WO2011049205A1 - 非滅菌発酵による乳酸製造方法 - Google Patents

非滅菌発酵による乳酸製造方法 Download PDF

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solution
cellulose
plant
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湯本勲
吉宗一晃
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独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to a novel alkalophilic lactic acid bacterium and a method for producing lactic acid by non-sterile fermentation, for example.
  • Polylactic acid an environmentally friendly biodegradable plastic, uses lactic acid as a raw material.
  • L-form or D-form lactic acid with high optical purity is required.
  • lactic acid obtained by fermentation has a high optical purity and is more advantageous than lactic acid synthesized from petroleum.
  • lactic acid fermentation is performed using edible plant biomass such as corn as a carbon source
  • production of lactic acid using (easy) food resources as a raw material causes a rise in food.
  • development of lactic acid fermentation technology using non-edible plant biomass that does not compete with food is also required.
  • Non-edible parts of rice and wheat such as rice straw and wheat straw are known as typical non-edible plant biomass. Although it differs depending on the region, rice straw is an unused resource that is disposed of by field burning or plowing into farmland, and only about half of it is used. However, since cellulases that saccharify rice straw are expensive, rice straw is difficult to use.
  • a hydrolysis method using concentrated sulfuric acid is used for saccharification of woody biomass.
  • problems of neutralization cost after concentrated sulfuric acid treatment and increase in environmental load due to the use of concentrated sulfuric acid.
  • it is necessary to purify glucose from the concentrated sulfuric acid treatment solution, which contributes to further cost increase.
  • the medium is heat sterilized at 120 ° C. for 20 minutes before inoculating lactic acid bacteria.
  • the sterilization operation not only an expensive facility such as a boiler is required for the culture apparatus, but also the cost for the sterilization operation is high. Further, since pressure is applied to sterilization, the container is required to be sturdy and requires a high initial cost.
  • Patent Documents 1 and 2 lactic acid fermentation using plant biomass as a raw material in an open system in which sterilization is not performed is known.
  • Patent Document 1 In the method of inoculating a large amount of lactic acid bacteria (Patent Document 1), about 2.5% of L-lactic acid can be obtained per 3 days in 3 days.
  • Patent Document 2 In addition, in lactic acid fermentation at a high temperature of about 45 ° C. (Patent Document 2), about 4% of L-lactic acid can be obtained per culture solution in 2 days.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing lactic acid from plant biomass without requiring a sterilization operation, for example.
  • an alkaliphilic lactic acid bacterium producing high concentration of lactic acid was isolated from rice straw-derived glucose, and according to the alkaliphilic lactic acid bacterium, non-sterile plant non-edible part biomass-derived The inventors have found that a high concentration of lactic acid can be produced from a saccharified solution, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • a method for producing glucose comprising a step of immersing plant biomass in an alkaline solution to remove lignin and a step of contacting cellulose fibers with cellulase.
  • a composition for lactic acid fermentation containing glucose obtained by the method according to any one of (10) to (14).
  • lactic acid can be obtained in high yield from cellulosic plant biomass without sterilization. Further, according to the present invention, the conventional complicated and costly process such as high-pressure steam sterilization can be omitted, and the cost reduction in lactic acid production can be achieved.
  • the lactic acid bacterium according to the present invention consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 95% or more (preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, Most preferably, it is an alkaliphilic lactic acid bacterium belonging to Enterococcus having a 16S ribosomal RNA (rRNA) gene having 100% homology.
  • alkaline lactic acid bacteria means, for example, lactic acid bacteria that can grow under alkaline conditions of pH 9 or higher (preferably pH 10 or higher).
  • lactic acid bacterium According to the lactic acid bacterium according to the present invention that grows under alkaline conditions due to the fact that there are few microorganisms (miscellaneous) that can grow under alkaline conditions of about pH 10, sterilization of saccharified liquid containing glucose and xylose derived from plant biomass It can be used for lactic acid fermentation (particularly, lactic acid fermentation under alkaline conditions).
  • Sequence homology can be determined by, for example, using a program published on the homepage of DNA-Data-Bank-of-Japan (DDBJ) (http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html) or DNA sequence analysis software such as ClustalX. Can be determined using.
  • DDBJ DNA-Data-Bank-of-Japan
  • ClustalX DNA sequence analysis software
  • lactic acid bacteria according to the present invention examples include lactic acid bacteria having the above-mentioned characteristics belonging to Enterococcus casseriflavus, particularly Enterococcus casseriflavus L-120 strain (hereinafter referred to as “L-120 strain”). Moreover, the mutant strains of the lactic acid bacteria obtained by mutating by natural or artificial means and growing under alkaline conditions and performing lactic acid fermentation are included in the lactic acid bacteria according to the present invention.
  • a sample derived from the natural world such as a drain outlet, soil, vegetation, etc. is added to a culture solution (medium) containing 10% glucose, 1% yeast extract and 100 mM carbonate buffer (pH 10).
  • a culture solution medium
  • glucose 10% glucose
  • yeast extract 10% yeast extract
  • 100 mM carbonate buffer pH 10
  • a method of adding and isolating bacteria that grow well under non-aerated conditions as lactic acid bacteria according to the present invention can be mentioned. According to this method, the L-120 strain could be isolated.
  • the growth possible pH is 5 to 12 (the optimum growth pH is 6 to 9, and even at pH 10, it has 50% or more of the growth rate at pH 7).
  • the growth temperature is 25 ° C to 46 ° C (optimal growth temperature is 35 to 40 ° C).
  • the L-120 strain showed high homology of 99.9% (1244 bases in 1245 bases) with Enterococcus casseliflavus.
  • the L-120 strain was determined to be a new strain belonging to Enterococcus caselliflavus.
  • Enterococcus casseriflavus (IFO 12256 strain) reported so far has reported that the yield of lactic acid is 78% and the optical purity of L-lactic acid is 99% when glucose is used as a substrate. (Taniguchi, M., T. Tokunaga, K. Horiuchi, K. Hoshino, K. Sakai, T. Tanaka (2004) Production of L-lactic acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic acid bacteria Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 160-165).
  • the L-120 strain has an optical purity of 100% L-lactic acid obtained with a yield of lactic acid based on glucose of 96 to 100%. From the viewpoint of the utilization of lactic acid production, it is recognized that it is superior to the conventionally known Enterococcus caselliflavus or other Enterococcus bacteria.
  • the method for producing lactic acid according to the present invention is a method in which the lactic acid bacterium according to the present invention is brought into contact with a cellulose saccharified solution under a pH condition of, for example, pH 5 to 11, regardless of sterilization, cultured, and lactic acid fermentation is performed. It is.
  • the method for producing lactic acid according to the present invention can be performed under non-sterilization.
  • the lactic acid bacterium according to the present invention is cultured in a medium containing cellulose saccharified solution under non-sterile and alkaline conditions of pH 9 to 11 (preferably pH 10 to 11), and after cell growth.
  • lactic acid can be produced by further culturing under pH conditions of pH 5 to 9 (preferably pH 7) and subjecting it to lactic acid fermentation.
  • “under non-sterilization” means that a sterilization operation is not performed through the steps of the lactic acid production method according to the present invention.
  • the cellulose saccharified solution (medium) as a raw material usually requires sterilization, but in the present invention, there are few microorganisms (miscellaneous bacteria) that can grow under alkaline conditions of about pH 10, and the lactic acid bacteria according to the present invention are under alkaline conditions.
  • the cellulose saccharified solution can be used for culturing and lactic acid fermentation (especially culturing under alkaline conditions and lactic acid fermentation) without performing sterilization treatment.
  • a lactic acid bacterium and a cellulose saccharified solution according to the present invention are prepared.
  • a lactic acid bacteria according to the present invention for example, in a medium comprising the following composition (10% glucose, 1% yeast extract and 100 mM carbonate buffer (pH 10)), a temperature of 25 to 45 ° C. (preferably 30 to 37 ° C.) and a pH of 7 to
  • a sufficient amount of lactic acid bacteria according to the present invention to be inoculated can be prepared by culturing for 10 hours (preferably pH 9 to 10) for a sufficient time.
  • a cellulose saccharified solution containing a high concentration of glucose can be obtained by immersing plant biomass in an alkaline solution to remove lignin and bringing the cellulose fiber after lignin removed into contact with cellulase.
  • alkaline solution to be used include a caustic soda (sodium hydroxide) solution, a potassium hydroxide solution, a sodium carbonate solution, a calcium hydroxide solution, and the like, and a caustic soda solution is preferable.
  • Plant biomass includes a complex of cellulose fiber crystal structure and lignin, and is composed of cellulose, hemicellulose, lignin and the like.
  • plant biomass include herbaceous biomass and soft cellulose.
  • herbaceous biomass or soft cellulose include non-edible parts (non-edible cellulosic plant biomass) of plants such as rice straw, wheat straw, paper sludge, corn stalk, sugarcane pomace, rice husk and the like.
  • a non-edible cellulosic plant biomass of a plant that is an annual plant for cultivation such as rice straw, wheat straw, and corn stalk is preferred.
  • the plant biomass is rice straw
  • 1L of 0.1-2 N (preferably 0.2N or more) alkaline solution such as caustic soda per 50g of rice straw
  • the mixture is left at room temperature for half a day (for example, 1 day) or subjected to a heat treatment at a high temperature of 50 ° C. or more (for example, 50 ° C. to 120 ° C.) for 10 minutes or more (for example, 20 minutes).
  • lignin is eluted in the solvent.
  • the obtained cellulose fiber is thoroughly washed with water, adjusted to pH 2 to 6, and then compressed and dehydrated.
  • cellulase is added per 50 g of the obtained wet cellulose, cellulase is added, and the mixture is reacted at 25 to 70 ° C. (eg 37 ° C.) for 2 hours or longer (eg 10 hours).
  • the cellulase used include commercially available biomass cellulase such as Cellic® CTec manufactured by Novozymes and cellulase derived from Trichoderma® reesei.
  • the amount of cellulase added to the wet cellulose is, for example, 500 to 3,000 EGU (Endo Glucanase Unit), preferably 2,000 to 3,000 EGU per 50 g of wet cellulose.
  • Saccharification can be promoted by further adding xylanase having ⁇ -glucanase activity (for example, Cellic®HTec manufactured by Novozymes).
  • xylanase having ⁇ -glucanase activity for example, Cellic®HTec manufactured by Novozymes.
  • the amount of xylanase added to the wet cellulose is, for example, 500 to 3,000 FXU (Farvet Xylan Unit) per 50 g of wet cellulose, preferably 2,000 to 3,000 FXU.
  • a new solution of wet cellulose is added to the reaction solution, and the reaction is repeated several times (for example, 5 times) to obtain a high-concentration glucose solution.
  • the cellulose saccharified solution (glucose) thus obtained can be used as a cellulose saccharified solution used in the lactic acid production method according to the present invention or as a composition for lactic acid fermentation (medium).
  • a nitrogen source for example, 30 g of okara or 5 g of yeast extract is preferably added per 500 ml of 150 g / L glucose-containing cellulose saccharified solution.
  • a bran digest obtained by cellulase hydrolysis (for example, 1.5% by weight with respect to the whole medium) as a vitamin and mineral source, and fish-derived peptone (for example, the whole medium) that is a nitrogen source. 0.3 wt%) can be added.
  • the prepared lactic acid bacteria according to the present invention can be inoculated into a medium containing a cellulose saccharified solution, cultured, and lactic acid fermentation can be performed without performing a sterilization operation.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention are inoculated with, for example, 0.01 g or more (preferably 0.05 g or more) of wet cells per 100 g of glucose in a cellulose saccharified solution, and pH 9 to 11 (for example, pH 9 or more). Cultivated at a temperature of 20-40 ° C. (eg 30 ° C.) and preferably at a temperature of 20-40 ° C.
  • Lactic acid fermentation is performed by culturing for 3 days.
  • L lactic acid having a high optical purity of 95% or higher at a high concentration for example, 12% (W / V) in the culture solution
  • lactic acid can also be manufactured from the xylose obtained by saccharification of cellulosic biomass. Therefore, the cellulose saccharified solution may contain not only glucose but also xylose.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention are inoculated into a medium containing a cellulose saccharified solution, and the culture and lactic acid fermentation are carried out under neutral pH conditions (for example, pH 6 to 8, preferably pH 7). High concentration lactic acid can also be obtained by carrying out in
  • the culture solution itself recovered from the cells by centrifugation or the like may be used as lactic acid, or lactic acid can be purified / extracted by subjecting it to more general purification means or extraction means.
  • Example 1 ⁇ Isolation of alkaliphilic lactic acid bacteria> The scale at the drain was added to a culture solution containing 10% glucose, 1% yeast extract and 100 mM carbonate buffer (pH 10), and a fungus that grew well under anaerobic conditions was isolated and named strain L-120. Specific isolation of bacteria is a non-sterile, anaerobic condition in which air is replaced with nitrogen and a pH controller in a culture in which the delignified rice straw saccharified solution described below is maintained at a pH of 10 with an anaerobic condition. This was done by isolating bacteria that grew spontaneously under the condition of maintaining the pH at 10.
  • the L-120 strain obtained from the isolation process described above is the same as the rice straw saccharified solution because the same type of bacteria grows even if other strains are inoculated into the medium using the delignified rice straw saccharified solution as a substrate. It is considered that the strain is highly compatible with a culture medium using sucrose as a substrate.
  • Example 2 ⁇ Lactic acid productivity of L-120 strain under general culture conditions> L-120 strain, glucose 16.2wt% (including glucose by fusuma hydrolysis), yeast extract 0.8wt%, fish-derived peptone 0.3wt% and bran digest (degraded by cellulase manufactured by Amano Enzyme) 1.5wt% was maintained at pH 9 with 10N NaOH with a pH controller and cultured under anaerobic conditions at 35 ° C. After 67 hours of culture, 16.9 wt% lactic acid was obtained per liter, and the recovery rate was about 100% with respect to glucose added to the medium.
  • the optical purity of the obtained lactic acid was measured by high performance liquid chromatography (HPLC) using a column SUMICHIRAL OA-500 (4.6 mm x 150 mm) and 1 mM copper sulfate as the liquid phase.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the left panel is the HPLC analysis result of the standard containing 50% each of L-form and D-form of lactic acid
  • the right panel is the HPLC analysis result of L-lactic acid produced by L-120 strain. is there.
  • 100% of the lactic acid produced by the L-120 strain was L-form.
  • Example 3 ⁇ Saccharification of rice straw cellulose> 1 L of 1N caustic soda per 50 g of rice straw cut to a length of about 10 cm or less was added and heated at 120 ° C. for 20 minutes.
  • FIG. 2 shows the added amount of delignified rice straw and the concentration (g / L) of sugar (glucose) produced by cellulase and xylanase. As shown in FIG. 2, 160 g / L of sugar (glucose) was detected in the saccharified solution obtained by adding a total of 80 g of delignified rice straw.
  • Example 4 ⁇ Lactic acid fermentation 1 using alkaline strain L-120> 1 L of 1N caustic soda per 50 g of rice straw cut to a length of about 10 cm or less was added and heated at 120 ° C. for 20 minutes. After cooling, the cellulose filtered through a case was thoroughly washed with water, and then squeezed to remove water well to obtain wet cellulose. In this way, 100 g of wet cellulose per 50 g of rice straw was obtained.
  • Table 1 shows the lactic acid concentration (W / V%) in the culture solution obtained by the above culture (lactic acid fermentation) with respect to the number of culture days.
  • Example 5 ⁇ Lactic acid fermentation 2 under neutral conditions using L-120 strain> Without sterilization, L-120 strain (wet cells 0.1 g) was inoculated into a medium containing glucose 20% (W / V) and yeast extract 5% (W / V), and neutral conditions (pH 7 ) For 3 days at 30 ° C. After culturing for 3 days, 17% (W / V) lactic acid was obtained in the obtained culture broth. Even when sterilization was performed, the same high concentration of lactic acid could be obtained.
  • Example 6 ⁇ Xylose metabolism of L-120 strain> When cellulosic biomass is saccharified, about 20% of the total reducing sugar is xylose. For this reason, in order to utilize cellulosic biomass effectively, utilization of xylose becomes indispensable. However, xylose is very difficult to use compared to glucose, and for example, xylose cannot be used in most yeasts.
  • FIG. 3 shows the concentration of organic acid produced by the L-120 strain using a medium (containing 5 wt% yeast extract) containing 16 wt% glucose and 2.4 wt% xylose as a carbon source.
  • each graph shows the following sugar and organic acid concentrations: Graph indicated by black square dots: Glucose concentration Graph indicated by black circle dots: Xylose concentration Graph indicated by white circle dots: Lactic acid concentration White triangle Graph indicated by dots: Graph indicated by dots of acetic acid concentration x: Concentration of formic acid L-120 strain in the medium while suppressing the growth of miscellaneous bacteria at pH 9 without aeration until the inoculum grows sufficiently Was cultured for 20 hours.
  • the L-120 strain was cultured for 8 days under pH 7.5, which is highly productive of lactic acid and easily metabolizes xylose.
  • pH 7.5 which is highly productive of lactic acid and easily metabolizes xylose.
  • 11 wt% lactic acid was obtained, and the residual xylose concentration was 0.2 wt%.
  • the L-120 strain can metabolize not only glucose but also xylose to perform lactic acid fermentation, and has characteristics suitable for lactic acid production from saccharified liquid of cellulosic biomass.
  • Example 7 ⁇ Search for substances that promote lactic acid fermentation> In addition to glucose, lactic acid fermentation requires the addition of a nitrogen source, various vitamins and minerals. In order to add these nutrients, it is common to add yeast extract, but because of its high cost, we searched for alternative substances.
  • FIG. 4 shows a culture medium containing glucose 18 wt%, yeast extract 0.8 wt% and fish meat-derived peptone 0.3 wt%, and the L-120 strain at pH 9 at 27 ° C. (graph indicated by black square dots) or 35 ° C. (Graph indicated by black triangular dots) or further added 1.5 wt% of the bran degradation product to the medium, and the L-120 strain at 35 ° C under pH 9 in the medium containing the bran degradation product.
  • concentration (g / L) of lactic acid produced when cultured is shown.
  • lactic acid productivity of the L-120 strain could be improved by adding bran hydrolyzed with cellulase as a vitamin and mineral source and adding fish-derived peptone as a nitrogen source.
  • generation rate can be improved by making culture
  • a medium suitable for lactic acid fermentation can be produced from non-edible plant biomass such as rice straw, raw materials for lactic acid production can be obtained at low cost without competing with food.
  • sterilization by high temperature and high pressure is not required in lactic acid production, the lactic acid fermentation apparatus can be greatly simplified.

Abstract

　本発明は、滅菌操作を必要とすることなく、植物バイオマスから乳酸を製造する方法、具体的には、好アルカリ性乳酸菌を非滅菌且つpH9～11下でセルロース糖化液を含む培地において培養した後、pH5～9下でさらに培養する、乳酸製造方法に関する。

Description

非滅菌発酵による乳酸製造方法
　本発明は、例えば好アルカリ性の新規乳酸菌及び非滅菌発酵による乳酸製造方法に関する。
　環境に優しい生分解性プラスチックであるポリ乳酸は乳酸を原料とする。ポリ乳酸の品質を高めるためには、L体又はD体の光学純度の高い乳酸が必要である。この点、発酵により得られる乳酸は高い光学純度を有し、石油から合成する乳酸よりも有利である。
　また今後、石油資源の枯渇が予想されるため、将来的に石油由来のプラスチックをポリ乳酸に置き換える必要がある。しかしながら、ポリ乳酸は石油由来プラスチックと比較して高価であるため、乳酸発酵コストの低減が求められている。
　一般的に、乳酸発酵は、トウモロコシ等の食用植物バイオマスを炭素源として行われるため、(安易な)食料資源を原料とした乳酸の生産は食料の高騰を引き起こす原因となる。このため、食料と競合しない非食用植物バイオマスを用いた乳酸発酵技術の開発も求められている。
　非食用植物バイオマスの代表的なものとして稲ワラ及び麦ワラ等の稲及び麦の非可食部が知られている。地域によって異なるものの、稲ワラは野焼きや農地へのすき込みによって処分され、半分程度しか利用されていない未利用資源である。しかしながら、稲ワラを糖化するセルラーゼが高価であることから、稲ワラは利用されにくい。
　木質バイオマスの糖化には、濃硫酸による加水分解法が用いられている。しかしながら、当該方法によれば、濃硫酸処理後の中和コストや濃硫酸を使うことによる環境負荷の増大が問題となっている。さらに、濃硫酸処理液からグルコースを精製する必要があり、更なるコスト上昇の一因となっている。
　公知の乳酸発酵では、乳酸菌を植菌する前に培地を120℃で20分間熱殺菌する。この滅菌操作のために、培養装置にはボイラー等の高価な施設が必要となるだけでなく、滅菌操作にかかるコストが大きい。また、滅菌に圧力をかけるため、容器も頑丈なものが求められ、高い初期コストを要する。
　一方、滅菌操作を行わない開放系において植物バイオマスを原料とした乳酸発酵が知られている(特許文献１及び２)。大量の乳酸菌を植菌する方法(特許文献１)では、3日間で培養液当たり2.5％程度のL-乳酸を得ることができる。また、45℃程度の高温での乳酸発酵(特許文献２)では、2日間で培養液当たり4％程度のL-乳酸を得ることができる。
　しかしながら、大量に乳酸菌を植菌する方法では乳酸発酵を行う際に大量の菌体を培養する必要がありコストと手間がかかる。一方、高温(45℃程度)で乳酸発酵を行う場合、発酵槽を高温に保つためのコストが必要である。さらにこれらの乳酸発酵では、最高でも培養液当たり4％程度の乳酸しか得られず、発酵に続く乳酸精製コストが高くなる欠点がある。
　従って、滅菌操作を行わずに少ない植菌量で室温において植物バイオマスから乳酸発酵を行う方法が求められている。
特開2000-245491号公報 特開2005-73549号公報
　本発明は、上述した実情に鑑み、例えば滅菌操作を必要とせずに、植物バイオマスから乳酸を製造する方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、稲ワラ由来グルコースから高濃度の乳酸を生成する好アルカリ性乳酸菌を単離し、当該好アルカリ性乳酸菌によれば非滅菌の植物非可食部バイオマス由来の糖化液から高濃度の乳酸を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
　（１）配列番号１に記載の塩基配列から成るか又は配列番号１に記載の塩基配列と95％以上の相同性を有する16S リボソームRNA遺伝子を有し、且つpH10以上のアルカリ条件下で生育するエンテロコッカス(Enterococcus)に属する好アルカリ性乳酸菌。
　（２）エンテロコッカス・キャセリフラバス(Enterococcus casseliflavus)に属する、（１）記載の好アルカリ性乳酸菌。
　（３）受託番号FERM BP-11295で特定される微生物である、（１）又は（２）記載の好アルカリ性乳酸菌。
　（４）（１）～（３）のいずれか１記載の好アルカリ性乳酸菌を非滅菌且つpH9～11下でセルロース糖化液を含む培地において培養した後、pH5～9下でさらに培養する工程を含む、乳酸製造方法。
　（５）セルロース糖化液が、植物の非可食部から得られたものである、（４）記載の方法。
　（６）前記植物の非可食部が、稲ワラ、麦ワラ又はトウモロコシ茎である、（５）記載の方法。
　（７）植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬し、リグニンを除去する工程と、セルロース繊維をセルラーゼと接触させ、セルロース糖化液を得る工程とを含む、（４）～（６）のいずれか１記載の方法。
　（８）アルカリ溶液が苛性ソーダ溶液である、（７）記載の方法。
　（９）上記浸漬した植物バイオマスを室温で放置するか又は加熱処理に供することを含む、（７）又は（８）記載の方法。
　（１０）植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬し、リグニンを除去する工程と、セルロース繊維をセルラーゼと接触させる工程とを含む、グルコースを生成する方法。
　（１１）植物バイオマスが植物の非可食部である、（１０）記載の方法。
　（１２）前記植物の非可食部が、稲ワラ、麦ワラ又はトウモロコシ茎である、（１１）記載の方法。
　（１３）アルカリ溶液が苛性ソーダ溶液である、（１０）～（１２）のいずれか１記載の方法。
　（１４）上記浸漬した植物バイオマスを室温で放置するか又は加熱処理に供することを含む、（１０）～（１３）のいずれか１記載の方法。
　（１５）（１０）～（１４）のいずれか１記載の方法により得られたグルコースを含む乳酸発酵用組成物。
　（１６）おからを含む、（１５）記載の乳酸発酵用組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-244894号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、滅菌操作無しにセルロース系植物バイオマスから高収量で乳酸を得ることできる。また本発明によれば、従来における高圧蒸気滅菌等の煩雑でコストの高い工程を省略でき、乳酸製造における低コスト化を図ることができる。
L-120株の培養液中に産生された乳酸の光学純度を示すHPLC分析の結果である。 脱リグニン稲ワラの添加量と生成した糖(グルコース)濃度(g/L)との関係を示すグラフである。 L-120株によるキシロース代謝を示すグラフである。 L-120株による乳酸発酵促進物質存在下での乳酸生成を示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る乳酸菌は、配列番号１に記載の塩基配列から成るか又は配列番号１に記載の塩基配列と95％以上(好ましくは96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、最も好ましくは100％)の相同性を有する16S リボソームRNA(rRNA)遺伝子を有するエンテロコッカス(Enterococcus)に属する好アルカリ性乳酸菌である。ここで、「好アルカリ性乳酸菌」とは、例えば、pH9以上(好ましくはpH10以上)のアルカリ条件下で生育することができる乳酸菌を意味する。pH10程度のアルカリ条件下で生育できる微生物(雑菌)が少ないことに起因して、アルカリ条件下で生育する本発明に係る乳酸菌によれば、植物バイオマス由来のグルコース及びキシロースを含む糖化液を滅菌処理することなく乳酸発酵(特に、アルカリ条件下の乳酸発酵)に使用できる。
　配列相同性は、例えばDNA Data Bank of Japan(DDBJ)のホームページ(http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)に掲載のプログラム又はClustalX等のDNA配列解析ソフトを使用して決定することができる。
　本発明に係る乳酸菌としては、例えばエンテロコッカス・キャセリフラバスに属する上記特性を有する乳酸菌が挙げられ、特にエンテロコッカス・キャセリフラバスL-120株(以下、「L-120株」と称する)が挙げられる。また、自然的又は人工的手段によって変異させて得られ且つアルカリ条件下で生育し、乳酸発酵を行う、上記乳酸菌の変異株は、本発明に係る乳酸菌に含まれる。
　本発明に係る乳酸菌の単離方法としては、例えば、排水口、土壌、草木等の自然界由来の試料を10％グルコース、1％酵母エキス及び100mM 炭酸バッファー(pH10)を含む培養液(培地)に添加し、非通気条件下で良好に生育する菌を本発明に係る乳酸菌として単離する方法が挙げられる。当該方法によれば、L-120株を単離することができた。
　以下に単離したL-120株の菌学的性質を説明する。
〔形態的性質〕
(1)グラム染色：陽性
(2)芽胞：無し
(3)運動性：無し
(4)菌形：球菌
〔培養的性質〕
　コロニーの色調は白色半透明であり、コロニーの形状は小さな円形であり、コロニーの表面は平滑である。液体培養時には、培養後期に黄色の色素を生産する。
〔生理学的性質〕
　生育可能pHは5～12（最適生育pHは6～9であり、pH10においてもpH7での生育速度の50%以上を有する）である。また、生育可能温度は25℃～46℃(最適生育温度は35～40℃）である。
〔化学分類学的性質〕
　L-120株のDNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅して得られた16S rRNA遺伝子の塩基配列(配列番号１)をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べた。
　その結果、16S rRNA遺伝子について、L-120株はエンテロコッカス・キャセリフラバス(Enterococcus casseliflavus)と99.9％(1245塩基中1244塩基が一致)の高い相同性が示された。
　以上より、L-120株はエンテロコッカス・キャセリフラバスに属する新菌株であると判断した。
　これまで報告されているエンテロコッカス・キャセリフラバス(IFO 12256株)は、グルコースを基質とした場合の乳酸の収率が78％で、L-乳酸の光学純度が99％であることが報告されている(Taniguchi, M., T. Tokunaga, K. Horiuchi, K. Hoshino, K. Sakai, T. Tanaka (2004) Production of L-lactic acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 160-165)。また、従来において、エンテロコッカス・キャセリフラバスに関して、pH9.6での生育が報告されているが、pH10における生育は報告されていない（Ludwig, W., Schleifer, K.-H., Whtman W. B. In P. De Vos et al. eds, Bwegey’s Manual of Systematic Bacteriology Second edition Vol. 3 The Frimicutes. Springer, Dordrecht, Heidelberg, London, New York, pp. 594-607）。さらに、上記バージェーズマニュアル（Bwegey’s Manual of Systematic Bacteriology）を初めその他の文献による記載において、エンテロコッカス属細菌がpH10以上で生育し、乳酸を産生する記載は無い。
　一方、L-120株は後述の実施例で示す様にグルコースに対する乳酸収率が96～100％で得られるL-乳酸の光学純度が100％であり、pH10で良好な生育（24時間培養で明らかな生育が認められる）を示すことから、従来知られているエンテロコッカス・キャセリフラバス又はその他のエンテロコッカス属細菌と比較して、乳酸産生の利用性の面から明らかな優位性が認められる。
　L-120株は、平成21年(2009年)9月14日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国 茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に受託番号FERM P-21847として寄託され、さらに平成22年(2010年)9月8日付けで受託番号FERM BP-11295として国際寄託へ移管されている。
　本発明に係る乳酸製造方法は、上述の本発明に係る乳酸菌を、滅菌の有無を問わず、例えばpH5～11のpH条件下においてセルロース糖化液と接触させ、培養し、且つ乳酸発酵を行う方法である。特に、本発明に係る乳酸製造方法を非滅菌下で行うことができる。例えば、本発明に係る乳酸製造方法では、本発明に係る乳酸菌を、非滅菌且つpH9～11(好ましくはpH10～11)のアルカリ条件下でセルロース糖化液を含む培地において培養し、菌体増殖後に、例えばpH5～9(好ましくはpH7)のpH条件下でさらに培養し、乳酸発酵に供することで、乳酸を製造できる。ここで、「非滅菌下」とは、本発明に係る乳酸製造方法の工程を通じて滅菌操作を行わないことを意味する。特に、原料となるセルロース糖化液(培地)は通常滅菌処理を要するが、本発明においてはpH10程度のアルカリ条件下で生育できる微生物(雑菌)が少ないこと及び本発明に係る乳酸菌がアルカリ条件下で生育できることにより、滅菌処理を行うことなく、セルロース糖化液を培養及び乳酸発酵(特にアルカリ条件下の培養及び乳酸発酵)に使用することができる。
　本発明に係る乳酸製造方法では、先ず本発明に係る乳酸菌とセルロース糖化液を準備する。本発明に係る乳酸菌については、例えば以下の組成(10％グルコース、1％酵母エキス及び100mM 炭酸バッファー(pH10))から成る培地において、温度25～45℃(好ましくは30～37℃)及びpH7～10(好ましくはpH9～10)下で十分な時間培養することで、植菌すべき十分な量の本発明に係る乳酸菌を準備することができる。
　一方、グルコースを含むセルロース糖化液の準備については、グルコースから乳酸を収率100％で生成した場合、グルコースと乳酸濃度の比は理論上1対1となる。このことは加えたグルコース濃度以上の乳酸濃度は得られないことを示している。また、乳酸発酵に続く乳酸の精製過程では高濃度乳酸溶液が求められる。さらに、稲ワラ等の植物バイオマスに含まれるリグニンは発酵阻害物質を多く含むため、乳酸発酵前に除去する必要がある。
　そこで、本発明者等は、植物バイオマスからの高濃度のグルコースの生成方法を見出した。具体的には、植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬することでリグニンを除去し、リグニン除去後のセルロース繊維をセルラーゼと接触させることで、高濃度のグルコースを含むセルロース糖化液を得ることができる。使用するアルカリ溶液としては、例えば苛性ソーダ(水酸化ナトリウム)溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、水酸化カルシウム溶液等が挙げられ、好ましくは苛性ソーダ溶液である。
　植物バイオマスは、セルロース繊維の結晶構造とリグニンとの複合体を含み、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等から構成されている。植物バイオマスとしては、例えば草本系バイオマス、ソフトセルロース等が挙げられる。さらに、草本系バイオマス又はソフトセルロースとしては、例えば稲ワラや麦ワラ、ペーパースラッジ、トウモロコシの茎、サトウキビの搾りかす、籾殻等の植物の非可食部(非食用セルロース系植物バイオマス)が挙げられる。特に、本発明においては稲ワラや麦ワラ、トウモロコシ茎等の栽培上一年生植物である植物体の非食用セルロース系植物バイオマスが好ましい。
　例えば、植物バイオマスが稲ワラである場合には、稲ワラ50g当たり1Lの0.1～2 N(好ましくは0.2N以上)の苛性ソーダ等のアルカリ溶液を加え、稲ワラをアルカリ溶液に浸漬し、良く撹拌する。次いで、当該混合物を室温で半日以上(例えば1日)放置するか、又は50℃以上の高温(例えば50℃～120℃)で10分以上(例えば20分間)の加熱処理に供する。この操作により溶媒にリグニンが溶出する。得られるセルロース繊維を水で十分に洗浄し、pHを2～6に調整した後、圧縮して脱水する。
　次いで、得られた湿潤セルロース50ｇ当たり200mlの水を入れ、セルラーゼを添加して25～70℃(例えば37℃)で2時間以上(例えば10時間)反応させる。ここで、使用するセルラーゼとしては、例えばノボザイムズ社製のCellic CTec等の市販のバイオマス用セルラーゼやトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)由来セルラーゼが挙げられる。湿潤セルロースに添加するセルラーゼ量としては、例えば湿潤セルロース50g当たり500～3,000EGU(Endo Glucanase Unit)、好ましくは2,000～3,000EGUが挙げられる。なお、β-グルカナーゼ活性を有するキシラナーゼ(例えば、ノボザイムズ社製のCellic HTec)をさらに添加することにより糖化を促進することができる。湿潤セルロースに添加するキシラナーゼ量としては、例えば湿潤セルロース50g当たり500～3,000FXU(Farvet Xylan Unit)、好ましくは2,000～3,000FXUが挙げられる。
　湿潤セルロースとセルラーゼ(又はセルラーゼとキシラナーゼとの組合せ)との反応後、反応液に新たに湿潤セルロースを添加し、反応させることを数回(例えば5回)繰り返すことで、高濃度のグルコース溶液を得ることができる。このようにして得られたセルロース糖化液(グルコース)は、本発明に係る乳酸製造方法に使用するセルロース糖化液として、又は乳酸発酵用組成物(培地)として使用することができる。なお、窒素源として、例えば150g/Lのグルコース含有セルロース糖化液500ml当たり30gのおから又は5gの酵母エキスを加えることが好ましい。さらに、乳酸発酵促進物質として、ビタミン及びミネラル源であるセルラーゼ加水分解により得られたふすま分解物(例えば、培地全体に対して1.5重量％)、並びに窒素源である魚肉由来ペプトン(例えば、培地全体に対して0.3重量％)を加えることができる。
　本発明に係る乳酸製造方法では、滅菌操作を行わずに、準備した本発明に係る乳酸菌を、セルロース糖化液を含む培地に植菌し、培養し、乳酸発酵を行うことができる。具体的には、本発明に係る乳酸菌を、例えばセルロース糖化液中のグルコース100g当たり湿潤菌体0.01g以上(好ましくは湿潤菌体0.05g以上)で植菌し、pH9～11(例えば、pH9以上、好ましくはpH10以上)及び温度20～40℃(例えば30℃)下で12～24時間(例えば24時間)培養し、その後pH5～9(好ましくはpH7)下でさらに1～5日間（好ましくは3日間)培養することで、乳酸発酵を行う。当該乳酸発酵によれば、高濃度(例えば、培養液中12％(W/V))の95％以上の高い光学純度を有するL乳酸を得ることができる。また、本発明に係る乳酸菌によれば、セルロース系バイオマスの糖化により得られるキシロースから乳酸を製造することもできる。従って、セルロース糖化液は、グルコースだけでなくキシロースも含んでいてもよい。
　あるいは、滅菌処理の有無に関係なく、本発明に係る乳酸菌を、セルロース糖化液を含む培地に植菌し、培養及び乳酸発酵を中性程度のpH条件(例えばpH6～8、好ましくはpH7)下で行うことでも、高濃度の乳酸を得ることができる。
　培養後、菌体から遠心分離等によって回収した培養液それ自体を乳酸として使用してもよく、あるいはさらに一般的な精製手段や抽出手段に供すことで、乳酸を精製/抽出することができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
＜好アルカリ性乳酸菌の単離＞
　排水口の水垢を、10％グルコース、1％酵母エキス及び100mM 炭酸バッファー(pH10)を含む培養液に添加し、嫌気条件下で良好に生育する菌を単離し、L-120株と命名した。具体的な細菌の単離は、後述する脱リグニンした稲ワラ糖化液を嫌気条件下、pHコントローラでpH10に維持した培養において、非滅菌で、空気を窒素で置換した嫌気条件下で且つpHコントローラでpHを10に維持した条件下で自然発生的に生育した細菌を分離することによって行った。以上の単離の経緯から得られたL-120株は、脱リグニンした稲ワラ糖化液を基質とした培地に他の菌株を接種しても同種の細菌が生育することから、稲ワラ糖化液を基質とした培地に非常に適合性の高い菌株であるものと考えられる。
［実施例２］
＜L-120株の一般的な培養条件下における乳酸産生性＞
　L-120株を、グルコース16.2wt％(フスマ加水分解によるグルコースを含む)、酵母エキス0.8wt％、魚肉由来ペプトン0.3wt％及びふすま分解物（天野エンザイム社製セルラーゼによって分解したもの）1.5wt％を含む培地において、pHコントローラで10N NaOHによりpH9に維持し、35℃における嫌気条件下で培養した。67時間の培養後、1L当たり16.9wt％の乳酸が得られ、培地に投入したグルコースに対して約100％の回収率であった。
　得られた乳酸の光学純度を、カラムSUMICHIRAL OA-500 (4.6 mm × 150 mm)を使用し、液相として1mM硫酸銅を使用した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定した。結果を図１に示す。図１において、左側のパネルは、乳酸のL体及びD体を50%ずつ含んだスタンダードのHPLC分析結果であり、右側のパネルは、L-120株が産生したL-乳酸のHPLC分析結果である。図１に示すように、D-乳酸が示す25.71分にピークが出ないことから、L-120株により産生された乳酸は100％がL体であった。
［実施例３］
＜稲ワラセルロースの糖化＞
　10cm以下程度の長さに切断した稲ワラ50g当たり1Lの1N苛性ソーダを加え、120℃で20分間加熱した。
　得られた脱リグニン稲ワラ10g当たりに水50ml及び市販のセルラーゼとキシラナーゼ(ノボザイムズ社製：Cellic CTec及びCellic HTecをそれぞれ0.2ml(それぞれ200EGU及び200FXUに相当))を加えて37℃で1日反応させた。反応後、さらに脱リグニン稲ワラ10gを添加し1日反応を繰り返した。反応物(糖化液)における糖(グルコース)量を、DNS(3,5-dinitro salicylic acid)法により測定した。結果を図２に示す。
　図２は、脱リグニン稲ワラの添加量とセルラーゼ及びキシラナーゼにより生成した糖(グルコース)の濃度(g/L)を示す。図２に示すように、合計80gの脱リグニン稲ワラを加えることで得られた糖化液には160g/Lの糖(グルコース)が検出された。
［実施例４］
＜L-120株を用いたアルカリ条件下での乳酸発酵１＞
　10cm以下程度の長さに切断した稲ワラ50g当たり1Lの1N苛性ソーダを加え、120℃で20分間加熱した。冷却後、カーゼでろ過したセルロースを水で十分に洗浄した後、絞って水分を良く除き、湿潤セルロースを得た。このようにして、稲ワラ50g当たり100gの湿潤セルロースが得られた。
　得られた湿潤セルロース50g当たり200mlの水を入れ、pHを2～6程度にした後、バイオマス用セルラーゼCellic CTec及びキシラナーゼCellic HTec(いずれもノボザイムズ社製)をそれぞれ1.5ml(それぞれ1500EGU及び1500FXUに相当)添加し、37℃で12時間反応させ糖化した。得られた糖化液に上記湿潤セルロース50g並びに上記セルラーゼ及びキシラナーゼ各1.5mlを添加し、37℃で12時間反応させた。この湿潤セルロース50gを添加する操作を4回繰り返すことで、150g/Lグルコース溶液(糖化液)を500ml作製した。
　得られたグルコース溶液500ml当たり30gのおからを入れ、pHを10にした後、滅菌操作を行わずに、L-120株の終夜培養液10ml(湿潤菌体0.1g)を植菌した。当該培養物を通気せずに30℃で1日間培養し、その後培養液をpH7にしてさらに2日間培養した。
　培養日数に対する上記培養(乳酸発酵)により得られた培養液中の乳酸濃度(W/V％)を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、3日間の培養により、12％(W/V)の乳酸を得た。
［実施例５］
＜L-120株を用いた中性条件下での乳酸発酵２＞
　滅菌操作を行わずに、グルコース20％(W/V)及び酵母エキス5％(W/V)を含む培地にL-120株(湿潤菌体0.1g)を植菌し、中性条件(pH7)下で30℃において3日間培養した。3日間の培養後、得られた培養液において17％(W/V)の乳酸を得た。なお、滅菌操作を行っても同様の高濃度の乳酸を得ることができた。
[実施例６]
＜L-120株のキシロース代謝＞
　セルロース系バイオマスを糖化した場合、全還元糖の約2割はキシロースである。このためセルロース系バイオマスを有効に利用するために、キシロースの利用が不可欠となる。しかしながら、キシロースはグルコースと比較して非常に利用されにくく、例えばほとんどの酵母ではキシロースを利用できない。
　図３は、16wt％グルコース及び2.4wt％キシロースを炭素源とする培地(5wt％酵母エキス含有)を用いてL-120株によって生成する有機酸濃度を示す。なお、図３において、各グラフは、以下の糖及び有機酸の濃度を示す：
黒塗りの四角のドットで示されたグラフ：グルコースの濃度
黒塗りの丸のドットで示されたグラフ：キシロースの濃度
白抜きの丸のドットで示されたグラフ：乳酸の濃度
白抜きの三角のドットで示されたグラフ：酢酸の濃度
×のドットで示されたグラフ：蟻酸の濃度
　種菌が十分に成育するまで通気せずに、pH9で雑菌の成育を抑制しながら当該培地でL-120株を20時間培養した。その後、乳酸の生産性が高くキシロースを代謝しやすいpH7.5下でL-120株を8日間培養した。この結果、図３に示すように、11wt％の乳酸が得られ、残存キシロース濃度は0.2wt％となった。
　このように、L-120株はグルコースだけでなくキシロースも代謝して乳酸発酵でき、セルロース系バイオマスの糖化液からの乳酸生産に適した特徴を有する。
[実施例７]
＜乳酸発酵促進物質の探索＞
　乳酸発酵にはグルコース以外に窒素源、各種ビタミン及びミネラルの添加が必要となる。これらの栄養素を添加するために酵母エキスの添加が一般的だが、高コストなため、その代替となる物質の探索を行った。
　結果を図４に示す。図４は、グルコース18wt％、酵母エキス0.8wt％及び魚肉由来ペプトン0.3wt％を含む培地で、L-120株をpH9下で27℃(黒塗りの四角のドットで示されるグラフ)又は35℃(黒塗りの三角のドットで示されるグラフ)において培養し、あるいはさらに当該培地にふすま分解物1.5wt％を添加し、当該ふすま分解物含有培地で、L-120株をpH9下で35℃において培養した(黒塗りの丸のドットで示されるグラフ)際の生成された乳酸の濃度(g/L)を示す。
　図４に示すように、ビタミン及びミネラル源としてセルラーゼで加水分解したふすま、窒素源として魚肉由来ペプトンを添加することで、L-120株の乳酸生産性を向上させることができた。さらに、培養温度を35℃にすることで乳酸生成速度を向上させることができる。18wt％グルコース、1.5wt％ふすま分解物及び0.3wt％魚肉ペプトンを含み、pH9とした培地において、L-120株を35℃で6日間培養することで15wt％の乳酸を得ることができる(図４における黒塗りの丸のドットで示されるグラフ)。
　本発明によれば、稲ワラ等の非食用植物バイオマスから乳酸発酵に適した培地を作製できるため、食料と競合せずに安価に乳酸生産用原料を入手できる。また、乳酸製造において、高温高圧による滅菌操作が不要となるため、乳酸発酵装置の大幅な簡素化が可能となる。
FERM BP-11295
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (16)

  1. 　配列番号１に記載の塩基配列から成るか又は配列番号１に記載の塩基配列と95％以上の相同性を有する16S リボソームRNA遺伝子を有し、且つpH10以上のアルカリ条件下で生育するエンテロコッカス(Enterococcus)に属する好アルカリ性乳酸菌。
  2. 　エンテロコッカス・キャセリフラバス(Enterococcus casseliflavus)に属する、請求項１記載の好アルカリ性乳酸菌。
  3. 　受託番号FERM BP-11295で特定される微生物である、請求項１又は２記載の好アルカリ性乳酸菌。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項記載の好アルカリ性乳酸菌を非滅菌且つpH9～11下でセルロース糖化液を含む培地において培養した後、pH5～9下でさらに培養する工程を含む、乳酸製造方法。
  5. 　セルロース糖化液が、植物の非可食部から得られたものである、請求項４記載の方法。
  6. 　前記植物の非可食部が、稲ワラ、麦ワラ又はトウモロコシ茎である、請求項５記載の方法。
  7. 　植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬し、リグニンを除去する工程と、セルロース繊維をセルラーゼと接触させ、セルロース糖化液を得る工程とを含む、請求項４～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　アルカリ溶液が苛性ソーダ溶液である、請求項７記載の方法。
  9. 　上記浸漬した植物バイオマスを室温で放置するか又は加熱処理に供することを含む、請求項７又は８記載の方法。
  10. 　植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬し、リグニンを除去する工程と、セルロース繊維をセルラーゼと接触させる工程とを含む、グルコースを生成する方法。
  11. 　植物バイオマスが植物の非可食部である、請求項１０記載の方法。
  12. 　前記植物の非可食部が、稲ワラ、麦ワラ又はトウモロコシ茎である、請求項１１記載の方法。
  13. 　アルカリ溶液が苛性ソーダ溶液である、請求項１０～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 　上記浸漬した植物バイオマスを室温で放置するか又は加熱処理に供することを含む、請求項１０～１３のいずれか１項記載の方法。
  15. 　請求項１０～１４のいずれか１項記載の方法により得られたグルコースを含む乳酸発酵用組成物。
  16. 　おからを含む、請求項１５記載の乳酸発酵用組成物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060231A (zh) * 2012-12-26 2013-04-24 福建大用生态农业综合发展有限公司 用于养殖场消除臭味的复合微生态菌剂
WO2015068645A1 (ja) * 2013-11-05 2015-05-14 関西化学機械製作株式会社 乳酸の製造方法
EP4056707A1 (en) 2021-03-10 2022-09-14 Indian Oil Corporation Limited An improved process for second generation lactic acid production

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114634903B (zh) * 2022-05-05 2023-07-21 至农科技发展(浙江)有限公司 一种土壤中有益菌群定向激活方法及酵母裂解物在乳酸菌促生中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63167796A (ja) * 1986-12-27 1988-07-11 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> セルロ−ス質材酵素加水分解の前処理方法
JP2009125050A (ja) * 2007-11-28 2009-06-11 Jfe Engineering Corp 草本系バイオマスの酵素加水分解の前処理方法、草本系バイオマスを原料とするエタノール製造方法及びパームヤシ空果房を原料とするエタノール製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000245491A (ja) 1999-02-25 2000-09-12 Yoshito Shirai 高純度ｌ乳酸の製造方法
JP2005073549A (ja) 2003-08-29 2005-03-24 Oita Technology Licensing Organization Ltd 乳酸液の製造方法。

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63167796A (ja) * 1986-12-27 1988-07-11 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> セルロ−ス質材酵素加水分解の前処理方法
JP2009125050A (ja) * 2007-11-28 2009-06-11 Jfe Engineering Corp 草本系バイオマスの酵素加水分解の前処理方法、草本系バイオマスを原料とするエタノール製造方法及びパームヤシ空果房を原料とするエタノール製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROTO YOKARYO ET AL.: "Lactic acid production by alkaliphilic microorganisms isolated from semi-tropical region (Okinawa)", ABSTRACTS OF THE ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR BIOTECHNOLOGY, vol. 61, - 25 August 2009 (2009-08-25), JAPAN, pages 121 - 123 *
MORIO ISHIKAWA: "Koensei Ko-Alkali-sei Nyusankin no Tayosei to Tokusei", JPN.J.FOOD MICROBIOL., vol. 26, no. 2, 31 July 2009 (2009-07-31), pages 49 - 59 *
TANIGUCHI M. ET AL: "Production of L-lactic acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic acid bacteria", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 66, no. 2, December 2004 (2004-12-01), pages 160 - 165, XP002491588, DOI: doi:10.1007/s00253-004-1671-x *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060231A (zh) * 2012-12-26 2013-04-24 福建大用生态农业综合发展有限公司 用于养殖场消除臭味的复合微生态菌剂
WO2015068645A1 (ja) * 2013-11-05 2015-05-14 関西化学機械製作株式会社 乳酸の製造方法
JPWO2015068645A1 (ja) * 2013-11-05 2017-03-09 関西化学機械製作株式会社 乳酸の製造方法
JP2019146596A (ja) * 2013-11-05 2019-09-05 関西化学機械製作株式会社 乳酸の製造方法
EP4056707A1 (en) 2021-03-10 2022-09-14 Indian Oil Corporation Limited An improved process for second generation lactic acid production

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