных участков.
Позиции Р2 и РЗ - отвечающие за регуляцию взаимодействия с дыхательной цепью митохондрий. Если на одном из этих атомов углерода нет заместителя, то такое вещество может не восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий, за счет чего соединение превращается в прооксидант. Тот же эффект может быть достигнут, если один или оба заместителя в этой позиции по своей структуре не позволяют дыхательной цепи восстанавливать и/или окислять соответствующее соединение.
Заместители в тех же позициях Р2 и РЗ могут влиять на соотношение прооксидантных и антиоксидантых свойства соединения. Присутствие атомов кислорода в положениях Р2 и РЗ может приводить к образованию внутренней водородной связи с атомом водорода ОН группы хинола в восстановленной или частично восстановленной (хинольной или семихиноной) формах антиоксиданта. Такая водородная связь может затруднять окисление ОН группы в реакции со свободными радикалами, и активными формами кислорода, что резко снижает антиоксидантные свойства вещества по сравнению с соединением в котором в Р2 и РЗ нет кислородов (например, находятся метальные группы). Этим можно объяснить разницу этих свойств у SkQl и MitoQ.
Р4 - позиция, отвечающая за проникающую способность биологически активного вещества. Способность проникать в митохондрии зависит от заряда и гидрофобности соединения. Например, опыты на искусственных мембранах показывают, что соединения, с трифенилфосфонием в позиции Р4 обладают меньшей проникающей способностью по сравнению с веществами, где в этой позиции находится более гидрофобный катион - остаток родамина G.
«Link» - элемент структуры, также способный коренным образом влиять на свойства всего соединения. На проникающую способность соединения может влиять длина и состав линкерного звена Link (рис. 2). Сокращение длины линкера и увеличение его гидрофильное™ приведет к снижению проникающей способности всего соединения. Также модифицируя состав звена Link можно изменять стабильность соединения -
введение в его состав сложноэфирных связей, пептидных связей, других связей, обладающих меньшей стабильностью по сравнению с С-С связью, может сделать все соединение уязвимым для клеточных ферментов таких как эстеразы, пептидазы. Также изменяя длину этого элемента можно изменять положение гидрофобной части молекулы (антиоксидантного остатка) внутри бислойной мембраны, что является важным фактором, определяющим возможность взаимодействия всего соединения с дыхательной цепью митохондрий.
Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является метод создания структур (дизайн) митохондриально-адресованных соединений с прогнозируемой биологической активностью. Под биологической активностью понимается воздействие на биологические системы и их модели (то есть искусственные бесклеточные системы, субклеточные фракции и органеллы, клетки, участки тканей и органов или целый организм), включающее в себя антиоксидантное действие, прооксидантное действие, разобщающее действие на митохондрии, изменение свойств биологических мембран, регуляторное действие через различные мессенджеры на различных уровнях (регуляция экспрессии генов, активности белков, регуляция гормонального профиля организма и др.).
П.б Способ создания соединений с использованием комбинаторых библиотек
Другим аспектом данного изобретения является комбинаторная библиотека митохондриально-адресованных соединений и методы поиска и отбора перспективных соединений из этой библиотеки. Такая библиотека представляет собой набор соединений общей формулы (I), объективно способных адресно накапливаться в митохондриях. Соединения для библиотеки могут быть синтезированы в том числе на основе общей части, представляющей собой липофильный катион, соединенный с линкером (частью линкера), несущим "активированный" остаток, например галоген, посредством которого осуществляется присоединение вариабильной части соединения. Другими словами, библиотека митохондриально-адресованных соединений может быть получена присоединением к липофильному катиону библиотеки неадресованных низкомолекулярных соединений.
П.в Также аспектом изобретения является метод тестирования (в том числе, если метод является автоматизированным или полуавтоматизированным) биологической активности
соединений библиотеки с целью отбора соединений, обладающих требуемой активностью. Такой метод включает в себя следующие этапы:
1) тест, позволяющий отобрать из библиотеки группу веществ-кандидатов;
2) построение комбинаторной суббиблиотеки на основе отобранных веществ и их модификаций, если таковые возможны;
3) тестирование суббиблиотеки с целью отбора соединений, обладающих наиболее выраженной искомой биологической активностью;
4) повтор этапов с 1 по 3-й до тех пор, пока не будут перебраны все возможные варианты соединений или не будет достигнута искомая биологическая активность.
Следует отметить, что наиболее эффективным представляется комбинирование нескольких методов тестирования биологической активности на этапах 1 и 3, что позволяет существенно снизить вероятность получения артефактных результатов. Конкретные методы тестирования могут быть адаптированы квалифицированными специалистами в области биохимии, биофизики, биоэнергетики, микробиологии, молекулярной биологии, клеточной биологии или других областях современной биологии на основании общедоступных литературных данных по методам работы с комбинаторными библиотеками и методов, приведенных в описании данного изобретения (см. разделы методы тестирования, методики интерпретации результатов, экспериментальные примеры). Приведенные в соответствующем разделе экспериментальные примеры представляют собой методы тестирования активности митохондриально-адресованных соединений «в отдельных пробирках» и могут быть легко адаптированы для тестирования комбинаторных библиотек высоко-производительными методами используя стандартные подходы.
III. Методы тестирования
Еще одним аспектом данного изобретения является набор методов-тестов, применяемых для тестирования биологической активности новых митохондриально- адресованных соединений общей формулы (I). При этом тестируемые соединения могут изучаться как индивидуально, так и в составе комбинаторных библиотек. В этот набор методов-тестов входят следующие методы:
) тестирование окислительно-восстановительных свойств и стабильности соединений общей формулы (I) in vitro;
) тестирование проникающей способности митохондриально-адресованных соединений на искусственной «черной» мембране;
) тестирование защитного или повреждающего действия митохондриально- адресованных соединений на мембранные белки на модели искусственной мембраны, содержащей грамицидиновые каналы;
) тестирование антиоксидантного или прооксидантного действия митохондриально- адресованных соединений на изолированные митохондрии;
) тестирование антиоксидантного или прооксидантного действия митохондриально- адресованных соединений на культурах животных, растительных, бактериальных или дрожжевых клеток;
) тестирование антиапоптозного, или антинекротического, или проапоптозного, или пронекротического митохондриально-адресованных соединений на культурах клеток;
) тестирование накопления митохондриально-адресованных соединений внутри клеток;
) тестирование специфической активности митохондриально-адресованных соединений; под специфической активностью в данном случае понимается способность активировать иди подавлять определенные метаболические пути, что, в свою очередь, может проявляться в активации работы определенных генов на уровне транскрипции, стабильности мРНК или трансляции, на уровне модификаций белков, включающих в себя фосфорилирование или дефосфорилирование, протеолиз, гликозилирование, карбонилирование и другие способы изменения активности белков или белковых комлексов; активация или подавление метаболических путей может также проявляться в изменении других физиологических параметров клетки, как то: изменение скорости дыхания, изменение скорости продукции определенных метаболитов, изменении скорости потребления определенных субстратов, изменении мембранного потенциала на наружной мембране, на митохондриальной мембране или мембранах других органелл, изменении ионной проводимости одной или нескольких из вышеперечисленных мембран, изменении концентраций определенных ионов,
включая изменение рН в цитоплазме клетки или в других компартментах клетки, изменении во внутриклеточном транспорте биомолекул, везикул и органелл, изменении в ходе клеточного цикла, изменении, приводящему к делению клеток, к трансформации клеток, к гибели клеток или, наоборот, к их выживанию;
9) тестирование биологической активности соединений общей формулы (I) in vivo на животных или растениях; эти тесты неприменимы на стадии первичного тестирования комбинаторных библиотек и могут быть применены только для изучения ограниченного количества соединений.
Таким образом, аспектами данного изобретения являются каждый из вышеперечисленных тестов, примененных для изучения свойств новых соединений общей формулы (I), в том числе для прогнозирования перспективности таких соединений. Под перспективностью в данном случае понимается перспективность практического применения этих соединений в медицине, биотехнологии, косметологии.
IV. Методика интерпретации результатов
Другим аспектом данного изобретения является методика интерпретации результатов, получаемых в ходе тестирования соединений общей формулы (I), с целью прогнозирования перспективности практического применения соединений-кандидатов в медицине, биотехнологии, косметологии и с целью отбора наиболее перспективных соединений.
Основным элементом данной методики является сравнение результатов тестирования соединений - кандидатов, с результатами тестирования соединения SkQl , которые приведены в разделе «экспериментальные примеры». Данные по SkQl , таким образом, могут рассматриваться в качестве «отправной точки», репера, стандарта для прогнозирования эффективности других соединений общей формулы (I), поскольку SkQl является достаточно эффективным биологически-активным соединением и может быть применено в медицине, биотехнологии, косметологии (см. заявки на изобретения PCT7RU2006/000394, PCT/RU2006/000546, PCT/RU2006/000547 и др. публикации по SkQl).
Другими стандартами для сравнения активности могут служить вещества SkQRl, MitoQ, MitoVitE, DMMQ. При этом является предпочтительным возможность
восстановления испытуемого соединения дыхательной цепью митохондрий, предпочтительно именно ферментами и ко-ферментами дыхательной цепи, и существенное превалирование у испытуемого соединения антиоксидантных свойств над прооксидантными.
Таким образом, соединения MitoVitE и DMMQ являются своего рода «негативными» реперами и при отборе наиболее перспективных соединений - антиоксидантов следует избегать тех соединений, которые сходны с ними по биологической активности (начиная с уровня тестирования на митохондриях). Также негативным репером является вещество MitoQ.
При отборе новых соединений на основе испытаний их свойств следует отбирать те соединения, которые ближе по своей активности к SkQl чем к MitoQ. В первую очередь под активностью понимается способность проявлять антиоксидантные свойства в малых и сверхмалых концентрациях. Митохондриально адресованные антиоксиданты при повышении их дозы обладают сильным про-оксидантным действием на разные биологических объекты (см. экпериментальные примеры а также Doughan А. К., Dikalov S.I. (2007), Antioxid. Redox Signal. 9: 1825-36). При меньших дозах эти соединения проявляют антиоксидантные свойства.
Таким образом, важнейшей характеристикой соединения - митохондриально адресованного вещества - является т.н. «окно применения» - то есть разница между минимальной концентрацией (дозой) вещества, уже проявляющей антиоксидантные свойства и минимальной концентрацией (дозой) вещества, проявляющей про- оксидантные свойства. Очевидно, что превышение последней концентрации (дозы) крайне нежелательно при практическом применении вещества и может существенно ограничить возможность такого применения. Методы оценки «окна применения» на разных уровнях приведены в разделе экспериментальные примеры. Пара соединений SkQl - MitoQ может служить хорошим репером для оценки перспективности испытуемых соединений, поскольку SkQ l обладает достаточным «окном применения», в то время как MitoQ - нет.
Ниже приведена методика интерпретации результатов тестирования соединений. Методика подразделяется на несколько этапов:
1) на основании результатов тестирования свойств веществ in vitro (тесты 1 ,2,3 из раздела Методы тестирования) можно оценить антиоксидантные и
прооксидантные свойства тестируемых соединений; это позволяет прогнозировать их применимость в областях, где полезным является применение прооксиданта или антиоксиданта; также тесты in vitro позволяют определить способность соединений-кандидатов проникать через биологические мембраны, и, следовательно, прогнозировать биодоступность соединений, их способность к преодолению различных барьеров в организме (например, гематоэнцефалический), а также и их стабильность;
2) примеры интерпретаций результатов тестов, являющихся аспектом данного изобретения, приведены в разделе «экспериментальные примеры»; на основании этих примеров и соответствующих интерпретаций квалифицированный специалист в области биохимии, биофизики, биоэнергетики, микробиологии, молекулярной биологии, клеточной биологии или других областях современной биологии сможет правильно оценить результаты тестирования веществ-кандидатов и отобрать из них наиболее перспективные и наиболее подходящие для искомого практического применения.
Для подтверждения осуществимости настоящего изобретения и верности предлагаемой модели, были синтезированы новые митохондриально адресованные антиоксиданты SkQ3, SkQ4, SkQ5 и SkQBl .
V. Примеры соединений, перспективность которых предсказывается настоящим изобретением:
SkQ3:
Прогнозируемые характеристики: соединение должно обладать большей стабильностью, но менее выраженными антиоксидантыми свойствами по сравнению с SkQl . Возможно применение в биотехнологии растений, микологии и микробиологии.
SkQ4:
Характеристики: пониженная (по сравнению с SkQl) способность проникать через биомембраны. Тем самым должна быть снижена биодоступность препарата и снижена выраженность побочных эффектов.
SkQ5:
Характеристики: уменьшение длины линкера между «ионом Скулачева» и антиоксидантом уменьшает гидрофобность соединения и может влиять на скорость проникновения соединения через мембраны.
Серия соединений SkQB - с повышенной проникающей способностью, по сравнению с SkQl. К этой серии относятся все соединения, в которых в качестве «иона Скулачева» используются природные соединения, например, бербирин. Соединения из серии SkQB (например, SkQB l, формула которого приведена ниже) обладают
повышенной проникающей способностью и, следовательно, более перспективны с фармацевтической точки зрения, имеют большую способность по преодолению гематоэнцефалического и гематоофтальмологического барьеров. Также, соединения серии SkQB, должны обладать менее выраженными побочными эффектами, так как бербирин (также как и пальмитин) являются природными соединениями растительного происхождения.
SkQB 1 А
В общем виде SkQB на основе берберина могут быть представлены общей формулой:
SkQB:
1) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
2) природную изопреноидную цепь.
Предпочтительно L является остатком декана.
Правая часть формулы соединения представляет собой остаток берберина, присоединенный по одному из входящих в его состав атомов к линкеру L. Соединение может быть осуществлено через С-С, С-О, C-N, C-S связи, в том числе сложноэфирную связь, пептидную связь, дисульфидную связь. В том числе присоединение может быть осуществлено в виде просто-эфирной связи, замещая одну из метоксильных групп береберина.
В соединениях серии SkQB вместо берберина возможно использование пальматина.
Также предпочтительными соединениями на основе берберина и пальматина являются следующие соединения:
SkQBl:
SkQPl:
SkQP5:
Способы синтеза и описание химических свойств и биологической активности приведенных выше соединений приведены в разделе «Экспериментальные примеры».
VI. Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов.
Одним из аспектов настоящего изобретения являются параметры нормативной документации, позволяющей применять в медицинской практике фармацевтическую субстанцию на основе МАА и, в частности, включающие в себя следующие показатели:
1. подлинность, определяемая, в частности, при помощи
a. спектрофотометрии в заданном диапазоне длин волн и сравнению с определенными результатами спектрофотометр ическо го исследования образца МАА
b. ИК - спектрометрии. Инфракрасный спектр субстанции, снятый по методу нарушенного полного внутреннего отражения должен иметь совпадение полос поглощения с полосами поглощения прилагаемого спектра по положению и интенсивности полос.
c. Реакция на бромиды. Хлороформный слой должен окраситься в желтый цвет.
2. Содержание посторонних примесей, определяемые с помощью метода ВЖХ. Содержание каждой отдельной примеси не более 1,5%. Суммарное содержание примесей не более 4,0%.
3. Содержание тяжелых металлов (не более 0,001%).
4. Содержание остаточных органических растворителей (такие как этанол, метанол и хлороформ).
5. Стерильность.
6. Количественное определение субстанции
7. Упаковка, маркировка и хранение
8. Установленный срок годности
На практике известные хинон-содержащие митохиндриально-адресованные соединения, включая вещества SkQl, SkQRl , MitoQ и др. (см. выше), существуют, главным образом, в одной окисленной (хинонной) форме. При этом в обычных условиях окисленная форма способна частично восстанавливаться в хинольную форму (см. фиг. 12). Таким образом, при использовании МАА в качестве фармацевтических субстанций, основной примесью, содержание которой может достигать 5-8% и более, является восстановленная форма МАА. Выделение и детальное исследование этой формы представляется трудноразрешимой задачей ввиду ее высокой химической лабильности и склонности к сложным окислительно-восстановительным переходам.
С другой стороны, получение фармацевтической субстанции МАА в хинонной форме, свободной от восстановленной (хинольной) формы стандартными методами хроматографической очистки является затруднительным из-за схожести этих соединений.
Вторая проблема, с которой приходится сталкиваться в процессе очистки вышеприведенной серии препаратов МАА, заключается в необходимости сохранения характеристического противоиона, например иона брома. Обычные условия проведения ионообменной или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) оказываются слишком жесткими по отношению к этим лабильным соединениям и не гарантируют сохранения противоиона в исходной структуре.
Таким образом, существующие методы и приемы выделения и очистки препаратов серии МАА не обеспечивают необходимых параметров чистоты для такого рода фармацевтических субстанций.
В рамках настоящего изобретения эта задача решается за счет:
Метод 1. Применение нестандартного метода ВЭЖХ в бессолевой безбуферной системе подвижной фазы, а на заключительной стадии - гель-фильтрация высококонцентрированного раствора препарата.
Метод 2. Использование «молекулярной ловушки» для восстановленной формы МАА в виде агента в неполярном растворителе, который выполняет роль эффективного индуктора окисления или конкурентного заместителя хинонной формы в равновесии хинон-хинол.
Таким образом, еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения МАА в форме, приемлемой для фармацевтических субстанций, и включающий в себя Метод 1 и/или Метод 2.
VII. Также аспектом настоящего изобретения является улучшенный метод синтеза МАА на основе хинонов. Улучшенная методика позволяет осуществлять промышленное получение (синтез) МАА из более дешевых и доступных компонентов, в частности в случае синтеза пластохинонилдецилтрифенифосфония (ПДТФ) бромида и других производных пластохинона она позволяет использовать в качестве исходного сырья не диметилгидрохинон, а 2,3-диметил фенол. Синтез включает в себя следующие стадии:
1. Окисление 2,3-диметилфенола (1) в 2,3-диметил- 1,4-бензохинон (2) реактивом Джонса.
2. Присоединение 11 -бромундекановой кислоты (3) к трифенилфосфину с образованием бромида (Ю-карбоксидецил)трифенилфосфина (4)
3. Образование целевого соединения (5) в результате реакции полученного соединения (4) с 2,3-диметил- 1,4-бензохиноном (2) в присутствии нитрата серебра и персульфата аммония.
Общая схема синтеза приведена на Фигуре 13. Подробнее синтез описан в экспериментальном примере ЭП8.
Краткое описание фигур
Фиг.1 Способность соединений общей формулы (I) окисляться под действием кислорода (А) или супероксида (Б) образуемым в реакции ксантиноксидазы с ксантином.
Фиг.2 Сравнение способности соединений отвечающих структуре (I) проникать через бислойную мембрану и образовывать мембранный потенциал. Для сравнения на графике чёрной линией показаны расчетные показатели для идеально проникающего монокатиона (по уравнению Нернста).
Фиг.З Тестирование защитного или повреждающего действия митохондриально- адресованных соединений на мембранные белки на модели искусственной мембраны, содержащей грамицидиновые каналы. Повреждение грамицидиновых каналов стимулировалось фотоактивацией фотосенсибилизатора фталоцианина (А) либо смесью FeS04, аскорбата и третбутилгидропероксида (Б).
Фиг.4 Накопление SkQl и S Q5 в митохондриях измеренное с помощью ТФФ+ электрода.
Фиг.5 Способность митохондрий восстанавливать или окислять SkQl в зависимости от активности компонентов дыхательной цепи.
Фиг.6 SkQl защищает митохондрии в условиях окислительного стресса вызванного смесью сульфата железа с аскорбатом калия.
Фиг.7 SkQl и MitoQ защищает клетки от гибели вызванной Н202 (300 мкМ). Клетки инкубировались с SkQl или MitoQ в течение 7 дней, после чего рассаживались для эксперимента.
Фиг.8 Короткая преинкубация клеток HeLa с SkQRl (2 часа) снижает уровень окислительного стресса в клетках вызванного Н202 (300 мкМ). Данные цитофлуометрии (А) на основании которых были рассчитано количество клеток с низким уровнем окислительного стресса (Б). Расчеты проводили на основании данных 7 экспериментов. Данные рассчитывали относительно группы контрольных клеток лежащих на диаграмме в области низкой флуоресценции DCF DA (50% популяции), эта группа клеток принималась за 100 % и относительно них рассчитывались показатели для каждого воздействия.
Фиг.9 Обработка клеток SkQl (20 нМ) в течение 7 дней защищает клетки HeLa от окислительного стресса вызванного Н202 (300 мкМ)
Фиг. 10 Индукция люминесценции Е. coli MG1655 pLUX::PsoxS в присутствии пероксида водорода (100 мкМ) и параквата (ЮОмкМ).
Фиг. 11 Индукция soxS промотора пероксидом водорода (500 мкМ) и паракватом (100 мкМ) в присутствии SkQ l (10 мкМ).
Фиг. 12 Равновесие хинонной и хинольной форм митохондриально-адресованных антиоксидантов. R - линкерная группа, соединенная с липофильным ионом («ионом Скулачева»).
Фиг. 13 Схема улучшенного метода синтеза митохондриально-адресованного антиоксиданта ПДТФ.
Осуществление изобретения - экспериментальные примеры.
Ниже приведены экспериментальные примеры (ЭП), которые призваны проиллюстрировать возможность применения изобретения для разработки новых митохондриально-адресованных соединений. Результаты экспериментов (тестов) также являются отправными точками, позволяющими оценивать перспективность новых соединений, разработанных (или отобранных из комбинаторных библиотек) специалистами в данной области, использующими данное изобретение для поиска новых митохондриально адресованных соединений. В этой связи экспериментальные примеры названы «тестированиями», поскольку представляют собой методы тестирования новых соединений.
ЭШ. Тестирование окислительно-восстановительных свойств и стабильности соединений общей формулы (I) in vitro.
Первым этапом отбора соединений отвечающих структуре (I) является тестирование их окислительно-восстановительных свойств. Именно на этом этапе можно отбирать вещества с заданными про- или антиоксидантными свойствами. Наиболее простым способом отбора соединений с потенциально антиоксидантными свойствами это тестирование их способности окисляться под действием кислорода или супероксида образуемого в реакции ксантина с ксантиноксидазой. Стабильность во времени восстановленных форм SkQl и MitoQ исследовали методом анализа абсолютных спектров поглощения данных соединений в диапазоне от 240 до 310 нм, полученных при помощи двухлучевого спектрофотометре Pye Unicam SP1 100, Англия. По разработанной методике производные хинонов восстанавливали тетрагидроборатом натрия в среде измерения, содержавшей 20мМ MOPS-КОН, рН=7,6. Кювета сравнения не содержала SkQl или MitoQ, восстановитель вносили в обе кюветы, измерения проводили по окончании выделения водорода. Степень восстановленности хинонов оценивали по величине площади пика методом взвешивания, для сравнения измеряли абсолютное значение поглощения в максимуме при 267 нм. Полученные данные указывают на то, что под
действием кислорода восстановленная (хинольная) форма SkQl более устойчива к окислению кислородом воздуха, чем MitoQ (фигЛа). Тем самым, SkQl менее склонен спонтанно взаимодействовать с кислородом и образовывать радикалы, что потенциально указывает на его меньшую токсичность для клетки. С другой стороны, когда соединения окислялись не кислородом а супероксидом, образующимся в результате реакции ксантиоксидазы с ксантином, SkQl окислялся гораздо эффективней MitoQ (фиг.16). Это может служить указанием, что SkQl более активен как антиоксидант и его восстановленная (активная) форма более устойчива к спонтанному окислению кислородом воздуха, чем MitoQ и обладает большим сродством к супероксидному радикалу.
ЭП2. Тестирование проникающей способности м итохонд риал ыю- адресованных соединений на искусственной «черной» мембране,
Для тестирования проникающей способности митохондриально-адресованных соединений отвечающих структуре (I) предлагается использовать метод, основанный на способности ионов проникать сквозь бислойную фосфолипидную мембрану, двигаясь по градиенту концентрации. Бислойная мембрана разделяет две камеры, заполненные водным раствором, в одну из них добавляется исследуемое вещество. Если заряженное вещество способно проникать через бислойную мембрану, то происходит его быстрая диффузия из камеры с высокой концентрации в камеру с низкой концентрации вещества, при этом на мембране образуется разность потенциалов. Для ионов несущих один заряд и способных свободно проникать через мембрану 10 кратный градиент концентраций позволяет образовывать потенциал в 60 мВ (согласно уравнению Нернста).
Данная методика применялась в различных исследованиях по изучению способности ионов проникать сквозь билипидную мембрану и подробно описана в статье Starkov АА, Bloch DA, Chemyak BV, Dedukhova VI, Mansurova SA, Symonyan RA, Vygodina TV, Skulachev VP, 1997, Biochem. Biophys Acta, 1318, 159-172. С помощью этого метода нами было протестировано несколько веществ отвечающих структуре (I), а именно SkQl, SkQ3, SkQRl и MitoQ. Было показано, что SkQ3 и SkQRl полностью подчиняются уравнению Нернста в концентрациях от 5 х 10"6 до 5х \0л М (для SkQ3) и 5>< 10"6 до 5 < 10"5 М (для SkQRl). В концентрации выше 5х 10"5 М SkQRl перестает соответствовать уравнению Нернста что, вероятно, связано с его способностью повреждать мембрану при высоких
концентрациях. Градиент SkQl и MitoQ начинает образовывать потенциал в соответствии с уравнением Нернста при более высоких концентрациях (в пределах от 5х 10"5 до бх Ю"4 М). Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод что SkQl и MitoQ обладают меньшей проникающей способность по сравнению с SkQ3 или SkQRl . Этот относительно простой метод является идеальным на стадии первичного отбора предполагаемых митохондриально направленных соединений отвечающих структуре (I), так как позволяет быстро отобрать соединения, обладающие наилучшей проникающей способностью, т.е. потенциально наиболее биодоступные.
Также была проанализирована проникающая способность соединений SkQBl и SkQBPl . Результаты анализа показали высокую проникающую способность этих соединений (не уступающую способности SkQl).
ЭПЗ. Тестирование защитного или повреждающего действия митохондриально-адресованных соединений на мембранные белки на модели искусственной мембраны, содержащей грамицидиновые каналы.
В нашей лаборатории была разработана методика позволяющая изучать антиоксидантную активность веществ в простой системе состоящей из бислойной мембраны, проводящего белка грамицидина и фотосенсибилизатора (митотрэкера красного, трижды сульфированного алюмофталоцианина либо фталоцианина цинка). Суть метода заключается в способности активных форм кислорода, образующихся в результате фотоактивации молекул фотосенсибилизатора, повреждать грамицидиновые каналы, в результате чего проводящая способность бислойной мембраны резко падает. Кроме фотосенсибилизаторов повреждение грамицидиновых каналов можно вызвать, запустив в системе реакцию Фэнтона, в результате которой образуется высокоактивный гидроксильный радикал кислорода (реакция Фэнтона запускается смесью FeS04, аскорбата и третбутилгидропероксида). С помощью этой методики нами были протестированы соединения SkQl, SkQ3 и MitoQ. Как видно из представленных на фигуре За данных фотоактивация фталоцианина с помощью короткой вспышки света приводит к сильному падению проводимости мембраны вследствие повреждения грамицидиновых каналов бислойной мембраны. Падение проводимости мембраны эффективно блокировалось с помощью азида натрия (высокоэффективной ловушки синглентного кислорода), а также при помощи фермента супероксидисмутазы
(катализирует превращение супероксида кислорода в относительно слабоактивный пероксид водорода). Ни азид натрия, ни супероксидисмутаза полностью не предотвращает падение проводимости бислойной мембраны. Этот факт указывает на то, что при фотоактивации фталоцианина происходит генерация как синглентного кислорода, так и супероксида кислорода. SkQl в этой модели был наиболее эффективен, т.е. SkQl является антиоксидантом широкого спектра действия защищающий от различных активных форм кислорода. В другой модели, где повреждение грамицидиновых каналов стимулировали смесью FeS04, аскорбата и третбутилгидропероксида SkQl также был наиболее эффективным, в то время как MitoQ и SkQ3 оказались менее эффективными антиоксидантами (фиг. 36).
Метод, использованный нами для тестирования антиоксидантной способности синтезированных нами соединений, является высоко эффективным и позволяет не только оценить антиоксидантную активность соединений, но и определить специфичность соединения к конкретным активным формам кислорода. В качестве эталонного вещества для этого метода было бы правильно использовать SkQl как наиболее эффективное соединение, проявляющее антиоксидантную активность к широкому спектру активных форм кислорода.
ЭП4. Тестирование антиоксидантного или прооксидантного действия митохондриально- адресованных соединений на изолированные митохондрии.
Существует большое количество методов, где в качестве объекта исследования выступают митохондрии. Нами были подобраны наиболее информативные методики, позволяющие с высокой степенью достоверности определять потенциальную биоактивность митохондриально - адресованных соединений общей формулы (I).
i) Тестирование способности соединений общей формулы (I) накапливаться в митохондриях.
Способность соединений общей формулы (I) накапливаться в митохондриях тестировалось с помощью тетрафенилфосфониевого электрода. Этот метод можно использовать только для соединений общей формулы (I), в которых в качестве адресной группы используется липофильный катион тетрафенилфосфония. С помощью этого
электрода можно измерять распределение тетрафенилфосфониевого катиона (или соединений, в состав которых он входит) между матриксом митохондрий и средой. Как видно на фигуре 4 SkQl накапливается в митохондриях в течение 15-20 минут. Падение мембранного потенциала митохондрий, вызванное с помощью разобщителя окислительного фосфорилирования FCCP, приводит к выходу относительно небольшого количества SkQl из митохондрий. Учитывая, что SkQl является липофильным катионом (распределение октанол : вода для SkQl составляет 20000 : 1) основное количество SkQl накапливается в митохондриальной мембране независимо от степени энергизации митохондрий. Если вместо SkQl использовать менее липофильный SkQ5 то уровень энергонезависимого накопления заметно снижается. Данная методика позволяет исследовать эффективность накопления соединений общей формулы (I) в митохондриях, зависимость скорости их накопления от функционального состояния митохондрий, а также предсказывать потенциальную биодоступность исследуемых соединений.
и) Измерение способности соединений общей формулы (I) восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий.
Ключевым преимуществом митохондриально - адресованных антиоксидантов, предложенных в рамках этого изобретения, является их способность восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий. Для изучения возможности восстановления соединений общей формулы (I) дыхательной цепью митохондрий измеряли скорость изменения соотношения окисленной и восстановленной форм соединений в присутствии субстратов дыхания в среде выделения митохондрий печени крысы. Измерения проводили в присутствии митохондрий. Эксперименты показали, что SkQl способен восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий. Использование различных субстратов окисления показало, что SkQl способен восстанавливаться как комплексом I (митохондрии энергизировали, глутаматом с малатом) так и комплексом II (субстрат окисления сукцинат) (фиг. 5а). Для исключения влияния эндогенных субстратов использовали ингибиторы комплекса I - ротенон, а также ингибитор комплекса II - малонат. Ингибирование комплекса II малонатом на фоне ротенона стимулировало окисление SkQl, вероятно комплексом III. Ингибирование комплекса III миксотиазолом, в свою очередь, препятствовало этому окислению, что подтверждает способность
комплекса III окислять SkQl (фиг.5б). Окисление SkQl комплексом III происходит гораздо медленней, чем его восстановление комплексами I и II (фиг. 56). Полученные данные указывают на то, что в энергизированных митохондриях основное количество SkQl находится в восстановленном состоянии (хинольная форма) в котором проявляется его антиоксидантные свойства.
Таким образом, данная методика позволяет исследовать способность соединений общей формулы (I) восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий, кроме того на основании полученных данных можно предсказывать про- или антиоксидантные свойства тестируемых соединений.
ш) Тестирование антиоксидантной активности соединений общей формулы (I) в условиях окислительного стресса митохондрий вызванного с помощью смеси FeSOb аскорбата.
Одним из широко используемых методов для определения окислительного стресса в митохондриях, в культурах клеток или в тканях, является метод количественного определения малонового диальдегида. Окислительный стресс в этих случаях можно индуцировать различными способами: третбутилгидропероксидом, гидроперекисью Кумола, пероксидом водорода, ксантин/ксантиноксидазой, смесью сульфата железа с аскорбатом калия и др. В своих экспериментах для запуска окислительного стресса мы использовали смесь сульфата железа с аскорбатом калия. Как известно, в процессе метаболизма митохондрии образуют некоторое количества Н202, которое в физиологических условиях не представляет опасности, так как быстро утилизируются различными антиоксидантными системами. Добавление в среду, содержащую митохондрии, сульфат железа в сочетании с аскорбатом калия вызывает реакцию железа с Н202 (реакция Фентона) в результате которой образуется высоко реакционный гидроксил радикал (Fe2+ + Н202 — *· Fe3+ + ·ΟΗ + ΌΗ). В свою очередь, гидроксил радикал взаимодействует с ненасыщенными жирными кислотами мембран и стимулирует их свободно радикальное окисление, в конечном итоге приводящее к накоплению малонового диальдегида. Подобная модель хорошо подходит для изучения эффективности различных антиоксидантов, в том числе и соединений общей формулы (I). На фигуре 6 показаны результаты тестирования антиоксидантного действия SkQl. Как видно, максимальное антиоксидантное действие SkQl проявляется уже в концентрациях
20-50 нМ. Добавление к суспензии митохондрий миксотиазола (ингибитор комплекса III), препятствует окислению SkQ l комплексом III, что заметно повышает антиоксидантную способность SkQl . Полученные данные подтверждают антиоксидантные способности SkQl , и, кроме того, показывают важность способности антиоксидантов восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий.
Таким образом, метод количественного измерения малонового диальдегида позволяет с высокой степенью достоверности предсказывать про- или антиоксидантные свойства исследуемых соединений, а также тестировать их действующие концентрации.
ЭП5. Тестирование антиоксидантного или прооксидантного действия митохондриально-адресованных соединений на культурах животных, растительных, бактериальных или дрожжевых клеток.
Учитывая большое количество разнообразных методов тестирования биологической активности соединений в культуре клеток, в данном разделе будут описаны лишь те методы, которые, благодаря своей простоте и информативности, наиболее подходят для первоначального тестирования соединений общей формулы (I). а. Тестирование действия митохондриально-адресованных соединений на культурах животных клеток.
В качестве модели для тестирования антиоксидантной способности соединений общей формулы (I), нами были выбраны клетки карциномы матки человека линии HeLa, а также нормальные диплоидные фибробласты из кожи и легких человека. Тестирование антиоксидантной способности соединений проводили с помощью методов цитофлуометрии, а также флуоресцентной микроскопии. В предварительных экспериментах для каждой из клеточных культур была подобрана оптимальная концентрация Н202, которая вызывает значительный (60-80%) апоптоз клеток без видимых признаков некроза. Для определения конденсации и фрагментации хроматина, происходящей в клетках при апоптозе, использовали флуоресцентный краситель Hoechst. Краситель в концентрации 1 мкг/мл добавляли в конце инкубации к живым или фиксированным клеткам на 30 минут. Для определения некроза к нефиксированным клеткам добавляли флуоресцентный краситель пропидий иодид (PI) в концентрации 2 мкг/мл. Процент апоптозных и некрозных клеток определяли с помощью подсчета числа
клеток с фрагментированным ядром и клеток, проницаемых для пропидий иодида, соответственно.
В экспериментах с проникающими митохондриально-направленными антиоксидантами необходимо учитывать, что, в зависимости от проникающей способности соединений, время необходимое для их накопления в митохондриях клеток культуры может быть различно.
Так нами было показано, что SkQl и MitoQ повышают устойчивость клеток к Н202 только в случае, если клетки инкубировать с ними в течение 5-7 дней. Разобщитель окислительного фосфорилирования FCCP, вызывающий падение мембранного потенциала митохондрий, препятствовал защитному действию SkQl и MitoQ. Это является важным контролем указывающим на то, что исследуемые соединения действительно являются митохондриально-адресованными. SkQl и MitoQ, являясь митохондриально- адресованными антиоксидантами, проявляют свое действие в чрезвычайно низких концентрациях. Так, SkQl проявляет свое защитное действие уже в концентрации 0,2 нМ (фиг.7). Как видно на фигуре 7 SkQl гораздо более эффективно защищает клетки от гибели по сравнению с MitoQ, т.е. SkQl является более эффективным антиоксидантом. Как и любые антиоксиданты SkQ l и MitoQ имеют предельные концентрации, выше которых проявляется их прооксидантная активность, так при концентрации SkQ 1 и MitoQ выше 0,5 mkM проявляется их прооксидантное действие, что приводит к стимуляции гибели клеток вызванной Н202.
Для измерения уровня окислительного стресса стимулированного Н202, клетки окрашивали флуоресцентным красителем DCF-DA (2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат), после чего измеряли уровень флуоресценции этого красителя с помощью цитофлуориметра. С помощью этого метода показано, что инкубация клеток с SkQl либо MitoQ в течение 1 - 5 часов не препятствовала окислительному стрессу в клетках вызванному Н202. В то же время, обладающий более высокой проникающей способностью SkQRl (в качестве адресной группы вместо тетрафенилфосфония использовался гидрофобный катион - остаток родамина G) уже за эти времена оказывал антиоксидантное действие, причем в более низких, по сравнению с SkQl, концентрациях (фиг. 8 А, Б). SkQl (фиг. 9) как и MitoQ (не показано) проявляли свои антиоксидантные свойства только через 5 - 7 дней инкубации с клетками. Полученные временные зависимости хорошо соотносятся с проникающей способностью SkQRl, SkQl и MitoQ
(проникающие способности этих катионов располагаются в следующей последовательностью: SkQRl > SkQl> MitoQ).
Таким образом, методики, описанные выше, позволяют определять способность соединений общей формулы (I) защищать клетки от гибели вызванной окислительным стрессом. Кроме того, данные методы могут помочь в предсказании терапевтических дозировок и времени приема препаратов на основе соединений общей формулы (I).
Ъ. Тестирование действия митохондриалъно-адресованных соединений на клетках Е. coli.
Для тестирования про- и антиоксидантных свойств митохондриально-адресованных соединений общей формулы (I) был разработан метод определения окислительного стресса в клетка Е. coli. Для этого была создана система биосенсоров на основе генов luxAB, кодирующих бактериальные люциферазы, для изучения воздействия проникающих ионов на окислительный стресс бактериальной клетки. Люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены-репортеры), при биохимических анализах (например, определение микроколичеств АТФ), в генно- инженерных работах (селекция), в биотехнологии и экологии (биосенсоры) и др. Высокая чувствительность, простота детектирования светового сигнала с помощью люминометра или сцинтиляционного счетчика, прямая пропорциональность между количеством фермента-люциферазы и интенсивностью биолюминесценции в пределах нескольких порядков величины, возможность проведения измерений как in vitro, так и in vivo (без разрушения клеток) и ряд других преимуществ определяют применение генов люцифераз в различных генетических и биохимических тестах. В разработанной нами методике использовали гены, кодирующие люциферазу наземных бактерий Photorhabdus luminescens [1]. Грам-отрицательные бактерии Ph. luminescens являются симбионтами энтомопатогенных нематод, Люцифераза из Ph. luminescens характеризуется высокой термостабильностью (активна при температурах до 45°С), что облегчает использование / с-генов в качестве репортеров.
Для тестирования химических примесей (токсикантов) в воде, почве, пищевых продуктах, воздухе и др. /их-биосенсоры в настоящее время используются в двух вариантах:
1) основанном на тушении биолюминесценции токсикантом;
2) основанном на индукции (усилении) интенсивности биолюминесценции токсикантом.
В методиках, принадлежащих первой группе, используется механизм ингибирующего действия ядовитых веществ на метаболизм клетки, в основном, на дыхательную цепь, что опосредованно влияет на люциферазную реакцию, вызывая ослабление интенсивности биолюминесценции суспензии клеток.
Ко второй группе методик, основанных на индукции (усилении) биолюминесценции клеток при воздействии токсиканта, относятся различные варианты использования специфических регуляторных элементов, выработанных бактериями в процессе эволюции и специфически реагирующими на наличие в среде того или другого химического вещества. Данная группа биосенсоров характеризуются как специфичностью, так и высокой чувствительностью, т.к. определяется особенностью взаимодействия белка- рецептора (репрессора или активатора) с химическим соединением. У бактерий можно выделить регуляторные системы, специфически реагирующие на токсиканты, действующие на: 1) клеточные мембраны, 2) белки, 3) хромосому (ДНК), а также 4) индуцирующие в клетке окислительный стресс. Кроме того, бактерии имеют регуляторные системы, специфично реагирующие на тяжелые металлы и на ионы мышьяка. В качестве биосенсора на токсиканты, действующие на клеточные белки (например, различные фенольные производные, спирты), может быть использован промотор grpE: PgrpE- Этот промотор в бактериальном геноме расположен перед генами «теплового шока» и активируется лишь при появлении в клетке модифицированных, денатурированных белков. В роли биосенсора на ДНК-тропные агенты (митомицин С, метилметансульфонат, диоксины, а также ультрафиолетовое и ионизирующее излучение) используется SOS-промотор РгесА- Репрессором является белок LexA. Промотор РгеСА активируется лишь при индукции повреждений в геноме, т.е в молекулах ДНК. Для детекции веществ, индуцирующих в клетке окислительный стресс (образующих в клетке гидроксильный радикал (ОН ), супероксид-ион-радикал (02 ~), перекись водорода (Н202)) используются промоторы Pka,G и Psoxs- Промотор Pkato (активатор OxyR) специфически реагирует на перекись водорода, органические пероксиды и др. Промотор Psoxs активируется при появлении в среде супероксид-ион-радикала. На основе вышеописанных, индуцируемых промоторах были сконструированы / с-биосенсоры.
Все промоторы, используемые в разработанной нами методике, с соответствующими регуляторными участками, были получены из генома бактерий Escherichia coli К12 MG1655 с помощью метода PCR с использованием специальных, синтезированных праймеров. В качестве вектора использовали беспромоторный вектор с репликоном pBR322 и геном Ыа, определяющим резистентность к ампициллину (селективный маркер). Встраивание промоторной области в плазмиду проводили по сайтам EcoRl- BamHl. В качестве /ux-кассеты нами был выбран /ю оперон Ph. luminescens, состоящий из пяти генов, /шсСБАВЕ.
Все полученные биосенсоры тестировались на пригодность для работы с митохондриально-направленными антиоксидантами общей формулы (I).
Как выяснилось митохондриально-направленные антиоксиданты общей формулы (I), в частности SkQl и MitoQ, по всей видимости, обладают высокой специфичностью к биосенсорам, так или иначе связанным с окислительным стрессом, так как имеют в своей структуре производные хинонов и с высокой эффективностью накапливаются в заряженных мембранах. Поэтому оптимальным представляется использование pLUX::PkatG и pLUX::PsoxS биосенсоров. Фиксация повреждений ДНК при окислительном стрессе и влияние проникающих ионов на этот процесс возможна при использовании pLUX::PrecA биосенсора. pLUX::PgrpE и pLUX::Plac биосенсоры, по видимому, будут использоваться как положительный и отрицательный контроли.
На первом этапе тестирования были подобраны условия индукции окислительного стресса, при котором происходит максимальная индукция люминесценции. Так, на фигуре 10 показана способность Н202 и параквата индуцировать биолюминесценцию биосенсора. Индукция люминесценции Е. coli MG1655 pLUX::PkatG в присутствие Н202 становится заметной в течение 15 минут и достигает максимальных значений за час (фиг 10А). Соотношение интенсивности люминесценции контрольных клеток к индуцированным составляет при оптимальных концентрациях Н202 1/80. Индукция люминесценции Е. coli MG1655 pLUX::PsoxS в присутствие параквата становится заметной в течение 15-20 минут и достигает максимальных значений за два часа (фиг 10Б). Соотношение интенсивности люминесценции контрольных клеток к индуцированным составляет при оптимальных концентрациях параквата 1/100.
На следующим этапе уже возможно тестировать про- или антиоксидантные способности соединений общей формулы (I). При помощи биосенсоров pLUX::PkatG и
pLUX::PsoxS были проверены антиоксидантные свойства SkQ в условиях окислительного стресса Е. coli. Показано, что 10 мкМ SkQ эффективно спасает клетку от супероксид анион радикалов появляющихся в результате окислительного стресса вызванного перекисью водорода, при этом указанная концентрации SkQ не оказывала заметного влияния на окислительный стресс вызванный паракватом (фиг.11). Причины подобного расхождения могут заключатся в различных способах генерации АФ пероксидом водорода и параквата. Если в случае пероксида водорода, мы индуцируем окислительный стресс на непродолжительное время (Н202 активно разлагается ферментами антиоксидантной защиты клетки), то в случае параквата окислительный стресс длится гораздо дольше. Кроме того, показано, что в клетках Е. coli активно работает система множественной лекарственной устойчивости (MDR), занимающаяся откачиванием положительных катионов из клетки. Работа этих ферментов резко снижает эффективность SkQl и его аналогов. Таким образом, если в случае Н202 SkQl успевает защитить клетки от окислительного стресса до того как белки MDR выкачают его из клетки, то в случае параквата SkQl становится не эффективным.
Полученные результаты показали, что разработанный тест-метод является надежным и быстрым инструментом для тестирования про- или антиоксидантной способности соединений общей формулы (I).
ЭП6. Тестирование биологической активности соединений общей формулы (I) in vivo на животных и растениях.
Тестирование соединений общей формулы (I) in vivo на животных или растениях может быть применено только к тем соединениям, которые прошли все предыдущие тесты раздела и для которых показана потенциальная биологическая активность. Это связано с тем, что для подготовки опытов in vivo необходимо обладать полной информацией о потенциальных мишенях действия препарата, что необходимо для разработки модели, на которой стоит работать исследователю для получения наиболее информативных результатов. Для опытов in vivo на стадии предварительного отбора следует использовать наиболее простые методы позволяющие судить о принципиальной возможности препаратов оказывать биологически активное действие. Для этих целей в качестве модельного объекта могут быть применены мелкие беспозвоночные животные, типа рачков Ceriodaphnia affinis. Подобные объекты, в частности - организмы зоопланктона, служат популярным тест - объектом при оценках загрязненности среды,
исследованиях биологического действия вытяжек из материалов, из кормовых продуктов, препаратов медицинского назначения. В подавляющем числе применений оценки проводятся в кратковременных опытах с учетом выживаемости, поведения тест - объектов и нарушения некоторых физиологических функций. Для выявления эффектов слабых воздействий в хроническом режиме контролируются, помимо указанных, такие интегральные индивидуальные показатели, как рост и размножение.
При количественных оценках действия химических агентов на тест - объекты в хроническом режиме проявляется феномен, называемый «фазностью» токсического эффекта, т.е. чередование угнетения и стимуляции активности биологической функции или развития структурного элемента при действии потенциально токсичных веществ. В итоге многие потенциальные токсиканты при некоторых концентрациях могут оказывать временный стимулирующий эффект на отдельные функции и на тест-объект в целом. Таким образом, важным критерием благоприятного действия препаратов является полная продолжительность жизни организмов, т.к. в этом случае можно исключить опасность попасть в благоприятную фазу препарата являющегося на самом деле токсичным.
Было исследовано влияние препарата SkQl в разных концентрациях на основные жизненные функции рачков Ceriodaphnia affinis на протяжении естественной длительности их жизни с особым вниманием к стимулирующему действию препарата.
В первой серии опытов (численность животных в каждой серии составляла 20 особей) выживаемость рачков в присутствии этанола (0,79 мг/л) практически не отличалась от контрольной (фиг. 4). В концентрациях 5,5 и 0,55 нМ SkQl выживаемость рачков была выше контрольной, а в концентрации 55 нМ - ниже. Срок гибели фиксированной доли рачков в концентрациях SkQl 0,55 и 5,5 нМ был повышен весь период наблюдения, а срок гибели 50% превышал показатель в контроле в 2 и 1,4 раза, соответственно (таблица 1).
Таблица 1. Сроки (в сутках) фиксированных величин гибели Ceriodaphnia при действии препарата SkQ 1
Концентрации LT2s% LTso% LT75o/„
Контроль 16 18 29
Этанол, 0,79 мг/л 14 18 25
0,55 нМ 22 36 45
5,5 нМ 18 26 46
55 нМ 9 12 17
Средняя продолжительность жизни рачков в концентрациях 0,55 и 5,5 нМ была выше, чем в контроле, в концентрации 55 нМ - ниже, эти различия статистически достоверны (таблица 2).
Таблица 2. Средняя продолжительность жизни Ceriodaphnia affinis при действии п епа ата SkQl
*- отличие статистически достоверно
Таким образом, полученные результаты указывают на способность SkQl оказывать благотворное влияние на жизнедеятельность мелких беспозвоночных, что выражается в увеличении продолжительности их жизни. Кроме того, были подобраны концентрации соединения оказывающего благоприятное действие на организм, что может быть применено в опытах по тестированию биологической активности исследуемых препаратов общей формулы (I) на высших животных.
ЭП7. Метод очистки мнтохондриально-адресованного антиоксиданта с использованием «молекулярной ловушки»
1. Исходный технический продукт ПДТФ (5 г) после предварительной очистки на силикагеле в системе этанол-хлороформ (1 :9) имеет чистоту около 85%. Содержание восстановленной формы 8 %.
Для очистки от основной массы примесей использован метод ВЭЖХ. Колонка С]8, 500x45 мм. Подвижная фаза - бессолевой безбуферный водно-этанольный раствор. Режим градиентный. Система А - 15% этанола, система Б - 40 % этанола.
После отбора центральных фракций чистота препарата составляет около 92%. Содержание восстановленной формы 6%.
Сравнительная качественная реакция на бромиды исходного и очищенного продукта показывает сохранение иона брома после хроматографической очистки.
Аналитическая ВЭЖХ на колонке Ci8, 250x4,6 мм в системе 0,05% трифторуксусной кислоты в 65% ацетонитрила в воде также демонстрирует примерно одинаковую интенсивность пика иона брома ( в начале хромато граммы) для исходного и очищенного продукта.
2. Продукт после очистки методом ВЭЖХ (3,8 г), отгона растворителя и сушки в высоком вакууме имеет вид густого прозрачного масла темно-коричневого цвета. Для минимизации содержания восстановленной формы в препарате использован один из вариантов метода «молекулярной ловушки».
В колбу с маслом приливают 200 мл гексана, добавляют 5 мл ацетона и массу интенсивно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин. После этого осторожно декантируют слой растворителя. Производят хроматографический контроль слитой порции растворителя и оставшегося масла. На ВЭЖХ растворителя кроме небольшого пика ацетона есть только интенсивный пик восстановленной формы; основная окисленная форма отсутствует.
На хроматограмме целевого продукта хорошо видно уменьшение содержания восстановленной формы.
Для дальнейшей минимизации содержания восстановленной формы может потребоваться повторение данной процедуры несколько раз.
Возможно проведение этой процедуры в автоматическом режиме с непрерывной подачей свежей порции растворителя и сливом отработанного раствора.
Важно отметить, что при проведении данной методики совершенно отсутствуют потери основного вещества. Бром-ион сохраняется.
Чистота получаемого продукта составляет около 97%. Доля восстановленной формы - не более 1 ,0%.
2. Гель-хроматография в растворе этанола.
Данный способ очистки удобен как финальная стадия перед дозированным розливом концентрированного раствора препарата, сушки и постановки на хранение.
Около 3,7 г препарата растворяют в 5-6 мл этанола и хроматогафируют на колонке 600x 10 мм с сефадексом LH-20, предварительно уравновешенной абсолютным этанолом для спектрофотометрии.
Отбрасывают головные и хвостовые фракции. Чистота основной фракции - не менее 98%. Доля восстановленной формы - 0,8-0,9%. Концентрация препарата может
достигать 150-200 мг/мл. С таким раствором удобно производить дозированный розлив и сушку готовой субстанции.
ЭП8. Синтез пластохинонилдецилтрифенилфосфония (ПДТФ) бро ида
Синтез включает в себя следующие стадии:
1. Окисление 2,3-диметилфенола (1) в 2,3-диметил-1 ,4-бензохинон (2) реактивом Джонса;
2. Присоединение 1 1-бромундекановой кислоты (3) к трифенилфосфину с образованием бромида (Ю-карбоксидецил)трифенилфосфина (4)
3. Образование целевого соединения (5) в результате реакции полученного соединения (4) с 2,3-диметил-1,4-бензохиноном (2) в присутствии нитрата серебра и персульфата аммония.
Схема синтеза приведена на фигуре 2.
Синтез 2,3-диметил-1,4-бензохинона (2)
К раствору 20 г (0.16 моль) 2,3 диметилфенола в 230 мл эфира и перемешивании добавили реактив Джонса (раствор 1 10 г (0.37 моль) Na2Cr207 х 2Н20 в смеси 157 мл воды и 70 мл конц. серной кислоты) и перемешивали смесь в течение 24 час. Экстрагировали смесь эфиром, объединенные эфирные вытяжки промывали, а затем сушили прокаленным сульфатом магния, и после удаления растворителя на роторном испарителе остаток подвергали флаш-хроматографии на силикагеле в хлороформе. Выход соединения 2 в виде желтого кристаллического вещества 8.7 г (40%).
ТСХ: Rf (CHCb) = 0.46; HPLC: τ = 17.4 min (0-90 % В for 26.4 min; A: 10 mM H3P04, B: AcCN), m.p.58 °C (56.5-57.5 °С)'; UV (CH3OH): max 209 nm, 256 nm, 344 nm; ESI MS: m/z вычислено для C8H802 136.15; найдено 136.2.
Синтез бромида (Ю-карбоксидецил)трифенилфосфина (4)
К 530 мг (2 ммоль) 1 1-бромундекановой кислоты добавили 588 мг (2.24 ммоль) трифенилфосфина и выдерживали смесь в запаянной ампуле при температуре 85 °С в течение 12 час. После этого смесь подвергли разделению на колонке с силикагелем в
системе хлороформ - метанол (9: 1). Выход соединения 4 в виде прозрачного масла 895 мг (85%).
ТСХ: Rf 0.52 (хлороформ - метанол, 4: 1); ВЭЖХ: τ = 7.28 мин (5 - 95% В за 1 1.5 мин; А: 0.1% водная ТФУ; В: 0.1% ТФУ в ацетонитриле); УФ спектр (0.1% ТФУ - ацетонитрил, 38:62):
200 нм, 224 нм, 268 нм; ESI MS: вычислено для С29Н3бОР: 447.6; найдено m/z 448.2 (МН+; 100%).
Синтез [10-(4,5-диметил-3,6-диоксоци логекса-1,4-диен-1-ил)децил]- трифенилфосфониум бромида, ПДТФ бромида (5)
К раствору 135 мг (1ммоль) 2, 526 мг (1ммоль) 4 и 85 мг (0,5 ммоля) азотнокислого серебра в 40 мл смеси ацетонитрила и воды (1 : 1) при температуре 80-90о С добавляли раствор 228 мг (1 ммоль) персульфата аммония в 5 мл воды. Нагревали с перемешиванием при той же температуре 12 час. Смесь разбавляли водой и экстрагировали дихлорметаном. После упаривания дихлорметана до небольшого объема продукт осаждали диэтиловым эфиром. Раствор с осадка декантировали, осадок переосаждали несколько раз. В конце осадок очищали на колонке силикагеля в смеси дихлорметан - этанол (в соотношении 9: 1) Выход [10-(4,5-диметил-3,6-диоксоциклогекса- 1,4-диен-1-ил)децил]-трифенилфосфониум бромида,( ПДТФ бромида) 35%.
ТСХ: Rf (СНС13 - СНЗОН, 4: 1) = 0.66; HPLC: τ = 10.1 min (5-95 % В for 12 min; А: 0.05% TFA, В: 0.05% TFA in AcCN); UV (СНЗОН): ληΐ3χ 198 nm, 226 nm, 260 nm (ε260= 18652 cm-l*M-l), 352 nm; ESI MS: m/z calcd. for СэбН^ОгР 537.69; found 537.3.
ЭП9. Синтез митохондриально адресованных соединений - перспективных митохондриально адресованных антиоксидантов.
Структуры бербериновых и пальматиновых производных SkQ:
Схема синтеза 9, 10-диметокси- 13-[7-(4,5-диметил-3,6-диоксоциклогекса- 1 ,4-диен--ил)гептилоксикарбонил-метил]-5,6-дигидробензоИ-1,3-бензодиоксоло[5,6-
а]хинолизиниум бромида, 1 (бромида 13-[7-(4,5-диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен- 1-ил)гептилоксикарбонил-метил]берберина)
KBS
Аналогичным образом получали соединения 2 - 4. Характеристики полученных соединений.
13-[7-(4,5-Диметил-3,6-диоксоциклогекса- 1 ,4-диен- 1 -ил)гептилоксикарбонил- метил]берберин: ТСХ: Rf (хлороформ - метанол, 65: 10) = 0,16; Rf (хлороформ - метанол, 4: 1) - 0,39. ВЭЖХ: τ = 8,98 мин (5-95% В за 11 мин; А: 0,05% TFA В: 0,05% TFA в MeCN; Luna С18(2)' 0,46 х 15 см, 5мкм, 1 мл/мин). УФ (этанол): ληΐ3χ 262 нм, 350 нм (ε350= 23850 cm'^M'1), 430 нм (ε430= 5278 cm-l*M-l). ESI MS: m/z рассчитано для C37H4oN08 626,72; найдено 626,69.
13-[7-(4,5-Диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1-ил)гептилоксикарбонил- метил]пальматин: ТСХ: Rf (хлороформ - метанол, 65:10) = 0,16; Rf (хлороформ - метанол,
4: 1) = 0,39. УФ (этанол): Лтах 262 нм, 350 нм, 430 нм. ESI MS: m/z рассчитано для C38H44N08 642,76; найдено 642,29.
13-[4-(4,5-Диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1 -ил)бутилоксикарбонил- метил]берберин: ТСХ: R (хлороформ - метанол, 65: 10) = 0,23; Rf (хлороформ - метанол, 4: 1) = 0,39. ВЭЖХ: τ = 7,71 мин (5-95 % В за 1 1 мин; А: 0,05% TFA В: 0,05% TFA в MeCN; Luna С 18(2)' 0,46 х 15 см, 5мкм, 1 мл/мин). УФ (этанол): тах 262 нм, 350 нм, 430 нм. ESI MS: m/z рассчитано для C 4H34N08 584,64; найдено 584,22.
13-[4-(4,5-Диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1-ил)бутилоксикарбонил- метил]пальматин : ТСХ: Rf (хлороформ - метанол, 65: 10) = 0,23; Rf (хлороформ - метанол, 4: 1) = 0,39. ВЭЖХ: τ = 7,73 мин (5-95 % В за 1 1 мин; А: 0,05% TFA В: 0,05% TFA в MeCN; Luna С18(2)' 0,46 х 15 см, 5м м, 1 мл/мин). УФ (этанол): Хтах 262 нм, 350 нм, 430 нм. ESI MS: m/z рассчитано для C35H38N08 600,68; найдено 600,87.
Claims
1. Способ отбора митохондриально-адресованных соединений - антиоксидантов или прооксидантов, общей формулы (I) 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии, и где
«А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (И)
(И)
и/или его восстановленную форму
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
(III)
и/или ее восстановленную форму
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой: а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z"
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме;
при этом Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло- органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
включающий в себя следующие стадии:
a) конструирование структуры соединения на основе предварительного прогоноза свойств митохондриально-адресованных антиоксидантовт
b) синтез соединения, соответствующего указанной структурной формуле или выделение и очистка соединения, соответствующего указанной структурной формуле в случае если оно или его близкий аналог существуют в природе.
c) тестирование биологического активности соединения при помощи набора тестов, включающего в себя один и/или более тестов, выбранных из:
i) тестирование окислительно-восстановительных свойств и стабильности соединений общей формулы (I) in vitro;
ii) тестирование проникающей способности митохондриально-адресованных соединений на искусственной «черной» мембране;
iii) тестирование защитного или повреждающего действия митохондриально- адресованных соединений на мембранные липиды и белки на бесклеточной модельной системе;
iv) тестирование антиоксидантного или прооксидантного действия митохондриально-адресованных соединений на изолированные митохондрии; v) тестирование антиоксидантного или прооксидантного действия митохондриально-адресованных соединений на культурах животных, растительных, бактериальных или грибковых клеток;
vi) тестирование антиапоптозного, или антинекротического, или проапоптозного, или пронекротического, или антиоксидантного, или прооксидантного действия митохондриально-адресованных соединений на культурах клеток;
vii) тестирование накопления митохондриально-адресованных соединений внутри клеток;
viii) тестирование митохондриально-адресованных соединений на их способность активировать или подавлять желаемые метаболические пути, что проявляется в активации работы генов на уровне транскрипции, стабильности мРНК или трансляции, на уровне модификаций белков, включающих в себя, в частности, фосфорилирование или дефосфорилирование, протеолиз, гликозилирование, карбонилирование и других изменений активности белков или белковых комлексов, причем активация или подавление метаболических путей может также проявляться в изменении иных физиологических параметров клетки, в том числе: изменение скорости дыхания, изменение скорости продукции метаболитов, изменении скорости потребления субстратов, изменении мембранного потенциала на наружной мембране, на митохондриальной мембране или мембранах иных органелл, изменении ионной проводимости одной или нескольких из вышеперечисленных мембран, изменении концентраций ионов, включая изменение рН в цитоплазме клетки или в других компартментах клетки, изменении во внутриклеточном транспорте биомолекул, везикул и органелл, изменении в ходе клеточного цикла, изменении, приводящему к делению клеток, к трансформации клеток, к гибели клеток или, наоборот, к их выживанию;
ix) тестирование биологической активности соединений общей формулы (I) in vivo на животных или растениях, в том числе тестирование соединений на моделях заболеваний.
d) интерпретация результатов тестирования соединений и отбор наиболее перспективных соединений, соответствующих требуемым параметрам.
e) отбор искомых митохондриально-адресованных антиоксидантов или прооксидантов.
2. Комбинаторная библиотека, представляющая собой набор из более, чем одного митохондриально-адресованного соединения, соответствующего общей формуле
(I)· 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; и где
«А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (II) 
(И)
и/или его восстановленную форму
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
и/или ее восстановленную форму
где R и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z"
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион; б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме;
При этом, Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
3. Способ по п. 1 , для анализа комбинаторной библиотеки соединений, охарактеризованной в п. 2.
4. Отобранные или сконструированные с использованием способа по п.п. 1 или 3 митохондриально-адресованные антиоксиданты с заданным соотношением про- и антиоксидантных свойств и описываемые общей формулой (I) 
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии и где «А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (II)
(И)
и/или его восстановленную форму
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
(III)
и/или ее восстановленную форму
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой: а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z_
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме
При этом, Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло- органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
включая, SkQBl, SkQBIA, SkQBIB, SkQBPl, SkQB5, SkQBP5 а также ИХ фармацевтически приемлемые соли.
5. Отобранные или сконструированные с использованием способа по п. п. 1 или 3 митохондриально-адресованные прооксиданты с заданным соотношением про- и антиоксидантных свойств и описываемые общей формулой (I) 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии и где «А» может представлять собой прооксидант общей формулы (П)
(И)
и/или его восстановленную форму
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
(III)
и/или ее восстановленную форму
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси, и где А предпочтительно представляет собой дезметоксиубихинон или ионол, имеющими структуры: 
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z"
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме, при этом Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
включенную в состав соединения формулы (I) через участки, обозначенные Rl, R2, R3 или R4, а оставшиеся заместители Rl, R2, R3 или R4 могут быть отобраны в соответствии с требованиями, предъявляемыми к свойствам всего соединения, напримерд для того чтобы увеличить или уменьшить гидрофобность всей молекулы; Ме+ означает ион металла, предпочтительно, Mn, Fe, Со, Си, Mg ИЛИ Zn.
6. Способ получения митохондриально-адресованных антиоксидантов общей формулы (I) 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии и где «А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (II)
(П) и/или его восстановленную форму
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой ким образом, что образуют структуру (III):
(III)
и/или ее восстановленную форму
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z"
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме; при этом, Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
включенную в состав соединения формулы (I) через участки, обозначенные Rb R2, R3 или R4, а оставшиеся заместители Rj, R2, R3 или R4 могут быть отобраны в соответствии с требованиями, предъявляемыми к свойствам всего соединения, например^ для того чтобы увеличить или уменьшить гидрофобность всей молекулы; Ме+ означает ион металла, предпочтительно, Mn, Fe, Со, Си, Mg ИЛИ
Zn,
включающий в себя процесс синтеза митохондриально-адресованного антиоксиданта, при условии, что этот процесс включает в себя, по меньшей мере, одну из следующих стадий: а) получение 2,3-диметил-1,4-бензохинона из доступных компонентов, в частности, из 2,3-диметилфенола;
б) получение липофильного катиона, соединенного с линкерной группой, предпочтительно получение карбоксиалкильного производного липофильного катиона, особенно предпочтительно 10-карбоксидецилтрифенил-фосфония.
7. Способ очистки митохондриально-адресованного антиоксиданта общей формулой (I) 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; и где «А» может представлять собой антиоксидант формулы (II)
(П)
и/или его восстановленную форму,
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
(III)
и/или ее восстановленную форму
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z"
где Sk - липофильный катион; Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме; при этом, Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, например, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
включающий в себя, по меньшей мере, одну из следующих стадий:
а) очистка при помощи градиентной обращенно-фазовой хроматографии в бессолевой безбуферной системе подвижной фазы,
б) очистка при помощи гель-фильтрационной хроматографии в этаноле,
в) очистка от окисленной формы митохондриально-адресованного антиоксиданта, г) очистка от восстановленной формы митохондриально-адресованного антиоксиданта, предпочтительно с использованием «молекулярной ловушки» восстановленной формы митохондриально-адресованного антиоксиданта вышеприведенной общей формулы, где под молекулярной ловушкой понимается соединение с кето- или хиноно-подобной группировкой, обладающее окислительно-индукционным потенциалом, предпочтительно, не менее 0,2 В при нейтральных значениях рН и предпочтительно хорошо растворимое в инертном растворителе, предпочтительно в гептане или гексане.
8. Молекулярная ловушка восстановленной формы митохондриально- адресованного антиоксиданта, представляющая собой соединение с кето- или хиноно- подобной группировкой, обладающее окислительно-индукционным потенциалом, предпочтительно не менее 0,2 В при нейтральных значениях рН и предпочтительно хорошо растворимое в инертном растворителе, предпочтительно в гептане или гексане, и при этом позволяющее очищать синтезированный митохондриально-адресованный антиоксидант от восстановленной формы.
9. Способ получения митохондриально-адресованных антиоксидантов общей формулы (I) 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; «А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (И)
(П)
и/или его восстановленную форму,
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III): 
(III) и/или ее восстановленную форму
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z~
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме; при этом Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
включенную в состав соединения формулы (I) через участки, обозначенные Ri, R.2, R3 или R4, а оставшиеся заместители Ri, R2, R3 или R4 могут быть отобраны в соответствии с требованиями, предъявляемыми к свойствам всего соединения, например, для того чтобы увеличить или уменьшить гидрофобность всей молекулы; Ме+ означает ион металла, предпочтительно, Mn, Fe, Со, Си, Mg ИЛИ
Zn;
в форме фармацевтической субстанции лекарственных препаратов, включающий в себя один из способов по п. п. 6 и 7.
10. Фармацевтическая субстанция на основе митохондриально-адресованного антиоксиданта общей формулы (I) 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; и где «А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (II)
и/или его восстановленную форму,
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
(III)
и/или ее восстановленную форму
где R\ и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z- где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион; б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме; при этом Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
в которой соотношение окисленной и восстановленной форм, находится в диапазоне от 0,2% до 99,8% окисленной формы и в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение всего срока годности при соблюдении установленных условий хранения.
11. Фармацевтическая субстанция по п. 10, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм находится в диапазоне более предпочтительно от 50% до 99,5% окисленной формы.
12. Фармацевтическая субстанция по п. 12, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм находится в диапазоне более предпочтительно от 97,5% до 99,5% окисленной формы.
13. Фармацевтическая субстанция по п. п. 10-12, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение не менее 1 мес.
14. Фармацевтическая субстанция по п. п. 10-12, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение не менее 6 мес.
15. Фармацевтическая субстанция по п. п. 10-12, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение не менее 2-х лет.
16. Фармацевтическая субстанция, представляющая собой соединение общей формулы (I) 
(I)
где «А» - эффекторная группа; «L» - линкерная группа, п - целое число 1 - 20; «В» - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; и где «А» может представлять собой антиоксидант общей формулы (II)
(П)
и/или его восстановленную форму,
где m - целое число 0 - 3; Y - одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси; или два вицинальных Y связаны между собой таким образом, что образуют структуру (III):
где Ri и R2 одинаковые или разные заместители, представляющие собой низший алкил или низший алкокси;
«L» - линкерное звено, представляющее собой:
а) либо простую или разветвленную углеводородную цепь, при необходимости, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и при необходимости, замещенную одним или более заместителем, предпочтительно являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кето-группой, амино-группой;
б) либо природную изопреноидную цепь;
«В» - представляет собой:
а) либо Скулачев-ион Sk:
Sk+ Z"
где Sk - липофильный катион;
Z - фармацевтически приемлемый анион;
б) либо амфифильный цвиттер-ион, способный проникать внутрь митохондрий в своей катионной форме; при этом Sk+ в составе «В» может представлять собой липофильное металло-органическое соединение, в частности, липофильный металлопорфирин, предпочтительно имеющий структуру:
включенную в состав соединения формулы (I) через участки, обозначенные Ri, R2, R3 или R^ а оставшиеся заместители Ri, R2, R3 или R4 могут быть отобраны в соответствии с требованиями, предъявляемыми к свойствам всего соединения, например, для того чтобы увеличить или уменьшить гидрофобность всей молекулы; Ме+ означает ион металла, предпочтительною Mn, Fe, Со, Си, Mg или Zn;
полученное с использованием, по крайней мере одного из способов по п.п. 1, 3, 6, 7, 9 и отвечающее требованиям фармакопеи.
Priority Applications (15)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201200604A EA023248B1 (ru) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов |
| EP09851317A EP2500336A1 (en) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Pharmaceutical substances on the basis of mitochondrially addressed antioxidants |
| BR112012011197-3A BR112012011197A2 (pt) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | subtâncias farmacêuticas com base em antioxidantes direcionados à mitocôndria |
| PCT/RU2009/000621 WO2011059355A1 (ru) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов |
| CN2009801624014A CN102791670A (zh) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | 基于定向于线粒体的抗氧化剂的药物物质 |
| KR1020127015205A KR20120125980A (ko) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | 미토콘드리아 표적화된 항산화제에 기초한 약학적 물질 |
| JP2012538785A JP2013510849A (ja) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | ミトコンドリアアドレス型抗酸化剤をベースとする医薬物質 |
| AU2009355359A AU2009355359B2 (en) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Pharmaceutical substances on the basis of mitochondrially addressed antioxidants |
| MX2012005356A MX2012005356A (es) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Substancias farmaceuticas basadas en antioxidantes dirigidos a mitocondria. |
| CA2789846A CA2789846C (en) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Pharmaceutical substances on the basis of mitochondria-addressed antioxidants |
| UAA201207236A UA107476C2 (ru) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Фармацевтическая субстанция на основе митохондриально-адресованных соединений |
| CA3068007A CA3068007C (en) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Pharmaceutical substances on the basis of mitochondria-addressed antioxidants |
| IL219533A IL219533A (en) | 2009-11-13 | 2012-05-02 | Mitochondrial-oriented antioxidant-based pharmaceuticals |
| ZA2012/03345A ZA201203345B (en) | 2009-11-13 | 2012-05-07 | Pharmaceutical substances on the basis of mitochondrially addressed antioxidants |
| US13/470,823 US9233903B2 (en) | 2009-11-13 | 2012-05-14 | Pharmaceutical substances on the basis of mitochondria-addressed antioxidants |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2009/000621 WO2011059355A1 (ru) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| US13/470,823 Continuation-In-Part US9233903B2 (en) | 2009-11-13 | 2012-05-14 | Pharmaceutical substances on the basis of mitochondria-addressed antioxidants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2011059355A1 true WO2011059355A1 (ru) | 2011-05-19 |
Family
ID=43991821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2009/000621 WO2011059355A1 (ru) | 2009-11-13 | 2009-11-13 | Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9233903B2 (ru) |
| EP (1) | EP2500336A1 (ru) |
| JP (1) | JP2013510849A (ru) |
| KR (1) | KR20120125980A (ru) |
| CN (1) | CN102791670A (ru) |
| AU (1) | AU2009355359B2 (ru) |
| BR (1) | BR112012011197A2 (ru) |
| CA (2) | CA2789846C (ru) |
| EA (1) | EA023248B1 (ru) |
| IL (1) | IL219533A (ru) |
| MX (1) | MX2012005356A (ru) |
| UA (1) | UA107476C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011059355A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201203345B (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015063553A2 (en) | 2013-04-11 | 2015-05-07 | Mitotech S.A. | Mitochondrially-targeted timoquinones and toluquinones |
| WO2019002936A2 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Mitotech S.A. | SET OF COMPOUNDS TARGETING MITOCHONDRIA |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6448366B2 (ja) * | 2011-06-03 | 2019-01-09 | ミトテック ソシエテ アノニム | ミトコンドリアを標的とする抗酸化剤の経口製剤ならびにそれらの調製および使用 |
| CN109232219A (zh) * | 2018-11-11 | 2019-01-18 | 苏州怡彼得生物技术有限公司 | 一种线粒体靶向抗氧化剂skq1中间体2,3-二甲基-对苯醌的合成方法 |
| CN109232216A (zh) * | 2018-11-11 | 2019-01-18 | 苏州怡彼得生物技术有限公司 | 一种线粒体靶向抗氧化剂skq1二季膦盐衍生物的合成方法 |
| CN109900652B (zh) * | 2019-04-29 | 2021-06-04 | 北京普赞生物技术有限公司 | 一种食品中双乙酸钠的快速检测方法 |
| KR102527406B1 (ko) | 2021-01-15 | 2023-04-28 | 아주대학교산학협력단 | 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR102410556B1 (ko) | 2020-01-16 | 2022-06-20 | 아주대학교산학협력단 | 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 |
| EP4210695A1 (en) | 2020-09-09 | 2023-07-19 | Social Profit Network | Methods and compositions for delivery of biotin to mitochondria |
| WO2023220365A1 (en) * | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Mitochondrial antioxidant treatment for cask-linked neurodevelopmental disorders |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1047701A1 (en) | 1997-11-25 | 2000-11-02 | The University of Otago | Mitochondrially targeted antioxidants |
| US6331532B1 (en) | 1998-11-25 | 2001-12-18 | University Of Otago | Mitochondrially targeted antioxidants |
| EP1534720A1 (en) | 2002-08-12 | 2005-06-01 | Medical Research Council | Mitochondrially targeted antioxidants |
| WO2007046729A1 (en) | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Limited Liability Company 'mitotechnology' | Method of acting upon organism by targeted delivery of biologicaly active substances into m itochondria, pharmaceutical composition for carrying out said method, and compound used for the purpose |
| WO2008094062A1 (fr) * | 2007-01-29 | 2008-08-07 | Limited Liability Company 'mitotechnology' | Compositions pharmaceutiques servant à la prévention et au traitement de maladies oncologiques |
| WO2009005386A1 (fr) | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Limited Liability Company 'mitotechnology' | Utilisation de compositions à adressage mitochondrial dans la prévention et le traitement de maldies cardio-vasculaires |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5538974A (en) | 1994-01-27 | 1996-07-23 | Senju Pharamceutical Co., Ltd. | Ophthalmic composition for lowering intraocular pressure |
| US20080275005A1 (en) | 1998-11-25 | 2008-11-06 | Murphy Michael P | Mitochondrially targeted antioxidants |
| US20070270381A1 (en) | 2000-05-25 | 2007-11-22 | Antipodean Pharmaceuticals, Inc. | Mitochondrially targeted antioxidants |
| US20020044913A1 (en) | 2000-02-11 | 2002-04-18 | Hamilton Nathan D. | Cosmetics to support skin metabolism |
| ITRM20010755A1 (it) | 2001-12-20 | 2003-06-20 | Simonelli Giuseppe | Uso del chinone q10 per il trattamento delle malattie oculari. |
| CA2580584C (en) | 2003-09-19 | 2015-07-28 | Galileo Pharmaceuticals, Inc. | Use of alpha-tocotrienol for treatment of mitochondrial diseases |
| WO2006005759A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-19 | Oridis Biomed Forschungs- Und Entwicklungs Gmbh | Mitochondrially targeted antioxidants in the treatment of liver diseases and epithelial cancers |
| RU2007111720A (ru) | 2004-08-30 | 2008-10-10 | Канека Корпорейшн (Jp) | Активаторы митохондрий |
| EA200900582A1 (ru) | 2006-10-20 | 2009-08-28 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Митотехнология" | Фармацевтические композиции для профилактики и лечения глазных патологий |
| US8716486B2 (en) | 2008-06-25 | 2014-05-06 | Edison Pharmaceuticals, Inc. | 2-heterocyclylaminoalkyl-(p-quinone) derivatives for treatment of oxidative stress diseases |
-
2009
- 2009-11-13 AU AU2009355359A patent/AU2009355359B2/en active Active
- 2009-11-13 EP EP09851317A patent/EP2500336A1/en not_active Withdrawn
- 2009-11-13 JP JP2012538785A patent/JP2013510849A/ja active Pending
- 2009-11-13 MX MX2012005356A patent/MX2012005356A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-11-13 CA CA2789846A patent/CA2789846C/en active Active
- 2009-11-13 WO PCT/RU2009/000621 patent/WO2011059355A1/ru active Application Filing
- 2009-11-13 CN CN2009801624014A patent/CN102791670A/zh active Pending
- 2009-11-13 CA CA3068007A patent/CA3068007C/en active Active
- 2009-11-13 BR BR112012011197-3A patent/BR112012011197A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-11-13 UA UAA201207236A patent/UA107476C2/ru unknown
- 2009-11-13 EA EA201200604A patent/EA023248B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-11-13 KR KR1020127015205A patent/KR20120125980A/ko not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-05-02 IL IL219533A patent/IL219533A/en active IP Right Grant
- 2012-05-07 ZA ZA2012/03345A patent/ZA201203345B/en unknown
- 2012-05-14 US US13/470,823 patent/US9233903B2/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1047701A1 (en) | 1997-11-25 | 2000-11-02 | The University of Otago | Mitochondrially targeted antioxidants |
| US6331532B1 (en) | 1998-11-25 | 2001-12-18 | University Of Otago | Mitochondrially targeted antioxidants |
| EP1534720A1 (en) | 2002-08-12 | 2005-06-01 | Medical Research Council | Mitochondrially targeted antioxidants |
| WO2007046729A1 (en) | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Limited Liability Company 'mitotechnology' | Method of acting upon organism by targeted delivery of biologicaly active substances into m itochondria, pharmaceutical composition for carrying out said method, and compound used for the purpose |
| WO2008094062A1 (fr) * | 2007-01-29 | 2008-08-07 | Limited Liability Company 'mitotechnology' | Compositions pharmaceutiques servant à la prévention et au traitement de maladies oncologiques |
| WO2009005386A1 (fr) | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Limited Liability Company 'mitotechnology' | Utilisation de compositions à adressage mitochondrial dans la prévention et le traitement de maldies cardio-vasculaires |
Non-Patent Citations (18)
| Title |
|---|
| AGAPOVA L.S. ET AL.: "Mitochondria-Targeted Plastoquinone Derivatives as Tools to Interrupt Execution of the Aging Program. 3. Inhibitory Effect of SkQ1 on Tumor Development from p53-Deficient Cells", BIOCHEMISTRY, vol. 73, no. 12, 2008, pages 1300 - 1316, XP055059771 * |
| ANTONENKO Y.N. ET AL.: "Mitochondria-Targeted Plastoquinone Derivatives as Tools to Interrupt Execution of the Aging Program. 1. Cationic Plastoquinone Derivatives: Synthesis and in vitro Studies.", BIOCHEMISTRY, vol. 73, no. 12, 2008, pages 1273 - 1287, XP055059770 * |
| ANTONENKO YU.N. ET AL., BIOCHEMISTRY (MOSC)., vol. 73, 2008, pages 1273 - 87 |
| BAKEEVA L.E. ET AL.: "Proizvodnoe plastokhinona, adresovannoe v mitokhondrii, kak sredstvo, preryvajuschee progammu stareniya. 2. terapiya nekotorykh starcheskikhpatoligy, oposredovannykh aktivnymi formami kisloroda (serdechnoi aritmii, infarkta miokarda, ishemii pochti i insulta golovnago mozga).", BIOKHIMIYA 0320-9725, vol. 73, no. 12, 2008, pages 1607 - 1621, XP008167984 * |
| DOUGHAN A.K.; DIKALOV S.I., ANTIOXID. REDOX SIGNAL., vol. 9, 2007, pages 1825 - 36 |
| GREEN D.E.: "The electromechanochemical model for energy coupling in mitochondria", BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA., vol. 346, 1974, pages 27 - 78 |
| KIRSTE BURKHARD ET AL.: "Continuous-wave electron spin resonance studies of porphyrin and porphyrin-quinone triplet states.", J. CHEM. SOC. PERKIN TRANS., vol. 2, 1995, pages 2147 - 2152, XP055059773 * |
| KNUNYANTSA I.L. ET AL.: "Atseton. Khimicheskaya entsiklopediya pod red.", NAUCHNOE IZDATELSTVO "BOLSHAYA ROSSIISKAYA ENTSIKLOPEDIYA", vol. 1, 1998, pages 436, XP008168715 * |
| KURRECK H. ET AL.: "Mimicking primary processes in photosynthesis covalently linked porphyrin quinones.", RADIATION PHYSICS AND CHEMISTRY, vol. 45, no. 6, 1995, pages 853 - 865, XP004051430 * |
| KURRECK H. ET AL.: "Mimicking primary processes in photosynthesis. Photochemistry of covalently linked porphyrin quinones studied by EPR spectroscopy.", SOLAR ENERGY MATERIALS AND SOLAR CELLS, vol. 38, no. 1-4, 1995, pages 91 - 110, XP055059774 * |
| MATHIAS O. SENGE ET AL.: "Structure and Conformation of Photosynthetic Pigments and Related Compounds. 12. A Crystallographic Analysis of Porphyrin-quinones and Their Precursors.", PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY, vol. 70, no. 2, 1999, pages 206 - 216, XP055059772 * |
| MATJISHIN A. A. ET AL.: "Otsenka lipofilnosti nekotorykh antioksidantov novogo pokoleniya.", FARMATSIYA, no. 5, 2008, pages 23 - 28, XP008168021 * |
| PLOTNIKOV E. Y. ET AL.: "Interrelations of mitochondrial fragmentation and cell death under ischemia/reoxygenation and UV-irradiation: Protective effects of SkQI, lithium ions and insulin.", FEBS LETTERS, vol. 582, no. 20, 2008, pages 3117 - 3124, XP025471730 * |
| SKULACHEV V.P. ET AL., BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1787, 2009, pages 437 - 61 |
| SKULACHEV V.P., BIOCHEMISTRY (MOSC)., vol. 72, 2007, pages 1385 - 96 |
| SKULACHEV V.P., IUBMB LIFE., vol. 57, 2005, pages 305 - 10 |
| SMITH R.A. ET AL., ANN. N. Y. ACAD. SCI., vol. 1147, 2008, pages 105 - 11 |
| STARKOV AA; BLOCH DA; CHEMYAK BV; DEDUKHOVA VI; MANSUROVA SA; SYMONYAN RA; VYGODINA TV; SKULACHEV VP, BIOCHEM. BIOPHYS ACTA, vol. 1318, 1997, pages 159 - 172 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015063553A2 (en) | 2013-04-11 | 2015-05-07 | Mitotech S.A. | Mitochondrially-targeted timoquinones and toluquinones |
| WO2019002936A2 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Mitotech S.A. | SET OF COMPOUNDS TARGETING MITOCHONDRIA |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20120125980A (ko) | 2012-11-19 |
| EA023248B1 (ru) | 2016-05-31 |
| EP2500336A1 (en) | 2012-09-19 |
| US9233903B2 (en) | 2016-01-12 |
| JP2013510849A (ja) | 2013-03-28 |
| BR112012011197A2 (pt) | 2020-10-20 |
| US20120259110A1 (en) | 2012-10-11 |
| AU2009355359A1 (en) | 2012-06-07 |
| EA201200604A1 (ru) | 2012-09-28 |
| MX2012005356A (es) | 2013-01-29 |
| CA2789846A1 (en) | 2011-05-19 |
| CN102791670A (zh) | 2012-11-21 |
| AU2009355359B2 (en) | 2016-11-10 |
| ZA201203345B (en) | 2013-01-30 |
| IL219533A0 (en) | 2012-06-28 |
| CA2789846C (en) | 2020-02-25 |
| IL219533A (en) | 2017-04-30 |
| UA107476C2 (ru) | 2015-01-12 |
| CA3068007A1 (en) | 2011-05-19 |
| CA3068007C (en) | 2022-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2011059355A1 (ru) | Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов | |
| Logan et al. | Assessing the mitochondrial membrane potential in cells and in vivo using targeted click chemistry and mass spectrometry | |
| Dodani et al. | A targetable fluorescent sensor reveals that copper-deficient SCO1 and SCO2 patient cells prioritize mitochondrial copper homeostasis | |
| RU2318500C2 (ru) | Способ воздействия на организм путем адресной доставки биологически активных веществ в митохондрии, фармацевтическая композиция для его осуществления и соединение, применяемое для этой цели | |
| Le Trionnaire et al. | The synthesis and functional evaluation of a mitochondria-targeted hydrogen sulfide donor,(10-oxo-10-(4-(3-thioxo-3 H-1, 2-dithiol-5-yl) phenoxy) decyl) triphenylphosphonium bromide (AP39) | |
| Sokolova et al. | New quaternary ammonium camphor derivatives and their antiviral activity, genotoxic effects and cytotoxicity | |
| Smith et al. | Targeting coenzyme Q derivatives to mitochondria | |
| Zhang et al. | Visualizing hydrogen sulfide in living cells and zebrafish using a red-emitting fluorescent probe via selenium-sulfur exchange reaction | |
| ES2442901T3 (es) | Derivados de ácido lipoico | |
| Shigenaga et al. | Development and photo-responsive peptide bond cleavage reaction of two-photon near-infrared excitation-responsive peptide | |
| Ćoćić et al. | New dinuclear palladium (II) complexes: Studies of the nucleophilic substitution reactions, DNA/BSA interactions and cytotoxic activity | |
| KR20090129105A (ko) | 구리 이온 검출용 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체,및 이를 이용한 프로브 | |
| Denisov et al. | Tuning the hydrophobicity overcomes unfavorable deprotonation making octylamino-substituted 7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole (n-octylamino-NBD) a protonophore and uncoupler of oxidative phosphorylation in mitochondria | |
| Antonenko et al. | Alkyl-substituted phenylamino derivatives of 7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole as uncouplers of oxidative phosphorylation and antibacterial agents: involvement of membrane proteins in the uncoupling action | |
| CN114957231B (zh) | Gpx4蛋白靶向降解嵌合体及其制备方法与应用 | |
| Panagoulis et al. | Synthesis and pharmacochemical study of new Cu (II) complexes with thiophen-2-yl saturated and α, β-unsaturated substituted carboxylic acids | |
| Banik et al. | Oxovanadium (IV) catecholates of terpyridine bases for cellular imaging and photocytotoxicity in red light | |
| Banik et al. | Carbohydrate-appended photocytotoxic (imidazophenanthroline)-oxovanadium (IV) complexes for cellular targeting and imaging | |
| Guimaraes et al. | Naphthoquinone-based hydrazone hybrids: synthesis and potent activity against cancer cell lines | |
| US9290528B1 (en) | Light-activated compounds | |
| Isor et al. | Synthesis of triphenylphosphonium dibenzothiophene S-oxide derivatives and their effect on cell cycle as photodeoxygenation-based cytotoxic agents | |
| Xu et al. | 4-Thio-5-bromo-2′-deoxyuridine: chemical synthesis and therapeutic potential of UVA-induced DNA damage | |
| Li et al. | Thiadiazole: a new family of intercalative photonuclease with electron transfer and radical mechanisms | |
| Li et al. | General strategy for the preparation of membrane permeable fluorogenic peptide ester conjugates for in vivo studies of ester prodrug stability | |
| Yamanaka et al. | Dimethylarsine likely acts as a mouse-pulmonary tumor initiator via the production of dimethylarsine radical and/or its peroxy radical |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 200980162401.4 Country of ref document: CN |
|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 09851317 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 219533 Country of ref document: IL |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: MX/A/2012/005356 Country of ref document: MX |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2012538785 Country of ref document: JP Ref document number: 2009851317 Country of ref document: EP |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2009355359 Country of ref document: AU |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 201200604 Country of ref document: EA |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 4662/DELNP/2012 Country of ref document: IN |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2009355359 Country of ref document: AU Date of ref document: 20091113 Kind code of ref document: A |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 20127015205 Country of ref document: KR Kind code of ref document: A |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: A201207236 Country of ref document: UA |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2789846 Country of ref document: CA |
|
| REG | Reference to national code |
Ref country code: BR Ref legal event code: B01A Ref document number: 112012011197 Country of ref document: BR |
|
| REG | Reference to national code |
Ref country code: BR Ref legal event code: B01E Ref document number: 112012011197 Country of ref document: BR Free format text: IDENTIFIQUE O SIGNATARIO DA PETICAO NO 018120024929 DE 10/07/2012 E COMPROVE QUE O MESMO TEM PODERES PARA ATUAR EM NOME DO DEPOSITANTE, UMA VEZ QUE BASEADO NO ARTIGO 216 DA LEI 9.279/1996 DE 14/05/1996 (LPI) ?OS ATOS PREVISTOS NESTA LEI SERAO PRATICADOS PELAS PARTES OU POR SEUS PROCURADORES, DEVIDAMENTE QUALIFICADOS, COM ASSINATURA LEGIVEL E CARIMBO DO MESMO.? |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 112012011197 Country of ref document: BR Kind code of ref document: A2 Effective date: 20120511 |