WO2011056091A1 - Способ получения амидов креатина - Google Patents

Способ получения амидов креатина Download PDF

Info

Publication number
WO2011056091A1
WO2011056091A1 PCT/RU2010/000534 RU2010000534W WO2011056091A1 WO 2011056091 A1 WO2011056091 A1 WO 2011056091A1 RU 2010000534 W RU2010000534 W RU 2010000534W WO 2011056091 A1 WO2011056091 A1 WO 2011056091A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
creatine
acid
condensing agent
base
added
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000534
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сергей Владимирович БУРОВ
Ольга Сергеевна ВЕСЕЛКИНА
Мария Викторовна ЛЕКО
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Bертекс"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Bертекс" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Bертекс"
Priority to EP10828601.4A priority Critical patent/EP2497765B1/de
Priority to US13/261,286 priority patent/US8735623B2/en
Publication of WO2011056091A1 publication Critical patent/WO2011056091A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C277/00—Preparation of guanidine or its derivatives, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C277/08—Preparation of guanidine or its derivatives, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups of substituted guanidines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala

Definitions

  • the invention relates to the field of pharmaceutical chemistry, and in particular to methods for producing biologically active substances (BAS), in particular, creatine amides.
  • BAS biologically active substances
  • Creatine is an endogenous nutrient present in various mammalian tissues, for example, in the liver, kidneys, muscle tissue, brain tissue, blood, and is both in a free state and in the form of creatine phosphate. Creatine is considered as a means of improving energy tissue metabolism - increasing the energy reserve of ATP, primarily in muscle and nerve cells.
  • Creatine phosphate maintains ATP levels while increasing energy expenditures in the cell, i.e. participates in the physiological process of ADP phosphorylation with the formation of ATP.
  • KrF is one of the main sources of the high-energy phosphate conversion cycle and, thus, is involved in the oxidative phosphorylation of glucose, which ensures the release of energy necessary for the functioning of muscle tissue cells, including skeletal muscle and heart muscle. Due to the fact that creatine phosphate is able to provide ATP biosynthesis, an increase in the amount of creatine in the muscles also increases muscle reserves of creatine phosphate, improving It has tissue energy metabolism, improves muscle performance (endurance), and increases muscle mass.
  • Creatine phosphate and creatine are also allosteric regulators of cell processes (N. Bmstovetsky et al., J. of Neurochemistry, 2001, 76, 425-434). So, taking from 20 to 30 g of creatine monohydrate per day for several days leads to an increase of more than 20% in the total content of creatine in human skeletal muscles. These properties attract particular attention in connection with the possibility of using creatine as a dietary supplement to strengthen the body and increase working capacity. Thus, the use of creatine monohydrate in a daily dose of 15 g for at least 2 days is used to increase muscle strength (WO 94/02127, 1994).
  • Creatine and creatine phosphate are widely used in medicine. So, creatine, creatine phosphate and cyclocreatine (US 6,706,764, 2004) are recommended for the treatment of diseases of the nervous system, such as diabetic and toxic neuropathies, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, stroke, etc., metabolic disorders such as hyperglycemia and diabetes mellitus (US 6,193,973, 2001). Oral administration of creatine has been described for the treatment of heart failure.
  • creatine is poorly absorbed from the gastrointestinal tract - the degree of absorption is 1-14%. This necessitates the use of high doses of creatine.
  • the compositions currently being produced are taken in quantities of up to 20 g per day.
  • the introduction of high doses of creatine can lead to negative consequences for the body - impaired nitrogen metabolism, gastrointestinal upsets, diarrhea, etc.
  • creatine derivatives with greater stability or higher biological activity, which will allow, on the one hand, a reduction in the dose of the substance used, and, on the other hand, the discovery of new areas of application.
  • derivatives of creatine and various organic acids aroused the greatest interest.
  • creatine pyruvates US 6,166,249, 2000; RU 2 114 823, 1998) to increase performance, reduce body weight, adapt to conditions of oxygen deficiency in ischemia, as a dietary supplement, to protect the skin from aging and exposure to sunlight (US 7,186,754, 2007) in the treatment of female sexual disorders, in particular dysmenorrhea (US 6,503,951, 2000).
  • NH C (NH 2 ) -N (CH 3 ) -CH 2 -CO-NH-R * X, where R is an amine oxide - lot residue or substituted amino acid residue; X is an organic or mineral acid or water (RU 2 354 645, 2009).
  • R is an amine oxide - lot residue or substituted amino acid residue
  • X is an organic or mineral acid or water (RU 2 354 645, 2009).
  • the method for producing such creatine amides which is the closest in effect to the claimed effect, consists in the interaction of free or protected guanidylating agents with sarcosine amides in polar organic solvents at a temperature of not more than 50 ° C. Based on sarcosine amides, it is possible to obtain other derivatives of amino acids using standard chemical reactions described in the literature (A. A. Gershkovich, V. K. Kibirev “Synthesis of Peptides. Reagents and Methods.” Kiev. “Naukova Dumka” ". 1987).
  • the disadvantage of this method is its multi-stage nature, associated with the need for preliminary preparation of sarcosine amides, the insufficiently high yield of the target product, which, in particular, for creatinyl-glycine benzyl ester hydrochloride, is about 5%.
  • i-TSC is carried out at least in an equimolar amount with respect to creatine.
  • the introduction of amino acid derivatives and a condensing agent into the solution is carried out after dissolution of the complex of creatine and p-TSC, and the introduction of the base in 10-15 minutes. after the start of the reaction and the establishment of reaction equilibrium, to shift the latter in a given direction.
  • Processing Kr p-TSC simultaneously solves the problem of translating creatine into solution and protecting the guanidine group of creatine by forming a complex, which complicates the conversion of creatine to creatinine as a result of intramolecular cyclization.
  • Anhydrous creatine or cheaper creatine monohydrate is used as Cr.
  • Carbodiimides in particular dicyclohexylcarbodiimide, N-ethyl- ⁇ - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, diisopropylcarbodiimide, or carbonic acid monoesters, in particular ethyl chloroformate, isobutyl, can be used as a condensing agent.
  • bases soluble in organic solvents in particular tertiary amines, for example, N-morpholine, triethylamine, diisopropylamine, etc.
  • organic solvents Dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, winier-methylpyrrolidone, etc., were used to ensure complete dissolution of the complex of creatine and p-TSC.
  • carbonic acid monoesters as a condensing agent, in particular isobutylchloroformate or ethyl chloroformate, and as carbodiimides, dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide, preferably, because the amount of impurities is reduced and the technology of isolating the target product is simplified.
  • the reaction mixture obtained during the process is purified, as a rule, using ion-exchange resins followed by recrystallization of the target product, the yield of which reaches 20% with a purity of more than 90% according to HPLC analysis.
  • the main impurity in the synthesis is creatinine, the content of which in the target product, as a rule, does not exceed 1.5%.
  • Creatine amides obtained during the implementation of the claimed method can be further modified using standard technologies of organic synthesis.
  • the molecular weight of creatine amides is determined by the mass spectrometric method at the MX-5303 time-of-flight mass reflectron with an Electrospray type ion source (FINEPHF RAS).
  • the oily residue is dissolved in 160 ml of chloroform and left for 10 hours at a temperature of (-) 10 ° C.
  • the solution is filtered off, extracted with water (3x100 ml).
  • the combined aqueous extract containing the target product was extracted 2 times with chloroform, the aqueous solution was evaporated in vacuo to a volume of 50 ml.
  • the resulting solution was passed through a 30x250 mm column filled with a Dowex 1x8 sorbent in the acetate form in water.
  • the eluent is water, the elution rate is 2 ml / min.
  • the column is washed with water, controlling the pH of the eluate.
  • the resulting product was dissolved in 30 ml of ethyl alcohol, held for 20 hours at a temperature of (-) 10 ° ⁇ , the solution was filtered, and The tin alcohol is removed in vacuo, the residue is crystallized from diethyl ether.
  • the oily residue is dissolved in 100 ml of chloroform and left in the refrigerator for 10 hours at a temperature of (-) 10 ° C.
  • the solution is filtered off and extracted with water (3 ⁇ 10 ml).
  • the combined aqueous extract containing the desired product is extracted twice with chloroform and evaporated in vacuo to a volume of 50 ml.
  • the selection of the target product is carried out according to the method described in example 1.
  • the yield of CuH ⁇ C ⁇ -CrHBCO2 is 1.05 g (14.6%).
  • the content of creatinylglycylglycine isopropyl ether acetate according to non-aqueous titration is 98.5% by mass, the content of creatinine impurity is 1.3% by mass.
  • Example 3 Preparation of Creatinyl Glycine Methyl Ester Hydrochloride A suspension of 2.98 g (20 mmol) of creatine monohydrate in 20 ml of dimethyl acetamide is placed in a 250 ml one-necked round bottom flask equipped with a dropping funnel with a compensator closed by a calcium chloride tube, 3.99 g (21 are added with stirring on a magnetic stirrer) mm) monohydrate of ⁇ -toluenesulfonic acid - after about 5 minutes the precipitate is completely dissolved.
  • the precipitate is dissolved in 80 ml of chloroform and left for 10 hours in the refrigerator at a temperature of (-) 10 ° ⁇ .
  • the solution is filtered off and extracted with water (3x100ml).
  • the combined aqueous extract containing the desired product was extracted with chloroform (2x80 ml) and evaporated in vacuo to a volume of 50 ml.
  • Example 4 Preparation of Creatinyl Glycine Ethyl Amide Tartrate from Anhydrous Creatine
  • a suspension of 2.62 g (20 mmol) of creatine in 20 ml of dimethylformamide is placed in a 250 ml one-necked round-bottomed flask equipped with a dropping funnel with a compensator closed by a calcium chloride tube, and 3.83 g (20.1 1 mmol) are added with stirring on a magnetic stirrer. i-toluenesulfonic acid monohydrate after about 10 minutes. the precipitate is completely dissolved.
  • the oily residue is dissolved in 80 ml of chloroform and left for 20 hours in a refrigerator at a temperature of (-) 10 ° C.
  • the solution is filtered off, extracted with water (3x100ml), the combined aqueous extract containing the desired product is extracted with chloroform (2x80ml) and evaporated in vacuo to a volume of 50 ml.
  • the resulting product was isolated according to the method described in Example 1, except that a Dowex 1x8 filled sorbent in tartrate form was used. Fractions containing the target product are analyzed by RP-HPLC, combined, evaporated. Yield [C 8 Hi 7 N 5 0 2 ] 2-C 4 H 6 0 6 - 3.7 g (32%).
  • Example 5 Obtaining ⁇ -carbobenzo si - ⁇ - creatinillisine ethyl ester diacetate. A suspension of 3 g (20.5 mmol) of creatine monohydrate in 40 ml of dimethylformamide is placed in a 250 ml one-neck round-bottom flask equipped with a dropping funnel with a compensator closed by a calcium chloride tube, and 3.81 g (20.5 mmol) of toluenesulfonic acid monohydrate are added with stirring.
  • the oily residue is dissolved in 80 ml of chloroform and left for 20 hours at a temperature of -10 ° C.
  • the solution is filtered off, extracted with water (3x100ml), the combined aqueous extract containing the desired product is extracted with chloroform (2x80ml) and evaporated in vacuo to a volume of 50 ml.
  • Example 7 Preparation of Hemisuccinate Ethyl Creatinyl Glycylalanine A suspension of 2 g (13.4 mmol) of creatine monohydrate in 10 ml of dimethylformamide is placed in a 100 ml one-necked round-bottomed flask equipped with a dropping funnel with a compensator closed by a calcium chloride tube, and 2.54 g (13.4 mmol) are added with stirring on a magnetic stirrer.
  • the oily residue is dissolved in 100 ml of chloroform and extracted with water (3x100 ml).
  • the combined aqueous extract containing the target product is extracted twice with chloroform and evaporated on a rotary evaporator to a volume of 20 ml.
  • the resulting solution was passed through a 30x150 mm column filled with Dowex 2x8 in succinate form, eluting with water.
  • the elution rate is 2 ml / min.
  • the residue is crystallized from 10 ml of acetonitrile at a temperature of (-) 10 ° C for 5 hours.
  • the product is dissolved in 15 ml of ethyl alcohol, incubated for 10 hours at a temperature of (-) 10 ° C, the solution is filtered. The mother liquor is evaporated, the residue is dissolved in 5 ml of water and applied to a column with YMOGel ODS
  • Example 8 Preparation of creatinyl-y-aminobutyric acid ethyl acetate.
  • a suspension of 4.20 g (32 mmol) of creatine in 40 ml of dimethylformamide was placed in a 250 ml single-necked round-bottomed flask with a volume of 250 ml, equipped with a dropping funnel with a compensator closed by a calcium chloride tube, and 5.02 g (35 mmol) of p-toluenesul- acid, 5.36 g (32 mmol) of ⁇ -aminobutyric acid ethyl ester hydrochloride, after dissolving it, cool the reaction mixture to a temperature of (-) 10 ° C in a salt-water bath.
  • Example 9 Obtaining creatinylalanine ethyl acetate.
  • a suspension funnel with a compensator closed by a chlorine-cauldron tube is placed in a suspension of 2 g (13.4 mmol) of creatine monohydrate in 10 ml of dimethylformamide, and 2.54 g (13.4 mmol) of i-toluenesulfonic acid monohydrate and then l are added on a magnetic stirrer.
  • the resulting solution was passed through a 30x150 mm column filled with Dowex 2x8 in acetate form, eluting with water.
  • the elution rate is 2 ml / min.
  • the column is washed with water, controlling the pH of the eluate.
  • the residue was crystallized from 10 ml of acetonitrile at a temperature of (-) 10 ° C for 5 hours.
  • the precipitate of creatinilalanine ethyl acetate is filtered off, washed with cold acetonitrile, diethyl ether and dried.
  • a suspension of 11.3 g (86 mmol) of creatine in 80 ml of dimethylformamide was placed in a 250 ml one-neck round bottom flask equipped with a dropping funnel with a compensator closed by a calcium chloride tube.
  • 16 g (86 mmol) of i-toluenesulfonic acid monohydrate are added on a magnetic stirrer - after about 5 minutes the precipitate is completely dissolved.
  • 11.5 g (50 mmol) of phenylalanine ethyl ester hydrochloride and 7.75 ml (45 mmol) of diisopropylcarbodiimide are added.
  • a study of the neuroprotective effect of creatine amides was carried out on focal ischemia models in male Wistar rats, 12-14 weeks old, weight 220-240 g. Anesthesia was performed with sodium thiopental at a dose of 60 mg / kg.
  • animals were injected intravenously (iv) with a solution of creatine amide in saline solution 45 minutes before ischemia, in the control group, saline solution, in the second group, a solution of creatine amide in saline solution was injected into the animals three times a day intragastrically (per os) with a probe , control group - saline.
  • Endovascular occlusion of the middle cerebral artery was performed according to the method of Koizumi, J, et al (1986), in the modification of Longa, EZ, et al (1989) and Belayev L, et al (1999).
  • the standard terms for ischemia were 39 minutes, and reperfusion was 48 hours.
  • the area of the damage zone was determined by staining phenyltetrazolium chloride and then obtaining and analyzing digital photographs of the stained section.
  • the coefficient of damage to the brain was calculated — the ratio of the area of damage to the entire surface of the cut (Table 1). Table 1.
  • Table 1 The effect of creatine amides on brain damage in Wistar male rats during experimental ischemia / reperfusion (p ⁇ 0.05).
  • the stability of creatine amides in human blood plasma was evaluated by the relative change in the concentration of creatine amide in plasma. 1 ml of plasma was mixed with 0.2 ml of an aqueous solution of creatine amide with a concentration of 5 mg / ml, the mixture was kept at 37 ° ⁇ , an aliquot of 0.2 ml was taken at fixed time intervals, mixed with 0.02 ml of 10% trichloroacetic acid solution, after 15 minutes the precipitate was centrifuged at 3 00 g for 20 minutes. Creatine amide concentration was determined in supernatant by HPLC (table
  • Drug 2 100 100 97 90
  • Drug 3 100 100 95 90
  • the drug 5 100 100 97 87

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к способам получения биологически активных веществ (БАВ), в частности, амидов креатина. Предложен способ получения амидов креатина, заключающийся в обработке креатина пара-толуолсульфокислотой в органическом растворителе с последующим взаимодействием полученного комплекса с соединениями, содержащими первичную или вторичную аминогруппу, в присутствии последовательно вводи- мых конденсирующего агента и основания. Заявляемый способ позволяет повысить выход целевого продукта в 2-5 раз по сравнению с аналогами, а также расширить номенклатуру получаемых соединений.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДОВ КРЕАТИНА
Область техники
Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к способам получения биологически активных веществ (БАВ), в частности, амидов креатина.
Предшествующий уровень техники
Креатин (Кр) является эндогенным питательным веществом, присут- ствующим в различных тканях млекопитающих, например, в печени, поч- ках, мышечной ткани, ткани головного мозга, крови и находится как в свободном состоянии, так и в форме креатинфосфата. Креатин рассмат- ривается в качестве средства, улучшающего энергетический тканевый метаболизм - повышающего энергетический резерв АТФ, прежде всего, в мышечных и нервных клетках.
Креатинфосфат (КрФ) поддерживает уровень АТФ при увеличении затрат энергии в клетке, т.е. участвует в физиологическом процессе фосфорилирования АДФ с образованием АТФ. Наряду с гликогеном, КрФ является одним из основных источников цикла превращений высоко- энергетичных фосфатов и, таким образом, участвует в окислительном фосфорилировании глюкозы, что обеспечивает выделение энергии, необ- ходимой для функционирования клеток мышечной ткани, включая скелет- ные мышцы и сердечную мышцу. В связи с тем, что креатинфосфат спо- собен обеспечивать биосинтез АТФ, увеличение количества креатина в мышцах увеличивает также и мышечные запасы креатинфосфата, улучша- ет тканевый энергетический метаболизм, улучшает работоспособность (выносливость) мышц, увеличивает мышечную массу.
Креатинфосфат и креатин являются также и аллостерическими регу- ляторами клеточных процессов (N. Bmstovetsky et al., J. of Neurochemistry, 2001, 76, 425-434). Так, прием от 20 до 30 г моногидрата креатина в сутки в течение нескольких дней, приводит к повышению более чем на 20 % об- щего содержания креатина в скелетных мышцах человека. Данные свойст- ва привлекают особое внимание в связи с возможностью использования креатина в качестве пищевой добавки для укрепления организма и повы- шения работоспособности. Так, применение креатина моногидрата в су- точной дозе 15 г в течение, по крайней мере, 2 дней, используется для по- вышения мышечной силы (WO 94/02127, 1994).
Креатин и креатинфосфат находят достаточно широкое применение в медицине. Так, креатин, креатинфосфат и циклокреатин (US 6,706,764, 2004) рекомендованы для лечения заболеваний нервной системы, таких как диабетические и токсические невропатии, болезнь Альцгеймера, бо- лезнь Паркинсона, инсульт и т.п, таких нарушений метаболизма, как ги- пергликемиия и сахарный диабет (US 6,193,973, 2001). Пероральное при- менение креатина описано для лечения сердечной недостаточности
(WO/EP97/06225, 1999), астмы (US 6,093,746, 2000). Показано применение креатинфосфата для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, перспек- тивность для лечения новообразований (US 5,219,846, 1993). Вместе с тем, применение креатина и креатинфосфата ограничено плохой растворимо- стью и нестабильностью в водных средах при физиологических значениях Н (RU 2 295 261, 2007).
Более того, креатин плохо абсорбируется из желудочно-кишечного тракта - степень абсорбции составляет 1-14 %. Это вызывает необходи- мость применения высоких доз креатина. Для того чтобы употребление креатина было эффективным, композиции, производимые в настоящее время, принимаются в количестве до 20 г в сутки. Вместе с тем, наряду с повышением стоимости терапии, введение высоких доз креатина может приводить к негативным последствиям для организма - нарушение азотно- го обмена, желудочно-кишеч-ные расстройства, диарея и т.п.
В этой связи большой интерес представляет получение производных креатина, обладающих большей стабильностью или более высокой биоло- гической активностью, что позволит с одной стороны снизить дозу приме- няемого вещества, а с другой стороны - обнаружить новые области при- менения. При этом наибольший интерес вызвали производные креатина и различных органических кислот. Так, известно использование пируватов креатина (US 6,166,249, 2000; RU 2 114 823, 1998) для повышения работо- способности, снижения веса тела, адаптации к условиям кислородной не- достаточности при ишемии, в качестве пищевой добавки, для защиты ко- жи от старения и воздействия солнечных лучей (US 7,186,754, 2007) при лечении женских половых расстройств, в частности дисменореи (US 6,503,951, 2000).
Производные креатина и малоновой, малеиновой, фумаровой, орото- вой кислот и таурина (CN 10/249338, 2003; US 6,861,554, 2005; US
6,166,249, 2000; CA 10/740263, 2003) показаны для лечебного питания как пищевые добавки; креатина цитрат (US 2004/077719, 2004) рекомендован в качестве ноотропного средства.
Одними из наиболее перспективных производных креатина, яв- ляются синтезированные и исследованные авторами амиды креатина об- щей формулы: NH=C(NH2)-N(CH3)-CH2-CO-NH-R*X, где R- аминокис- лотный остаток или замещенный аминокислотный остаток; X - органиче- ская или минеральная кислота или вода (RU 2 354 645, 2009). Как было установлено в ходе экспериментов, синтезированные амиды креатина по сравнению с известными аналогами обладали повышенной растворимостью и стабильностью в водных растворах, что позволяет бо- лее широко использовать их в качестве источника креатина в организме.
Способ получения подобных амидов креатина, являющийся наиболее близким по достигаемому эффекту к заявляемому, состоит во взаимодей- ствии свободных или защищенных гуанидилирующих агентов с амидами саркозина в полярных органических растворителях при температуре не более 50 °С. На основе амидов саркозина возможно получение иных про- изводных аминокислот с использованием стандартных химических реак- ций, описанных в литературе (А. А. Гершкович, В. К. Кибирев «Синтез пеп- тидов. Реагенты и методы». Киев. «Наукова думка». 1987).
Недостатком данного способа является его многостадийность, связан- ная с необходимостью предварительного получения амидов саркозина, не- достаточно высокий выход целевого продукта, который, в частности, для креатинил-глицин бензилового эфира гидрохлорида, составляет около 5 %.
Сущность изобретения
Предлагается создание более простой и эффективной технологии по- лучения амидов креатина с более высоким выходом путем перевода креа- тина (Кр) в комплекс, растворимый в органических растворителях, в ре- зультате его обработки пара-толуолсульфокислотой (и-ТСК) до полного растворения Кр, с последующим взаимодействием данного комплекса с производными аминокислот, содержащими первичную или вторичную аминогруппу, в частности, с эфирными или амидными производными али- фатических или ароматических аминокислот, в присутствии последова- тельно вводимых конденсирующего агентов и основания. Варианты осуществления изобретения
Введение и-ТСК осуществляют, как минимум, в эквимолярном по отноше- нию к креатину количестве. Введение в раствор производных аминокислот и конденсирующего агента осуществляют после растворения комплекса креатина и п-ТСК, а введение основания - через 10-15 мин. после начала реакции и установления реакционного равновесия, для сдвига последнего в заданном направлении.
В результате обработки Кр п-ТСК одновременно решается проблема перевода креатина в раствор и защита гуанидиновой группы креатина пу- тем образования комплекса, что затрудняет превращение креатина в креа- тинин в результате внутримолекулярной циклизации.
В качестве Кр используют безводный креатин или более дешевый креатин моногидрат. В качестве конденсирующего агента могут быть ис- пользованы карбодиимиды, в частности, дициклогексилкарбодиимид, N- этил-ΝΓ -(3 -диметиламинопропил)карбодиимид, диизопропилкарбо диимид, или хлорангидриды моноэфиров угольной кислоты, в частности, этил- хлорформиат, изо-бутилхлорформиат, а в качестве основания, связываю- щего выделяющуюся соляную кислоту, основания, растворимые в органи- ческих растворителях, в частности - третичные амины, например, N- мор- фолин, триэтиламин, диизопропиламин и пр. В качестве органических растворителей могут быть использованы диметилформамид, диметилаце- тамид, диметилсульфоксид, Ν-метилпирролидон и т.п., обеспечивающие полное растворение комплекса креатина и п-ТСК.
Использование в качестве конденсирующего агента хлорангидридов моноэфиров угольной кислоты, в частности изо-бутшгхлорформиата или этилхлорформиата, а в качестве карбодиимидов - дициклогексилкарбо- диимида или диизопропилкарбодиимида, предпочтительно, т. к. при этом снижается количество посторонних примесей и упрощается технология выделения целевого продукта.
Полученную в ходе процесса реакционную смесь очищают, как пра- вило, с использованием ионообменных смол с последующей перекристал- лизацией целевого продукта, выход которого достигает 20 % с чистотой, по данным ВЭЖХ анализа, более 90 %. Основная примесь при синтезе - креатинин, содержание которого в целевом продукте, как правило, не пре- вышает 1.5 %.
Амиды креатина, полученные в ходе осуществления заявляемого спо- соба, могут быть в дальнейшем модифицированы с использованием стан- дартных технологий органического синтеза.
Контроль за ходом реакции, а также оценка чистоты конечных и про- межуточных продуктов проводится методом ОФ ВЭЖХ на хроматографе Alliance (Waters), колонки Zorbax ODS, 3.5 мкм, 3x100 мм, (Agilent Tech- nologies). Для элюирования используют смесь буферного раствора, содер- жащего 0.01 М натрия октансульфоната и 0.02 М натрия дигидрофосфата, с ацетонитрилом. Детектирование проводится методом УФ-спектроско- пии, при длине волны 210 нм. Содержание основного вещества в амидах креатина определяют методом неводного титрования раствором хлорной кислоты в ледяной уксусной кислоте в присутствии индикатора - кристал- лического фиолетового.
Определение молекулярной массы амидов креатина проводится мас- спектрометрическим методом на времяпролетном масс-рефлектроне МХ-5303 с источником ионов типа "Электроспрей" (ФИНЭПХФ РАН).
Промышленная применимость
Пример 1. Получение креатинилгли ин мзо-пропилового эфира аце- тата. В одногорлую кругло донную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 5.67 г (38 мМ) креатин моногидрата в 40 мл диме- тилформамида, и при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 7.23 г (38 мМ) моногидрата и-толуолсульфокислоты. Приблизительно че- рез 5 мин. креатин моногидрат полностью растворяется. Затем прибавля- ют 6.71 г (40 мМ) гидрохлорида изопропилового эфира глицина, и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)Ю °С на водно-соляной бане. Далее вносят 5.24 мл (38 мМ) изо- бутилхлорформиата, и в течение 10 мин. из капельной воронки прибавля- ют 8.9 мл (81 мМ) Ν-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем постепенно доводят температуру до комнат- ной. Через 10 час отфильтровывают выпавший осадок гидрохлорида N- метилморфолина, упаривают раствор в вакууме при температуре 50 °С. Маслообразный остаток растворяют в 160 мл хлороформа и оставляют на 10 ч при температуре (-)Ю °С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой (3x100 мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, 2 раза экстрагируют хлороформом, водный раствор упаривают в вакууме до объема 50 мл. Полученный раствор пропускают через колонку размером 30x250 мм, заполненную сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной фор- ме, в воде. Элюент - вода, скорость элюирования - 2 мл/мин. Колонку про- мывают водой, контролируя рН элюата. Фракции с рН = 7 (рН воды = 5) собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, прибавляют ук- сусную кислоту и упаривают. Остаток кристаллизуют из 20 мл ацетонит- рила при температуре (-)Ю °С в течение 20 ч. Осадок ацетата кзо-пропи- лового эфира креатинилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.
Полученный продукт растворяют в 30 мл этилового спирта, выдер- живают 20 час при температуре (-)Ю °С, раствор отфильтровывают, эти- ловый спирт удаляют в вакууме, остаток кристаллизуют из диэтилового эфира.
Выход C9H18N4C C2H4O2- креатинилглицин шо-пропилового эфира ацетата - 2.3 г (21 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 290.29. Вычислено: М 290.32 . Содержание креатинилглицина шо-пропилового эфира ацетата по данным неводного титрования - 97.7 % масс, содержание примеси креати- нина - 1.5 % масс.
Пример 2. Получение реатинилглицилглицин этилового эфира аце- тата. В одногорлую круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 4.77 г (32 мМ) креатина моногидрата в 40 мл Ν-ме- тилпирролидона, при перемешивании прибавляют 5.02 г (35 мМ) безвод- ной и-толуол-сульфокислоты - приблизительно через 5 мин креатин пол- ностью растворяется. Затем прибавляют 4.33 г (22 мМ) гидрохлорида эти- лового эфира диглицина и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)Ю °С на водно-соляной бане. Далее вносят 4.51 мл (33 мМ) о-бутилхлор-формиата и в течение 10 мин. из капельной во- ронки прибавляют 5.1 мл (54 мМ) Ν-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 ч на ледяной бане, затем температуру постепенно дово- дят до комнатной. Через 10 час отфильтровывают выпавший осадок гид- рохлорида Ν-метилморфолина, и упаривают растворитель в вакууме при 50 °С. Маслообразный остаток растворяют в 100 мл хлороформа и остав- ляют на 10 ч в холодильнике при температуре (-)Ю °С. Раствор отфильтро- вывают и экстрагируют водой (ЗхЮОмл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, два раза экстрагируют хлороформом и упа- ривают в вакууме до объема 50 мл. Выделение целевого продукта осуществляют по методике, описанной в примере 1. Выход СюН^С^-СгБЦОг - 1.05 г (14.6 %). Масс-спектр, най- дено: m/z: 333.29. Вычислено: М 333.29. Содержание креатинилглицилг- лицин изопропилового эфира ацетата по данным неводного титрования - 98.5 % масс, содержание примеси креатинина - 1.3 % масс.
Пример 3. Получение креатинилглицин метилового эфира гидрохло- рида. В одногорлую кругло донную колбу на 250 мл, снабженную капель- ной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, поме- щают суспензию 2.98 г (20 мМ) креатина моногидрата в 20 мл диметил- ацетамида, при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 3.99 г (21 мМ) моногидрата «-толуолсульфокислоты - приблизительно через 5 мин осадок полностью растворяется. Затем прибавляют 2.64 г (21 мМ) гид- рохлорида метилового эфира глицина, и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)Ю °С на водно-соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20 мМ) о-бутилхлорформиата, и в течение 10 мин из ка- пельной воронки прибавляют 4.4 мл (40 мМ) Ν-метилморфолина. Реакци- онную смесь перемешивают 1 ч на ледяной бане, затем температуру по- степенно доводят до комнатной. Через 7 час отфильтровывают выпавший осадок гидрохлорида Ν-метилморфолина, осаждают продукт гексаном, от- деляют маслообразный осадок. Осадок растворяют в 80 мл хлороформа и оставляют на 10 ч в холодильнике при температуре (-)Ю °С. Раствор от- фильтровывают и экстрагируют водой (3x100мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, экстрагируют хлороформом (2x80 мл) и упаривают в вакууме до объема 50 мл. Очистку целевого продукта проводят в условиях примера 1, за исключением того, что фракции с рН = 7 (рН воды = 5) собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, прибавляют соляную кислоту и упаривают. Выход C7H14N4CVHCI - 1.52 г (30 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 238.65 Вычислено: М 238.67. Содержание креатинилглицин метилового эфира гидрохлорида по данным неводного титрования - 98.3 % масс, со- держание примеси креатинина - 1.5 % масс.
Пример 4. Получение креатинилглицин этиламида тартрата из без- водного креатина. В одногорлую круглодонную колбу на 250 мл, снаб- женную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 2.62 г (20 мМ) креатина в 20 мл диметил- формамида, и при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 3.83 г (20.1 1 мМ) моногидрата и-толуолсульфокислоты - приблизительно через 10 мин. осадок полностью растворяется. Затем прибавляют 4.77 г (22 мМ) трифторацетата этиламида глицина, и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)Ю °С на водно-соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20 мМ) о-бутилхлорформиата, и в течение 10 мин. из ка- пельной воронки прибавляют 4.7 мл (43 мМ) Ν-метилморфолина. Реакци- онную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем температуру по- степенно доводят до комнатной. Через 20 час выпавший осадок отфильт- ровывают, растворитель упаривают в вакууме при 50 °С. Маслообразный остаток растворяют в 80 мл хлороформа и оставляют на 20 ч в холодиль- нике при температуре (-)Ю °С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой (3x100мл), объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, экстрагируют хлороформом (2x80мл) и упаривают в вакууме до объема 50 мл. Полученный продукт выделяют по способу, приведенному в примере 1, за исключением того, что используют заполненную сорбен- том Dowex 1x8 в тартратной форме. Фракции, содержащие целевой про- дукт, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, упаривают. Выход [C8Hi7N502]2-C4H606 - 3.7 г (32 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 583.62. Вычислено: М 583.61. Содержание основного вещества - креа- тинилглицин этиламида тартрата - по данным неводного титрования - 98.9 % масс, содержание примеси креатинина - 0.7 % масс.
Пример 5. Получение ^-карбобензо си-^-креатиниллизин этилового эфира диацетата. В одногорлую круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркаль- циевой трубкой, помещают суспензию 3 г (20.5 мМ) креатина моногидрата в 40 мл диметилформамида, и при перемешивании прибавляют 3.81 г (20.5 мМ) моногидрата и-толуолсульфокислоты. Затем через 10 мин прибавляют 7 г (20.5 мМ) гидрохлорида этилового эфира ос-карбобензокси-Ь-лизина, после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (- )10 °С на водно-соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20.5 мМ) о-бутил- хлорформиата, и в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 4.4 мл (20.5
Figure imgf000012_0001
Реакционную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем температуру постепенно доводят до комнатной. Через 10 час суспензию фильтруют, упаривают растворитель в вакууме при температуре 50 °С. Маслообразный остаток растворяют в 150 мл w-бу- танола, 4 раза промывают 5 % раствором NaHC03, 2 раза - водой. Далее н- бутанол упаривают, к остатку прибавляют 30 мл воды и наносят получен- ную суспензию на колонку с сорбентом YMC*Gel ODS 22.5x150, уравно- вешенным в 0.2 % уксусной кислоте, колонку промывают 0.2 % раствором уксусной кислоты, далее элюируют в режиме линейного градиента до 10 % опропилового спирта в 0.2 % растворе уксусной кислоты. Фракции анализируют с помощью качественных реакций и ВЭЖХ; объединяют, упаривают. Остаток кристаллизуют из 5 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают в вакууме. W 201
12
Выход СгоНз^Оз-СгН Ог - r>f -карбобензокси-ЫЕ-креатиниллизин этилово- го эфира ацетата - 1.5 г (18 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 481.77. Вычис- лено: М 481.77. Содержание основного вещества - N -Kap6o6eH30KCH-Ns- креатиниллизин этилового эфира ацетата - по данным неводного титрова- ния - 98.9 % масс, содержание примеси креатинина - 1.0 % масс.
1.0 г полученного ^ -карбобензокси-г^-креатиниллизин этилового эфира ацетата, растворяют в 10 мл метанола и гидрируют над Pd чернью в тече- ние 3 час. Полноту удаления карбобензоксигруппы контролируют с по- мощью ТСХ в системе ацетонитрил : вода : уксусная кислота 6:1:1. Ката- лизатор отфильтровывают, к фильтрату добавляют 1 мл уксусной кислоты и упаривают. Остаток кристаллизуют из 10 мл ацетонитрила. Продукт от- фильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, эфиром и высуши- вают в вакууме.
Выход CioH2i 503-2C2H402 - Е-креатиниллизин этилового эфира диаце- тата - 0.4 г (84 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 379.41. Вычислено: М 379.41. Содержание основного вещества - КЕ-креатиниллизин этилового эфира диацетата - по данным неводного титрования - 99.2 % масс, содер- жание примеси креатинина - 0.5 % масс. >
Пример 6. Получение креатинилфенилаланин этиламида гидрохлори- да из безводного креатина. В одногорлую кругл од онную колбу на 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлор- кальциевой трубкой, помещают суспензию 2.62 г (20 мМ) креатина в 20 мл диметилсульфоксида, при перемешивании на магнитной мешалке при- бавляют 3.83 г (20.11 мМ) моногидрата /?-толуолсульфокислоты - прибли- зительно через 10 мин осадок полностью растворяется. Затем прибавляют 6.71 г (20 мМ) трифторацетата этиламида фенилаланина, после его рас- творения охлаждают реакционную смесь до температуры -10 °С на водно- соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20 мМ) изо-бутилхлорформиата, в те- чение 10 мин из капельной воронки прибавляют 4.65 мл (43 мМ) морфо- лина. Реакционную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем тем- пературу постепенно доводят до комнатной. Через 20 час выпавший оса- док отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме при 50 °С. Мас- лообразный остаток растворяют в 80 мл хлороформа и оставляют на 20 час при температуре -10 °С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой (3x100мл), объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, экстрагируют хлороформом (2x80мл) и упаривают в вакууме до объема 50 мл. Полученный продукт выделяют по способу, приведенному в приме- ре 1, за исключением того, что фракции с рН = 7 (рН воды = 5) собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, прибавляют 1 М раствор соляной кислоты и упаривают.
Выход C15H23N5O2 HCI - креатинилфенилаланин этиламида гидро- хлорида - 3.7 г (32 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 341.87. Вычислено: М 341.84. Содержание основного вещества - креатинилфенилаланин этила- мида гидрохлорида по данным неводного титрования - 99.3 % масс, со- держание примеси креатинина - 0.5 % масс.
Пример 7. Получение креатинилглицилаланин этилового эфира геми- сукцината . В одногорлую кругло донную колбу объемом 100 мл, снаб- женную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 2 г (13.4 мМ) креатина моногидрата в 10 мл диметилформамида, и при перемешивании на магнитной мешалке прибав- ляют 2.54 г (13.4 мМ) моногидрата и-толуолсульфокислоты и далее - 1.41 г (6.7 мМ) гидрохлорида этилового эфира глицилаланина, 1.38 г (6.7 мМ) дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диметилформамида. Затем в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 1.14 мл (6.7 мМ) диизопропилэ- тиламина. Реакционную смесь оставляют на 20 час при комнатной темпе- ратуре, отфильтровывают осадок гидрохлоридов диизопропилэтиламина и дициклогексилмочевины, маточник упаривают при температуре 50 °С. Маслообразный остаток растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют водой (3x100мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, дважды экстрагируют хлороформом и упаривают на роторном испарителе до объема 20 мл. Полученный раствор пропускают через ко- лонку 30x150 мм, заполненную Dowex 2x8 в сукцинатной форме, элюиру- ют водой. Скорость элюирования - 2 мл/мин. Колонку промывают водой, контролируя рН элюата. Фракции с рН = 6-^7 собирают, объединяют, упа- ривают. Остаток кристаллизуют из 10 мл ацетонитрила при температуре (- )10 °С, в течение 5 часов. Осадок креатинилглицилаланин этилового эфира гемисукцината отфильтровывают, промывают холодным ацетонит- рилом, диэтиловым эфиром и высушивают. Выход неочищенного продук- та - 1.8 г.
Продукт растворяют в 15 мл этилового спирта, выдерживают 10 час при температуре (-)Ю °С, раствор фильтруют. Маточник упаривают, оста- ток растворяют в 5 мл воды и наносят на колонку с YMOGel ODS
22.5x150, уравновешенную в 0.05 % янтарной кислоте в воде. Элюируют 0.02 % янтарной кислотой, фракции анализируют с помощью ВЭЖХ. Объ- единяют фракции, содержащие целевой продукт с чистотой не менее 95 %, упаривают. Остаток высушивают отгонкой с &зо-пропиловым спиртом и кристаллизуют из диэтилового эфира.
Выход C11H21 5O4 * 0.5 С4Н6О4- креатинилглицилаланин этилового эфира гемисукцината - 0.56 г (24 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 346.33. Вычислено: М 346.36. Содержание основного вещества -креатинилгли- цилаланин этилового эфира гемисукцината по данным неводного титрова- ния - 99.4 % масс, содержание примеси креатинина по данным ВЭЖХ - 0.8 % масс.
Пример 8. Получение креатинил-у-аминомасляной кислоты эти- лового эфира ацетата. В одногорлую кругло донную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлор- кальциевой трубкой, помещают суспензию 4.20 г (32 мМ) креатина в 40 мл диметил-формамида, при перемешивании прибавляют 5.02 г (35 мМ) п- толуолсуль-фокислоты, 5.36 г (32 мМ) γ-аминомасляной кислоты этилово- го эфира гидрохлорида, после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)Ю °С на водно-соляной бане. Далее вносят 3.2 мл (33 мМ) этилхлорформиата, в течение 10 мин. из капельной воронки при- бавляют 5.1 мл (54 мМ) Ν-метилморфолина. Реакционную смесь пе- ремешивают 1 час на ледяной бане, затем температуру постепенно дово- дят до комнатной. Через 10 час отфильтровывают осадок гидрохлорида N- метилморфолина, маточник упаривают в вакууме при 50 °С. Остаток пе- рекристаллизовывают из изо-щош- лового спирта, очищают с помощью ионообменной хроматографии на колонке, заполненной Сефадексом SE С25, в пиридин-ацетатном буфере. Фракции, содержащие целевой про- дукт, объединяют, упаривают.
Выход C10H20N4O3 * С2Н4О2- креатинил-у-аминомасляной кислоты этилового эфира ацетата - 1.95 г (25.0 %). Масс-спектр, найдено: m/z:
304.34. Вычислено: М 304.35. Содержание основного вещества - креати- нил-у-амино-масляной кислоты этилового эфира ацетата по данным не- водного титрования - 98.7 % масс, содержание примеси креатинина по данным ВЭЖХ - 1.2 % масс.
Пример 9. Получение креатинилаланин этилового эфира ацетата. В одногорлую круглодонную колбу объемом 100 мл, снабженную капель- ной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркалышевой трубкой, поме- щают суспензию 2 г (13.4 мМ) креатина моногидрата в 10 мл диметил- формамида, и при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 2.54 г (13.4 мМ) моногидрата и-толуолсульфокислоты и далее - l.Olr (6.7 мМ) гидрохлорида этилового эфира аланина, 0.85 г (6.7 мМ) диизопропилкар- бодиимида в 2 мл диметилформамида. Затем в течение 10 мин из ка- пельной воронки прибавляют 0.94 мл (6.7 мМ) триэтиламина. Реакцион- ную смесь оставляют на 20 час при комнатной температуре, отфильтровы- вают выпавший осадок гидрохлоридов диизопропилэтиламина и диизо- пропилмочевины, маточник упаривают при температуре 50 °С. Маслооб- разный остаток растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют водой (3x100мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой про- дукт, дважды экстрагируют хлороформом и упаривают на роторном испа- рителе до объема 20 мл.
Полученный раствор пропускают через колонку 30x150 мм, запол- ненную Dowex 2x8 в ацетатной форме, элюируют водой. Скорость элюи- рования - 2 мл/мин. Колонку промывают водой, контролируя рН элюата. Фракции с рН = 6-^7 собирают, объединяют, упаривают. Остаток кри- сталллизуют из 10 мл ацетонитрила при температуре (-)Ю °С, в течение 5 час. Осадок креатинилаланин этилового эфира ацетата отфильтровыва- ют, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высуши- вают.
Выход C9H18N4O3* С2Н402- креатинилаланин этилового эфира ацета- та - 0.56 г (24 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 290.35. Вычислено: М 290.31. Содержание основного вещества - креатинилаланин этилового эфира аце- тата по данным неводного титрования - 99.1 % масс, содержание примеси креатинина по данным ВЭЖХ - 0.9 % масс. Пример 10. Получение креатинилфенилаланин этилового эфира аце- тата.В одногорлую кругло донную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой труб- кой, помещают суспензию 11.3 г (86 мМ) креатина в 80 мл диметилфор- мамида и при перемешивании на магнитной мешалке добавляют 16 г (86 мМ) моногидрата и-толуолсульфокислоты - приблизительно через 5 ми- нут осадок полностью растворяется. Затем добавляют 11.5 г (50 мМ) фе- нилаланина этилового эфира гидрохлорида и 7.75 мл (45 мМ) диизопро- пилкарбодиимида. Далее в течение 10 минут из капельной воронки при- бавляют 8.6 мл (50 мМ) диизопропилэтиламина. Реакционную смесь ос- тавляют на 20 час при комнатной температуре, далее добавляют 10 мл воды, отфильтровывают выпавший осадок диизопропилмочевины, и ана- лизируют полученный раствор с помощью ВЭЖХ. По данным анализа реакция прошла на 50 %.
Полученный продукт выделяют по способу, приведенному в примере 1, за исключением того, что фракции с рН = 7 (рН воды = 5) собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, добавляют 1 М раствор уксусной кислоты и упаривают.
Выход C15H22N4O3 *С2Н4С>2 - креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата - 7.9 г (25 %). Масс-спектр, найдено: m/z: 366.37. Вычислено: М 366.41. Содержание основного вещества - креатинилфенилаланин этилово- го эфира ацетата по данным неводного титрования— 99.4 % масс, содер- жание примеси креатинина - 0.7 % масс.
Изучение нейропротекторной активности амидов креатина
Исследования здесь и далее проводили с использованием следующих амидов креатина, полученных по заявляемому способу: 1. Креатинилглицин изо-пропиловый эфир ацетат
2. Креатинилглицилглицин этиловый эфир ацетат
3. Креатинилглицин этиламид тартрат
4. Ка-карбобензокси-Ме-креатиниллизин этиловый эфир ацетат
5. Креатинилфенилаланин этиламид гидрохлорид
6. Креатинил-у-аминомасляной кислоты этиловый эфир ацетат
Исследование нейропротекторного действия амидов креатина прове- дено на моделях фокальной ишемии на крысах-самцах Вистар, возраст 12- 14 недель, масса 220-240 г. Анестезия выполнялась тиопенталом натрия в дозе 60 мг/кг. В первой группе животным за 45 мин до ишемии вводили внутривенно (в/в) раствор амида креатина в физрастворе, контрольной группе - физраствор, во второй - за сутки до ишемии животным трижды в день внутрижелудочно (per os) зондом вводили раствор амида креатина в физрастворе, контрольной группе - физраствор.
Эндоваскулярная окклюзия средней мозговой артерии проводилась по методике Koizumi, J, et al (1986), в модификации Longa, E.Z., et al (1989) и Belayev L, et al (1999). Стандартные сроки ишемии составляли 39 мин, ре- перфузии - 48 час. Для оценки размеров повреждения головного мозга жи- вотных умерщвляли, получали фронтальные срезы толщиной 2 мм. Пло- щадь зоны повреждения определялась путем окрашивания фенилтетразо- лия хлоридом и последующего получения и анализа цифровых фотогра- фий окрашенного среза. Вычислялся коэффициент повреждения головного мозга - отношение площади повреждения ко всей поверхности среза (Таб- лица 1). Таблица 1. Влияние амидов креатина на повреждение головного мозга крыс-самцов Вистар при экспериментальной ишемии/реперфузии (р<0.05).
Figure imgf000020_0001
Исследование влияния амидов креатина на сохранение когни- тивных функций при ишемии головного мозга. Ишемия головного моз- га воспроизводилась по вышеописанной методике. Раствор амида креатина или физраствор животным вводился внутривенно. Для оценки неврологи- ческого дефицита при фокальном ишемическом и реперфузионном по- вреждении головного мозга использовалась шкала Garcia et al (1955). Тес- тирование животных проводилось перед ишемией, на вторые и третьи су- тки после ишемии/реперфузии в фиксированное время для исключения изменений поведения за счет циркадного ритма. Оценивались: спонтанная активность, симметричность движений конечностей, подъем по верти- кальной сетчатой стенке, проприорецепция тела, реакции на прикоснове- ние к вибриссам. Максимальный балл по данной шкале - 18 (отсутствие неврологического дефицита), минимальный - 3 (тяжелый неврологический дефицит). Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2. Неврологическое состояние крыс по шкале Garcia на 2-е и 3-й сутки после ишемии (р<0.05).
Figure imgf000021_0001
Исследование стабильности амидов креатина в искусственном желудочном соке и плазме крови человека. Для исследования ста- бильности амидов креатина 10 мг амида креатина растворяли в 20 мл ис- кусственного желудочного сока, аликвоту раствора помещали в виалу для хроматографа. Затем виалу с раствором помещали в автосамплер хромато- графа при температуре 37 °С. Методом ВЭЖХ определяли начальную кон- центрацию амида креатина и ее относительное изменение в желудочном соке при указанной температуре (таблица 3). Таблица 3. Стабильность амидов креатина в искусственном желудоч- ном соке при температуре 37 °С.
Figure imgf000022_0001
Стабильность амидов креатина в плазме крови человека оценивали по относительному изменению концентрации амида креатина в плазме. Сме- шивали 1 мл плазмы с 0.2 мл водного раствора амида креатина с концен- трацией 5 мг/мл, выдерживали смесь при температуре 37 °С, через фикси- рованные промежутки времени отбирали аликвоту объемом 0.2 мл, сме- шивали с 0.02 мл 10 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 15 мин осадок центрифугировали при 3 00 g в течение 20 мин. В суперна- танте определяли концентрацию амида креатина методом ВЭЖХ (таблица
4)·
Таблица 4. Стабильность амидов креатина в плазме крови человека при температуре 37 °С.
Стабильность, %
Препарат
0 час 0.25 час 0.5 час 1 час
Препарат 1 100 100 99 91
Препарат 2 100 100 97 90 Препарат 3 100 100 95 90
Препарат 4 100 100 100 89
Препарат 5 100 100 97 87
Приведенные результаты показали, что при использовании заявляемо- го способа удается получить амиды креатина по более простой техноло- гии, из более дешевого сырья и с более высоким выходом. Полученные амиды креатина представляют интерес для применения в медицине, т.к. обладают нейропротекторным действием.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения амидов креатин в виде солей, заключающийся в обработке креатина и-толуолсульфокислотой в органическом рас- творителе с последующим взаимодействием полученного комплекса с производными аминокислот, содержащими первичную или вто- ричную аминогруппу, в присутствии последовательно вводимых конденсирующего агента, такого как карбодиимид или хлорангид- рид моноэфира уксусной кислоты и основания, такого как третичные амины.
Способ по п. 1 , отличающийся тем, что обработку и-толуолсульфо- кислотой осуществляют, как минимум, в эквимолярном по отноше- нию к креатину количестве
Способ по п. 1 , отличающийся тем, что в качестве креатина исполь- зуют безводный креатин.
Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве креатина исполь- зуют креатин моногидрат.
Способ по п. 1 , отличающийся тем, что в качестве производных ами- нокислот используют эфирные или амидные производные алифати- ческих и ароматических аминокислот.
Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют дициклогексилкарбодиимид.
Способ по п. 1 , отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют диизопропилкарбодиимид.
Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют изо-бутилхлорформиат.
Способ по п. 1 , отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют этилхлорформиат.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве основания, ис- пользуют основания, растворимые в органических растворителях, в количествах, обеспечивающих связывание выделяющейся кислоты.
11. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что в качестве основания исполь- зуют Ν-метилморфолин.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве основания исполь- зуют триэтиламин.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве основания исполь- зуют диизопропилэтиламин.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют диметилацетамид, Ν-метилпирролидон, диметилсульфоксид, диметилформамид.
PCT/RU2010/000534 2009-11-03 2010-09-28 Способ получения амидов креатина WO2011056091A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10828601.4A EP2497765B1 (de) 2009-11-03 2010-09-28 Verfahren zur herstellung von kreatinamiden
US13/261,286 US8735623B2 (en) 2009-11-03 2010-09-28 Process for preparing creatine amides

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009140380 2009-11-03
RU2009140380/04A RU2428414C2 (ru) 2009-11-03 2009-11-03 Способ получения амидов креатина

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011056091A1 true WO2011056091A1 (ru) 2011-05-12

Family

ID=43970135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000534 WO2011056091A1 (ru) 2009-11-03 2010-09-28 Способ получения амидов креатина

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8735623B2 (ru)
EP (1) EP2497765B1 (ru)
HU (1) HUE026935T2 (ru)
RU (1) RU2428414C2 (ru)
WO (1) WO2011056091A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2929538A1 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Creatine analogs and the use thereof
RU2579120C1 (ru) * 2015-05-19 2016-03-27 Закрытое Акционерное Общество "Вертекс" Способ получения амидов креатина

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2304591A1 (de) * 1972-02-22 1973-09-06 Pfizer 6-eckige klammer auf alpha-(omegaguanidinoalkanoylamido)-acylamido eckige klammer zu -penicillansaeuren, deren nichttoxische salze und ester
US3972872A (en) * 1974-09-23 1976-08-03 Pfizer Inc. 6-[α-(ω-Guanidinoalkanoylamido)acylamido]penicillanic acids
US5219846A (en) 1991-12-03 1993-06-15 Nicole Bru Treatment of human tumors utilizing compounds having a phosphoamides linkage or enol phosphate linkage
WO1994002127A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Eric Hultman A method of increasing creatine supply depot
RU2114823C1 (ru) 1992-12-02 1998-07-10 Фурнье Эндюстри Э Санте Аналоги 15-деоксиспергуалина, способ их получения и фармацевтическая композиция на их основе
US6093746A (en) 1997-09-05 2000-07-25 Yoshiyuki Uchida Therapeutic agents for asthma
US6166249A (en) 1996-12-20 2000-12-26 Skw Trostberg Aktiengesellschaft Creatine pyruvates
US6193973B1 (en) 1997-08-22 2001-02-27 B. David Tuttle Dietary supplement for boosting energy and increasing muscular strength
US6503951B2 (en) 1999-06-30 2003-01-07 Skw Trostberg Aktiengesellschaft Use of creatine and/or creatine derivatives for treating typical disorders in women
US6706764B2 (en) 1994-11-08 2004-03-16 Avicena Group, Inc. Use of creatine or creatine analogs for the treatment of diseases of the nervous system
US20040077719A1 (en) 2000-12-28 2004-04-22 Ralf Jager Creatine/citric acid compound, method for the production of the same and the use thereof
US6861554B2 (en) 2001-03-23 2005-03-01 Biosalts S.R.L. Creatine salt having enhanced nutritional and therapeutic efficacy and compositions containing same
US7186754B2 (en) 1999-06-25 2007-03-06 Avicena Group, Inc. Use of creatine or creatine compounds for skin preservation
RU2295261C2 (ru) 2001-03-02 2007-03-20 Дзе Ховард Фаундейшн Композиция, содержащая креатин и креатинин, и способ ее получения
RU2354645C1 (ru) 2007-11-21 2009-05-10 Закрытое Акционерное Общество "Вертекс" Амиды креатина, способ их получения, средство, обладающее нейропротекторным действием

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2304591A1 (de) * 1972-02-22 1973-09-06 Pfizer 6-eckige klammer auf alpha-(omegaguanidinoalkanoylamido)-acylamido eckige klammer zu -penicillansaeuren, deren nichttoxische salze und ester
US3972872A (en) * 1974-09-23 1976-08-03 Pfizer Inc. 6-[α-(ω-Guanidinoalkanoylamido)acylamido]penicillanic acids
US5219846A (en) 1991-12-03 1993-06-15 Nicole Bru Treatment of human tumors utilizing compounds having a phosphoamides linkage or enol phosphate linkage
WO1994002127A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Eric Hultman A method of increasing creatine supply depot
RU2114823C1 (ru) 1992-12-02 1998-07-10 Фурнье Эндюстри Э Санте Аналоги 15-деоксиспергуалина, способ их получения и фармацевтическая композиция на их основе
US6706764B2 (en) 1994-11-08 2004-03-16 Avicena Group, Inc. Use of creatine or creatine analogs for the treatment of diseases of the nervous system
US6166249A (en) 1996-12-20 2000-12-26 Skw Trostberg Aktiengesellschaft Creatine pyruvates
US6193973B1 (en) 1997-08-22 2001-02-27 B. David Tuttle Dietary supplement for boosting energy and increasing muscular strength
US6093746A (en) 1997-09-05 2000-07-25 Yoshiyuki Uchida Therapeutic agents for asthma
US7186754B2 (en) 1999-06-25 2007-03-06 Avicena Group, Inc. Use of creatine or creatine compounds for skin preservation
US6503951B2 (en) 1999-06-30 2003-01-07 Skw Trostberg Aktiengesellschaft Use of creatine and/or creatine derivatives for treating typical disorders in women
US20040077719A1 (en) 2000-12-28 2004-04-22 Ralf Jager Creatine/citric acid compound, method for the production of the same and the use thereof
RU2295261C2 (ru) 2001-03-02 2007-03-20 Дзе Ховард Фаундейшн Композиция, содержащая креатин и креатинин, и способ ее получения
US6861554B2 (en) 2001-03-23 2005-03-01 Biosalts S.R.L. Creatine salt having enhanced nutritional and therapeutic efficacy and compositions containing same
RU2354645C1 (ru) 2007-11-21 2009-05-10 Закрытое Акционерное Общество "Вертекс" Амиды креатина, способ их получения, средство, обладающее нейропротекторным действием

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.A. GERSHKOVICH, V.K. KIBIREV: "Synthese der Peptide. Reagens und Verfahren", NAUKOVA DUMKA, 1987
KOIZUMI, J. ET AL., METHODE, 1986
LONGA, E.Z. ET AL., MODIFIKATIONEN, 1989
N. BRUSTOVETSKY ET AL., J. OF NEUROCHEMISTRY, vol. 76, 2001, pages 425 - 434
See also references of EP2497765A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2009140380A (ru) 2011-05-10
US20120277459A1 (en) 2012-11-01
EP2497765A1 (de) 2012-09-12
EP2497765B1 (de) 2015-11-11
US8735623B2 (en) 2014-05-27
RU2428414C2 (ru) 2011-09-10
EP2497765A4 (de) 2013-05-01
HUE026935T2 (hu) 2016-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2217580T3 (es) Composiciones orales de levosimendan.
JP2022513392A (ja) 活性分子送達のための胆汁酸及びそれらの誘導体の抱合体
AU2016253911B2 (en) Carboxylic acid URAT1 inhibitor containing diarylmethane structure, preparation method and use thereof
DK2692719T3 (en) A process for the preparation of kreatinfedtestere, thus prepared and to their use kreatinfedtestere
CN110256313B (zh) 一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用
WO2021088938A1 (zh) 四氢吡啶并嘧啶类抑制剂及其制备方法和应用
US8350077B2 (en) Amides of creatine, method of their preparation, and remedy possessing a neuroprotective activity
RU2428414C2 (ru) Способ получения амидов креатина
US20150239890A1 (en) Crystal of n-[2-(amino)-2-methylpropyl]-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine-6-carboxamide
CN102250179B (zh) 环磷腺苷盐的化合物实体及其用途
BR112021007684A2 (pt) cocristal, composição farmacêutica, métodos para tratar uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da modificação da cadeia de transporte de elétrons, para reduzir os níveis de triglicerídeos, para tratar uma doença ou distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste em uma síndrome metabólica, diabetes tipo ii, uma hiperlipidemia congênita e hiperlipidemia induzida por drogas, para tratar uma condição relacionada à disfunção mitocondrial, para melhorar o desempenho esportivo, resistência, construção de forma ou força muscular, ou facilitar a recuperação dos efeitos do treinamento ou competição e para tratar ou prevenir distrofinopatia, sarcoglicanopatia ou disferlinopatia, processo para preparar um cocristal, e, uso de um cocristal
JPH06509817A (ja) グルタチオンアルキルエステルと非アミノ酸類との塩類
RU2354645C1 (ru) Амиды креатина, способ их получения, средство, обладающее нейропротекторным действием
EP1457492B1 (en) Crystals of taxane derivative and process for their production
JP2018199718A (ja) ３−ホルミルリファマイシンｓｖ及び３−ホルミルリファマイシンｓの３−（４−シンナミル−１−ピペラジニル）アミノ誘導体を含有する医薬製剤並びにこれらの製造方法
CN108164506B (zh) 一种dpp-4酶抑制剂及其制备和应用
CN115073368B (zh) 一种米力农-5-磺基水杨酸晶型
WO2022022472A1 (zh) 烟酰胺核苷芳甲酸酯类化合物及其组合物的用途以及化合物晶型
CN109134295B (zh) 蒽二酮衍生物及其制备方法和应用
CA3179161C (en) Therapeutic compositions comprising deuterated or partially deuterated n,n-dimethyltryptamine compounds
AU2018210739B2 (en) Phenylcreatine, its use and method for its production
CN115433257A (zh) 咪唑并哒嗪类双功能protac分子化合物及其制备和应用
TW202329954A (zh) Ezh1/2抑制劑及其製備和抗腫瘤治療中的應用
WO2023241699A1 (zh) 一种环戊基腺苷衍生物及其药物用途
WO2024120448A1 (zh) 一种hdac抑制剂及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10828601

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010828601

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13261286

Country of ref document: US